MASARYKOVA UNIVERZITA LÉKAŘSKÁ FAKULTA

MASARYKOVA UNIVERZITA

LÉKAŘSKÁ FAKULTA Klinika dětské onkologie LF MU a FN Brno

Detekce vybraných genových a chromozomových změn u meduloblastomu a jejich prognostický význam

Disertační práce

MUDr. Karel Zitterbart

Studijní program D-ON4 Onkologie 5103V041 Školitel: Prof. MUDr. Jaroslav Štěrba, Ph.D.

Brno 2010

Bibliografická identifikace

Jméno a příjmení autora:

Karel Zitterbart

Název disertační práce:

Detekce vybraných genových a chromozomových změn u meduloblastomu a jejich prognostický význam

Název disertační práce anglicky:

Detection of selected gene and chromosomal changes in medulloblastoma and their prognostic significance

Studijní obor:

D-ON4 Onkologie 5103V041

Školitel:

prof. MUDr. Jaroslav Štěrba, Ph.D.

Rok obhajoby:

2010

Klíčová slova:

nádory dětí, meduloblastom, p73, MYCN, MYCC, prognóza, imunodetekce, fluorescenční hybridizace in situ

Klíčová slova anglicky:

childhood cancer, medulloblastoma, p73, MYCN, MYCC, prognosis, immunodetection, fluorescence hybridization in situ

Dříve publikované články jsou použity se souhlasem nakladatelů. Vznik práce byl podpořen granty FRVŠ 1303/2005, IGA MZ 9125-4 a IGA MZ 10218-3. © Karel Zitterbart, Masarykova univerzita, 2010. 2

Poděkování Na tomto místě bych rád poděkoval svému školiteli prof. MUDr. Jaroslavu Štěrbovi, Ph.D., za odborné vedení, cenné rady a trpělivost, a to nejen při zpracování předkládané práce. Celému kolektivu Kliniky dětské onkologie LF MU a FN Brno děkuji za tvůrčí a podnětnou pracovní atmosféru. Dále děkuji pracovníkům Oddělení lékařské genetiky Fakultní nemocnice Brno pod vedením prim. MUDr. Renaty Gaillyové, Ph.D., jmenovitě doc. RNDr. Petru Kuglíkovi, CSc., Mgr. Haně Filkové a dalším z Integrované laboratoře molekulární cytogenetiky OLG, kteří prováděli diagnostická vyšetření FISH. RNDr. Jitce Kadlecové, Ph.D., a Bc. Renatě Spěšné z Laboratoře molekulární diagnostiky OLG děkuji za významný podíl na zavedení metody a vyšetřování transkriptů izoforem TP73. Za klíčovou spolupráci při imunohistochemické detekci proteinu p73 děkuji MUDr. Ivě Zambo (Zavřelové) a laborantkám z Ústavu patologie LF MU a FN Brno. Doc. RNDr. Renatě Veselské, Ph.D., M.Sc., děkuji za to, že stála u mých prvních vědeckých krůčků a dnes je důležitým spolupracovníkem. Svému středoškolskému profesorovi chemie a biologie Lubomíru Radovi a ve vzpomínkách i prof. MUDr. Oldřichu Nečasovi, DrSc., děkuji za prvotní a stále nemizící inspiraci.

Svým nejbližším za lásku a krásu. 3

Obsah  Seznam prací  

6 

Cíle práce 

7 

1. Úvod 

8 

1.1. Nádorová onemocnění u dětí 

8 

1.2. Nádory centrálního nervového systému u dětí 

8 

1.3. Molekulární diagnostika v dětské onkologii 

9 

1.3. Detekce prognosticky významných biologických markerů u meduloblastomu  2. Exprese proteinu p73 u meduloblastomu (Práce III a IV) 

10  11 

2.1. Struktura a funkce proteinu p73 

11 

2.2. Exprese proteinu p73 u nádorů 

12 

2.3. Výsledky – detekce transkriptů TAp73 a ΔNp73 a imunohistochemické značení                      p73 a ΔNp73 u meduloblastomu (Práce III) 

13 

2.4. Výsledky – detekce N‐terminálních isoforem proteinu p73 u buněk nádorových linií  derivovaných z meduloblastomu (Práce IV)  3. Početní změny protoonkogenů MYCC a MYCN u meduloblastomu (Práce V) 

17  18 

3.1. Molekulární subklasifikace u meduloblastomu 

18 

3.2. Výzkum protoonkogenů MYC u meduloblastomu 

19 

3.3. Výsledky ‐ limitované zvýšení počtu kopií genů MYCC a MYCN u meduloblastomu             (Práce V) 

21 

3.4. Další perspektivy a vývoj klinických studií u meduloblastomu 

22 

Souhrn 

23 

Literatura 

25 

   

4

Přílohy  Práce I) 

34  34 

Zitterbart K, Pavelka Z, Štěrba J (2010) Nádory centrálního nervového systému. In Adam Z, Krejčí  M, Vorlíček J (Eds.) Speciální onkologie ‐ Příznaky, diagnostika a léčba maligních chorob.             

 

1. vydání. Praha: Galén. pp. 355‐360  Práce II) 

41 

Zitterbart K, Pavelka Z, Zitterbartová J (2010) Meduloblastom: nejčastější zhoubný nádor mozku 

 

u dětí. Onkologie 4:256‐259  Práce III) 

45 

Zitterbart K, Zavrelova I, Kadlecova J, Spesna R, Kratochvilova A, Pavelka Z, Sterba J (2007) p73  expression in medulloblastoma: TAp73/∆Np73 transcript detection and possible association of 

 

p73α/∆Np73 immunoreactivity with survival. Acta Neuropathologica 114:641‐650  Práce IV)  #

58 

Nekulova M, #Zitterbart K, Sterba J, Veselska R (2010) Analysis of the intracellular localization of 

p73 N‐terminal protein isoforms TAp73 and ∆Np73 in medulloblastoma cell lines. Journal of  Molecular Histology 41:267‐275 (#contributed equally)   Práce V) 

68 

Zitterbart K, Filkova H, Tomasikova L, Necesalova E, Zambo I, Kantorova D, Slamova I, Vranova  V, Zezulkova D, Pesakova M, Pavelka Z, Veselska R, Kuglik P, Sterba J (2010) Low‐level copy  number changes of MYC genes have a prognostic impact in medulloblastoma. Journal of Neuro‐ Oncology 2010 Jul 8. [Epub ahead of print]  

5

Tato disertační práce využívá možnosti, která byla dána oborovou radou doktorského studijního programu Onkologie Lékařské fakulty Masarykovy univerzity v Brně, a je předkládána jako soubor přehledných a originálních prací opatřených komentářem. V textu disertace je na jednotlivé práce odkazováno římskými číslicemi. Jejich kopie jsou uvedeny v příloze, použity jsou se souhlasem nakladatelů.

SEZNAM PRACÍ 

I)

Zitterbart K, Pavelka Z, Štěrba J (2010) Nádory centrálního nervového systému. In Adam Z, Krejčí M, Vorlíček J (Eds.) Speciální onkologie - Příznaky, diagnostika a léčba maligních chorob. 1. vydání. Praha: Galén. pp. 355-360

II)

Zitterbart K, Pavelka Z, Zitterbartová J (2010) Meduloblastom: nejčastější zhoubný nádor mozku u dětí. Onkologie 4:256-259

III)

Zitterbart K, Zavrelova I, Kadlecova J, Spesna R, Kratochvilova A, Pavelka Z, Sterba J (2007) p73 expression in medulloblastoma: TAp73/∆Np73 transcript detection and possible association of p73α/∆Np73 immunoreactivity with survival. Acta Neuropathologica 114:641-650. IF 2007 = 3,179

IV)

#

V)

Zitterbart K, Filkova H, Tomasikova L, Necesalova E, Zambo I, Kantorova D, Slamova I, Vranova V, Zezulkova D, Pesakova M, Pavelka Z, Veselska R, Kuglik P, Sterba J (2010) Low-level copy number changes of MYC genes have a prognostic impact in medulloblastoma. Journal of Neuro-Oncology 2010 Jul 8. [Epub ahead of print] IF 2009 = 2,752

Nekulova M, #Zitterbart K, Sterba J, Veselska R (2010) Analysis of the intracellular localization of p73 N-terminal protein isoforms TAp73 and ∆Np73 in medulloblastoma cell lines. Journal of Molecular Histology 41:267-275 (#contributed equally). IF 2009 = 1,752

6

CÍLE PRÁCE  Práce se zabývá studiem vybraných molekulárních faktorů a nenáhodných chromosomových změn u meduloblastomu, nejčastějšího zhoubného nádoru mozku u dětí. Úvod do problematiky dětské neuroonkologie přinášejí dvě práce: kapitola z učebnice speciální onkologie podává základní přehled o nádorech centrální nervové soustavy u dětí (Práce I), druhá publikace shrnuje klinické aspekty diagnostiky a léčby meduloblastomu (Práce II). Dílčí cíle, vedoucí k originálním zjištěním, byly definovány takto:

ƒ

Studovat expresi proteinu p73, který je členem rodiny nádorového supresoru p53, a zhodnotit prognostický význam této exprese (Práce III). Vzhledem k získaným výsledkům byl tento cíl následně rozšířen o detailní morfologickou studii exprese N-terminálních isoforem proteinu p73 u buněk nádorových linií derivovaných z meduloblastomu (Práce IV).

ƒ

Zhodnotit, zda má limitované zvýšení počtu kopií (tzv. gain) protoonkogenů MYCN a MYCC vztah ke klinickému průběhu onemocnění (Práce V). Za prognostický znak je u meduloblastomu považována amplifikace těchto genů.

7

1. ÚVOD  1.1. Nádorová onemocnění u dětí  V České republice onemocní ročně zhoubným nádorem přibližně 300 až 350 dětí a adolescentů. Více než polovinu případů tvoří leukémie, lymfomy a nádory embryonální histologie. Proliferační index většiny dětských malignit je vysoký, což podmiňuje jejich rychlý lokální růst a časné metastazování, avšak povětšinou také dobrou chemosenzitivitu a radiosenzitivitu, a to mnohdy i v případě pokročilých onemocnění. Proto ve srovnání s výsledky léčby u dospělých dosahuje dětská onkologie výrazně vyššího podílu úspěšně vyléčených pacientů: dlouhodobých remisí je dosahováno v 75–80 % případů. V pediatrické onkologii je standardem léčba v rámci klinických studií fáze III, jejichž výsledky léčebné postupy optimalizují. Přesto přibližně jednu pětinu dětí s maligními nádory není možno současnými postupy vyléčit a nádory zůstávají ve vyspělých zemích včetně České republiky hlavní příčinou úmrtí mezi nemocemi (Pizzo and Poplack 2002, Štěrba 2009). Příkladem nemocných s velmi špatnou prognózou jsou adolescenti s rabdomyosarkomem diseminovaným do kostí a kostní dřeně nebo pacienti s osteosarkomem metastazujícím mimo plíce. Téměř beznadějná zůstává prognóza dětí s inoperabilními, difuzními nádory mozkového kmene. Neexistuje-li v případě progrese či relapsu onemocnění adekvátní záchranná léčba či postup vyšší priority, mohou být pacienti účastni klinických studií fáze I a II. Naděje jsou vkládány především do inhibitorů signálních drah, protinádorové imunoterapie a metronomické léčby (Mahalingam et al. 2009, Herrington et al. 2009, Ardon et al. 2010, Pasquier et al. 2010). Trvalou výzvu pro dětské onkology představuje snaha minimalizovat riziko pozdních následků léčby a vzniku sekundárních malignit (Oeffinger et al 2010). Typickým příkladem je historický vývoj protokolů pro léčbu Hodgkinova lymfomu, ve kterých dochází ke snižování intenzity terapie u onemocnění nízkého a středního rizika (Keller et al. 2009). Lze tedy shrnout, že na základě nejnovějších trendů v dětské onkologii směřuje výzkum k individualizaci léčby a hledání nových léčebných postupů (Štěrba 2009).

