MASARYKOVA UNIVERZITA. Přírodovědecká fakulta BAKALÁŘSKÁ PRÁCE

MASARYKOVA UNIVERZITA Přírodovědecká fakulta

BAKALÁŘSKÁ PRÁCE

Brno 2014

Rostislav Navrátil

MASARYKOVA UNIVERZITA Přírodovědecká fakulta Ústav experimentální biologie Oddělení genetiky a molekulární biologie

Neinvazivní prenatální diagnostika monogenních onemocnění Bakalářská práce

Rostislav Navrátil

VEDOUCÍ PRÁCE: Mgr. Diana Grochová, Ph.D.

Brno 2014

Bibliografický záznam

Autor:

Rostislav Navrátil Přírodovědecká fakulta, Masarykova univerzita Ústav experimentální biologie

Název práce:

Neinvazivní

prenatální

diagnostika

monogenních

onemocnění Studijní program:

Experimentální biologie

Studijní obor:

Molekulární biologie a genetika

Vedoucí práce:

Mgr. Diana Grochová, Ph.D.

Akademický rok:

2013/2014

Počet stran:

48

Klíčová slova:

Neinvazivní prenatální diagnostika; invazivní prenatální diagnostika; cffDNA; sekvenování nové generace; polymerázová řetězová reakce; monogenní onemocnění

Bibliographic Entry

Author:

Rostislav Navrátil Faculty of Science, Masaryk University Department of Experimental Biology

Title of Thesis:

Non-invasive prenatal diagnosis of monogenic disorders

Degree Programme: Experimental biology

Field of Study:

Molecular biology and genetics

Supervisor:

Mgr. Diana Grochová, Ph.D.

Academic Year:

2013/2014

Number of Pages:

48

Keywords:

Non invasive prenatal diagnosis; invasive prenatal diagnosis;

cffDNA;

next

generation

sequencing;

polymerase chain reaction; monogenic diseases

Abstrakt V této bakalářské práci se věnuji problematice neinvazivní prenatální diagnostiky monogenních onemocnění. Je rozdělena na několik částí - první část věnuji obecně neinvazivní prenatální diagnostice a především volné fetální DNA a jejím využitím. V další části práce se zaměřuji na techniky, kterými je možné detekovat volnou fetální DNA a v poslední části popisuji prenatální diagnostiku některých monogenních onemocnění s využitím analýzy volné fetální DNA provedené technikami, které jsou v práci zmiňovány.

Abstract In this bachelor thesis I focus on the issue of prenatal diagnostics of monogenic disorders. It is divided in to several parts – I dedicate the first part to noninvasive prenatal diagnostics in general and especially focused on free fetal DNA and its use. In the next part I focus on the techniques we can use to analyze free fetal DNA and in the last part I describe prenatal diagnostics of some monogenic disorders using free fetal DNA analysis by techniques described in the thesis.

Poděkování Tímto bych rád poděkoval paní Mgr. Dianě Grochové, Ph.D., vedoucí této bakalářské práce, za odbornou pomoc a čas, který mi věnovala při vypracování dané problematiky. Dále bych chtěl poděkovat Cytogenetické laboratoři Brno, s.r.o., za možnost zpracování bakalářské práce na jejich pracovišti

Obsah

Obsah 1. Úvod …………………………………………………………………………………….. 11 2. Neinvazivní prenatální diagnostika ……………………………………………………... 12 2.1. Klasické metody neinvazivní prenatální diagnostiky ………………………………. 12 2.2. Moderní metody neinvazivní prenatální diagnostiky ………………………………. 13 2.2.1. Volná fetální DNA …………………………………………………………... 13 2.2.1.1.

Využití cffDNA ……………………………………………………… 16

3. Techniky analýzy cffDNA ………………………………………………………………. 20 3.1. Kvantitativní fluorescenční PCR …………………………………………………… 20 3.2. Digitální PCR ………………………………………………………………………. 21 3.3. Droplet digital PCR ………………………………………………………………… 23 3.4. MALDI-TOF ……………………………………………………………………….. 24 3.5. Nová generace sekvenování ………………………………………………………... 25 3.5.1. 454 Roche …………………………………………………………………… 26 3.5.2. Solexa Illumina ……………………………………………………………… 27 3.5.3. SOLiD system Applied Biosystems …………………………………………. 29 3.5.4. Ion Torrent Life Technologies ………………………………………………. 30 4. Neinvazivní prenatální diagnostika monogenních onemocnění ………………………… 32 4.1. Autozomálně dominantní onemocnění ……………………………………………... 32 4.1.1. Huntingtonova choroba ……………………………………………………… 32 4.1.2. Achondroplázie ……………………………………………………………… 33 4.1.3. Myotonická dystrofie ………………………………………………………... 34 4.2. Autozomálně recesivní onemocnění ………………………………………………... 35 4.2.1. Talasémie ……………………………………………………………………. 35 4.2.2. Srpkovitá anémie …………………………………………………….………. 37 4.2.3. Cystická fibróza …………………………………………………………….... 38 4.3. Gonozomální onemocnění …………………………………………….……………. 38 4.3.1. Hemofilie …………………………………....………………………….......... 39 4.3.2. X - vázaná retinitis pigmentosa ……………………………....……………… 39 5. Závěr …………………………………………………………………………………….. 40 6. Literatura ……………………………………………………………………………….... 41 6.1. Internetové zdroje ……………………………………………………………………48

Seznam zkratek

Seznam zkratek AMK

Aminokyselina

ATP

Adenosintrifosfát

CAH

Kongenitální adrenální hyperplazie (congenital adrenal hyperplasia)

CF

Cystická fibróza

cffDNA

Volná fetální DNA (cell free fetal DNA)

CVS

Odběr buněk choriových klků (chorionic cillus sampling)

ddNTP

Dideoxyribonukleotidtrifosfát

ddPCR

Dropletová digitální PCR (droplet digital PCR)

dNTP

Deoxyribonukleotidtrifosfát

dPCR

Digitální PCR

DS

Downův syndrom

emPCR

Emulzní PCR

FISH

Fluorescenční in situ hybridizace

GIT

Gastrointestinální trakt

hCG

Lidský choriový gonadotropin (human chorionic gonadotropin)

HD

Huntingtonova choroba (Huntington’s disease)

MALDI

Laserová

desorpce/ionizace

za

účasti

matrice

(matrix-assisted

laser

desorption/ionization) MB

Molecular beacon fluorescenční sonda

MD

Myotonická dystrofie

MoM

Násobky mediánů (multiples of median)

MPS

Masivní paralelní sekvenování

NGS

Nová generace sekvenování

NIPD

Neinvazivní prenatální diagnostika (non-invasive prenatal diagnosis)

NK

Nukleová kyselina

NTP

Nukleotidtrifosfát

PAP

Pyrofosforolýzou aktivovaná polymerace

PCR

Polymerázová řetězová reakce (polymerase chain reaction)

PD

Prenatální diagnostika

QF-PCR

Kvantitativní fluorescenční PCR (quantitative fluorescent PCR)

QRT-PCR

Kvantitativní reverzně transkripční PCR (Quantitative reverse transcriptase PCR)

Seznam zkratek

RMD

Relativní mutační dávka

rtPCR

PCR v reálném čase (real-time PCR)

SNP

Jednonukleotidové polymorfizmy (single-nucleotide polymorphism)

Y-PCR

PCR specifických sekvencí chromozomu

Úvod

1. Úvod Prenatální diagnostika jako taková je souborem různých procedur, testů a metod sloužících k vyšetření zdraví plodu v průběhu gravidity, tedy ještě před narozením dítěte. Umožňuje nám detekovat nejrůznější genetické abnormality, které mohou být v důsledku neslučitelné se životem plodu nebo mohou ohrozit život matky. V současnosti se mezi tyto metody řadí několik invazivních i neinvazivních technik. Mezi neinvazivní postupy patří především ultrazvukové vyšetření společně s biochemickým vyšetřením matčiny krve. Na základě výsledků je případně matce doporučen invazivní zásah, tedy např. odběr plodové vody či choriových klků pro přesnější diagnostiku přímo z buněk plodu. To ovšem nese sice malé, byť nezanedbatelné riziko potratu plodu téměř 1%. Genetické poradenství si klade za cíl informovat rodiče o riziku vrozené vady, psychicky připravit rodiče na zátěž s rizikem spojenou a posoudit preventivní možnosti. V případě zjištění onemocnění plodu, které by mohlo být neslučitelné se životem dítěte či ohrožovalo život matky při porodu, je v České republice ze zákona povoleno uměle ukončit graviditu. Na základě jiných nepříznivých genetických výsledků má matka možnost ukončit těhotenství do 24. týdne gestačního věku. Vědci se snažili přijít na způsob jak diagnostikovat genetická onemocnění a zároveň snížili riziko potratu či poškození plodu na minimum. S objevem volné fetální DNA cirkulující v matčině krevním oběhu (cffDNA) se otevřely dveře novým možnostem prenatální diagnostiky. S tímto milníkem přichází i snaha o rozvoj technologií určených pro co nejcitlivější zkoumání cffDNA. V této bakalářské práci se zabývám objevem, vlastnostmi a využitím cffDNA. Představuji některá monogenní onemocnění, která se stala terčem výzkumu využití cffDNA pro NIPD těchto abnormalit. Popisuji technologie využívané k diagnostice od klasické fluorescenční PCR (QF-PCR) přes plně automatizovanou digitální PCR (dPCR) až po nejmodernější metody Nové Generace Sekvenování (NGS), které nabízí zcela nový rozměr NIPD.

11

Neinvazivní prenatální diagnostika

2. Neinvazivní prenatální diagnostika Metody neinvazivní prenatální diagnostiky (NIPD) umožňují vyšetření bez rizika ohrožení života nebo zdraví matky a plodu. Mezi ně patří především klasické ultrazvukové vyšetření a screeningové metody založené na stanovení hladiny určitých biochemických markerů v krvi matky. Tyto přístupy ovšem nejsou schopny detekovat monogenní onemocnění plodu a k diagnostice jsou proto využívány vzorky odebrány metodami invazivními. Objev volné fetální DNA (cffDNA, cell-free fetal DNA) cirkulující v matčině krvi (Lo et al., 1997), vede k možnosti využití neinvazivních metod k prenatální diagnostice chromozomálních a monogenních abnormalit u plodu. Doposud je NIPD brána jako screeningová metoda, ale neustále probíhající výzkum se snaží úplně eliminovat nutnost použití invazivních postupů.

2. 1. Klasické metody neinvazivní prenatální diagnostiky Mezi klasické neinvazivní metody patří, jak už bylo zmíněno, ultrazvukové vyšetření a stanovování určitých markerů z matčiny krve. Hodnoty z měření biochemických markerů slouží k vypočítání rizika vrozené vady u plodu. Výsledky jsou převedeny do násobků mediánů (MoM) pro gestační věk, upravené pro mateřskou hmotnost a rasu a společně s MoM hodnot z ultrazvukového vyšetření je z průměru tří měření vypočítáno riziko (Malone et al., 2005). Na základě tohoto údaje je poté doporučen invazivní zákrok. V prvním trimestru těhotenství se provádí kombinovaný test založený na ultrazvukovém vyšetření tloušťky šíjového projasnění, měření hladiny plazmatického proteinu A a volné betapodjednotky lidského choriogonadotropinu (Malone et al., 2005). Ve druhém trimestru se provádí čtyřnásobný screening alfa fetoproteinu, celkového lidského choriogonadotropinu (hCG), nekonjugovaného estriolu a inhibinu A (Malone et al., 2005). Plně integrovaný screening jako kombinace výsledků z měření v prvním a druhém trimestru dosahuje vysoké citlivosti, jeho hodnota detekčního podílu je až 96% při 5% falešné pozitivity (Malone et al., 2005).

