MASARYKOVA UNIVERZITA. Lékařská fakulta BAKALÁŘSKÁ PRÁCE Daniela Petříková

MASARYKOVA UNIVERZITA Lékařská fakulta

BAKALÁŘSKÁ PRÁCE

2014

Daniela Petříková

Masarykova univerzita Lékařská fakulta

Význam stanovení biochemických parametrů u septických stavů

Bakalářská práce Obor zdravotní laborant

Vedoucí bakalářské práce:

Autor:

RNDr. Miroslava Beňovská, Ph.D.

Daniela Petříková

Brno, duben 2014

Jméno a příjmení autora:

Daniela Petříková

Název bakalářské práce:

Význam stanovení biochemických parametrů u septických stavů

Pracoviště:

Oddělení klinické biochemie FN Brno

Vedoucí bakalářské práce: RNDr. Miroslava Beňovská, Ph.D.

Rok obhajoby bakalářské práce:

2014

Souhrn: Bakalářská práce se zabývá stanovením biochemických parametrů u septických stavů. Septické stavy jsou významnou komplikací velké řady onemocnění u dospělých i dětí. Mezi nejvíce využívané parametry patří C-reaktivní protein, prokalcitonin a nově i presepsin. V teoretické části jsou zahrnuty poznatky o sepsi a jednotlivých parametrech. V praktické části byly změřeny hodnoty presepsinu u souboru pacientů z různých oddělení FN Brno. Tyto hodnoty byly porovnány s hodnotami CRP a prokalcitoninu, které u těchto pacientů byly již dříve analyzovány. Klíčová slova: Presepsin, CRP, Prokalcitonin, Sepse, PATHFAST

Souhlasím, aby práce byla půjčována ke studijním účelům a byla citována dle platných norem.

Prohlašuji, že jsem bakalářskou práci vypracovala samostatně pod vedením RNDr. Miroslavy Beňovské, Ph.D. a uvedla v seznamu literatury všechny použité literární a odborné zdroje.

V Brně dne .......................

.................................................. (vlastnoruční podpis autora)

Tato práce vznikla za podpory projektu BiochemNet – Vytvoření sítě pro podporu spolupráce biochemických pracovišť a zvýšení uplatnitelnosti absolventů biochemických oborů v praxi (registrační číslo CZ.1.07/2.4.00/31.0133). Projekt je realizován v rámci Operačního programu vzdělávání pro konkurenceschopnost, který je spolufinancovaný z Evropského sociálního fondu a státního rozpočtu ČR.

Poděkování Touto cestou bych ráda poděkovala RNDr. Miroslavě Beňovské, Ph.D. za odborné vedení při psaní bakalářské práce, za věnovaný čas a za cenné rady. Za spolupráci děkuji panu primáři MUDr. Jiřímu Žurkovi, Ph.D. z Kliniky dětské anesteziologie a resuscitace. Také děkuji celému kolektivu laborantek z Oddělení klinické biochemie za jejich pomoc a trpělivost při sběru dat.

Použité symboly a zkratky CRP

C-reaktivní protein

PCT

Prokalcitonin

SIRS

Systemic inflammatory response syndrome Systémové zánětlivé odpovědi organismu

MODS

Multiple organ dysfunction syndrome Syndrom mnohočetného orgánového selhání

TNF

Tumor necrosis factor Faktor nádorové nekrózy

IL-6

Interleukin 6

VAP

Ventilator-associated bronchopneumonia S ventilátorem asociovaná pneumonie

CD14

Cluster of differentiation 14

LPS

Lipopolysacharid

LBP

Lipopolysaccharide binding protein Lipopolysacharidy vázající protein

TLR4

Toll-like receptor 4

TRACE

Time-Resolved Amplified Cryptate Emission

POCT

Point of care testing Testování v místě péče o pacienta

ECLIA

Electro-chemiluminiscence immunoassay Elektrochemiluminiscenční imunoanalýza

SOFA

Sepsis-related organ failure assessment

Obsah 1. Cíle a hypotéza ...................................................................................................................................11 1.1 Cíle práce ......................................................................................................................................11 1.2 Hypotéza ......................................................................................................................................11 2. Sepse ..................................................................................................................................................12 2.1 Definice sepse ..............................................................................................................................12 2.2 SIRS ............................................................................................................................................... 12 2.3 Stádia sepse..................................................................................................................................13 2.4 Etiologie sepse .............................................................................................................................15 2.4.1 Patogeneze sepse ..................................................................................................................15 2.4.2 Původci a zdroje sepse ..........................................................................................................16 2.5 Markery sepse ..............................................................................................................................17 2.5.1 C-reaktivní protein ................................................................................................................17 2.5.2 Prokalcitonin .........................................................................................................................18 2.5.3 Presepsin ...............................................................................................................................19 2.5.4 Interleukin-6 ..........................................................................................................................22 2.5.5 Lipopolysacharidy vázající protein ........................................................................................23 2.6 Diagnostika sepse .........................................................................................................................23 2.6.1 Klinické parametry ................................................................................................................23 2.6.2 Laboratorní parametry ..........................................................................................................24 2.7 Porovnání parametrů ...................................................................................................................26 2.7.1 Porovnání PCT a presepsinu ..................................................................................................26 2.7.2 Porovnání CRP a PCT .............................................................................................................27 3. Praktická část .....................................................................................................................................29 3.1 Přístrojové vybavení .....................................................................................................................29 3.1.1 PATHFAST ..............................................................................................................................29 3.1.2 Cobas 8000 ............................................................................................................................30 3.2 Principy stanovení a referenční rozmezí sledovaných parametrů ...............................................30 3.2.1 Stanovení Presepsinu ............................................................................................................30 3.2.2 Stanovení CRP .......................................................................................................................31 3.2.3 Stanovení PCT........................................................................................................................31 3.2.4 Referenční rozmezí ...............................................................................................................32 3.3 Opakovatelnost a mezilehlá přesnost ..........................................................................................32 3.4 Sběr dat a popis souboru .............................................................................................................34