1.2. Nádory centrálního nervového systému u dětí  Nádory centrálního nervového systému (CNS) představují nejčastější skupinu solidních nádorů u dětí a po leukémiích a lymfomech jsou druhým nejčastějším onkologickým onemocněním dětského věku. Nádory CNS tvoří přibližně 20–22 % pediatrických nádorů s incidencí 3,5 nových případů na 100 000 dětí mladších patnácti let. Vzestupný trend ve výskytu nádorů mozku a míchy pozorovaný v minulých dvou dekádách je však pravděpodobně dán spíše zlepšením jejich záchytu pomocí moderních

8

diagnostických metod, než skutečným zvýšením incidence těchto onemocnění (Pizzo and Poplack 2002, Gupta et al. 2010). Nádory CNS dětí jsou velmi heterogenní skupinou onemocnění - liší se svým biologickým chováním, histogenetickým původem, typickým věkem výskytu i způsobem klinické manifestace. Přes pokroky v diagnostice, moderních operačních a radioterapeutických technikách i užití nových chemoterapeutik vykazuje přežití pacientů ve srovnání s jinými oblastmi dětské onkologie jen mírné zlepšení (Pizzo and Poplack 2002). Meduloblastom, embryonální neuroektodermální nádor mozečku, je nejčastějším zhoubným nádorem CNS dětského věku. Ročně onemocní meduloblastomem v České republice přibližně 10 až 12 dětí. Terapeutický postup se v současnosti odvíjí od stáří dítěte, rozsahu chirurgické resekce a přítomnosti metastáz. Historický vývoj léčebných protokolů podávají v recentní přehledné práci Packer a Vezina (Packer and Vezina 2008). I přes intenzivní multimodální léčbu není současnými postupy možno vyléčit 20–30 % pacientů standardního rizika a 40–60 % pacientů vysokého rizika. Meduloblastom tak zodpovídá za téměř 10 % nádorem podmíněných úmrtí u dětí (Gustafsson et al. 2007). Pozdní následky léčby u mnoha přeživších navíc ztěžují jejich návrat k běžnému způsobu života (Boman et al. 2009). Onemocnění meduloblastomem u dítěte tak představuje velmi závažný medicínský i společenský problém.

1.3. Molekulární diagnostika v dětské onkologii   Ve světových databázích se denně objevují nové informace, které rozšiřují poznání o molekulární podstatě nádorového bujení, a u řady diagnóz došlo k rychlému transferu poznatků ze základního výzkumu do klinické praxe. Detekce nenáhodných chromosomových změn, resp. molekulárních faktorů majících význam v patogenezi onemocnění má dnes v diagnostice a léčbě řady nádorů jasně definovanou úlohu. Konkrétním příkladem je diagnostika sarkomů (Jain et al. 2010). Rutinně jsou dnes, a to i v České republice, vyšetřovány specifické fúzní transkripty přítomné v nádorových buňkách u většiny případů Ewingova sarkomu/pPNET, alveolárního rabdomyosarkomu, synovialosarkomu, popřípadě infantilního fibrosarkomu (Sumerauer et al. 2001, Krsková et al. 2006, Múdry et al. 2009). Kromě uvedených diagnóz je molekulárně genetické vyšetření přínosné i v diagnostice dalších, v dětské onkologii však již vzácných sarkomů (např. desmoplastický tumor z malých kulatých buněk nebo liposarkom). Především v hematoonkologii se přítomnost specifických chromosomových aberací odráží i v klasifikačních schématech Světové zdravotnické organizace - příkladem je skupina akutních myeloidních leukémií s definovanými rekurentními genetickými abnormitami (Swerdlow et al. 2008). Navíc lze očekávat, že s přibývajícími znalostmi o prognostickém významu nově detekovaných genetických změn a s rozšířením léčiv cílených na konkrétní molekulární terč dozná klasifikace hematoonkologických malignit dalších úprav (Vardiman et al. 2009). Také odhalení zásadního významu minimální 9

zbytkové nemoci pro prognózu pacientů s leukémiemi je oblastí, ve které laboratorní diagnostika hraje klíčovou roli. Vyšetřování hladin reziduální nádorové populace v průběhu léčby leukémie a adekvátní reakce na tuto informaci se stalo již rutinní součástí léčebných protokolů (Froňková et al. 2008). U solidních nádorů dětského věku je klinický význam diseminace onemocnění na submikroskopické úrovni předmětem probíhajícího výzkumu (Sumerauer et al. 2001, Kågedal 2009, Krsková et al. 2010).

1.3. Detekce prognosticky významných biologických markerů u meduloblastomu   Metodami molekulární biologie byly u řady histopatologických jednotek identifikovány vzájemně se lišící „molekulárních varianty“ daného onemocnění. V mnoha případech bylo prokázáno, že rozdíly mezi těmito variantami jsou významné z hlediska klinického průběhu onemocnění, neboť daný biologický znak je spojen s odlišnou prognózou pacienta či je prediktorem léčebné odpovědi. Výsledek laboratorního vyšetření tak napomáhá volbě optimálního terapeutického plánu. U nádorů dětského věku je modelovým příkladem amplifikace protoonkogenu MYCN u neuroblastomu (Brodeur et al. 1984). Jde o historicky první molekulárně genetický znak užitý v dětské onkologii k prospektivní stratifikaci léčby pacientů. Dávková intenzita terapie pro konkrétního pacienta s neuroblastomem je tak dle současných poznatků založena na kombinaci klinických a biologických parametrů (věk, rozsah onemocnění dle INSS, ne/přítomnost amplifikace MYCN, ploidita nádoru, histopatologická klasifikace dle Shimady). Bez znalosti těchto informací neodhalíme skupinu pacientů vyžadujících intenzifikaci léčby, naproti tomu u pacientů s biologicky příznivým onemocněním vyvstává riziko toxicity „nadbytečné“ chemoterapie či radioterapie. Na základě dosavadních výsledků výzkumu lze předpokládat, že kombinace klinických a biologických faktorů bude určovat dávkovou intenzitu léčby také u meduloblastomu. Recentní analýzy kandidátních biomarkerů, které byly provedeny na velkých souborech uniformě léčených pacientů, tomu nasvědčují (Ellison et al. 2005, Pfister et al. 2009, Ellison et al. 2010, Northcott et al. 2010). V uvedených příkladech se však jedná o studie retrospektivní, a je proto zapotřebí jednoznačná validace jejich výsledků v prospektivně běžících studiích.

10

2. Exprese proteinu p73 u meduloblastomu (Práce III a IV)  2.1. Struktura a funkce proteinu p73  Ztráta funkce nádorového supresoru p53 má klíčovou roli v procesu kancerogeneze u řady nádorů (Vogelstein et al. 2000, Nenutil et al. 2005). Hledání proteinů homologních k p53 vedlo k objevu dalších dvou členů rodiny proteinu p53 - proteinu p73 (Kaghad et al. 1997) a proteinu p63 (Yang et al. 1998). Gen TP73 je lokalizován na krátkém raménku chromosomu 1 (lokus 1p36.2-3) v oblasti podléhající u řady nádorů ztrátě heterozygotnosti, a homologie s p53 vede ke schopnosti proteinu p73 indukovat transkripci některých cílových genů shodných s působením p53. Proto se nejdříve předpokládalo, že půjde o nádorový supresor Knudsonova typu. Tato domněnka však nebyla prvními studiemi potvrzena, neboť inaktivující mutace či epigenetické umlčení transkripce jsou v lidských nádorech nalézány extrémně řídce a p73-/- deficientní myš nemá zvýšený sklon ke spontánnímu výskytu nádorů (Ikawa et al. 1999, Yang et al 2000). Naopak u většiny analyzované nádorové tkáně byla zjištěna zvýšená exprese p73 (Moll and Slade 2004) a funkční studie odhalovaly jak vlastnosti obdobné proteinu p53, tak role antagonistické či zcela unikátní (Oswald and Stiewe 2008). Za touto skutečností stojí nezvyklý počet N-koncových a C-koncových isoforem proteinu p73, jejichž existence vychází z komplexnosti genového lokusu TP73 (Obrázek 1). Kromě promotoru P1 je v oblasti intronu 3 lokalizován ještě další interní promotor P2. Přepis z P1 dává vznik nezkrácené, transaktivačně kompetentní TA-isoformě, přepis z P2 vede ke vzniku zkrácené isoformy ΔNp73, u níž je 61 N-koncových aminokyselin proteinu TAp73 nahrazeno 13 aminokyselinami kódovanými z alternativního exonu 3B (Ishimoto et al. 2002). Dále byla prokázána existence aberantních transkriptů p73Δex2, p73Δex2/3, ΔN´p73, které - byť přepisovány z promotoru P1 - rovněž postrádají TA doménu. p73Δex2 a p73Δ2/3 vznikají alternativním sestřihem exonů 2 resp. 2/3, kódují protein počínající aminokyselinou 49, resp. 72. Transkript ΔN´p73 obsahuje 198 párů bází z alternativního exonu 3B, při translaci však kóduje protein identický s ΔNp73 v důsledku předčasného ukončení translace (Pützer et al. 2003). Souhrnně jsou proteiny p73Δex2, p73Δex2/3 a ΔNp73 označovány jako ΔΤΑp73. C-koncové isoformy α, β, γ, δ, ε, ζ, η vznikají alternativním sestřihem exonů 10 až 14. Experimentální data naznačují rozdílnou funkci jednotlivých isoforem, které se liší svojí expresí v různých tkáních a buněčných liniích a vyznačují se odlišnou silou vazby na DNA i účinností při aktivaci transkripce (Holčáková et al. 2008).