12


2. 2. Moderní metody neinvazivní prenatální diagnostiky Jelikož klasické metody nedosahují 100% senzitivity a mají poměrně vysokou falešnou pozitivitu (Benn et al., 2013), byla snaha vyvinout přesnou a spolehlivou neinvazivní metodu, která by zachytila chromozomové aberace či genové mutace u plodu s vysokou citlivostí. K tomu přispěl objev volných jaderných hematopoetických buněk plodu v matčině krvi (Walknowska et al., 1969). Tohoto objevu bylo využito například při stanovení detekce sekvencí specifických pro chromozom Y pomocí PCR nebo při detekci trizomie chromozomu 21 metodou FISH (Bicanchi et al., 1990, Bianchi et al., 1992). Ovšem koncentrace těchto buněk je velice nízká, což je limitující faktor v NIPD. V roce 2002 Bianchi et al. detekovali alespoň jednu jadernou buňku mužského plodu v matčině periferní krvi v 41,1% případů, avšak s 11,1% falešnou pozitivitou. Míra detekce alespoň jedné fetální aneuploidní buňky v matčině krvi v této studii byla 74,4% s 0,6 – 4,1% falešnou pozitivitou (Bianchi et al., 2002). Ze studie vyplynulo, že citlivost diagnostiky z volných fetálních buněk je srovnatelná s citlivostí screeningu jednoho biochemického markeru (Bianchi et al., 2002). Objevem volné fetální DNA (cffDNA) v roce 1997 se otevřely dveře novým možnostem NIPD (Lo et al., 1997). 2. 2. 1. Volná fetální DNA (cffDNA, cell-free fetal DNA)

Objev cffDNA Na základě objevu volné DNA nádorových buněk v plazmě a séru pacientů s rakovinou (Stroun et al., 1989), se Lo a jeho tým v roce 1997 rozhodli zjistit, zda je možné v mateřské krvi detekovat fetální DNA (Lo et al., 1997). Pro detekci bylo těhotným ženám odebráno 5 – 10 mL periferní krve, společně s 10 mL plodové vody. Pro kontrolu bylo použito 10 vzorků krve žen, které těhotné nebyly. Amplifikace Y-specifických sekvencí v DNA plodu byla provedena pomocí Y-PCR a následnou elektroforézou na agarózovém gelu byly vzorky analyzovány a výsledky porovnány s těmi z analýzy plodové vody a kontrolní skupiny. Úspěšnost detekce Y-specifických sekvencí byla v tomto pilotním pokusu 70% v séru a 80% v plazmě při amplifikaci 10 µL vzorku (Lo et al., 1997). 13


Vlastnosti cffDNA Další studie týmu profesora Lo provedená v roce 1998 pomohla určit celkové zastoupení cffDNA v plazmě matky. Za pomoci modifikované kvantitativní PCR (QF-PCR, viz níže) v reálném čase (Heid et al., 1996) s použitím sond TaqMan byl zjištěn podíl cffDNA v plazmě matky 3,4% u raného těhotenství (11. – 17. týden gestace) a 6,2% u pozdější fáze těhotenství (37. – 43. týden gestace) z celkového množství volné DNA cirkulující v matčině krvi. (Lo et al., 1998a). V roce 2008 bylo provedeno měření pomocí mikrofluidní digitální PCR (dPCR, viz níže) a bylo zjištěno, že skutečná koncentrace cffDNA v plazmě matky je mnohem větší, než se doposud myslelo. Hodnoty koncentrace byly v prvním trimestru 9,7%, ve druhém 9% a ve třetím 20,4%. Při porovnání s měřením klasickou PCR byly tyto hodnoty průměrně 2,5krát větší (Lun et al., 2008a). Chan et al. (2003) objevili pomocí sériové analýzy korelaci mezi koncentrací cffDNA v matčině plazmě a gestačním věkem ve třetím trimestru. Zjistili, že v průběhu třetího trimestru stoupá koncentrace cffDNA průměrně o 29,3% každý týden (Chan et al., 2003). U žen trpících preeklampsií bylo pozorováno až 5násobné zvýšení koncentrace cffDNA oproti normálu v krevním oběhu. Tento objev zvýšil možnosti využití fetální DNA pro diagnostiku tohoto onemocnění (Lo et al., 1999a). Jelikož se cffDNA v plazmě matky vyskytuje ve velmi malé koncentraci a je problematické ji odlišit od matčiny vlastní volné DNA, byly provedeny studie zabývající zvýšením koncentrace cffDNA. Bylo zjištěno, že fragmenty mateřské volné DNA jsou delší než fragmenty cffDNA v plazmě těhotné ženy. 99% těchto fragmentů je kratších než 312bp (Chan et al., 2004). Na základě této studie Li et al., (2004) provedli elektroforetickou separaci fragmentu menších než 300bp a efektivně tak oddělily cffDNA od volné mateřské DNA a mohli ji tak snadněji využít k diagnostice. Zajímavou vlastností cffDNA je její velice rychlé „vyklizení“ z matčina krevního oběhu po porodu. Její průměrný poločas rozpadu po porodu byl stanoven na 16,3 min. a po 2 hodinách již nebyla detekovatelná téměř vůbec. To je důležité především při NIPD následných těhotenství (Lo et al., 1999b). Již od objevení cffDNA v roce 1997 se vědci snažili zjistit, kde má původ. Předpokládali, že se uvolňuje z apoptických buněk, podobně jako je tomu u vlastní matčiny volné DNA. Hlavním středem zájmu se stala placenta, jelikož je v těsném kontaktu s matčiným krevním oběhem.

14


Ohaschi et al. (2002) objevili korelaci mezi zvyšováním koncentrace cffDNA a hCG ve druhém trimestru. Jelikož hCG pochází z placentárních trofoblastů, a zvýšení jeho koncentrace v krvi ve druhém trimestru může souviset s komplikacemi během těhotenství (např. preeklampsie), vědci logicky dospěli k závěru, že je výskyt fetální DNA v matčině plazmě spojen s patologickým stavem trofoblastů placenty (Ohaschi et al., 2002). Další studie Ng et al. (2003) také pomohla poodhalit původ cffDNA v krevním oběhu matky. Vědci použili kvantitativní reverzně transkripční PCR v reálném čase (QRT-PCR) pro detekci transkriptů genů lidského placentárního laktogenu a β podjednotky lidského choriového gonadotropinu v matčině plazmě. Tyto markery jsou typické pouze pro placentární buňky, a proto jejich následná detekce v matčině krvi potvrdila, že se mohou volné nukleové kyseliny (tedy i cffDNA) dostávat přes membránu placenty (Ng et al., 2003). Dalším důkazem placentárního původu volné fetální DNA byl výzkum těhotných žen s placentárním mozaicismem. U několika případů byly objeveny v matčině krevním oběhu 3 různé alely jednoho genu (jedna od matky, dvě od otce), ale v krevním oběhu novorozence pouze leukocyty obsahující 2 alely (jedna od otce, jedna od matky). Skutečnost, že přebývající alela v matčině volné DNA zmizela do dvou hodin po porodu z jejího krevního oběhu, značí placentární původ (Masuzaki et al., 2004). Tjoa et al. (2006) testovali hypotézu, že k uvolnění cffDNA do krevního oběhu matky dochází po indukci apoptózy syncytiotrofoblastu placenty. Vědci vystavili po porodu placenty in vitro normoxickým podmínkám (10% kyslíku) po dobu 20 hodin. Poté snížili koncentraci kyslíku na 0,5% na dobu jedné hodiny a opět reoxidovali. Koncentrace volné DNA v roztoku před a po zákroku vzrostla. Zároveň byla pomocí western blottingu potvrzena zvýšená aktivace kaspázy 3 (marker buněčné apoptózy) a imunolokalizována v syncytiotrofoblastu. Tato studie jako první dokázala vztah mezi mechanizmy placentární apoptózy a uvolňováním nukleových kyselin do krevního oběhu matky (Tjoa et al., 2006). V roce 2007 Alberry et al. studovali vzorky choriových klků a plazmy devíti žen s tzv. prázdným gestačním váčkem. Ten se vytváří při abnormálním průběhu těhotenství, kdy se vyvíjí pouze placenta bez plodu. Za pomoci kvantitativní fluorescenční PCR v reálném čase kvantifikovali oblast markeru DYS14 chromozomu Y v matčině plazmě. Koncentrace cffDNA u matek s prázdným gestačním váčkem a matek s normálním průběhem těhotenství se téměř nelišila. To potvrdilo hypotézu, že placenta je hlavním zdrojem cffDNA v krvi těhotné ženy (Alberry et al., 2007).

15


2. 2. 1. 1. Využití cffDNA Určení pohlaví plodu Jednou možností využití volné fetální DNA, je např. určení pohlaví dítěte. To může být například využito při diagnostice na pohlaví vázaného onemocnění nebo detekce abnormalit na genitálu (např. vlivem CAH), kdy není pohlaví patrné z ultrazvukového vyšetření. Zjištěním, zda matka nese mužský či ženský plod, může být vyloučena invazivní diagnostika, která by tedy byla zbytečná. Již při objevu cffDNA v roce 1997 Lo et al. prakticky určovali pohlaví plodu, kdy pomocí metody PCR amplifikovali úsek DYS14, vyskytujícím se pouze na Y chromozomu. Honda et al. (2001) odebrali krev 61 těhotným ženám a po extrakci DNA z plazmy provedli detekci markerů DYS14 a DYZ3 specifických pro Y chromozom pomocí PCR s následnou gelovou elektroforézou. Výsledky byly srovnány s cytogenetickou analýzou plodové vody, která odhalila, že 31 žen mělo mužský plod a 30 ženský. DYS14 společně s DYZ3 byly detekovány u 27 z 31 žen s plodem mužského pohlaví. Zároveň nebyl ani jeden z markerů detekován u jediné ženy nesoucí ženský plod. Markery DYS14 a DYZ3 se tedy jeví jako vhodné pro neinvazivní detekci pohlaví plodu (Honda et al., 2001). Devaney et al. (2011) vydali systematické review s meta analýzou výsledků vědeckých prací zabývajících se určováním pohlaví dítěte pomocí NIPD, vydaných od roku 1997 do roku 2011. Studie byly analyzovány na základě typu vzorku (sérum, plazma, moč nebo krev), použité amplifikační metody (konvenční PCR nebo qrt-PCR), analyzované Y chromozomové sekvence (SRY, DYS14, DYS1/DAZ, DYZ3, AMELY) a gestačního věku. Z celkového množství 3524 žen nesoucích mužský plod a 3017 těhotných s plodem ženského pohlaví byla určena celková specificita a senzitivita jednotlivých metod v určitém gestačním věku. Nejvyšší citlivosti dosáhla qrt-PCR provedená po 20. týdnu těhotenství (sensitivita 99%, specificita 97,3%). Nejvyšší senzitivity dosáhly testy vzorků plazmy (95,3%). Jako nejvhodnější marker pro analýzu vyšel lokus DYS1 (97,5%). Nejcitlivější metoda je qtr-PCR s citlivostí 96%. Testy provedené před ukončeným 7. týdnem gravidity vyšly nejhůře (senzitivita 74,5%, specificita 99,6%) (Devaney et al., 2011). Určení Rh faktoru krve plodu Dalším možným využitím cffDNA je určení Rh faktoru krve plodu. Ten je určen skupinou 40. antigenů, vyskytujících se na povrchu červených krvinek. Nejdůležitějších je 5 antigenů C, c, E, e a D, které jsou uloženy na 3 genech. Nejsilnějším je D, jestliže ten je 16


