Masarykova univerzita Lékařská fakulta
Klinický význam vyšetření nádorových markerů, metody jejich stanovení
Bakalářská práce v oboru zdravotní laborant
Vedoucí diplomové práce:
Autor:
RNDr. Zdeněk Veškrna
Hana Říhová
Brno, duben 2012
Jméno a příjmení autora: Hana Říhová
Název bakalářské práce: Klinický význam vyšetření nádorových markerů, metody jejich stanovení
Pracoviště: Nemocnice Znojmo, Oddělení klinické biochemie
Vedoucí bakalářské práce: RNDr. Zdeněk Veškrna
Rok obhajoby bakalářské práce: 2012
Souhrn: Práce podává stručný a ucelený přehled o používaných nádorových markerech a jejich vlastnostech. Podrobně popisuje metodiku stanovení nádorových markerů na Oddělení klinické biochemie Nemocnice Znojmo včetně preanalytické fáze a ekonomiky vyšetření. V experimentální části ukazuje na příkladě pěti kazuistik praktické využití
nádorových
markerů při terapii různých nádorových onemocnění (karcinom prostaty, ovaria, prsu, tlustého střeva a zhoubný novotvar mediastina).
Klíčová slova: nádorový marker, OKB, Nemocnice Znojmo, CA 15-3, CA 125, PSA
Prohlašuji, že jsem bakalářskou práci vypracovala samostatně pod vedením RNDr. Zdeňka Veškrny a uvedla v seznamu literatury všechny použité literární a odborné zdroje.
V Brně dne ……………..
…………………………..
Děkuji svému školiteli RNDr.Zdeňkovi Veškrnovi za odborné vedení při psaní bakalářské práce, za cenné rady a připomínky. Zároveň děkuji Mgr. Miladě Nezvedové za pomoc při řešení problémů a celé své rodině za trpělivost a ochotu po celou dobu studia.
Obsah
Úvod ...........................................................................................................................................7 1 Obecná část .........................................................................................................................8 1.1 Nádory ........................................................................................................................8 1.1.1 Molekulární podstata vzniku nádorů ..................................................................8 1.1.2 Třídění nádorů.....................................................................................................9 1.2 Nádorové markery ......................................................................................................9 1.2.1 Rozdělení nádorových markerů ........................................................................10 1.2.2 Vlastnosti nádorového markeru ......................................................................10 1.2.3 Využití nádorových markerů ...........................................................................11 1.2.4 Frekvence vyšetření nádorových markerů ........................................................14 1.2.5 Interpretace a zdroje interference vyšetření nádorových markerů...................15 1.2.6 Nejčastěji používané nádorové markery...........................................................16 1.2.7 Méně časté nádorové markery ..........................................................................26 1.2.8 Potenciální nové nádorové markery .................................................................28 2 Speciální část ....................................................................................................................30 2.1 Cíl práce....................................................................................................................30 2.2 Metodika a přístrojové vybavení OKB.....................................................................31 2.2.1 Analyzátor Beckman Coulter UniCel DxI 800.................................................31 2.2.2 Analyzátor Roche Cobas e 411.........................................................................35 2.2.3 Analyzátor Siemens IMMULITE 1000 ............................................................36 2.3 Informace o nádorových markerech .........................................................................37 2.3.1 Preanalytické požadavky ..................................................................................37 2.3.2 Analytické parametry metod.............................................................................39 2.3.3 Ekonomika stanovení nádorových markerů .....................................................41 2.4 Programy CRACTES a BIANTA.............................................................................42 2.5 Experimentální část...................................................................................................44 Závěr .........................................................................................................................................56 Seznam literatury a použitých zdrojů .......................................................................................57
Použité symboly a zkratky
BRCA………………….breast cancer CA……………………..carbohydrate antigen CD……………………..cluster designation CRP……………………c-reaktivní protein ČSKB………………….Česká společnost klinické biochemie GIT…………………….gastrointestinální trakt TM……………………..tumor marker TNF……………………tumor necrosis factor ZN……………………...zhoubný novotvar
Úvod V posledních letech dochází k výraznému zvýšení výskytu zhoubných novotvarů, které patří hned po kardiovaskulárních nemocech k nejčastějším příčinám úmrtí ve všech civilizovaných zemích. Nejvyšší incidence byla zaznamenána u maligních nádorů tlustého střeva a konečníku, ledvin, plic, prostaty u mužů a prsu u žen. Cílem současné medicíny je co nejčasnější diagnóza, což znamená záchyt nádoru v jeho počátečním stádiu a bez generalizace. Zobrazovací metody mají schopnost postihnout nádor o hmotnosti asi 1 g a obsahu 109 buněk. Imunochemickými metodami lze prokázat nádor až tisíckrát menší. Sérové nádorové markery proto představují důležité parametry, které usnadňují sledování léčby a predikci vývoje onemocnění u onkologických pacientů. Racionální využití nádorových markerů předpokládá znalost správné indikace vyšetření, jejich významu v diagnostickém procesu, klinické senzitivity a specifičnosti, analytických možností, preanalytických faktorů i interferencí a
znalost významu pro určení stadia maligního
onemocnění.
7
1 Obecná část Nádorové onemocnění je různorodá skupina chorob, jejichž společným rysem je, že některá populace vlastních buněk organismu se vymkne kontrole a začne relativně autonomně růst. Za normálních okolností jsou buňky schopny mutaci detekovat a opravit nebo se seberozložit apoptózou. Bujení pak může být naprosto neškodné, ale také může v poměrně krátké době nemocného zahubit . Obvykle se považuje za projev zhoubnosti (malignity) to, že nádor roste infiltrativně do okolí, je schopen se rozsévat po těle a zakládat vzdálená ložiska, tzv. metastázy. Výjimku z tohoto pravidla představují maligní nádory mozku, které jen vzácně zakládají metastázy.
1.1 Nádory Nádor zpravidla původně vychází z mutací jedné buňky, ale proces nádorové transformace je vícestupňový, to znamená postupná kumulace několika mutací, tak že se postupně stává geneticky heterogenní. Průběh nádorového onemocnění lze shrnout do tří fází: •
iniciace nádorového zvratu buňky – jedná se o ireverzibilní mutaci určitého kritického genu,
•
promoce – bývá dlouhá, někdy i desetiletí, mutované buňky musí být stimulovány dalšími faktory k výraznější proliferaci ( např. hormonální stimulace, fyzikální iritace, působení karcinogenní látky nebo onkogenní viry),
•
progrese – narůstá mutací genů stimulace růstu, kontrolních bodů buněčného cyklu, transkripčních faktorů; nádor prorůstá do okolí, metastazuje na vzdálená místa nebo prorůstá cévami. (Kopecká, 2006)
1.1.1 Molekulární podstata vzniku nádorů Všechny nádory jsou důsledkem genetické poruchy, a to klíčových genů kontroly buněčného cyklu. Rozlišují se tři skupiny zasažených genů: •
protoonkogeny – geny, jejichž normální funkcí je stimulace růstu a dělení buněk, mutovaný gen je zvýšeně aktivní, dělení je nekontrolované,
•
tumor supresorové geny – označované také jako antionkogeny, zpomalují nekontrolovaný růst i u buněk nádorově transformovaných, 8
•
DNA reparační geny – geny, jejichž funkcí je oprava poškozené DNA, pokud jsou mutovány neopravená změna může být přenesena do dceřinných buněk. (Nečas, 2000)
Genetická změna může vzniknout chybou replikace DNA a dělení buňky. Dále působením zevních faktorů (karcinogenů): •
biologických – některé RNA a DNA viry nebo helminti,
•
chemických – působení organických látek, toxinů, těžkých kovů,
•
fyzikální – záření o vysoké energii, zejména ionizující záření,
•
hormonální – dlouhotrvající hormonální stimulace některých tkání může způsobit jejich přeměnu v nádor.
1.1.2
Třídění nádorů
Nádory dělíme podle: a) biologických vlastností nádorů a to na: •
benigní (nezhoubné) nádory – rostou pomalu, expanzivně, jsou ohraničené, bývají opouzdřené, netvoří metastázy, nádory jsou většinou chirurgicky odstranitelné,
•
intermediární nádory – představují rozhraní mezi benigními a maligními nádory,
•
maligní nádory – rostou rychle, invazivně, destruktivně, jsou neohraničené, tvoří metastázy, chirurgicky obtížně odstranitelné.
b) původu – to znamená podle histologického vzhledu nádorů: •
epiteliální,
•
mezenchymální,
•
neuroektodermové. (Mačák, 2004)
1.2
Nádorové markery
Nádorové markery jsou definovány jako molekuly převážně proteinového charakteru, které jsou přítomny v organismu v důsledku vzniku a vývoje maligního procesu. Jejich výskyt ve tkáni zhoubného nádoru (celulární nádorové markery) a v tělních tekutinách (humorální nádorové markery) souvisí s růstem nádoru v organismu. Nádorové markery jsou produkovány samostatným nádorem (s nádorem asociované antigeny) nebo jinými tkáněmi jako odpověď na maligní proces v organismu (indukované nádorové markery). Přítomnost 9
nádorových markerů v tělních tekutinách je podmíněna přechodem těchto látek z místa syntézy do oběhu. Koncentrace nádorových markerů v séru má obvykle přímý vztah k typu a rozsahu onemocnění. (Šimíčková, 2004) Chemická struktura nádorových markerů je různorodá. Jedná se o glykoproteiny, cukerné determinanty glykoproteinů, sacharidy, glykolipidy, polypeptidy, imunoglobuliny a polyaminy (Králíková, 2003). Řada z nich má enzymovou aktivitu, s vyjímkou LD se zpravidla stanovují jako antigeny pomocí specifických protilátek většinou monoklonálních. (Zima, 2007)
1.2.1
Rozdělení nádorových markerů
Nádorové markery se mohou dělit do tří skupin, mezi kterými však neexistuje ostré rozhraní: •
Onkofetální antigeny – molekuly, které organismus produkuje fyziologicky ve fetálním období vývoje a po narození je tvoří jen v souvislosti s onemocněním, zejména nádorovým. Příkladem mohou být – karcinoembryonální antigen, α1fetoprotein a lidský choriový gonadotropin.
•
Tkáňové nebo orgánově specifické antigeny – látky, které se normálně nacházejí ve zdravé tkáni nebo orgánu a mimo něj pronikají jen v minimálním množství. Teprve při nádorovém onemocnění, ale také v malé míře při zánětech nebo traumatizaci, se uvolňují. Jsou to například prostatický specifický antigen, neuron specifická enoláza, protein S-100b, tkáňový polypeptidový antigen, CYFRA 21-1, antigeny CA 15-3, CA 125, CA19-9, CA 72-4, antigen skvamózních buněk nebo thyreoglobulin.
•
Nespecifické
antigeny
a
nádorové
markery
mezi
které
patří
ferritin,
laktádehydrogenáza, thymidinkináza či β2- mikroglobulin.(Zima, 2007)
1.2.2 Vlastnosti nádorového markeru Pro nejlepší klinickou využitelnost by měl mít ideální nádorový marker stoprocentní specifitu (správnou negativitu) při co nejvyšší senzitivitě (správné pozitivitě, tj. správný záchyt nemocných). Vzhledem k širokému spektru nádorových onemocnění neexistuje univerzální nádorový marker a ani senzitivita při dostatečné specifičnosti nedosahuje ideálních 100%. Nezvýšená 10
koncentrace nádorového markeru tedy neznamená nepřítomnost maligního onemocnění, a naopak pozitivní výsledek nemusí znamenat zhoubný nádor. (Šimíčková, 2004) Senzitivita a specifita testu spolu souvisí a jejich poměr je závislý na hodnotě, která je považována za hraniční pro hodnocení testu, tzv. cut-off value. Senzitivitu lze zvýšit kombinací několika tumorových markerů, potom je ovšem nutné počítat s nižší specifičností a tím větším výskytem falešně pozitivních výsledků.(Zima, 2007) Vztah senzitivity a specifity vyjadřuje ROC-křivka ( Receiver Operating Charakteristics).