11

Obrázek 1: Struktura genu a proteinu p73. (a) Znázorněn je vznik jednotlivých N-koncových a Ckoncových isoforem přepisem ze dvou promotorů a alternativním sestřihem transkriptu. Nekódující sekvence jsou vyznačeny černou, kódující úseky bílou barvou. (b) Schéma N- a C-koncových isoforem proteinu p73. (Upraveno dle Machado-Silva et al. 2010)

V současnosti většina prací dokumentuje, že isoforma TAp73 je nádorovým supresorem, jak prokazuje také in vivo model (Tomasini et al. 2009), kdežto role ΔΤΑp73 proteinů je onkogenní (Zaika et al. 2002, Emmrich et al. 2009). Ve vztahu k tématu předkládané práce je zajímavá skutečnost, že u buněk neuroblastomu a feochromocytomu (Lo et al. 2003) i u postmitotických neuronů (Jiang et al. 2006) vyvolává zvýšená exprese TAp73 apoptózu. Isoforma ΔNp73 byla naopak dokumentována jako důležitý antiapoptotický faktor v neuronální tkáni (Lee at al. 2004, Tissir et al. 2009)

2.2. Exprese proteinu p73 u nádorů   Protein p73 byl dosud prokázán u řady malignit. V buňkách různých typů nádorů byla zjištěna exprese p73 vyšší než v okolní zdravé tkáni, přičemž jeho výskyt byl prokázán především u karcinomu plic, prsu, spinocelulárního karcinomu hlavy a krku, jícnu, žaludku, tlustého střeva a rekta, jater, žlučníku, vaječníku, močového měchýře, vulvy a děložního čípku (Moll and Slade 2004). V případě neurogenních nádorů byl protein p73 popsán u ependymomu, gliomů, meningiomu a neuroblastomu (Loiseau et al. 12

1999, Nozaki et al. 2001, Douc-Rasy et al. 2002, Kamiya and Nakazato 2002, Ugur et al. 2004, Wager et al. 2006). U meduloblastomu byla zvýšená exprese proteinu p73 dokumentována v rámci naší studie (Práce III). Nezávisle, a to ve stejném roce, byla úloha N-koncových isoforem p73 u meduloblastomu zkoumána také v práci Castellina a spolupracovníků; zde však byl větší soubor primárních vzorků vyšetřen pouze metodou PCR, nikoliv na úrovni proteinu (Castellino et al. 2007). Zvýšená exprese isoformy ΔNp73 byla v některých pracích korelována s přežitím pacientů a bylo zjištěno, že má prognosticky negativní význam především u karcinomů (Concin et al. 2004, Uramoto et al. 2004, Müller et al. 2005, Vilgelm et al. 2010) a u neuroblastomu (Casciano et al. 2002). Většina prvotních studií však detekovala expresi isoforem p73 pouze metodou RTPCR. Teprve recentní práce potvrzují přítomnost p73 i na úrovni proteinu, neboť jeho detekce je ztížena minimální dostupností protilátek s dostatečnou vazebnou specificitou pro jednotlivé isoformy. V kontextu předkládané práce je třeba zdůraznit, že všechny užité protilátky lze považovat za dostatečně specifické, jak vyplývá z metodických prací Sayana a Rosenbluthové (Sayan et al. 2005, Rosenbluth et al. 2009). 2.3.  Výsledky  –  detekce  transkriptů  TAp73  a  ΔNp73  a  imunohistochemické  značení p73 a ΔNp73 u meduloblastomu (Práce III)  Prvním z cílů této disertační práce bylo provést pilotní studii exprese Nterminálních isoforem proteinu p73 v nádorové tkáni meduloblastomu. Pracovní hypotéza, že isoformy p73 mohou hrát roli v dysregulaci signálních drah v buňkách meduloblastomu, vycházela ze zjištění, že se protein p73 účastní morfogeneze a regulace apoptózy v neuronální tkáni. Přitom není bez zajímavosti, že aberantní exprese řady morfogenů je v patogenezi nádorového růstu dobře známa (Pozniak at al. 2000, Meyer et al. 2002, Fogarty et al. 2005). Hypotéza o možném vztahu exprese isoformy ΔNp73 k prognóze dětí s meduloblastomem vychází z analogií u jiných typů nádorů (viz kapitola 2.2. této práce); na tomto místě je vhodné zdůraznit prognostický význam exprese ΔNp73 u neuroblastomu, nejčastějšího embryonálního nádoru periferní nervové soustavy u dětí (Casciano et al. 2002, Wolter et al. 2010). V rámci experimentální části práce byla zavedena detekce transkriptů TAp73 a ΔNp73 pomocí metody real-time PCR. Stanovení bylo provedeno na systému LightCycler (Roche Diagostics), vlastní reakce v modifikaci TaqMan (homogenous 5´ nuclease assay). Sekvence primerů vycházela z dříve publikované práce (Stiewe et al. 2004). K hodnocení exprese byla užita metoda relativní kvantifikace, exprese cílových transkriptů byla normalizována k expresi beta-aktinu jako housekeepingového genu. Bylo vyšetřeno celkem 13 vzorků nativní nádorové tkáně meduloblastomu pacientů Kliniky dětské onkologie LF MU v Brně. Míra exprese obou cílových transkriptů byla srovnána s jejich expresí v komerčně dostupné referenční tRNA ze směsné tkáně normálního mozečku (BD Biosciences). TAp73 transkript byl prokázán ve všech nádorových vzorcích, ΔNp73 13

transkript u přibližně poloviny vzorků. V normální tkáni byla úroveň exprese obou transkriptů nízká, resp. nedetekovatelná. Rozdíl v expresi obou transkriptů mezi nádorovou a normální tkání byl statisticky významný. Imunohistochemické značení proteinu p73 bylo provedeno standardní technikou na souboru primární nádorové tkáně meduloblastomu 29 pacientů Kliniky dětské onkologie LF MU a FN Brno. Parafínové bloky byly získány z archívů patologicko-anatomických ústavů. Byly užity následující primární protilátky: 1) myší monoklonální protilátka proti p73α/β (klon ER-15, Lab Vision, Neomarkers; ředění 1:2000), vzhledem k lokalizaci použitého epitopu tato protilátka specificky značí pouze C-koncovou α-isoformu (Sayan et al. 2005); 2) myší monoklonální protilátka proti ΔNp73 (klon 38C674.2, Imgenex; ředění 1:4000), vhodnost této protilátky pro IHC na parafínových blocích je dokumentována v pracích Saifudeen et al. 2005 a Rosenbluth et al. 2009. Při použití plexus chorioideus jako pozitivní kontroly (Cabrera-Socorro et al. 2006, Domínguez et al. 2006) jsme zaznamenali silnou a specifickou imunoreaktivitu v buňkách jeho epitelu. Míra exprese isoforem p73α a ΔNp73 v nádorové tkáni meduloblastomu byla hodnocena semikvantitativně. V našem souboru jsme jako pozitivní vyhodnotili 52 %, resp. 29 % nádorů. Charakteristika souboru (věk, pohlaví, rozsah onemocnění, histologický podtyp, stupeň anaplazie, přežití) a výsledky imunodetekce p73α a ΔNp73 u jednotlivých případů jsou uvedeny v Práci III. Pilotní analýza prostřednictvím Kaplan-Meierových křivek prokázala negativní vztah mezi pozitivitou pro p73α a ΔNp73 a celkovým a bezpříznakovým přežitím. V případě isoformy ΔNp73 a celkového přežití byl tento vztah statisticky významný. Věk pacienta, rozsah onemocnění ani histopatologický podtyp však s imunopozitivitou obou zjišťovaných isoforem p73 nekorelovaly. Tabulka 1 prezentuje, ve srovnání s Publikací III z roku 2007, aktualizovaná data o bezpříznakovém a celkovém přežití pacientů (stav k 1. 10. 2010). Inverzní vztah mezi expresí proteinů p73α a ΔNp73 a přežitím pacientů zůstal zachován (Obrázek 2), přičemž celkové přežití pacientů, jejichž nádor byl imunoreaktivní pro ΔNp73, je signifikantně sníženo (P=0,035, log-rank test).

14

Věk 2 3 3 3 3 4 5 5 6 7 8 8 8 9 9 9 10 10 10 12 13 13 14 14 15 17 17 17 22

Pohlaví F F F F M F F F M M F M M M F M F F F M M M M M M F M M F

Rozsah Lokalizovaný Lokalizovaný Metastatický Metastatický Lokalizovaný Metastatický Lokalizovaný Lokalizovaný Metastatický Lokalizovaný Lokalizovaný Metastatický Lokalizovaný Lokalizovaný Lokalizovaný Metastatický Metastatický Lokalizovaný Lokalizovaný Lokalizovaný Metastatický Lokalizovaný Lokalizovaný Metastatický Lokalizovaný Lokalizovaný Metastatický Lokalizovaný Lokalizovaný

Podtyp Klasický Desmoplastický Klasický Desmoplastický Klasický Klasický Klasický Klasický Klasický Desmoplastický Desmoplastický Desmoplastický Klasický Klasický Klasický Klasický Klasický Klasický Klasický Klasický Klasický Klasický Klasický Klasický Velkobuněčný Klasický Klasický Klasický Klasický

p73α ++ ++ + +/+++ +++ +/+ + ++ +++ +/+/+ ++ ++ + +/+ +

ΔNp73 + + +/+++ + + +++ NA +/+ +/+ -

EFS 18 4 12 121 114 NA 4 20 19 23 48 21 100 80 2 87 23 55 136 46 49 82 17 11 66 51 15 6 22

OS 27 13 24 121 114 NA 18 64 22 25 48 96 100 80 13 87 26 55 136 54 49 82 18 12 69 51 21 74 24

Přežití DOD+ DOT (PR2) DOD+ CR CR DOD° DOD DOD+ DOD DOD CR CR2 CR CR DOD CR DOD CR CR DOT (PD) CR CR DOD DOD DOD CR DOD CR2 DOD+

Tabulka 1: Soubor pacientů s meduloblastomem, přehled klinických a histopatologických ukazatelů. Výsledky imunohistochemického značení jsou vyjádřeny semikvantitativně: (–) negativní, (+/–) méně než 1 % nádorových buněk pozitivních, (+) 1-5 % pozitivních, (++) 6-15 % pozitivních, (+++) více než 15 % nádorových buněk pozitivních (rozsah 20-60 %). Věk při diagnóze udán v rocích, F ženské pohlaví, M mužské pohlaví, EFS přežití bez události v měsících, OS celkové přežití v měsících, DOD úmrtí na základní nemoc, DOT úmrtí na komplikace léčby, CR kompletní remise onemocnění, CR2 druhá kompletní remise onemocnění, PD progrese onemocnění, PR2 druhá parciální remise onemocnění, NA nehodnoceno, + nedodržení léčebného protokolu (non-compliance), °úmrtí v perioperačním období před zahájením protinádorové léčby.

