Masarykova univerzita Lékařská fakulta
VYUŽITÍ HPV TESTACE VE SCREENINGU KARCINOMU DĚLOŽNÍHO HRDLA
Bakalářská práce v oboru zdravotní laborant
Vedoucí diplomové práce:
Autor:
MUDr. Iva Zambo, Ph.D.
Lenka JURAČKOVÁ
Brno, duben 2014
Jméno a příjmení autora: Lenka Juračková
Název bakalářské práce: Využití HPV testace ve screeningu karcinomu děložního hrdla
Pracoviště: Damier, s.r.o., Brno
Vedoucí bakalářské práce: MUDr. Iva Zambo, Ph.D.
Rok obhajoby bakalářské práce: 2014
Souhrn: Karcinom děložního hrdla je celosvětově třetí nejčastější malignitou ženského genitálu s vysokou incidencí a mortalitou. Nejvýznamnějším etiologickým faktorem podílejícím se na vzniku tohoto onemocnění je infekce vysoce rizikovým typem lidského papilomaviru (HR HPV), který se přenáší pohlavním stykem. V případě včasného záchytu dysplastických či počínajících nádorových změn může pacientka podstoupit nemutilující, přesto dostatečně radikální a sanativní léčbu. V souboru 293 pacientek vyšetřených cytologicky a následně i molekulárně-geneticky byla hodnocena exprese HR HPV u jednotlivých cytologických nálezů, nejčetnější subtypy HPV a statisticky byla hodnocena závislost HR HPV na cytologické diagnóze. HPV testace je využitelná v případech s nejednoznačnou
cytologickou
diagnózou
(ASC-US,
ASC-H) a u diskrepantních
cytologických a kolposkopických nálezů. Molekulárně-genetické vyšetření se navíc jeví jako velmi vhodné u cytologické diagnózy AGC-NOS. V budoucnu lze očekávat zařazení HPV testace mezi screeningové metody pro detekci karcinomu děložního hrdla.
Klíčová slova: HPV, karcinom děložního hrdla, prevence, screening
Souhlasím, aby práce byla půjčována ke studijním účelům a byla citována dle platných norem.
PROHLÁŠENÍ AUTORA
Prohlašuji, že jsem bakalářskou práci vypracovala samostatně pod vedením MUDr. Ivy Zambo, Ph.D. a uvedla v seznamu literatury všechny použité literární a odborné zdroje.
V Brně dne 22. 4. 2014
……………….
PODĚKOVÁNÍ AUTORA
Touto cestou bych ráda poděkovala mé vedoucí bakalářské práce MUDr. Ivě Zambo, Ph.D., za její ochotu, odborné vedení, čas a cenné rady při vypracování této práce. Dále děkuji Mgr. Matyášovi Kuhnovi za zpracování statistických dat a kolektivu cytologické laboratoře Damier s.r.o. s vedoucí Mgr. Irenou Večerkovou.
ABECEDNÍ SEZNAM POUŽITÝCH ZKRATEK
ACS
The American Cancer Society, Americká organizace pro eliminaci rakoviny
AGC
Atypical glandular cells, Atypické žlázové buňky
AGC-NEO
Atypical glandular cells - favor neoplastic, Atypické žlázové buňky - spíše neoplastické
AGC-NOS
Atypical glandular cellsof undetermined significance, Atypické žlázové buňky nejasného významu
AIS
Adenocarcinoma in situ, adenokarcinom in situ
ASC
Atypical squamous cells, Atypické dlaždicové buňky
ASC-H
Atypical squamous cells - cannot exclude HSIL, Atypické dlaždicové buňky - nevylučující HSIL
ASC-US
Atypical squamos cells of undetermined significance, Atypické dlaždicové buňky nejasného významu
ČR
Česká republika
DNA
Deoxyribonucleotidyl acid, Deoxyribonukleová kyselina
E genes
Early genes, Časné geny
HPV
Human papilloma virus, Lidský papilomavirus
HR
High risk, Vysoce rizikové
HSIL
High grade squamous intraepithelial lesion, Vysoký stupeň dlaždicové intraepiteliální léze
IBA
Institut biostatistiky a analýz
KOLPO
Kolposkopické vyšetření
L genes
Late genes, Pozdní geny
LBC
Liquid based cytology, Cytologie v tekutém médiu
LCR
Long control region, Dlouhá kontrolní oblast
LR
Low risk, Nízce rizikové
LSIL
Low grade squamous intraepithelial lesion, Nízký stupeň dlaždicové intraepiteliální léze
MZ
Ministerstvo zdravotnictví
OC
Onkologická cytologie
ORF
Open reading frame, Otevřený čtecí rámec
PAP
Papanicolaův test
PCR
Polymerase chain reaction, Polymerázová řetězová reakce
URR
Upstream regulatory region, Protisměrná regulační oblast
USA
The United States of America, Spojené státy americké
USPSTF
The United States Preventive Services Task, Úřad Spojených států pro prevenci
OBSAH 1. Úvod........................................................................................................................................9 2. HUMAN PAPILLOMA VIRUS (HPV) ...............................................................................10 2.1. Charakteristika a struktura papilomaviru ......................................................................10 2.2. Genom viru....................................................................................................................11 2.3. Výskyt HPV v závislosti na věku..................................................................................12 2.4. Incidence HR HPV v České republice a ve světě .........................................................13 2.5. Přenos HPV ...................................................................................................................14 2.6. Imunita proti HPV .........................................................................................................14 2.7. Formy HPV infekce ......................................................................................................14 2.8. HPV v mužské populaci ................................................................................................15 3. Karcinom děložního čípku ....................................................................................................16 3.1. Rizikové faktory rozvoje karcinomu děložního čípku ..................................................18 3.2. Historické mezníky výzkumu vztahu HPV infekce a rakoviny děložního čípku .........19 4. Screening ..............................................................................................................................20 4.1. Screening karcinomu děložního čípku ..........................................................................20 4.2. Prevence ........................................................................................................................22 4.2.1. Vakcinace ..............................................................................................................23 4.3. Onkologická cytologie ..................................................................................................24 4.3.1. Základní cytologická kritéria pro detekci HPV infekce ........................................26 4.3.2. Limitace cytologické diagnostiky..........................................................................26 5. Bethesda klasifikace .............................................................................................................27 6. Cíle bakalářské práce ............................................................................................................34 7. Metodika ...............................................................................................................................35 7.1. Výsledky .......................................................................................................................37 7.2. Výsledky statistické analýzy ve sledované populaci ....................................................40 7
8. Diskuze .................................................................................................................................41 9. Závěr .....................................................................................................................................45 10. Literatura .............................................................................................................................46
8
1. ÚVOD Karcinom děložního hrdla je zhoubné nádorové onemocnění s vysokou incidencí a mortalitou. Za nejvýznamnější rizikový faktor je považována infekce vysoce rizikovými typy HPV přenášeného pohlavním stykem. Přednádorové změny jsou asymptomatické, proto je velice důležitá prevence a včasný záchyt dysplastických změn na děložním čípku. Pomocí kolposkopického, cytologického, a v suspektních případech i bioptického vyšetření lze odhalit většinu morfologických změn na exocervikální sliznici, prekanceróz či malignit. V České republice patří mezi screeningové metody pro včasnou diagnostiku karcinomu děložního hrdla onkologická cytologie a kolposkopie. Obě metody jsou však zatíženy rizikem falešně pozitivních a falešně negativních výsledků. Nově lze pomocí detekce virové DNA vysoce rizikových typů HPV objasnit diskrepantní kolposkopické a cytologické nálezy a lépe naplánovat sled kontrolních vyšetření u nejasných cytologických diagnóz (ASC-US a ASCH). V budoucnu lze navíc předpokládat začlenění molekulárně-genetických vyšetření mezi screeningové metody karcinomu děložního hrdla.
9
2. HUMAN PAPILLOMA VIRUS (HPV) 2.1. Charakteristika a struktura papilomaviru Papilomaviry jsou hlavním faktorem vzniku karcinomu děložního hrdla, ale i dalších karcinomů anogenitální oblasti, kůže a karcinomů hlavy a krku. Papilomaviry jsou všudypřítomné, infikují zvířata i lidi. Infekce se často klinicky neprojevuje. Permisivní jsou pro ně epiteliální buňky kůže a sliznic. Podle onkogenního potenciálu se rozdělují na nízce(low risk, LR) a vysoce- (high risk, HR) rizikové typy (tabulka č. 1). Nejčastěji se vyskytujícím HR genotypem je HPV 16, který je detekován přibližně v polovině vzorků karcinomu děložního čípku a je nejčastěji se vyskytujícím typem HPV i v karcinomech jiných anogenitálních lokalizací, vyskytuje se ale i u zdravých jedinců (Tachezy R., 2006). V současné době je známo přibližně 120 různých genotypů HPV. Asi 30 z nich postihuje anogenitální oblast (vulvu, pochvu, čípek, penis nebo anus) (Vráželová K., 2012).
HR HPV
16, 18, 26, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 73, 82
LR HPV
6, 11, 40, 42, 43, 44, 54, 61, 72, 81
Tabulka č. 1: Příklady low risk a high risk HPV typů (Šimůnková M., 2008).
Papilomaviry patří do rodiny papollomaviridae. Jsou to malé neobalené DNA viry s vysokou afinitou k epitelu sliznic. Jejich DNA nese informaci pro dva pozdní proteiny L1 a L2 a osm časných proteinů (E1-E7), z nichž E6 a E7 jsou specifické virové onkoproteiny. Bílkovinný obal viru (kapsidu) tvoří proteiny L1 (major capsid protein) a L2 (minor capsid protein). Protein L1 tvoří kapsidu viru s průměrem 60 nm. Skládá se ze 72 bílkovinných kapsomer vytvářejících pravidelný desetistěn (obrázek č. 1). Proteiny kapsidy představují 8590% hmotnosti celého viru a jsou v jednotlivých genotypech HPV podobné. Oba kapsidové proteiny jsou pro infikovanou buňku cizorodé a mají tedy pro ni antigenní charakter. Za fyziologických okolností se proti nim vytvářejí protilátky, kterými organismus eliminuje vir, a tím se brání proti infekci.
10
Obrázek č. 1: Stavba kapsidy HPV (převzato z www.bristol.ac.uk).
