MASARYKOVA UNIVERZITA Přírodovědecká fakulta
BAKALÁŘSKÁ PRÁCE
Brno 2013
Kateřina Tejkalová
MASARYKOVA UNIVERZITA Přírodovědecká fakulta Ústav experimentální biologie Oddělení genetiky a molekulární biologie
CANNABIS SATIVA V ÉŘE GENOMIKY A BIOLOGICKÉ LÉČBY Bakalářská práce
Kateřina Tejkalová
VEDOUCÍ PRÁCE: doc. RNDr. Jana Řepková, CSc.
Brno 2013
Bibliografický záznam Autor:
Kateřina Tejkalová Přírodovědecká fakulta, Masarykova univerzita Ústav experimentální biologie
Název práce:
Cannabis sativa v éře genomiky a biologické léčby
Studijní program:
bakalářský
Studijní obor:
Molekulární biologie a genetika
Vedoucí práce:
doc. RNDr. Jana Řepková, CSc.
Akademický rok:
2012/2013
Počet stran:
55
Klíčová slova:
Cannabis sativa; kanabinoidy; THC; genom; léčba
Bibliographic Entry Author:
Kateřina Tejkalová Faculty of Science, Masaryk University Department of Experimental Biology
Title of Thesis:
Cannabis sativa in the age of genomics and biological therapy
Degree Programme: bachelor Field of Study:
Molecular Biology and Genetics
Supervisor:
Assoc. Prof. RNDr. Jana Řepková, CSc.
Academic Year:
2012/2013
Number of Pages:
55
Keywords:
Cannabis sativa; cannabinoids; THC; genome; therapy
Abstrakt Čeleď Cannabaceae je významnou skupinou kulturních rostlin, které produkují široce využitelné sekundární metabolity kanabinoidy. Práce se zaměřuje na druh Cannabis sativa L., která je producentem látky THC a dalších kanabinoidů s léčebnými účinky. Genom C. sativa byl v roce 2011 osekvenován s cílem identifikovat geny podílející se na biosyntéze sekundárních metabolitů a s cílem studia genetické variability. Byly identifikovány a klonovány tři enzymy podílející se na syntéze kanabinoidů. Bakalářská práce shrnuje dosavadní poznatky o genomu, genetice a metodách identifikace obsahu aktivních látek v rostlině C. sativa.
Abstract The Cannabaceae family is an important group of cultivated plants, producing miscellaneous types of secondary metabolites cannabinoids with various useful properties. This thesis is focused on the species Cannabis sativa L., the main producer of THC (tetrahydrocannabinol) and other cannabinoids, which can be used as a medicine for the treatment of various diseases. The genome of C. sativa was sequenced in 2011 in order to both identify the genes involved in the biosynthesis of important cannabinoids and to study the variability of genotypes. Genes encoding the three main enzymes involved in biosynthesis of cannabinoids were cloned. The thesis reviews the knowledge about the Cannabis genome, genetics and methods of analysis of the chemical composition and content of active components in the plant.
Poděkování Na tomto místě bych chtěla poděkovat své školitelce doc. RNDr. Janě Řepkové, CSc. za ochotu a odbornou pomoc, kterou mi poskytla během psaní této práce.
2
Prohlášení Prohlašuji, že jsem svoji bakalářskou práci vypracovala samostatně s využitím informačních zdrojů, které jsou v práci citovány.
Brno 4. 5. 2013
………………………. Kateřina Tejkalová
3
Obsah: Seznam zkratek .......................................................................... 6 1. Úvod ........................................................................................ 8 2. Obecná charakteristika Cannabis sativa .............................. 9 2.1 Původ a historie pěstování ............................................................................... 9 2.2 Taxonomické zařazení a biologická charakteristika ............................ 10 2.2.1 Hlediska klasifikace .................................................................................................. 11 2.3 Genetická charakteristika ............................................................................. 12 2.4 Možnosti biologické léčby .............................................................................. 13
3. Sekundární metabolity a endokanabinoidní systém ....... 14 3.1 Kanabinoidy ........................................................................................................ 14 3.1.1 Historie identifikace ................................................................................................ 14 3.1.2 Charakteristika ........................................................................................................... 15 3.1.3 Biosyntéza .................................................................................................................... 16 3.2 Endokanabinoidní systém ............................................................................. 18 3.3 Terapeutické účinky kanabinoidů .............................................................. 19 3.3.1 Mechanismus .............................................................................................................. 20 3.3.2 Účinky a oblasti využití ........................................................................................... 20
4. Cannabis v éře genového inženýrství ............................... 23 4.1 Genetická transformace Cannabis .............................................................. 23 4.1.1 Explantátové kultury ............................................................................................... 23 4.1.2 Metody genetické transformace ......................................................................... 25 4.1.3 Klonování genů pro klíčové enzymy ................................................................. 26 4.2 Metody hodnocení obsahu aktivní látky ................................................... 31 4.2.1 Chemická analýza ...................................................................................................... 31 4.2.2 Genotypizace ............................................................................................................... 32 4.2.3 Nové přístupy chemické klasifikace zohledňující terapeutický
přínos ............................................................................................................................. 35
5. Závěr ................................................................................... 37 4
6. Seznam použité literatury ................................................... 39
5
Seznam zkratek AFLP
amplified fragment length polymorphism
polymorfismus
délek
amplifikovaných fragmentů ATB
antibiotics
antibiotika
BBE
berberine bridge enzyme
CBD
cannabidiol
CBDA
cannabidiolic acid
CBDAS
cannabidiolic acid synthase syntáza kyseliny kanabidiolové
CBGA
cannabigerolic acid kanabigerolová kyselina
CBN
cannabinol
cDNA
complementary DNA komplementární DNA (zpětným přepisem RNA)
CNS
central nervous system
centrální nervová soustava
ES
endocannabinoid system
endokanabinoidní systém
EST
expressed sequence tag
sekvence s expresní adresou
FAD
flavine adenine dinucleotide flavin adenin dinukleotid
GC-MS
gas chromatography-mass spectrometry
enzym berberinových můstků
kanabidiol kyselina kanabidiolová
kanabinol
plynová chromatografie s
hmotnostní spektrometrií HPLC
high performance liquid chromatography
vysoce účinná kapalinová
chromatografie ISSR
inter-simple sequence repeat polymorfismus sekvencí mezi dvěma
mikrosatelity ITS
internal transcribed spacer vnitřní přepisovaný mezerník
MAS
marker assisted selection
asistovaná
selekce
na
základě
molekulárních markerů asociovaných s cílovým znakem (ve šlechtění) NCBI
National Center for Biotechnology Information
NK
natural killer (cell)
NMR
nuclear magnetic resonance nukleární magnetická rezonance
OLA
olivetolic acid
OLS
olivetolic acid synthase
ORF
open reading frame otevřený čtecí rámec
PCR
polymerase chain reaction polymerázová řetězová reakce
buňky imunitního systému, tzv. přirození zabíječi olivetová kyselina syntáza kyseliny olivetové
6
RAPD
randomly amplified polymorphic DNA
polymorfismus
náhodně
restriction fragment length polymorphism polymorfismus
délek
amplifikované DNA RFLP
restrikčních fragmentů RT-PCR
real time polymerase chain reaction polymerázová
řetězová
reakce
v reálném čase SCAR
sequence characterized amplified region
sekvenčně
specifická
amplifikovaná oblast SDS-PAGE sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis elektroforéza v polyakrylamidovém gelu SNP
single nucleotide polymorphism
jednonukleotidový polymorfismus
SSR
simple sequence repeat
opakování
STR
short tandem repetitions
krátké tandemové repetice; mikrosatelity
THC
(–)
jednoduchých
sekvencí,
mikrosatelitů ∆9-trans-tetrahydrokanabinol,
podle
alternativního
číslování
1
(–) ∆ -trans-tetrahydrokanabinol; jeho izomerem bez psychoaktivních vlastností je (–) ∆8-trans-tetrahydrokanabinol THCA
tetrahydrocannabinolic acid kyselina tetrahydrokanabinolová
THCAS
tetrahydrocannabinolic acid synthase
tetrahydrokanabinolové
7
syntáza
kyseliny
1. Úvod Cannabis sativa je člověkem využívána od počátků civilizace. V medicíně má historii starou tisíce let a člověku poskytuje široké spektrum svých rozmanitých vlastností. V práci jsou popsány hlavní aktivní látky konopí, což jsou kanabinoidy, základní mechanismus jejich biosyntézy a jejich účinky na lidský organismus se zaměřením na terapeutický potenciál. V České republice je podle § 24 zákona č. 167/1998 Sb. (Zákon o návykových látkách a o změně některých dalších zákonů) Cannabis omamnou látkou a je zakázáno pěstovat druhy a odrůdy rostliny konopí (rod Cannabis), které mohou obsahovat více než 0,3 % látek ze skupiny tetrahydrokanabinolů. Podle § 30 zákona č.200/1990Sb. (Zákon o přestupcích) se ten, kdo v malém množství přechovává pro svoji potřebu omamnou či psychotropní látku, dopouští přestupku. Podle § 187a zákona č. 412/2002 Sb. (Trestní zákon) se trestného činu dopouští ten, kdo přechovává pro svoji potřebu omamnou či psychotropní látku v množství větším než malém. Malé množství je definováno jako 0,3 g čisté hmoty THC. Zákon č. 167/1998 Sb. byl několikrát novelizován. Jako poslední byla schválena novela zákona, která legalizuje konopí k léčebným účelům, kterou 15. února 2013 podepsal prezident České republiky. Lékařské využití konopí by tedy od roku 2013 v České republice mělo být legální. Od roku 2011 jsou získávány poznatky o genomu Cannabis, což urychluje další rozvoj jejího výzkumu. Tyto poznatky přináší zásadní posun v možnostech identifikace a klonování klíčových genů biosyntézy kanabinoidů s perspektivním využitím při získání genotypů se zlepšenými terapeutickými vlastnostmi. V tom může sehrát důležitou úlohu genové inženýrství, které umožní získání takových genotypů. Následné šlechtění léčebných kultivarů by mohlo znamenat efektivnější produkci léčivých látek a snížení rizika zneužití Cannabis jako drogy. Tato práce je zaměřena na současný stav aplikace metod genového inženýrství a základní metodiky hodnocení obsahu biologicky aktivních látek. Vývoj moderních biotechnologií a genomických přístupů, které umožní využívat Cannabis jako zdroj kvalitního, dostupného a bezpečného léčiva, se v současnosti stává velice aktuálním.