3.5 Postup stanovení presepsinu .......................................................................................................35 3.5.1 Kalibrace a QC .......................................................................................................................35 3.5.2 Postup měření Presepsinu ....................................................................................................36 3.6 Výsledky .......................................................................................................................................37 3.6.1 Kazuistiky...............................................................................................................................37 3.6.2 PCT, CRP a presepsin při přijetí .............................................................................................45 3.6.3 Statistické vyhodnocení ........................................................................................................47 4. Diskuze ............................................................................................................................................... 52 5. Závěr ...................................................................................................................................................54 6. Seznam použité literatury ..................................................................................................................55 7. Přílohy ................................................................................................................................................ 59

Úvod Septické stavy jsou významnou komplikací velkého množství onemocnění u pacientů v dětském i dospělém věku. Touto problematikou se zabývají lékaři napříč velkým množstvím medicínských oborů a snaží se najít vhodný marker pro diagnostiku a monitorování sepse. V laboratorní diagnostice nejčastěji využíváme stanovení C-reaktivního proteinu a prokalcitoninu, v literatuře se stále popisují nějaké nové parametry. V současné době je velmi diskutovaným parametrem presepsin. Hlavním cílem této bakalářské práce je porovnat běžně stanovované parametry, kterými jsou CRP a PCT s presepsinem.

10

1. Cíle a hypotéza 1.1 Cíle práce:

1. Sumarizovat současné poznatky o septických stavech včetně informací o biochemických parametrech využívaných při diagnostice a prognóze sepse

2. Zvládnout metodiky stanovení presepsinu, prokalcitoninu a CRP

3. U pacientů vybraných z databáze OKB FN Brno stanovit presepsin

4. Získané výsledky statisticky zpracovat, porovnat a vyhodnotit diagnostické a prognostické vlastnosti sledovaných parametrů

1.2 Hypotéza:

Na základě výsledků stanovení presepsinu a prokalcitoninu je možné přispět k určení diagnózy a prognózy u pacientů v septickém stavu.

11

Teoretická část 2. Sepse 2.1 Definice sepse Sepse je obranný mechanismus, který má za cíl eliminovat zdroj infekce a zabránit jejímu šíření. V některých případech může dojít k zánětlivému procesu i na nepostižených orgánech. To může vést k rozvoji orgánové dysfunkce a v konečném důsledku k porušení integrity orgánových funkcí s následkem smrti nemocného [2]. Sepse je automaticky spojována s mikroby, ale toto slovo vzniklo ještě dříve, než došlo k porozumění nemocem, které mají mikrobiální původ. Slovo sepse pochází z řeckého slova „sepsios“, které lze přeložit jako shnilý, prohnilý nebo rozklad [1]. V minulosti vznikla řada definic sepse. To vedlo k terminologické nejednotnosti, která zhoršovala diagnostiku jednotlivých stádií sepse. V roce 1992 dospěla konsenzuální konference v USA k definici SIRS (syndrom systémové zánětlivé odpovědi) a stádií sepse, která jsou uznávána v současné době. Sepse se definuje jako systémová odpověď na infekci [3]. Sepsi je možné definovat i jako specifický typ SIRS (musí být splněna dvě či více níže zmíněných kritérií SIRS), kdy je možné dokázat invazi patogenních nebo potenciálně patogenních mikroorganismů v normálně sterilní tkáni, tekutině nebo tělesné dutině hostitele. Pokud má pacient známky infekce, ale nesplňuje kritéria SIRS, o sepsi se nejedná [1, 32].

2.2 SIRS SIRS je syndrom systémové zánětlivé odpovědi organismu. SIRS vzniká jako odpověď organismu na různé škodliviny. Tyto škodliviny mohou mít původ vnitřní nebo zevní. Mezi zevní noxy patří faktory fyzikální (mechanické, tepelné, radiační), chemické (toxiny organického a anorganického původu) nebo biologické (bakterie, viry, plísně, houby). Příkladem vnitřních nox jsou tkáňové nekrózy, trombózy, ischemické a hemoragické tkáňové infarzace apod. [1]. Definice SIRS vznikla, aby bylo možné definovat nespecifickou reakci infekčního nebo neinfekčního původu. SIRS je potvrzena, pokud jsou splněna dvě nebo více z následujících proměnných: •

teplota více než 38°C nebo méně než 36°C

•

tepová frekvence nad 90/min 12

•

dechová frekvence nad 20/min nebo pCO2 pod 32 mmHg

•

množství leukocytů nad 12 000/µl nebo pod 4 000/µl 000/ nebo více jak 10% nezralých forem [4-5] [4

2.3 Stádia sepse Vznikly dva možné způsoby dělení stadií sepse. Starší způsob dělení stádií sepse vznikl v roce 1979. Siegel a Cerra definovali čtyři stádia sepse na základě současného sledování hemodynamických a biochemických změn. Pokud bereme v úvahu především klinické parametry, průběh sepse se dělí na tři stádia. Toto dělení vzniklo v roce 1992 na konsenzuální konsenzuální konferenci v USA. Stádia sepse podle Consensus Conference (1992): (1992) •

sepse

•

těžká sepse

•

septický šok [3]

Sepse je syndrom systémové zánětlivé odpovědi v přítomnosti nebo jako důsledek předpokládané nebo nebo prokázané infekce [6]. Těžká sepse má příznaky znaky jako u sepse (dvě či více výše zmíněná kritéria SIRS a dokázaná invaze mikroorganismů) mikroorganismů) společně se změnami chování a/nebo a/nebo vědomí vědomí.. Dále jsou tu příznaky dysfunkce nebo hypoperfúze orgánů, hypotenze, laktátová acidóza, oligurie, pokles počtu dysfunkce krevních destiček. Obrázek č. 1: SIRS, sepse, těžká sepse, septický šok [6]