Prostřednictvím L1 proteinu dochází k vytvoření primárního kontaktu s molekulami glykozaminoglykanů v plazmatické membráně napadené buňky. Tato interakce aktivuje furínovou proteázu, konformační změnu pentametru proteinu L1 a jejich následnou interakci s receptorem pro alfa-6-beta-4-integrín. Poté se aktivují molekuly v membráně buňky a v průběhu 2-8 hodin dochází k vniknutí viru do buňky za vzniku transportního endozómu. Během transportu viru cytoplazmou v endozómu dochází účinkem zatím blíže nespecifikované protézy k redukci disulfidických vazeb mezi molekulami proteinu L1. Výsledkem je rozpad kapsidy. Samotný gen viru, který tvoří kruhová dvouvláknová DNA, je transportovaný proteinem L2 k jádrovému pólu, kterým vstupuje do jádra infikované buňky (Mikyšková I. aj., 2003; Mikyšková I. aj., 2004). .
2.2. Genom viru Genom viru tvoří kruhová molekula dvouvláknové DNA obsahující přibližně 8000 párů bazí, z nichž je jedno vlákno kódující. Genom viru kóduje celkem 8 genů. Obsahuje otevřené čtecí rámce (ORF, open reading frame) pro tzv. časné geny (E, early genes), kódující regulační proteiny, které se uplatňují v časných fázích infekce při transkripci a translaci virového genomu (např. E1, E2) a onkogenní transformaci buňky (např. E6, E7), a pro pozdní geny (L, late genes), které kódují majoritní a minoritní kapsidový protein (L1, L2). Kromě toho obsahuje nekódující oblast (URR, upstream regulatory region, synonymním označením LCR, long control region), ve které se nacházejí regulační sekvence.
11
Genom viru je rozdělený do tří úseků (obrázek č. 2): a. první úsek kóduje tzv. časné geny E1-E7 b. druhý úsek kóduje pozdní geny L1 a L2 c. třetí úsek zahrnuje nekódující regulační oblast URR (alternativním označením LCR) (Mikyšková I. aj., 2003).
Obrázek č. 2: Schéma genomu HPV (převzato z www.medscape.com).
2.3. Výskyt HPV v závislosti na věku Nejčastější výskyt HPV je u sexuálně aktivních mladých žen do 25 let, nejvyšší výskyt karcinomu děložního hrdla je u žen ve věku 35-54 let (vrchol je okolo 35-39 let, později klesá). V současnosti je častěji pozorován i výskyt u mladších žen. Pokles prevalence HPV infekce s věkem se vysvětluje více faktory, např. strukturálními změnami cervixu, imunitou po předchozích infekcích a nižším počtem sexuálních expozic. Existují však důkazy, že i po 25. roku je riziko HPV infekce u sexuálně aktivních žen relativně vysoké (Dušek L. aj., 2007).
12
2.4. Incidence HR HPV v České republice a ve světě Analýzou výsledků průzkumů provedených v letech 1993 až 2003 ve třinácti oblastech v jedenácti zemích celého světa byl upřesněn geografický výskyt různých typů HPV. Získané informace jsou důležité pro vývoj screeningových HPV testů a pro sledování účinnosti vakcín proti HPV infekcím (Clifford GM. et al., 2005). V současné době jsou k dispozici výsledky souborných analýz prevalence HPV typů u asymptomatických žen, žen s LSIL, HSIL a karcinomem děložního hrdla. V dlaždicobuněčných karcinomech cervixu se celosvětově nejčastěji vyskytuje typ HPV 16, jehož prevalence na všech kontinentech přesahuje 50 %. Nejvyšší je v Evropě, kde se blíží 58 %, v České republice byla DNA HPV 16 prokázána dokonce v 76 % skvamocelulárních karcinomů (Tachezy R. aj., 2006). Mezi další, nejčastěji zastoupené HR HPV typy, seřazeny sestupně dle prevalence, patří HPV 18, -45, -31, -33, -52, -58 a -35. Všechny výše uvedené jsou společně s HPV 16 zodpovědné za 89 % karcinomů děložního hrdla. V adenokarcinomech je celosvětově nejčastěji zastoupený typ HPV 18 (Schiffman M. et al., 2003). V high grade lézích je nejčastěji zastoupený HPV 16 bez souvislosti s geografickou polohou, v Evropě 52 %, v Asii 34 %; další typy dle snižující se prevalence HPV 31, -58, -18, -33, -52, -35, -51, -56, -45, -39, -66. V ČR je výskyt HPV v HSIL lézích 93 %, z toho HPV 16 v 51,4 %. Celkově bylo v ČR v HSIL lézích identifikováno 10 různých typů HPV (Tachezy R. aj., 1999; Tachezy R. aj., 2006). Geografické rozdíly ve výskytu jednotlivých HPV typů v high grade lézích nejsou významné. HPV 33 je třetím nejčastějším typem v Africe a v Evropě, HPV 31 v Severní, Střední a Jižní Americe a typ HPV 58 v Asii. V low grade lézích je opět HPV 16 nejčastějším detekovaným typem, a to ve 26 % HPV pozitivních lézích. Dalšími typy, uvedenými v sestupném pořadí, jsou HPV 31, -51, -53, -56, -52, -18, -66 a -58. V lehkých dyspláziích byly z hlediska geografie nalezeny významné rozdíly ve výskytu HPV 16 (29 % v Evropě, 16 % v Africe) a HPV 18 (12 % v Severní Americe a 5 % ve Střední a Jižní Americe). V ČR je prevalence HR HPV v LSIL lézích přes 50 %, a HPV 16 byl prokázán v polovině vzorků. Celkově bylo v ČR v LSIL lézích identifikováno 12 různých typů HPV (Tachezy R. aj., 1999). V ČR byla v rámci studie RNDr. Tachezy a jejích spolupracovníků zjišťována přítomnost DNA lidského papilomaviru u 651 žen s atypickým cytologickým nálezem. V 50,7 % případů byla detekována HR HPV infekce, z toho v 6,5 - 15 % HPV 16 a v 1,7 - 6 % HPV 18. V závislosti na věku prevalence klesala, ve věkové kategorii 25 - 29 let byla nejvyšší 13
(64,5 %), ve skupině 35 - 39 let 31,9 %, a ve skupině 45 - 49 let 21,3 % (Tachezy R. aj., 2007). V ČR se HR HPV infekce u zdravých žen (tedy u žen bez zjištěné dysplázie či karcinomu) pohybuje kolem 22 % a HPV 16 byl prokázán u 38 % z těchto pozitivních žen (Tachezy R. aj., 2006). Z výše uvedeného vyplývá, že v závislosti na závažnosti léze roste prevalence HPV 16, -18, ale i -45.
2.5. Přenos HPV Infekce HPV je v současné době nejčastější sexuálně přenosnou infekcí na světě. Během života se infikuje více než 80 % sexuálně aktivní populace. Prokázán byl i přenos perinatální (při porodu), transplacentární a kontaktem kůže. Předpokládá se, že virus infikuje buňky bazální vrstvy epitelu skrz mikroskopická poranění nebo přímým kontaktem, ke kterému dochází na transformační zóně, která se nachází nejenom na děložním čípku, ale i v dalších anatomických lokalitách (Tachezy R., 2006).
2.6. Imunita proti HPV V současné době neexistuje žádná metoda léčby získané HR HPV infekce. Z větší části je HPV likvidován imunitním systémem organismu infikovaného jedince a proti viru je vytvářena imunita. Dosud není známo, zda je imunita proti konkrétnímu typu celoživotní, krátkodobá nebo dlouhodobá. Převládá názor, že získaná imunita je dlouhodobá, pravděpodobně ale ne celoživotní, a jistě nebrání infekci dalším podtypům HPV viru (Pluta M., 2001).
2.7. Formy HPV infekce Latentní infekce -
přítomnost HPV bez produkce virů
-
je definovaná laboratorně detekovatelnou HPV DNA bez prokazatelné léze
-
většina HPV infekcí je latentních, cytologicky ani histologicky není zjistitelná
14
Okultní infekce -
je skrytě probíhající infekce, bez patrných lézí na cervixu, cytologicky a histologicky je prokazatelná jen v 50 %, případně identifikovatelná imunocytochemicky s průkazem pozitivity HPV DNA
Perzistentní infekce -
musí být prokázaný jistý typ HPV, při více než jednom vyšetření v časovém intervalu 3-6 měsíců
-
spojována s vyšším rizikem vzniku neoplázie
Produktivní infekce -
je vyvolávána HR HPV
-
infekce je identifikovatelná cytologicky i histologicky
-
dochází k přeměně epitelu na dysplastický (Mistríková J., 2005).
2.8. HPV v mužské populaci Rezervoárem lidského papilomaviru u mužů je močová trubice. Infekce HPV u mužů se projevuje tvorbou exofytických lézí, které nacházíme v místě se zvýšenou vlhkostí – v oblasti předkožky, v ústí uretry, na perineu nebo v oblasti perianální. U většiny mužů probíhá infekce asymptomaticky. Méně časté jsou uretrální kondylomatózy postihující uretru, které se klinicky projevují změnami proudu moče, dysuriemi nebo krvavým výtokem. Častěji se vyskytují condylomata accuminata. Plošné papilární léze nacházíme na sušších místech, např. na kůži penisu. Inkubační doba pro vznik kondylomat je 3 týdny až 8 měsíců. Condylomata accuminata (špičaté kondylomy) jsou bradavičnaté útvary virového původu. Asi 30% karcinomů penisu je spojeno s výskytem HPV. Až čtvrtina nemocných mužů je mladších 50 let (Jakubalová S., 2010).
15
3. KARCINOM DĚLOŽNÍHO ČÍPKU Více než 95 % cervikálních karcinomů vzniká v příčinné souvislosti s infekcí HR HPV. Jedná se o třetí nejčastější malignitu ženského genitálu (po zhoubných novotvarech endometria a ovária). Mezi maligními nádory děložního čípku jsou nejvíce zastoupeny: dlaždicobuněčný karcinom typicky vyrůstající v transformační zóně, nepoměrně vzácnější adenokarcinomy endocervikálního kanálu a zcela raritní jiné maligní tumory, např. Mülleriánský tumor nebo embryonální rabdomyosarkom, který se ale vyskytuje v dětském věku (Tavassoli FA. et al., 2003). Incidence v České republice je dlouhodobě a setrvale vysoká (tabulka č. 2). V 2. polovině minulého století došlo v české populaci k poklesu incidence v důsledku zřízení cytologických center a center gynekologicko-onkologické prevence (Tachezy R. aj., 2007). Od roku 1980 došlo jen k velmi mírnému poklesu četnosti tohoto onemocnění z původních 20,3 na nynějších (údaje z roku 2010) 18,53 nově hlášených případů/100 000 žen (graf č. 1) Pokles incidence karcinomu děložního čípku pod 20/100 000 žen je jistě příznivá zpráva, ale ve srovnání s jinými evropskými zeměmi (Lucembursko, Finsko aj., graf č. 2) je tato hodnota stále hrozivá (Chovanec J. aj., 2008). Vysoká incidence u karcinomu děložního hrdla zasahuje široké spektrum věkových kategorií žen. Více než 30 % nových případů karcinomu děložního hrdla se vyskytuje u žen ve věku mladších 45 let. Česká populace není výjimkou, věkově specifická incidence začíná významně narůstat již od 29 let a vrcholu dosahuje u žen ve věku 35–39 let. Bohužel i v těchto věkových kategoriích je relativně vysoká mortalita, k čemuž přispívá i fakt, že neustále je nově diagnostikováno téměř 30 % pacientek v pokročilém klinickém stadiu (Dušek L. aj., 2007).