Obr.1 ROC-křivka pro CEA a CA 15-3 pacientek s diagnózou karcinomu mammae
Koncentrace tumorového markeru je závislá na: •
rozsahu nádoru (staging),
•
stupni zralosti nádorových buněk (grading),
•
schopnosti produkce příslušného markeru,
•
schopnosti vyplavení markeru do krve – dáno stupněm prokrvení nádoru.
1.2.3
Využití nádorových markerů
Screening Vzhledem ke své nedostatečné specifičnosti a relativně nízké citlivosti se tumorové markery nehodí k vyhledávání zhoubných nádorů u asymptomatických jedinců. Mohou být ovšem užitečné při vyšetřování symptomatických jedinců nebo u rizikových skupin lidí, kteří jsou ohroženi nádorovým onemocněním. Zavedení screeningu karcinomu prostaty pomocí PSA u mužů nad 50 let řeší dlouhodobě odborné společnosti a zdravotní pojišťovny, zatím bez dosažení stejného názoru. Dalším příkladem může být vyšetřování AFP u nemocných s jaterní cirhózou vzhledem k možnosti vzniku hepatocelulárního karcinomu nebo vyšetřování 11
kalcitoninu v rodinách s familiárním výskytem medulárního karcinomu štítné žlázy nebo stanovení nádorového markeru CA 15-3 v rodinách s mutacemi v genech BRCA1 a BRCA2 (ČSKB, 2008). Stanovení nového nádorového markeru HE4 v kombinaci s antigenem CA 125 může být významnou diagnostickou pomůckou pro včasné odhalení ovariálního karcinomu.
Primární diagnostika Tumorové markery nejsou podobně jako screening vhodné pro primární diagnostiku nádorů. Při určování stádia nádoru jsou významné především vysoké hodnoty markeru, které obvykle znamenají pokročilé onemocnění.
Staging a prognóza Je určení rozsahu nádoru. Vysoká hodnota nádorového markeru v séru může upozornit na špatně stanovené nižší stadium nemoci. Vysoké hodnoty nádorových markerů mohou ukazovat na pokročilé stádium onemocnění (ČSKB, 2008)
Sledování průběhu nemoci a účinku terapie Sledování průběhu onemocnění a efektu terapie je hlavní doménou indikace nádorových markerů, kdy je nutné stanovit jejich hladinu před léčbou. Analýza hladin nádorových markerů bývá přínosná pro hodnocení remise nebo při podezření na reziduální nádor, někdy i měsíce před objevením klinických příznaků. Tab. 1 ukazuje nádorové markery vhodné k monitorování průběhu onemocnění či účinnosti terapie. Vzhledem k různým biologickým poločasům jednotlivých markerů (tab.2) je nutné volit vhodně intervaly odběrů krve k vyšetření tak, aby se skutečně postihla účinnost terapie a ne „lysis-fenomén“ tzn. prudké přechodné zvýšení koncentrace markeru v séru v důsledku úspěšné terapie. (Šimíčková, 2004)
12
Tab. 1 Nádorové markery vhodné pro monitorování průběhu choroby a účinnosti terapie (ČSKB, 2008)
Nádor - lokalizace Žaludek Jícen - horní třetina Jícen - dolní třetina Pankreas Játra Játra - cholangiocelulární Játra - metastázy Mléčná žláza Ovarium - nemucinózní Ovarium - mucinózní Ovarium - germinativní Cervix - epidermoidní Cervix - adenokarcinomy Corpus uteri Vulva Ledviny Močový měchýř Prostata Testes - seminomy Testes - neseminomy Karcinoid Štítná žláza - medulární Štítná žláza - anaplastické Melanom Plíce - SCLC Plíce - NSCLC Hlava, krk CNS - neuroblastomy CNS - gliomy CNS - astrocytomy Leukemie Lymfom - hodgkinký Lymfom - non-hodgkinký Mnohočetný myelom
Markery základní CA 72-4, CEA SCC CA 72-4, CEA CA 19-9, CEA CA 19-9, CEA CA 19-9 CEA CA 15-3, CEA CA 125 CA 19-9, CA 72-4 AFP, hCG SCC CEA CA 125 SCC TPA/TPS, CEA TPA/TPS PSA, fPSA hCG, AFP hCG, AFP 5-hydroxy,3-indolyoctová kys.,NSE kalcitonin, CEA TPA/TPS NSE, S100 beta CEA, NSE CYFRA 21-1, CEA SCC NSE CEA TK TK, FER, LD B2M, FER, LD TK, B2M, LD B2M, paraproteiny
13
Markery doplňkové CYFRA 21-1
TPA/TPS TPA/TPS CEA CYFRA 21-1, CEA CEA NSE CYFRA 21-1 Chromogranin A NSE
NSE TK TPA/TPS SCC CYFRA 21-1
Tab. 2 Biologický poločas nádorových markerů v séru (ČSKB, 2008)
Marker
Dny
AFP
5
Hodiny
B2M
0,7
BHCG
1
CA 125
4
CA 15-3
7
CA 19-9
5
CEA
14
CYFRA 21-1
3
FER
2
fPSA
7
hCG
1
NSE
1
PSA
2
SCC
0,3
TG
2,5
TK
2
TPA
7
1.2.4 Frekvence vyšetření nádorových markerů Pro frekvenci stanovení nádorových markerů platí kritéria doporučená WHO a podle zkušeností kliniků i statistiků, kteří hodnotí dynamiku změn nádorových markerů ve vztahu ke klinickému vývoji choroby je nutné dodržet doporučenou frekvenci vyšetření. Nejčastěji jsou navrhovány intervaly: 1 měsíc v prvním půl roce po primární terapii, 2 měsíce ve druhé polovině roku, v první polovině následujícího roku každé 3 měsíce, po roce a půl a v dalších letech 1x za 6 měsíců.
Koncentrace nádorového markeru má být dále vyšetřena před
nasazením léčby, po ukončení terapie obvykle 3.- 4. týden podle biologického poločasu rozpadu nádorového markeru, dále při změně léčby a při nejasném průběhu nemoci.(ČSKB, 2008)
14
1.2.5 Interpretace a zdroje interference vyšetření nádorových markerů Pro správnou interpretaci změn v hladinách nádorových markerů, zejména při dlouhodobém sledování nemocných s nádorovými chorobami, je třeba vyloučit všechny faktory, které by mohly stanovní ovlivnit již v preanalytické fázi. Některé vyšetřovací zásahy mohou ovlivnit hladiny nádorových markerů, příkladem může být rektální vyšetření prostaty. Kontaminace vzorku při odběru může též znehodnotit stanovení např.stanovení SCC je citlivé na kontaminaci slinami či NSE, kde vadí hemolýza, proto je třeba oddělit sérum od krevních elementů do jedné hodiny po odběru. Zvýšené hladiny nalézáme také u nemaligních onemocnění, nebo při poruchách jejich vylučování při zhoršené funkci ledvin a jater. (Šimíčková, 2001) Příklady analytických interferencí: •
zkřížená reaktivita strukturálně podobných molekul – jedná se o neoddělitelnou vlastnost imunologických metod, které nedocílí naprosté specifity protilátky vzhledem k zachycované molekule,
•
hook-efekt způsobený vysokou koncentrací markeru – jedná se o stav, kdy velmi vysoká koncentrace analytu překročí vazebnou schopnost pevné fáze,
•
přenos analyzovaného markeru mezi jednotlivými vzorky, tzv. carry-over – jde o jev daný nedokonalým očistěním pipetovacích systémů od stop předchozího vzorku o vysoké koncentraci,
•
interference heterofilních a lidských anti-myších protilátek (HAMA) – lidské heterofilní protilátky jsou endogenní imunoglobuliny, které reagují s myšími nebo králičími imunoglobuliny in vivo a také in vitro. Lidské anti-myší protilátky jsou imunoglobuliny,
jenž
specificky
reagují
s epitopy
myších
imunoglobulinů.
Mechanismus interference heterofilů nebo lidských anti-myších protilátek spočívá buď v přemostění vazebného místa pro ligand, kdy se protilátka chová jako pozitivní interferent, v blokaci primární či sekundární protilátky, nebo v přednostním vychytání antigenu před jeho vazbou na primární protilátku navázanou na pevnou fázi. Heterofilní myší protilátky se mohou objevit v tělních tekutinách jako důsledek reakce organismu na myší bílkoviny, podané za účelem diagnostiky a terapie. (ČSKB, 2008) Podle doporučení Working Group on Tumor Marker Criteria bývají jako signifikantní posuzovány tyto změny nádorových markerů: •
bez terapie (v klinické remisi) – výrazný nárůst koncentrace ve třech následujících odběrech i v hladinách v rozmezí cut-off značí recidivu nebo progresi onemocnění, 15
•
během terapie – vzestup hladin o více než 25% značí progresi onemocnění, pokles o více než 50% značí parciální remisi (kompletní remise nemůže být hodnocena jenom pomocí změn v hladinách nádorových markerů).
1.2.6
Nejčastěji používané nádorové markery
Karcinoembryonální antigen, CEA
CEA je onkofetální glykoprotein, který je za fyziologických podmínek produkován vyvíjejícím se embryem a v dospělosti je syntetizován epiteliálními buňkami střevní sliznice, žaludku a bronchů. Nachází se především ve tkáni karcinomů tlustého střeva, konečníku, plic, u medulárního thyroideálního karcinomu, mléčné žlázy, močového měchýře, ledvin, prostaty, testikulární teratomy, nádorů ženských pohlavních orgánů, endometriální nádory a nádory děložního těla. Zvýšené hladiny nacházíme u benigních onemocnění jako jsou cirhóza jater, Crohnova choroba, střevní polypy, onemocnění plic, ledvin, žlučníku, pankreatitida, benigní onemocnění prsu, dále u alkoholiků a kuřáků. Hodnota cut-off je kolem 5,0 µg/l. Pro screening i diagnostiku maligního onemocnění nelze CEA použít. Je vhodný pro potvrzení stádia choroby a rozhodnutí o průběhu terapie. K základním využití CEA patří monitorování průběhu onemocnění. Hodnoty vyšší než 10 µg/l znamenají obvykle progresi maligního procesu, hodnoty vyšší než 50 µg/l svědčí o jaterních nebo kostních matastázách. Senzitivita a specifita stanovení kolísá podle typu nádoru a stádia onemocnění. Pro nádory zažívacího traktu se senzitivita pohybuje při návratu onemocnění pro kolorektální karcinom kolem 60 %, pro nádory žaludku asi 50 %. Pokles hodnot CEA po chirurgickém zákroku může poskytnout údaj o úspěšnosti terapie.(ČSKB 2008, Šimíčková, 2004)
Alfa1 -fetoprotein, AFP Alfa1 – fetoprotein je glykoprotein velikosti albuminu, produkovaný buňkami žloutkového vaku (od 10. dne po oplodnění do 10. týdnu gravidity) a později fetálními játry plodu, s minimální koncentrací v krvi dospělých. AFP v séru matky, kam přechází přes placentu, je důležitým ukazatelem fyziologického průběhu těhotenství. Významná je jeho role trasportní (vazba steroidů, některých těžkých kovů, bilirubinu, mastných kyselin, antibiotik, drog apod.). Hodnota cut – off je 10 µg/l.
16
Zvýšené koncentrace AFP nacházíme u primárních maligních nádorů jater, u germinativních ovariálních a testikulárních nádorů. Zvýšené hladiny s nemaligními příčinami bývají akutní virová i chronická hepatitida, cirhóza jater, těhotenství. Použití pro klinické účely má screening maligního onemocnění pouze u symptomatických nemocných s jaterní cirhózou nebo u nemocných s podezřením na germinativní nádor varlat. K základním využitím AFP patří monitorování průběhu onemocnění. Pro hepatocelulární karcinom je AFP markerem první volby – senzitivita u neléčeného onemocnění je až 80 %. (ČSKB 2008, Šimíčková, 2004).