15

EFS

OS p73α pozitivní p73α negativní

0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1

1,0 Kumulativní podíl přežívajících

Kumulativní podíl přežívajících

1,0

p=0,246

0,0 0

2

p73α pozitivní p73α negativní

0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1

p=0,147

0,0 4

6

8

10

12

0

2

4

Čas (roky)

EFS

0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 p=0,130 0

2

1,0 Kumulativní podíl přežívajících

Kumulativní podíl přežívajících

ΔNp73 positivní ΔNp73 negativní

0,9

0,0

10

12

6 Čas (roky)

8

10

12

ΔNp73 positivní ΔNp73 negativní

0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0,0

4

8

OS

1,0

0,1

6 Čas (roky)

p=0,035 0

2

4

6

8

10

12

Čas (roky)

Obrázek 2: Kaplan–Meierovy grafy znázorňující celkové přežití (OS) a bezpříznakové přežití (EFS) pacientů ve vztahu k imunohistochemickému průkazu p73α a ΔNp73. Je zřejmý trend k horší prognóze pacientů s nádorem pozitivním pro isoformy p73. V případě ΔNp73 a celkového přežití byl negativní prognostický význam tohoto nálezu statisticky významný (log–rank test P = 0,035)

Lze shrnout, že tyto výsledky odhalují zapojení proteinu p73 v tumorigenezi meduloblastomu. Bylo prokázáno, že v nádorové tkáni meduloblastomu jsou aktivovány oba promotory genu TP73, neboť ve srovnání s tkání normálního cerebella byla v nádorech detekována statisticky významně zvýšená exprese transkriptů TAp73 a ΔNp73. Imunohistochemické značení potvrdilo přítomnost p73α a ΔNp73 na úrovni proteinu. V pilotní analýze se ΔNp73 pozitivita ukázala jako možný negativní prognostický znak. 16

Validaci tohoto zjištění na nezávislém, dostatečně robustním souboru pacientů považujeme za velmi žádoucí.

2.4.  Výsledky  –  detekce  N­terminálních  isoforem  proteinu  p73  u  buněk  nádorových linií derivovaných z meduloblastomu (Práce IV)  Protein p73 byl prioritně popsán popsán jako transkripční faktor (Kaghad et al 1997) a lokalizace p73 v jádře je proto nezbytným předpokladem pro jeho vazbu na promotory genů a přímou regulaci transkripce. Následně byly objeveny specifické exportní sekvence umožňující řízený transport p73 mezi jádrem a cytoplazmou (Inoue et al. 2002), což podmínilo výzkum protein-proteinových interakcí p73 v cytoplazmě (Dobbelsein et al. 2005), které ovlivňují jak stabilitu isoforem p73, tak jejich účast v procesu apoptózy, diferenciace, nádorové proliferace a neurodegenerace (Inoue et al. 2002, Douc-Rasy et al. 2002, Vella et al. 2003, Aqeilan et al. 2004, Wilson et al. 2004, Kim et al. 2007). Biologický význam přítomnosti isoforem TAp73 a ΔNp73 v cytoplazmě buněk však není doposud dostatečně objasněn. V buňkách normálního lidského hipokampu, neokortexu i plexus chorioideus byla isoforma ΔNp73 lokalizována především v jádře (CabreraSocorro et al. 2006), v nádorové tkáni karcinomu plic a karcinomu prsu však byla popsána cytoplazmatická exprese proteinu (Uramoto et al. 2004, Bozzetti et al. 2007). Rovněž námi provedená imunohistochemická studie u meduloblastomu prokazuje přítomnost této isoformy především v cytoplazmě, ale ojediněle byla zaznamenána i zřetelná jaderná pozitivita pro ΔNp73 (Práce III). Jiné práce však detekují protein ΔNp73 v jádrech nádorových buněk, a to u hepatocelulárního a kolorektálního karcinomu (Müller et al. 2005, Domínguez et al. 2006). Význam pozorovaných rozdílů v intracelulární lokalizaci proteinu p73 není dosud objasněn. Obecně lze říci, že abnormální lokalizace proteinu může vést ke ztrátě jeho funkce, v případě nádorového supresoru tedy může přispívat k nádorové transformaci. Jako příklad lze uvést zjištění, že nemutovaný protein p53 je u buněk neuroblastomových linií sekvestrován v cytoplazmě (Moll et al. 1995), což negativně ovlivňuje jeho úlohu v buněčné odpovědi na genotoxický stres (Moll et al. 1996). Sekvestrace nemutovaného proteinu p53 byla pozorována i v případě karcinomu prsu (Moll et al. 1992). Detailní morfologická studie přítomnosti endogenních isoforem TAp73 a ΔNp73 na buněčné úrovni v literatuře chybí. Rozhodli jsme se proto provést takovou analýzu u buněčných linií derivovaných z meduloblastomu a popsat intracelulární distribuci proteinu, a to nejprve za pomoci nepřímé imunofluorescence. V budoucnu bychom rádi potvrdili získaná data také elektronovou mikroskopií s využitím imunodetekce na ultratenkých řezech . Značení N-koncových isoforem TAp73 a ΔNp73 bylo provedeno nepřímou imunofluorescencí jak u referenční sbírkové meduloblastomové linie DAOY (American Type Culture Collection, HTB-186), tak u linií MBL-03, MBL-06, MBL-07 a MBL-10, které byly derivovány z nádorové tkáně pacientů Kliniky dětské onkologie LF MU a FN 17

Brno. K detekci proteinů byly použity následující primární protilátky: 1) králičí polyklonální anti-TAp73 (IHC-00197-1, Bethyl Laboratories, ředění 1:100); 2) myší monoklonální protilátka anti-ΔNp73 (klon 38C674.2, Imgenex; ředění 1:50). Metodické detaily jsou uvedeny v Práci IV. Proteiny TAp73 a DeltaNp73 byly detekovány u všech zkoumaných meduloblastomových linií. U sbírkové linie DAOY byl protein TAp73 přítomen výhradně v jádře a to téměř u všech buněk. Linie MBL obecně vykazovaly vyšší heterogenitu jak exprese, tak distribuce proteinu TAp73. Fluorescenční signál odpovídající lokalizaci TAp73 byl v některých buňkách detekován pouze v jádře, u více než poloviny buněk MBL linií pak souběžně v jádře a v nenáhodně definované oblasti cytoplazmy v blízkosti jádra. V malém procentu buněk byl přítomen pouze v cytoplazmě. U části buněk MBL s jadernou lokalizací proteinu TAp73 byla patrna zesílená fluorescence po obvodu jádra, tento nález může naznačovat vazbu na jadernou membránu. Isoforma ΔNp73 byla pozorována pouze v jádře buněk, a to v menší části buněčné populace. Je tedy možné shrnout, že u buněk nádorových linií meduloblastomu byla potvrzena konstituční exprese N-koncových isoforem TAp73 a ΔNp73. Lze předpokládat, že změny v subcelulární distribuci N-koncových isoforem proteinu p73 jsou jedním z nepřímých způsobů regulace jeho funkce a vedou k odlišným protein-proteinovým interakcím. Získané morfologické výsledky představují základ pro další výzkum, který se zaměří na odkrytí důvodů výše uvedených rozdílů ve variabilitě exprese, a to i ve vztahu k přítomnosti dalších proteinů rodiny nádorového supresoru p53. Podrobná diskuse k získaným výsledkům je součástí Práce IV.

3.  Početní  změny  protoonkogenů  MYCC  a  MYCN  u  meduloblastomu (Práce V)  3.1. Molekulární subklasifikace u meduloblastomu  Univerzální molekulární či cytogenetická abnormalita, která by sloužila jako patognomický marker, nebyla u meduloblastomu identifikována. Přesto však metodami klasické cytogenetiky, molekulární onkocytogeneticky (FISH, CGH) a dnes především array-CGH, SNP-arrays a expresním profilováním byla v nádorové tkáni meduloblastomu odhalena řada nenáhodných změn (MacDonald et al. 2002, Pomeroy et al. 2002). Recentně bylo v několika nezávislých expresních studiích vygenerováno velké množství dat (Thompson et al. 2006, Kool et al. 2008, Pfister et al. 2009, Northcott et al. 2010), jejichž syntéza vede ke zcela novému pohledu na meduloblastom jako onemocnění s několika molekulárními podtypy. Důležité je, že v rámci jednotlivých skupin nacházíme specifické asociace jak s klinickými údaji (věk pacienta při diagnóze, metastatické šíření, prognóza onemocnění), tak histopatologickými charakteristikami (podtyp, stupeň anaplazie). 18

Obrázek 3: Současný pohled na molekulární klasifikaci meduloblastomu. Je patrné, že jsou aberantně aktivovány signální dráhy klíčové pro normální vývoj v nervové tkáni. Významné je spojení mezi biologickým profilem a klinicko-histopatologickými znaky. (Upraveno dle Pfister et al. 2010)

Detailně je současné poznání o molekulární subklasifikaci meduloblastomu shrnuto v přehledu Pfistera (Pfister et al. 2010), z kterého je převzat, pro jeho vysokou informační hodnotu, i Obrázek 3.

3.2. Výzkum protoonkogenů MYC u meduloblastomu   Protoonkogeny rodiny MYC jsou jedním z klíčových regulátorů proliferace a diferenciace, v odpovědi na stresové stimuly se rovněž podílí na indukci programované buněčné smrti (Evan and Littlewood 1998, Torres et al. 2010). Úloha MYCN a MYCC u meduloblastomu je známa již více než 20 let. Friedman v roce 1988 poprvé popsal 19