16
Graf č. 1: Časové trendy epidemiologie karcinomu děložního čípku v ČR (převzato ze www.svod.cz).
Graf č. 2: Incidence karcinomu děložního čípku v evropských zemích (převzato ze www.svod.cz).
17
Incidence Celkový počet nově diagnostikovaných žen
994
Z toho v klinickém stadiu III-IV
330 (33,2 %)
Incidence na 100 000 žen
18,53
Mortalita Celkem zemřelých
384
Mortalita na 100 000 žen
7,16
Tabulka č. 2: Základní epidemiologické údaje karcinomu děložního čípku v ČR (údaje z roku 2010, převzato ze www.svod.cz).
Vznik cervikálního karcinomu je v příčinné souvislosti s infekcí HR HPV. Vstupní bránou
viru
do
organismu
a
místem
virové
replikace
je
metaplastický
epitel
skvamokolumnární junkce. Mezi rizikové faktory zvyšující pravděpodobnost infekce papilomavirem patří například časný počátek sexuálního života (před 20. rokem života), rizikové sexuální chování, vysoký počet porodů a potratů v anamnéze, první porod ve velmi mladém věku, opakované lacerace děložního čípku při instrumentálních zákrocích, chronické zánětlivé změny v oblasti junkce, kouření, drogy či špatné socioekonomické podmínky (Chovanec J. aj., 2008).
3.1. Rizikové faktory rozvoje karcinomu děložního čípku Přestože je prevalence HPV infekce vysoká, u většiny
žen nedojde k
rozvoji karcinomu děložního čípku. K tomu je zapotřebí celá řada dalších faktorů, které dělíme do tří skupin. Do první skupiny řadíme výše jmenované exogenní faktory, do druhé faktory virové, jako jsou infekce specifickým HR typem a koinfekce jiným typem HPV. Do třetí skupiny patří faktory hostitele, například endogenní hormony či genetické faktory. Zvýšený výskyt karcinomu děložního čípku byl pozorován u pacientů s vrozeným nebo získaným imunodeficitem. Adenokarcinomy děložního hrdla mohou být součástí některých dědičných syndromů (Muñoz N. et al., 2006, Chovanec J. aj., 2008).
18
3.2. Historické mezníky výzkumu vztahu HPV infekce a rakoviny děložního čípku V polovině 19. století bylo poukázáno na nepřítomnost karcinomu děložního hrdla u mnišek, což vedlo k odhalení souvislosti mezi sexuální aktivitou a vznikem karcinomu děložního hrdla. Od počátku 20. století se datuje výzkum papilomaviru, po zjištění přenosu bradavic z jedné osoby na druhou osobu pomocí přípravku neobsahující žádné buňky. V polovině 20. století se zjistilo, že infekce HPV může progredovat do vzniku vzácných forem karcinomu při některých dědičných onemocněních. Během sedmdesátých let bylo poprvé poukázáno na význam HPV při vzniku karcinomu děložního hrdla. V roce 1983 byla prokázána první izolace onkogenního typu viru HPV 16 ze vzorku karcinomu děložního hrdla. Přítomnost HPV se zjistila i v abnormálních lézích, které mohou progredovat do karcinomu děložního hrdla. Navíc byla prokázána exprese specifických virových genů v maligních buňkách. Poté byla vypracována první rozsáhlejší epidemiologická studie zkoumající souvislost mezi přítomností DNA HPV a nádorovými lézemi děložního hrdla. Na konci 20. století se potvrdila infekce HR HPV jako jednoznačná příčina vzniku cca 90% případů karcinomu děložního hrdla (Mistríková J., 2005). V roce 2008 doktor Harald zur Hausen z Univerzity v Düsseldorfe získal Nobelovu cenu za první izolaci onkogenního typu HPV 16 na základě vyšetření biopsií žen, které měly rakovinu děložního hrdla (www.cervix.cz).
19
4. SCREENING Screening znamená plošné vyšetřování populace za účelem detekce léčitelného nádorového onemocnění v jeho časných stádiích, kdy pacienti ještě nemají potíže a příznaky. Cílem screeningu je snížit morbiditu (nemocnost) i mortalitu (úmrtnost) na sledované onemocnění. Ke screeningovým programům jsou vhodné zejména nádory, které splňují tato kritéria: •
mají relativně vysokou morbiditu,
•
existuje účinná léčba v časných stadiích,
•
pro jejich detekci je k dispozici dostupný a laciný test.
Hlavním přínosem screeningových testů je zlepšení prognózy onemocnění a možnost méně radikální, zpravidla lacinější, ale přitom účinnější léčby. V České republice v současné době existují tři screeningové programy: 1. rakoviny děložního čípku 2. rakoviny prsu 3. rakoviny tlustého střeva a konečníku
4.1. Screening karcinomu děložního čípku Kritéria a podmínky programu pro screening karcinomu děložního hrdla v ČR jsou zakotvena ve Věstníku MZ ČR č. 07/2007 (str. 147-152). Stanovení o obsahu a časovém rozmezí preventivních prohlídek je pojednáno ve Vyhlášce MZ ČR č. 3/2010 Sb. Na začátku roku 2008 zahájilo Ministerstvo zdravotnictví ČR celorepublikový screeningový program zaměřený na včasný záchyt karcinomu děložního čípku. Navazuje tak na program screeningu nádoru prsu, který v České republice úspěšně probíhá od roku 2002. Cervikální screening spočívá v pravidelných gynekologických kontrolách, jejichž cílem je odhalit prekancerózy nebo časná stádia karcinomu děložního čípku. Preventivní stěr z děložního čípku žen starších 15 let jednou ročně hradí pojišťovna! Vyšetření není povinné a aktivně ho podstupuje přibližně polovina žen v reprodukčním věku. Návštěvnost gynekologické preventivní prohlídky průběžně mírně roste. V roce 2007 u žen ve věku 25-59 20
let dosáhla 40,9 %. Podle údajů úda z roku 2008 došlo k dalšímu zvýšení až na 48,5 %. Nyní využívá gynekologické preventivní prohlídky méně mén než 55% žen (graf č. 3) (Májek O. aj., 2013).
Graf č.. 3: Zapojení cílové populace žen (ve vvěku 25-59 let) v ČR R do screeningu karcinomu čípku.
Většina nádorůů se vyskytuje vyskytuje u žen, které prevenci opomíjejí. opomíje V západní Evropě onemocní rakovinou děložního čípku 10 žen ze 100 tisíc, v České republice je to přibližně dvojnásobek. Přednádorový řednádorový ednádorový stav se vyvíjí mnoho let, není doprovázen žádnými klinickými příznaky čii subjektivními obtížemi, přesto p je detekovatelný dříve říve, než dospěje do stádia rakoviny (Schejbalová M., 2011). Karcinom děložního ěložního hrdla je všeobecně všeobecn uznáván jako nádor, u kterého je dnes ze všech zhoubných novotvarů možno provádět nejlépe a nejefektivněji ěji organizovaný screening. Česká republika stále patří mezi země s vysokou incidencí tohoto onemocnění onemocn (www.svod.cz), což si lze vysvětlit vysv například íklad i tím, že u nás screening cervikálního karcinomu není plně organizovanýý (ženám v cílové skupině jsou rozesílány zvací dopisy k preventivní prohlídce až od začátku čátku letošního roku, roku chybí dostatečná osvěta ěta lajcké veřejnosti ve a tedy i motivace toto vyšetření ření podstoupit). podstoupit 21
4.2. Prevence Nejúčinnější a nejlevnější prevencí proti všem onkologickým chorobám je informování veřejnosti o rizicích jejich vzniku a možnostech změn životního stylu (Holubová A., 2007). Prevenci můžeme rozdělit do těchto kategorií: •
Primární prevence – má za úkol předejít vzniku nádoru. Předcházet nemocem, ale i vést zdravý životní styl, co nejvíce omezit vliv známých rizikových faktorů, posilovat obranyschopnost organismu, která může pomoci v likvidaci poškozených nebo již dysplastických buněk. Z hlediska vzniku cervikálního karcinomu je cílem primární prevence zamezit přenosu HPV infekce.
•
Sekundární prevence – je zaměřena na záchyt prekanceróz a zhoubných nádorů v raných stadiích řešením v období bezpříznakovém nebo s minimálními příznaky, kdy jsou vhodné podmínky pro úspěšné léčení a vyléčení. Jde o aktivní vyhledávání prekanceróz v rámci každoročního gynekologického screeningu tak, aby byly ošetřeny ještě před rozvojem invazivního nádoru.
•
Terciární prevence – jejím cílem je časný záchyt recidivy nádoru, a tím časné zahájení terapie v potenciálně léčitelné fázi onemocnění. Základem této prevence je efektivní dispenzární schéma, shromažďování a hodnocení vyšetření za pomoci ostatních specializací. Nutností je kompletní provádění preventivní péče, která snižuje riziko zanedbání dalších onkologických onemocnění.
•
Kvartérní prevence – spočívá v předcházení a předvídání možných komplikací v době, kdy průběh onemocnění je vzhledem k pokročilosti nádorů již nezvratný.
Nejefektivnějšími a ekonomicky nejméně nákladnými jsou bezesporu programy primární a sekundární prevence. Všeobecné povědomí o rizicích HR HPV infekce a možnostech její detekce v rámci cervikálního onkologického screeningu jsou bohužel v České republice nízké. Odborná osvěta spoléhá na gynekology, kteří mají v rámci preventivních prohlídek vysvětlovat jejich význam. Tyto informace jsou ale šířeny pouze mezi ženy, které se preventivních prohlídek již zúčastňují. Plošná osvěta je u nás v současné době praktikována pouze v komerčně atraktivní oblasti, v rámci které je propagována vakcinace proti HPV infekci (Eggová P. aj., 2012).