Antigen CA 15-3
CA 15-3 je glykoproteinový antigen polymorfního epiteliálního mucinu (PEM), nazývaný též MUC1. V dospělosti je syntetizován epiteliálních buňkách vývodů mléčné žlázy. Hodnota cut-off je 35 kU/l. Koncentrace CA 15-3 je výrazně zvýšena u maligního procesu v prsu. Dále je zvýšena u benigního onemocnění prsu, u poškození jater a ledvin, u zánětů plic, revmatického onemocnění a fyziologicky v těhotenství. Stanovení CA 15-3 se využívá především k posouzení úspěšnosti léčby a včasného záchytu recidivy karcinomu prsu (ČSKB 2008, Šimíčková, 2001)
Antigen CA 19-9
Antigen CA 19-9, nazývaný též GICA (gastrointestinal cancer antigen) se vyskytuje jako glykolipid ve tkáni nebo mucin v séru, obsahuje determinanty krevní skupiny Lewis 5 – 10% populace tento antigen netvoří. Hodnota cut-off je kolem 40 kU/l. Zvýšené koncentrace CA 19-9 se nacházejí u karcinomu pankreatu, jater a ovárií. Benigní a zánětlivá onemocnění žaludku, střeva, pankreatu a jater též zvyšují hladiny. Pro screening a stanovení diagnózy maligního onemocnění není vhodný i přes vysokou senzitivitu pro nádory pankreatu. Pro monitorování průběhu onemocnění je CA 19-9 markerem první volby pro karcinom pankreatu, kde se klinická specifita a senzitivita pohybují v rozmezí 70 – 90%. Vysokou senzitivitu dosahuje tento marker i podle závažnosti onemocnění u karcinomů kolorekta (18-58%), u cholangiocelulárních karcinomů, u nádorů
17
žlučových cest a žaludku. Koncentrace CA 19-9 dobře korelují s účinností terapie. (ČSKB 2008, Šimíčková, 2004)
Antigen CA 125
Antigen CA 125 je glykoprotein poprvé prokázaný na povrchu buněk ovariálního karcinomu. Fyziologicky se vyskytuje v epiteliální výstelce ženského genitálního traktu, v parietálních a mezoteliálních buňkách peritonea, pleury a perikardu. Hodnota cut-off je 35 kU/l. Zvýšené koncentrace CA 125 se nacházejí u karcinomů ovárií, dělohy, pankreatu, plic, mléčné žlázy a žlučových cest. Zvýšené hladiny způsobené nemaligním onemocněním zahrnují chronická onemocnění jater, peritonitidu, leiomyom, selhání ledvin, benigní onemocnění ovárií a endometria. Pro screening je CA 125 vhodný pouze u pacientek v případě rodinné predispozice ke karcinomu ovárií. Je vhodný pro potvrzení stadia choroba, nárust koncentrace může předcházet klinickou diagnózu o 1 – 8 měsíců. Pro monitorování průběhu onemocnění je CA 125 markerem první volby pro karcinom ovárií. Výhodou CA 125 je dobrá korelace s velikostí nádoru, zvláště v případě serózních nádorů. Klinická senzitivita je 81 – 98%. (ČSKB 2008, Šimíčková, 2004)
Antigen CA 72-4
CA 72-4 je antigen glykoproteinového typu. Za fyziologického stavu jej produkuje vyvíjející se plod epiteliálními buňkami žaludku, jícnu a pankreatu. Hodnota cut-off je 7,0 kU/l. Zvýšené koncentrace jsou typické pro karcinom žaludku, pankreatu, žlučových cest a tlustého střeva. Příčiny zvýšení u benigních chorob zahrnují jaterní cirhózu, akutní pankreatitidu, chronickou bronchitidu, vředovou chorobu žaludku a zánětlivá onemocnění GIT. Pro screening a stanovení diagnózy se CA 72-4 neužívá. Je vhodný pro monitorování maligních nádorů u karcinomu žaludku, dolní třetiny jícnu, tlustého střeva, pankreatu a mucinového typu ovariálního karcinomu. (ČSKB 2008, Šimíčková, 2004)
18
CYFRA 21-1
CYFRA 21-1 je rozpustný fragment cytokeratinu 19, bílkoviny nacházející se ve všech buňkách. Hodnota cut-off je kolem 3,3 µg/l. Zvýšené koncentrace jsou charakteristické pro nemocné s karcinomy plic, močového měchýře, děložního čípku, nádorů hlavy a krku. Z benigních onemocnění je nutné zvažovat falešně pozitivní hodnoty u pacientů s cirhózou jater, s chronickým selháním ledvin, astma a infekce respiračního traktu. Pro screening a stanovení diagnózy maligního procesu se CYFRA 21-1 nepoužívá. Hlavním využitím markeru je monitorování průběhu onemocnění a úspěšnosti terapie u epidermoidních karcinomů plic, význam má též sledování
nemocných s karcinomem
močového měchýře epidermoidních nádorů cervixu a nádorů oblasti hlavy a krku. (ČSKB 2008, Šimíčková, 2004)
Lidský choriový gonadotropin, hCG
hCG je glykoprotein hormonální povahy, vznikající v trofoblastických buňkách placenty, tvořený dvěma rozdílnými podjednotkami – α a β. Jeho funkcí je tlumit v průběhu těhotenství T lymfocyty a tím podporovat imunotoleranci matky vůči plodu. Podobnou funkci má i v nádorových buňkách – tlumí imunitní reakce organismu vůči nádorovým buňkám. Stanovení hCG, zvláště její podjednotky β (specifická pro molekulu hCG, α podjednotka hCG je společná pro všechny glandotropní hormony hypofýzy), má význam i diagnostický – vysoké hodnoty se nacházejí u mola hydatidosa a při jejím přechodu v choriokarcinom neustále stoupají, v tomto případě je senzitivita až 100 %. Vysoké koncentrace této podjednotky se nachází i u germinativních nádorů varlat a ovária. Hodnota cut-off je 5 kU/l. Zvýšené koncentrace hCG jsou nacházeny při fyziologickém i patologickém těhotenství, u žen s myomy a ovariálními cystami. Screening maligního procesu pomocí hCG v séru lze provádět u symptomatických osob to je u osob s podezřením na germinativní nádory varlat ( nesestouplé varle, nádor testes u sourozence). Koncentrace hCG má význam pro zhodnocení stadia onemocnění, pro potvrzení histologické charakterizace nádorů testes a choriokarcinomů a pro jejich monitorování. (ČSKB 2008, Šimíčková, 2004)
19
Tkáňový polypeptidový antigen, TPA, TPS
TPA - tkáňový polypeptidový antigen, TPS - tkáňový polypeptidový specifický antigen. TPA je polypeptid ze solubilních fragmentů cytokeratinů typu středních filament (cytokeratin 8, 18 a 19). TPS je antigen s velice podobnou charakteristikou definovaný na podkladě reaktivity s jinou monoklonální protilátkou (odpovídající cytokeratinu 18). Hodnota cut-off je kolem 140 U/l. Tyto antigeny jsou spíš ukazatelem buněčné proliferace než specifickým markerem určitého nádoru. Jeho zvýšení bylo pozorováno u řady rychle rostoucích zhoubných nádorů jako je karcinom prsu, bronchiálního, kolorektálního, močového měchýře, ovaria, děložního čípku. Není tedy příliš specifický, jeho předností je vyšší citlivost, kdy v případě účinné terapie jeho koncentrace v krvi rychle klesá. Jeho zvýšené hladiny byli prokázány také u nemaligních onemocnění jako jsou zánětlivá onemocnění plic, jater a urogenitálního ústrojí. Pro screening, stanovení diagnózy a odhadnutí závažnosti onemocnění se nepoužívají. Pro monitorování je sérový TPA/TPS marker vhodný pro dlouhodobé sledování nemocných s nádory plic, prsu, močového měchýře. (ČSKB 2008, Šimíčková, 2004)
Prostatický specifický antigen PSA, fPSA
PSA - prostatický specifický antigen, fPSA – volná frakce PSA. PSA je serinová proteáza produkovaná buňkami prostaty, umožňující zkapalnění seminální tekutiny, čímž usnadňuje pohyb spermiím. Jeho určité množství lze prokázat i v séru, z toho větší část je vázána na α2 makroglobulin a α1 - antichymotrypsin a malá část je ve volné formě. Hodnoty cut – off se mění v závislosti na věku: •
do 50 let = 2,5 µg/l,
•
do 60 let = 3,5 µg/l,
•
do 70 let = 6,5 µg/l.
Frakce fPSA/PSA bývá u maligních nádorů 0 – 15 %, hraniční hodnoty jsou 15 – 20 %, u benigního onemocnění nad 20 %. Zvýšení koncentrace se nachází u karcinomu prostaty, ale může být způsobeno i její hyperplazií benigního původu nebo při palpaci prostaty při vyšetření per rectum, katetrizaci močového měchýře či jiném mechanickém dráždění prostaty.
20
Význam screeningu karcinomu prostaty pomocí sérového PSA u asymptomatických mužů – jedenkrát ročně od 50 let – není zatím definitivně uzavřeno. Sreening je výhodné provádět u starších mužů se symptomy poruch močového traktu nebo u mužů s rodinnou zátěží. Pro stanovení diagnózy má význam stanovení poměru volného a vázaného PSA pro odlišení benigní hyperplasie prostaty od karcinomu. Koncentrace PSA nad 30 µg/l mohou ukazovat na vzdálenější metastázy. PSA se používá při monitorování pacientů v remisi, při léčbě radioterapií nebo hormonoterapií. (ČSKB 2008, Šimíčková, 2004)
Thymidinkináza, TK
Thymidinkináza adenosintrifosfátu
je
enzym
katalyzující
fosforylaci
thymidinu
v přítomnosti
na thymidinmonofosfát, jde o vedlejší cestu syntézy DNA, která
nevyžaduje vitamín B12. Aktivita tohoto enzymu odráží míru buněčné proliferace. Za fyziologických podmínek je syntetizována v játrech vyvíjejícího se plodu. Hodnota cut-off je 9 U/l. (ČSKB 2008, Šimíčková, 2004) Zvýšení hladin TK provází řadu zhoubných onemocnění – karcinom prsu, plic, kolorektální, lymfomy, leukémie, mnohočetný myelom, ale i některá virová onemocnění herpes viry, HIV, zánětlivá onemocnění plic a psoriázu. Normální cesta syntézy DNA bývá blokována cytostatiky, proto je nutné stanovit hladinu TK před zahájením léčby, aby výsledky nebyly falešně pozitivní po nastartování vedlejší cesty syntézy DNA. (Racek a kol., 1999) Pro screening a stanovení diagnózy se TK obvykle neužívá. Hlavní oblast využití markeru je pro monitorování průběhu onemocnění úspěšnosti terapie.