přítomen na povrchu červených krvinek, označujeme jedince jako Rh pozitivního (Rh+), v opačném případě Rh negativního (Rh-). Diagnostika Rh faktoru je důležitá z hlediska rizika Rh inkompatibility matky a plodu. Jestliže je matka Rh- a plod Rh+ (zdědil alelu Rh+ od otce), může dojít k tzv. izoimunizaci, kdy se po vniku červených krvinek plodu do krevního řečiště matky začnou tvořit protilátky antiD. To se děje většinou při porodu či potratu, kdy je množství krve plodu, které se dostává do matčina oběhu, dostatečné pro izoimunizaci. U prvního těhotenství většinou komplikace nevznikají, u dalších těhotenství s Rh+ plodem pronikají matčiny již vytvořené protilátky antiD placentou do krevního oběhu plodu a rozkládají červené krvinky (fetální erytroblastóza). Rozpadem krvinek se uvolňuje červené barvivo hemoglobin a jeho metabolismem vzniká žlutý bilirubin. Ten se ukládá ve tkáních a způsobuje novorozeneckou žloutenku. Nadměrné množství tohoto barviva se může ukládat v nervové tkáni a způsobuje vážné poruchy centrální nervové soustavy. Dalším projevem izoimunizace je silná anémie plodu způsobená erytroblastózou. Tvorba protilátek u senzibilizovaných matek může být potlačena podáním anti-D-gamaglobulinu do 72 hodin po porodu (Avent a Reid 2000). Hlavní výhodou využití cffDNA pro diagnostiku Rh faktoru je zamezení další případné imunologické reakci v důsledku krvácení při invazivních postupech. Nejpřesnější je toto vyšetření až po ukončeném prvním trimestru (Lo et al., 1998b). Faas et al. (1998) testovali 31 Rh- těhotných žen s gestačním věkem mezi 16. - 17. týdnem. Pomocí PCR amplifikovali úsek exonu 7 genu RHD a výsledná analýza správně určila Rh faktor plodu ve všech vzorcích (Faas et al., 1998). 100% výsledků dosáhli i Rijnders et al. (2004), kteří pomocí rtq-PCR kvantifikovali také úsek exonu 7 genu RHD. Autoři v práci uvádějí, že by tato metoda mohla nahradit klasické invazivní postupy (Rijnders et al., 2004). V současnosti jsou výsledky NIPD Rh faktoru plodu dostačující pro potvrzení diagnózy. NIPD aneuploidií Diagnostika aneuploidií je další oblastí využití volné fetální DNA. Numerické chromozomové abnormality (aneuploidie) se vyznačují odchylkou od normálního počtu chromozomů. Jsou to takové změny, kdy jeden chromozom buď přebývá (2n+1, trizomie) nebo naopak chybí (2n-1, monozomie). Trizomie vznikají při rozchodu chromozomů nebo chromatid v prvním nebo druhém meiotickém dělení a oplozením dizomické abnormální gamety. Monozomie může vznikat stejným způsobem pouze s tím rozdílem, že dochází k oplození nulizomické gamety. 17


Nejznámější a zároveň nejčastější aneuploidií je trizomie chromozomu 21, nazývána Downův syndrom (DS; 47,XX,+21 nebo 47,XY,+21). Ta může být způsobena již zmiňovanou nondisjunkcí chromozomů při meioze nebo také tzv. Robertsonovskou translokací, kdy fúzí chromozomu 21 s jiným akrocentrickým chromozomem (např. 14 nebo 15) vzniká u jedince balancovaná chromozomální aberace, která nevede k vnějším projevům, ale tento jedinec může svému potomkovi předat fúzovaný chromozom 21 společně s normálním chromozomem 21. Syndrom se projevuje mentální retardací, svalovou hypotonií, vadami srdce, různými skeletárními anomáliemi a vývojovými vadami orgánů. Průměrně se tito jedinci dožívají 40 let. Dalšími častými aneuploidiemi jsou trizomie a chromozomu 18 a 13. 47,XX,+18 nebo 47,XY,+18 nazýváme Edwardsův syndrom. Téměř polovina postižených jedinců umírá již před narozením, 50% narozených dětí umírá do dvou měsíců po narození a jen minimum se dožije jednoho roku života. Mezi projevy patří nízká porodní váha, malformace srdce, abnormálně tvarovaný skelet, malá hlava a poruchy dýchání. 47,XX,+13 nebo 47,XY,+13 označujeme jako Patauův syndrom. K projevům patří velmi silné deformace skeletu, malformace orgánových soustav, kyklopie, rozštěp patra, polydaktylie atd. 50% postižených umírá do konce prvního měsíce života. Mezi nejčastější gonozomální aneuploidie patří Klinefelterův syndrom (47,XXY) a Turnerův syndrom (45,X). Nadbytek či nedostatek gonozomu způsobuje především poruchy v produkci pohlavních hormonů. Jednou z technik diagnostiky DS je detekce jednonukleotidových polymorfizmů (A/G) v genu PLAC4 nacházejícím se na transkriptu příslušného úseku chromozomu 21. Pomoci digitální PCR se zjišťuje poměr alel A a G u heterozygotních plodů. Pokud je plod postižen trizomií, jedna z alel je detekována ve dvounásobném množství a poměr vzroste na 2:1 (Lo et al., 2007). Jiná možnost detekce aneuploidií je prostřednictvím epigenetických alelických poměrů. Byl objeven rozdíl mezi metylací promotoru genu SERPINB5 kódujícím protein maspin v placentárních buňkách a buňkách mateřských. Pomocí kvantitativní metylačně-specifické PCR v reálném čase byly v mateřské krvi detekovány nemetylované sekvence SERPINB5, což dokazuje původ právě v placentě. Jedná se o vůbec první univerzální marker cffDNA v matčině krevním oběhu (Chim et al., 2005). Detekce nemetylovaných specifických sekvencí SERPINB5 chromozomu 18 v mateřské plazmě a určení alelických poměrů se jeví jako vhodný prostředek pro diagnostiku této trizomie (Tong et al., 2006). Nevýhodou analýzy alelických poměrů je omezení pouze na heterozygotní jedince.

18


V roce 2008 přišel převrat v NIPD aneuploidií, kdy ve dvou nezávislých studiích vědci využili moderní techniky masivního paralelního sekvenování (MPS) pro detekci trizomií. Chiu et al. (2008) analyzovali fragmenty mateřské a fetální volné DNA pomocí technologie Solexa od firmy Illumina. Použili vzorky 14 žen nesoucích plod postižen trizomií 21. chromozomu a 14 žen s plodem euploidním. Výsledky sekvenování jasně určily vyšší podíl sekvencí 21. chromozomu u plodu s DS ve všech případech (Chiu et al., 2008). Fan et al. (2008) analyzovali cffDNA plodů s trizomií chromozomu 21, 18 nebo 13 pomocí vysoce výkonného „shot-gun“ sekvenování. Podobně jako tomu bylo v předchozí studii, i zde metoda dosáhla 100% senzitivity. Zároveň však Fan et al., pozorovali velké rozdíly v obsahu GC bohatých sekvencí jednotlivých chromozomů mezi různými vzorky. Tyto rozdíly vznikají pravděpodobně při PCR a mají za následek, že se citlivost k aneuploidiím chromozom od chromozomu liší. Přestože mají lidské trizomie velice malou variabilitu a jsou snadno detekovatelné i při odlišném poměru CG mezi vzorky, vědci uznávají, že použitím sekvenování jednotlivých molekul je možné docílit větší citlivosti. (Fan et al., 2008). Přístupy sekvenace jednotlivých molekul DNA pro NIPD DS otestovali van der Oever et al. (2012). Pomoci sekvenátoru firmy Helicos, který pracuje bez potřeby amplifikace vzorku, eliminovali chyby v CG poměrech a docílili tak vysoké citlivosti. Tato studie jako první ukázala, že NIPD pomocí sekvenování jednotlivých molekul je velice spolehlivá a přesná metoda, která může nahradit starší postupy (van der Oever et al., 2012). V dnešní době v ČR nabízí několik společností komerční testy aneuploidií. Jedním z těchto testů je projekt PRENASCAN Asociace Center lékařské genetiky ČR. Tento test je schopen pomocí masivního paralelního sekvenování na přístrojích Hiseq (Illumina) detekovat aneuploidie s citlivostí až 99% (www.prenascan.eu). Zlínská firma IMALAB, s.r.o. jako partner společnosti Sequenom Center for Molecular Medicine® nabízí test MaterniT21™ PLUS. Ten je pomocí MPS schopen detekovat všechny 3 nejčastější trizomie, ale také aneuploidie gonozomů nebo mikrodeleční syndromy (www.maternit21.cz). Také klinika PREDIKO, s.r.o. nabízí pod záštitou laboratoří Ariosa Diagnostics Harmony™ test, schopný detekovat 3 nejčastější trizomie s citlivostí až 99% (www.harmony-test.cz). Nespecifický marker Volná DNA fetu v matčině oběhu může sloužit také jako nespecifický marker. Lo et al. (1999) objevili, že u žen trpících preeklampsií je podíl cffDNA v krvi až pětkrát vyšší oproti zdravým ženám. Toho lze využít pro diagnostiku nebo sledování tohoto onemocnění (Lo et al., 1999). Některé pozdější studie tento předpoklad potvrdily (Smid et al. 2001, Farina et al. 2004). 19

Techniky analýzy cffDNA

3. Techniky analýzy cffDNA Základní technologií využívanou pro detekci, kvantifikaci a diagnostiku cffDNA je PCR, nejčastěji její modifikace QF-PCR a digitální PCR v reálném čase. V dnešní době se do klinické praxe zavádějí především techniky nové generace sekvenování (NGS). Funkční principy jednotlivých technologií jsou vysvětleny v následujících podkapitolách. Jejich využitím u konkrétních diagnóz se zabývá kapitola 4.

3. 1. Kvantitativní fluorescenční PCR Samotná PCR neboli polymerázová řetězová reakce byla objevena roku 1985 Kary B. Mullisem. Princip metody spočívá v amplifikaci námi vybraného úseku DNA pomocí uměle syntetizovaných primerů, DNA polymerázy a volných dNTP. Tři po sobě následující kroky zajistí denaturaci dsDNA (1. krok, 95 °C), hybridizaci primerů na konkrétní místo v řetězcích (2. krok, 50-60 °C) a elongaci řetězce pomocí DNA polymerázy (3. krok, 65-75 °C). Opakováním těchto cyklů se docílí exponenciálního růstu koncentrace námi zvoleného úseku DNA. Klasická PCR slouží pouze k amplifikaci vzorku a následná analýza musí být provedena separací gelovou elektroforézou, výsledky mají kvalitativní charakter. Z toho důvodu byla vytvořena PCR v reálném čase (rtPCR), jinak nazývaná kvantitativní fluorescenční PCR (QFPCR). Termocyklér provádějící celou PCR reakci je schopen detekovat narůstající fluorescenční signál v čase a tak přímo zjišťuje koncentraci DNA. Existuje několik typů fluorescenčních sond, které se k tomuto účelu využívají. Některé pracují na principu zhášení, kdy nenavázaná sonda obsahující reportér (vysílač signálu) a tzv. zhášeč (pohlcovač signálu) nevysílá žádný světelný signál, ale po navázání na specifickou cílovou sekvenci v DNA, které způsobí oddálení zhášeče od reportéru, začne vyzařovat fluorescenci. Toto oddálení může být způsobeno úplným odpojením reportéru ze sondy (sondy TaqMan) nebo změnou tvaru sondy (Molecular beacon, MB). V praxi bylo této techniky využito například při studiu závislosti koncentrace cffDNA v matčině oběhu na gestačním věku (Lo et al., 1998a) nebo při hledání původu cffDNA (Alberry et al., 2007). Při diagnostice aneuploidií se používají primery vymezující specifické tandemové repetice na konkrétních chromozomech. Tyto repetice jsou něco jako otisky prstů v DNA a liší se u každého člověka svou délkou. Po provedené kapilární elektroforéze je možné, na základě porovnání velikostí ploch píků, z elektroforetogramu odečíst, zda je jedinec zdravý 20


či nenese aneuploidii (např. 3 různě vysoké vrcholy znamenají trizomii). Tyto repetice ovšem není vhodné zkoumat pomocí fragmentů cffDNA, z důvodu jejich omezené délky. V NIPD monogenních chorob byla technika QF-PCR využita ve studiích rizika paternálně zděděné Huntingtonovi choroby, viz níže (Gonzalez-Gonzalez et al., 2003, Bustamante-Aragones et al., 2008b).