amplifikaci MYCC u buněčné linie D341 a v následujících letech byly publikovány další studie potvrzující amplifikaci MYCC a MYCN v nádorové tkáni meduloblastomu (Friedman et al. 1998, Badiali et al. 1991, Rasheed and Bigner 1991, Tomlinson et al. 1994, Bruggers et al. 1998, Jay et al. 1999, Gilhuis et al. 2000, Kučerová et al. 2000). Později byla odhalena souvislost mezi amplifikací MYCC/MYCN a těžce anaplastickým podtypem nádoru (Brown et al. 2000, Eberhart et al. 2002, Lamont et al. 2004, Stearns et al. 2006). Amplifikace MYCC se ukazuje být s prognózou asociována silněji, než přítomnost velkobuněčné/těžce anaplastické (LC/A) varianty per se, neboť pacienti s LC/A meduloblastomem, u nichž přítomnost MYCC amplifikace prokázána nebyla, měli přežití srovnatelné s pacienty s klasickým meduloblastomem (von Hoff et al. 2010). Rovněž na úrovni transkripce byl odhalen zvýšený obsah MYCC a MYCN mRNA (Bruggers et al. 1989, Garson et al. 1989) a v některých studiích byl rovněž prokázán vztah mezi zvýšenou expresí těchto mRNA a horší prognózou pacientů s meduloblastomem (Herms et al. 2000, Grotzer et al. 2001, Eberhart et al. 2004). Závěry těchto studií však nejsou jednoznačné, neboť elevace MYCC mRNA byla pozorována také u některých případů s aktivací WNTsignální dráhy a elevace MYCN mRNA u některých případů s aktivací SHH-signální dráhy, což jsou molekulární varianty onemocnění spjaté se spíše příznivou prognózou (Pfister et al. 2010). Amplifikace MYCC a MYCN může být zjišťována různými metodami; v publikovaných studiích byly užity Southern blotting, PCR, FISH, CGH i array-CGH (Bruggers et al. 1998, Brown et al. 2000, Gilhuis et. al. 2000, Neben et al. 2004, Rutkowski et al. 2007, Malakho et al. 2008, Pfister et al. 2009). Z pohledu rutinního užití v diagnostice se jako nejpříhodnější metodický přístup jeví interfázní fluorescenční hybridizace in situ (FISH) na otiscích nativní tkáně. Vyšetření z parafínových řezů je technicky proveditelné, v případě vyšetřování MYCC/MYCN je však zatíženo v 10-15 % případů neinformativním výsledkem, přičemž komerčně dostupné sondy od výrobce Abbott/Vysis se jeví v případě vyšetřování parafínových řezů vhodnější než sondy od jiných výrobců (Clifford, personal communication). U neuroblastomu je zjišťování ne/přítomnosti amplifikace MYCN součástí rutinní laboratorní diagnostiky a výsledek vyšetření tohoto markeru je užit prospektivně k určení míry rizika onemocnění jako jeden ze stratifikačních znaků. Bylo také dosaženo jednoznačné shody na arbitrární definici, jaký výsledek laboratorního vyšetření je hodnocen jako amplifikace (Ambros et al. 2009). U meduloblastomu je situace mnohem méně jasná. V publikovaných pracích je za amplifikaci považována především tzv. „highlevel“ amplifikace, tedy přítomnost homogenně se barvících oblastí (hrs) či double minutes chromatinových tělísek (dmin) (Lamont et al. 2004, Ellison et al. 2010). Teprve zcela recentní práce definuje taxativně i zisk (gain) na příslušném lokusu (Ellison et al. 2010). Doposud největší analyzovaný soubor pacientů s meduloblastomem, který čítal 260 pacientů, popsal amplifikaci MYCC/MYCN ve 4 %, resp. 7 % případů, přičemž za amplifikaci, stanovovanou metodou FISH, bylo považováno více jak 8 kopií onkogenu, resp. charakteristický obraz hrs či dmin (Pfister et al. 2009). Tato studie jednoznačně potvrdila negativní prognostický význam amplifikace MYCC a MYCN u meduloblastomu, 20

jak už naznačovaly dřívější pozorování u jednotlivých případů (Badiali et al. 1991, Tomlinson et al. 1994) i analýzy na větších souborech pacientů (Scheurlen at al. 1998, Kučerová et al. 2000, Aldosari et al. 2004, Lamont et al. 2004, Neben et al. 2004). V případě amplifikace MYCN jsou však výsledky studií méně konkluzivní, neboť recentní práce na souboru 187 případů negativní prognostický význam nepotvrzuje (Ellison et al. 2010).

3.3.  Výsledky  ­  limitované  zvýšení  počtu  kopií  genů  MYCC  a  MYCN  u  meduloblastomu (Práce V)  V souladu s výše uvedeným rozvojem poznání o klinickém významu molekulární diagnostiky u meduloblastomu probíhá u pacientů s touto diagnózou na Klinice dětské onkologie LF MU a FN Brno již více jak 10 let onkocytogenetické vyšetření nádorové tkáně, a to ve spolupráci s Oddělením lékařské genetiky FN Brno. Prováděná vyšetření zahrnují - vedle klasického cytogenetického vyšetření a nověji případně spektrálního karyotypování - především interfázní analýzy: stanovení počtu kopií genů MYCN a MYCC metodou FISH a také celogenomový screening chromosomových abnormalit pomocí komparativní genomové hybridizace. Za marker negativní prognózy je považována amplifikace protoonkogenů MYC (viz kapitola 3.2.) Cílem bylo zhodnotit, zda limitované zvýšení počtu kopií (tzv. gain) protoonkogenů MYCN a MYCC má v doposud vyšetřeném souboru pacientů prognostický význam. Použita byla metoda fluorescenční hybridizace in situ, k hybrizidaci byly použity komerčně dostupné duální sondy. Analyzovány byly případy z let 2000-2007. Většina nádorů byla vyšetřena prospektivně, tj. bezprostředně po provedeném resekčním neurochirurgickém výkonu, a to z otisků nativní nádorové tkáně. V případě MYCN byla některá vyšetření provedena retrospektivně, na řezech z archivních parafínových bloků. Ty byly užity i v případech, kdy otisky nativní tkáně nebyly dostupné, především v případě operace pacienta mimo onkocentrum. Na základě dříve publikované studie u jiného typu nádoru (Ryott et al. 2009) byly označeny případy s více než čtyřmi kopiemi protoonkogenu u více než 10 % buněk jako případy s limitovanou početní změnou (tzv. gain). Zvýšený počet kopií (5-9) protoonkogenu MYCC byl v našem souboru prokázán v 6 z 29 případů (21 %), amplifikace u 2 případů (7 %). Vyšetření MYCN odhalilo, že v 5 z 27 případů byl přítomen gain (19 %), kdežto amplifikace byla prokázána v jediném případě (4 %). Detailní klinickopatologické charakteristiky souboru a výsledky jednotlivých vyšetření získaných FISH jsou obsaženy v Práci V. Pro statistickou analýzu vztahu zjištěných početních změn MYCN a MYCC jsme jako pozitivní označili případy s 5 a více kopiemi protoonkogenu. Ponížením cut-off (amplifikace vs. gain) bylo identifikováno oproti amplifikaci dalších 6 / 29, tj. přibližně 20 % pacientů, jejichž nádor nesl početní změny MYCN či MYCC. Pilotní univariantní analýza metodou Kaplan-Meierových křivek prokázala negativní vztah mezi přítomností početních 21

změn MYCC či MYCN a celkovým i bezpříznakovým přežitím. V případě MYCN byl tento vztah statisticky významný (log rank, P= 0,02, resp. 0,03). Pokud jde o další klinickopatologická kritéria, tři ze čtyř LC/A meduloblastomů byly nositeli početních změn MYCC/MYCN, zatímco metastatická choroba s přítomností početních změn v našem souboru nekorelovala. Lze proto shrnout, že naše výsledky prokazují možný význam limitovaných početních změn na lokusech 8q24 (MYCC) a především 2p24 (MYCN) pro prognózu pacientů s meduloblastomem. Neboť bude do léčby meduloblastomu již brzy zaveden model stratifikace rizika zohledňující klinická, histopatologická i molekulární kritéria (první takové studie jsou již v přípravě, viz 3.4.) (Clifford et al. 2010), mají prezentované výsledky potenciálně značný klinický dopad a lze předpokládat, že budou nezávisle validovány na větším souboru pacientů.

3.4. Další perspektivy a vývoj klinických studií u meduloblastomu  Detekce biomarkerů u meduloblastomu je jasným trendem translačního výzkumu tohoto onemocnění, přičemž konkrétní výstupy pro klinickou praxi jsou patrny již dnes. Kooperativní skupinou v rámci sdružení SIOP–Europe jsou připravovány dvě mezinárodních studie, jejichž spuštění lze očekávat v roce 2011. Obě budou určeny pro pacienty standardního rizika, tj. pro děti starší tří let, s non-metastatickým meduloblastomem po provedené radikální resekci nádoru. V první studii, na základě dosaženého konsenzu, bude za příznivý biologický profil považován současný výskyt následujících tří znaků: (i) histopatologickým vyšetřením je vyloučena velkobuněčná či těžce anaplastická varianta, (ii) je prokázána jaderná imunoreaktivita pro beta-catenin, a (iii) není přítomna amplifikace protoonkogenů MYCC či MYCN stanovená pomocí FISH. Pacienti splňující tato kritéria budou léčeni jednoramenným protokolem, který redukuje dávky dnes podávaných chemoterapeutik. Cílem tak bude potvrdit hypotézu, že u těchto nemocných je možno snížit intenzitu léčby a tím i její akutní a pozdní toxicitu a přitom zachovat léčebné výsledky non-inferiorní současným postupům. Druhá komplementární studie si klade za cíl určit, zda ti pacienti, u nichž příznivý biologický profil nádoru nebude potvrzen, profitují z randomizovaného podání karboplatiny jako radiosenzitizéru (Clifford et al. 2010, Rutkowski, personal communication). Lze tedy odůvodněně očekávat, že detekce prognostických markerů optimalizující konvenční léčebné postupy, spolu s výzkumem cílené protinádorové terapie na buněčné úrovni, napomohou v budoucnu zvrátit mnohdy nepříznivý osud dětí s meduloblastomem.

22

Souhrn  Tato práce se zabývá detekcí vybraných molekulárních faktorů a nenáhodných chromosomových změn u meduloblastomu, nejčastějšího zhoubného nádoru mozku u dětí. V první části práce byla studována exprese proteinu p73, který je členem rodiny nádorového supresoru p53. Pracovní hypotéza, že isoformy p73 mohou hrát v tumorigenezi meduloblastomu roli, byla založena na pozorování, že se protein p73 účastní morfogeneze a je důležitým regulátorem programované buněčné smrti v neuronální tkáni. Hypotéza o možném vztahu exprese N-koncové isoformy ΔNp73 k prognóze dětí s meduloblastomem vycházela z analogií u jiných typů nádorů. Nejdříve byla zavedena kvantifikace transkriptů TAp73 a ΔNp73 pomocí real-time PCR a bylo vyšetřeno 13 vzorků nativní nádorové tkáně meduloblastomu. Úroveň exprese v primárních vzorcích byla srovnána s expresí v komerčně dostupné tRNA pocházející ze směsné tkáně normálního mozečku. Transkript TAp73 byl prokázán ve všech nádorových vzorcích, transkript ΔNp73 u přibližně poloviny vzorků. V normální tkáni byla míra exprese TAp73 a ΔNp73 nízká, resp. nedetekovatelná. Pozorovaný rozdíl v míře exprese mezi nádorovou a normální tkání byl pro oba transkripty statisticky významný. Následně bylo provedeno na souboru primární nádorové tkáně meduloblastomu od 29 pacientů imunohistochemické značení proteinu p73. K imunodetekcím byla užita jednak myší monoklonální protilátka proti p73α a jednak myší monoklonální protilátka proti ΔNp73. Za pozitivní kontrolu sloužil plexus chorioideus. Imunohistochemické značení p73α a ΔNp73 v nádorové tkáni meduloblastomu bylo vyhodnoceno semikvantitativně a za pozitivní bylo označeno 52 %, resp. 29 % nádorů. Pilotní analýza prostřednictvím Kaplan-Meierových křivek prokázala negativní vztah mezi pozitivitou pro p73α a ΔNp73 a celkovým a bezpříznakovým přežitím, v případě isoformy ΔNp73 a celkového přežití byl tento vztah statisticky významný. Věk pacienta, rozsah onemocnění ani histopatologický podtyp s imunopozitivitou detekovaných isoforem nekorelovaly. Lze shrnout, že byla prokázána aktivace obou promotorů genu TP73 a imunohistochemickým značením potvrzen výskyt isoforem p73α a ΔNp73 na úrovni proteinu. Statistická analýza ukázala pozitivitu ΔNp73 jako možný biomarker s negativním prognostickým významem. Považovali bychom proto za velice přínosné provést navazující studii na nezávislém souboru pacientů. Vzhledem k získaným výsledkům byla realizována rovněž morfologická studie exprese N-terminálních isoforem proteinu p73 u buněk nádorových linií derivovaných z meduloblastomu. Její výsledky potvrdily konstituční expresi N-koncových isoforem TAp73 a ΔNp73 u všech pěti užitých buněčných linií. V případě isoformy TAp73 byla u linií derivovaných z klinického materiálu - ve srovnání se sbírkovou linií DAOY pozorována větší heterogenita v subcelulární distribuci proteinu, a to včetně jaderné exkluze. Existuje předpoklad, že tyto změny mohou nepřímým způsobem regulovat funkci TAp73, respektive vést k různým protein-proteinovým interakcím majícím význam pro tumorigenezi. 23