Neuron – specifická enoláza, NSE
Neuron-specifická enoláza je izoenzym specifický pro nervovou tkáň. Fyziologicky je NSE produkována v nervové i plicní tkáni plodu, v dospělosti je syntetizována ve tkáních neuroendokrinního původu. Hodnota cut-off je 15µg/l. Zvýšená aktivita NSE se nachází u mozkových tumorů a maligních nádorů neuroektodermálního
původu
jako
je
malobuněčný
karcinom
plic,
karcinoid,
feochromocytom. Může být pozorována též u nemaligních plicních a jaterních onemocnění. Vzhledem k obsahu NSE v erytrocytech a trombocytech je nutné provést separaci krevních elementů do jedné hodiny po odběru. Pro screening a stanovení diagnózy není NSE vhodná. Monitorování průběhu onemocnění má význam především pro pacienty s neuroblastomy, 21
malobuněčným karcinomem, meduloblastomem, retinoblastomem, s nádorem ledvin. (ČSKB 2008, Šimíčková, 2004)
Antigen skvamózních buněk, SCC
Antigen skvamózních buněk je glykoprotein, patřící mezi serin-proteinasové inhibitory. Je definován jako složka směsného antigenu TA-4, prokázaném v séru žen s karcinomem děložního čípku. Byly identifikovány dva homologní proteiny SCC1 a SCC2, které byly charakterizovány jako serin proteinázové inhibitory – serpiny. Marker je velmi citlivý na kontaminaci slinami nebo potem v preanalytické fázi. Hodnota cut-off je 1,5 µg/l. Zvýšené hladiny jsou u karcinomu děložního čípku, u dalších gynekologických nádorů, u epidermoidního karcinomu plic a nádorů hlavy a krku. Zvýšená exprese byla prokázána u benigních gynekologických, plicních a jaterních onemocnění. Pro screening a stanovení diagnózy se neužívá. Monitorování průběhu onemocnění se provádí u pacientů s nádory orofaciální oblasti, děložního čípku, těla dělohy, endometria, vulvy, vaginy a epidermoidních nádorů plic. (ČSKB 2008, Šimíčková, 2004)
ß2 – mikroglobulin, B2M B2M je glykoprotein s poměrně nízkou molekulovou hmotností a proto prochází glomerulárním filtrem. B2M tvoří lehký řetězec lidského leukocytárního antigenu HLA I.třídy a to extracelulární doménu. Je přítomen téměř ve všech buňkách kromě erytrocytů a trofoblastických buněk. Odbouráván a vylučován je převážně ledvinami. Hodnota cut-off je 2,4 mg/l. Jeho nejvyšší koncentrace se nachází u nádorů odvozených od lymfocytů a plazmocytů. Při stanovení vyšší hladiny tohoto mikroproteinu je ovšem nutné zvážit, zda pacient netrpí poruchou glomerulární filtrace, kdy nedochází k filtraci Β2M glomerulem do moči. Nespecifické zvýšení lze pozorovat u pacientů s chronickými zánětlivými a autoimunními onemocněními. Pro screening a diagnostiku maligního onemocnění nelze stanovení použít. Je velice vhodný při sledování účinku léčby a u mnohočetného myelomu má i význam prognostický, kdy pacienti se zvýšenou koncentrací tohoto markeru mají nekolikanásobně kratší dobu přežití než nemocní s normální hladinou této bílkoviny. (ČSKB 2008, Šimíčková, 2004)
22
Ferritin, FER
Ferritin je vysokomolekulární bílkovina fungující jako zásobárna železa v organismu. Za fyziologických podmínek je ferritin produkován retikuloendoteliálními buňkami sleziny, jater a kostní dřeně. Fyziologická hladina v séru je ovlivněna koncentrací železa v organismu. Hodnota cut-off pro premenopauzální ženy je 150 µg/l, pro muže a postmenopauzální ženy je hodnota 400 µg/l. Molekulu ferritinu s kyselejším charakterem produkují buňky některých nádorových onemocnění jako jsou akutní myeloblastické leukemie, Hodgkinův lymfogranulom a mnohočetný myelom. Zvýšení sérových hladin můžeme pozorovat u zánětlivých onemocnění, hematochromatóz, sideróz a po krevních transfuzích. Snížení hladiny může indikovat anémii z nedostatku železa. Pro screening a stanovení diagnózy se neužívá. U hematologických malignit koreluje se závažností onemocnění. Hlavní oblastí využití tohoto markeru je monitorování průběhu onemocnění a monitorování terapie. (ČSKB 2008, Šimíčková, 2004)
Laktátdehydrogenáza, LD
Laktátdehydrogenáza je enzym tvořený dvěma polypeptidovými řetězci, které formují 5 izoenzymů. Hodnota cut-off je horní mez referenčního intervalu laboratoře. Na zvýšení hladiny LD u maligních onemocnění se podílí zejména izoenzym LD-1 a LD2. LD-1 je často nalézána u testikulárních nádorů, u kterých představuje nezávislý prognostický faktor. U non-hodgkinského lymfomu je stanovení hladiny LD součástí mezinárodního prognostického indexu (IPI). LD je tedy vhodným doplňkovým markerem pro monitorování pacientů s diferencovanými lymfocytárními i histiocytárními typy non-hodgkinských lymfomů, leukémií a solidních nádorů. (ČSKB 2008)
23
Alkalická fosfatáza, ALP
Alkalická fosfatáza je enzym katalyzující hydrolýzu různých monoesterů kyseliny fosforečné v alkalickém prostředí. Rozlišují se tři izoenzymy – placentární, střevní
a
izoenzym obsažený v kostech, játrech a ledvinách. Hladina kostního izoenzymu je zvýšená u osteosarkomu a osteoplastických metastáz do kostí, jaterní izoenzym je zvýšen u metastatického postižení jater, ale také u nenádorových hepatopatií. (Racek, 1999)
Tyreoglobulin, TG
TG je glykoprotein obsahující jód a 10% sacharidů. Je tvořen dvěma identickými podjednotkami. Za účinku TSH je jodován do stupně trijódtyroninu (T3) a tyroxinu (T4). Hodnota cut-off je v závislosti na použité metodě kolem 33 µg/l. Zvýšené hladiny jsou u maligních onemocnění štítné žlázy, u Graves-Basedowovy choroby, eufunkční nodózní strumy a zánětů štítné žlázy. Pro screening a diagnostiku se vyšetření neužívá. Vhodný je pro monitorování pacientů s dobře diferencovaným karcinomem štítné žlázy po operaci a léčbě radioaktivním jodem. Při stanovení TG je důležité zjistit přítomnost autoprotilátek proti TG, které mohou způsobit falešně negativní výsledky. (ČSKB 2008, Šimíčková, 2004)
Kalcitonin
Kalcitonin
je
polypeptid,
za
normálních
okolností
je
kalcitonin
produkován
parafolikulárními buňkami (C–buňky) štítné žlázy. Stimulem pro sekreci je hyperkalcémie. Hodota cut-off je 19 ng/l. Zvýšené hladiny kalcitoninu se nacházejí u medulárních nádorů štítné žlázy. (ČSKB 2008, Šimíčková, 2004)
Monoklonální imunoglobuliny
Monoklonální
imunoglobuliny jsou
abnormální
imunoglobuliny
–
paraproteiny,
produkovány jedním klonem B-lymfocytů, resp. plazmocytů. Volné lehké řetězce přecházejí glomerulární filtrací do moče jako tzv. Bence – Jonesova bílkovina.
24
Screening a kvantifikace monoklonálních imunoglobulinů se provádí pomocí elektroforézy sérových bílkovin. Nově zachycený paraprotein se určuje pomocí imunofixace, kde se identifikuje těžký řetězec (IgG, IgA, IgM, případně IgD, IgE) a lehký řetězec (kappa nebo lamda). Kvantifikaci paraproteinu a jeho typ laboratoř poskytuje spolu se slovní interpretací nálezu. Za výrazné snížení nebo zvýšení hladiny monoklonálního proteinu se považuje změna o více než 10 g/l. Monoklonální imunoglobuliny v séru nebo v moči se vyskytují u mnohočetného myelomu, Waldensrtrömovy
makroglobulinémie,
lymfomů,
chronické
lymfocytární
leukémie,
amyloidózy, maligních tumorů, lymfotropní virózy a MGUS ( monoclonal gammapathy of undermined significance) zahrnující nejasný výskyt či preneoplastický výskyt paraproteinů. Stanovení monoklonálních imunoglobulinů v séru a moči je vhodné pro monitorování odpovědi na léčbu u myelomu nebo plazmocytomu. (ČSKB 2008)
Protein S-100b
Protein S-100b je kalcium, zinek a měď vázající protein cytosolu, který se vyskytuje ve formě homo- či heterodimeru z podjednotek α a β. Fyziologicky se nalézá v nervové tkáni. Hodnota cut-off je kolem 0,2 µg/l. Zvýšené hladiny nacházíme u maligního melanomu, u mozkového infarktu, úrazu, po srdeční
zástavě,
operaci,
mnohočetné
sklerózy,
Creutzfeld-Jacobs
choroby,
neurodegenerativních chorob a také u akutních psychotických stavů. Protein S-100b je vhodným parametrem při monitorování pacientů s maligním melanomem. (ČSKB 2008, Šimíčková, 2004)
Lidský epididymální protein 4, HE 4
HE4 patří do rodiny proteinů označovaných jako „whey acidic four-disulfide core (WFDC)“ s vlastnostmi podobnými inhibitoru trypsinu. Jeho fyziologické funkce nejsou zatím objasněné, má zřejmě antimikrobiální a protizánětlivé účinky. HE4 byl poprvé detekován v epitelu distálního nadvarlete. Vykazuje nízkou expresi respiračních a reprodukčních tkání, ale vykazuje vysokou expresi ve tkáni ovariálního nádoru. Vysoké hladiny HE4 se nacházejí u pacientek s karcinomem ovárií. Jako jediný nádorový marker má HE4 nejvyšší senzitivitu pro detekci epiteliálního karcinomu ovárií (EOC), zejména v 1.stádiu stádiu onemocnění, v raném nesymptomatickém stádiu. Stanovení hladiny 25
HE4 je významnou diagnostickou pomůckou i pro včasné odhalení opětovného výskytu ovariálního karcinomu u léčených pacientek. Kombinace stanovení HE4 a CA 125 může přispět ke zjištění, zda je nádor v malé pánvi benigní nebo maligní u žen před a po menopauze. (Bálková,2012)
1.2.7
Méně časté nádorové markery
Antigen CA 549
Antigen CA 549 je vysokomolekulární glykoprotein (mucin) obalující mléčné tukové partikule. Je prokazatelný na membránách epiteliálních buněk. Hodnota cut-off je 12 kU/l. Může být zvýšen u karcinomu mléčné žlázy, endometria, ovaria, plic a tlustého střeva. Antigen CA 549 není vhodný pro screening. Je užívaný při monitorování nemocných s nádorem prsu. Jeho hladina koreluje s hladinou CA 15-3.(Šimíčková, 2001)
Mucin-like cancer associated antigen, MCA
MCA je glykoprotin s vysokým obsahem kyseliny sialové. Fyziologicky je tvořen během těhotenství, u zdravých žen v epiteliálních buňkách mléčné žlázy a distálních tubulech ledvin. Hodnota cut-off je 15 kU/l. Zvýšené hladiny nacházíme u všech typů nádoru prsu, ovárií, enometria, kolorekta, pankreatu, prostaty, ledvin, plic a urologických nádorů. MCA je vhodný k monitorování léčby karcinomu prsu. (Šimíčková, 2001)
Antigen CA 50
CA 50 je sialinizovaný laktotetraosaceramidový antigen, který je tvořený i u osob Lewis negativních. Hodnota cut-off je 25 kU/l. Jeho vyšetření má význam pro nemocné s nádorem pankreatu, dalších nádorů GIT, nádorů těla a hrdla děložního. (Šimíčková, 2001)
26
Antigen CA 195
CA 195 je hetrogenní glykoprotein. Hodnota cut-off je 10 kU/l. Ve zvýšených koncentrací je prokazatelný u nádorů GIT. Je vhodný pro monitorování nemocných s nádory kolorekta, pankreatu a jater. (Šimíčková, 2001)
Antigen CA 242
CA 242 je nádorový marker se specifitou pro GIT. Hodnota cut-off je kolem 20 kU/l. Jeho využití je při monitorování léčby zvláště karcinomu pankreatu a kolorektálního.(Kopáč, 2004)
Chromogranin A, CgA
Chromogranin A je ve vodě rozpustný kyselý glykoprotein. Je obsažen v sekrečních granulích endokrinních a neuroendokrinních buněk. Hodnota cut-off je 18 U/l. Jeho hladina odráží masu nádoru i jeho biologickou aktivitu. Má význam při sledování nemocných s neuroendokrinními nádory. (Šimíčková, 2001)
Prostatický specifický antigen izoformy, [-2]proPSA
Sérový prostatický specifický antigen – PSA existuje buď ve volné formě fPSA nebo v komplexní formě cPSA. Bylo zjištěno, že %fPSA (poměr fPSA/PSA) v séru zlepšuje rozlišení karcinomu prostaty od benigní hyperplazie prostaty. Vyšší %fPSA v séru koreluje s nižším rizikem karcinomu prostaty, hodnoty fPSA pod 10% s vyšším rizikem karcinomu. ProPSA a BPSA jsou rozdílné formy fPSA prokazující lepší korelaci s onemocněním než PSA a fPSA. Zkrácené formy proPSA jsou zvýšené v periferní zóně tkáně karcinomu v porovnání s tkáněmi benigní hyperplasie prostaty. ProPSA v nativní formě obsahuje 7 aminokyselin pro vedoucí peptid ([-7proPSA]) společně se zkrácenými formami, které obsahují menší počet aminokyselin ([-5,-4,-2]pro PSA). V extraktech z tumorů byla nalezena primární forma [-2]proPSA, ze zjištěných forem proPSA je nejstabilnější. Při studiích bylo prokázáno, že [-2]proPSA zlepšovalo specifitu detekce karcinomu vůči %fPSA. 27
Prekurzorní formy PSA nastupují jako důležité diagnostické sérové markery pro rozšíření a zlepšení detekce karcinomu prostaty.(Lapišová, 2010)
1.2.8
Potenciální nové nádorové markery
V budoucnu by se novými nádorovými markery mohly stát látky, které mají význam v dějích důležitých pro přežití buněk, jejich dělení, diferenciaci a metastázování – regulace buněčného cyklu, apoptóza, signální trasdukce, adheze a angiogeneze. Řadu markerů lze detekovat v cirkulaci a jejich měření by mohlo umožnit efektivní léčbu.