3. 2. Digitální PCR Další diagnosticky hojně využívanou metodou je digitální PCR (dPCR). Ta byla vyvinuta roku 1999 B. Volgensteinem a K. W. Kinzlerem. Princip metody spočívá v rozdělení jednotlivých molekul vzorku do jamek, kde probíhá vlastní PCR. Po amplifikaci oddělených molekul v jamkách se přidávají 2 fluorescenční MB sondy, jedna vážící se na normální alelu a druhá specifická pro mutantní alelu. Každá sonda nese jinou fluorescenční značku a po navázání na produkty amplifikace se jednotlivé jamky rozsvítí příslušnou barvou. Přístroj analyzuje barevné signály a z jejich poměru určí kvantitu molekul ve vzorku (Obr. 1, B. Vogelstein a K. W. Kinzler 1999).

21


Obrázek 1: Schéma dPCR (B. Vogelstein a K. W. Kinzler 1999; upraveno). V prvním kroku dochází k ředění vzorku tak, aby v jedné jamce byla jedna nebo žádná molekula. Dalším krokem je přidání a navázání fluorescenčních sond MB. Zelená sonda se váže na řetězec se standartní alelou a červená na sekvenci s alelou mutantní. Bílé jamky neobsahují žádný produkt PCR.

V PD byla technika dPCR využita např. při neinvazivním testováním srpkovité anémie (Barret et al., 2012, viz níže). V některých studiích byla dPCR zkombinována s měřením relativní mutační dávky (RMD). Pomocí této metody se zjišťuje poměr mezi mutovanými a zdravými alelami ve vzorku matčiny krve. Pokud je matka pro sledovaný znak heterozygotní, určuje se, zda je mutovaná alela v nadbytku (plod je postižen), alely jsou v rovnováze (plod je taktéž heterozygotní) nebo je-li v nadbytku alela standartní (plod je zdravý). RMD vědci využili např. při diagnostice β talasémie (Lun et al., 2008b, viz níže) nebo hemofilie (Tsui et al., 2011, viz níže).

22


3. 3. Droplet Digital PCR Firma QuantaLife představila v roce 2008 nový systém digitální PCR s názvem Droplet digital PCR (ddPCR). V roce 2011 byla společnost odkoupena firmou Bio Rad a dnes patří ddPCR pod tuto značku (www.bio-rad.com). Principem této metody (Obr. 2) je vytváření nanolitrových olejových kapiček oddělujících PCR každého templátu DNA. 8 vzorků společně s komponenty PCR reakce a TaqMan sondami je naneseno do jednotlivých jamek kazety, která obsahuje i jamky pro olej. Systém sám dokáže vytvářet monodisperzní olejové kapičky (~1000k/s), ve kterých probíhá oddělená PCR každého templátu. Kapičky prochází kapilárou jedna po druhé a fluorescenční detektor čte každou jednotlivou kapičku. Software na základě barvy určí pozitivitu či negativitu signálu a spočítá koncentraci (Hindson et al., 2011).

23


Obrázek 2: Droplet digital PCR (Hindson et al., 2011, upraveno). a) Vzorky a olej jsou naneseny do 8 jamek kazety. b) Kapky se vytvářejí automaticky spojením oleje se vzorkem. c) Kapky jsou přeneseny do 96-jamkové destičky a je provedena PCR (d). e) Dělící olej odděluje jednotlivé kapky a ty procházejí pod detektorem vypočítá

fluorescence. koncentraci

f)

Software

na

základě

fluorescenčních signálů.

Přístroje QX100 a QX200 firmy Bio Rad pracující na principu ddPCR dokáží z 20µl vzorku vytvořit až 20 000 kapiček a jsou schopny detekovat mutaci s frekvencí výskytu 0,001% ve vzorku (www.bio-rad.com).

3. 4. MALDI-TOF Jednou z dalších metod využívaných pro NIPD monogenních onemocnění je hmotnostní spektrometrie pomocí laserové desorpce/ionizace za účasti matrice (MALDI), společně s analýzou na průletovém hmotnostním analyzátoru (TOF). 24


Hmotnostní spektrometrie slouží k rozdělení ionizovaných molekul podle jejich molekulové hmotnosti. V případě metody MALDI-TOF (Obr. 2) se pro ionizaci vzorku používá laser. Ten neosvěcuje vzorek přímo, ale přes tzv. matrici, což je látka, která absorbuje záření laseru, ionizuje se a předává energii molekulám vzorku. Tímto způsobem je zabráněno porušení struktury molekul vlivem laseru. Po ionizaci vstupují uvolněné molekuly vzorku do trubice detektoru letu, kde jsou rozděleny podle molekulové hmotnosti a náboje. Seřazené molekuly dopadají na detektor a z doby letu je možné vypočítat poměr hmotnosti a náboje (Havliš 1999).

Obrázek 3: MALDI-TOF (www.mpipz.mpg.de, upraveno) Na vzorek s matricí dopadá paprsek laseru, který ionizuje molekuly matrice a ty předávají energii molekulám vzorku. Po průletu trubicí se ionizované molekuly rozdělují podle velikosti a dopadají na detektor. V praxi se tato technika využívá pro analýzu peptidů a bílkovin, ale také nukleových kyselin (Havliš 1999). Pro NIPD monogenních onemocnění byla využita např. při studiu achondroplázie (Li et al., 2007, viz níže).

3. 5. Nová generace sekvenování (NGS) Sekvenování neboli čtení pořadí nukleotidových bází v NK bylo objeveno v 70. letech minulého století. Do nedávné doby se v praxi využívala především modifikovaná metoda Fredericka Sangera, ale od roku 2005 se čím dál více využívají techniky NGS. Tyto metody dokáží na rozdíl od jejich předchůdců pracovat na principu MPS, tedy sekvenují velké množství molekul zároveň a jsou tak efektivnější, rychlejší a tedy i ekonomicky výhodnější než metody 25


klasické. Mezi systémy NGS patří především 454 od firmy Roche, Solexa firmy Illumina, SOLiD firmy Applied Biosystems a Ion Torrent od Life Technologies.

3. 5. 1. 454 Roche V roce 2005 byl firmou Roche na trh uveden vůbec první přístroj NGS pracující na principu pyrosekvenování. Pyrosekvenování je založeno na pyrofosfátové detekci, která byla vyvinuta Nyrénem a Lundinem v roce 1985. Postup celého cyklu začíná připojením adaptorů A a B na 5‘ konce fragmentu DNA. Pomocí adaptoru B se fragment kovalentně připojí na magnetickou mikrokuličku. Po připojení fragmentů se kuličky protřepávají v emulzi vody a oleje, dokud každá jednotlivá kulička není olejovou kapkou oddělena od ostatních. Poté se provádí tzv. emulzní PCR (emPCR), kdy v každé kapce probíhá vlastní oddělená amplifikace fragmentu na kuličce. Následně jsou kuličky aplikovány na mikročip obsahující jamky pro jednotlivé kuličky. Společně s kuličkami se do jamek dostává i DNA polymeráza, ATP sulfuryláza, luciferin a luciferáza. Přes destičku se přelévá roztok obsahující vždy jeden typ dNTP. Pokud je nukleotid připojen, uvolňuje se pyrofosfát, ten je ATP sulfurylázou přeměněn na ATP, který aktivuje oxidaci luciferinu na oxiluciferin pomocí luciferázy. Reakce uvolní energii ve formě světla, které detekuje optické vlákno v jamce (Obr. 3, www.454.com). Software podle intenzity signálu určí, kolik nukleotidů se začlenilo a tímto způsobem je přečten celý fragment DNA (www.454.com).

26


Obrázek 4: Pyrosekvenování (www.454.com, upraveno) Polymeráza prodlužuje primer ve směru ke kuličce. Připojený nukleotid uvolňuje APS a ten je pomocí sulfurylázy přeměněn na ATP, který dodává energii luciferáze pro oxidaci luciferinu na oxiluciferin za vyzáření světelné energie. V roce 2011 firma představila přístroj GS FLX+, který dokáže číst fragmenty o délce 1kb a v jednom běhu (23h) tak dokáže přístroj osekvenovat až 1 000 000 000 bází (www.454.com). Z hlediska citlivosti, ceny, časové náročnosti a také velikosti přístroje se pro PD jeví jako vhodný přístroj GS Junior představený firmou Roche v roce 2010.

3. 5. 2. Solexa Illumina V roce 2006 byl firmou Solexa představen sekvenátor Genome Analyzer. O rok později byla tato firma koupena společností Illumina. Podobně jako u předchozího systému je i tento založen na sekvenaci syntézou a to konkrétně pomocí tzv. můstkové PCR. U technologie Solexa (Obr. 4) se nejprve provádí fragmentace DNA (200-250bp), poté se konce štěpů zarovnají polymerázou a na konce jsou připojeny adaptory podobně jako u předchozí metody. Pomocí těchto adaptorů se fragmenty váží na oligonukleotidy připojené na destičce. Následně probíhá můstková PCR, kde v prvním kroku dojde k denaturaci vzniklých řetězců a jejich ohnutí a připojení komplementárních adaptorů k sousedním oligonukleotidům. Tímto způsobem vzniká několik milionů shluků amplikonů, přičemž každý shluk obsahuje až 1000 těchto kopií. Samotná sekvenace syntézou probíhá podobně jako u pyrosekvenování. Každý volný nukleotid je označen jinou fluorescenční barvou a citlivá CCD kamera zaznamenává barevné signály příslušných shluků. Po připojení jednoho nukleotidu je syntéza řetězce pozastavena, a jakmile je fluorescenční značka odmyta z nukleotidu, může být připojen další (www.illumina.com).

27


Obrázek 5. Princip sekvenování firmy Illumina (www.bitesizebio.com, upraveno) V prvním kroku dochází k fragmentaci DNA a následné selekci úseků o délce 200 – 300bp. Po připojení adaptorů jsou fragmenty připojeny na oligonukleotidy na čipu. Následně probíhá můstková PCR a vzniká několik milionů shluků amplikonů. V závěru je provedena samotná sekvenace syntézou pomocí reverzibilně terminačních, fluorescenčně značených nukleotidů. V současné době firma Illumina nabízí několik přístrojů pracujících na principu můstkové PCR a sekvenace syntézou. Jsou to například MiSeq který dokáže přečíst 7,5 – 8,5 28


Gb za cca 39 hodin nebo sekvenátor HiSeq, který přečte až 1Tb za 6 dní. Pro diagnostické účely společnost vyvinula sekvenátor MiSeqDx, který je navržen speciálně pro klinické laboratorní prostředí (www.illumina.com). Přístroj Genome Analyzer IIx byl využit pro celogenomové sekvenování za účelem NIPD talasémie (Lo et al., 2010, viz níže). HiSeq 2000 zase pro cílené sekvenování mutantních otcovských alel talasémie u plodu (Papasavva et al., 2013, viz níže).