Druhá část práce se zabývala analýzou prognostického významu limitovaného zvýšení počtu kopií (tzv. gain) protoonkogenů MYCN a MYCC u meduloblastomu. Za biomarker s negativním významem pro prognózu je považována amplifikace těchto genů. Na základě práce zkoumající jiný typ nádoru byly za případy s limitovanou početní změnou (gain) označeny vzorky s více než čtyřmi kopiemi protoonkogenu u více než 10 % buněk. Gain MYCC byl v našem souboru prokázán v 6 / 29 případů (21 %), amplifikace u 2 případů (7 %). Gain MYCN byl přítomen v 5 z 27 případů (19 %), amplifikace byla prokázána v jediném (4 %). Pro statistickou analýzu byly za pozitivní označeny případy s více než 4 kopiemi protoonkogenů MYCC a MYCN. Tímto snížením hranice pro pozitivitu (cut-off) bylo identifikováno oproti amplifikacím dalších 6 z 29, tj. přibližně 20 % pacientů, jejichž nádor nesl početní změny MYCN či MYCC. Pilotní analýza prokázala negativní vztah mezi přítomností početních změn MYCC či MYCN a celkovým i bezpříznakovým přežitím, přičemž v případě MYCN byl tento vztah statisticky významný. U tří ze čtyř velkobuněčných/těžce anaplastických meduloblastomů byly přítomny početní změny MYCC/MYCN, metastatická choroba s přítomností početních změn v našem souboru nekorelovala. Rovněž výsledky druhé části práce mají klinický dopad a lze předpokládat, že budou nezávisle ověřovány na větším souboru pacientů. Zjištění prezentovaná v této disertaci rozšiřují poznání o prognostických biomarkerech u meduloblastomu a mohou napomoci, po jejich prospektivní validaci na nezávislých souborech pacientů, k větší individualizaci léčby dětí s meduloblastomem.

24

Literatura  Aldosari N, Bigner SH, Burger PC, Becker L, Kepner JL, Friedman HS, McLendon RE (2002) MYCC and MYCN oncogene amplification in medulloblastoma. A fluorescence in situ hybridization study on paraffin sections from the Children's Oncology Group. Arch Pathol Lab Med 126:540-544 Ambros PF, Ambros IM, Brodeur GM, Haber M, Khan J, Nakagawara A, Schleiermacher G, Speleman F, Spitz R, London WB, Cohn SL, Pearson AD, Maris JM (2009) International consensus for neuroblastoma molecular diagnostics: report from the International Neuroblastoma Risk Group (INRG) Biology Committee. Br J Cancer 100:1471-1482 Aqeilan RI, Pekarsky Y, Herrero JJ, Palamarchuk A, Letofsky J, Druck T, Trapasso F, Han SY, Melino G, Huebner K, Croce CM (2004) Functional association between Wwox tumor suppressor protein and p73, a p53 homolog. Proc Natl Acad Sci U S A 101:4401-4406 Ardon H, De Vleeschouwer S, Van Calenbergh F, Claes L, Kramm CM, Rutkowski S, Wolff JE, Van Gool SW (2010) Adjuvant dendritic cell-based tumour vaccination for children with malignant brain tumours. Pediatr Blood Cancer 54:519-525 Badiali M, Pession A, Basso G, Andreini L, Rigobello L, Galassi E, Giangaspero F (1991) N-myc and c-myc oncogenes amplification in medulloblastomas. Evidence of particularly aggressive behavior of a tumor with c-myc amplification. Tumori 77:118-121 Boman KK, Hovén E, Anclair M, Lannering B, Gustafsson G (2009) Health and persistent functional late effects in adult survivors of childhood CNS tumours: a populationbased cohort study. Eur J Cancer 45:2552-2561 Bozzetti C, Nizzoli R, Musolino A, Martella EM, Crafa P, Lagrasta CA, Camisa R., Bonati A, Lunghi P, Ardizzoni A (2007) p73 a p53 pathway in human breast cancer. J Clin Oncol 25:1451-1453 Brodeur GM, Seeger RC, Schwab M, Varmus HE, Bishop JM (1984) Amplification of Nmyc in untreated human neuroblastomas correlates with advanced disease stage. Science 224:1121-1124 Brown HG, Kepner JL, Perlman EJ, Friedman HS, Strother DR, Duffner PK, Kun LE, Goldthwaite PT, Burger PC (2000) "Large cell/anaplastic" medulloblastomas: a Pediatric Oncology Group Study. J Neuropathol Exp Neurol 59:857-865 Bruggers CS, Tai KF, Murdock T, Sivak L, Le K, Perkins SL, Coffin CM, Carroll WL (1998) Expression of the c-Myc protein in childhood medulloblastoma. J Pediatr Hematol Oncol 20:18-25 Cabrera-Socorro A, Pueyo Morlans M, Suarez Sola ML, Gonzalez Delgado F J, Castañeyra-Perdomo A, Marin MC, Meyer G (2006) Multiple isoforms of the tumor protein p73 are expressed in the adult human telencephalon and choroid plexus and present in the cerebrospinal fluid. Eur J Neurosci 23:2109-2118 25

Casciano I, Mazzocco K, Boni L, Pagnan G, Banelli B, Allemanni G, Ponzoni M, Tonini GP, Romani M (2002) Expression of DeltaNp73 is a molecular marker for adverse outcome in neuroblastoma patients. Cell Death Differ 9:246-251 Castellino RC, De Bortoli M, Lin LL, Skapura DG, Rajan JA, Adesina AM, Perlaky L, Irwin MS, Kim JY (2007) Overexpressed TP73 induces apoptosis in medulloblastoma. BMC Cancer 7:127 Clifford SC, Rutkowski S, Gustafsson G, Branger DF, Kortmann RD, Doz F, Ellison DW, Pietsch T (2010) Stratification of children and adolescents with medulloblastoma by histological and biological parameters in SIOP-Europe PNET clinical trials. Neuro-Oncology 12:ii6 Concin N, Becker K, Slade N, Erster S, Mueller-Holzner E, Ulmer H, Daxenbichler G, Zeimet A, Zeillinger R, Marth C, Moll UM (2004) Transdominant DeltaTAp73 isoforms are frequently up-regulated in ovarian cancer. Evidence for their role as epigenetic p53 inhibitors in vivo. Cancer Res 64:2449-2460 Dobbelstein M, Strano S, Roth J, Blandino G (2005) p73-induced apoptosis: a question of compartments and cooperation. Biochem Biophys Res Commun 331:688-693 Domínguez G, García JM, Peña C, Silva J, García V, Martínez L, Maximiano C, Gómez ME, Rivera JA, García-Andrade C, Bonilla F (2006) DeltaTAp73 upregulation correlates with poor prognosis in human tumors: putative in vivo network involving p73 isoforms, p53, and E2F-1. J Clin Oncol 24:805-815 Douc-Rasy S, Barrois M, Echeynne M, Kaghad M, Blanc E, Raguenez G, Goldschneider D, Terrier-Lacombe MJ, Hartmann O, Moll U, Caput D, Bénard J (2002) DeltaNp73alpha accumulates in human neuroblastic tumors. Am J Pathol 160:631-639 Eberhart CG, Kratz JE, Schuster A, Goldthwaite P, Cohen KJ, Perlman EJ, Burger PC (2002) Comparative genomic hybridization detects an increased number of chromosomal alterations in large cell/anaplastic medulloblastomas. Brain Pathol 12:36-44 Eberhart CG, Kratz J, Wang Y, Summers K, Stearns D, Cohen K, Dang CV, Burger PC (2004) Histopathological and molecular prognostic markers in medulloblastoma: cmyc, N-myc, TrkC, and anaplasia. J Neuropathol Exp Neurol 63:441-449 Ellison DW, Onilude OE, Lindsey JC, Lusher ME, Weston CL, Taylor RE, Pearson AD, Clifford SC; United Kingdom Children's Cancer Study Group Brain Tumour Committee (2005) beta-Catenin status predicts a favorable outcome in childhood medulloblastoma: the United Kingdom Children's Cancer Study Group Brain Tumour Committee. J Clin Oncol 23:7951-7957 Ellison DW, Kocak M, Dalton J, Megahed H, Lusher ME, Ryan SL, Zhao W, Nicholson SL, Taylor RE, Bailey S, Clifford SC (2010) Definition of Disease-Risk Stratification Groups in Childhood Medulloblastoma Using Combined Clinical, Pathologic, and Molecular Variables. J Clin Oncol [Epub ahead of print] Emmrich S, Wang W, John K, Li W, Pützer BM (2009) Antisense gapmers selectively suppress individual oncogenic p73 splice isoforms and inhibit tumor growth in vivo. Mol Cancer 8:61 26