Markery spojené se signální transdukcí •
c-erb B-2 (HER-2/neu) – protoonkogen na chromosomu 17, zvýšené hladiny jsou u karcinomu prsu,
•
C-myc onkoproteiny,
•
EGF – epidermální růstový faktor, zvýšená exprese je typická pro řadu malignit,
•
IGF-1, IFG-IR, interleukiny, Ras protein, TGF-β, TNF – α.
Markery spojené s regulací buněčného cyklu •
cykliny,
•
inhibitory cyklin-dependentních kináz.
Markery spojené s apoptózou •
Bcl-2 protein,
•
sFas, sFasL,
•
protein – produkt mutovaného genu p53 a protilátky proti proteinu p53.
Markery spojené s angiogenezí
Angiogeneze – novotvorba cév, je předpokladem pro růst nádoru a jeho metastázování. Některé faktory působí stimulačně a jiné inhibičně: 28
•
angiostatin, angiogenin,
•
bFGF, CD 105, endostatin, trombospodin, VEGF – vaskulární endoteliální růstový faktor.
Markery spojené a adhezí
Buněčné adhezní molekuly jsou potřebné pro progresi nádoru a metastazování. •
E-cadherin, CD44, E-selektin,
•
ICAM -1 - intercelulární adhezní molekula,
•
VCAM -1 – vaskulární buněčná adhezní molekuly.
Markery spojené se specifickými vlastnostmi nádorových buněk •
vztah k zánětu – CRP,
•
souvislost s nekrózou nádorových buněk,
•
matrixové metalloprotinázy,
•
cyklooxygenáza 2.
Výše uvedené nové markery by mohly mít v budoucnu význam pro cílenou terapii, včasnou detekci a monitorování léčby. (Zima, 2007)
29
2 Speciální část 2.1 Cíl práce Cílem této práce je: 1) popsat používané markery na OKB Nemocnice Znojmo, metody jejich stanovení včetně analytických parametrů, preanalytické požadavky a ekonomické náklady 2) ukázat na základě několika kazuistik význam a použití nádorových markerů při léčbě pacientů s nádorovým onemocněním
30
2.2 Metodika a přístrojové vybavení OKB Nádorové markery by se měly stanovovat v akreditovaných laboratořích splňující podmínky interní a externí kontroly kvality. OKB splnilo podmínky získání Auditu I i II NASKL a celá Nemocnice Znojmo je držitelem certifikátu ISO 9001:2000. Preanalytické a analytické podmínky stanovení nádorových markerů jsou v rutinní praxi velmi důležité. Nádorové markery by měly být stanovovány jednou metodikou a v jedné laboratoři
za standardních podmínek. Diagnostické kity od různých výrobců mohou
vykazovat rozdílné hodnoty hladin nádorových markerů u jednoho vzorku. Oddělení klinické biochemie disponuje třemi analyzátory na vyšetření hladin nádorových markerů – UniCel DxI 800, Cobas e 411 a Immulite 1000.
2.2.1 Analyzátor Beckman Coulter UniCel DxI 800
Obr. 2 Analyzátor UniCel DxI
Analyzátor Beckman Coulter UniCel DxI 800 (obr.2) je kompaktní plně automatický uzavřený systém, který umožňuje provádění imunochemických stanovení metodou chemiluminiscence. Systém je založen na použití alkalické fosfatázy jako markeru, paramagnetických mikročástic jako nosiče protilátek resp. antigenů a luminiscenční detekci využívající přeměny dioxetanfosfátu na dioxetan. Analyzátor má vysokou detekční citlivost při širokém koncentračním rozmezí, velmi dobrou přesnost a reprodukovatelnost výsledků.
31
Na začátku analýzy je ze vzorku vytvořen alikvot, z kterého je část odipetována do reakční kyvety. Pomocí reagenčního pipetoru je ke vzorku přidána reagencie a proběhne inkubace. Během inkubační doby se analyt naváže na paramagnetické částice z činidla. Po ukončení inkubace je kyveta přesunuta do promývacího karuselu. V další fázi jsou paramagnetické částice pomocí magnetu přitaženy ke stěnám reakční kyvety a odstraněn promývací
roztok
s nenavázaným
analytem.
Po
tomto
kroku
je
napipetován
chemiluminiscenční substrát, který reaguje s analytem, na nějž je navázán enzym, při této reakci dochází k emisi fotonů, která je měřena luminometrem. Výstup z luminometru je vyjadřován v relativních světelných jednotkách (RLU), které se používají spolu s kalibračními daty k výpočtu výsledku. Analyzátor využívá kompetitivní nebo nekompetitivní enzymoimunoanalýzu. Příkladem kompetitivní (soutěživého) principu je stanovení FT3 (volného trijódtyroninu): •
volný T3 je kompetitivní vazebné enzymoimunoanalytické stanovení. Vzorek je přidán do reakční kyvety spolu s monoklonální protilátkou proti T3, konjugovanou s ALP. Během inkubace volný T3 ve vzorku reaguje s protilátkou pro T3. Do směsi jsou potom přidány částice potažené streptavidinem a biotynylovaným analogem T3. Neobsazená vazebná místa na protilátce proti T3 jsou navázána na částici prostřednictvím analogu T3. Po inkubaci v reakční kyvetě jsou látky navázáné na pevnou fázi zadrženy pomocí magnetického pole, nenavázané látky jsou odstraněny promytím. Do kyvety je následně přidán chemiluminiscenční substrát Lumi-Phos*530 a světlo vytvořené při reakci se měří luminometrem. Produkce světla je nepřímo úměrná koncentraci volného T3 ve vzorku. Množství analytu přítomného ve vzorku se stanoví z vícebodové kalibrační křivky. (orig.návod FT3,2005)
32
Obr. 3
Obecné schéma kompetitivní enzymoimunoanalýzy
Příkladem nekompetitivního (sendvičového) principu je stanovení CEA: •
CEA je sendvičové imunoenzymatické stanovení využívající dvě myší monoklonální protilátky proti CEA, které reagují s různými epitopy CEA. Vzorek se přidá do reakční kyvety spolu s konjugátem první myší monoklonální protilátky proti CEA s ALP a s druhou myší monoklonální protilátkou proti CEA navázanou na paramagnetické částice. Po inkubaci následuje magnetická separace a promytí. Do reakční kyvety se pak přidá chemiluminiscenční substrát Lumi-Phos*530 a světlo vytvořené při reakci se měří luminometrem. Produkce světla je přímo úměrná koncentraci CEA ve vzorku. Koncentrace analytu ve vzorku se stanoví podle vícebodové kalibrační křivky. (orig.návod CEA, 2008)
Na sendvičovém principu je založeno i stanovení ostatních nádorových markerů analyzátoru UniCel DxI. 33
Obr .4
Obecné schéma nekompetitivní enzymoimunoanalýzy
34
2.2.2 Analyzátor Roche Cobas e 411
Obr. 5 Analyzátor Cobas e 411
Analyzátor Cobas e 411 (obr.5) je plně automatický stolní analyzátor. Je určen pro in vitro kvantitativní a kvalitativní stanovení pomocí elektrochemiluminiscenční technologie – ECLIA. (uživatelská příručka,2006). Vzorek a reagencie jsou napipetovány do reakční kyvety v pipetovací stanici, která je přesunuta do inkubátoru, kde je ponechána až 9 minut a jsou přidávána další činidla nebo mikročástice v závislosti na metodě. V další fázi je kyveta přesunuta do aspirační stanice, kde jehla nasaje k přípravě měřící komůrky roztok Pro Cell a potom komůrku naplní reakční směsí. Paramagnetické mikročástice s navázanými imunokomplexy jsou přichyceny ke stěnám komůrky a nezreagované složky vymyty roztokem ProCell. Za světelnou emisi je zodpovědný
rutheniový
chelát,
kterým
je
označena
protilátka.
Iniciátorem
elektrochemiluminiscence je tripropylamin (TPA), jehož funkcí je přenos elektronu na rutheniový chelát. Přenos se uskutečňuje po vložení napětí na elektrodu a oxidaci TPA a rutheniového chelátu. Tím dochází k redukci rutheniového chelátu na nestabilní excitovanou formu a při návratu do stabilního stavu dochází k vyzáření fotonu. K měření se používá fotonásobič. Pomocí analog-digitálního konvektoru dojde ke kvantifikaci vyzářených fotonů. Jejich množství je přímo úměrná koncentraci analytu ve vzorku. (referenční příručka,2010) Jako příklad lze uvést stanovení antigenu CA 72-4 : •
CA 72-4 je nekompetitivní (sedvičová) imunoanalýza. Ke vzorku se přidá biotinylovaná monoklonální protilátka proti CA 72-4 (CC49) a monoklonální specifická protilátka proti CA 72-4 (B72.3), značená rutheniovým komplexem, probíhá první inkubace za tvorby sendvičového komplexu. Poté následuje druhá inkubace - po přidání mikročástic, potažených streptavidinem se komplex váže na pevnou fázi prostřednictvím interakce mezi biotinem a streptavidinem. Dále je reakční směs nasáta do měřící cely, kde jsou mikročástice zychyceny magnetickým polem na 35
povrchu elektrody. Nenavázané složky jsou odstraněby roztokem ProCell. Přivedené napětí na elektrodě vyvolá chemiluminiscenční emisi fotonů, která je změřena fotonásobičem. Výsledky jsou hodnoceny z kalibrační křivky, která je specificky vytvořena pro analyzátor 2-bodovou kalibrací a master křivky, dodané v čárovém kódu činidla (orig.návod CA72-4,2010) Na sendvičovém principu probíhá měření i ostatních nádorových markerů na analyzátoru Cobas e 411.
2.2.3
Analyzátor Siemens IMMULITE 1000
Obr. 6 Analyzátor IMMULITE 1000
Analyzátor IMMULITE 1000 (obr.6) provádí automatizovaná chemiluminiscenční stanovení. Systém využívá plastové kuličky potažené protilátkou nebo antigenem specifickým pro daný test jako pevnou fázi, činidlo značené ALP a chemiluminiscenční substrát. Potažená kulička je uložena v patentovaném plastovém pouzdře, které se nazývá testovací jednotka. Testovací jednotka slouží jako reakční nádobka pro imunitní reakci, proces inkubace, promývání a vývoj signálu. Postup stanovení (obr.7) – vzorky a testovací jednotky se vloží do podavače, po spuštění analyzátoru se do testovací jednotky automaticky napipetuje činidlo, jednotka je pak inkubována při 37 °C a promíchávána (obr.a). Po inkubaci se reakční směs oddělí vertikálním odstředěním při vysokých otáčkách podél svislé osy (obr.b). Celý kapalný obsah se zachytí do 36
koaxiální odpadní komory v testovací jednotce (obr.c). Kulička zůstane bez zbytkového nenavázaného
značení.