13

Septický šok má příznaky uvedené v předchozích dvou skupinách. Je považován za součást těžké sepse a vzniká její další progresí. Hypotenze však nereaguje zvýšením krevního tlaku na vybalancované doplnění objemu kolující tekutiny a příznaky hypoperfúze orgánů trvají [3, 32]. Při rozhodování, o které stádium sepse se jedná, můžeme použít následující tabulku: Tabulka 1: Stadia sepse podle Consensus Conference, USA 1992, [3] Příznak sepse alterace chování/vědomí horečka > 38,3°C nebo hypotermie < 36°C + tachypnoe > 20/min nebo pCO2 < 4,3 kPa + tachykardie > 90/min + leukocyty > 12x109/l nebo < 4x109/l nebo + > 10% tyčkových forem dysfunkce nebo hypoperfúze orgánů hypotenze reakce hypotenze na doplnění objemu tekutin

těžká sepse + + + + + + + +

septický šok + + + + + + + -

Stádia sepse podle Siegela a Cerry: •

stadium A

•

stadium B

•

stadium C

•

stadium D

Pro stadium A je charakteristický zvýšený příjem kyslíku a tvorba laktátu. Ke zvýšené tvorbě laktátu přispívá blok glykolýzy na úrovni pyruvátu, i když je kyslík dostupný. Laktát je játry využíván ke glukoneogenezi, a proto nedochází k laktátémii. Lipolýza zatím probíhá, organismus využívá jako zdroj energie β-oxidaci a produkci ketolátek. Tvorba močoviny je zvýšená, ale katabolismus a negativita dusíkové bilance je v normě. Acidobazická rovnováha je víceméně normální. Množství triacylglycerolů nestoupá, ale preventivně můžeme podávat tukové emulze, které pak můžou být energeticky využity. Ve stadiu B je snížený příjem kyslíku tkáněmi. Díky nedostatečnému zpracování laktátu játry dochází k hyperlaktátémii. Klesá lipolýza, snižuje se produkce ketolátek i β-oxidace a tuky nemůžeme využít jako zdroj energie. Přívod tukových emulzí není možní kvůli zvýšenému množství triacylglycerolů. Pro glukoneogenezi jsou využívány aminokyseliny vzniklé při katabolismu bílkovin z tkání. Tento proces se nazývá septický autokanibalismus. Stoupá množství vylučované urey až na 800-1100 mmol/den, je zvýšená negativita dusíkové bilance. Pokud dojde ke zkatabolizování 40% bílkovin myokardu, hrozí srdeční selhání. Vzniká metabolická acidóza a respirační alkalóza, která přechází v respirační acidózu, není-li pacient uměle ventilován. Srdeční frekvence, kontraktilita myokardu i srdeční minutový objem se zvyšuje, ale klesá odpor v periferním cévním řečišti. 14

Ve stadiu C a stadiu D dochází k poklesu středního arteriálního tlaku a tento pokles vede až k multiorgánové dysfunkci a selhání organismu [3]. Tabulka 2: Dělení sepse (podle Siegela a Cerry) [3] Stadium A kompenzovaná sepse Stadium B metabolická insuficience Stadium C respirační insuficience Stadium D kardiální insuficience

Stresová odpověď jako po traumatu nebo po větší operaci. Zvýšený srdeční výdej, frekvence a kontraktilita. Zvýšená spotřeba kyslíku. Bez metabolických abnormalit. Hyperdynamický oběh zvýrazněn. Klesá extrakce kyslíku, není pokryta potřeba periferie. Metabolická acidóza. Vývoj hypotenze při normálním či zvýšeném srdečním výdeji. Další pokles arteriálního vaskulárního tonu. Respirační insuficience. Hypotenze se prohlubuje. Klesá srdeční výdej a kontraktilita. Městnání v malém oběhu. Krytí potřeb periferie dále zhoršeno.

2.4 Etiologie sepse Sepse je reakce organismu na infekci. V případě normální reakce imunitního systému dochází ke zničení patogenů, ale sepse vzniká právě díky tomu, že jsou tyto běžné reakce nevhodně regulovány [26].

2.4.1 Patogeneze sepse

Na počátku infekce, kdy se mikroby začínají množit, jsou zánětlivé změny jen lokální a aktivují se imunitní mechanismy. To, jak se bude infekce dále rozvíjet, závisí na mnoha okolnostech, např. genetických faktorech (ovlivňují tvorbu a hladinu cytokinů IL-1, IL-6, IL10 a TNF), léčbě (steroidy, cyklosporinem A), věku pacienta a dietě. Pokud se v časné fázi zánětu objeví silná odpověď v podobě tvorby cytokinů, aktivují se dostatečně rychle a intenzivně makrofágy a granulocyty, které mikroby z větší části fagocytují a zničí. V pozdní fázi zánětu je pak v krevním systému jen malé množství mikrobů, hladina cytokinů se snižuje a k sepsi nedochází. Mikroby jsou z cirkulace postupně odstraněny systémem mononukleárních fagocytů. Pokud nedojde k dostatečně silné cytokinové reakci na počátku infekce, aktivace makrofágů a stimulace granulocytů je nedostatečná, značná část mikrobů v cirkulaci zůstává a dochází k jejich pomnožení. V pozdní fázi zánětu koluje v krvi velké množství mikrobů, organismus na to reaguje zvyšujícími se hladinami cytokinů a objevuje se syndrom systémové odpovědi na zánět [28]. Zánětlivá odpověď je blízce spjatá s koagulačním systémem. Oba systémy se spojují na endoteliální buňce. Působením prozánětlivých cytokinů na endoteliální buňky dojde k uvolnění tkáňového faktoru. Tkáňový faktor aktivuje faktor VII a dojde k uvolňování destičky aktivujícího faktoru. Faktor VII je spouštěč koagulace zevní cestou. Za normálních okolností je koagulace regulována, ale u sepse jsou hladiny látek, které inhibují prokoagulační 15

enzymy sníženy. Tyto inhibitory se starají o to, aby koagulace probíhala jen v místě poranění endotelu. Inaktivace nebo nedostatečný účinek inhibitorů koagulace vede ke vzniku mikrotrombů, které se mohou šířit do vzdálených orgánů a způsobit jejich dysfunkci až selhání [1]. Obrázek č. 2: Vztahy SIRS, infekce a sepse a jejich hlavní příčiny [3]

2.4.2 Původci a zdroje sepse

To, jak se bude infekce rozvíjet, závisí na původci infekce a jeho množství v organismu, na místě, kde infekce pronikla a na stavu obranyschopnosti organismu. Mezi nejčastější původce sepse ze skupiny gramnegativních bakterií patří: Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiela pneumoniae, salmonely, enterobaktery, meningokoky a bakterie rodu Proteus. Z grampozitivních bakterií jsou nejčastějšími původci koaguláza negativní stafylokoky a enterokoky. Méně častými původci jsou viry, houby, prvoci a spirochety. Někteří pacienti léčení cytostatiky a imunosupresivy mohou také být ohroženi kandidovou sepsí [29, 33]. Nejčastější zdroje sepse jsou: centrální žilní katétr, plíce, břicho (tlusté střevo), močový trakt, měkké tkáně, rány a další. Plíce jsou ohroženy vznikem VAP (s ventilátorem asociovaná pneumonie), riziko vzniku stoupá s délkou intubace. Po chirurgickém zákroku hrozí infekce ran povrchových (kůže a podkoží), hlubokých a infekce tkání nebo orgánů při přítomnosti implantátů [33].