3. 5. 3. SOLiD System Applied Biosystems Sekvenátor SOLiD System byl na trh uveden v roce 2007 pod taktovkou společnosti Applied Biosystems (AB). AB je dnes součástí značky Life Technologies, která patří firmě Thermo Fisher Scientific. Na rozdíl od předchozích systémů pracuje platforma SOLiD na principu ligace (www.lifetechnologies.com). Systém funguje následovně, po navázání adaptorů na fragmenty DNA se provádí emPCR na mikrokuličkách podobně jako u pyrosekvenování. Následně jsou kuličky komplementárně navázány na povrch destičky. Sekvenování ligací je zajištěno specifickými sondami. Ty jsou složeny z 8 bazí dlouhého řetězce na jehož 5‘ konci je připojena fluorescenční značka. Existují 4 základní sondy nesoucí vždy jinou barvu a jejich specificita je dána prvními dvěma nukleotidy. V prvním sekvenačním cyklu je na adaptor připojen primer o délce n nukleotidů. Za něj je pomocí ligázy připojena některá ze sond podle principu komplementarity, příslušná barva je zaznamenána, sonda je štěpena mezi 5. a 6. nukleotidem a následně je navázána sonda nová. Tímto způsobem je přečten vždy 1 pár nukleotidů ob 3 neznámé. Je tedy potřeba opakování sekvenačních cyklů s primerem vždy o jeden nukleotid kratším (n-1, n-2, n3, n-4). Tímto způsobem je zajištěno přečtení každé báze dvakrát (ve dvou po sobě následujících cyklech) a zvyšuje se tak citlivost metody. Tento princip se nazývá tzv. dvoufázové dekódování (Obr. 5, www.lifetechnologies.com).

29


Obrázek 6. Sekvenování SOLiD Applied Biosystems (www.lifetechnologies.com, upraveno) 1. k primeru je ligázou připojena jedna ze 4 sond charakterizovaná prvními dvěma nukleotidy. 2. sekvenační cykly se opakují vždy s o jeden nukleotid kratším primerem pro pokrytí celého čteného fragmentu. Platforma AB byla využita např. pro NIPD paternálně zděděné Retinitis pigmentosa (Bustamante-Aragones et al., 2006, viz níže). Nejnovější přístroje AB dosahují citlivosti až 99,99% (www.lifetechnologies.com). Pro diagnostické účely je z hlediska ceny a rychlosti vhodný přístroj IonTorrent patřící také pod značku Life Technologies, ten ovšem pracuje na jiném principu než systém SOLiD, viz níže.

3. 5. 4. Ion Torrent Life Technologies V roce 2011 byl představen přístroj Ion Torrent pod značkou Life Technologies. Tato technologie přichází se zcela novým systémem sekvenování bez potřeby použití fluorescenčních značek či terminačních nukleotidů. Princip metody (Obr. 6) spočívá v detekci vodíkových iontů uvolněných při inkorporaci nukleotidu do řetězce DNA. Samotná příprava knihovny probíhá jako v předchozích metodách napojením adaptorů a následnou emulzní PCR. Několikavrstevný čip s jamkami pro mikrokuličky obsahuje pod každou jamkou senzor citlivý na změnu pH. Přes destičku jsou 30


postupně přelévány roztoky s určitým typem dNTP a po jeho připojení DNA polymerázou je z vazby uvolněn H+. Senzor detekuje každý jednotlivý iont, a rozpozná tak, zda se připojil jeden či více nukleotidů (Rothberg et al., 2011).

Obrázek 7. Sekvenování Ion Torrent (www.genomics.cn, upraveno) Příprava knihovny začíná fragmentací DNA a připojením adaptorů (b). Poté následuje emPCR (c) a samotné sekvenování (d). Senzor detekuje uvolněné vodíkové ionty a určuje počet začleněných nukleotidů podle síly signálu. Life technologies na svých stránkách uvádí, že přístroj Ion Proton, pracující na stejném principu, dokáže přečíst až 10Gb za 4 hodiny při délce čtených fragmentů 200 bází (www.lifetechnologies.com).

31

Neinvazivní prenatální diagnostika monogenních onemocnění

4. Neinvazivní prenatální diagnostika monogenních onemocnění Monogenně vázané choroby mají původ v mutacích v jediném genu. Ty mohou způsobovat např. nedostatečnou či naopak zvýšenou expresi genu a tím ovlivňovat metabolické dráhy kódovaných enzymů, nebo mohou pozměňovat struktury a tedy i vlastnosti proteinu. Rozlišujeme tři základní typy monogenních onemocnění a to autozomálně dominantní, autozomálně recesivní a pohlavně vázané. V dnešní době je známo více než 10 000 těchto poruch. V následujících podkapitolách jsou zmíněna některá onemocnění s uvedením jejich klinických projevů, molekulárně-genetických poznatků a metodických přístupů jejich diagnostiky.

4. 1. Autozomálně dominantní onemocnění U tohoto typu dědičnosti je přenos znaku podmíněn dominantní alelou. Znak se projevuje fenotypově jak u heterozygotů (Aa), tak u dominantních homozygotů (AA). Pokud znak vykazuje neúplnou dominanci, fenotypový projev u heterozygotů je slabší než u dominantních homozygotů. Jestliže je jedinec recesivní homozygot (fenotypově zdravý), mutantní alelu nepředává do další generace. V případě autozomálních onemocnění je každé pohlaví postiženo stejně často. Prenatální diagnostika se nejprve zaměřovala na těhotenství s rizikem vzniku poruchy pocházejícím z otcovy strany, jelikož techniky NIPD nedokázaly dobře rozeznat mutantní alely fetu zděděné od matky na pozadí matčiny vlastní volné DNA. Průlom přichází až s objevením moderních technik NGS. Mezi nejčastěji diagnostikované autozomálně dominantní choroby patří Huntigtonova choroba (HD), achondroplázie a myotonická dystrofie (MD).

4. 1. 1. Huntingtonova choroba Toto onemocnění je způsobeno mutací v genu HTT nacházejícím se na 4. chromozomu. Protein huntingtin, kódovaný tímto genem, je spojen s funkcí centrální nervové soustavy. Vyznačuje se repeticí maximálně 35 tripletů CAG, které kódují aminokyselinu glutamin. Mutace v genu způsobuje zmnožení tripletů nad hranici 35 a přebytečné glutaminy 32


v polypeptidovém řetězci změní funkci huntingtinu. To má za následek neurodegenerativní změny CNS. V závislosti na délce repetice se mohou první příznaky objevit kdykoli během života, ale nejčastěji to bývá okolo 40. roku. Mezi projevy onemocnění patří chorea, deprese, psychóza a progresivní retardace. Trvání choroby je kolem 20 let a končí smrtí (Walker 2007). González-González et al. (2003) poprvé diagnostikovali HD pomocí QF-PCR u zdravé ženy nesoucí plod s rizikem paternálně zděděné HD. Metoda odhalila přítomnost dvou normálních a jedné mutantní alely a výsledky byly potvrzeny invazivními metodami. Sami autoři ale uvádějí nevýhodu metody v omezení pouze na paternálně zděděná onemocnění (González-González et al., 2003). Bustamante-Aragones et al. (2008b) využili dinukleotidový polymorfní mikrosatelit I1CADH-2, nacházející se na exonu 1 genu HTT, pro NIPD 4 těhotenství s rizikem paternálně zděděné HD. Ve 2 případech byla objevena mutantní alela zděděná od otce, v jednom případě byly diagnostikovány pouze zdravé alely a v posledním vzorku nebyla detekována ani normální ani mutantní otcovská alela. Teprve až odběr choriových klků a následná diagnostika odhalila u čtvrtého případu mutantní alelu s repeticí 114 CAG. Falešně negativní výsledek byl zapříčiněn malou délkou cffDNA, která znemožnila správnou detekci takto dlouhé repetice (BustamateAragones et.al. 2008b). 4. 1. 2. Achondroplázie Achondroplázie je nejčastější kostní dysplazií u člověka. Vzniká většinou de novo a to především v otcovské linii v závislosti na věku rodiče (vyšší riziko nad 35 let). Podstatou onemocnění je mutace v genu FGFR3. Ta způsobí záměnu báze G za A v pozici 380 (nebo C v pozici 375) v tripletu GGG kódujícím aminokyselinu glycin. Takto vzniklá AMK arginin mění funkci receptoru fibroblastového růstového faktoru 3 kódovaný genem FGFR3. Důsledkem mutace je změna v aktivaci receptoru a inhibice proliferace fibroblastů prostřednictvím signálních drah (Horton et al., 2007). Příznaky onemocnění jsou poruchy v růstu kostí, celkově malý vzrůst, mikromelie, brachycefalická lebka, vystouplé čelo, hyperlordóza bederní páteře, krátké končetiny, mikrodaktylie. Průměrná výška dospělého muže je 131cm a ženy 125cm. Svaly ani vnitřní orgány postiženy nejsou. Intelekt jedinců s achondroplázií je často nadprůměrný. Jako první provedli NIPD achondroplázie Saito et al. v roce 2000. Na základě ultrasonografického vyšetření vědci odebrali matce s podezřením postižení plodu vzorek periferní krve a plodové vody. Pomocí metody PCR zmnožili specifické fragmenty genu 33


FGFR3 a na základě detekce polymorfismů délek restrikčních fragmentů (RFLP) na elektroforetickém gelu úspěšně analyzovali mutaci v tomto genu (Saito et al., 2000). Li et al. (2004) využili pro citlivější analýzu techniku zvýšení koncentrace cffDNA pomocí gelové elektroforézy. Na základě studie Chana et al., (2004) byly fragmenty kratší než 300pb odseparovány a pomocí PCR amplifikovány specifické úseky genu FGFR3. Následná restrikční analýza odhalila mutaci. Autoři práce uvádějí, že obohacení cffDNA pomocí elektroforetické frakcionace je významný krok k přesnější detekci sekvencí plodu, které se jen málo odlišují od matčiny vlastní volné DNA (Li et al., 2004). S příchodem techniky hmotnostní spektrometrie pomocí laserové desorpce/ionizace za účasti matrice (MALDI) společně s analýzou na průletovém hmotnostním analyzátoru (TOF) dokázali vědci mnohem efektivněji detekovat jednonukleotidové mutace. Kombinací elektroforetické frakcionace s metodou MALDI-TOF byla diagnostikována achondroplázie plodu u dvou zdravých rodičů a u plodu s rizikem paternálně zděděného onemocnění s velmi vysokou senzitivitou. Výsledky práce ukázaly, že analýza velikostně separované cffDNA zlepšila detekci mutace genu FGFR3 oproti jiným technikám analyzujícím celkovou plazmatickou DNA (Li et al., 2007). Lim et al. (2010) testovali dvě zdravé těhotné ženy, z nichž jedna nesla plod postižen achondroplázií. Pro detekci mutace v genu FGFR3 využili techniku QF-PCR. Vědci testovali matčinu vlastní DNA, DNA plodu a také celkovou DNA v plazmě matky. U případu s nemocným plodem byla v plazmě detekována mutantní alela G a v nadbytku zdravá alela A. Potvrdila se tak heterozygotnost plodu pro achondroplázii. Spolehlivost metody byla potvrzena sekvenováním (Lim et al., 2010). 4. 1. 3. Myotonická dystrofie Tato autozomálně dominantní multi-systémová porucha postihuje kosterní svalstvo, hladké svalstvo, srdce, oči, nervovou tkáň i endokrinní systém. Rozlišují se 2 hlavní typy, MD typu jedna a dvě. Nejčastější a klinicky nejzávažnější formou je MD typu 1. Expanze CTG trinukleotidových repetic genu DMPK (kóduje myotonin) na chromozomu 19 nad normální hodnotu (35) vede ke vzniku choroby. Vyšší počet repetic má za následek vážnější průběh onemocnění a časnější úmrtí. Mezi příznaky patří svalová slabost, katarakta, myotonie, hypotonie, kognitivní poruchy, respirační potíže, srdeční poruchy, diabetes, hypogonadyzmus, postižení očí, deformace kostí v obličejové části, poruchy gastrointestinálního a imunitního systému. Nejčastější příčinou úmrtí jsou respirační problémy a srdeční komplikace. 34


Druhý typ je způsoben zmnožením tetranukleotidových sekvencí CCTG genu ZNF9 na chromozomu 3. Tato forma má podobné příznaky jako MD typu 1, ale mírnější. Je podstatně vzácnější, jen 2% MD jsou tohoto typu. Amicucci et al. (2000) provedli první diagnostiku zmožení tripletů CTG pomocí PCR. Vědci odebrali krev zdravé matce i postiženému otci. Pro potvrzení přítomnosti cffDNA v matčině plazmě byla provedena Y-specifická PCR, pomocí které bylo zjištěno, že je plod mužského pohlaví. Následně byla amplifikována specifická sekvence genu DMPK obsahující CTG repetice. Elektroforetická separace na agarózovém gelu ukázala přítomnost normální mateřské alely a mutované alely zděděné po otci (Amicucci et al., 2000).