22
4.2.1. Vakcinace Vakcinace proti HPV infekci je považována za zásadní průlom v prevenci HPV asociovaných onemocnění. Vývoj vakcín proti HPV byl poměrně složitý, jelikož HPV se nemnoží na běžných typech tkáňových kultur. Podobně jako u hepatitidy B, jsou vakcíny připravované metodami genového inženýrství. Jedná se o tzv. kapsidy (virům podobné částice tvořené hlavním strukturálním proteinem virové kapsidy), které neobsahují virovou DNA – nejsou tedy schopné vyvolat tvorbu nádorů. Tyto kapsidy jsou připravované v kvasinkách nebo v hmyzích buňkách a bylo prokázáno, že jsou vysoce imunogenní a navazují tím tvorbu neutralizujících protilátek (Tachezy R., 2006). Na našem trhu jsou v současnosti dostupné dvě preventabilní vakcíny: Silgard je tetravalentní rekombinantní vakcína proti lidským papilomavirům typu 6, 11, 16 a 18. Zajišťuje prevenci genitálních bradavic, vaginálních a cervikálních dysplázií a karcinomu děložního čípku. V ČR je registrována od června 2006. Cervarix je bivalentní rekombinační vakcína proti lidským papilomavirům typu 16 a 18. Zajišťuje prevenci vaginálních a cervikálních dysplázií a karcinomu děložního čípku. V ČR je registrována od ledna 2007 (Schejbalová M., 2011). Obě vakcíny jsou podávány intramuskulárně ve třech dávkách v rozmezí šesti měsíců. Výsledky studií ukazují, že obě vakcíny jsou dobře tolerované a navazují vysoký titr protilátek proti použitým antigenům. Výsledky dlouholetého sledování (4-5 let) účinnosti vakcín prokazují jejich 100% schopnost zabránit vzniku lézí vyvolaných vakcinačními typy a 100% schopnost zabránit perzistentní infekci vakcinačních typů. Plošné očkování proti HPV infekci začalo v ČR 1. dubna 2012. Dívky mohou dostat vakcínu nejdříve v den třináctých narozenin a nejpozději den před čtrnáctými narozeninami. Očkování je nepovinné (http://zdravi.e15.cz). Od zahájení očkování v roce 2006 se během prvních čtyř let nechalo naočkovat téměř 140 000 žen a dívek (tabulka č. 3). Tabulka: HPV proočkovanost věkových skupin českých dívek a žen % Proočkovanost skupinách
ve
věkových
2007
2008
2009
2010
<11 let
0,2
0,4
0,4
0,3
11-15 let
3,9
8,6
10,3
9,2
16-20 let
3,3
9,1
15,4
21,1
21-26 let 0,9 2,3 3,5 4,6 Tabulka č. 3: HPV proočkovanost ve věkových skupinách dívek a žen (převzato z www.vakciny.net).
23
S příchodem vakcín na trh se objevuje řada otázek, které vyžadují rychlé řešení. Především je nutno mít na paměti, že vakcíny nezabrání vzniku všech lézí, neboť část bude stále vznikat infekcí nevakcinačními typy (Tachezy R., 2006). Výsledky studií laboratoře Ústavu hematologie a krevní transfuze v Praze ukázaly, že v lézích, které předcházejí vzniku nádorů a v nádorech vyvolaných infekcí HPV, je nejčastěji zastoupen typ 16. Z výsledků vyplývá, že očkování proti HPV infekci, by mohlo zamezit vzniku minimálně 34 % lehkých lézí, 63 % těžkých lézí, považovaných za pravé prekurzory karcinomu děložního hrdla a 80 % skvamocelulárních karcinomů děložního hrdla. Vakcíny by dále mohly zabránit až 90 % karcinomů jiných anatomických lokalizací, které jsou kauzálně spojené s infekcí HR HPV (www.ukht.cz).
4.2.1.1.
Možné nežádoucí účinky vakcín
Podobně jako všechny vakcíny a léky, můžou mít i tyto přípravky nežádoucí účinky, které se ale nemusí vyskytnout u každého. Po aplikaci vakcíny se mohou objevit následující nežádoucí účinky – bolest a nepříjemný pocit v místě vpichu injekce, zarudnutí a otok v místě vpichu, bolest hlavy, svalů, svalová slabost, únava, horečka, červená vyrážka, svědění, ale i závažné systémové komplikace, kterými jsou rozvrat imunologických mechanizmů nebo anafylaktický šok (www.msd.cz). Je diskutován i možný vliv extrémně vysokých dávek adjuvancií přítomných ve vakcínách (např. hliníku) se zvýšeným rizikem vzniku autoimunitních onemocnění (Gherardi RK. et al., 2001; Exley C. et al., 2009). Zatím ale chybí ucelená a publikačně silná data, která by tyto možné nežádoucí účinky statisticky signifikantně potvrdila.
4.3. Onkologická cytologie Anatomické poměry a dostupnost klinického vyšetření děložního čípku vytvářejí výborné předpoklady pro časný záchyt onemocnění (Chovanec J. aj., 2008). Gynekologická cytologie se řadí spolu s kolposkopií k nepostradatelným prebioptickám diagnostickým metodám, podílí se na odhalení dysplastických změn na děložním hrdle (onkologická cytologie) a cyklických hormonálních změn na sliznici (funkční cytologie) (Kobilková J. aj., 2000). Kolposkopie má hlavní význam v diagnostice - v přesném určení závažnosti léze, plošného rozsahu a vztahu léze k endocervikálnímu kanálu. Předpokladem správné interpretace cytologického nálezu je
24
kvalitní odběr a zpracování materiálu. Existují dva odlišné způsoby zpracování cytologického materiálu z cervixu. •
Konvenční (klasický) stěr - ve většině zemí, včetně ČR, je za standardní metodu cytologického vyšetření hrazenou ze zdravotního pojištění považován stěr, tzv. klasická cytologie. Odběr se provádí stěrem z povrchu exocervixu, z endocervixu je buněčný materiál odebírán kartáčkem. Takto získaný materiál je natřen na podložní sklíčko a ihned fixován (alkohol-éterem, např. sprejem CYTOFIXATIV), čímž se předchází vzniku artefaktů při vyschnutí. Preparát je v laboratoři polychromaticky barven dle Papanicolaoua a montován pod krycí sklíčko.
•
Cytologie v tekutém médiu (LBC, liquid based cytology) – je alternativou konvenčnímu stěru, při které je kartáčkem materiál odebírán do speciálního roztoku a v laboratoři dále zpracován. Po zhotovení cytologického preparátu zůstává v odběrové nádobce část cytologického materiálu jako rezerva, která může být v budoucnu využita pro případná další vyšetření, např. imunocytochemii, detekci HR HPV či chlamydií (Roberts JM. et al., 2007). Zavedení LBC, ale vyžaduje zásadní změnu organizace práce laboratoře, je finančně nákladnější a navíc nebyla prokázána statisticky
významnější
senzitivita
ani
specificita
detekce
intraepiteliálních
neoplastických lézí či karcinomu oproti konvenčnímu stěru (Mattosinho CF. et al., 2004).
Cílem cytologického vyšetření je odhalit nepravidelnosti buněk, ve smyslu dysplastické transformace. Ale definitivní diagnostický závěr poskytuje pouze histopatologické vyšetření vzorku tkáně (Citterbart K., 2001). Doplňkovou metodou k cytologickému vyšetření, která zvyšuje procento záchytu prekanceróz, je HR HPV testace, která využívá molekulárně-genetické metody (PCR, hybrid capture) pro detekci virové DNA vysoce rizikových genotypů HPV (www.linkos.cz). HPV typizace pomáhá zjistit míru rizika onemocnění děložního čípku. Tato vyšetřovací metoda nenahrazuje pravidelné gynekologické preventivní prohlídky ani cytologické vyšetření, tzv. PAP stěr, pouze zvyšuje odhad míry rizika rozvoje karcinomu děložního čípku na základě odhalení infekce HPV.
25
4.3.1. Základní cytologická kritéria pro detekci HPV infekce Základními cytologickými kritérii pro detekci HPV infekce je přítomnost koilocytů, dyskeratocytů nebo atypických parabazálních buněk. •
Koilocyty – Jsou to superficiální nebo intermediální dlaždicové buňky s ostře ohraničeným velkým perinukleárním haló. Haló je úplně světlé, v elektronovém mikroskopu neobsahuje žádné cytoplazmatické částice. Jádro může být normální, ale většinou je zvětšené, jedno nebo dvoujaderné, často hyperchromní, s mírně nepravidelnými konturami jaderné membrány (viz. obrázek č. 6).
•
Dyskeratocyty – jsou drobné, oválné nebo vřetenovité epitelie s malými kulatými pyknotickými
jádry
s lehce
eozinofilní
světlou
cytoplazmou.
Podobají
se
superficiálním epiteliím. Přítomnost dyskeratotických epitelií je značně suspektní z infekce HPV. •
Atypické parabazální buňky – jsou malé buňky s velkými hyperchromními osamocenými nebo dvojitými jádry s chromatinem rozmazaného vzhledu.
Tyto morfologicky změněné dlaždicové epitelie se mohou vyskytovat ve variabilním počtu, jednotlivě nebo ve skupinkách, pozadí stěru bývá čisté bez záplavy erytrocytů či známek masivního zánětu (Kubálek V., 2001).
4.3.2. Limitace cytologické diagnostiky Cytologický screening v mnohých případech odhaluje prekancerózy a časná stádia karcinomu. Cytologie má však svoje hranice, a proto se nedá zabránit falešně negativním nebo falešně pozitivním výsledkům. Hlavními příčinami jsou: 1. lidský faktor – cytologie v dnešní podobě je komplexní metoda vysoce náročná na hodnocení, proto nemůže být nikdy zcela objektivní, nelze vyloučit chybnou interpretaci nálezu 2. matematická pravděpodobnost – mezi desetitisíci buňkami v nátěru může být jen několik atypických buněk, ale nemusí se objevit v zorném poli nebo mohou být zastřeny krví, zánětem nebo hojným hlenem 3. chyby při odběru – nejčastější příčina – nedostatečný nebo nesprávný odběr, či další zpracování materiálu může vést k falešně pozitivním nebo negativním výsledkům 4. časový interval – nádorové buňky se mohou vyvinout v období mezi jednotlivými odběry (Kulhánková J. aj., 2002). 26
5. BETHESDA KLASIFIKACE Bethesda klasifikace je sytém pro stanovení cervikovaginální cytologické diagnózy. Tato klasifikace byla představena na konferenci v roce 1988 ve městě Bethesda ve státě Maryland (odtud vznikl název) a dále revidována v letech 1991 a 2001 (aktuální verze). Bethesda systém má především sloužit ke sjednocení terminologie mezi patology, gynekology a cytologickými laboratořemi. Jednotlivé nálezy jsou tak reprodukovatelné i mezi odborníky z různých zeměpisných oblastí.