16

2.5 Markery sepse Mezi biochemické markery, které se v současnosti nejvíce využívají při diagnostice sepse patří: C-reaktivní protein, prokalcitonin, presepsin, interleukin-6 a lipopolysacharidy vázající protein.

2.5.1 C-reaktivní protein

C-reaktivní protein patří mezi reaktanty akutní fáze. Poprvé byl objeven Tilletem a Francisem v roce 1930 v séru nemocných s pneumokokovou pneumonií. Jeho název vznikl právě díky schopnosti precipitace s tzv. C-polysacharidem pneumokoků [9]. Molekula CRP má cyklickou strukturu, skládá se z pěti podjednotek a 206 aminokyselin. Molekulová hmotnost je 118 kDa. Pozice v elektroforeogramu je v β-globulinové frakci. Gen pro CRP se nachází na dlouhém raménku 1. chromosomu. Syntéza probíhá v játrech (hepatocytech) i na jiných místech organismu např. v endotelu nebo v lymfocytech, kde je důležitá stimulace prozánětlivými cytokiny, zejména interleukinem 6 za spolu působení interleukinu 1 [10]. Biologickou funkcí CRP je odstranění látek, které by mohly působit jako alergeny. Váže se na endogenní i exogenní ligandy (např. mikroorganismy), na vlastní poškozené buňky a jejich produkty, aby mohlo dojít k jejich odstranění. Eliminaci těchto látek, po opsonizaci CRP, zajistí komplement a fagocytóza [35]. Referenční rozmezí: 0,0-5,0 mg/l. Vzestup od 6 hodin po zánětlivém stimulu, v průběhu 24-48 hodin dochází k maximální reakci na zátěž. Jeho hodnota může dosáhnout až mnoha set mg/l. K nejvýraznějším změnám hladiny CRP dochází při bakteriální infekci, u virových infekcí je vzestup hladiny relativně malý. CRP reaguje i na jiné typy zátěže např.: chirurgický zákrok, poranění, infarkt myokardu apod. [8]. K indikacím stanovení patří např.: •

včasná diagnostika bakteriálních infekcí novorozence

•

sledování průběhu bakteriální infekce

•

odlišení bakteriálního a virového zánětu

•

včasný záchyt hnisavých komplikací po operaci

•

odlišení bakteriálního zánětu močových cest od pyelonefritidy

•

sledování průběhu a aktivity revmatických chorob a maligních onemocnění

•

změna antibiotik při přetrvávajících vysokých hladinách [7] 17

V diagnostice se využívá dynamika změn v závislosti na stavu, rozsahu a průběhu zánětlivé reakce. Hladina CRP odráží aktivaci cytokinové kaskády. Je to citlivý, ale nespecifický marker, ke stimulaci stačí malá zánětlivá reakce. Hladiny CRP 3. a 5. den po operaci jsou považovány za prognostický faktor z hlediska ohrožení septickou komplikací. Očekává se pokles hladiny CRP 5. den po operaci [11]. CRP splňuje požadavky kladené na biomarker díky těmto jeho vlastnostem: •

je stabilní a snadno stanovitelný s možností automatizace

•

jsou definovány jeho biologické vlastnosti-senzitivita a specifičnost

•

rychlý nárůst hladiny při vzniku a rychlý pokles při útlumu zánětu [10]

Nevýhodou CRP je jeho nízká specifita. Informuje pouze o přítomnosti infekce, ne o stupni orgánového zatížení [9].

2.5.2 Prokalcitonin

Prokalcitonin se v poslední době začíná využívat ve výzkumu i klinické praxi jako reaktant akutní fáze. Je to bílkovina složená ze 116 aminokyselin a jeho molekulová hmotnost je 13 kDa [13]. Obrázek č. 3: Prokalcitonin [16]

V roce 1975 byly objeveny intracelulární prekurzory kalcitoninu a jeho štěpné produkty, kam patří i PCT. Struktura PCT jako glykoproteinu byla objasněna až v roce 1981. První zmínka o využití PCT v akutní medicíně je z roku 1993, kdy byly zaznamenány jeho vysoké hodnoty u septického pacienta. V roce 1994 byl za hlavního stimulátora sekrece označen bakteriální endotoxin. V roce 2000 byl nalezen zdroj syntézy v játrech [12]. 18

Rozlišujeme zánětlivý a nezánětlivý PCT. Oba kóduje stejný gen a mají i stejnou strukturu, ale liší se místem vzniku. Prokalcitonin, který vzniká v těle fyziologicky a je prekurzorem kalcitoninu je tvořený v C buňkách štítné žlázy. Není detekovatelný v krvi. Zánětlivý prokalcitonin je tvořen extratyroidálně (játra, plíce, ledviny…) a není konvertován na kalcitonin. I když je zánětlivý PCT tvořen v játrech nebo ledvinách, jeho hladina nekoreluje s biochemickými ukazateli jaterní nebo ledvinné insuficience. Syntéze je stimulována zejména bakteriálním endotoxinem, pravděpodobně prostřednictvím cytokinů (IL-6, IL-1, TNF-α) [14, 16]. Referenční rozmezí PCT je do 0,5 ng/ml. Hladina PCT reaguje na zánětlivé agens během 2-3 hodin a maxima dosahuje za 6-12 hodin po reakci na endotoxin [12, 15]. Tabulka 3: Rozsah hodnot PCT a jejich vztah ke klinickému stavu [14] Koncentrace PCT [ng/ml] do 0,5