Evan G and Littlewood T (1998) A matter of life and cell death. Science 281:1317-1322 Fogarty MP, Kessler JD, Wechsler-Reya RJ (2005) Morphing into cancer : the role of developmental signaling pathways in brain tumor formativ J Neurobiol 64:458-475 Friedman HS, Burger PC, Bigner SH, Trojanowski JQ, Brodeur GM, He XM, Wikstrand CJ, Kurtzberg J, Berens ME, Halperin EC, Bigner DD (1988) Phenotypic and genotypic analysis of a human medulloblastoma cell line and transplantable xenograft (D341 Med) demonstrating amplification of c-myc. Am J Pathol 130:472-484 Fronkova E, Mejstrikova E, Avigad S, Chik KW, Castillo L, Manor S, Reznickova L, Valova T, Zdrahalova K, Hrusak O, Jabali Y, Schrappe M, Conter V, Izraeli S, Li CK, Stark B, Stary J, Trka J (2008) Minimal residual disease (MRD) analysis in the non-MRD-based ALL IC-BFM 2002 protocol for childhood ALL: is it possible to avoid MRD testing? Leukemia 22:989-997 Garson JA, Pemberton LF, Sheppard PW, Varndell IM, Coakham HB, Kemshead JT (1989) N-myc gene expression and oncoprotein characterisation in medulloblastoma. Br J Cancer 59:889-894 Gilhuis HJ, Anderl KL, Boerman RH, Jeuken JM, James CD, Raffel C, Scheithauer BW, Jenkins RB (2000) Comparative genomic hybridization of medulloblastomas and clinical relevance: eleven new cases and a review of the literature. Clin Neurol Neurosurg 102:203-209 Grotzer MA, Hogarty MD, Janss AJ, Liu X, Zhao H, Eggert A, Sutton LN, Rorke LB, Brodeur GM, Phillips PC (2001) MYC messenger RNA expression predicts survival outcome in childhood primitive neuroectodermal tumor/medulloblastoma. Clin Cancer Res 7:2425-2433 Gupta N, Banerjee A, Haas-Kogan D (Eds.) (2010) Pediatric CNS Tumors, Second Edition. Heidelberg: Springer Gustafsson G, Heyman M, Vernby A (Eds.) (2007) Childhood cancer incidence and survival in Sweden 1984–2005. Report 2007 from the Swedish childhood cancer registry. Stockholm: Karolinska Institutet Herms J, Neidt I, Lüscher B, Sommer A, Schürmann P, Schröder T, Bergmann M, Wilken B, Probst-Cousin S, Hernaiz-Driever P, Behnke J, Hanefeld F, Pietsch T, Kretzschmar HA (2000) C-myc expression in medulloblastoma and its prognsotic value. Int J Cancer 89:395-402 Herrington B, Kieran MW (2009) Small molecule inhibitors in children with malignant gliomas. Pediatr Blood Cancer 53:312-317 Holcakova J, Ceskova P, Hrstka R, Muller P, Dubska L, Coates PJ, Palecek E, Vojtesek B (2008) The cell type-specific effect of TAp73 isoforms on the cell cycle and apoptosis. Cell Mol Biol Lett 13:404-420 Ikawa S, Nakagawara A, Ikawa Y (1999) p53 family genes: structural comparison, expression and mutation. Cell Death Differ 6:1154-1161 Inoue T, Stuart J, Leno R, Maki CG (2002) Nuclear import and export signals in control of the p53-related protein p73. J Biol Chem 277:15053–15060 27

Ishimoto O, Kawahara C, Enjo K, Obinata M, Nukiwa T, Ikawa S (2002) Possible oncogenic potential of DeltaNp73: a newly identified isoform of human p73. Cancer Res 62:636-641 Jain S, Xu R, Prieto VG, Lee P (2010) Molecular classification of soft tissue sarcomas and its clinical applications. Int J Clin Exp Pathol 3:416-429 Jay V, Squire J, Bayani J, Alkhani AM, Rutka JT, Zielenska M (1999) Oncogene amplification in medulloblastoma: analysis of a case by comparative genomic hybridization and fluorescence in situ hybridization. Pathology 31:337-344 Jiang Y, Lo W, Akhmametyeva EM, Chang LS (2006) Over-expression of p73beta results in apoptotic death of post-mitotic hNT neurons. J Neurol Sci 240:1-6 Kågedal B (2009) Detecting minimal residual disease in neuroblastoma: still a ways to go. Clin Chem 55:1268-1270 Kaghad M, Bonnet H, Yang A, Creancier L, Biscan JC, Valent A, Minty A, Chalon P, Lelias JM, Dumont X, Ferrara P, McKeon F, Caput D (1997) Monoallelically expressed gene related to p53 at 1p36, a region frequently deleted in neuroblastoma and other human cancers. Cell 90:809-819 Kamiya M, Nakazato Y (2002) The expression of p73, p21 and MDM2 proteins in gliomas. J Neurooncol 59:143-149 Keller FG, Castellino SM, Nachman JB (2009) What is the best treatment for children with limited-stage Hodgkin lymphoma? Curr Hematol Malig Rep 4:129-135 Kim EJ, ParkJS, Um SJ (2007) Filamin A negatively regulates the transcriptional activity of p73α in the cytoplasm. Biochem Biophys Res Commun 362: 1101-1106 Kool M, Koster J, Bunt J, Hasselt NE, Lakeman A, van Sluis P, Troost D, Meeteren NS, Caron HN, Cloos J, Mrsić A, Ylstra B, Grajkowska W, Hartmann W, Pietsch T, Ellison D, Clifford SC, Versteeg R (2008) Integrated genomics identifies five medulloblastoma subtypes with distinct genetic profiles, pathway signatures and clinicopathological features. PLoS One 3:e3088 Krskova L, Mrhalova M, Hilska I, Sumerauer D, Drahokoupilova E, Mudry P, Kodet R (2010) Detection and clinical significance of bone marrow involvement in patients with rhabdomyosarcoma. Virchows Arch 456:463-472 Krskova L, Mrhalova M, Sumerauer D, Kodet R (2006) Rhabdomyosarcoma: molecular diagnostics of patients classified by morphology and immunohistochemistry with emphasis on bone marrow and purged peripheral blood progenitor cells involvement. Virchows Arch 448:449-458 Kucerova H, Stejskalova E, Vicha A, Tichy M, Chanova M, Sumerauer D, Koutecky J, Eckschlager T (2000) Gene aberrations in childhood brain tumors. Folia Biol (Praha) 46:187-190 Lamont JM, McManamy CS, Pearson AD, Clifford SC, Ellison DW (2004) Combined histopathological and molecular cytogenetic stratification of medulloblastoma patients. Clin Cancer Res 10:5482-5493

28

Lee AF, Ho DK, Zanassi P, Walsh GS, Kaplan DR, Miller FD (2004) Evidence that DeltaNp73 promotes neuronal survival by p53-dependent and p53-independent mechanisms. J Neurosci 24:9174-9184 Lo WD, Akhmametyeva EM, Zhu L, Friesen PD, Chang LS (2003) Induction of apoptosis by the p53-related p73 and partial inhibition by the baculovirus-encoded p35 in neuronal cells. Brain Res Mol Brain Res 113:1-12 Loiseau H, Arsaut J, Demotes-Mainard J (1999) p73 gene transcripts in human brain tumors: overexpression and altered splicing in ependymomas. Neurosci Lett 263:173-176 MacDonald TJ, Brown KM, LaFleur B, Peterson K, Lawlor C, Chen Y, Packer RJ, Cogen P, Stephan DA (2002) Expression profiling of medulloblastoma: PDGFRA and the RAS/MAPK pathway as therapeutic targets for metastatic disease. Nat Genet 29:143-152 Mahalingam D, Mita A, Sankhala K, Swords R, Kelly K, Giles F, Mita MM (2009) Targeting sarcomas: novel biological agents and future perspectives. Curr Drug Targets 10:937-949 Malakho SG, Korshunov A, Stroganova AM, Poltaraus AB (2008) Fast detection of MYCN copy number alterations in brain neuronal tumors by real-time PCR. J Clin Lab Anal 22:123-130 Meyer G, Perez-Garcia CG, Abraham H, Caput D (2002) Expression of p73 and Reelin in the developing human cortex. J Neurosci 22:4973-4986 Moll UM, Riou G, Levine AJ (1992) Two distinct mechanisms alter p53 in breast cancer: mutation and nuclear exclusion. Proc Natl Acad Sci USA 89:7262–7266 Moll UM, LaQuaglia M, Bénard J, Riou G (1995) Wild-type p53 protein undergoes cytoplasmic sequestration in undifferentiated neuroblastomas but not in differentiated tumors. Proc Natl Acad Sci USA 92:4407–4411 Moll UM, Ostermeyer AG, Haladay R, Winkfield B, Frazier M, Zambetti G (1996) Cytoplasmic sequestration of wild-type p53 protein impairs the G1 checkpoint after DNA damage. Mol Cell Biol 16:1126-1137 Moll UM, Slade N (2004) p63 and p73: roles in development and tumor formation. Mol Cancer Res 2:371-386 Mudry P, Mazanek P, Zitterbart K (2009) Molekulárně genetické změny u sarkomů měkkých tkání a jejich využití v klinické praxi. Ortopedie 3:137-139 Müller M, Schilling T, Sayan AE, Kairat A, Lorenz K, Schulze-Bergkamen H, Oren M, Koch A, Tannapfel A, Stremmel W, Melino G, Krammer PH (2005) TAp73/DeltaNp73 influences apoptotic response, chemosensitivity and prognosis in hepatocellular carcinoma. Cell Death Differ 12:1564-1577 Müller M, Schilling T, Sayan AE, Kairat A, Lorenz K, Schulze-Bergkamen H, Oren M, Koch A, Tannapfel A, Stremmel W, Melino G, Krammer PH (2005) TAp73/∆Np73 influences apoptotic response, chemosensitivity and prognosis in hepatocellular carcinoma. Cell Death Differ 12: 1564-1577

29

Neben K, Korshunov A, Benner A, Wrobel G, Hahn M, Kokocinski F, Golanov A, Joos S, Lichter P (2004) Microarray-based screening for molecular markers in medulloblastoma revealed STK15 as independent predictor for survival. Cancer Res 64:3103-3111 Nenutil R, Smardova J, Pavlova S, Hanzelkova Z, Muller P, Fabian P, Hrstka R, Janotova P, Radina M, Lane DP, Coates PJ, Vojtesek B (2005) Discriminating functional and non-functional p53 in human tumours by p53 and MDM2 immunohistochemistry. J Pathol 207:251-259 Northcott PA, Korshunov A, Witt H, Hielscher T, Eberhart CG, Mack S, Bouffet E, Clifford SC, Hawkins CE, French P, Rutka JT, Pfister S, Taylor MD (2010) Medulloblastoma Comprises Four Distinct Molecular Variants. J Clin Oncol [Epub ahead of print] Nozaki M, Tada M, Kashiwazaki H, Hamou MF, Diserens AC, Shinohe Y, Sawamura Y, Iwasaki Y, de Tribolet N, Hegi ME (2001) p73 is not mutated in meningiomas as determined with a functional yeast assay but p73 expression increases with tumor grade. Brain Pathol 11:296-305 Oeffinger KC, Nathan PC, Kremer LC (2010) Challenges after curative treatment for childhood cancer and long-term follow up of survivors. Hematol Oncol Clin North Am 24:129-149 Oswald C, Stiewe T (2008) In good times and bad: p73 in cancer. Cell Cycle 7:1726-1731 Packer RJ, Vezina G (2008) Management of and prognosis with medulloblastoma: therapy at a crossroads. Arch Neurol 65:1419-1424 Pasquier E, Kavallaris M, André N (2010) Metronomic chemotherapy: new rationale for new directions. Nat Rev Clin Oncol 7:455-465 Pfister S, Remke M, Benner A, Mendrzyk F, Toedt G, Felsberg J, Wittmann A, Devens F, Gerber NU, Joos S, Kulozik A, Reifenberger G, Rutkowski S, Wiestler OD, Radlwimmer B, Scheurlen W, Lichter P, Korshunov A (2009) Outcome prediction in pediatric medulloblastoma based on DNA copy-number aberrations of chromosomes 6q and 17q and the MYC and MYCN loci. J Clin Oncol 27:16271636 Pfister SM, Korshunov A, Kool M, Hasselblatt M, Eberhart C, Taylor MD (2010) Molecular diagnostics of CNS embryonal tumors. Acta Neuropathol 120:553-566 Pizzo PA, Poplack DG (Eds.) (2002) Principles and Practice of Pediatric Oncology. Fourth Edition. Philadelphia: Lippincott Williams and Wilkins Pomeroy SL, Tamayo P, Gaasenbeek M, Sturla LM, Angelo M, McLaughlin ME, Kim JY, Goumnerova LC, Black PM, Lau C, Allen JC, Zagzag D, Olson JM, Curran T, Wetmore C, Biegel JA, Poggio T, Mukherjee S, Rifkin R, Califano A, Stolovitzky G, Louis DN, Mesirov JP, Lander ES, Golub TR (2002) Prediction of central nervous system embryonal tumour outcome based on gene expression. Nature 415:436-442