Aktuální verze klasifikace Bethesda 2001: V prvním kroku se hodnotí kvalita stěru – tato může být dostatečná nebo nedostatečná pro hodnocení. Stěr má obsahovat buňky z exo- i endocervixu, jeho kvalita ale může být limitována krví, zánětem atd. Ve stěru se dále specifikuje mikrobiální pozadí a případné reaktivní buněčné změny spojené se zánětem, zavedeným nitroděložním tělískem, předchozí radioterapií apod. Nálezy dle terminologie Bethesda klasifikace jsou uvedeny v tabulce č. 4.
27
DLAŽDICOVÉ BUŇKY (SQUAMOUS CELLS) Normální ASC - Atypické dlaždicové buňky ASC-US – nejasného významu (of undetermined (atypical squamous cells)
significance) ASC-H - nevylučující HSIL (cannot exclude HSIL)
LSIL - nízký stupeň dlaždicové intraepitelové léze (low grade squamous intraepithelial lesion) HSIL - vysoký stupeň dlaždicové intraepitelové léze (high grade intraepithelial lesion) HSIL, suspektní z invaze
Dlaždicobuněčný carcinom (squamous cell carcinoma) ŽLÁZOVÉ BUŇKY (GLANDULARCELLS) Normální Atypické (Atypical)
AGC-NOS – endocervikální buňky (endocervical cells) AGC-NOS - endometriální buňky (endometrial cells) AGC-NOS – žlazové buňky (glandular cells)
Atypické (Atypical)
AGC-NEO
-
endocervikální
buňky
spíše
neoplastického původu (endocervical cells, favor neoplastic) AGC-NEO
-
glandulární
buňky
spíše
neoplastického původu (glandular cells, favor neoplastic) Endocervikální adenokarcinom in situ (endocervical adenocarcinoma in situ), AIS Adenokarcinom (Adenocarcinoma)
endocervikální (endocervical) endometriální (endometrial) extrauterinní (extrauterine) blíže nespecifikovaný (not otherwise specified)
Jiné zhoubné tumory Tabulka č. 4: Terminologie cytologických nálezů dle Bethesda klasifikace (Solomon D. et al., 2004).
28
Dlaždicové buňky: •
normální - negativní pro lézi
•
atypické dlaždicové buňky - ASC
- nejasného významu, ASC-US: jde o změny naznačující SIL, ale nesplňující jednoznačná kritéria. Tato skupina zahrnuje menšinu případů dříve označovaných jako ASCUS/R (spíše reaktivní), většinu případů, dříve označovaných jako ASCUS spíše SIL. Vylučuje případy HSIL. - nevylučující HSIL, ASC-H: cytologické změny naznačující HSIL, ale nesplňující kritéria pro definitivní interpretaci. Jsou indikací k biopsii. Nálezy kategorií ASC by měly být v cytologické laboratoři zastoupeny v méně než 10 % všech diagnóz za rok! •
LSIL: korespondující s CIN I
•
HSIL: odpovídající CIN II, CIN III, včetně případů suspektní invaze
•
Dlaždicobuněčný karcinom
Žlázové buňky: •
normální - negativní pro lézi
•
atypické - endocervikální buňky AGC-NOS, - endometriální buňky AGC-NOS, - glandulární buňky AGC-NOS
•
atypické - endocervikální buňky spíše neoplastického původu AGC-NEO, - glandulární buňky spíše neoplastického původu AGC-NEO,
•
endocervikální adenokarcinom in situ AIS
•
adenokarcinom - endocervikální - endometriální - extrauterinní - blíže nespecifikovaný
•
jiné zhoubné tumory (Solomon D. et al., 2004).
29
Součástí cytologického výsledku je i doporučení dalšího postupu ve sledování pacientky případně došetření abnormálního nálezu. Při negativním nálezu je pacientce doporučena další preventivní prohlídka za 1 rok. V případě pozitivního nálezu je interval kontrolní cytologie 3 – 6 měsíců, nebo doporučena expertní kolposkopie, biopsie či HPV testace (obrázek č. 3).
Výsledek cytologie → další postup
Obrázek č. 3: Možné diagnostické postupy na základě cytologického výsledku. Vysvětlivky zkratek: ASC-US – atypické dlaždicové buňky nejasného významu, LSIL – nízký stupeň dlaždicové intraepiteliální léze, HSIL – vysoký stupeň dlaždicové intraepiteliální léze, ASC-H atypické dlaždicové buňky nevylučující HSIL, AGC/AIS – atypické žlázové buňky/endocervikální adenokarcinom in situ, HR HPV – vysoce rizikové typy HPV, OC – onkologická cytologie, kolpo – kolposkopické vyšetření.
30
Cytologický nález z laboratoře laborato e je zasílán gynekologovi, který prováděl provád stěr, a zároveň i na server IBA (Institut biostatistiky a analýz), který data shromažďuje shromaž a statisticky zpracovává. Získaná data jsou po určitých ur časových asových intervalech vyhodnocena a slouží jako důležitý ležitý zdroj pro sledování trendů trend a změnn incidence a prevalence daného nádorového onemocnění (www.svod.cz www.svod.cz).
Obrázek č. 4: Negativní Negativní cytologie, pravidelné dlaždicové a endocervikální bb., zvětšení 200x.
Obrázek č. 5: ASC-US, ASC metaplastické buňky se zvětšenými, tšenými, ale pravidelnými jádry, zvětšení 200x.
31
Obrázek č. 6: LSIL, koilocyty, zvětšení zv 200x a 400x.
Obrázek č.. 7: HSIL, trsy atypické metaplázie, zvětšení 200x, 400x.
Obrázek č.. 8: Dlaždicobun Dlaždicobuněčný karcinom, zvětšení 200x, 400x.
32
Obrázek č. 9: AGC AGC-NOS, zvětšení 200x, a AIS, zvětšení 400x.
33
6. CÍLE BAKALÁŘSKÉ PRÁCE Onkologická cytologie patří mezi screeningové metody zatížené nezanedbatelným rizikem falešně negativního i falešně pozitivního výsledku. Detekce virové DNA vysoce rizikových typů HPV může cytologickou diagnózu zpřesnit. Dílčí cíle bakalářské práce lze shrnout do následujících bodů: vytvořit soubor pacientek s dostupnou cytologickou diagnózou, u kterých bylo zároveň provedeno molekulárně-genetické vyšetření detekující přítomnost HR HPV (Cobas 4800 HPV test) zjistit četnost HR HPV ve sledovaném souboru pacientek analyzovat frekvenci výskytu jednotlivých typů HR HPV, a to v kategoriích HPV 16, HPV 18, tzv. ostatní HR HPV, případně koincidenci výše zmíněných kategorií korelovat negativní či suspektní cytologické diagnózy (tzn. jiné než negativní cytologie) s výsledkem molekulárně-genetického vyšetření vyhodnotit možný přínos molekulárně-genetického vyšetření pro onkologický screening karcinomu děložního čípku a jeho případnou roli pro klinickou praxi.
34
7. METODIKA Ve sledovaném období, od 1. 2. 2013 do 31. 1. 2014, byla detekce přítomnosti p HR HPV DNA provedena u celkem 293 pacientek, od kterých byl také k dispozici výsledek korespondujícího cytologického stěru. st ru. Jednalo se o pacientky vyšetřené vyšet v akreditované cytologické laboratoři ři Damier s.r.o. v Brně. Průměrný věkk i medián pacientek byl 40 let. Věk pacientek byl v rozmezí od 17 do 71 let (graf č. 4).
Graf č. 4: Stratifikace dle věku v pacientek. Do vyšetřovaného ovaného souboru byly zařazeny za pacientky ve věku ku od 17 do 71 let. let
Použité diagnostické metody: Cytologické vyšetření vyšetř (konvenční stěr) – na podložním ožním skle natřené nat a zfixované stěry z exo- a endocervikální sliznice byly barveny v barvícím přístroji Merck Mirostainer DS50 metodou podle Papanicolaua. Obarvené preparáty byly montovány pod krycí sklo po překrytí řekrytí montážním médiem. Následně Následn cytologické screenerky s hodnotily preparáty dle Bethesda klasifikace.. Všechny suspektní nálezy z primárního screeningu byly předány ředány k supervizi lékaři nebo odpovědnému dnému pracovníkovi. K hodnocení cytologických preparátů preparát byl použit mikroskop typu Nikon Elipse E200. 35
HPV testace byla provedena na poloautomatizovaném přístroji Cobas 4800 HPV (Roche, USA). Cobas 4800 HPV test je vyšetření přítomnosti DNA vysoce rizikových typů HPV metodou PCR. Jeho unikátnost spočívá v tom, že podává informaci o přítomnosti konkrétních nejvíce rizikových typů HPV, testuje odděleně HPV 16 a HPV 18, a zvlášť 12 ostatních vysoce rizikových typů HPV (31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 a 68).
Obecný princip PCR (Polymerase Chain Reaction) – enzymatická amplifikace DNA in vitro syntézou mnoha kopií vybrané sekvence DNA v cyklické reakci o třech teplotních fázích. 1) Denaturace - DNA se po dobu 20–30 sekund zahřívá na teplotu 94-98 °C. Při této teplotě dochází k rozrušení vodíkových můstků v molekule DNA a k rozvolnění dvoušroubovice. Vzniká tak jednovláknová DNA, na kterou mohou v dalším kroku nasednout primery. 2) Nasednutí
primerů –
teplota
je
snížena
na
50-65 °C,
což
umožňuje
nasednutí primerů na specifická místa DNA. Na dvouvláknové úseky DNA-primer se váže DNA polymeráza. 3) Syntéza DNA - teplota použitá v této fázi závisí na použité DNA polymeráze. Nejběžnější Taq polymeráza má optimum aktivity v rozmezí 75-80 °C. V tomto kroku dochází k samotné syntéze DNA. Ve směru od 5' konce ke 3' konci přirůstá vlákno DNA komplementární k původní molekule DNA. Tyto kroky se cyklicky opakují, pro dostatečnou amplifikaci původní molekuly DNA obvykle postačuje 30 cyklů. V případě, že na začátku byla ve vzorku pouze jediná molekula DNA, po 32 cyklech teoreticky dostaneme až 1 miliardu nesyntetizovaných molekul DNA (Bartůňková J. aj., 2005).