Interpretace pro dospělé a děti starší 48 hodin Zdravá populace

0,5-2,0

Lokalizovaná infekce, virová, mykotická infekce, chronický zánět, SIRS Systémová bakteriální infekce, intenzivní nebakteriální SIRS Těžká sepse, multiorgánové selhání

2,0-10 nad 10

V diagnostice se PCT využívá při diferenciální diagnostice zánětlivých onemocnění a horeček neznámého původu. Využíváme ho k monitorování kriticky nemocných. Kontrolujeme terapii a průběh bakteriálních infekcí, hodnotíme prognózu pacientů. Pomáhá při rozhodování, zda pokračovat nebo nepokračovat v podávání antibiotik. U novorozenců dochází po porodu k vzestupu PCT s maximem za 24 hodin a během 48 hodin hladina klesá na obvyklé hodnoty [11].

2.5.3 Presepsin

Presepsin je fragment CD14 (viz pozn. 1), který se nachází na N-terminální sekvenci CD14. Je to polypeptid s molekulovou hmotností 13 kDa. Poprvé byl definován v roce 2005. Provedené studie ukazují, že se hladina presepsinu zvyšuje v plazmě s bakteriální infekcí. Vysoké hladiny presepsinu se nacházejí u septických pacientů i pacientů s těžkou sepsí [17;24]. Poznámka 1: Zkratka CD neboli cluster of differentiation je označení pro transmembránové bílkoviny, které produkují vysoce specifické protilátky proti některým proteinům. Nazývají se CD znaky. V diagnostice se využívá toho, že některé CD znaky jsou natolik specifické pro jednotlivé typy buněk, že je můžeme využít k vyhledávání a značení těchto buněk [18]. 19

CD14 je glykoprotein, který je vyjádřený na membránovém povrchu monocytů a makrofágů. Slouží jako receptor pro komplexy lipopolysacharidů (LPS) a LPS vazebného proteinu (LBP) [19]. V případě produkce presepsinu in vivo je mnoho aspektů, které zůstávají neznámé a jsou založené na výsledcích pokusů na zvířatech [24]. Ke vzniku presepsinu dochází po navázání komplexu LPS a LBP na CD14. Tím se aktivuje toll-like receptor 4 (TLR4). Po aktivaci TLR4 se spouští specifická prozánětlivá signalizační kaskáda, která spouští zánětlivou reakci proti infekčnímu agens. Zároveň po aktivaci prozánětlivé signalizační kaskády je komplex LPS-LBP-CD14 uvolněn do krevního oběhu. CD14, který je uvolněn do krevního oběhu, je označován jako rozpustný CD14 (sCD14). V krevním oběhu dochází ke štěpení komplexu LPS-LBP-CD14 plazmatickými proteázami (například cathepsinem D) a vzniká rozpustný CD14 podtyp (sCD14-ST) což je presepsin, který stanovujeme [21]. Obrázek č. 4: Mechanismus sekrece presepsinu [20]

Hladina presepsinu se zvyšuje během 2 hodin a maxima dle autora dosahuje za 3 hodiny. Doporučuje se, aby si každá laboratoř určila své vlastní referenční hodnoty. Hodnoty presepsinu se zvyšují podle individuální imunitní odpovědi organismu a různé klinické situace, a proto by se měly pro hodnocení stavu pacienta používat i ostatní laboratorní nálezy. Podle studie uvedené v návodu od firmy Mitsubishi Chemical Medience Corporation je cut-off hodnota pro rozlišení zdravého pacienta od pacienta se sepsí 337 pg/ml. Tyto výsledky 20

byly získány z analýzy provedené u 119 vzorků EDTA plazmy zdravých jedinců. Hodnoty presepsinu byly v rozmezí 60-365 pg/ml (viz. obrázek 5) [22]. Obrázek č. 5: Distribuce presepsinu u normálních jedinců [22]

Tabulka 4: Hodnoty presepsinu a diagnóza [23] Presepsin pg/ml < 200

Diagnóza vyloučení sepse

200-300

nepravděpodobná systémová infekce

300-500

možná systémová infekce (sepse)

500-1000

střední riziko progrese systémové infekce, zvyšující se riziko nepříznivého výsledku vysoké riziko progrese systémové infekce

≥ 1000

V diagnostice se presepsin využívá k rozlišení bakteriální a nebakteriální infekce. V případě bakteriální infekce však nelze rozlišit, zda původce patří do skupiny gram negativních nebo gram pozitivních bakterií. U pacientů s virovou infekcí zatím zvýšená hladina presepsinu nebyla prokázána. Měření koncentrace presepsinu je důležité k posouzení závažnosti infekce a monitorování klinické odpovědi organismu [25].

21

Hodnoty presepsinu můžeme využít k určení prognózy. U pacientů s podezřením na sepsi je nejvyšší riziko úmrtnosti do 30 dnů. Byla provedena Kaplan-Meierova analýza přežití do 30 dnů po přijetí do nemocnice a bylo zjištěno, že pacienti s hodnotou presepsinu >1858 pg/ml mají riziko úmrtnosti >60%. Pokud je hodnota v dolním kvartilu je riziko nižší [22]. Obrázek č. 6: Prognostická váha presepsinu [22]

2.5.4 Interleukin-6

Interleukin-6 patří mezi prozánětlivé cytokiny. Cytokiny jsou různorodá skupina bílkovinných mediátorů zánětlivé odpovědi. Je pro ně charakteristická rychlá tvorba po různých stimulech a krátký poločas [1]. Interleukin-6 je glykoprotein s molekulovu hmotností 22-29 kDa. Je produkován více typy buněk, kam patří T-lymfocyty, B-lymfocyty, endoteliální buňky, makrofágy, lymfocyty. Jeho syntéza je stimulována cytokiny (TNF-α, IL-1…) a virovými nebo bakteriálními součástmi jako jsou například lipopolysacharidy. V případě infekce a poškození tkáně je produkován časně. IL-6 indukuje syntézu proteinů akutní fáze v hepatocytech (CRP, fibrinogen, α1antitrypsin a komplement), proliferaci a aktivaci B- a T-lymfocytů a zvyšuje aktivitu NK-buněk [27]. IL-6 má maximum nástupu syntézy za 1,5-3 hodiny. Uplatňuje se v patogenezi nádorových onemocnění (mnohočetný myelom) a některých chronických zánětlivých onemocnění (revmatoidní artritida). Je to dominantní cytokin z hlediska klinického využití. V diagnostice využíváme toho, že jeho hladiny za 48 hodin korelují s mortalitou pacienta. 22