8
2. Obecná charakteristika Cannabis sativa 2.1 Původ a historie pěstování Cannabis sativa je jednou z prvních domestikovaných rostlin. Předpokládaným centrem jejího původu je oblast centrální a severovýchodní Asie, konkrétně dnešní Čína. Od neolitu je zde nepřetržitě pěstována více než 6000 let. Pro Číňany byla základní surovinou pro výrobu lan, textilu, sítí, papíru, oleje a léků (Li, 1974). Dnes patří mezi jednu z nejrozšířenějších kulturních rostlin na světě. K dosud nejstarším a nejzachovalejším důkazům o používání konopí pro lékařské účely patří nález starý 2800 let z pohřebiště šamana v poušti Gobi ve střední Asii. Rozbor těchto tajně skrytých vzorků potvrdil, že nešlo o rostliny sbírané ve volné přírodě, ale o cíleně pěstované kultivary. Navíc byly nalezeny pouze části samičích rostlin, což znamená, že lidé si již ve starověku všimli výrazně vyšší produkce THC v samičích částech rostliny (Russo et al., 2008). Další záznamy o nejstarším medicínském použití konopí pochází z Číny, Indie, Egypta, Sýrie, Persie a Tibetu (Fisar, 2009). Asyřané, jejichž kultura je stará 3000 let, zanechali farmaceutický odkaz na stovkách hliněných tabulek. Cannabis patřila k jejich hlavním léčivům (Russo, 2007; Mechoulam a Ben-Shabat, 1999). Antičtí Řekové a Římani používali konopí jako předivo a účinný lék a léčebné vlastnosti konopí zmiňují i arabští lékaři, jako např. ibn Sina (Avicenna) roku 1294 (Russo, 2011). V období středověku bylo konopí pěstováno nejen pro účely medicíny, ale i pro vysoké nutriční hodnoty semen. Koncem devatenáctého století se již v Evropě i USA vědělo mnoho o možnostech medicínského využití konopí (Zias et al., 1993). Větší farmaceutické společnosti tehdy prodávaly konopí ke tlumení bolesti, depresí, nechutenství, křečí, kašle, astmatu a jako sedativum. S příchodem moderních analytických metod se věda zaměřila na chemický rozbor aktivních látek konopí. Farmaceutické laboratoře se pokoušely vyvinout kanabinoidy, které by byly léčivé bez psychotropních účinků, ale nepodařilo se jim to dostatečně rychle. Obecně liberální přístup společnosti k používání konopí v medicíně se proto v polovině dvacátého století změnil na přísně konzervativní (Fisar, 2009) a medicínské užití do té doby oblíbeného konopí takřka vymýceno. Dnešní výzkum usiluje o stanovení pravidel a podmínek, za kterých bude možné kanabinoidy předepisovat na řadu zdravotních potíží. 9
2.2 Taxonomické zařazení a biologická charakteristika Konopí seté (C. sativa L.) je řazeno do třídy dvouděložné (Dicotyledonae) a čeledi konopovité (Cannabaceae). Kromě konopí zahrnuje tato čeleď ještě další hospodářsky významnou rostlinu chmel otáčivý (Humulus lupulus L.). Carl Linne označil konopí v knize Species plantarum jako monotypickou rostlinu zastoupenou právě jedním druhem C. sativa, který je dnes jediným platným druhem, všechny ostatní názvy jsou jeho pouhá synonyma (www.plantlist.org). Dnešní klasifikace druh dále dělí na variety sativa a spontanea Vavilov a křížence obou zmíněných, nothovarietu intersita (Soják) ined. C. spontanea (synonymum ruderalis) je plevelné konopí. Všechny kultivary (odrůdy vzniklé šlechtěním) jsou řazeny k var. sativa. Cannabis je často určována podle morfologie, čili fenotypu. Rozlišujeme dva morfotypy, C. sativa a C. indica. Druh indica je nižší se širšími listy, druh sativa je naopak vyšší a jeho listy jsou úzké a prstovité (Fischedick et al., 2010). C. indica kvete a plodí dříve než C. sativa pěstovaná za stejných podmínek. Liší mezi sebou také pachem, což je pravděpodobně dáno odlišným chemickým zastoupením terpenoidů (Hillig, 2004; Hillig a Mahlberg, 2004). Pozoruhodná morfologická rozmanitost konopí je dána tím, že se varianty mezi sebou volně kříží. Klasifikace kultivarů není jednotná (viz kapitola 2.2.1). Označení konopí (angl. hemp) se v USA a Kanadě používá pouze pro technické konopí. V Evropě tímto termínem označujeme veškeré varianty rodu Cannabis. Tato jednoletá cizosprašná rostlina patří mezi dvoudomé (dioecie). To znamená, že tyčinkové (samčí) a pestíkové (samičí) květy se nachází na oddělených rostlinách. Vzácně se objevují i jednodomé kultivary (van Bakel et al., 2011). Renner a Ricklefs (1995) uvádí, že dioecie se u kvetoucích krytosemenných rostlin (Angiospermae) vyvinula u zhruba 6 % druhů rostlin. Po tisíciletí je konopí v oblibě pro své široké spektrum využití. Jedná se o zemědělsky významnou plodinu pěstovanou jako zdroj potravy, celulózy a látek s farmakologickým účinkem, tzv. kanabinoidů (Russo, 2007). Zejména technické konopí s vysokým obsahem celulózy je důležité pro produkci tkanin, paliva, stavebního materiálu a papíru. Konopná semena (kterými jsou nažky) obsahují 30 % tuku, semena odrůdy „oleifera“ obsahují dokonce 40 % (Small et al., 1975). Podle Kuhnt et al. (2012) jsou semena významným zdrojem omega-3-nenasycených mastných kyselin (tzv. PUFA; obsah až 70-80 %), dále mononenasycených mastných kyselin (tzv. MUFA; obsah 53 %) a linolové kyseliny (omega-3-nenasycená mastná kyselina; obsah 57,1 %). Kromě tuků poskytují 10
semena všechny esenciální aminokyseliny a některé stopové prvky jako jod, chrom, stříbro a lithium. 2.2.1 Hlediska klasifikace Doposud bylo identifikováno 700 kultivarů, které se liší různými vlastnostmi, což je důsledek intenzivního neoficiálního pěstování pro rekreační a léčebné účely. Současná klasifikace pro posouzení variability není dostatečná. Řada studií byla zaměřena na kvantitativní rozbor chemického složení. Pro určení fenotypu byla porovnána koncentrace a poměr hlavních kanabinoidů (THC, CBD a CBN) (Rustichelli et al., 1998; Hazekamp a Fischedick, 2012). Fetterman et al. (1971) definovali dva typy konopí podle poměru (THC+CBN)/CBD v čerstvé rostlině. Rostliny typu „drug“ mají poměr vyšší než 1 a jde o rostliny s vysokým obsahem THC a nízkým obsahem CBD. Rostliny typu „fibre“ mají nízký obsah THC a vysoký obsah CBD. Small et al. (1975) měřili zastoupení nejvýznamnějších sekundárních metabolitů v rostlině a určili tři fenotypové kategorie (Obr. 1). Pro fentoyp I je typický obsah THC > 0,3 % a obsah CBD < 0,5 %, pro fenotyp II je obsah THC > 0,3 % a obsah CBD > 0,5 % a pro fenotyp III je obsah THC > 0,3 %. Small et al. (1975) poté objevili a popsali fenotyp IV, který obsahuje 0,05 % kanabinoidu s podobným retenčním časem jako kanabigerol monomethylether (CBGM). Turner et al. (1978) uvádí, že jedna rostlina může spadat do jakékoli z těchto kategorií v závislosti na věku rostliny.
Obr. 1: Graf 3 hlavních fenotypů (Small et al., 1975)
11
Pro legislativní a kriminalistické účely je konopí nejčastěji rozdělováno na dvě základní skupiny: technické konopí (typ „fibre“) a konopí vhodné pro léčebné a relaxační účely (marihuana, typ „drug“). Hlavním kritériem je obsah THC v sušině apikální (květní) části rostlin (Rustichelli, 1998). Legálně pěstované technické konopí v EU zahrnuje kultivary C. sativa s maximální hladinou THC 0,2 % (Pellegrini et al., 2005; Pinarkara et al., 2009). Kultivary schválené pro oficiální medicínské projekty patří téměř bez výjimek ke kategorii konopí pro léčebné a relaxační účely (hladina THC je vyšší než 0,2 %) (Hazekamp a Fischedick, 2012). Avšak i technické konopí obsahuje poměrně vysoké koncentrace biologicky aktivního CBD a může být proto používáno pro léčení. Dědičnost chemického fenotypu zkoumal jako první de Meijer et al. (2003). Pomocí plynové chromatografie provedl rozbor chemického složení a obsahu kanabinoidů v rostlině a během křížení rostlin pozoroval tři chemotypy podle obsahu a zastoupení hlavních kanabinoidů v celkovém množství biomasy (CBD, CBD/THC a THC). Analýzou RAPD bylo zjištěno, že podstata těchto chemotypů je řízena monogenně a je determinována lokusem B s alelami BD a BT vykazujícími kodominanci. Chemotyp CBD je řízen alelami BD/BD a chemotyp THC má genotyp BT/BT. Chemotyp CBD/THC je klasický heterozygot s alelami BD/BT. Po křížení těchto dvou homozygotů vykazuje generace F2 mendelovský poměr 1 : 2 : 1 (CBD:CBD/THC:THC).
2.3 Genetická charakteristika C. sativa má v genomu dvě sady chromozomů (2n = 20), základní číslo x = 10, z toho devět autozomů a jeden pohlavní chromozom. Chromozomální určení pohlaví je typu Drosophila, kdy samičí rostliny mají homogametické pohlaví XX, samčí heterogametické XY. Jak uvádí Ming et al. (2011), determinace pohlaví je řízena poměrem počtu chromozomů X k počtu sad autozomů. Genom C. sativa byl poprvé osekvenován v roce 2011 (van Bakel et al., 2011). Do té doby se informace v databázi NCBI omezovaly na údaje o velikosti transkriptomu. Bylo zde uloženo 12 907 EST a 23 neposkládaných sekvencí RNA. Ačkoli se jedná o zhruba dvacátý rostlinný genom, který byl osekvenován, jde o historicky první sekvenaci genomu léčebného druhu rostliny. Velikost haploidního genomu samičí rostliny je přibližně 818 Mb, samčí 843 Mb. Rozdíl je dán odlišnou velikostí chromozomu Y, neboť na jeho dlouhém raménku se v průběhu evoluce nakumulovaly stovky sekvencí retrotranspozonů bez dlouhých koncových repeticí (Ming et al., 2011). Fyzická ani genetická mapa genomu dnes zatím nejsou k dispozici. Znalost genomu a transkriptomu je nezbytná k hlubšímu pochopení 12
evoluce a funkcí jednotlivých genů. Sekvenování genomu konopí je omezeno přísnými opatřeními a podmínkami jeho pěstování a manipulacemi s touto rostlinou (van Bakel et al., 2011).
2.4 Možnosti biologické léčby Biologická léčba (biological therapy) se zaměřuje na tlumení chorobných procesů u člověka ovlivněním biologických procesů. Zaměřuje se na buňky postižené za současného neovlivňování buněk zdravých, proto je označována jako léčba cílená (targeted therapy). Cannabis je považována za nejvíce kontroverzní rostlinu na světě. Je významná svými farmakologickými vlastnostmi a současně je celosvětově nejčastěji užívanou nelegální drogou (De Backer et al., 2009). Výzkum jejích chemických a farmakologických vlastností ukázal, že skupina sekundárních metabolitů kanabinoidů má také léčebné účinky (Fischedick et al., 2010) a s rozvojem moderních molekulárně-biologických metod vzrůstá i potenciál jejího využití jako fytofarmaka v biologické léčbě. V Kanadě (od roku 2001) a Nizozemí (od roku 2003) fungují státem řízené programy zajišťující přístup k léčebným odrůdám Cannabis o vysoké kvalitě. V jiných státech jako např. Česká republika a Izrael jsou takovéto oficiální programy teprve zakládány. Projekty zajišťující dovážení konopí z Nizozemí fungují např. v Itálii, Finsku a Německu (Hazekamp et al., 2012).
13
3.
Sekundární metabolity a endokanabinoidní systém
Cannabis produkuje široké spektrum látek. Bylo identifikováno víc jak 489 sloučenin z různých chemických skupin (Fisar, 2009). Některé patří mezi primární metabolity, jako např. aminokyseliny, mastné kyseliny, sacharidy a nukleové kyseliny. Mezi sekundární metabolity Cannabis se řadí flavonoidy, stilbenoidy, terpenoidy, steroidy, lignany, alkaloidy a kanabinoidy. Sekundární metabolity se od primárních liší tím, že je rostlina může postrádat, tedy nejsou esenciální. Jejich koncentrace závisí na části rostliny (typu pletiva), kultivaru (biotypu), vývojové fázi (věku), podmínkách kultivace (výživě, vlhkosti, teplotě a osvětlení), době sklizně a způsobu skladování (Ross a ElSohly, 1996; Keller et al., 2001; Toonen et al., 2006; Potter a Duncombe, 2012). Obsah aktivních látek v rostlině závisí na příliš mnoha faktorech (Hazekamp a Fischedick, 2012) a zařadit rostlinu podle tohoto kritéria do jasně definované kategorie je proto velmi obtížné a sporné.
3.1 Kanabinoidy 3.1.1 Historie identifikace Způsob extrakce farmakologicky aktivních látek konopí byl patentován v roce 1914 a následoval vývoj nových metod jejich izolace. V první polovině dvacátého století byly úspěšně izolovány látky kanabinol a kanabidiol a byla určena jejich struktura (Tab. 1). Pokusy s jejich deriváty potvrdily, že hlavní psychotropní látkou jsou tetrahydrokanabinoidy. Výzkum
metabolitů
C.
sativa
zaostával
za
výzkumem
máku
setého
(Papaver
somniferorum L.). Morfin byl z opia máku izolován začátkem devatenáctého století a přesnou chemickou strukturu THC popsali Gaoni a Mechoulam až v roce 1964 (Gaoni a Mechoulam, 1964). Také první receptory opiátů byly popsány již v sedmdesátých letech dvacátého století, zatímco existence kanabinoidních receptorů v CNS byla potvrzena v roce 1988 (Devane et al., 1988). Jak dále uvádí Mechoulam a Ben-Shabat (1999), první endogenní opiáty byly izolovány v sedmdesátých letech dvacátého století, zatímco první úspěšná izolace endokanabinoidů proběhla v devadesátých letech. Byla prokázána řada pozitivních účinků kanabinoidů v humánní terapii, avšak jejich léčebný potenciál je zkoumán teprve od začátku devadesátých let. 14
Tab. 1: Historický přehled výzkumu kanabinoidů (Fisar, 2008)
3.1.2 Charakteristika Cannabis produkuje více než 70 terpeno-fenolických sloučenin (Mechoulam a BenShabat, 1999), které tvoří dvacet dva uhlíků. Jejich neutrální forma má uhlíků dvacet jedna. Tyto látky, jejich deriváty a metabolické produkty jsou označovány jako fytokanabinoidy. Pojem kanabinoid obecně znamená jakoukoli látku, která se váže na kanabinoidní receptory, které jsou součástí endokanabinoidního systému (Howlett et al., 2002). Jsou rozlišovány
tři
základní
skupiny
kanabinoidů:
syntetické,
rostlinného
původu
(fytokanabinoidy) a produkované lidským organismem (endokanabinoidy) (Fisar, 2009). Hlavní
psychoaktivní
látkou
je
THC,
konkrétně
jeho forma
(–) trans-∆9-tetrahydrokanabinol (Mechoulam, 1970). Vzniká dekarboxylací kyseliny tetrahydrokanabinolové a je nestálý na světle. Při přímém osvětlení je THC oxidován na kanabinol (CBN) (Razdan et al., 1972). Kromě ∆9-THC se v konopí vyskytují i jiné kanabinoidy.
Patří
mezi
ně
∆8-tetrahydrokanabinol
(∆8-THC),
kanabidiol
(CBD),
kanabichromen (CBC), tetrahydrokanabivarin (THCV), kanabigerol (CBG), kanabinol (CBN) etc. (Hanus, 2009; van Bakel et al., 2011) (Obr. 2). Tyto metabolity vykazují slabé nebo žádné psychotropní účinky.
15
Obr. 2: Schéma syntézy hlavních kanabinoidů (upraveno podle Hill et al., 2012)
3.1.3 Biosyntéza Fytokanabinoidy jsou v tucích rozpustné látky tvořící součást pryskyřice sekretované v nejvyšších koncentracích žlaznatými trichomy na samičích rostlinách (Turner et al., 1978). Skupina těchto látek nenese svůj název proto, že by měla místo účinku či reakční mechanismus stejné jako endokanabinoidy a syntetické kanabinoidy, nýbrž podle podobné chemické struktury.