4. 2. Autozomálně recesivní onemocnění Znak je podmíněn recesivní alelou a fenotypově se projevuje pouze u recesivních homozygotů (aa). U dominantních homozygotů (AA) nebo heterozygotů (Aa) se klinicky mutantní alela neprojevuje, pokud se ovšem neuplatňuje neúplná dominance. Obě pohlaví mají stejné riziko postižení. U NIPD těchto onemocnění je, podobně jako u autozomálně dominantních, problém pozadí matčiny vlastní volné DNA, díky které není možné dobře rozeznat, zda je mutovaná alela pouze matčina nebo ji zdědil také plod. Mezi nejčastěji diagnostikovaná recesivní onemocnění patří talasémie, srpkovitá anémie nebo cystická fibróza.

4. 2. 1. Talasémie Tato choroba postihuje podjednotky řetězce hemoglobinu. Rozlišují se dva základní typy tohoto onemocnění, α a β. Pro správnou tvorbu α řetězců hemoglobinu jsou potřeba dva funkční geny (HBA1 a HBA2) na chromozomu 16, nemoc se projevuje v různém stupni závažnosti podle toho, kolik alel ze čtveřice chybí. Ztráta 2 alel způsobuje tvorbu malých světlých červených krvinek a slabou anémii, ztráta 1 alely nemá většinou žádné fenotypové projevy, ale může se přenášet do další generace. Častějším typem talasémie je forma β. Mutace v genu HBB pro β řetězec na chromozomu 11 vede k poruše tvorby tohoto řetězce. Může být způsobena různými mechanizmy a každá se vyskytuje v jiných populacích s určitou frekvencí. Nejčastěji se toto onemocnění objevuje v oblastech Středomoří, centrální Asie, Indie, jižní Číny, jižní a severní Afriky. Poruchy hemoglobinu obecně vedou k hypochromní a mikrocytární anémii, splenomegalii a extramedulární hemopoeze.

35

K léčbě se využívají


transfuze krve, případně transplantace kostní dřeně (Harteveld a Higgs 2010, Gallanelo a Origa 2010) První NIPD talasémie provedli Chiu et al. v roce 2002. Diagnostikovali deleci tetranukleotidové sekvence - CTTT kodonu 41/42 v genu pro β globin, která způsobuje až 40% případů talasémie v Hong Kongu. Pro NIPD 100 vzorků využili QF-PCR v reálném čase se sondami TaqMan. Vědci konstatují, že i přes velmi přesnou detekci delece je nevýhodou této metody neschopnost detekovat rozdíl mezi minoritní a majoritní formou u paternálně zděděných onemocnění. Jinak řečeno, zdali plod zdědil mutaci od obou rodičů (majoritní) nebo jen od otce (minoritní) (Chiu et al., 2002). Tento problém vyřešili Lun. et al. (2008) použitím tzv. digitálně měřené relativní mutační dávky (RMD). Princip této metody spočívá v digitálním porovnání poměru mutovaných alel k normálním. Pokud je matka heterozygotní pro sledovaný znak, je zjištěn poměr alel v plazmě matky, a následně je odvozeno, zda má plod minoritní či majoritní formu β talasémie. Pro zvýšení koncentrace cffDNA potřebné ke správné RMD tým vytvořil techniku NASS (z angl. Digital Acide Size Selection), která prostřednictvím dvou přímých a jednoho reverzního primeru amplifikuje kratší fragmenty volné DNA. Kombinací těchto přístupů diagnostikovali deleci – CTTT a záměnu G za A v genu HbE u plodů 5 heterozygotních matek. První mutace byla ve všech případech diagnostikována správně (3 major, 2 minor), avšak druhá byla ve dvou případech diagnostikována chybně (1 major, 1 minor, 1 zdravý, 2 neklasifikovány) (Lun et al., 2008b). Lo et al. (2010) využili techniku masivního paralelního sekvenování k vytvoření celogenomového profilu plodu. Zkoumali plod, jehož otec byl postižen delecí – CTTT a matka mutací A>G v genu HBB. Byla provedena genotypizace SNP otce a matky z leukocytů a plodu z buněk choriových klků. Následovalo rozdělení jednotlivých SNP do kategorií podle toho, zda je matka či otec homozygot nebo heterozygot. Vytvoření otcovského genotypu a mateřského haplotypu (skupina společně děděných SNP) umožnilo vědcům sestavit celý genom plodu z fragmentů cffDNA pomocí sekvenování až s 65 násobným pokrytím. Analýzou genomu bylo zjištěno, že plod zdědil od otce deleci – CTTT a od matky alelu normální. Zároveň autoři studie dokázali, že lze v matčině plazmě nalézt kompletní genom plodu (Lo et al., 2010). Jelikož je celogenomové sekvenování časově a finančně náročné, rozhodli se v roce 2013 Papasavva et al. otestovat tzv. cílené sekvenování SNP. Vybrali 4 nejčastější SNP v genu pro β globin u kyperské populace. Odebrali vzorky krve 10 rodin (3 generací), společně s CVS. Při amplifikaci jednotlivých úseků genu se sledovanými SNP využili vědci techniky tzv. „slepování“ s genomovou DNA, aby určili specifitu testu pro každou ze sledovaných SNP. 36


Použili 100% genomové DNA homozygotní pro sledované SNP a vzorek obsahující 90% homozygotní DNA s přídavkem 10% heterozygotní DNA. Pro potvrzení reprodukovatelnosti výsledků provedli 4 opakování pro každou SNP zvlášť. Samotné sekvenování bylo provedeno na přístroji HiSeq 2000 firmy Illumina. U plodů ze 4 rodin byla správně detekována mutantní otcovská alela na základě výsledků všech 4 SNP. U dalších 4 plodů jiných rodin byla detekována normální otcovská alela. Ve dvou případech nebylo možné alely správně analyzovat. Vědci konstatují, že pro efektivnější a přesnější diagnostiku β talasémie je potřeba více než 4 SNP (Papasavva et al., 2013). 4. 2. 2. Srpkovitá anémie Podobně jako β-talasémie je i srpkovitá anémie způsobena mutací v genu pro βglobinový řetězec hemoglobinu. Konkrétně pak záměna nukleotidu A za T v tripletu CAG, který kóduje AMK glutamovou. To způsobí záměnu na valin, který v řetězci mění strukturu proteinů, ty se agregují do provázkovitých struktur napříč červenou krvinkou. Při vzniku deoxyhemoglobinu se mění její tvar na srpkovitě prohnutý. Takto pozměněné erytrocyty špatně procházejí kapilárami a ucpávají je. Klinickými příznaky onemocnění jsou anémie, hypoxie, infarkty, ischemie a zmenšená slezina (Stuart a Nagel 2004). Byla provedena NIPD 65 plodů s rizikem zděděné srpkovité anémie pomocí digitální PCR. Vědci použili sondy TaqMan specifické pro mutaci A>T. Technikou RMD byla správně určena diagnóza pouze u 52 případů z 65, ale u vzorků s koncentrací vyšší než 7% cffDNA byla senzitivita metody 100%. Tento výsledek zároveň podporuje dřívější tvrzení, že vyšší koncentrace cffDNA ve vzorku zvyšuje citlivost její diagnostiky (Barrett et al., 2012). Phylipsen et al. (2012) využili techniky PAP (z angl. Pyrophosphorolysis activated polymerization) pro NIPD hemoglobinopatií (β talasémie, srpkovitá anémie) 13 plodů. Podstatou PAP je primer, který na svém 3‘ konci nese dideoxynukleotid komplementární k mutované alele v cílovém řetězci. Tímto způsobem je zajištěno, že primer nasedne pouze na sekvence s mutací a po odstranění ddNTP může být provedena specifická cílená PCR. Ve všech 13 případech byla správně detekována otcovská alela na pozadí mateřské volné DNA a u plodu s rizikem vrozené hemoglobinopatie bylo onemocnění vyloučeno. Stejných výsledků dosáhly invazivní postupy, což potvrdilo možnost využití PAP pro NIPD (Phylipsen et al., 2012).

37


4. 2. 3. Cystická fibróza Toto další velice časté onemocnění je způsobeno mutací v genu CFTR (z angl. cystic fibrosis transmembrane conductance regulator) kódujícím chloridový kanál. Je známo více než 1000 mutací tohoto genu, nejčastější je F508del. Porucha ve funkci chloridového kanálu vede ke špatnému transportu chloridových iontů, což má za následek nadměrnou reabsorbci sodíku. Z důvodu zvýšení osmotického tlaku dochází k dehydrataci hlenu především v dýchací soustavě a gastrointestinálním traktu (GIT). K příznakům patří bronchiolitida, pneumonie, pneumotorax, plicní hypertenze, kašel a především infekce způsobené izotonicitou periciliární tekutiny. V GIT je to nedostatečná sekrece pankreatu, deficit vitamínů a minerálů, i přes nadměrný příjem potravy děti nepřibývají na váze. Neprůchodnost vas deferens vede u mužů k neplodnosti (Ratjen a Döring 2003). Využít cffDNA pro diagnostiku cystické fibrózy se rozhodli González-González et al. v roce 2002. Testovali rodinu, jejichž první dítě bylo postiženo CF. U otce byla zjištěna mutace Q890X a u matky G542X genu CFTR v heterozygotním stavu. Vědci pomocí PCR amplifikovali úsek genu s mutací. Následně provedli restrikční analýzu bodové mutace Q890X. Separace fragmentů na agarózovém gelu ukázala přítomnost normální i mutantní alely (González-González et al., 2002). Bustamante-Aragones et al. (2008a) použili techniku SNaPshot od firmy Applied Biosystems k detekci mutací genu CFTR u 3 plodů s rizikem paternálně zděděné CF. Tato metoda

je

založena

na

minisekvenování

pomocí

fluorescenčně

značených

dideoxyribonukleotidů (ddNTP), které fungují jako terminátory elongace primeru. Pokud je v určitém místě fragmentu DNA pozměněna báze, příslušný ddNTP se začlení do řetězce a syntéza dále neprobíhá. Analyzátor poté přečte barvu příslušného fluorochromu, a tak zjistí, jaký typ báze se v místě mutace nachází. U dvou případů ze tří byla diagnostikována CF. Diagnózu potvrdily i výsledky invazivní PD (Bustamante-Aragones et al., 2008a).

4. 3. Gonozomální onemocnění Jde o mutace vyskytující se na pohlavních chromozomech (gonozomech). Většina těchto onemocnění je vázána na chromozom X. Pokud je znak dominantní, projevuje se jak u mužů, tak u žen, které bývají z pravidla heterozygotní. U recesivně dědičných chorob se mutace projevuje u mužů vždy, jelikož mají pouze jednu alelu, a u žen jen pokud jsou pro sledovaný 38


znak homozygotní. Mezi nejčastěji diagnostikovaná onemocnění patří hemofilie nebo retinitis pigmentosa.