Je rozhodující pro indukci syntézy CRP a proto o několik hodin předchází vzestup CRP. Jeho hladina u septických stavů stoupá úměrně s vývojem závažnosti sepse. IL-6 má důležitou diagnostickou úlohu při průkazu neonatální infekce a sepse, kdy ještě nemusí být plně rozvinuta odpověď proteinů akutní fáze. Jako ukazatel závažnosti a prognózy SIRS se používá poměr IL-6 a protizánětlivého IL-10. Zvýšené koncentrace IL-6 a naopak snižující se koncentrace IL-10 (stoupající poměr IL-6/IL-10) jsou považovány za parametr rozvoje MODS (syndrom mnohočetného orgánového selhání). To znamená špatnou prognózu vzhledem k přežití. Hladina IL-6 je snížena při léčbě kortikosteroidy [3, 11].

2.5.5 Lipopolysacharidy vázající protein

Lipopolysacharidy vázající protein (LBP) je rozpustný protein akutní fáze o molekulové hmotnosti 65 kDa. Pochází převážně z jater a jeho plazmatická koncentrace se zvedá po zánětlivém podnětu, mezi které můžeme zahrnout i bakteriální sepsi. Váže se na lipopolysacharidy (LPS) a prezentuje je receptorům CD14 na monocytárních buňkách. Při přítomnosti LBP se cytokiny uvolňují při nižších koncentracích než při jeho nepřítomnosti. Z toho vyplývá, že funkcí LBP je zvýšit schopnost organismu detekovat LPS již na začátku infekce. I když je LBP potřeba pro indukci zánětlivé odpovědi, není potřeba k odstranění LPS z oběhu. LBP hraje dále roli v opsonizaci gram-negativních bakterií. Vazba LBP na lipid A, který je součástí gram-negativních bakterií, vede k jejich opsonizaci. V séru zdravých jedinců je koncentrace LBP 5-20 µg/ml. Při akutní odpovědi organismu se koncentrace zvyšuje až na hodnoty kolem 200 µg/ml. [31, 38].

2.6 Diagnostika sepse V diagnostice sepse má kvůli včasnému nasazení antibiotické léčby důležitou roli čas. Podle definice uvedené výše by měla být diagnostika snadná. U sepse by měla být přítomna dvě a více kritérií SIRS a přítomnost infekce. Ne každý pacient má klasické příznaky jako jsou změny v tělesné teplotě, leukocytóza a tachykardie. Příznaky sepse jsou nespecifické a mohou se objevit i u úrazů, popálenin a srdečního selhání [1].

2.6.1 Klinické parametry •

Tělesná teplota je snadno dostupný a měřitelný údaj. U sepse může být teplota zvýšená i snížená. Zvýšená teplota je první známkou infekce a je to reakce na uvolňování mikrobiálních produktů nebo průnik živých bakterií do oběhu. Za zvýšenou teplotu u sepse je zodpovědný TNF-α (Tumor necrosis factor- α), který pak stimuluje syntézu IL-6. 23

•

Tepová frekvence je nespecifický příznak. Tachykardie, která se objevuje u sepse a SIRS se vyskytuje u celé řady dalších nemocí [1].

2.6.2 Laboratorní parametry

Mezi mikrobiologická laboratorní vyšetření patří: hemokultury, sputum, stěr z rány a moč na kultivaci. •

Hemokultura je považována za zlatý standard mezi diagnostickými metodami sepse. Je to mikrobiologické kultivační vyšetření krve na přítomnost bakterií. Pacientovi se odebírají dva vzorky krve o objemu 10 ml. Jeden vzorek je pro aerobní a druhý pro anaerobní kultivaci. Je důležité, aby odběr proběhl před podáním antibiotik. Vzorky se pak vloží do přístroje, kde je udržována stálá kultivační teplota 37 °C. V přístroji vzorky zůstávají obvykle 5 dní. Pokud jsou v krvi bakterie, provedeme následná kultivační vyšetření k určení přesného agens [25, 30, 33].

Mezi hematologická laboratorní vyšetření patří: vyšetření krevního obrazu a koagulace •

Zvýšení leukocytů je běžným příznakem infekce, ale není pro ni zcela specifické.

•

Při sepsi dochází k aktivaci koagulace. Klesá hladina inhibitorů koagulace, u těžké sepse je v 90% snížená koncentrace proteinu C. Koagulační parametry se spíše než k diagnóze využívají ke sledování závažnosti stavu pacienta [1, 33]

Mezi biochemická laboratorní vyšetření patří: C-reaktivní protein, prokalcitonin, Na, K, urea, kreatinin, glykémie, jaterní testy, krevní plyny včetně pH, laktát a v některých laboratořích se stanovuje také IL-6, presepsin a LBP. •

C-reaktivní protein je dnes nejčastěji využívaným markerem u pacientů s podezřením na sepsi. Bývá zvýšený i u mnoha neinfekčních stavů jako jsou malignity, úrazy, infarkty nebo pooperační stavy. Pro stanovení můžeme využít sérum i plazmu. Dříve se ke stanovení využíval latexový aglutinační test nebo radiální imunodifúze, ale tyto testy jsou již zastaralé, málo citlivé, semikvantitativní a výsledky jsou ovlivněné subjektivním hodnocením. Dnes se nejvíce využívá imunoturbidimetrie, imunonefelometrie a chemiluminiscenční analýza. [1, 34]