16
Obr. 3: Základní schéma biosyntézy THC (Sirikantaramas et al., 2004)
Prekurzorem hlavních fytokanabinoidů ∆9-THC a CBD je kyselina kanabigerolová (CBGA) (Obr. 3). Vzniká kondenzací kyseliny olivetové (OLA) a geranylpyrofosfátu. Enzym katalyzující syntézu OLA je označován jako olivetol syntáza (OLS) (Taura et al., 2009). CBGA je substrátem syntázy kyseliny tetrahydrokanabinolové (THCAS) a syntázy kyseliny kanabidiolové (CBDAS) (Fellermeier a Zenk, 1998). Z CBGA vzniká THCA za přítomnosti THCAS oxidativní cyklizací. Koncentrace THCAS vypovídá o intenzitě psychotropních účinků rostliny a je proto klíčovým enzymem pro kontrolu psychoaktivity. Gen THCAS je významně exprimován v typu „drug“ (van Bakel et al., 2011), zatímco gen CBDAS je exprimován převážně v typu „fibre.“ Kanabinoidy jsou syntetizovány v nestabilní formě karboxylových kyselin, které se v rostlině nachází v daleko vyšších koncentracích oproti neutrálním kanabinoidům. Kyselina tetrahydrokanabinolová (THCA) dekarboxyluje na neutrální THC a analogicky z kyseliny kanabidiolové (CBDA) vzniká CBD (Mechoulam a Ben-Shabat, 1999). K této dekarboxylaci dochází neenzymatickými úpravami (zejména zahříváním) po sklizni, v živé rostlině proto kanabinoidy převažují ve formě kyselin. Míra exprese THCA je různá v jednotlivých části rostliny. Obsah THCA byl naměřen ve stoncích, pylu, semenech a v kořeni (Tanaka a Shoyama, 1999), avšak semena obsahují
17
téměř nulové množství THC (Fisar, 2009). Místem nejintenzivnější exprese a zároveň rezervoárem THCA jsou žláznaté trichomy neopylených květů. Významným přínosem pro identifikaci a charakteristiku genů je sekvenace genomu a transkriptomu. Transkriptom Cannabis byl poprvé osekvenován roku 2011 (van Bakel et al., 2011). Geny kódující biosyntézu kanabinoidů ani její mechanismus nejsou dostatečně prozkoumány. Identifikace genů pro klíčové enzymy jako THCAS a CBDAS metodami molekulární biologie jako je jejich klonování a cílené umlčování umožní selektivní přípravu léčebných kultivarů.
3.2 Endokanabinoidní systém Endogenní kanabinoidní systém v lidském těle se skládá z kanabinoidních receptorů, jejich endogenních ligandů endokanabinoidů a proteinů zodpovědných za jejich syntézu a následnou degradaci. Kanabinoidní receptory CB1 byly naklonovány v roce 1990 (Matsuda et al., 1990) a CB2 byly naklonovány v roce 1993 (Munro et al., 1993). Kanabinoidní receptory CB1 a CB2 patří do skupiny receptorů spojených s G-proteinem (Devane et al., 1988) se sekundární strukturou sedmi transmembránových alfa-helixů. Navázání ligandu (agonisty) způsobí konformační změnu cytosolové domény a vyvolá následnou reakci. Většina účinků kanabinoidů je zprostředkována kanabinoidními receptory v CNS (Howlett et al., 2004), jsou ovšem známy i účinky na receptorech částečně či zcela nezávislé. Některé kanabinoidní účinky jsou zprostředkovány jejich metabolity nebo prostřednictvím jiných na receptorech nezávislých mechanismů (Pertwee, 2000). Příklad uvádí Sanchez et al. (1998), kteří popsali, že THC může vyvolávat apoptózu buněk gliomu prostřednictvím mechanismů nezávislých na receptorech. Receptory CB1 se nachází zejména v mozku a mohou se vyskytovat i v páteřní míše a v periferních nervech (Pertwee, 1997). V nejvyšších koncentracích se receptory CB1 nachází na bazálních gangliích, v určitých oblastech mozkové kůry a v hipokampu. Leží zejména v oblasti synapsí a když jsou aktivovány, je jejich hlavní funkcí inhibovat vylévání neurotransmiterů (Pertwee, 1999). Protože kanabinoidní receptory se nachází v oblastech mozku, které kontrolují pohyb a emoce, ovlivňují kanabinoidy kontrolu nad těmito funkcemi. Fisar (2006) uvádí, že hlavní účinky kanabinoidů na nervový systém zprostředkovává receptor CB1, jelikož je nejvíce rozšířeným receptorem ve vazbě s G-proteinem v CNS. Fyziologická role receptorů CB2 není přesně objasněna. Nachází se primárně na povrchu buněk imunitního systému, zejména na povrchu B-lymfocytů, později také na NK buňkách a makrofázích (Howlett et al., 2002). V buňkách zdravého mozku nebyly receptory 18
CB2 nalezeny, byly popsány pouze v zanícené mozkové tkáni, kde je jejich exprese stimulována cytokiny. To ukazuje na roli CB2 receptorů v protizánětlivé odpovědi (Munro et al., 1993). Je pravděpodobné, že se uplatňují v imunitní odpovědi zdravých i oslabených jedinců. Ligandy receptorů CB2 by proto mohly být využívány např. nejen při léčbě projevů roztroušené sklerózy, ale i při léčbě jejích příčin (Pertwee, 1999). Ligandy CB2 stimulují uvolňování cytokinů (Newton et al., 2009) a migraci imunitních buněk (Pertwee, 2006). Terapeutický význam receptorů CB2 v souvislosti s imunitou je třeba dále testovat. Přirození agonisté těchto receptorů, které si živočišná tkáň sama syntetizuje, se nazývají endokanabinoidy. Jedná se o amidy kyseliny arachidonové, která je jednou z nejdůležitějších nenasycených mastných kyselin v mozku. Jejich funkcí je inhibovat vylévání neurotransmiterů z presynaptických zakončení. Nejznámějšími endokanabinoidy jsou 2-arachidonoylglycerol (2-AG), arachidonoylglycerylether (noladin ether) a anandamid (N-arachidonoyletanolamid, ANA) (Hanus, 2009; Pertwee et al., 2010). Název anandamid pochází ze sanskrtského výrazu blaženost, ananda. Anandamid se váže na stejné vazebné místo na receptoru CB1 (kompetitivní vazba) jako THC (Adams et al., 1998) a vykazuje i řadu podobných účinků nejen na psychiku (Solinas et al., 2007). Endokanabinoidy fungují jako neuromodulátory či neurotransmitery, neboť jsou syntetizovány v neuronech, z nichž se po depolarizaci membrány vylijí a z mimobuněčného prostoru jsou rychle odváděny a vstřebávány (Howlett et al., 2002). Právě tento mechanismus zpětného vstřebání (uptake) vylitých endokanabinoidů do buňky není objasněn. Anandamid i 2-AG jsou dále uvnitř buňky hydrolyticky rozkládány mikrosomálním enzymem hydrolázou amidu mastných kyselin (FAAH, fatty acid amin hydrolase) na kyselinu arachidonovou a etanolamin. Hydroláza amidu mastných kyselin byla prvním klonovaným enzymem odbourávání endokanabinoidů (Cravatt et al., 1996). Látky, které do endokanabinoidního systému zasahují nepřímo, by mohly sloužit k terapeutickým účelům, a to buď pomocí selektivní inhibice zpětného vstřebávání endokanabinoidů do buněk, nebo prostřednictvím ovlivnění metabolismu tak, aby došlo ke zvýšení koncentrací endokanabinoidů v okolí receptorů CB. Pertwee (1999) uvádí, že by šlo o velice selektivní typ farmak, neboť by zasahovaly pouze do míst, kde jsou endokanabinoidy aktuálně produkovány.
3.3 Terapeutické účinky kanabinoidů Po objevu endokanabinoidního systému bylo zjištěno, že jeho fyziologická funkce je velice rozsáhlá. Ovlivňuje chuť k jídlu, paměť, motoriku, imunitní systém, kardiovaskulární systém, rozmnožování, dýchání, kosterní systém a CNS celkově. Howlett et al. (2002) uvádí, 19
že většina účinků kanabinoidů je spojena s receptory CB1 a CB2 a některé působí i nezávisle na nich. Po objevu kanabinoidních receptorů a jejich funkcí byl zahájen výzkum jejich ligandů (agonistů i antagonistů), které by mohly mít terapeutické využití. 3.3.1 Mechanismus Podle Fisar (2009) se kanabinoidy jako částeční agonisté receptorů CB1 a CB2 pro svoji lipofilní povahu akumulují v lipidické vrstvě buněčných membrán a obsazují vazebná místa kanabinoidních receptorů (lokalizovaná na hydrofobních částech transmembránových proteinů). Ovlivněna může být i funkce membránových mastných kyselin. Farmakologické
účinky
fytokanabinoidů
lze
vysvětlit
jejich
interakcemi
s kanabinoidními receptory na presynaptických zakončeních. Agonisté receptorů CB1 silně inhibují stimulační i inhibiční neurotransmitery v mozku i periferní nervové soustavě. Byla popsána inhibice vylévání acetylcholinu, dopaminu, GABA, histaminu, serotoninu, glutamátu, noradrenalinu, prostaglandinů a opioidních peptidů (Howlett et al., 2002). Inhibice uvolňování neurotransmiterů neznamená obecně snížení neuronální aktivity, protože některé neurotransmitery aktivují i receptory inhibující přenos signálu (Fisar, 2006). Mechanismus účinku na receptorech CB2 je třeba zkoumat hlouběji (viz kapitola 3.2.1). 3.3.2 Účinky a oblasti využití Hlavními dvěma kanabinoidy, které jsou v některých státech schváleny pro terapeutické použití, jsou psychotropní THC a nepsychoaktivní CBD (Obr. 4, obr. 5). THC je farmakologicky a toxikologicky nejvýznamnější sloučenina, která se v Cannabis nachází. Má široké spektrum léčebných účinků, z nichž hlavní je tlumení nevolnosti a zvracení u onkologických pacientů (Sallan et al., 1975). Díky zvýšenému zájmu o THC byly do prodeje uvedeny jeho syntetické analogy, Marinol (legalizován v USA) a Cesamet (legalizován v UK). Marinol je syntetická forma sloučeniny dronabinol (mezinárodní nechráněný název pro ∆9-THC) a prodává se rozpuštěný v sezamovém oleji v želatinových kapslích. Účinnou látkou Cesametu je nabilon (syntetický analog ∆9-THC). Obě tyto syntetické formy THC pomáhají tlumit zvracení (často po chemoterapii), dronabinol navíc podporuje chuť k jídlu (např. při podvýživě, kachexii a nechutenství pacientů s AIDS) (Beal et al., 1995; Meiri et al., 2007; Hanus, 2009). Dále také mírní bolesti, snižují spasticitu, ataxii, katalepsii, svalovou slabost spojenou s roztroušenou sklerózou a působí příznivě na bronchodilataci u astmatiků (Varvel et al., 2005; Pertwee, 1997). Výzkum syntetických kanabinoidů usiluje o větší cílenost a účinnost bez vedlejších účinků a bude se nadále rozvíjet. 20
Endokanabinidní systém je totiž funkčně provázán s dopaminergním (French et al., 1997) a opiodním systémem (Navarro et al., 2001) při tišení bolesti, fyzické závislosti a vzniku tolerance při tzv. efektu odměny. ∆9-THC zmírňuje abstinenční příznaky (Vela et al., 1995). Bylo zjištěno, že závislost na opiátech je spojena s kanálky receptoru CB1. ∆9-THC a další agonisté receptoru CB1 (anandamid, ∆8-THC) jsou tak potenciálním lékem vážných závislostí (Yamaguchi et al., 2001). Je tedy možné, že kanabinoidy budou využívány v léčení abstinenčních příznaků. ∆9-THC snižuje nitrooční tlak (Jarvinen et al., 2002). Z tohoto důvodu je využíván pro léčbu zeleného zákalu (glaukomu). CBD působí proti psychózám a úzkostem vyvolaným užitím THC (Carlini et al., 1970). Byla popsána jeho funkce neuroprotektivního antioxidantu (Hampson et al., 1998) s účinky silnějšími než kyselina askorbová a tokoferol (Russo a Guy, 2006). CBD má protizánětlivý a imunosupresivní vliv a mírní artritidu (Malfait et al., 2000). Příznivě působí i při léčbě Alzheimerovy (Iuvone et al., 2004) a pravděpodobně i Parkinsonovy choroby (Venderova et al., 2004). CBD vykazuje cytostatické a cytotoxické účinky (Russo a Guy, 2006). Vaccani et al. (2005) popsali inhibici buněčné migrace lidských gliomových buněk působením CBD.