Statistická analýza V analýze byly použity nálezy cytologických stěrů ve vyšetřovaném souboru pacientek a výsledky Cobas 4800 HPV testu. Statistická významnost vztahu mezi cytologickým nálezem a výsledkem Cobas testu byla hodnocena pomocí oboustranného Fisherova přesného testu. Při všech analýzách byla zvolena hladina významnosti 0,05.
36
7.1. Výsledky
Cobas 4800 HPV test Cytologický nález / počet případů
HPV 16 +, Ostatní HR Negativní
ostatní HR
HPV 16 +
HPV 18 +
HPV + HPV + Negativní / 63
56
6
1
0
0
ASC-US / 121
92
21
3
4
1
LSIL / 72
53
11
3
5
0
ASC-H / 10
5
4
0
1
0
HSIL / 8
1
2
0
5
0
AGC-NOS / 19
18
1
0
0
0
Celkem / 293
225
45
7
15
1
Tabulka č. 5: Nálezy cytologických stěrů ve vyšetřovaném souboru pacientek a výsledky Cobas 4800 HPV testu. ASC-US – atypie dlaždicových buněk nejasného významu, LSIL – low grade skvamózní intraepiteliální léze, ASC-H – atypie dlaždicových buněk suspektní z high grade léze, HSIL – high grade skvamózní intraepiteliální léze, AGC-NOS – atypie žlázových buněk blíže nesecifikované, HR HPV – high risk lidský papilomavirus.
Z celkového počtu 293 cytologických vyšetření (tabulka č. 5) bylo hodnoceno 63 (21,5 %) jako onkologicky negativních. Ve zbývajících 230 (78,5 %) stěrech byly nalezeny cytonukleární atypie, které byly ve 121 (41,3 %) případech klasifikovány jako ASC-US, v 72 (24,6 %) případech jako LSIL, v 10 (3,4 %) případech jako ASC-H, v 8(2,7 %) případech jako HSIL a v 19 (6,5 %) případech jako AGC-NOS. V žádném z konvenčních stěrů nebyly diagnostikovány
buněčné
změny
suspektní
adenokarcinomu) (graf č. 5).
37
z karcinomu
(dlaždicobuněčného
či
Graf. č. 5: Četnost etnost cytologických nálezů v různých věkových kových kategoriích.
Ve studovaném souboru pacientek nebyla virová DNA vysoce rizikových typů typ HPV detekována v 225 (76,8 %) případech. Nejčastěji byla detekována ekována kategorie tzv. other HR HPV a HPV 16, konkrétně v 45 (15,4 %) a 15 případech ch (5,1 %). Koinfekce virem HPV 16 a některým z ostatních HR HPV byla prokázána u 7 pacientek (2,4 %). Pouze u jediné (0,3 %) pacientky byla identifikována DNA HPV 18. 18 Pomocí molekulárně-genetického molekulárně vyšetření, ení, Cobas 4800 HPV testu, nebyla u pacientek s negativní cytologií vysoce riziková rizikov virová DNA identifikována v 56 (88,9 %) případech, p v6 (9,5 %) případech byla zastižena DNA ostatních HR HPV a v jednom (1,6 ( %) případě kombinace HPV 16 a ostatních HR HPV. Ve 121 stěrech rech cytologicky diagnostikovaných jako ASC-US US byla identifikovaná virová v DNA ostatních HR HPV ve 21 (17,4 %) případech, ve 3 (2,5 %) kombinace HPV 16 a ostatních HR HPV, ve 4 (3,3 %) případech řípadech HPV 16, v jednom (0,8 0,8 %) HPV 18, a ve zbývajících 92 (76,0%) případech nebyla ebyla HR HPV DNA zastižena. U 72 pacientek s diagnostikovaným LSIL nebyla HR HPV zjištěna ěna v 53 (73,6 %) případech, v 11 (15,3 %) byla prokázána prokázá DNA ostatních HR HPV, ve třech (4,2 4,2 %) případech HPV 16 a ostatních HR HPV a v 5 (6,9 %) případech HPV 16. V polovině případů př s cytologickým závěrem ASC-H H nebyla pomocí Cobas testu identifikována DNA žádného z vysoce rizikových typů, u 4 (40 40,0%) pacientek byla prokázána DNA ostatních HR HPV a v jednom (10,0%) případěě HPV 16. Diagnóza HSIL byla ve dvou (25,0%) ( %) případech p asociována s přítomností DNA NA ostatních HR HPV a u pěti (62,5 %) pacientek s HPV 16, v jednom (12,5 38
%) případě nebyla DNA vysoce rizikových typů typ lidských papilomavirů ilomavirů prokázána. U celkem 19 pacientek s cytologickou diagnózou AGC-NOS AGC nebyla HR HPV DNA identifikována v 18 (94,7 %) případech, padech, u jedné (5,3 ( %) pacientky byla zastižena DNA ostatních HR HPV (graf č. 6).
Graf č. 6: Procentuální zastoupení detekovaných typů typ HPV (negativní, ostatní HR HPV +, HPV 16 + s ostatními HR HPV +, HPV 16 +, HPV 18 +) u jednotlivých cytologických nálezů ná (negativní, ASC-US, LSIL, ASC-H, H, HSIL, AGC-NOS). AGC
Z celkového počtu 68 HR HPV pozitivních případůů byla nejčastěji nejč detekována virová DNA katgorie tzv. other HR HPV, a to celkem v 45 (66,2 %) případech. př HPV 16 byla zjištěna na u 15 (22,1 %) pacientek, a kombinace ko HPV16 16 a ostatních HR HPV v 7 (10,3 %) případech. ípadech. Nejméně často č byla detekovaná vaná HPV 18, a to u jediné (1,4 %) pacientky. Virová DNA HR HPV byla nejfrekventněji nejfrekventn zjištěna na u pacientek ve věkové v kategorii 26-35 let, a to celkem v 31 (45,6 %) případech, p naopak v kategorii 66-75 66 let nebyla HR HPV detekována u žádné pacientky, a ve skupině sku 56-65 65 let byla zjištěna zjišt HR HPV DNA v jednom (0,01 %) případě př (graf č. 7). 39
Graf č. 7: Četnost etnost detekovaných typ typů HR HPV v různých věkových kových kategoriích.
7.2. Výsledky statistické ické analýzy ve sledované populaci U pacientek s diagnostikovaným LSIL, ASC-H H nebo HSIL vyšel statisticky signifikantně pozitivní výsledek Cobas testu, pLSIL=0,028; pASC-H ASC =0,008; pHSIL<0,001. Pravděpodobnost podobnost detekce HR HPV u pacientek s cytologickou diagnózou diagnó ASC-US je na hranici statistické významnosti (pASC-US=0,05), u pacientek s diagnostikovaným AGC-NOS AGC se naopak nepotvrdila závislost pozitiního výsledku Cobas testu na cytologické diagnóze diagnóz (pAGCNOS=0,678).
Byla prokázána statisticky signifikantně signifikantn vyšší pravděpodobnost ěpodobnost detekce HR HPV u pacientek s diagnózou HSIL v porovnání s pacientkami s diagnostikovaným ASC-US, ASC LSIL či AGC-NOS NOS (hodnoty p uváděny uvád postupně,, p=0,005; 0,011; 0,061). Obdobně Obdobn diagnózy ASC-US, LSIL a ASC-H H byly spojeny se signifikantně signifikantn vyššíí pravděpodobností pravdě průkazu HR HPV než diagnóza AGC-NOS AGC NOS (p=0,076; 0,061; 0,011). Naopak nebyl prokázán signifikantní rozdíl v pravděpodobnosti ěpodobnosti detekce vysoce rizikové rizikové HPV DNA u pacientek s high grade cytologickými diagnózami, tedy ASC-H ASC versus HSIL (p=0,367) a obdobně obdobn u pacientek s low grade cytologickými diagnózami, konkrétně konkrétn ASC-US US versus LSIL (p=0,730). Specificita a senzitivita uvedených testů test dosahuje hodnoty 88,9 %, respektive 91 %. %
40
8. DISKUZE Nejvýznamnějším etiologickým faktorem, podílejícím se na vzniku dysplázie a karcinomu děložního čípku, je infekce vysoce rizikovými typy HPV. Na základě makroskopických a mikroskopických morfologických změn exocervikální sliznice lze za pomocí kolposkopického, cytologického, a v suspektních případech i bioptického vyšetření, většinu prekanceróz či malignit odhalit. Onkologická cytologie spolu s kolposkopií patří mezi screeningové metody pro včasnou diagnostiku karcinomu děložního čípku. Obě vyšetření však jsou zatížena rizikem falešně negativních i falešně pozitivních výsledků. Autoři Kulhánková a kolektiv se ve své práci zabývali korelací cytologického a histologického nálezu u 673 žena specifikovali možné příčiny diskrepantního závěru do tří hlavních skupin. Jako každé vyšetření, i metody onkologického screeningu jsou zatíženy lidskou chybou – i zjevný nález může být špatně interpretován. Cytologický materiál nemusí suspektní buňky z přítomné léze vůbec obsahovat, a do třetice, cytologický obraz může být velmi diskrétní – mezi desetitisíci buněk natřených na skle jsou pak přítomny zcela ojedinělé atypické buňky, které, zvláště při zánětu, cytolýze nebo zhmoždění, mohou uniknout pozornosti cytologa (Kulhánková J. aj., 2002). Verifikace přítomnosti nebo absence virové DNA HR HPV pomocí molekulárně-genetických metod tak může upřesnit nejasné kolposkopické či cytologické nálezy a v konečném důsledku i optimalizovat časový odstup a posloupnost následných kontrolních vyšetření. V předkládané bakalářské práci jsme na souboru celkem 293 pacientek se známým výsledkem cytologického vyšetření detekovali pomocí Cobas testu přítomnost HR HPV, a to v kategoriích HPV 16, HPV 18 a ostatní HR HPV (HPV 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 a 68), případně současnou koinfekci více typy HR HPV. Jednalo se o pacientky z databáze cytologické laboratoře Damier s.r.o, které během dvanácti měsíců (v období od 1. 2. 2013 do 31. 1. 2014) podstoupily cytologické vyšetření a Cobas test. Pacientky byly ve věku 17 až 71 let, průměrný věk byl 40 let. Nejčastěji byly cytologicky a molekulárně-geneticky vyšetřeny pacientky ve věku 30 – 39 let, naopak nejméně často byla zastoupena kategorie 17 – 19 let. Ve studovaném souboru nebyla virová DNA vysoce rizikových typů HPV detekována u 225(76,8 %) pacientek. Nejčastěji byla identifikována kategorie ostatních HR HPV a HPV 16, konkrétně v 45 (15,4 %) a 15 případech (5,1 %). Koinfekce virem HPV 16 a některým z ostatních HR HPV byla prokázána u 7 pacientek (2,4 %). Pouze u jediné (0,3 %) pacientky byla detekována DNA HPV 18.