Potom
se
stanoví
množství
navázaného
značení
pomocí
dioxetanového substrátu, který produkuje světlo (obr.d). Emitované světlo se změří fotonásobičem a vypočítá se výsledek každého vzorku (IM 1000 návod k obsluze, 2010)
Obr.7
Postup stanovení
a)
b)
c)
d)
Nevýhodou tohoto principu je poměrně dlouhá doba analýzy – 45 minut, resp. 75 minut u dvoukrokových stanovení. Ta je způsobena malým reakčním povrchem jedné velké kuličky potažené protilátkou. Konstrukce Immulitu 1000 navíc neumožňuje pozitivní identifikaci vzorku čárovým kódem.
2.3 Informace o nádorových markerech
2.3.1 Preanalytické požadavky Po doručení biologického materiálu kontroluje pracovník na příjmu dodržení preanalytických požadavků, zejména typ odběrové zkumavky a čas odběru. Informace o odběrech pro všechna oddělení nemocnice jsou uvedeny v laboratorní příručce. Typ 37
odběrových nádobek je mimo jiné uveden na žádance, kde jsou rovněž označeny nestabilní analyty hvězdičkou (obr. 8).
Obr .8 Žádanka na biochemické vyšetření
Vzorky krve pro stanovení hladin nádorových markerů se centrifugují při 2000 x g po dobu deseti minut. Pokud se analyt nestanoví ihned, vytvoří se alikvoty, které se namrazí (tab.3)
38
Tab. 3
Marker AFP
Materiál
hCG β celk.
sérum sérum, plazma sérum, plazma sérum, plazma sérum, plazma sérum, plazma sérum, plazma
PSA
sérum
Free PSA
sérum sérum, plazma sérum, plazma
CEA CA 15-3 CA 19-9 CA 125 CA 72-4
FERITIN CYFRA 21-1 NSE
sérum sérum, THYEROGLOBULIN plazma
β2Μ TPS
sérum, moč sérum, plazma
Stabilita 25oC 8 hod.
8oC 48 hod.
8 hod. 14 dní 48 8 hod. hod. 48 8 hod. hod. 48 8 hod. hod. 1 8 hod. měsíc 48 8 hod. hod. 24 3 hod. hod. 24 6 hod. hod. 48 8 hod. hod. 8 hod. 28 dní 24 6 hod. hod. 24 hod. 3 dny 8 hod.
7 dní
4 hod.
2 dny
Analyzátor
Frekvence
UniCel DxI
denně
UniCel DxI
denně
UniCel DxI
denně
UniCel DxI
denně
UniCel DxI
denně
Cobas e 411
2x týdně
UniCel DxI
denně
UniCel DxI
denně
UniCel DxI
denně
UniCel DxI
denně
Cobas e 411
2x týdně
Cobas e 411
2x týdně
Cobas e 411
1x týdně
IMMULITE 1000 IMMULITE 1000
1x týdně 1x týdně
2.3.2 Analytické parametry metod Používaný kontrolní materiál: •
Biorad Lyphocheck TM Control u metod – CA 15-3, CA 19-9, CA 125, CA 72-4, CYFRA 21-1, NSE, Thyreoglobulin,
•
Biorad Liquichek Immunoassay Plus u metod – AFP, CEA, hCG β celk., PSA, free PSA, Ferritin,
•
u metod β2M a TPS je kontrola součástí diagnostické soupravy 39
Tab. 4 Parametry nádorových markerů
Marker AFP CEA CA 15-3 CA 19-9 CA 125 CA 72-4 hCG β celk. PSA Free PSA FERITIN CYFRA 21-1 NSE
Rozsah měření
Interference
< 9,0 µg/l < 3,0 µg/l < 31,3 kU/l < 35 kU/l < 35 kU/l < 6,9 kU/l < 2,7 IU/l < 4,0 µg/l
0,5 - 3000 ug/l 0,1 - 1000 ug/l 0,5 - 1000 kU/l 0,8 - 2000 kU/l 0,5 - 500 kU/l 0,2 - 300 kU/l 0,5 - 1000 IU/l 0,01 -150 µg/l 0,01 - 20 µg/l 0,2 - 1500 µg/l 0,1 - 500 µg/l 0,05 - 370 µg/l 0,1 - 1000 µg/l 4 - 500 µg/l 0 - 2400 U/l
-
hodnota pro výpočet indexu
THYEROGLOBULIN
β2Μ TPS
Referenční meze
24 - 340 µg/l < 3,3 µg/l < 16,3 µg/l 1,4 - 78 µg/l 670 - 2140 µg/l < 83 U/l
hemolýza hemolýza,lipemie hemolýza hemolýza hemolýza hemolýza hemolýza hemolýza hemolýza
Tab.5 Analytické parametry metod získané při verifikaci
CV% opakovatelnost
Bias (%)
CV% mezilehlá preciznost
AFP
3,73
2,46
5,49
CEA
2,99
4,21
6,74
CA 15-3
7,03
-2,40
6,98
CA 19-9
4,20
-0,74
6,50
CA 125
3,75
-4,05
4,44
CA 72-4
0,78
0,74
8,90
hCG β celk.
5,21
-0,41
6,56
PSA
1,63
6,58
5,39
Free PSA
3,19
-1,00
4,93
FERITIN
3,68
-1,71
7,05
CYFRA 21-1
1,09
7,17
4,50
NSE
0,90
5,35
3,57
TPS
2,39
8,48
7,81
Marker
40
•
bias ( vychýlení) - systematická chyba měření, je to rozdíl mezi naměřenou a očekávanou hodnotou,
•
opakovatelnost měření – preciznost měření za podmínek opakovatelnosti,
•
mezilehlá preciznost měření – preciznost měření za podmínek mezilehlé preciznosti měření.(Milde,2009)
2.3.3
Ekonomika stanovení nádorových markerů
V tab. 6 jsou uvedeny počty vyšetření nádorových markerů za rok 2011, bodové hodnocení pojišťovny i její úhrady v Kč a hrubé náklady OKB z ceny 1 soupravy. V nákladech na 1 vyšetření není zahrnuta cena kontrol a kalibrátorů.
Tab.6
Marker
Počet vyšetření
Úhrada za 1 vyšetření
Náklady na 1 vyšetření
za rok 2011
body
Kč cca
Kč cca
AFP
1 775
182
157
103
CEA
4 190
330
284
101
CA 15-3
1 908
494
425
92
CA 19-9
2 326
494
425
92
CA 125
1 430
494
425
92
CA 72-4
499
494
425
172
hCG β celk.
236
189
163
67
PSA
3 692
252
217
120
Free PSA
1 015
393
338
116
FERITIN
3 581
226
194
51
CYFRA 21-1
350
650
559
143
NSE
395
459
395
163
THYEROGLOBULIN
625
262
225
68
β2M
575
266
229
127
TPS
456
525
452
246
41
2.4 Programy CRACTES a BIANTA
Program CRACTES (Cancer Recurrence, Analysis, Correlation, Testing and Statistics) je software určený pro sekundární nádorovou diagnostiku v rámci dispenzární péče o pacienty a při podezření na výskyt metastáz. Hlavním úkolem, který program pomáhá řešit, je včasná diagnostika návratu nádorového onemocnění a určení nejpravděpodobnějších lokací metastáz, je-li riziko recidivy vysoké. Po dosažení klinického stavu úplné remise bývá pacient zván ke kontrole v doporučených intervalech (ne delších než 3 měsíce), dle doby jež uplynula od léčby primárního nádoru. Je důležité odhalit metastatický proces dřív, než se projeví klinicky. Riziko vzniku vzdálených metastáz je modelováno metodami statistické analýzy přežití. Program vyhodnocuje následující parametry: AFP, B2M, CA 15-3,CA 19-9, CA 125, CA 724, CA 50, CEA, ferritin, CYFRA 21-1, kalcitonin, SCC, beta a total hCG, NSE, PSA, fPSA, TK, TPS, TG,tT4,tT3 a další. Program pracuje se skupinami diagnóz, u kterých byla provedena specifická analýza. Riziko vzniku metastáz bylo určeno jako funkce všech předchozích měření nádorových markerů specifických pro danou diagnózu, věku a pohlaví pacienta. Určení rizika probíhá ve dvou krocích: •
matematický model chování markerů během remise a před klinickou manifestací metastáz poskytne několik údajů, které popisují individuální hladinu pacienta v remisi nebo okamžik kdy marker začal růst
•
model analýzy přežití pak z těchto údajů určí hodnotu, která reprezentuje příspěvek naměřených hodnot markerů k riziku vzniku metastáz
Do programu je zahrnut výběr markerů, jejich kombinace a doporučené frekvence odběrů mezi měřeními v závislosti na typu onemocnění. (Pecen,1998)
Nemá-li pacient „C“ diagnózu, je k vyhodnocení automaticky použit program BIANTA (Bayesien Inteligent Associative Network for Tumor Analysis).Tento software pomáhá lokalizovat primární nádor při průkazu mnohočetných metastáz neznámého původu. Takové případy tvoří přibližně dle světových statistik 3 – 5 % z celkového počtu primárních nádorových onemocnění. Program lze použít i při podezření na nádorové onemocnění a pro primární nádorovou diagnostiku k vyloučení možné záměny metastáz za primární nádor. Systém vychází z teorie Bayesovských sítí. Na základě vyšetření nádorových markerů, věku, pohlaví pacienta a epidemiologických onkologických údajů poskytne pravděpodobnosti
42
jednotlivých nádorových diagnóz a doporučení, které markery se u těchto diagnóz mají stanovit. Program vyhodnocuje stejné nádorové markery jako program CRACTES. Interpretace vyšetření nádorových markerů pomocí matematicko statistických metod umožňuje lépe využít informace obsažené v těchto vyšetření. Stanovení nádorových markerů je pouze jedním z diagnostických prostředků u nádorových onemocnění. Při vyhodnocování předpokládá úzkou spolupráci laboratorních pracovníků s klinickými lékaři.(Pecen,1995)
Příklad hodnocení programu CRACTES:
pacient:
C61 ORKO - ambulance 1
pohlavi = muz vek = 66 Posledni vysledky z: 24.11.2011 : sPSA : sCEA :
0.13 2.10
ug/l ug/l
normalni koncentrace normalni koncentrace
--------------------- Hodnoceni programem CRACTES ----------------------Dynamika zmen nadorovych markeru datum: 8. 9.2009 7. 1.2010 5. 5.2010 24. 6.2010 16. 9.2010 16.12.2010 10. 3.2011 2. 6.2011 25. 8.2011 24.11.2011
sPSA
sCEA
46.27 39.79 3.38 1.89 0.99 0.63 0.32 0.21 0.15 0.13
2.20 2.10 2.30 2.40 1.80 2.40 2.50 2.10
sFPSAsFPSA/sPSAsFPSA/sPSA
0.21
6.21
6.21
Predpokladane hodnoty nadorovych markeru za 3.0 mesice sPSA : 0.11 ug/l normalni koncetrace sCEA : 2.01 ug/l normalni koncetrace sFPSA/sPSA : 2.0 % sFPSA/sPSA : 2.0 % Riziko progrese vyplyvajici z chovani nadorovych markeru : Progrese onemocneni do 3.0 mesicu predikovana s pravdepodobnosti : 3 % Doporuceny interval do dalsi kontroly : 3 mesice. C61 (185) ca prostatae, nadory prostaty Doporucene nadorove markery pro sledovani u teto diagnozy : PSA, fPSA, (CEA,TPA,TPS,PAP,LDH,LASA,TK,NSE) Pravdepodobnost 5-leteho preziti u teto diag. ( epidemiologicky udaj, nikoliv pro zvoleneho pacienta !!! ): 45 %
43
2.5 Experimentální část
Pacient č. 1
Rok narození 1954, diagnóza N40 – Zbytnění prostaty – hyperplasia prostatae •
nádorový marker PSA je markerem první volby pro karcinom prostaty,
•
od roku 2008 sledována hladina PSA a free PSA, index fPSA/PSA (tab. 7),
•
v červnu 2008 vzhledem k věku pacienta, vyšší hladině PSA a hraničnímu indexu fPSA/PSA byla u pacienta provedena biopsie prostaty – negativní výsledek (podle informace ošetřujícího lékaře je pravděpodobnost záchytu karcinomu při první biopsii prostaty 25 – 35%),
•
v prosinci 2008 hladina PSA vysoká – zánět prostaty,
•
v červenci 2010 kvůli vzrůstající tendenci hladiny PSA opět provedena biopsie prostaty – výsledek negativní, pacient průběžně monitorován ,
•
říjen 2011 – hladina PSA a fPSA velmi zvýšena – třetí biopsie prostaty – výsledek pozitivní, u pacienta provedena prostatektomie,
•
leden 2012 – hladina PSA v normě.