Obr. 4: Vzorec THC
Obr. 5: Vzorec CBD
(Small et al., 1975)
(Small et al., 1975)
Kanabinoidy se dnes užívají jako galénika (léčiva připravená přímo z rostliny). Ačkoli vazba CBD k receptorům je slabá, vykazuje výrazný antagonistický účinek a pro léčbu je proto ideální v kombinaci s agonistou (jako THC) (Thomas et al., 2007). Přípravek Sativex (označovaný jako Nabiximols) je směs THC a CBD v poměru 1 : 1 s minimálním obsahem jiných kanabinoidů, připravený z plně standardizovaného chemotypu C. sativa. Kombinace THC a CBD zvyšuje účinnost a snižuje vedlejší účinky (Russo a Guy, 2006; Hazekamp et al., 2012). V některých zemích (např. Kanada) je předepisován zejména pro léčbu zvýšeného 21
svalového napětí (spasticity), chronických bolestí a dysfunkcí močového měchýře u roztroušené sklerózy (Novotna et al., 2011). Je téměř jisté, že i další kanabinoidy mají léčivé účinky. Je ovšem nejprve nezbytné jejich účinky ověřit preklinickými studiemi. Perspektivním kanabinoidem se pro své léčivé vlastnosti zdá THCV, který nebyl doposud uspokojivě prozkoumán. THCV je homolog THC a na rozdíl od něj má jeden propylový boční řetězec. THCV byl charakterizován jako kompetitivní antagonista receptoru CB1 a receptoru CB2 (Thomas et al., 2005). V budoucnosti by mohl být používán pro léčbu některých hyperexcitabilních poruch, jako např. dosud neléčitelné spinocerebelární ataxie (Paulson, 2009), nebo pro zmírňování projevů epilepsie (Hill et al., 2010). Bylo prokázáno, že THCV je velmi slibným léčivem pro zpomalení nástupu Parkinsonovy nemoci a pro zmírňování jejích motorických symptomů (Garcia et al., 2011). THCV podávaný samostatně či v kombinaci s CBD by proto mohl poskytnout zkvalitnění léčby Parkinsonovy choroby. Kanabinoidní kyseliny mají antibiotické účinky a před padesáti lety byly používány ve veterinárním lékařství v tehdejším Československu (Mechoulam, 2005) a podle Small et al. (1975) byly antibiotické účinky zaznamenány i při použití konopných semen. Bylo zjištěno, že extrakty mají větší účinnost než syntetické či izolované formy kanabinoidů. Na účincích kanabinoidů se totiž podílí i jiné sekundární metabolity rostliny, jako např. těkavé terpenoidy (Russo, 2011). Terpenoidy sdílí s kanabinoidy prekurzor geranylpyrofosfát a jsou také syntetizovány v žlaznatých trichomech. Russo a Guy (2006) popsali tzv. doprovodný účinek, kterým terpenoidy zesilují vlastnosti kanabinoidů. Podporují terapeutické účinky a zmírňují některé vedlejší účinky. Grinspoon a Bakalar (1995) uvádí, že pacienti a terapeuti, kteří mohou ze zkušenosti srovnávat syntetické analogy a rostlinný extrakt, shodně upřednostňují extrakt. Jeho dávkování je snadnější, lépe kontrolovatelné a účinky trvají déle, než u syntetického THC. Podle Grinspoon a Bakalar (1995) je nezpochybnitelnou výhodou konopí jako léku jeho bezpečnost. Hlavní fyziologické funkce jsou jím ovlivňovány pouze minimálně a nebyl zaznamenán žádný případ smrtelného předávkování. Cannabis je rovněž méně návyková než mnoho konvenčních léčiv typu svalových relaxantů, laxativ, hypnotik a sedativ. Nebezpečí spojená s užíváním Cannabis plynou z jejího statutu nelegální drogy. Lidé jsou nuceni shánět léčivo pochybné kvality na černém trhu, čímž se zároveň ocitají mimo zákon. Legalizace zpřístupní pacientům bezpečné kultivary s požadovaným účinkem a snadnější kontrolu přítomnosti plísní zejména rodu Aspergillus a dalších patogenů.
22
4.
Cannabis v éře genového inženýrství
Ve většině zemí jsou stanovena přísná právní omezení týkající se pěstování Cannabis, a to i pro následné experimentální účely. Sekvenování genomů a transkriptomů u organismů, na nichž není dovoleno provádět pokusy, se stává běžnou praxí. Možnou cestou jsou in silico analýzy spojené s modelováním regulačních mechanismů, které objasňují funkci genů a evoluci genomů. Základní srovnávací analýza genomů C. sativa a Arabidopsis thaliana, kterou uvedl van Bakel et al. (2011), svědčí o vysoké míře homologie, na jejímž základě je možné určit funkci řady transkripčních faktorů. Genové inženýrství a biotechnologie umožňují vytvářet kulturní rostliny se zlepšenými cílovými znaky. Je možné vnášet geny z jiných odrůd téhož druhu nebo nové geny z příbuzných druhů.
4.1 Genetická transformace Cannabis Podle Světové zdravotnické organizace (WHO) až 80 % světové populace využívá při léčbě léčivé rostliny. Až 25 % předepsaných léků obsahuje jako léčivou látku přírodní rostlinné extrakty (Tripathi a Tripathi, 2003). Nejcennějšími produkty rostlin jsou jejich sekundární metabolity. Genetická transformace umožňuje biologům cíleně zvyšovat produkci určitých sekundárních metabolitů u některých rostlinných druhů, a to zejména prostřednictvím bakterie Agrobacterium tumefaciens. Prostřednictvím biotechnologických přístupů je tak umožněn vývoj nových kultivarů s požadovanými vlastnostmi. Pro vegetativní množení konopí slouží explantátové kultury, které dále umožňují transformaci buněk prostřednictvím agrobakteria a usnadňují klonování genotypů s požadovanými vlastnostmi. Stejně tak byla kromě C. sativa prostřednictvím agrobakteria transformována např. Atropa belladonna (Yun et al., 1992). Snahy šlechtitelů o vylepšování vlastností konopí, jako je jeho rezistence k patogenům, jsou poněkud komplikovány jeho dvoudomostí (Clarke, 1999). 4.1.1 Explantátové kultury Explantátové kultury v rostlinných biotechnologiích slouží pro množení rostlin s požadovaným genotypem v podmínkách in vitro (tzv. mikropropagace), pro konzervaci genetického materiálu a genetické transformace.
23
Technika explantátových kultur je založena na vlastnosti totipotence somatických rostlinných buněk. Totipotence umožňuje regeneraci rostlin z jakýchkoli somatických buněk, tedy i z buněk modifikovaných. V rostlinných biotechnologiích se hojně využívá nediferencované pletivo, tzv. kalus, jehož homogenizací vzniká suspenzní buněčná kultura. Regenerace rostliny je možná cestou somatické embryogeneze, během níž je z jedné somatické buňky obnovena celá rostlina. Druhou možností je organogeneze , tedy indukce a diferenciace prýtových primordií (výhonů). Transformace somatických embryí umožňuje snadnou regeneraci rostlin, ale u C. sativa nebyla tato metoda úspěšná. Kultury kalusů a suspenzní kultury Cannabis mají tendenci formovat pouze kořeny. Vůči faktorům indukujícím regeneraci prýtů vykazují téměř naprostou necitlivost. Ranalli et al. (1999) jsou jediní, kteří dosáhli částečného úspěchu při regeneraci prýtů z kalusů. Z okrajů primárních explantátů rostliny (rostlinných segmentů) odvodili kalus, z něhož pomocí vhodných faktorů navodili tvorbu primordií prýtů. Takto získané prýty byly namnoženy, odděleny od sebe a přeneseny na nové zakořeňovací médium, na kterém celá rostlina regenerovala. Jako primárních explantátů využili dělohy, hypokotyl, listy, kořeny i embrya. Regenerace celé rostliny byla úspěšná pouze u děloh a hypokotylů, a to s nízkou četností. Tento postup regenerace je vhodný pro genetickou transformaci při vnášení cizích genů kódujících žádané znaky. Dalším typem kultur in vitro u konopí jsou dlouhodobé buněčné suspenzní kultury. Ve srovnání s výchozím materiálem mohou vykazovat značnou fenotypovou proměnlivost, která vzniká v průběhu vývojového cyklu explantátové kultury bez zásahu známých fyzikálních nebo chemických mutagenních faktorů, tzv. somaklonální variabilitu. Explantátová kultura se tak stává zdrojem nového typu genetické proměnlivosti, který je možné využít v biologii a následně pro šlechtění rostlin. Testováním lze identifikovat genotyp významný např. zvýšenou produkcí požadovaného metabolitu. Dlouhodobé buněčné kultury jsou využívány pro transformace a jako potencionální bioreaktory. Bioreaktory jsou buněčné kultury in vitro, které konstitutivně produkují sekundární metabolity (např. kanabinoidy) ve vysokých koncentracích (Ranalli et al., 1999). Bioreaktory z buněk C. sativa nebyly popsány. Většina studií o tkáňových kulturách C. sativa je zaměřena na produkci sekundárních metabolitů kanabinoidů (Turner et al., 1980). U Cannabis se daří zakládat stabilní buněčné kultury i kultury kalusů (Heitrich a Binder, 1982; Hartsel et al., 1983).
24
Pro konzervování genetického variability konopí byla použita kryoprezervace jeho suspenzních kultur (Jekkel et al., 1989). Alternativou kryoprezervace je konzervování klonů farmakologicky významných fenotypů in vitro (Lata et al., 2010). Podle Ranalli et al. (1999) je dále možné množení rostliny v kombinaci s vynuceným samosprášením (tzv. selfováním). Cílem je získání inbredních linií s vysokým stupněm homozygotnosti, která zaručuje genetickou stálost znaku. Postupuje se opakovaným samosprašováním
po
několik
generací,
až
je
určitý
cílový
znak
stabilizován
ve své homozygotní konstituci. Vynucené samosprášení se využívá v případě, že konkrétní genotyp je pro šlechtitele významný, například při fixování chemotypu. 4.1.2 Metody genetické transformace Metody genetických modifikací se dělí na přímé a nepřímé. Pro nepřímé transformace je využíváno bakterií rodu Agrobacterium. Jsou transformována semena, listové disky, kořeny, embrya a buňky. Mezi přímé postupy patří bombardování mikroprojektily (biolistika), elektroporace, transformace pomocí polyethylenglykolu a další. Metody přímé transformace nejsou u Cannabis běžně používány. Půdní bakterie Agrobacterium tumefaciens je rostlinný patogen zodpovědný za přirozené transformace rostlinných buněk. K infekci dochází kontaktem bakterie s poraněnými rostlinnými pletivy. Bakterie nese Ti-plazmid (tumor inducing), který je schopný začlenit do genomu hostitelské buňky oblast T-DNA a předat jí tak část genetické informace. Tímto způsobem je rostlina přirozeně transformována. T-DNA je ohraničena specifickými sekvencemi o délce 25 bp, které jsou nezbytné pro začlenění do rostlinné jaderné DNA (Gelvin, 2003). Do genomu infikované rostliny může být přenesena jakákoli sekvence DNA mezi těmito hraničními úseky. Cílový gen je do T-DNA vložen pomocí restrikčních enzymů a ligace a poté je celý konstrukt vložen zpět do bakterie. Předtím je nutné připojit k cílovému genu (transgenu) vhodné regulační sekvence jako je promotor a terminátor a součástí konstruktu je také markerový gen. Promotor je regulační úsek před kódující sekvencí zodpovědný za interakci mezi svými specifickými boxy a transkripčními faktory. Pro transformace rostlin je používán promotor viru květákové mozaiky (Cauliflower Mosaic Virus, CaMV35S) který vede ke konstitutivní expresi cílového genu, s nímž je spojen. Začleněním promotoru ve formě tetrameru se dosahuje jeho silné exprese. Terminační gen určuje zakončení sekvence transgenu na 3’ konci. Markerový gen (selekční marker) je ke konstruktu přidáván pro snazší rozpoznání úspěšné transformace buněk a jejich snadné selekce. Jako selekční marker se nejčastěji užívá gen pro rezistenci k antibiotikům. 25
Metody in vitro napodobují podmínky přirozeného procesu infekce bakterií. Jako hostitel může být zvolena široká škála rostlinných druhů, jedinou podmínkou je schopnost regenerace z buněk explantátu po infekci a transformaci. Pro transformace konopí pomocí agrobakteria se používají převážně suspenzní buněčné kultury. Tyto kultury in vitro jsou náročné na udržování, neboť vyžadují optimální regenerační a transformační podmínky. Proto vznikly nové metody in planta nevyžadující umělé udržování kultury in vitro (Chang et al., 1994). Feldmann a Marks (1987) vyvinuli metodu kokultivace klíčících semen rostliny (A. thaliana) s roztokem agrobakteria. Bylo zjištěno, že efektivnější je pracovat s celou rostlinou namísto semen. Byla vyvinuta metoda odstranění květenství a inokulace bakteriálního roztoku do vzniklých jizev (Katavic et al., 1994; Bent, 2000). Velice oblíbenou technikou in planta se stala vakuová infiltrace (Bechtold et al., 1993), která byla ještě vylepšena méně náročným namáčením květenství do roztoku agrobakteria obsahujícího smáčedlo (Clough a Bent, 1998). Metoda in planta byla u Cannabis použita například při klonování THCAS (viz kapitola 4.1.3). Transformace tkáňových kultur probíhá v pořadí: 1) volba explantátové kultury, 2) kokultivace s roztokem agrobakteria a jeho eliminace vhodným antibiotikem, 3) selekce transformovaných buněk a následná regenerace celé rostliny. MacKinnon (2000) úspěšně transformoval prýt C. sativa prostřednictvím A. tumefaciens nesoucím transgen pro rezistenci k infekci houbovým patogenem Botrytis cinerea. 4.1.3 Klonování genů pro klíčové enzymy Klonování DNA (genové, molekulární klonování) je definováno jako vložení segmentu DNA do klonovacího vektoru za vzniku rekombinantní molekuly DNA a její přenos do hostitelského organismu. Nově vzniklí geneticky identičtí jedinci obsahují molekuly rekombinantní DNA. Tyto modifikované organismy je možné dále množit, pěstovat a využívat jejich produkty. Cílem je zvyšování počtu identických molekul rekombinantní DNA. Klonuje se postupy in vivo a in vitro. Při metodě in vivo je nejprve gen zabudován do samostatně se replikujícího chromozomu a poté je vložen do hostitelské buňky, kde se rekombinantní molekula množí. Klonování in vitro je možné, pokud jsou známy sekvence na obou koncích DNA. To umožní navržení primerů, které komplementárně nasedají, a následnou amplifikaci pomocí PCR. Výsledný produkt je ověřován in vivo. Primárním cílem genového inženýrství u C. sativa je studium klíčových enzymů syntézy kanabinoidů a jejich následná homologní či heterologní exprese, konkrétně jejich nadprodukce prostřednictvím zvýšené exprese genu. Pomocí homologní exprese jsou produkovány látky, které jsou v rostlině přirozeně obsaženy. Naproti tomu heterologní 26
exprese spočívá ve vložení genů kódujících proteiny cizí hostitelskému organismu. Heterologní exprese THCAS byla doposud provedena v buňkách tabáku, hmyzu (Sirikantaramas et al., 2004) a v kvasinkách (Taura et al., 2007). V případě C. sativa je zajímavá možnost vložení genu kódujícího THCAS do jiného vytrvalého druhu, aby nemusela být jednoletá bylina C. sativa každoročně vysévána. Dosud byly naklonovány geny THCAS, CBDAS a OLS, které kódují syntázy hlavních kanabinoidů. První zprávu o molekulární charakterizaci enzymu specifického pro biosyntézu kanabinoidů publikovali Sirikantaramas et al. (2004). Z rychle rostoucích listů typu „drug“ C. sativa byla extrahována THCAS a byla analyzována její aminokyselinová sekvence. Dále byla klonována cDNA genu THCA syntázy. Pro klonování a expresi genu THCAS byla zvolena rostlinná heterologní exprese v suspenzní kultuře kořenů Nicotiana tabacum, ze které byla izolována mRNA a z ní následně reverzní transkripcí připravena cDNA. Fragmenty cDNA vzniklé pomocí odstupňované PCR byly následně klonovány do vektoru pUC119, kterým byly transformovány chemokompetentní kolonie Escherichia coli Top10F‘. Produkty byly sekvenovány a srovnány mezi sebou pro potvrzení identity sekvence cDNA se sekvencí aminokyselin v THCAS. Cílová sekvence byla vystřižena a znovu naklonována do nového vektoru pBI121 pod řízením promotoru CaMV35S. Plazmidový konstrukt byl zaveden do A. rhizogenes a bakteriální roztok byl in planta injikován do tabákových buněk. Transformanti vyrostli ve formě tabákových kořenů díky současnému začlenění bakteriálních genů zodpovědných za tvorbu kořenů. Tento pokus prokázal, že tabák může produkovat aktivní THCA syntázu. Pokud byl enzymu poskytnut substrát (CBGA), produkovaly kořeny THCA a tím bylo potvrzeno, že exprimovaný gen kóduje funkční enzym. Úspěšnost transformace může znamenat potenciální způsob syntézy THC a možnost řízené produkce THC rostlinou. Při nadprodukci genu by mohly vzniknout rostliny bohaté na THCA. Klonování enzymu THCAS je klíčovým krokem pro kontrolu a produkci rostlinných kanabinoidů pro medicínské účely. Otevřený čtecí rámec genu THCAS o délce 1635 nt kóduje peptid tvořený 545 aminokyselinami, z nichž prvních 28 tvoří signální sekvenci. Předpokládaná hmotnost polypeptidu složeného z 517 aminokyselin je 58,6 kDa. Kromě charakteristiky nativní formy enzymu THCAS bylo také třeba určit, jaký kofaktor či koenzym je reakcí vyžadován. Srovnávací analýzy bioinformatickými nástroji ukázaly, že tato aminokyselinová sekvence má 40,2% homologii a je tedy blízce evolučně příbuzná s enzymem berberinových můstků (BBE) rostliny sluncovka kalifornská (Eschscholtzia californica) z čeledi Papaveraceae. Enzym BBE je součástí biosyntézy alkaloidů. Ačkoli se tedy jedná o enzymy odlišných 27
biosyntetických drah sekundárních metabolitů (kanabinoidy a alkaloidy), mechanismus katalýzy (oxidativní cyklizace) je stejný. V obou případech se jedná o FAD-dependentní enzymy. Pro ověření funkčnosti bylo třeba purifikovat dostatečné množství enzymu THCAS. Jelikož z tekuté kultury tabákových kořenů nebylo možné izolovat dostatečné množství THCAS,
byla
použita
nadprodukce
rekombinantního
enzymu v hmyzích buňkách
infikovaných bakulovirem. Největší koncentrace THCAS byla naměřena v mediu, tedy většina enzymu byla produkována extracelulárně. Enzym byl purifikován a dále biochemicky analyzován. Purifikace ukázala, že se enzym nachází ve směsi s FAD, v molárním poměru 1 : 1. Dalšími testy bylo potvrzeno, že THCAS je skutečně FAD-dependentní enzym. Taura et al. (2007a) pokračovali ve studiu heterologní exprese genu THCAS. Transgenní buňky tabákových kořenů konvertovaly CBGA na THCA s 8% účinností a exprese v hmyzích buňkách byla finančně i technologicky náročná. Bylo proto třeba vyvinout efektivnější systém, který by umožnil snadnou a dostupnou biotechnologickou produkci THCA. Výroba substrátu CBGA je totiž snadná a z nasyntetizovaného THCA se samotné
THC
získává
prostým
působením
tepla.