41
Z celkového počtu 63 negativních cytologií bylo 7 (11,1 %) případů specifikováno jako HR HPV pozitivní (6krát ostatní HR HPV, a jedenkrát kombinace HPV16 a ostatní HR HPV). V těchto případech se pravděpodobně jednalo o latentní či okultní infekci bez morfologicky vytvořené nebo patrné léze. Dle literárních pramenů je časový interval od infekce HR HPV po vznik low grade dysplázie 2-3 roky, a za dalších 10-12 let se při perzistující infekci může u žen s normálně fungujícím imunitním systémem vyvinout karcinom (Burd EM, 2003). Pacientkám s prokázaným HR HPV ale normálním cytologickým a kolposkopickým nálezem lze nabídnout zopakování Cobas testu za rok a v případě perzistující infekce některým z HR HPV doporučit expertní kolposkopii. Cytologická diagnóza ASC-US byla stanovena ve 121 stěrech. Z tohoto počtu bylo 92 (76,0 %) pacientek HR HPV negativních. Pravděpodobně se tedy jednalo o cytonukleární atypie reaktivního původu, které byly nejčastěji asociované se zánětem, graviditou nebo se zavedeným nitroděložním tělískem. Reaktivní atypie obecně nejsou považovány za prekancerózu (Solomon et al. 2004). V 29 (24,0 %) ASC-USech byla detekována HR HPV (21krát ostatní HR HPV, 4krát HPV 16, 3krát kombinace HPV 16 a ostatních HR HPV a jedenkrát HPV 18). V těchto nejasných případech je doporučována expertní kolposkopie a v případě makroskopicky patrné léze bioptická verifikace nálezu ze suspektního ložiska. Dle histologického obrazu následuje konizace, v případech low grade dysplázie či při negativním nálezu lze zvolit přístup „watch-and-wait“ s pravidelnými kolposkopickými kontrolami a spolu s cytologickým vyšetřením opakování Cobas testu. Ze 72 cytologicky diagnostikovaných LSILů nebyla DNA HR HPV prokázána u 53 (73,6 %) pacientek. V těchto případech byly pravděpodobně nadhodnoceny reaktivní cytonukleární atypie imitující koilocytární přeměnu dlaždicových a metaplastických buněk. V literatuře však jsou popsány i případy low grade a dokonce i high grade dysplázie (CIN II) čípku způsobené low risk typy HPV, konkrétně HPV 6 a HPV 11 (Hudelist G., 2004; Insinga RP. et al., 2007; Fait T., 2013). Výsledek molekulárně-genetického vyšetření tedy nelze absolutně nadřazovat morfologickým metodám a jistě je vhodné u pacientky s diagnózou LSIL ale negativním Cobas testem provést expertní kolposkopické vyšetření a kontrolní cytologii za půl roku. Diagnózu ASC-H řadí Bethesda klasifikace mezi high grade dysplázie, i když připouští, že část výrazných cytonukleárních atypií může být reaktivního původu. V našem souboru s 10 ASC-H diagnózami nebyla HR HPV prokázána v polovině případů. Zřejmě se jednalo o pacientky s těžkým chronickým zánětem čípku, nelze vyloučit i spolupůsobení 42
dalších rizikových faktorů (mechanického dráždění, zavedeného nitroděložního tělíska, opakovaných infekcí genitálního traktu, aj.). High grade cytonukleární atypie věrně napodobují i zhmožděné atrofické epitelie. DNA ostatních HR HPV byla identifikována ve 4 (40,0 %) případech ASC-H, a v jednom (10,0 %) případě byla zastižena HPV 16. Z celkového počtu 8 HSIL byla v 7 (87,5 %) případech DNA HR HPV detekována (5krát HPV 16 a 2krát ostatní HR HPV). Významným zjištěním je detekce HPV 16 u celkem 62,5 % pacientek s cytologickou diagnózou HSIL. I když se jedná o malý soubor, přesto tento výsledek koreluje s literárními údaji, podle kterých infekce HPV 16 a HPV 18 způsobuje přibližně 70 % všech high grade cervikálních lézí, včetně karcinomu (Insinga RP et al., 2007). Cytologická diagnóza AGC-NOS byla stanovena u celkem 19 pacientek, přičemž pouze v jednom případě (5,3 %) byla identifikována DNA HR HPV, konkrétně ostatních HR HPV. Ve zbývajících 18 (94,7 %) případech nebyla HR HPV detekována.Dle Bethesda klasifikace diagnóza AGC-NOS koreluje s low grade endocervikální, přesněji glandulární, dysplázií. V optimálním případě by tedy měla být DNA HR HPV identifikována u signifikantního počtu pacientek s AGC-NOS. Pravděpodobně byl cytologický nález nadhodnocen, zřejmě se tedy jedná o falešně pozitivní výsledky. Na druhou stranu je třeba si uvědomit, že senzitivita cytologického vyšetření je obecně výrazně nižší u hluboko uložených lézí. Lépe je pacientku sledovat v kratších vyšetřovacích intervalech, než minout dysplastické či neoplastické změny v místech, která nejsou dostupná pro kolposkopickou aspekci. Cobas 4800 HPV test pomáhá hlavně v nejasných cytologických případech, a to hlavně u diagnóz ASC-US a ASC-H (obrázek č. 3), pomůže rozlišit falešně pozitivní výsledky od skutečných atypických cytologických nálezů. U LSIL a ASC-H se tento test doporučuje provést, jestliže jedna ze dvou diagnostických metod byla určena jako pozitivní (kolposkopie negativní a cytologie pozitivní nebo kolposkopie pozitivní a cytologie negativní). Molekulárně-genetický test je také vhodný i u jasných cytologických případů, konkrétně HSIL nebo suspektního invazivního dlaždicového karcinomu, ale nejlépe s časovým odstupem (1 rok) po chirurgickém řešení. V některých zemích je molekulárně-genetické vyšetření detekující HR HPV začleněno mezi primární screeningové metody. Dle recentních literárních zdrojů prestižních organizací US Food and Drug Administration advisory commitee (FDA; Brown T, 2014), The United States Preventive Services Task (USPSTF) a The American Cancer Society (ACS) doporučují u žen ve věku 30 až 65 let detekci HR HPV jako první krok v posloupnosti screeningových vyšetření. V případě negativního výsledku následuje onkologická cytologie ve screeningovém 43
intervalu, pro USA to jsou tři roky, dokonce je zvažováno prodloužení intervalu na pět let. Při detekci HPV 16 a/nebo HPV 18 pacientka podstoupí expertní kolposkopii. Pokud gynekolog na čípku makroskopicky identifikuje suspektní lézi, následuje její bioptická verifikace, v případě negativního kolposkopického nálezu je doporučováno cytologické vyšetření. Negativní cytologie znamená kontrolní HPV testaci za rok, suspektní cytologický nález by měl být následován bioptickou verifikací (kvadrantová biopsie, minikonizace apod.). U pacientek s prokázanou virovou DNA z kategorie ostatních HR HPV je doporučováno cytologické vyšetření, a další postup je stejný, jako v případě negativní či suspektní cytologie (viz. výše). V České republice je zavedený roční screeningový interval pro včasnou detekci dysplázií a karcinomu děložního čípku. Bohužel osvěta žen v reprodukčním věku, které jsou tímto zhoubným onemocněním nejvíce ohroženy (ve věku 25-59 let), je stále nízká, do screeningového programu je zapojeno pouze cca 55 % žen cílové skupiny. Problematika karcinomu děložního čípku je zmiňována v souvislosti s komerčními vakcínami, význam primární a sekundární prevence je opomíjen. Průlomem by mohly být od ledna tohoto roku adresně rozesílané dopisy od zdravotních pojišťoven, které zvou ženy nezapojené do screeningu k návštěvě gynekologa. Součástí těchto dopisů je vysvětlení významu prevence karcinomu děložního čípku, stručně jsou shrnuta základní fakta o tomto onemocnění. Na zhodnocení efektivity zvacích dopisů si musíme počkat. Za současné situace je ale povědomí laické veřejnosti o karcinomu děložního čípku nízké a prozatím tedy nelze podpořit i v České republice diskutované prodloužení screeningového intervalu. Lze ale předpokládat, že HPV testace se stane významnou součástí screeningových vyšetření, a to především v nejasných cytologických diagnózách nebo diskrepantních kolposkopických a cytologických nálezech.
44
9. ZÁVĚR V úvodní části bakalářské práce je teoreticky pojednáno o základních charakteristikách lidského papilomaviru a jeho významu pro vznik dysplastických a posléze i neoplastických změn v epitelu děložního čípku. Podrobně je diskutován vliv prevence, s ohledem na zaměření předkládané práce především prevence sekundární, tedy screeningu karcinomu děložního čípku. V České republice je ve srovnání s vyspělými zeměmi incidence karcinomu děložního čípku stále vysoká, a k jejímu poklesu dochází jen velmi pozvolna. Řešením by mohla být intenzivnější osvěta laické veřejnosti s vysvětlením významu primární a sekundární prevence. Vytyčené cíle bakalářské práce byly splněny v celém rozsahu. Celkem 293 pacientek se známou cytologickou diagnózou podstoupilo molekulárně-genetické vyšetření, Cobas 4800 HPV test. Byla zjišťována celková četnost HR HPV i frekvence jednotlivých kategorií HR HPV, konkrétně HPV 16, HPV 18, tzv. ostatních HR HPV, případně koinfekce více typy HR HPV. Výsledek HPV testu byl u každé pacientky porovnán s cytologickou diagnózou a získaná data byla statisticky zhodnocena. Ve
vyšetřovaném
souboru
byly
jednotlivé
cytologické
nálezy
zastoupeny
v následujícím pořadí: ASC-US (41,3 %), LSIL (24,6 %), negativní (21,5 %), AGC-NOS (6,5 %), ASC-H (3,4 %) a HSIL (2,7 %). U 225 (76,8 %) pacientek nebyla DNA vysoce rizikových HPV prokázána. Ve skupině 68 HR HPV pozitivních pacientek byly nejčastěji detekovány ostatní HR HPV (66,2 %), následně HPV 16 (22,1 %), kombinace HPV 16 a ostatních HR-HPV (10,3 %) a pouze v jednom případě byl identifikován HPV 18 (1,4 %). U cytologických nálezů LSIL, ASC-H a HSIL vyšel Cobas HPV test statisticky signifikantně pozitivní. Také byla prokázána vyšší pravděpodobnost detekce HR HPV u pacientek s HSIL ve srovnání s pacientkami s ASC-US, LSIL či AGC-NOS. Poslední jmenovaná diagnóza, tedy AGC-NOS nekorelovala s očekávaným výsledkem HPV testu, který byl ve většině případů negativní, nepotvrdila se tak závislost pozitivního výsledku Cobas testu na této diagnóze. Molekulárně-genetické vyšetření detekující virovou DNA vysoce rizikových typů HPV je využitelné v případech s nejednoznačnou cytologickou diagnózou (ASC-US, ASC-H) a u diskrepantních cytologických a kolposkopických nálezů. V budoucnu lze očekávat začlenění HPV testace mezi screeningové metody pro detekci karcinomu děložního hrdla.