Tab. 7
Rok
Měsíc
PSA free PSA µg/l µg/l
2008
květen
4,59
1,00
0,22
4,91 7,88 5,71 5,82 5,52 5,26
1,01 1,26 1,23 1,21 1,25 1,21
0,21 0,16 0,22 0,21 0,23 0,23
červen prosinec 2009 leden duben červenec 2010 leden červenec srpen listopad 2011 květen červenec
2012
říjen říjen leden
7,00 6,91 7,84 7,41 6,60 9,71 0,04
1,16 1,12 1,49 1,41 1,30 1,72 -
index fPSA/PSA
0,17 0,16 0,19 0,19 0,20 0,18 44
Zákrok-léčba biopsie prostatynegativní léčba antibiotiky
biopsie prostatynegativní léčba antibiotiky
biopsie prostatypozitivní PROSTATEKTOMIE
Obr. 9 Grafické znázornění sledování hladiny PSA v séru u pacienta č.1 12
hladina PSA (ug/l)
10
8
6
4
cut-off 2
1/ 12
10 /1 1
7/ 11
5/ 11
11 /1 0
8/ 10
7/ 10
1/ 10
7/ 09
4/ 09
1/ 09
12 /0 8
6/ 08
5/ 08
0
měsíc/rok
Obr. 10 Grafické znázornění sledování indexu fPSA/PSA (u maligních nádorů je index 0 – 0,15) 0,25
0,2
index fPSA/PSA
šedá zóna 0,15
0,1
0,05
0 5/08
6/08 12/08 1/09
4/09
7/09
1/10
7/10
měsíc/rok
45
8/10 11/10 5/11
7/11 10/11
Pacient č. 2
Rok narození 1945, diagnóza C56 – zhoubný novotvar vaječníku •
hladiny nádorových markerů sledovány od roku 2008, jsou uvedeny v tab. 8
•
leden 2008 u pacientky provedeno chirurgické odstranění karcinomu, následuje chemoterapie, remise,
•
leden 2010 recidiva, chemoterapie,
•
prosinec 2010 progrese, chemoterapie,
•
obr.11 znázorňuje hladinu antigenu CA 125, typického markeru vyskytujícího se u nádoru vaječníku,
•
zajímavé jsou hodnoty CA 15-3 (viz. obr. 11), tento nepatří mezi doplňkové markery karcinomu ovaria,
•
CEA nepatří mezi doplňkové markery karcinomu ovaria, čemuž odpovídají hodnoty v normě,
•
v raném stádiu tohoto onemocnění by se jistě uplatnil marker HE 4.
Tab.8
Rok
Měsíc
CEA µg/l
CA 15-3 kU/l
CA 19-9 kU/l
CA 125 kU/l
TPS U/l
Zákrokléčba
2008
leden březen duben květen červen červen červenec srpen srpen září říjen listopad listopad leden leden duben červenec říjen leden březen duben květen květen červen
1,1 0,8 0,9 1,1 1,1 1,3 1,3 1,2 1,6 1,6 1,7 1,6 1,2 0,9 1,0 1,0 1,3 1,2 1,3
33,3 42,4 47,4 43,2 35,6 32,2 29,5 29,1 31,3 31,2 34,9 28,6 38,2 60,8 64,7 62,4 -
27,4 24,0 25,2 25,4 26,5 22,4 28,6
145,3 70,5 49,1 21,3 12,0 8,5 7,4 7,2 6,7 5,7 5,1 5,3 5,2 6,0 5,6 7,6 11,0 24,7 80,0 91,0 47,1 29,3 18,1 15,3
100 71,8 65,6 63,5 38,5 29,2 27,7 32,9 34,4 34,2 <15 <15 148 159 122 -
operace
2009
2010
46
chemoterapie
remise
recidiva chemoterapie
Tab. 8 – pokračování
Rok
Měsíc
CEA µg/l
2010
červenec srpen srpen září říjen listopad listopad prosinec leden únor březen březen březen březen duben květen červen červen červenec srpen září září říjen říjen prosinec leden duben
1,3 1,6 1,5 1,5 1,6 1,2 1,3 1,4 1,4 1,3 1,1 1,1 0,9 1,0 1,1 1,2 1,1 1,1 1,0 0,9 0,9 0,9 1,2 1,2 1,0 1,0 -
2011
2012
CA 15-3 CA 19-9 kU/l kU/l 46,9 41,2 37,1 44,2 47,0 42,6 51,0 43,1 39,5 42,9 42,3 39,1 39,1 42,7 39,8 41,1 35,7 39,4 34,4 44,5 48,3 45,2 -
27,1 31,9 27,2 26,6 29,6 56,3 23,7 27,9 29,1 22,4 20,5 23,7 24,4 25,1 23,4 33,5 21,0 20,4 18,6 18,3 19,9 20,3 18,8 21,1 21,9 22,5 -
47
CA 125 kU/l
TPS U/l
11,9 8,9 14,6 15,7 15,9 18,4 20,9 27,6 35,7 59,5 44,5 44,7 39,4 41,1 39,0 43,3 44,0 56,3 68,5 77,9 88,6 140,0 123,7 141,3 134,9 136,1 134,2
92,8 -
Zákrokléčba
progrese chemoterapie
chemoterapie
pokračuje chemoterapie
Obr. 11 Grafické znázornění sledování hladiny CA 125 a CA 15-3 v séru pacienta č. 2 160 140
CA 125, CA 15-3 kU/l
120 100
CA 125
80 60
CA 15-3
40
cut-off
20
01 /0 8 4/ 08 6/ 08 08 /0 8 10 /0 8 01 /0 9 07 /0 9 01 /1 0 04 /1 0 06 /1 0 08 /1 0 10 /1 0 12 /1 0 02 /1 1 04 /1 1 06 /1 1 08 /1 1 10 /1 1 01 /1 2
0
chemoterapie
měsíc/rok
Hladiny markeru CA 125 v druhé polovině roku 2011 a v roce 2012 vypovídají o neúčinnosti léčby pacienta.
48
Hodnocení pacienta č. 2 programem CRACTES: pacient: č.2
C56 ORKO - ambulance 1
pohlavi = zena vek = 67 Posledni vysledky z: 18.4.2012 : sCA125 :
134.20
kU/l
extremne patologicka koncentrace
--------------------- Hodnoceni programem CRACTES ----------------------Dynamika zmen nadorovych markeru datum:
sCA125
sCA153
sCA199
sCEA
3. 1.2011 2. 2.2011 2. 3.2011 9. 3.2011 16. 3.2011 30. 3.2011 26. 4.2011 25. 5.2011 1. 6.2011 21. 6.2011 28. 7.2011 18. 8.2011 8. 9.2011 29. 9.2011 6.10.2011 12.10.2011 21.12.2011 7. 1.2012 18. 4.2012
35.70 59.50 44.50 44.70 39.40 41.10 39.00 43.30 44.00 56.30 68.50 77.90 88.60 140.00 123.70 141.30 134.90 136.10 134.20
47.00 42.60 51.00 43.10 39.50 42.90 42.30 39.10 39.10 42.70 39.80 41.10 35.70 39.40 34.40 44.50 48.30 45.20
29.10 22.40 20.50 23.70 24.40 25.10 23.40 33.50 21.00 20.90 18.60 18.30 19.90 20.30 18.80 21.10 21.90 22.50
1.40 1.30 1.10 1.10 0.90 1.00 1.10 1.20 1.10 1.10 1.00 0.90 0.90 0.90 1.20 1.20 1.00 1.00
sFrt
sTPS
548.00
92.80
Predpokladane hodnoty nadorovych markeru za 3.0 mesice sCA125 : 132.30 kU/l extremne patologicka koncetrace sCA153 : 42.10 kU/l patologicka koncetrace sCA199 : 23.10 kU/l normalni koncetrace sCEA : 1.00 ug/l normalni koncetrace Riziko progrese vyplyvajici z chovani nadorovych markeru : Progrese onemocneni do 3.0 mesicu predikovana s pravdepodobnosti : 80 % Nutna kontrola za : 2 tydny. Mozne lokace metastaz : plice, jatra, pleura C56 (183) ca ovarii, nadory vajecniku Doporucene nadorove markery pro sledovani u teto diagnozy : CA125 - serozni ; CA72-4, CA19-9, CEA, TPA, TPS, TK - mucinozni; AFP, HCG, b-HCG, TK, NSE - germinativni Pravdepodobnost 5-leteho preziti u teto diag. ( epidemiologicky udaj, nikoliv pro zvoleneho pacienta !!! ): 37 %
49
Pacient č. 3
Rok narození 1951, diagnóza C50.4 – ZN prsu - horní zevní kvadrant •
hladiny nádorových markerů sledovány od roku 2007 (tab. 9),
•
v květnu pacientka podstoupila chirurgické odstranění karcinomu, po kterém následovala chemoterapie, remise
•
prosinec 2010 – recidiva, následuje chemoterapie,
•
obr. 11 znázorňuje hladiny CEA a CA 15-3, které jsou markery volby u nádoru prsu,
•
s hodnotou CA 15-3 dobře korelují hodnoty CEA.
Tab. 9
Rok
Měsíc
CEA ug/l
CA 15-3 kU/l
CA 125 kU/l
TPS U/l
Zákrokléčba
2007
květen červen srpen srpen září říjen listopad leden leden únor duben květen srpen listopad únor květen prosinec březen listopad leden leden únor duben květen květen červen červenec srpen září duben
5,2 1,3 1,2 1,1 1,0 1,1 1,2 1,2 1,3 1,1 1,1 1,1 1,0 1,2 1,1 1,1 0,9 1,1 2,0 11,0 12,5 27,8 105,2 25,5 7,9 4,2 2,8 3,0 2,4 1,7
1,2 5,5 5,6 6,0 7,0 6,1 7,1 7,0 7,5 6,6 7,8 7,5 6,1 6,2 6,3 6,8 6,0 6,0 12,7 37,9 40,8 82,2 263,2 101,3 55,6 31,3 15,4 10,3 9,4 6,6
6,2 5,8 6,3 32,0 16,8 12,4 11,5 10,5 10,8 11,4 9,5
93,1 106 48,1 -
operace chemoterapie
2008
2009
2010 2011
2012
50
remise
recidiva chemoterapie
Obr. 12 Grafické znázornění sledování hladiny CEA a CA 15-3 v séru u pacienta č.3
300,0
200,0
150,0
100,0
50,0
0,0 06 /0 7 09 /0 7 11 /0 7 02 /0 8 05 /0 8 11 /0 8 05 /0 9 03 /1 0 01 /1 1 02 /1 1 05 /1 1 06 /1 1 08 /1 1 04 /1 2
hladina CEA ug/l, CA15-3 kU/ll
250,0
cut-off CEA: 3,0 ug/l cut-off CA15-3: 31kU/l
měsíc/rok CEA CA 15-3
chemoterapie
51
Pacient č .4
Rok narození 1959, diagnóza C18.7 – ZN – esovitý tračník – colon sigmoideum •
hladiny nádorových markerů sledovány od roku 2010 (tab. 10),
•
v září 2010 u pacienta provedeno chirurgické odstranění karcinomu, následovala chemoterapie,
•
říjen 2011 recidiva, pacient podstoupil chemoterapii, která byla v březnu 2012 přerušena,
•
březen 2012 hodnoty biochemických parametrů - odrážejí odezvu na chemoterapii: AST = 1,34 µkat/l, ALT = 2,97 µkat/l, Bilirubin = 67,7 µmol/l, ALP = 1,14 µkat/l, GMT =0,8 µkat/l, LD =8.48 µkat/l,
•
obr. 13 znázorňuje hladiny antigenu CA 19-9, který je vhodným markerem k monitorování pacientů s karcinomem tlustého střeva,
•
z hlediska výpovědních hodnot by bylo zřejmě užitečnější nahradit markery CEA popřípadě i CA 125 markerem CA 72-4.