Pro
transformaci
vektorem
pPICZ B s genem THCAS byly zvoleny buňky metylotrofní kvasinky Pichia pastoris SMD 1168 h. Úroveň exprese genu THCAS byla nízká, studie však umožnila podrobný výzkum vlivu různých podmínek na růst buněk a produkci THCAS. Kvasinkami sekretovaná THCAS konvertovala THCA z CBGA s 98% úspěšností. Průměrná hmotnost enzymu je 79 kDa, což je mnohokrát více, než je teoretická hodnota u nativního enzymu (58,6 kDa). Enzym byl dále purifikován a vykazoval dokonce vyšší aktivitu, než THCAS purifikovaná z C. sativa. Šlo o první studii, kdy se zdařila efektivní exprese rekombinantního enzymu THCAS. CBDAS je druhým enzymem souvisejícím s biosyntézou kanabinoidů, který byl charakterizován, a gen CBDAS byl úspěšně klonován. Taura et al. (2007b) izolovali CBDAS z rychle rostoucích listů C. sativa typu „fibre“ . CBDAS byla purifikována a byla určena její sekvence.
Sekvence
o
délce
1632
bp
ORF
kóduje
polypeptid
tvořený
544 aminokyselinami, 28 z nich je signální sekvence. Zralá syntáza se skládá z 516 aminokyselin a předpokládá molekulární hmotnost je 58,9 kDa. Byla extrahována RNA, reverzní transkriptázou získána cDNA a pomocí opakovaných PCR byl získán a amplifikován fragment cDNA kódující CBDAS. Tento fragment byl vložen do vektoru pFastBac1 a byl připraven rekombinantní bakulovirus nesoucí gen CBDAS, kterým byla infikována suspenzní kultura buněk můry blýskavky kukuřičné (Spodoptera frugiperda). Rekombinantní enzym 28
CBDAS byl katalyticky aktivní, avšak jeho aktivita byla výrazně nižší než u jeho nativní formy. Aby byl pomocí HPLC detekovatelný, bylo nutné prodloužit dobu inkubace suspenzní kultury buněk můry. Tato snížená aktivita vedla k hypotéze o dalších existujících genech pro syntézu CBDA. Následně byly naklonovány geny CBDAS2 a CBDAS3, ovšem jejich rekombinantní formy nevykazovaly žádnou enzymatickou aktivitu a hypotéza nebyla potvrzena. Slabá enzymatická aktivita CBDAS je pravděpodobně dána odlišným sbalováním proteinu v buňce hmyzu a rostliny, které plyne z rozdílného mechanismu proteinové syntézy. Bylo zjištěno, že míra homologie THCAS a CBDAS je 83,9 % a také mechanismus jejich syntézy je podobný. V obou případech se jedná o kovalentně flavinylované oxidázy, které pro reakci vyžadují molekulu FAD a kyslík. CBDAS také vykazuje vysokou míru homologie s BBE (40-50% identita), což ukazuje na podobnost s THCAS. Na základě tohoto evolučního srovnání je proto velice pravděpodobné, že byly původně jedním enzymem a mutacemi došlo k substitucím aminokyselin. Gen OLS kódující syntázu kyseliny olivetové (OLS) je dalším úspěšně klonovaným genem (Taura et al., 2009). OLS katalyzuje vznik kyseliny olivetové (OLA). Izolací RNA z rychle rostoucích listů C. sativa typu „drug“ a reverzní transkripcí byla získána cDNA, ze které byly pomocí PCR vytvořeny různé fragmenty cDNA a všechny byly klonovány do vektoru pUC119 a sekvenovány. Následně byla amplifikována DNA o plné délce a klonována do vektoru pUC119 s cílem sekvenace. Poté byl pomocí restrikčních enzymů vystřižen specifický úsek a spojen s expresním vektorem pET24. Tento konstrukt byl přenesen do buněk E. coli BL21. Gen OLS je dlouhý 1185 bp, enzym tvoří 385 aminokyselin a molekulární hmotnost je 42,6 kDa. Aminokyselinová sekvence enzymu OLS vykazuje 60-70% podobnost s rostlinnými polyketidsyntázami. Rekombinantní OLS byla syntetizována v buňkách E. coli, z nich poté purifikována a analyzována pomocí SDS-PAGE. Měřením aktivity OLS bylo zjištěno, že syntáza neprodukovala přímo kyselinu olivetovou, ale její dekarboxylovanou formu olivetol. V nativní formě je však OLA produkována za přítomnosti OLS, neboť OLA i OLS byly v největších koncentracích izolovány z květů a rychle rostoucích listů. Možné faktory, které ovlivňují syntézu OLA, jsou např. načasování hydrolýzy a cyklizace reakcí katalyzovaných OLA syntázou. Je proto nutný další výzkum tohoto enzymu. Byl popsán enzym, který katalyzuje první z kaskády reakcí při vzniku kanabinoidů (Fellermeier
a
Zenk,
1998).
Enzym
geranylpyrofosfát:olivetolát
geranyltransferáza
je zodpovědný za reakci kyseliny olivetové (OLA) s geranylpyrofosfátem. Produktem reakce je CBGA, která je prekurzor THCA. Klonování enzymu by mělo následovat v dalších 29
studiích. Umlčování genu zodpovědného za syntézu CBGA u kultivarů s komerčním využitím by mohlo dát vzniknout novým kultivarům, které nebudou zneužívány kvůli psychoaktivitě svých metabolitů.
30
4.2 Metody hodnocení obsahu aktivní látky Obsah a složení aktivních látek rostliny je možné určit biochemickými a molekulárními metodami, které jsou u C. sativa oproti klasickým biochemickým analýzám využívány méně často. 4.2.1 Chemická analýza Biochemické testy se používají pro identifikaci vzorku (odlišení léčebného konopí od technického a stanovení kultivaru), určení jeho geografického původu a pohlaví rostliny. Hlavní chemickou metodou pro identifikaci a kvantifikaci kanabinoidů je plynová chromatografie kombinovaná s hmotnostní spektrometrií (GC-MS) (Bruci et al., 2012). Hillig a Mahlbergh (2004) použili pro chemotaxonomickou analýzu plynovou chromatografii, která je pro chemotaxonomické účely a při rozboru obsahu kanabinoidů a terpenoidů běžně užívána. Metoda plynové chromatografie má však svá omezení. V živých rostlinách se nachází převážně kanabinoidové kyseliny a ty zahřátím na vysokou teplotu přímou plynovou chromatografií dekarboxylují na své neutrální formy, kanabinoidy. Plynovou chromatografií proto můžeme určit pouze celkový obsah kanabinoidů. Pro stanovení hladiny kyselin se jako dílčí krok využívá vysoce účinná kapalinová chromatografie (HPLC), kterou jsou detekovány kyseliny i kanabinoidy (McDonald a Gough, 1984; Rustichelli et al., 1998). Bylo vyvinuto mnoho typů HPLC pro detekci metabolitů v celé rostlině či v konopném oleji (Pellegrini et al., 2005). Další chemickou analýzou je nukleární magnetická rezonance (1H NMR), která je běžně používána pro identifikaci a charakteristiku hlavních kanabinoidů zastoupených v rostlině (Choi et al., 2004). 1H NMR byla také použita k chemotypizaci vodních extraktů a tinktur Cannabis (Politi et al., 2008). Významným přístupem při studiu rostlinné biochemie, chemotaxonomie, ekologie, farmakologie a kontroly kvality léčivých rostlin je otisk (tzv. fingerprinting), známý také jako metabolický
profil.
Je
při
něm
kombinována
plynová
chromatografie,
HPLC,
1
MS a nebo H NMR (van der Kooy et al., 2009). Cílem chemického otisku konopí je kvantifikovat skupinu či skupiny sloučenin v daném jedinci či skupině jedinců. Navzdory své oblíbenosti by chemické analýzy sloužící k identifikaci a klasifikaci vzorků Cannabis mohly být nahrazeny metodou genové kvantifikace, ovšem za předpokladu, že existuje korelace mezi počtem kopií genu THCAS a jeho produktem THC. RT-PCR však
31
nepotvrdila korelaci mezi úrovní exprese genu THCAS a množstvím THC v rostlině (Kojoma et al., 2006) a proto metoda genové kvantifikace nemá význam. 4.2.2 Genotypizace Analýza DNA se využívá při identifikaci druhu (Siniscalco Gigliano et al., 1997) a následné typizaci jedince, která souvisí s určením jeho původu. Pokud se konopí množí vegetativně, vznikají rostlinné klony, tedy kopie s identickými genotypy, čehož se využívá při rozboru vzorků k dohledání nejbližšího společného předka dané rostliny a případné identifikaci původu (Mandolino a Carboni, 2004). V současnosti jsou testy DNA užitečné také v případech, kdy množství aktivních látek obsažené ve vzorku je natolik malé, že citlivost biochemických metod není dostatečná, k čemuž dochází např. u semen, pylu, stopových zbytků kořínků nebo úlomků listů a rozkládajících se či částečně spálených vzorků. Rostlinné buňky obsahují dva typy DNA, jadernou a mimojadernou, z nichž je u Cannabis zkoumána pouze chloroplastová DNA (cpDNA). Výhodou cpDNA je velký počet jejích kopií v buňce (Wilkinson a Linacre, 2000). Potenciál jejího využití však není velký, neboť vykazuje pouze malý polymorfismus, který je dán tím, že prodělala malou evoluci struktury DNA a úroveň substitucí je nízká (Mandolino a Carboni, 2004). K identifikaci Cannabis slouží nejčastěji jaderná DNA. Molekulární studie jaderné DNA C. sativa jsou používány pro její individualizaci, genovou charakteristiku a selekci na základě markerů
(MAS,
marker
assisted
selection).