45
10. LITERATURA BARTŮŇKOVÁ J., PAULÍK M., Vyšetřovací metody v imunologii, Praha: Grada, 2005, 176s. ISBN 80-247-0691-1.
BURD EILEEN M., Human Papillomavirus and Cervical Cancer. Clinical Microbiology Reviews, 2003, Vol. 16, No. 1, p.: 1-17.
CITTERBART K., Gynekologie. 1. vydání. Praha: Galén. 2001, 278 s. ISBN: 80-7262-094-0.
CLIFFORD GM., GALLUS S., HERRERO R. et al. The IARC HPV Prevalence Survey Study Group. 2005. Worldwide distribution of human papillomavirus types in cytologically normal women in the International Agency for Research on Cancer HPV prevalence surveys: a pooled analysis. Lancet. 366 (9490): 991-998. DUŠEK L., ŽALOUDÍK J., INDRÁK K., Informační zázemí pro využití onkologických populačních dat v ČR. Klinická onkologie 20 (Suppl. 1). 2007. p. 196. EGGOVÁ P., GRÜNWALDOVÁ I., Prekancerózy děložního hrdla, Florence, 2012, č. 10, s. 23-25.
EXLEY C., SWARBRICK L., GHERARDI RK. et al. A role for the body burdenof aluminium in vaccine-associated macrophagic myofasciitis andchronic fatigue syndrome. Med Hypotheses. 72, 135-9, 2009.
GHERARDI RK., COQUET M., CHERIN P. et al. Macrophagic myofasciitislesions assess long-term persistence of vaccine-derived aluminium hydroxidein muscle. Brain. 124(9), 1821-3 1, 2001.
HOLUBOVÁ A., Sestra v prevenci a včasné diagnostice nádorových onemocnění. Sesta. 2007, č. 5, s. 52.
46
HUDELIST G., MANAVI M., PISCHINGER KI. et al. Physical state and expression of HPV DNA in benign and dysplastic cervical tissue: different levels of viral integration are correlated with lesion grade.Gynecol Oncol. 2004, Mar;92(3):873-80.
CHOVANEC J., DOSTÁLOVÁ Z., NAVRÁTILOVÁ J., Karcinom děložního hrdla, Lékařské listy. Příloha Zdravotnických novin. 2008, č. 7, s. 30-33. INSINGA RP., DASBACH EJ., ELBASHA EH. et al. Incidence and duration of cervical human papillomavirus 6, 11, 16, and 18 infections in young women: an evaluation from multiple analytic perspectives.Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 2007, Apr;16(4):709-15. JAKUBALOVÁ J., Co ještě možná nevíte o infekci HPV, Diagnóza v ošetřovatelství, 2010, č. 6, s. 28-29.
KOBILKOVÁ J., LOJDA Z., ONDRUŠ J. a kolektiv, Gynekologická cytodiagnostika, Praha: Galén, 2000. 109s. ISBN 80-7262-044-4.
KUBÁLEK V., Úvod do cytodiagnostiky, Brno: IDVPZ, 2001, 100s., ISBN 80-7013-333-3.
KULHÁNKOVÁ J., HORKÁ J., KUPCOVÁ L. a kolektiv, Možnosti cytologického vyšetření v diagnostice cervikálního karcinomu a jeho prekurzorů a přínos minibiopsií u diskrepantních nálezů. Praktická gynekologie, 2002, č. 6, s 22-24. MATTOSINHO CF., NICOLAU SM., STÁVALE JN. et al. Cervical biopsy-based comparison of a new liquid-based thin-layer preparation with conventional Pap smears.Diagn Cytopathol. 2004, Apr;30(4):220-6. MIKYŠKOVÁ I., DVOŘÁK V., MICHAL M., Lidské papilomaviry jako příčina vzniku gynekologických onemocnění. Praktická gynekologie, 2003, č. 4, s. 33-36.
MIKYŠKOVÁ I., MICHAL M., Diagnostika lidských papillomaviru, Česká gynekologie, 2004, č. 6, s. 510-516.
MISTRÍKOVÁ J., Patogenéza virusových nákaz, Bratislava, UK 2005. 47
MUNOZ N., CASTELLSAUGUĚ X., BERRINGTON G. et al. Chapter 1: HPV in the etiology of human cancer. Vaccine. 2006, 24 (S3): S1-S10.
PLUTA M., Infekce humánním papillomavirem (HPV) a karcinomu děložního hrdla, Lékařské listy. Příloha Zdravotnických novin, 2011, č. 9, s. 18-19.
ROBERTS JM., THURLOE JK., BOWDITCH RC. et al. A three-armed trial of the ThinPrep Imaging System. Diagn Cytopathol. 2007, Feb;35(2):96-102.
SCHEJBALOVÁ M., HPV infekce, Diagnóza v ošetřovatelství, 2011, č. 5, s. 28-30.
SCHIFFMAN M., CASTLE PE., Epidemiology of HPV. Arch Pathol Lab Med. 2003, 127: 930-934.
SOLOMON D., NAYAR R., The Bethesda System for Reporting Cervical Cytolog. 2004, ISBN 0-387-40358-2.
ŠIMŮNKOVÁ M., Rakovina děložního hrdla, Sestra, 2008, č. 2, s. 31-32.
TACHEZY R., HAMSIKOVA E., HAJEK T. et al. Human papillomavirus genotype spectrum in Czech women: correlation of HPV DNA presence with antibodies against HPV16, 18, and 33 virus-like particles. J Med Virol. 1999, 58: 378-386.
TACHEZY R., JIRASEK T., SALAKOVA M. et al. Human papillomavirus infection and tumours of the anal
canal: correlation of histology, PCR detection in paraffin sections and
serology. APMIS. 2007, 115: 195-203.
TACHEZY R., MIKYSKOVA I., LUDVIKOVA V. et at. Longitudinal study of patients after surgical treatment for cervical lesions: detection of HPV DNA and prevalence of HPVspecific antibodies. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 2006, 25: 492-500. TACHEZY R., ROB L., Skrínink pro prevenci karcinomu děložního hrdla v České republice. Časopis lékařů českých. 2007, 146(12):939–44. 48
TACHEZY R., Dermatovenerologické projevy infekcí vyvolaných papilomaviry. Lékařské listy. Příloha Zdravotnických novin, 2006, č. 16, s. 20-22.
TAVASSOLI FA., DEVILEE P., Pathology and Genetics Tumours of the Breast and Female Genital Organs, IARC Press Lyon, 2003, str. 262-284.
VRÁŽELOVÁ K., Nedostatečné znalosti mladých dívek o HPV infekci, Diagnóza v ošetřovatelství, 2012, č. 3, s. 26.
Internetové zdroje: Česká onkologická společnost České lékařské společnosti Jana Evangelisty Purkyně. [online]. [cit. 2014-01-01]. Dostupné z: http://www.linkos.cz/
Epidemiologie zhoubných nádorů v České republice. [online]. [cit. 2014-01-01]. Dostupné z: http://www.svod.cz/
FDA Panel: HPV DNA Test Before Pap for Cervical Cancer Screening. Troy Brown, RN, March 13, 2014. www.medscape.com
HPV
information.
[online].
[cit.
2013-11-15].
Dostupné
z:
http://www.bristol.ac.uk/biochemistry/gaston/HPV/hpv_information.htm
MÁJEK O., DVOŘÁK V., DUŠEK L. a kolektiv. Cervix.cz – Program cervikálního screeningu v České republice [online]. Masarykova univerzita, Brno, 2013. [cit. 2013-11-15]. Dostupný z WWW: http://www.cervix.cz/ISSN 1804-087X. Verze 1.6f.
Medscape: Human Papillomavirus E6/E7 mRNA Testing as a Predictive Marker for Cervical Carcinoma.
[online].
[cit.
2014-01-01].
http://www.medscape.com/viewarticle/585223
49
Dostupné
z:
Merck
Sharp
&
Dohme
s.r.o.
[online].
[cit.
2013-11-16].
Dostupné
z:
http://www.msd.cz/tinymce/uploaded/aaa_msd_20_sprn/Silgard%20injek%C4%8Dn%C3%A D%20suspenze_16.7.2013_PIL.pdf
Očkování Internetové Informační Centrum. [online]. [cit. 2013-11-15]. Dostupné z: http://www.vakciny.net/AKTUALITY/akt_2011_12.htm
Screening for Cervical Cancer: Clinical Summary of U.S. Preventive Services Task Force Recommendation. AHRQ Publication No. 11-05156-EF-3, March 2012. http://www.uspreventiveservicestaskforce.org/uspstf11/cervcancer/cervcancersum.htm
TACHEZY R., Ústav hematologie a kevní transfuze: Laboratoř molekulární epidemiologie virů [online]. [cit. 2013-11-16]. Dostupné z: http://www.uhkt.cz/zdravotnik/komplementlaboratori/laboratore-vu/laborator-molekularni-epidemiologie-viru
Zdravotnictví a medicína. [online]. [cit. 2014-01-01]. Dostupné z: http://zdravi.e15.cz/dennizpravy/z-domova/proockovanost-divek-proti-hpv-dosahla-v-cr-80-procent-470150
50