4. 3. 1. Hemofilie Toto recesivní onemocnění je způsobeno mutacemi genů pro koagulační faktory. Existují 2 základní typy s X-vázanou dědičností. Nejčastější je typ A, který je způsoben mutací v genu kódujícím koagulační faktor VIII a typ B, způsoben mutací genu pro faktor IX. Další formou hemofilie je typ C, který se dědí autozomálně recesivně a je dán mutací genu pro faktor XI. Obecně se nemoc projevuje jako porucha srážlivosti krve z důvodu nedostatku nebo snížení aktivity faktorů kaskády hemokoagulace. S tím jsou spojeny komplikace jako krvácení do kloubů a svalů (Bolton-Maggs a Pasi 2003) I v případě hemofilie vědci testovali využití techniky dPCR a RMD pro NIPD typů A a B. 7 těhotným ženám přenášejících hemofilii (3 s typem A a 4 s typem B) byly odebrány vzorky krve a digitálně bylo vyhodnoceno množství mutovaných alel k normálním. Jelikož byla matka heterozygotní (jeden chromozom X zdravý a druhý mutovaný), poměrově se určilo, zda je množství mutovaných alel v krvi větší (plod je nemocný) nebo menší (plod je zdravý) než alel normálních. 4 plody byly vyhodnoceny jako postižené (3 forma A a 1 forma B) a zbývající plody nesly chromozom X s normální alelou (Tsui et al., 2011). 4. 3. 2. X – vázaná retinitis pigmentosa (XLRP) Je známo více než 100 genů způsobujících RP. X-vázaná forma onemocnění je nejméně častým typem (5-15% případů). Byly identifikovány 2 geny pro XLPR: RPGR (70-80% případů) a RP2 (7-10%). Toto degenerativní onemocnění postihuje sítnici a projevuje se zhoršeným viděním ve tmě, ztrátou periferního vidění, snížením barvocitu až úplným oslepnutím (většinou kolem 60. roku života) (Hartong et al., 2006). Bustamante-Aragones et al. (2006) testovali plod s rizikem paternálně zděděné XLRP u matky s mozaicismem 45,X/46,XX. Otec byl nositelem mutace v genu RP2. Pro NIPD mutace byla zvolena metoda sekvenování a to konkrétně platforma firmy Applied Biosystems. Elektroforetogram ukázal přítomnost otcovské mutantní alely v matčině plazmě. Sekvenováním mateřské DNA bylo vyloučeno, že by mohla být nalezená mutantní alela matčina. Výsledky byly potvrzeny i analýzou délky restrikčních fragmentů (BustamanteAragones et al., 2006). 39

Závěr

5. Závěr Prenatální diagnostika naráží na mnoho etických aspektů, především při umělém ukončení těhotenství. Genetické poradenství a PD informuje rodiče o rizicích, nabízí jim podporu a informuje je o možnostech dalších postupů, mimo jiné právě umělé ukončení těhotenství na základě nepříznivé genetické diagnózy. U onemocnění, která přímo neohrožují život dítěte (např. Klinefelterův syndrom), se nabízí otázka, zda je správné rozhodovat o jeho životě ještě před narozením. Dalším problémem může být selekce podle pohlaví, kdy rodiče preferující jedno pohlaví dítěte mohou hledat záminky k ukončení těhotenství. V těchto případech záleží pouze na právních normách jednotlivých států a přístupu doktorů. Od objevu cffDNA v devadesátých letech uplynulo již mnoho let a za tu dobu dosáhl výzkum NIPD velkých pokroků. Především pak na poli technologií, kterými by bylo možné detekovat různé genetické abnormality rychleji, levněji a hlavně šetrněji. Přístupy NGS nabízí zcela nové možnosti NIPD a řeší problémy pozadí mateřské volné DNA u maternálně zděděných onemocnění. Tyto přístroje potřebují pro správnou detekci amplifikaci vzorku, při které může docházet k záměnám bází, což může znamenat problém u detekce SNP. Třetí generace sekvenování, neboli sekvenování jednotlivých molekul DNA, je novým přístupem, který sekvenováním bez nutnosti amplifikace vzorku řeší tento problém. NIPD je oborem relativně mladým, ale dynamicky se rozvíjejícím, a je jen otázkou času, kdy budou tyto doposud screeningové metody stačit k definitivní diagnostice bez nutnosti aplikace invazivních procedur.

40

Literatura

6. Literatura Alberry M., Maddocks D., Jones M., Hadi M. A., Abdel-Fattah S., Avent N., Soothill P. W. 2007. Free fetal DNA in maternal plasma in anembryonic pregnancies: confirmation that the origin is the trophoblast. - Prenat. Diagn. 27: 415–418.

Amicucci P., Gennarelli M., Novelli G., Dallapiccola B. 2000. Prenatal diagnosis of myotonic dystrophy using fetal DNA obtained from maternal plasma. – Clin. Chem. 46: 301-302 Barrett A. N., McDonnell T. C. R., Chan K. C. A., Chitty L. S. 2012. Digital PCR Analysis of Maternal Plasma for Noninvasive Detection of Sickle Cell Anemia. - Clin. Chem. 58: 10261032 Avent D. N. a Reid M. E. 2000. The Rh blood group system: a review. – Blood 95: 375-387.

Benn (Chair) P., Borell A., Chiu R., Cuckle H., Dugoff L., Faas B., Gross S., Johnson J., Maymon R., Norton M., Odibo A., Schielen P., Spencer K., Huang T., Wright D., Yaron Y. 2013. Position statement from the aneuploidy screening committee on behalf of the board of the international society for prenatal diagnosis. – Prenat. Diagn. 31: 519-522

Bianchi D. W., Simpson J. L., Jackson L. G., Elias S., Holzgreve W., Evans M. I., Dukes K. A., Sullivan L. M., Klinger K. W., Bischoff F. Z., Hahn S., Johnson K. L., Lewis D., Wapner R. J., de la Cruz F. 2002. Fetal gender and aneuploidy detection using fetal cells in maternal blood: analysis of NIFTY I data. National Institute of Child Health and Development Fetal Cell Isolation Study. - Prenat. Diagn. 22: 609–615. Bolton-Maggs P. H. B., Pasi K. J. 2003. Haemophilias A and B. – The Lancet 361: 1801-1809

Bustamante-Aragones A., Garcia-Hoyos M., Rodriguez De Alba M., Gonzalez-Gonzalez C., Lorda-Sanchez I., Diego-Alvarez D., Trujillo-Tiebas M. J., Ayuso C., Ramos C. 2006. Detection of a paternally inherited fetal mutation in maternal plasma by the use of automated sequencing. - Ann. N. Y. Acad. Sci. 1075: 108–117.

Bustamante-Aragones A., Gallego-Merlo J., Trujillo-Tiebas M. J., Rodriguez de Alba M., Gonzalez-Gonzalez C., Glover G., Diego-Alvarez D., Ayuso C., Ramos C. 2008a. New 41

Literatura

strategy for the prenatal detection/exclusion of paternal cystic fibrosis mutations in maternal plasma. – Jour. of Cyst. Fibro. 7: 505 – 510.

Bustamante-Aragones A., Trujillo-Tiebas M. J., Gallego-Merlo J., Rodriguez de Alba M., González-González C., Cantalapiedra D., Ayuso C., Ramos C. 2008b. Prenatal diagnosis of Huntington disease in maternal plasma: direct and indirect study. – Europ. Jour. of Neuro. 15: 1338-1344

Devaney S. A., Palomaki G. E., Scott J. A., Bianchi D. W. 2011. Noninvasive fetal sex determination using cell-free fetal DNA: a systematic review and metaanalysis. – JAMA. 306: 627–636.

Faas B. H. W., Beuling E. A., Christiaens G. C. M. L., von dem Borne A. E. G. K., van der Schoot C. E. 1998. Detection of fetal RHD-specific sequences in maternal plasma. – Lancet. 352: 1196

Farina A., Sekizawa A., Sugito Y., Iwasaki M., Jimbo M., Saito H., Okai T. 2004. Fetal DNA in maternal plasma as a screening variable for preeclampsia. A preliminary nonparametric analysis of detection rate in low-risk nonsymptomatic patients. – Prenat. Diagn. 24: 83–86

Fan H. C., Blumenfeld Y. J., Chitkara U., Hudgins L., Quake S. R. 2008. Noninvasive diagnosis of fetal aneuploidy by shotgun sequencing DNA from maternal blood. - Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105: 16266–16271.

Galanello R. and Origa R. 2010. - Beta-thalassemia Orphanet Journal of Rare Diseases, 5: 11 González-González M. C., García-Hoyos M., Trujillo M. J., M. Rodríguez de Alba, LordaSánchez I., Díaz-Recasens J., Gallardo E., Ayuso C., Ramos C. 2002. Prenatal detection of a cystic ﬁbrosis mutation in fetal DNA from maternal plasma. – Prenat. Diagn. 22: 946 – 948. González-González M. C., Trujillo M.J., Rodríguez de alba M., Ramos C. 2003. Early Huntington disease prenatal diagnosis by maternal semiquantitative fluorescent-PCR. – Neurology 60: 1214-1215. 42

Literatura

Havliš Jan 1999. – Vesmír 78: 448. Hindson B. J., Ness K. D., Masquelier D. A., Belgrader P., Heredia N. J., Makarewicz A. J., Bright I. J., Lucero M. Y., Hiddessen A. L., Legler T. C., Kitano T. K., Hodel M. R., Petersen J. F., Wyatt P. W., Steenblock E R., Shah P. H., Bousse L. J., Troup C. B., Mellen J. C., Wittmann D. K., Erndt N. G., Cauley T. H., Koehler R. T., So A. P., Dube S., Rose K. A., Montesclaros L., Wang S., Stumbo D. P., Hodges S. P., Romine S., Milanovich F. P., White H. E., Regan J. F., Karlin-Neumann G. A., Hindson C. M., Saxonov S., Colston B. W. 2011. High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number. – Anal. Chem. 83: 8604–8610. Harteveld C. L. and Higgs D. R. 2010. α-thalassaemia. – Orphanet Journal of Rare Diseases. 5: 13 Hartong D. T., Berson E. L., Dryja T. P. 2006. Retinitis pigmentosa. – Lancet 368: 17951809

Honda,H. Miharu N., Ohashi Y., Ohama K. 2001. Successful diagnosis of fetal gender using conventional PCR analysis of maternal serum. – Clin. Chem. 47: 41-46.¨ Horton W. A., Hall J. G., Hecht J. T. 2007. Achondroplasia. – Lancet 370: 162-72

Chan L. Y., Leung T. N., Chan K. C. A., Tai H. L., Lau T. K., Wong E. M., Lo Y. M. D. 2003. Serial analysis of fetal DNA concentrations in maternal plasma in late pregnancy. - Clin Chem. 49: 678–680.

Chan K. C. A., Zhang J., Hui A. B. Y., Wong N., Lau T. K., Leung T. N., Lo K. W., Huang D. W. S., Lo Y. M. D. 2004. Size distributions of maternal and fetal DNA in maternal plasma. – Clin. Chem. 50: 88-92.

Chiu R. W. K, Lau T. K., Cheung P. T., Gong Z. Q., Leung T. N., Lo Y. M. D. 2002. Noninvasive prenatal exclusion of congenital adrenal hyperplasia by maternal plasma analysis: a feasibility study. – Clin. Chem. 48: 778-780.

43

Literatura

Chiu R. W. K., Chan K. C. A., Gao Y., Lau V. Y. M., Zheng W., Leung T. Y., Foo C. H. F., Xie B., Tsui N. B. Y., Lun F. M. F., Zee B. C. Y., Lau T. K., Cantor C. R., Lo Y. M. D. 2008. Noninvasive prenatal diagnosis of fetal chromozomal aneuploidy by massively parallel genomic sequencing of DNA in maternal plasma. - Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105: 20458– 20463.