Genotypizace
Cannabis
je
založená
na molekulárních markerech a jejich analýze. Mezi markery analyzované u Cannabis patří allozymy (izoenzymy), polymorfismy délek restrikčních fragmentů (RFLPs), polymorfismy náhodně amplifikované DNA (RAPDs), polymorfismy délek amplifikovaných fragmentů (AFLPs), mikrosatelity, vnitřní přepisované mezerníky (ITSs), polymorfismy sekvencí mezi dvěma mikrosatelity (ISSRs) a jednonukleotidové polymorfismy (SNPs). Izoenzym (izozym) je kterákoli varianta téhož enzymu katalyzující stejnou reakci. Od jiných variant enzymu se liší primární strukturou aminokyselinové sekvence. Je možné je poznat místem výskytu v organismu, podle rozdílné elektroforetické pohyblivosti nebo podle biochemických vlastností. Izoenzymy, potažmo allozymy (enzymy produkované různými alelickými formami jednoho genu), byly prvními markery využitými ke studiu variability konopí (Hillig, 2005). Variabilita allozymů je vytvářena přirozenými mutacemi DNA a jednotlivé allozymy se mezi sebou liší jednou či více aminokyselinami, což je detekovatelné gelovou elektroforézou. Genetická variabilita vzorku je sledována na úrovni produktů transkripce. 32
Druhým markerem, který byl použit ve šlechtění rostlin, je RFLP. Polymorfismus je dán rozdíly v počtu a velikosti restrikčních fragmentů vytvářených štěpením genomových DNA dvou a více jedinců téhož druhu určitou restrikční endonukleázou. Technologie RFLP není ve výzkumu konopí využívána, protože po objevu PCR (1983) byly rozvíjeny zejména postupy založené na PCR. RFLP je navíc pracná a zdlouhavá (Alghanim a Almirall, 2003). Pro konopí v současnosti neexistují žádné RFLP markery, které by byly zaneseny v dostupných molekulárních mapách. Analýza RAPD využívá PCR, při níž je náhodně vybrán jediný primer, který se na DNA váže náhodně na nespecifických místech. Výsledkem je soubor amplikonů charakteristický pro daný organismus. Detekce RAPD je u C. sativa úspěšně používána zejména u vegetativně množených rostlin pro forenzní a pěstitelské účely (Congiu et al., 2000), často také pro doplnění chromatografických rozborů. Je vhodná pro rozlišování mezi kultivary (Siniscalco Gigliano et al., 1997). Je velmi rychlá a levná, ale na druhou stranu málo spolehlivá pro svou špatnou reprodukovatelnost (různé laboratoře získávají různá spektra polymorfismů). Proto byla vyvinuta spolehlivější a snadnější metoda markerů SCAR, což jsou specifické fragmenty ve vazbě s cílovou sekvencí (Mandolino et al., 1999; Forapani et al., 2001). Další posun přišel s vývojem markerů AFLP. Při této typizační metodě je selektivně amplifikován soubor fragmentů DNA, který byl vytvořen štěpením většinou dvěma restrikčními endonukleázami. Amplifikované fragmenty jsou dnes běžně značeny fluorescenčně a detekovány kapilární elektroforézou. Metoda je výborná pro genotypizaci a pro odlišení blízce příbuzných jedinců inbredních linií. Oproti analýze RAPD je spolehlivě reprodukovatelná (Mandolino a Carboni, 2004), protože metodiky jsou dnes propracované a vykazují vysoký stupeň polymorfismu. Je ovšem poměrně finančně náročná (Reddy et al., 2002). Pomocí markerů AFLP jsou často konstruovány genetické mapy, které usnadňují lokalizaci genů. Ve výzkumu konopí a při tvorbě genetických map se markery AFLP významně uplatňují, existuje minimálně jedna genetická mapa C. sativa na podkladě těchto markerů. Mikrosatelity (SSR, STR) jsou krátké repetitivní sekvence založené na motivu dvou až pěti nukleotidů, které jsou mezi jedinci variabilní. Vyskytují se hojně v celém eukaryotickém genomu a jsou nejčastějšími markery pro testování genetické identity lidí, a nachází se i u rostlin (Hsieh et al., 2003). Skóre evolučních změn uvnitř mikrosatelitů je vyšší oproti jiným typům DNA a proto jsou velmi polymorfní (Reddy et al., 2002). Tento typ polymorfismu má dobrou reprodukovatelnost a umožňuje rychlou a přesnou detekci 33
polymorfních míst, avšak tato technika je finančně i časově náročná (Kojoma et al., 2002). Analýza mikrosatelitů vyžaduje PCR se specifickými primery, které rozpoznají místo na jaderné DNA. Primery jsou navrhovány podle sekvence nukleotidů v okolí mikrosatelitů (tzv. flanking sequences). Pořadí nukleotidů v okolí mikrosatelitů je přesné a specifické pro daný mikrosatelit (Reddy et al., 2002). U C. sativa byly první mikrosatelity identifikovány teprve nedávno (Hsieh et al., 2003). Podle Alghanim a Admirall (2004) jsou mikrosatelity užitečné při analýzách směsných rostlinných vzorků konopí a nejčastěji opakujícím se motivem v DNA konopí je dinukleotid GA/CT (50 % mikrosatelitů), dále potom trinukleotidy GTT/CAA, AAG/TTC a GAT/CTA (16 %, 15 % a 10 % mikrosatelitů). Velice citlivou technikou je analýza oblastí ITS. Míra polymorfismu ITS je dostatečně velká pro srovnání uvnitř taxonomicky omezené skupiny. U Cannabis byly identifikovány ITS1 a ITS2 v jaderné ribozomální DNA (Siniscalco Gigliano et al., 1997). Pomocí amplifikace a sekvenace bylo dokázáno, že ITS jednoznačně odliší C. sativa od jiných druhů, dokonce i od příbuzného chmele otáčivého. Kohjyouma et al. (2000) identifikovali vnitrodruhové rozdíly v genomu několika vzorků C. sativa. Analyzovali sekvenci vnitřního přepisovaného mezerníku chloroplastové DNA a vybrali nekódující oblasti, které mají vyšší četnost mutací. Byla vyvinuta technika fingerprintu neboli otisku genetických polymorfismů pomocí ISSR markerů (Prevost a Wilkinson, 1999). Technika ISSR je založená na amplifikaci úseků mezi identickými mikrosatelity orientovanými obráceně. Komplementární sekvence k těmto mikrosatelitům slouží jako primery pro amplifikaci. Produktem PCR reakce je směs krátkých fragmentů, které se liší v délce. Reprodukovatelnost metody je vysoká a ISSR markery jsou vysoce polymorfní (Reddy et al., 2002). Tato rychlá a levná technika se používá k určení příbuznosti mezi populacemi, genetickému otiskování, identifikaci kultivarů, fylogenetické analýze, mapování a k identifikaci genové stability (Lata et al., 2010). Srovnáním účinnosti RAPD a ISSR při analýze C. sativa bylo zjištěno, že jsou podobné, pouze technika ISSR má vyšší reprodukovatelnost (Reddy et al., 2002). Podle Kayise et al. (2010) mohou být obě metody díky srovnatelným vlastnostem a finanční dostupnosti používány současně v laboratořích se základním molekulárně biologickým zázemím. Pro vzájemně srovnatelné vlastnosti a podobnou finanční dostupnost mohu být obě metody používány v laboratořích se základním molekulárně biologickým vybavením současně (Kayis et al., 2010). Systémy založené na analýze markerů jako RAPD, RFPL, AFLP a SSR, které jsou v oblibě poslední desetiletí, vyžadují detekci polymorfních fragmentů na gelu a jsou proto 34
časově i finančně náročné. SNP patří mezi markery nové generace, které detekci na gelu nevyžadují. SNP jsou místa, kde se DNA liší v jednom nukleotidu od původní sekvence. Jedná se o nejhojněji zastoupený typ polymorfismu, který je možné najít v sekvenci každého genomu. Nejlépe jsou prozkoumány v genomu člověka. U rostlin byly zatím SNP zkoumány u několika druhů jako je huseníček, kukuřice, ječmen a vinná réva (Lijavetzky et al., 2007). Analýza SNP je spolehlivá a reprodukovatelná, polymorfismy jsou stabilní a mají vysokou míru dědičnosti. Ve srovnání s mikrosatelity jsou markery SNP variabilnější a vyskytují se ve vyšší frekvenci (Gupta et al., 2001). Z tohoto důvodu jsou vhodné pro identifikaci kultivarů, konstrukci genetických map, hodnocení genetické diverzity, určení vazby mezi genotypem a fenotypem a pro asistovanou selekci ve šlechtění. V genomu se mohou SNP nacházet v kódujících či regulačních oblastech, stejně jako v repetitivních nekódujících oblastech. SNP nacházející se v kódující oblasti kosegregují s pozorovaným znakem, čehož se využívá při asistované selekci. Hustotu SNP je možné předpovědět podle počtu mikrosatelitů (Lijavetzky et al., 2007). Rotherham a Harbison (2011) použili analýzu SNP pro rozlišení mezi „legálním” (s nižším obsahem THC) a „nelegálním” (s vyšším obsahem THC) chemotypem C. sativa. Na základě záměn specifického nukleotidu bylo možné rozdělit populaci do několika skupin podle míry příbuznosti. Molekulární markery nejsou využívány pouze pro identifikaci vzorku a jeho genotypizaci pro forenzní a systematické účely (určování příbuznosti), ale i pro zefektivnění šlechtění rostlin. Po identifikaci dostatečného počtu těsně vázaných markerů je možné vytvářet fyzické mapy. Při znalosti genetické mapy daného druhu a lokalizace genu kódujícího cílový znak je možná MAS. Počátky MAS ve šlechtění konopí sahají do poloviny 90. let. Prostřednictvím MAS je možné identifikovat vzorek, určit jednotlivé kultivary konopí či odlišit technický typ od léčebného. Pozornost se dnes zaměřuje především na identifikaci genů zodpovědných za kvalitu a množství vlákniny a na určení jednodomosti. Jsou také vyvíjeny markery pro potenciálně užitečné léčebné chemotypy konopí (Mandolino a Carboni, 2004). 4.2.3 Nové přístupy chemické klasifikace zohledňující terapeutický přínos Obliba konopí jako léčebného prostředku v mnoha státech podstatně vzrostla. Otázkou zůstává, který z rozsáhlé množiny kultivarů by měl být oficiálně dostupný pro lékařské použití, neboť jsou zaznamenány i vzácné případy odlišných účinků jednoho kultivaru marihuany oficiálně schváleného pro lékařské účely, případně názory uživatelů, že oficiální kultivary nemají léčivé účinky. Dosavadní klasifikace vycházející z chemického složení 35
sekundárních metabolitů je užitečná pro účely forenzních věd při identifikaci lékařského a technického konopí. Zastoupení biologicky aktivních terpenoidů není touto klasifikací zohledňováno. Hazekamp a Fischedick (2012) navrhli nový klasifikační systém zohledňující chemické zastoupení nejen hlavních kanabinoidů, ale i všech potenciálně aktivních složek v různých kultivarech C. sativa (dohromady bylo analyzováno 28 hlavních složek). Analýzou hlavních komponent (PCA analýza) kvantitativních dat byly vytvořeny chemicky odlišné skupiny, tzv. chemovary. Ověřením účinků na zvířatech a klinickými studiemi byl následně popsán vztah mezi konkrétním chemovarem a jeho biologickými účinky. Tímto způsobem byla vytvořena nová komplexní klasifikace, která zohledňuje jak chemické složení, tak biologické účinky, a je tedy relevantní pro medicínu. Hlubší zkoumání chemovarů C. sativa, zejména rozšiřování počtu testovaných vzorků, umožní uživatelům vybrat si účinný a spolehlivý zdroj léčivé látky, dávkované ve správném množství.
36
5.
Závěr
Cannabis sativa je jedna z nejstarších člověkem pěstovaných rostlin využívaných v lékařství, ale současně v průběhu své historie vzbuzuje nejvíce kontroverze. Výzvou pro moderní medicínu a vědu je, zda dokážeme využít potenciál jejích vlastností a zajistit dostupnost bezpečných odrůd pro léčbu. Objev kanabinoidů a endokanabinoidního systému znamenal pochopení řady fyziologických procesů v těle, jako je regulace krevního tlaku, neuroprotekce, paměť a případně úzkostné stavy. Bylo také zjištěno, že syntetické analogy kanabinoidů mají menší léčivé účinky než galénika. K těmto pokrokům došlo díky úspěšné spolupráci mezi chemiky, biochemiky, molekulárními biology, farmakology a fyziology. Řešení problematiky prostřednictví spolupráce mezi vědními obory je obecný trend současné systémové biologie. Medicína v 21. století má před sebou mnoho nezodpovězených otázek. Odpovědi na některé z nich by mohla poskytnout právě rostlina Cannabis sativa. Její terapeutický potenciál, který byl téměř zapomenut, je dnes znovu objevován při léčbě chronické bolesti, spasticity, rakoviny, křečí, nevolností, podvýživy a některých infekčních onemocnění. Ukázalo se, že je důležitý další výzkum vedoucí k vytvoření nového klasifikačního systému (na základě jednotek chemovarů) s relevantním vztahem k terapeutickému využívání této rostliny. Je proto nutné rozvíjet dále metody MAS, zejména pak vyvíjet markery asociované s požadovanými farmaceutickými vlastnostmi Cannabis. Nejvíce perspektivní význam pro šlechtění konopí mají např. markery AFLP, ITS, ISSR a mikrosatelity. Klonování některých důležitých enzymů syntézy kanabinoidů (THCAS, CBDAS, OLS) je významným pokrokem, díky němuž byla objasněna jejich struktura a některé reakční podmínky. Výzkum v oblasti genomiky konopí bude pokračovat charakterizací dalších významných genů. Genové inženýrství by v budoucnosti mohlo vést k získání transformantů efektivně produkujících aktivní látky. Potenciál má i produkce metabolitů v suspenzních buněčných kulturách (tzv. bioreaktorech), nebo exprese genů syntézy v heterologních organismech. Ve většině zemí je nakládání s konopím i pro vědecké účely značně omezeno, což brání pokroku v dalším poznání. Mnoho států však v současnosti aktualizuje legislativu týkající se konopí, aby bylo možné maximální využití jeho potenciálu pro lékařské účely.
37
Právě to je cílem intenzivních výzkumných projektů, které probíhají v zemích jako Nizozemí a Kanada.