•

Prokalcitonin je v současnosti nejspecifičtější rutinně používaný marker pro sepsi. Hodnoty PCT dosahují obrovského rozmezí a korelují se závažností septických stavů. Hladina PCT po úspěšném chirurgickém zákroku nebo změně antibiotik rychle klesá. Stanovení se provádí v séru nebo plazmě. Při stanovení se využívá imunoanalytických principů, kdy spolu reaguje antigen a specifická protilátka za vzniku imunokomplexu. První protilátku používanou ke stanovení PCT připravila firma BRAHMS (Henningsdorf, Německo). PCT bylo možno nejprve stanovit na stolním luminometru, později na analyzátorech KRYPTOR pomocí technologie TRACE (Time-Resolved 24

Amplified Cryptate Emission), za kterou byla v roce 1987 firmě udělena Nobelova cena za chemii. Stanovení PCT můžeme provádět na POCT analyzátorech i na polo- či plně automatizovaných analyzátorech. Dostupným POCT analyzátorem je PCT-Q test od firmy BRAHMS, který provádí semikvantitativní stanovení, kde podle intenzity vzniklého zbarvení určíme množství PCT.

Obrázek č. 7: Možnosti stanovení prokalcitoninu [36]

Firma BRAHMS protilátku ke stanovení PCT prodala firmě Roche, která se postarala o rozšíření stanovení PCT na automatických imunoanalyzátorech. V současné době existuje řada komerčně dostupných diagnostických souprav. Polo- či plně automatizované analyzátory, na kterých může být stanoveno PCT vyrábí tyto firmy: Roche, Siemens, Brahms, BioMérixeu, DiaSorin, Olympus [1, 36, 37]. •

Presepsin se stanovuje v plazmě nebo plné krvi. Pro měření využíváme přístroj PATHFAST od firmy Mitsubishi Chemical, který dodává firma Medesa. Principem je enzymová chemiluminiscenční imunoanalýza. Presepsin se využívá v diagnostice a prognóze sepse, k určení stupně ohrožení u septických pacientů [20].

•

Plazmatické hladiny IL-6 poměrně dobře korelují s výsledkem léčby u kriticky nemocných. Cytokiny mají zvýšené hladiny také u řady jiných onemocnění, jako jsou úrazy, chirurgické výkony, srdeční selhání atd. Na trhu jsou minimálně dva výrobci souprav pro stanovení IL-6 v uzavřených systémech a to firma Siemens Healthcare Diagnostic se soupravou Immulite 2000 a firma Roche se soupravou Elecsys IL-6. Souprava Elecsys IL-6 využívá pro stanovení metodu ECLIA (Electrochemiluminiscence immunoassay), která je založena na elektrochemiluminiscenci s použitím biotinylované monoklonální specifické protilátky, monoklonální specifické protilátky značené rutheniovým komplexem a mikročástic potažených streptavidinem. Immulite 2000 využívá metody chemiluminiscence [1, 8, 11, 34].

25

•

Stanovení LBP můžeme provádět ze séra i plazmy. Pro stanovení se používá metoda ELISA (Enzym Linked-Immunosorbent Assay) s jamkami mikrotitrační destičky potaženými monoklonální protilátkou proti lidskému LBP. Napipetujeme vzorek a v průběhu inkubace je LBP (antigen) zachycen protilátkou navázanou na povrchu jamky. Nenavázaný materiál je odstraněn. Poté je přidána enzymově značená protilátka specifická proti LBP a vzorek se opět inkubuje. Enzym ze značené protilátky katalyzuje přeměnu substrátu, který je přítomný v reakční směsi na barevný produkt. Pro zjištění koncentrace měříme spektrofotometrem absorbanci při 450 nm [39].

2.7 Porovnání parametrů Pro diagnostiku sepse v současné době neexistuje ideální marker, proto měříme několik parametrů najednou, abychom získali co nejefektivnější data. Tabulka č. 5: Porovnání v čase [8, 12, 22] Parametr CRP PCT Presepsin

Vzestup 6h 2-3 h 2h

Vrchol 24-48 h 6-12 h 3h

2.7.1 Porovnání PCT a presepsinu

Hodnoty PCT a presepsinu byly změřeny u 140 pacientů, kteří byli přijati na pohotovost a jako kontrolní skupina byla vybrána skupina 119 zdravých osob. Stanovení hladin proběhlo při přijetí, po 24 hodinách a po 72 hodinách. Studie se zaměřila na diagnostickou účinnost parametrů a na monitorování průběhu onemocnění po podání léku. Při studii diagnostické účinnosti PCT a presepsinu byla průměrná hodnota presepsinu u zdravých jedinců 159 pg/ml, u septických pacientů 2563 pg/ml. Hodnoty PCT dosahovaly významného rozdílu mezi pacienty se sepsí, těžkou sepsí a septickým šokem. Rozlišovací schopnost presepsinu byla ještě lepší a více odpovídala klinickému stavu. Studie se zaměřila také na to, zda je u septických pacientů možné určit efektivitu terapie, která byl použita při přijetí, podle hodnot presepsinu a PCT. Všichni pacienti s diagnostikovanou sepsí dostali mikrobiální léčbu. U 104 pacientů (z celkového počtu 140 pacientů) došlo ke snížení hodnot obou parametrů (modrá linie) a terapie tedy byla správná. Ve skupině 36 pacientů, u kterých podané léky nezabraly (červená linie), oba parametry stoupaly. Vzestup byl výraznější u presepsinu [19].

26

Obrázek č. 8: Monitorování onemocnění [19]

Popis grafu: Dynamika hodnot presepsinu a PCT po podání léčby skupině 140 pacientů. Správná terapie vedla ke snížení hodnot u 104 pacientů (modrá linie). Při nesprávné terapii došlo ke zvýšení hodnot u 36 pacientů (červená linie) Výsledky studie ukazují, že presepsin je slibný parametr pro monitorování závažnosti onemocnění a stanovení prognózy. Hodnoty PCT se zvyšují i u pacientů se SIRS, ale presepsin se zvyšuje jen u septických stavů [19, 24].