Tab.10
Rok
Měsíc
CEA ug/l
CA 19-9 kU/l
CA 125 kU/l
Zákrokléčba
2010
září říjen prosinec březen březen květen květen srpen říjen listopad únor únor
4,0 4,2 3,7 2,3 2,5 2,3 2,1 1,7 2,1 2,1 2,2 2,1
97,5 114,5 28,4 14,0 16,8 16,4 12,1 15,2 32,3 36,1 101,5 128,2
55,5 10,4 6,1 10,8 10,2 7,2 7,2
operace chemoterapie
březen březen
2,5 2,7
148,5 154,1
12,7 10,7
2011
2012
recidiva chemoterapie progrese přerušení chemoterapie
52
Obr. 13 Grafické znázornění sledování hladiny CA 19-9 v séru u pacienta č. 4 180,0 160,0
hladina CA 19-9 kU/l
140,0 120,0 100,0 80,0 60,0 40,0 cut-off 20,0 0,0 09/10 10/10 12/10 03/11 03/11 05/11 05/11 08/11 10/11 11/11 02/12 02/12 03/12 03/12 chemoterapie
měsíc/rok
53
chemoterapie
Hodnocení pacienta č. 4 programem CRACTES: pacient: č.4
C188 ORKO - stacionář
pohlavi = muz vek = 53 Posledni vysledky z: 14.3.2012 : sCEA : sCA199 : sCA125 :
2.70 154.10 10.70
ug/l kU/l kU/l
hranicni koncentrace extremne patologicka koncentrace normalni koncentrace
--------------------- Hodnoceni programem CRACTES ----------------------Dynamika zmen nadorovych markeru datum:
sAFP
sCEA
sTPS
21. 9.2010 23. 9.2010 12.10.2010 17.12.2010 11. 3.2011 25. 3.2011 2. 5.2011 23. 5.2011 23. 8.2011 11.10.2011 1.11.2011 15. 2.2012 22. 2.2012 7. 3.2012 14. 3.2012
1.80
4.00
63.50
sCA199
97.50 114.50 28.40 14.00 16.80 16.40 12.10 15.20 32.30 36.10 101.50 128.20 148.50 154.10
4.20 3.70 2.30 2.50 2.30 2.10 1.70 2.10 2.10 2.20 2.10 2.50 2.70
sCA125
55.50 10.40
6.10 10.80 10.20 7.20 7.20 12.70 10.70
Predpokladane hodnoty nadorovych markeru za 3.0 mesice sCEA : 2.90 ug/l hranicni koncetrace sCA199 : 159.70 kU/l extremne patologicka koncetrace sCA125 : 8.70 kU/l normalni koncetrace Riziko progrese vyplyvajici z chovani nadorovych markeru : Progrese onemocneni do 3.0 mesicu predikovana s pravdepodobnosti : 80 % Nutna kontrola za : 2 tydny. Mozne lokace metastaz : jatra,plice(vice u rec.),omentum,peritoneum,kosti(pater,panev) C17-C21 (152-154) ca colon and colorecti, nadory strev Doporucene nadorove markery pro sledovani u teto diagnozy : CEA, CA19-9, CA125,TPA,TPS,CA72-4,(NSE,AFP,TK,CA50,B2M,SCCA) Pravdepodobnost 5-leteho preziti u teto diag. ( epidemiologicky udaj, nikoliv pro zvoleneho pacienta !!! ): 31 %
54
Pacient č. 5
Rok narození 1949, diagnóza C38.3 – ZN – mediastinum část NS •
hladiny nádorových markerů sledovány od roku 2011 (tab. 11),
•
srpen 2011 pacient podstoupil chemoterapii, radioterapii,
•
březen 2012 recidiva – chemoterapie,
•
NSE a CYFRA jsou nádorové markery vhodné k monitorování pacientů s epidermoidním karcinomem plic či malobuněčným karcinomem plic (obr. 14).
Tab.11
Rok
Měsíc
CYFRA ug/l
NSE ug/l
2011
leden srpen říjen březen duben
3,9 7,3 1,5 5,0 4,7
20,2 27,2 7,2 26,4 13,6
2012
Zákrok - léčba
chemoterapie chemoterapie
Obr. 14 Grafické znázornění sledování hladin CYFRA a NSE 30,0
CYFRA, NSE ug/l
25,0
20,0 cut-off NSE 15,0
NSE
10,0
CYFRA
5,0
cut-off CYFRA
0,0 01/11
08/11
10/11 měsíc/rok
chemoterapie
55
03/12
04/12
Závěr Uvedené kazuistiky dokazují užitečnost nádorových markerů při léčbě pacientů s nádorovým onemocněním. Hladiny správně zvolených nádorových markerů rychle odrážejí úspěšnost terapie nádoru, popřípadě včas upozorňují na recidivu či progresi onemocnění. Výběr nádorových markerů by měl být podle potřeby upraven tak, aby nedocházelo ke zbytečnému plýtvání finančními prostředky (viz. komentář u kazuistik pacienta č. 2 a č. 4).
56
Seznam literatury a použitých zdrojů AFP – originální návod diagnostické soupravy pro UniCel DxI 800, Beckman Coulter, 2006,str. 1-13 Β2M - originální návod diagnostické soupravy pro IMMULITE, Siemens, 2006, str. 1-7 Bálková O.,Labor Aktuell 01/12, HE4-nový nádorový marker proovariální karcinom,str.3537, časopis firmy ROCHE s.r.o., 2012, ISSN 1214-7672 CA 15-3 - BR Monitor originální návod diagnostické soupravy pro UniCel DxI 800, Beckman Coulter, 2006, str. 1-14 CA 19-9 – GI Monitor originální návod diagnostické soupravy pro UniCel DxI 800, Beckman Coulter, 2006, str. 1-14 CA 125 – OV Monitor originální návod diagnostické soupravy pro UniCel DxI 800, Beckman Coulter, 2006, str. 1-13 CA 72-4 - originální návod diagnostické soupravy pro Cobas e 411 , Roche, 2010, str. 1-4 CEA - originální návod diagnostické soupravy pro UniCel DxI 800, Beckman Coulter, 2006, str. 1-14 Cobas e 411 analyzátor, uživatelská příručka, verze softwaru 01-01, str.7, Roche Diagnostics, 2006 CYFRA 21-1 - originální návod diagnostické soupravy pro Cobas e 411,Roche, 2010, str. 1-3 Česká společnost klinické biochemie (ČSKB), Česká onkologická společnost, Česká společnosnost nukleární medicíny – sekce imunoanalytických metod – Doporučení k využití nádorových markerů v klinické praxi,autorský kolektiv: Valík D.,Nekulová M., Dubská L., Zima T., Springer D., Malhoban I., Topolčan O.,2008, zdroj: http://www.cskb.cz/cskb.php?pg=doporuceni--tumorove-markery Elecsys 2010, Referenční příručka, Roche Diagnostics Elecsys 2010 Immunoassay Ferritin - originální návod diagnostické soupravy pro UniCel DxI 800, Beckman Coulter, 2006, str. 1-10 Free T3 - originální návod diagnostické soupravy pro UniCel DxI 800, Beckman Coulter, 2006,str. 1-9 HE4 - originální návod diagnostické soupravy pro Cobas e 411 , Roche, 2011, str. 1-5 Hybritech free PSA - originální návod diagnostické soupravy pro UniCel DxI 800, Beckman Coulter, 2006,str. 1-15 Hybritech PSA - originální návod diagnostické soupravy pro UniCel DxI 800, Beckman Coulter, 2006,str. 1-15 57
Immulite 1000, Návod k obsluze, dokument č.600884-0002, Siemens Healthcare Diagnostics, 2009, kapitola 1 str. 2-3
Králíková M., Nádorové markery, Biochemický ústav LF MU Brno 2003,zdroj: http://med.muni.cz/mkralik/klinicka%biochemie Kopáč J., Lékařská laboratorní diagnostika, str.100-102, Lékařská laboratoř Turnov, Polygraf, 2004 Kopecká M., Nádorová transformace buněk ,Biologický ústav LF MU Brno,2006,zdroj: http://is.muni.cz/do/1499/el/estud/lf/js06/bltm0111p/p21_gk8_NADOROVA_TRANSFORM ACE.pdf Lapišová K., Mičíková I., In vitro diagnostika, PSA izoformy,[-2]proPSA a Index zdravé prostaty (phi),str.7, informační magazín 15-2010, časopis firmy Beckman Coulter Praha Mačák J.,Mačáková J., Patologie, Nádory, str 123-128, Grada, 2004, ISBN 80-247-0785-3 Milde D., Základní terminologické pojmy, 2009, zdroj: http://ach.upol.cz/user-files/intranet/02a-terminologievim3-1287047120.pdf Nečas O., Obecná biologie, Nádorová transformace buňky, str.290, H&H, 2000, ISBN 8086022-46-3 NSE - originální návod diagnostické soupravy pro Cobas e 411,Roche, 2010, str. 1-3 Pecen L.,Horad D.,Uživatelská příručka, Bianta,1995 Pecen L., Imunoanalytické metody v diagnostice, program CRACTES,1998,zdroj: http://oldweb.lfp.cuni.cz/journals/imj/1998/4/c1.html Racek J. a kol., Klinická biochemie, Speciální klinická enymologie, str. 79 -82, Galén, 1999, ISBN 80-7262-023-1 Racek J. a kol., Klinická biochemie, Laboratorní známky zhoubného novotvaru,str. 231 -241, Galén, 1999, ISBN 80-7262-023-1 Schneiderka P. a kolektiv, Kapitoly z klinické biochemie, Nádorové markery, str.194 -211, Karolinum, 2000, ISBN 80-246-0140-0 Šimíčková M.,Nekulová M., Černoch M., Valík D., Jednotlivé nádorové markery, Nádorové markery 2001, firma Roche Diagnostics , 2001 Šimíčková M.,Nekulová M., Nádorové markery, Obecná charakteristika nádorových markerů, str.2-4, firma Roche diagnostic, MedProGo 2004 Topolčan O., Onkogenní markery- indukace a interpretace, In vitro diagnostika, informační magazín 10-2008, časopis firmy Beckman Coulter Praha
58
Total βhCG - originální návod diagnostické soupravy pro UniCel DxI 800, Beckman Coulter, 2006,str. 1-11 TPS - originální návod diagnostické soupravy pro IMMULITE, Siemens, 2006, str. 1-7 Zima T., Laboratorní diagnostika, Nádorové markery, str.379-390, Galén, 2007, ISBN 807262-372-3
Použité obrázky – zdroj: Obrázek č.1 - Šimíčková M.,Nekulová M., Nádorové markery, Obecná charakteristika nádorových markerů, str.2-4, firma Roche diagnostic, MedProGo 2004 Obrázek č.2 - http://www.immunotech.cz/products_imch_dxi800.htm Obrázek č.3,4 - Dastych M., Breinek P., Klinická biochemie, Imunoanalytické metody,str.4142, Masarykova univerzita, 2011, ISBN 978-80-87192-18-4 Obrázek č.5 - http://www.roche-diagnostics.cz/produkty/klinickelaboratore/cobase411.aspx Obrázek č.6 - http://www.biotest.suceava.ro/dotari.html Obrázek č.7 - Immulite 1000, Návod k obsluze, dokument č.600884-0002, Siemens Healthcare Diagnostics, 2009, kapitola 1, str.3
59