38
6. Seznam použité literatury Adams I. B., Compton D. R. a Martin B. R. 1998. Assessment of anandamide interaction with the cannabinoid brain receptor: SR 141716A antagonism studies in mice and autoradiographic analysis of receptor binding in rat brain. J. Pharmacol. Exp. Ther., 284: 1209-1217. Alghanim H. J. a Almirall J. R. 2003. Development of microsatellite markers in Cannabis sativa for DNA typing and genetic relatedness analyses. Anal. Bioanal. Chem., 376: 1225-1233. Beal J. E., Olson R., Laubenstein L., Morales J. O., Bellman P., Yangco B., Lefkowitz L., Plasse T. F. a Shepard K. V. 1995. Dronabinol as a treatment for anorexia associated with weight-loss in patients with AIDS. J. Pain Symptom Manage., 10: 89-97. Bechtold N., Ellis J. a Pelletier G. 1993. In planta Agrobacterium-mediated gene transfer by infiltration of adult Arabidopsis thaliana plants. Comptes Rendus Acad. Sci. Ser. IIISci. Vie-Life Sci., 316: 1194-1199. In: Bechtold N., Jaudeau B., Jolivet S., Maba B., Vezon D., Voisin R. a Pelletier G. 2000. The maternal chromosome set is the target of the T-DNA in the in planta transformation of Arabidopsis thaliana. Genetics, 155: 1875-1887. Bent A. F. 2000. Arabidopsis in planta transformation. Uses, mechanisms, and prospects for transformation of other species. Plant Physiol., 124: 1540-1547. Bruci Z., Papoutsis I., Athanaselis S., Nikolaou P., Pazari E., Spiliopoulou C. a Vyshka G. 2012. First systematic evaluation of the potency of Cannabis sativa plants grown in Albania. Forensic Sci.Int., 222: 40-46. Carlini E. A., Santos M., Claussen U., Bieniek D. a Korte F. 1970. Structure activity relationship of 4 tetrahydrocannabinols and pharmacological activity of 5 semipurified extracts of Cannabis sativa. Psychopharmacologia, 18: 82-93. Chang S. S., Park S. K., Kim B. C., Kang B. J., Kim D. U. a Nam H. G. 1994. Stable genetic transformation of Arabidopsis thaliana by Agrobacterium inoculation in planta. Plant J., 5: 551-558. Choi Y. H., Hazekamp A., Peltenburg-Looman A. M. G., Frederich M., Erkelens C., Lefeber A. W. M. a Verpoorte R. 2004. NMR assignments of the major
39
cannabinoids and cannabiflavonoids isolated from flowers of Cannabis sativa. Phytochem. Anal., 15: 345-354. Clarke R. C. 1999. Botany of the genus Cannabis. In: Ranalli P. (ed.) Advances in hemp research. New York, Food Products Press- imprint Haworth Press, 185-208. Clough S. J. a Bent A. F. 1998. Floral dip: a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana. Plant J., 16: 735-743. Congiu L., Chicca M., Cella R., Rossi R. a Bernacchia G. 2000. The use of random amplified polymorphic DNA (RAPD) markers to identify strawberry varieties: a forensic application. Mol. Ecol., 9: 229-232. Cravatt B. F., Giang D. K., Mayfield S. P., Boger D. L., Lerner R. A. a Gilula N. B. 1996. Molecular characterization of an enzyme that degrades neuromodulatory fatty-acid amides. Nature, 384: 83-87. De Backer B., Debrus B., Lebrun P., Theunis L., Dubois N., Decock L., Verstraete A., Hubert P. a Charlier C. 2009. Innovative development and validation of an HPLC/DAD method for the qualitative and quantitative determination of major cannabinoids in Cannabis plant material. J. Chromatogr., B: Anal. Technol. Biomed. Life Sci., 877: 4115-24. De Meijer E. P., Bagatta M., Carboni A., Crucitti P., Moliterni V. M., Ranalli P. a Mandolino G. 2003. The inheritance of chemical phenotype in Cannabis sativa L. Genetics, 163: 335-46. Devane W. A., Dysarz F. A., Johnson M. R., Melvin L. S. a Howlett A. C. 1988. Determination and characterization of a cannabinoid receptor in rat brain. Mol. Pharmacol., 34: 605-613. Feldmann K. A. a Marks M. D. 1987. Agrobacterium-mediated transformation of germinating seeds of Arabidopsis thaliana - a non-tissue culture approach. Mol. Gen. Genet., 208: 1-9. Fellermeier M. a Zenk M. H. 1998. Prenylation of olivetolate by a hemp transferase yields cannabigerolic acid, the precursor of tetrahydrocannabinol. FEBS Letters, 427: 283-285. Fetterman P. S., Keith E. S., Waller C. W., Guerrero O., Doorenbos N. J. a Quimby M. W. 1971. Mississippi-grown Cannabis sativa L. - Preliminary observation on chemical definition of phenotype and variations in tetrahydrocannabinol content versus age, sex, and plant part. J. Pharm. Sci., 60: 1246-1249. Fisar Z. 2006. Endocannabinoids. Chem. Listy, 100: 314-322. 40
Fisar Z. 2008. Cannabinoids and mental disorders. Čes. a slov. Psychiat., 104: 297 -307. Fisar Z. 2009. Phytocannabinoids and endocannabinoids. Curr. drug abuse rev., 2: 51-75. Fischedick J. T., Hazekamp A., Erkelens T., Choi Y. H. a Verpoorte R. 2010. Metabolic fingerprinting
of
Cannabis
sativa
L.,
cannabinoids
and
terpenoids
for chemotaxonomic and drug standardization purposes. Phytochemistry, 71: 2058-73. Forapani S., Carboni A., Paoletti C., Cristiana V. M., Ranalli N. P. a Mandolino G. 2001. Comparison of hemp varieties using random amplified polymorphic DNA markers. Crop Sci., 41: 1682-1689. French E. D., Dillon K. a Wu X. F. 1997. Cannabinoids excite dopamine neurons in the ventral tegmentum and substantia nigra. Neuroreport, 8: 649-652. Gaoni Y. a Mechoulam R. 1964. Isolation, structure, and partial synthesis of an active constituent of hashish. J. Am. Chem. Soc., 86: 1646-1647. Garcia C., Palomo-Garo C., Garcia-Arencibia M., Ramos J. A., Pertwee R. G. a Fernandez-Ruiz J. 2011. Symptom-relieving and neuroprotective effects of the phytocannabinoid Delta(9)-THCV in animal models of Parkinson's disease. Br. J. Clin. Pharmacol., 163: 1495-1506. Gelvin S. B. 2003. Agobacterium-mediated plant transformation: The biology behind the "gene-jockeying" tool. Microbiol. Mol. Biol. Rev., 67: 16-37. Grinspoon L. a Bakalar J. B. 1995. Marijuana as medicine - a plea for reconsideration. J. Am. Med. Assoc., 273: 1875-1876. Gupta P. K., Roy J. K. a Prasad M. 2001. Single nucleotide polymorphisms: A new paradigm for molecular marker technology and DNA polymorphism detection with emphasis on their use in plants. Curr. Sci., 80: 524-535. Hampson A. J., Grimaldi M., Axelrod J. a Wink D. 1998. Cannabidiol and (-)Delta(9)-tetrahydrocannabinol are neuroprotective antioxidants. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 95: 8268-8273. Hanus L. O. 2009. Pharmacological and therapeutic secrets of plant and brain (endo) cannabinoids. Med. Res. Rev., 29: 213-271. Hartsel S. C., Loh W. H. T. a Robertson L. W. 1983. Biotransformation of cannabidiol to cannabielsoin by suspension cultures of Cannabis sativa and Saccharum officinarum. Planta Med., 48: 17-19. Hazekamp A. a Fischedick J. T. 2012. Cannabis - from cultivar to chemovar. Drug Test. Anal., 4: 660-667.
41
Hazekamp A., Ware A. M., Muller-Vahl K. R., Abrams D. a Grotenhermen F. The medicinal use of Cannabis and cannabinoids - an international cross-sectional survey on administration forms. IACM-Bulletin [online]. 2012 [cit. 3. dubna 2013].
Heitrich A. a Binder M. 1982. Identification of (3r,4r)-Delta1(6)-tetrahydrocannabinol as an isolation artifact of cannabinoid acids formed by callus cultures of Cannabis sativa L. Experientia, 38: 898-899. Hill A. J., Weston S. E., Jones N. A., Smith I., Bevan S. A., Williamson E. M., Stephens G. J., Williams C. M. a Whalley B. J. 2010. Delta 9-tetrahydrocannabivarin suppresses in vitro epileptiform and in vivo seizure activity in adult rats. Epilepsia, 51: 1522-1532. Hill A. J., Williams C. M., Whalley B. J. a Stephens G. J. 2012. Phytocannabinoids as novel therapeutic agents in CNS disorders. Pharmacol. Therapeut., 133: 79-97. Hillig K. W. 2004. A chemotaxonomic analysis of terpenoid variation in Cannabis. Biochem. Sys. Eco., 32: 875-891. Hillig K. W. 2005. Genetic evidence for speciation in Cannabis (Cannabaceae). Genet. Resour. Crop Evol., 52: 161-180. Hillig K. W. a Mahlberg P. G. 2004. A chemotaxonomic analysis of cannabinoid variation in Cannabis (Cannabaceae). Am. J. Bot., 91: 966-75. Howlett A. C., Barth F., Bonner T. I., Cabral G., Casellas P., Devane W. A., Felder C. C., Herkenham M., Mackie K., Martin B. R., Mechoulam R. a Pertwee R. G. 2002. International Union of Pharmacology. XXVII. Classification of cannabinoid receptors. Pharmacol. Rev., 54: 161-202. Howlett A. C., Breivogel C. S., Childers S. R., Deadwyler S. A., Hampson R. E. a Porrino L. J. 2004. Cannabinoid physiology and pharmacology: 30 years of progress. Neuropharmacology, 47: 345-358. Hsieh H. M., Hou R. J., Tsai L. C., Wei C. S., Liu S. W., Huang L. H., Kuo Y. C., Linacre A. a Lee J. C. I. 2003. A highly polymorphic STR locus in Cannabis sativa. Forensic Sci.Int., 131: 53-58. Iuvone T., Esposito G., Esposito R., Santamaria R., Di Rosa M. a Izzo A. A. 2004. Neuroprotective effect of cannabidiol, a non-psychoactive component from Cannabis sativa, on beta-amyloid-induced toxicity in PC12 cells. J. Neurochem., 89: 134-141.
42
Jarvinen T., Pate D. W. a Laine K. 2002. Cannabinoids in the treatment of glaucoma. Pharmacol. Therapeut., 95: 203-220. Jekkel Z., Heszky L. E. a Ali A. H. 1989. Effect of different cryoprotectants and transfer temperatures on the survival rate of hemp (Cannabis sativa L.) Cell suspension in deep freezing. Acta Biol. Hung., 40: 127-136. Katavic V., Haughn G. W., Reed D., Martin M. a Kunst L. 1994. In planta transformation of Arabidopsis thaliana. Mol. Gen. Genet., 245: 363-370. Kayis S. A., Hakki E. E. a Pinarkara E. 2010. Comparison of effectiveness of ISSR and RAPD markers in genetic characterization of seized marijuana (Cannabis sativa L.) in Turkey. Afr. J. Agric. Res., 5: 2925-2933. Keller A., Leupin M., Mediavilla V. a Wintermantel E. 2001. Influence of the growth stage of industrial hemp on chemical and physical properties of the fibres. Ind. Crop. Prod., 13: 35-48. Kohjyouma M., Lee I. J., Iida O., Kurihara K., Yamada K., Makino Y., Sekita S. a Satake M. 2000. Intraspecific variation in Cannabis sativa L. based on intergenic spacer region of chloroplast DNA. Biol. Pharmacol. Bull., 23: 727-730. Kojoma M., Iida O., Makino Y., Sekita S. a Satake M. 2002. DNA fingerprinting of Cannabis sativa using inter-simple sequence repeat (ISSR) amplification. Planta Med., 68: 60-63. Kojoma M., Seki H., Yoshida S. a Muranaka T. 2006. DNA polymorphisms in the tetrahydrocannabinolic acid (THCA) synthase gene in "drug-type" and "fiber-type" Cannabis sativa L. Forensic Sci.Int., 159: 132-140. Kuhnt K., Degen C., Jaudszus A. a Jahreis G. 2012. Searching for health beneficial n-3 and n-6 fatty acids in plant seeds. Eur. J. Lipid Sci. Technol., 114: 153-160. Lata H., Chandra S., Khan I. A. a Elsohly M. A. 2010. High frequency plant regeneration from leaf derived callus of high Delta(9)-tetrahydrocannabinol yielding Cannabis sativa L. Planta Med., 76: 1629-1633. Li H. L. 1974. Archeological and historical account of Cannabis in China. Econ. Bot., 28: 437-448. Lijavetzky D., Cabezas J. A., Ibanez A., Rodriguez V. a Martinez-Zapater J. M. 2007. High throughput SNP discovery and genotyping in grapevine (Vitis vinifera L.) by combining a resequencing approach and SNPlex technology. BMC Genomics, 8. MacKinnon L. , McDougall G., Aziz N. a Millam S. Progress towards transformation of fibre hemp. Scottish Crop Research Institute Annual Report [online]. 2000/2001 43
[cit. 4.
dubna
2013].
Invergowrie,
Dundee.