30

Pozniak CD, Radinovic S, Yang A, McKeon F, Kaplan DR, Miller FD (2000) An antiapoptotic role for the p53 family member, p73, during developmental neuron death. Science 289:304-306 Pützer BM, Tuve S, Tannapfel A, Stiewe T (2003) Increased DeltaN-p73 expression in tumors by upregulation of the E2F1-regulated, TA-promoter-derived DeltaN'-p73 transcript. Cell Death Differ 10:612-614 Rasheed BK, Bigner SH (1991) Genetic alterations in glioma and medulloblastoma. Cancer Metastasis Rev 10:289-299 Rosenbluth JM, Johnson K, Tang L, Triplett T, Pietenpol JA (2009) Evaluation of p63 and p73 antibodies for cross-reactivity. Cell Cycle 8:3702-3706 Rutkowski S, von Bueren A, von Hoff K, Hartmann W, Shalaby T, Deinlein F, WarmuthMetz M, Soerensen N, Emser A, Bode U, Mittler U, Urban C, Benesch M, Kortmann RD, Schlegel PG, Kuehl J, Pietsch T, Grotzer M (2007) Prognostic relevance of clinical and biological risk factors in childhood medulloblastoma: results of patients treated in the prospective multicenter trial HIT'91. Clin Cancer Res 13:2651-2657 Ryott M, Wangsa D, Heselmeyer-Haddad K, Lindholm J, Elmberger G, Auer G, Avall Lundqvist E, Ried T, Munck-Wikland E (2009) EGFR protein overexpression and gene copy number increases in oral tongue squamous cell carcinoma. Eur J Cancer 45:1700-1708 Saifudeen Z, Diavolitsis V, Stefkova J, Dipp S, Fan H, El-Dahr SS (2005) Spatiotemporal switch from deltaNp73 to TAp73 isoforms during nephrogenesis: impact on differentiation gene expression. J Biol Chem 280:23094-23102 Sayan AE, Paradisi A, Vojtesek B, Knight RA, Melino G, Candi E (2005) New antibodies recognizing p73: comparison with commercial antibodies. Biochem Biophys Res Commun 330:186-193 Scheurlen WG, Schwabe GC, Joos S, Mollenhauer J, Sörensen N, Kühl J (1998) Molecular analysis of childhood primitive neuroectodermal tumors defines markers associated with poor outcome. J Clin Oncol 16:2478–2485 Stearns D, Chaudhry A, Abel TW, Burger PC, Dang CV, Eberhart CG (2006) c-myc overexpression causes anaplasia in medulloblastoma. Cancer Res 66:673-681 Stiewe T, Tuve S, Peter M, Tannapfel A, Elmaagacli AH, Pützer BM (2004) Quantitative TP73 transcript analysis in hepatocellular carcinomas. Clin Cancer Res 10:626-633 Sumerauer D, Vicha A, Kucerova H, Kodet R, Houskova J, Bedrnicek J, Eckschlager T (2001) Detection of minimal bone marrow infiltration in patients with localized and metastatic Ewing sarcoma using RT-PCR. Folia Biol (Praha) 47:206-210 Swerdlow SH, Campo E, Harris NL (Eds.) (2008) WHO Classification of Tumours of Haematopoietic and Lymphoid Tissues. Lyon: IARC Štěrba J (2009) Dětská onkologie – slovo úvodem. Onkologie 4:212 Thompson MC, Fuller C, Hogg TL, Dalton J, Finkelstein D, Lau CC, Chintagumpala M, Adesina A, Ashley DM, Kellie SJ, Taylor MD, Curran T, Gajjar A, Gilbertson RJ

31

(2006) Genomics identifies medulloblastoma subgroups that are enriched for specific genetic alterations. J Clin Oncol 24:1924-1931 Tissir F, Ravni A, Achouri Y, Riethmacher D, Meyer G, Goffinet AM (2009) DeltaNp73 regulates neuronal survival in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 106:16871-16876 Tomasini R, Tsuchihara K, Wilhelm M, Fujitani M, Rufini A, Cheung CC, Khan F, ItieYouten A, Wakeham A, Tsao MS, Iovanna JL, Squire J, Jurisica I, Kaplan D, Melino G, Jurisicova A, Mak TW (2008) TAp73 knockout shows genomic instability with infertility and tumor suppressor functions. Genes Dev 22:26772691 Tomlinson FH, J enkins RB, Scheithauer BW, Keelan PA, Ritland S, Parisi JE, Cunningham J, Olsen KD (1994) Aggressive medulloblastoma with high-level Nmyc amplification. Mayo Clin Proc 69:359-365 Torres J, Regan PL, Edo R, Leonhardt P, Jeng EI, Rappaport EF, Ikegaki N, Tang XX (2010) Biological effects of induced MYCN hyper-expression in MYCN-amplified neuroblastomas. Int J Oncol 37:983-991 Ugur H, Sayan AE, Ozdamar SO, Kanpolat Y, Ozturk M (2004) Expression of TAP73 and DeltaNP73 in malignant gliomas. Oncol Rep 11:1337-1341 Uramoto H, Sugio K, Oyama T, Nakata S, Ono K, Morita M, Funa K, Yasumoto K (2004) Expression of DeltaNp73 predicts poor prognosis in lung cancer. Clin Cancer Res 10:6905–6911 Vardiman JW, Thiele J, Arber DA, Brunning RD, Borowitz MJ, Porwit A, Harris NL, Le Beau MM, Hellström-Lindberg E, Tefferi A, Bloomfield CD (2009) The 2008 revision of the World Health Organization (WHO) classification of myeloid neoplasms and acute leukemia: rationale and important changes. Blood 114:937951 Vella V, Zhu J, Frasca F, Li CY, Vigneri P, Vigneri R, Wang JY (2003) Exclusion of cAbl from the nucleus restrains the p73 tumor suppression function. J Biol Chem 278:25151-25157 Vilgelm AE, Hong SM, Washington MK, Wei J, Chen H, El-Rifai W, Zaika A (2010) Characterization of DeltaNp73 expression and regulation in gastric and esophageal tumors. Oncogene [Epub ahead of print] Vogelstein B, Lane D, Levine AJ (2000) Surfing the p53 network. Nature 408:307-310 von Hoff K, Hartmann W, von Bueren AO, Gerber NU, Grotzer MA, Pietsch T, Rutkowski S (2010) Large cell/anaplastic medulloblastoma: outcome according to myc status, histopathological, and clinical risk factors. Pediatr Blood Cancer 54:369-376 Wager M, Guilhot J, Blanc JL, Ferrand S, Milin S, Bataille B, Lapierre F, Denis S, Chantereau T, Larsen CJ, Karayan-Tapon L (2006) Prognostic value of increase in transcript levels of Tp73 DeltaEx2-3 isoforms in low-grade glioma patients. Br J Cancer 95:1062-1069 Wilson C, Henry S, Smith MA, Bowser R (2004) The p53 homologue p73 accumulates in the nucleus and localizes to neurites and neurofibrillary tangles in Alzheimer disease brain. Neuropathol Appl Neurobiol 30: 19-29 32

Wolter J, Angelini P, Irwin M (2010) p53 family: Therapeutic targets in neuroblastoma. Future Oncol 6:429-444 Yang A, Kaghad M, Wang Y, Gillett E, Fleming MD, Dötsch V, Andrews NC, Caput D, McKeon F (1998) p63, a p53 homolog at 3q27-29, encodes multiple products with transactivating, death-inducing, and dominant-negative activities. Mol Cell 2:305316 Yang A, Walker N, Bronson R, Kaghad M, Oosterwegel M, Bonnin J, Vagner C, Bonnet H, Dikkes P, Sharpe A, McKeon F, Caput D (2000) p73-deficient mice have neurological, pheromonal and inflammatory defects but lack spontaneous tumours. Nature 404:99-103 Zaika AI, Slade N, Erster SH, Sansome C, Joseph TW, Pearl M, Chalas E, Moll UM (2002) DeltaNp73, a dominant-negative inhibitor of wild-type p53 and TAp73, is up-regulated in human tumors. J Exp Med 196:765-780

33

Přílohy  Práce I)   Zitterbart  K,  Pavelka  Z,  Štěrba  J  (2010)  Nádory  centrálního  nervového  systému.  In  Adam Z, Krejčí M, Vorlíček J (Eds.) Speciální onkologie ‐ Příznaky, diagnostika a léčba  maligních chorob. 1. vydání. Praha: Galén. pp. 355‐360 

34

35

36

37

38

39

40

Práce II)  Zitterbart  K,  Pavelka  Z,  Zitterbartová  J  (2010)  Meduloblastom:  nejčastější  zhoubný  nádor mozku u dětí. Onkologie 4:256‐259 

41

42

43

44

Práce III) 

Zitterbart K, Zavrelova I, Kadlecova J, Spesna R, Kratochvilova A, Pavelka Z, Sterba J  (2007)  p73  expression  in  medulloblastoma:  TAp73/∆Np73  transcript  detection  and  possible  association  of  p73α/∆Np73  immunoreactivity  with  survival.  Acta  Neuropathologica 114:641‐650. IF 2007 = 3,179 

45

46

47

48

49

50

51

52

53

54

55

56

57

Práce IV) 

#Nekulova  M,  #Zitterbart  K,  Sterba  J,  Veselska  R  (2010)  Analysis  of  the  intracellular 

localization  of  p73  N‐terminal  protein  isoforms  TAp73  and  ∆Np73  in  medulloblastoma cell lines. Journal of Molecular Histology 41:267‐275 (#contributed  equally). IF 2009 = 1,752  

58

59

60

61

62

63

64

65

66

67

Práce V) 

Zitterbart K, Filkova H, Tomasikova L, Necesalova E, Zambo I, Kantorova D, Slamova I,  Vranova V, Zezulkova D, Pesakova M, Pavelka Z, Veselska R, Kuglik P, Sterba J (2010)  Low‐level  copy  number  changes  of  MYC  genes  have  a  prognostic  impact  in  medulloblastoma. Journal of Neuro‐Oncology 2010 Jul 8. [Epub ahead of print] IF  2009  = 2,752 

68

69

70

71

72

73

74

75

76

77