Turner Ch., Hilton-Jones D. 2008. The myotonic dystrophies: diagnosis and management. J. Neur. Neur. Psych. 81: 358-367.

Li Y., Zimmermann B., Rusterholz C., Kang A., Holzgreve W., Hahn S. 2004. Size separation of circulatory DNA in maternal plasma permits ready detection of fetal DNA polymorphisms. - Clin. Chem. 50: 1002–1011.

Li Y., Page-Christiaens G. C. M. L., Gille J. J. P., Holzgreve W., Hahn S. 2007. Noninvasive prenatal detection of achondroplasia in size-fractionated cell-free DNA by MALDITOF MS assay. – Prenat. Diagn. 27: 11-17.

Lim J. H., Kim M. J., Kim S. Y., Kim H. O., Song M. J., Kim M. H., Park S. Y., Yang J. H., Ryu H. M. 2010. Non-invasive prenatal detection of achondroplasia using circulating fetal DNA in maternal plasma. J Assist Reprod Genet 28: 167–172.

Lo Y. M. D., Corbetta N., Chamberlain P. F., Rai V., Sargent I. L., Redman C. W. G., Wainscoat J. S. 1997. Presence of fetal DNA in maternal plasma and serum. Lancet. 350: 485–487.

Lo Y. M. D., Tein M. S. C., Lau T. K., Haines C. J., Leung T. N., Poon P. M. K., Wainscoat J. S., Johnson P. J., Chang A. M. Z., Hjelm N. M. 1998a. Quantitative analysis of fetal DNA in maternal plasma and serum: Implications for noninvasive prenatal diagnosis. - Am. J. Hum. Genet. 62: 768-775.

Lo Y. M. D., Hjelm N. M., Fidler C., Sargent I. L., Murphy M. F., Chamberlain P. F., Poon P. M. K., Redman C. W. G., Wainscoat J. S. 1998b. Prenatal diagnosis of fetal RhD status by molecular analysis of maternal plasma. – N. Engl. J. Med. 339: 1734-1738. 44

Literatura

Lo Y. M. D., Leung T. N., Tein M. S.C., Sargent I. L., Zhang J., Lau T. K., Haines C. J., Redman C. W.G. 1999a. Quantitative Abnormalities of Fetal DNA in Maternal Serum in Preeclampsi. – Clin. Chem. 45: 184–188.

Lo Y. M. D., Zhang J., Leung T. N., Lau T. K., Chang A. M. Z., Hjelm N. M. 1999b. Rapid clearance of fetal DNA from maternal plasma. – Am. J. Hum. Genet. 64: 218224.

Lo Y. M. D., Lun F. M. F., Chan K. C. A., Tsui N. B. Y., Chong K. C., Lau T. K., Leung T. Y., Zee B. C. Y., Cantor C. R., Chiu R. W. K. 2007. Digital PCR for the molecular detection of fetal chromozomal aneuploidy. – Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104: 13116-13121.

Lo Y. M. D., Chan K. C. A., Sun H., Chen E. Z., Jiang P., Lun F. M. F., Zheng Y. W., Leung T. Y., Lau T. K., Cantor C. R., Chiu R. W. K. 2010. Maternal plasma DNA sequencing reveals the genome-wide genetic and mutational profile of the fetus. - Sci. Transl. Med. 2: 61ra91.

Lun F. M. F., Chiu R. W. K., Chan K. C. A., Leung T. Y., Lau T. K., Lo Y. M. D. 2008a. Microfluidics digital PCR reveals a higher than expected fraction of fetal DNA in maternal plasma. - Clin. Chem. 54: 1664-1672.

Lun F. M. F., Tsui N. B. Y., Chan K. C. A., Leung T. Y., Lau T. K., Charoenkwan P., Chow K. C. K., Lo W. Y. W., Wanapirak Ch., Sanguansermsri T., Cantor C. R., Chiu R. W. K., Lo Y. M. D. 2008b. Noninvasive prenatal diagnosis of monogenic diseases by digital size selection and relative mutation dosage on DNA in maternal plasma. - Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105: 19920-19925.

Malone F. D., Canick J. A., Ball R. H., Nyberg D. A., Comstock C. H., Bukowski R., Berkowitz R. L., Gross S. J., Dugoff L., Craigo S. D., Timor-Tritsch I. E., Carr S. R., Wolfe H. M., Dukes K., Bianchi D. W., Rudnicka A. R., Hackshaw A. K., LambertMesserlian G., Wald N. J., D´Alton M. E. 2005. First-trimester or secondtrimester screening, or both, for Down’s syndrome. - N. Engl. J. Med. 353: 2001-2011. 45

Literatura

Masuzaki M., Miura K., Yoshiura K., Yoshimura S., Niikawa N., Ishimaru T. 2004. Detection of cell free placental DNA in maternal plasma: direct evidence from three cases of confined placental mosaicism. - J Med Genet. 41:289–292

Ng E. K. O., Tsui N. B. Y., Lau T. K., Leung T. N., Chiu R. W. K., Panesar N. S., Lit L. C. W., Chan K. W., Lo Y. M. D. 2003. mRNA of placental origin is readily detectable in maternal plasma. – Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100: 4748-4753.

Ohashi Y., Miharu N., Honda H., Samura O., Ohama K. 2002.Correlation of Fetal DNA and Human Chorionic Gonadotropin Concentrations in Second-Trimester Maternal Serum. - Clin. Chem. 48: 386 – 388

Papasavva T., van IJcken W. F. J., Kockx Ch. E. M., van den Hout M. C. G. N., Kountouris P., Kythreotis L., Kalogirou E., Grosveld F. G., Kleanthous M. 2013. Next generation sequencing of SNPs for non-invasive prenatal diagnosis: challenges and feasibility as illustrated by an application to β-thalassaemia. – Eur. Jour. of Hum. Genet. 21: 1-8

Phylipsen M., Yamsri S., Treffers E. E., Jansen D. T. S. L., Kanhai W. A., Boon E. M. J., P. C. Giordano, Fucharoen S., Bakker E., Harteveld C. L. 2012. Non-invasive prenatal diagnosis of beta-thalassemia and sickle-cell disease using pyrophosphorolysis-activated polymerization and melting curve analysis. – Prenat. Diagn. 32: 578-587 Ratjen F., Döring G. 2003. Cystic fibrosis. – The Lancet 361: 681-689

Rothberg J. M., Hinz W., Rearick T. M., Schultz J., Mileski1 W., Davey M., Leamon J. H., Johnson K., Milgrew M. J., Edwards M., Hoon J., Simons J. F., Marran D., Myers J. W., Davidson J. F., Branting A., Nobile J. R., Puc B. P., Light D., Clark T. A., Huber M., Branciforte J. T., Stoner I. B., Cawley S. E., Lyons M., Fu Y., Homer N., Sedova M., Miao, B. Reed, J. Sabina, E. Feierstein, M. Schorn, M. Alanjary, E. Dimalanta, D. Dressman X., R. Kasinskas, Sokolsky T., Fidanza J. A., Namsaraev E., McKernan K. J., Williams A., Roth G. T., Bustillo J. 2011. An integrated semiconductor device enabling non-optical genome sequencing. – Nature 475: 348-352.

46

Literatura

Rijnders R. J. P., Christiaens G. C. M. L., Bossers B., van der Smagt J. J., van der Schoot C. E., de Haas M. 2004. Clinical applications of cell-free fetal DNA from maternal plasma. – Obstet. Gynecol. 103: 157-164

Smid M., Vassallo A., Lagona F., Valsecchi L., Maniscalco L., Danti L., Lojacono A., Ferrari A., Ferrari M., Cremonesi L. 2001. Quantitative analysis of fetal dna in maternal plasma in pathological conditions associated with placental abnormalities. - Ann. of the NY Acad. of Sci. 945: 132–137

Stroun M., Anker P., Maurice P., Lyautey J., Lederrey C., Beljanski M. 1989. Neoplastic Characteristics of the DNA Found in the Plasma of Cancer Patients. – Onco. 46: 318-322

Stuart M. J., Nagel R. L. 2004. Sicle-cell disease. - Lancet 364: 1343-1360

Tjoa M. L., Cindrova-Davies T., Spasic-Boskovic O., Bianchi D. W., Burton G. J. 2006. Trophoblastic Oxidative Stress and the Release of Cell-Free Feto-Placental DNA. – The American journal of pathology. 169: 400-404

Tsui N. B. Y., Kadir R. A., Chan K. C. A., Chi C., Mellars G., Tuddenham E. G., Leung T. Y., Lau T. K., Chiu R. W. K., Lo Y. M. D. 2011. Noninvasive prenatal diagnosis of hemophilia by microfluidics digital PCR analysis of maternal plasma DNA. – Blood 117: 36843691

Van den Oever J. M. E., Balkassmi S., Verweij E. J., van Iterson M., van Scheltema P. N. A., Oepkes D., van Lith J. M. M., Hoffer M. J. V., den Dunnen J. T., Bakker E., Boon E. M. J. 2012. Single molecule sequencing of free DNA from maternal plasma for noninvasive trisomy 21 detection. - Clin. Chem. 58: 699–706. Vogelstein B. a Kinzler K. W. 1999. Digital PCR. – Genetics 96: 9236–9241 Walker F. O. 2007. Huntington’s disease. – Lancet 369: 218-228

Walknowska J., Conte F. A., Grumbach M. M. 1969. Practical and theoretical implications of fetal-maternal lymphocyte transfer. – Lancet. 1: 1119–1122. 47

Literatura

6. 1. Internetové zdroje 454 Life Sciences/Roche. The technology. System workflow (online). (cit. 2014-04-18). Dostupne z: http://454.com/products/technology.asp.

Bio Rad. Amplification / PCR overview, category products (online) (cit. 2014-04-24). Dostupné z: http://www.bio-rad.com/en-cz/category/amplification-pcr#.

BitesizeBio. Sequencing-by-Synthesis: Explaining the Illumina Sequencing Technology (online) (cit. 2014-04-19). Dostupné z http://bitesizebio.com/13546/sequencing-by-synthesisexplaining-the-illumina-sequencing-technology/

Genomics.

NGS

platform/Ion

Torrent

(online)

(cit.

2014-04-23).

Dostupné

z

http://www.genomics.cn/en/navigation/show_navigation?nid=4147 Harmony test. Harmony™ prenatal test (online) (cit. 2014-05-10). Dostupné z http://www.harmony-test.cz/harmony-clinic.pdf Illumina. Technology/Illumina Sequencing Technology (online) (cit. 2014-04-19). Dostupné z http://www.illumina.com/technology/sequencing_technology.ilmn. Life technologies. SOLiD® Next-Generation Sequencing Chemistry (online) (cit. 2014-0423). Dostupné z http://www.lifetechnologies.com/cz/en/home/life-science/sequencing/nextgeneration-sequencing/solid-next-generation-sequencing/solid-next-generation-sequencingsystems-reagents-accessories/solid-next-generation-sequencing-chemistry.html# MALDI-TOF. MALDI-TOF-TOF MS/MS (online) (cit. 2014-04-18). Dostupné z http://www.mpipz.mpg.de/44542/MALDI-TOF-TOF_MS_MS.

Maternit21.

MATERNIT21™

PLUS

(online)

(cit.

2014-04-08),

Dostupné

z

PRENASCAN/anotace

(online)

(Cit.

2014-04-08).

Dostupné

z

http://www.maternit21.cz/

PRENASCAN.

http://www.prenascan.eu/pro-lekare/anotace/ 48

MASARYKOVA UNIVERZITA. Přírodovědecká fakulta BAKALÁŘSKÁ PRÁCE

Recommend Documents