Scottish
Crop
Research Institute. Malfait A. M., Gallily R., Sumariwalla P. F., Malik A. S., Andreakos E., Mechoulam R. a Feldmann M. 2000. The nonpsychoactive Cannabis constituent cannabidiol is an oral anti-arthritic therapeutic in murine collagen-induced arthritis. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 97: 9561-9566. Mandolino G. a Carboni A. 2004. Potential of marker-assisted selection in hemp genetic improvement. Euphytica, 140: 107-120. Mandolino G., Carboni A., Forapani S., Faeti V. a Ranalli P. 1999. Identification of DNA markers linked to the male sex in dioecious hemp (Cannabis sativa L.). Theor. Appl. Genet., 98: 86-92. Matsuda L. A., Lolait S. J., Brownstein M. J., Young A. C. a Bonner T. I. 1990. Structure of a cannabinoid receptor and functional expression of the cloned cDNA. Nature, 346: 561-564. Mcdonald P. A. a Gough T. A. 1984. Determination of the distribution of cannabinoids in Cannabis resin from the Lebanon using HPLC .3. J. Chromatogr. Sci., 22: 282-284. Mechoulam R. 1970. Marihuana Chemistry. Science, 168: 1159-1166. Mechoulam R. 2005. Plant cannabinoids: a neglected pharmacological treasure trove. Br. J. Clin. Pharmacol., 146: 913-915. Mechoulam R. a Ben-Shabat S. 1999. From gan-zi-gun-nu to anandamide and 2arachidonoylglycerol: the ongoing story of Cannabis. Nat. Prod. Rep., 16: 131-143. Meiri E., Jhangiani H., Vredenburgh J. J., Barbato L. M., Carter F. J., Yang H. M. a Baranowski V. 2007. Efficacy of dronabinol alone and in combination with ondansetron versus ondansetron alone for delayed chemotherapy-induced nausea and vomiting. Curr. Med. Res. Opin., 23: 533-543. Ming R., Bendahmane A. a Renner S. S. 2011. Sex chromosomes in land plants. Annu. Rev. Plant Biol., 62: 485-514. Munro S., Thomas K. L. a Abushaar M. 1993. Molecular characterization of a peripheral receptor for cannabinoids. Nature, 365: 61-65. Navarro M., Carrera M. R. A., Fratta W., Valverde O., Cossu G., Fattore L., Chowen J. A., Gomez R., Del Arco I., Villanua M. A., Maldonado R., Koob G. F. a De Fonseca F. R. 2001. Functional interaction between opioid and cannabinoid receptors in drug self-administration. J. Neurosci., 21: 5344-5350. 44
Newton C. A., Chou P. J., Perkins I. a Klein T. W. 2009. CB(1) and CB(2) cannabinoid receptors mediate different aspects of Delta-9-tetrahydrocannabinol (THC)-induced T helper cell shift following immune activation by Legionella pneumophila infection. J. Neuroimmune Pharm., 4: 92-102. Novotna A., Mares J., Ratcliffe S., Novakova I., Vachova M., Zapletalova O., Gasperini C., Pozzilli C., Cefaro L., Comi G., Rossi P., Ambler Z., Stelmasiak Z., Erdmann A., Montalban X., Klimek A. a Davies P. 2011. A randomized, double-blind, placebo-controlled, parallel-group, enriched-design study of nabiximols (Sativex (R)), as add-on therapy, in subjects with refractory spasticity caused by multiple sclerosis. Eur. J. Neurol., 18: 1122-1131. Paulson H. L. 2009. The Spinocerebellar Ataxias. J. Neuro-Ophthal., 29: 227-237. Pellegrini M., Marchei E., Pacifici R. a Pichini S. 2005. A rapid and simple procedure for the determination of cannabinoids in hemp food products by gas chromatographymass spectrometry. J. Pharm. Biomed. Anal., 36: 939-46. Pertwee R. G. 1997. Pharmacology of cannabinoid CB1 and CB2 receptors. Pharmacol. Therapeut., 74: 129-180. Pertwee R. G. 1999. Cannabis and cannabinoids: Pharmacology and rationale for clinical use. Forsch. Komplementarmed., 6: 12-15. Pertwee R. G. 2000. Neuropharmacology and therapeutic potential of cannabinoids. Addict. Biol., 5: 37-46. Pertwee R. G. 2006. Cannabinoid pharmacology: the first 66 years. Br. J. Clin. Pharmacol., 147: 163-171. Pertwee R. G., Howlett A. C., Abood M. E., Alexander S. P. H., Di Marzo V., Elphick M. R., Greasley P. J., Hansen H. S., Kunos G., Mackie K., Mechoulam R. a Ross R. A. 2010. International Union of Basic and Clinical Pharmacology. LXXIX. Cannabinoid Receptors and Their Ligands: Beyond CB1 and CB2. Pharmacol. Rev., 62: 588-631. Pinarkara E., Kayis S. A., Hakki E. E. a Sag A. 2009. RAPD analysis of seized marijuana (Cannabis sativa L.) in Turkey. Electron. J. Biotechn., 12: 2925-2933. Politi M., Peschel W., Wilson N., Zloh M., Prieto J. M. a Heinrich M. 2008. Direct NMR analysis of Cannabis water extracts and tinctures and semi-quantitative data on Delta(9)-THC and Delta(9)-THC-acid. Phytochemistry, 69: 562-570. Potter D. J. a Duncombe P. 2012. The effect of electrical lighting power and irradiance on indoor-grown Cannabis potency and yield. J. Forensic Sci., 57: 618-22. 45
Prevost A. a Wilkinson M. J. 1999. A new system of comparing PCR primers applied to ISSR fingerprinting of potato cultivars. Theor. Appl. Genet., 98: 107-112. Ranalli P., Mandolino G., Grassi G., Carboni A. a Moschetta A. 1999. Advances of biotechnological approaches in hemp breeding. In: Ranalli P. (ed.) Advances in hemp research. New York, Food Products Press-imprint Haworth Press, 185-208. Razdan R. K., Puttick A. J., Zitko B. A. a Handrick G. R. 1972. Hashish. 6. Conversion of (-)-Delta1(6)-tetrahydrocannabinol to (-)-Delta1(7)-tetrahydrocannabinol - Stability of (-)-Delta1- and (-)-Delta1(6)-tetrahydrocannabinols. Experientia, 28: 121-122. Reddy M. P., Sarla N. a Siddiq E. A. 2002. Inter simple sequence repeat (ISSR) polymorphism and its application in plant breeding. Euphytica, 128: 9-17. Renner S. S. a Ricklefs R. E. 1995. Dioecy and its correlates in the flowering plants. Am. J. Bot., 82: 596-606. Ross S. A. a Elsohly M. A. 1996. The volatile oil composition of fresh and air-dried buds of Cannabis sativa. J. Nat. Prod., 59: 49-51. Rotherham D. a Harbison S. A. 2011. Differentiation of drug and non-drug Cannabis using a single nucleotide polymorphism (SNP) assay. Forensic Sci.Int., 207: 193-197. Russo E. a Guy G. W. 2006. A tale of two cannabinoids: The therapeutic rationale for combining tetrahydrocannabinol and cannabidiol. Med. Hypotheses, 66: 234-246. Russo E. B. 2007. History of Cannabis and its preparations in saga, science, and sobriquet. Chem. Biodiv., 4: 1614-48. Russo E. B. 2011. Taming THC: potential Cannabis synergy and phytocannabinoid-terpenoid entourage effects. Br J Pharmacol, 163: 1344-64. Russo E. B., Jiang H. E., Li X., Sutton A., Carboni A., Del Bianco F., Mandolino G., Potter D. J., Zhao Y. X., Bera S., Zhang Y. B., Lu E. G., Ferguson D. K., Hueber F., Zhao L. C., Liu C. J., Wang Y. F. a Li C. S. 2008. Phytochemical and genetic analyses of ancient Cannabis from Central Asia. J. Exp. Bot., 59: 4171-82. Rustichelli C., Ferioli V., Baraldi M., Zanoli P. a Gamberini G. 1998. Analysis of cannabinoids in fiber hemp plant varieties (Cannabis sativa L.) by highperformance liquid chromatography. Chromatographia, 48: 215-222. Sallan S. E., Zinberg N. E. a Frei E. 1975. Antiemetic effect of Delta-9tetrahydrocannabinol in patients receiving cancer chemotherapy. N. Engl. J. Med., 293: 795-797. Sanchez C., Galve-Roperh I., Canova C., Brachet P. a Guzman M. 1998. Delta(9)tetrahydrocannabinol induces apoptosis in C6 glioma cells. FEBS Letters, 436: 6-10. 46
Siniscalco Gigliano G., Caputo P. a Cozzolino S. 1997. Ribosomal DNA analysis as a tool for the identification of Cannabis sativa L. specimens of forensic interest. Sci. Justice, 37: 171-174. Sirikantaramas S., Morimoto S., Shoyama Y., Ishikawa Y., Wada Y., Shoyama Y. a Taura F. 2004. The gene controlling marijuana psychoactivity - Molecular cloning and heterologous expression of Delta(1)-tetrahydrocannabinolic acid synthase from Cannabis sativa L. J. Biol. Chem., 279: 39767-39774. Small E., Beckstead H. D. a Chan A. 1975. Evolution of cannabinoid phenotypes in Cannabis. Econ. Bot., 29: 219-232. Solinas M., Tanda G., Justinova Z., Wertheim C. E., Yasar S., Piomelli D., Vadivel S. K., Makriyannis A. a Goldberg S. R. 2007. The endogenous cannabinoid anandamide produces delta-9-tetrahydrocannabinol-like discriminative and neurochemical effects that are enhanced by inhibition of fatty acid amide hydrolase but not by inhibition of anandamide transport. J. Pharmacol. Exp. Ther., 321: 370-380. Tanaka H. a Shoyama Y. 1999. Monoclonal antibody against tetrahydrocannabinolic acid distinguishes Cannabis sativa samples from different plant species. Forensic Sci.Int., 106: 135-146. Taura F., Dono E., Sirikantaramas S., Yoshimura K., Shoyama Y. a Morimoto S. 2007a. Production of Delta(1)-tetrahydrocannabinolic acid by the biosynthetic enzyme secreted from transgenic Pichia pastoris. Biochem. Biophys. Res. Commun., 361: 675-680. Taura F., Sirikantaramas S., Shoyama Y., Yoshikai K., Shoyama Y. a Morimoto S. 2007b. Cannabidiolic-acid synthase, the chemotype-determining enzyme in the fibertype Cannabis sativa. FEBS Letters, 581: 2929-2934. Taura F., Tanaka S., Taguchi C., Fukamizu T., Tanaka H., Shoyama Y. a Morimoto S. 2009. Characterization of olivetol synthase, a polyketide synthase putatively involved in cannabinoid biosynthetic pathway. FEBS Letters, 583: 2061-2066. Thomas A., Baillie G. L., Phillips A. M., Razdan R. K., Ross R. A. a Pertwee R. G. 2007. Cannabidiol displays unexpectedly high potency as an antagonist of CB1 and CB2 receptor agonists in vitro. Br. J. Pharm., 150: 613-623. Thomas A., Stevenson L. A., Wease K. N., Price M. R., Baillie G., Ross R. A. a Pertwee R. G. 2005. Evidence that the plant cannabinoid Delta(9)-tetrahydrocannabivarin is a cannabinoid CB1 and CB2 receptor antagonist. Br. J. Clin. Pharmacol., 146: 917926. 47
Toonen M., Ribot S. a Thissen J. 2006. Yield of illicit indoor Cannabis cultivation in the Netherlands. J. Forensic Sci., 51: 1050-4. Tripathi L. a Tripathi J. N. 2003. Role of biotechnology in medicinal plants. Trop. J. Pharm. Res., 2: 243-253. Turner C. E., Elsohly M. A. a Boeren E. G. 1980. Constituents of Cannabis sativa L. 17. A Review of the Natural Constituents. J. Nat. Prod., 43: 169-234. Turner J. C., Hemphill J. K. a Mahlberg P. G. 1978. Quantitative-determination of cannabinoids in individual glandular trichomes of Cannabis sativa L. (Cannabaceae). Am. J. Bot., 65: 1103-1106. Vaccani A., Massi P., Colombo A., Rubino T. a Parolaro D. 2005. Cannabidiol inhibits human glioma cell migration through a cannabinoid receptor-independent mechanism. Br. J. Clin. Pharmacol., 144: 1032-1036. Van Bakel H., Stout J. M., Cote A. G., Tallon C. M., Sharpe A. G., Hughes T. R. a Page J. E. 2011. The draft genome and transcriptome of Cannabis sativa. Genome biol., 12: R102. Van Der Kooy F., Maltese F., Choi Y. H., Kim H. K. a Verpoorte R. 2009. Quality control of herbal material and phytopharmaceuticals with MS and NMR based metabolic fingerprinting. Planta Med., 75: 763-775. Varvel S. A., Bridgen D. T., Tao Q., Thomas B. F., Martin B. R. a Lichtman A. H. 2005. Delta(9)-Tetrahydrocannbinol
accounts
for
the
antinociceptive,
hypothermic,
and cataleptic effects of marijuana in mice. J. Pharmacol. Exp. Ther., 314: 329-337. Vela G., Ruizgayo M. a Fuentes J. A. 1995. Anandamide decreases naloxone-precipitated withdrawal signs in mice chronically treated with morphine. Neuropharmacology, 34: 665-668. Venderova K., Ruzicka E., Vorisek V. a Visnovsky P. 2004. Survey on Cannabis use in Parkinson's disease: Subjective improvement of motor symptoms. Mov. Disord., 19: 1102-1106. Wilkinson M. a Linacre A. M. T. 2000. The detection and persistence of Cannabis sativa DNA on skin. Sci. Justice, 40: 11-14. Yamaguchi T. U., Hagiwara Y., Tanaka H., Sugiura T., Waku K., Shoyama Y., Watanabe
S.
a
Yamamoto
T.
2001.
Endogenous
cannabinoid,
2-
arachidonoylglycerol, attenuates naloxone-precipitated withdrawal signs in morphinedependent mice. Brain Res., 909: 121-126.
48
Yun D. J., Hashimoto T. a Yamada Y. 1992. Metabolic engineering of medicinal-plants transgenic
Atropa
belladonna
with
an
improved
alkaloid
composition.
Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 89: 11799-11803. Zias J., Stark H., Sellgman J., Levy R., Werker E., Breuer A. a Mechoulam R. 1993. Early medical use of Cannabis. Nature, 363: 215.
49