2.7.2 Porovnání CRP a PCT

CRP je parametr citlivý, ale nespecifický. Ke zvýšení dochází při lokalizované infekci, sepsi, virových infekcích i po operaci. Dynamika jeho změn je rychlá. V grafu můžeme vidět, 27

že CRP dosahuje vysokých hodnot i při nízké zátěži. Stav pacientů byl hodnocen podle SOFA skóre (sepsis-related organ failure assessment). SOFA skóre je systém pro odhad a hodnocení orgánové dysfunkce [3, 40]. Obrázek č. 9: Koncentrace CRP dle závažnosti sepse [40]

Prokalcitonin se specificky nezvyšuje pouze u systémové infekce, ke zvýšení může dojít i u jiných klinicky významných diagnóz, ale hodnoty jsou jen lehce nad 0,5 ng/ml. Obrázek č. 10: Koncentrace PCT dle závažnosti sepse [40]

PCT má lepší rozlišovací schopnost než jiné reaktanty akutní fáze včetně CRP. Podle počtu selhávajících orgánů reaguje na závažnost stavu. Je to vhodný parametr pro zpřesnění diagnózy při nesrovnalostech mezi klinickým stavem a hodnotami CRP. PCT má lepší kinetiku, reaguje rychleji než CRP. Hladina PCT se využívá při rozhodování o antibiotické léčbě [3, 40].

28

3. Praktická část 3.1 Přístrojové vybavení V rámci zpracování bakalářské práce jsem pracovala s analyzátorem PATHFAST a Cobas 8000.

3.1.1 PATHFAST

Stanovení presepsinu jsme prováděli na imunoanalyzátoru PATHFAST od firmy Mitsubishi Chemical. Velikost a hmotnost toho analyzátoru umožňuje jeho využití v laboratořích, ordinacích i nemocnicích. Systém PATHFAST kombinuje přesnost plnohodnotného analyzátoru s flexibilitou POCT (point of cate testing) zařízení. Poskytuje rychlé výsledky a je snadno ovladatelný. Vyšetření můžeme provádět z plné krve, plazmy nebo séra. Na analyzátoru je možné stanovení i jiných parametrů než je presepsin. Je to například stanovení myoglobinu, D-Dimerů, CK-MB, cTnI, NTproBNP, hsCRP a HCG.

Obrázek č. 11: Přístroj PATHFAST

29

Tabulka č. 6: Technická specifikace přístroje PATHFAST Typ přístroje Počet vzorků Doba měření Typ materiálu Reakční teplota Objem vzorku Vlnová délka Kalibrace

Stolní imunoanalyzátor Až 6 vzorků na jedno měření 17 minut Plná krev, plasma 37,5 °C 100 µl 300-650 nm 2-bodová, každé 4 týdny

Princip Analyzátor PATHFAST pracuje na principu chemiluminiscence s patentovanou technologií Magitration. Tato technologie umožňuje stanovení malých koncentrací analytu s vysokou přesností.

3.1.2 Cobas 8000

Cobas 8000 je modulární analytický systém od firmy Roche Diagnostics. Podle potřeb jednotlivých laboratoří je možné jednotlivé moduly variabilně skládat a měnit. Důležitým prvkem každého systému je tzv. Core modul, jehož součástí je vstupní jednotka, výstupní jednotka a obslužný systém pro dopravu stojánků k modulům. Dále jsou k dispozici ISE moduly, 3 druhy modulů pro klinickou biochemii (c 701, c 702, c 502) a modul pro heterogenní imunoanalýzu e 602. ISE jednotka má 3 indikační elektrody Na, K a CL. Výkon ISE jednotky je až 300 vzorků/hod. (900 testů/hod).

3.2 Principy stanovení a referenční rozmezí sledovaných parametrů 3.2.1 Stanovení Presepsinu

Princip testu je založen na nekompetitivní chemiluminiscenční enzymové imunoanalýze (CLEIA) s MAGITRATION technologií. MAGITRATION je technologie separace, při které jsou magnetické kuličky promývány v pipetovací špičce. Vzorek se inkubuje s polyklonální protilátkou proti presepsinu, která je značená alkalickou fosfatázou (ALP) a magnetickými kuličkami, které jsou potažené monoklonální protilátkou proti presepsinu. Presepsin ze vzorku vytvoří imunokomplex s enzymově značenou protilátkou a protilátkou na magnetických kuličkách. Pomocí MAGITRATION technologie se odstraní nenavázané protilátky a přidá se chemiluminiscenční substrát. Po krátké inkubaci dojde k enzymové reakci, která generuje luminiscenční záření. Intenzita luminiscence se měří při 461 nm. Intenzita luminiscence odpovídá koncentraci presepsinu ve vzorku. 30

Obrázek č. 12: Princip stanovení presepsinu [20]

3.2.2 Stanovení CRP

Na oddělení klinické biochemie FN Brno je analyzátor Cobas 8000 vybaven dvěma moduly c 702. Jedná se o fotometrický modul s výkonem až 2000 testů/hod. díky zdvojenému pipetování vzorku. Zdroj světla je halogenová lampa a detekce probíhá na detektoru diodového pole s využitím dvanácti vlnových délek. Vzorkové i reagenční pipetory mají detekci hladiny, detekci sraženiny a detektor nárazu do dna. Každý pipetor má svoji mycí stanici. Reakční teplota je 37 ± 0,1°C a je udržována cirkulující vodní lázní. Pro měření je nutný minimální objem 100 µl. Míchání vzorku zajišťují bezkontaktní ultrazvuková míchadla. Stanovení CRP na modulu c 702 probíhá imunoturbidimetricky. Latexové částice jsou potažené protilátkou proti CRP. Tyto částice aglutinují s lidským CRP ze vzorku a vzniknou aglutináty, které stanovujeme turbidimetricky při vlnové délce 800/570 nm. Reakční čas je 10 minut. Obrázek č. 13: Schéma turbidimetru [19]

M-monochromátor, D-detektor

3.2.3 Stanovení PCT

Stanovení PCT se provádí na modulu e 602 přístroje Cobas 8000. Dvě měřící komory umožňují výkon až 170 testů/hod. Aby nedošlo ke kontaminaci, při pipetování se používají jednorázové špičky. Ty jsou vybaveny detekcí sraženiny, hladinovým senzorem a detekcí pěny. Špičky jsou využívány i k míchání vzorku. Reakční teplota je 37 ± 0,3°C. 31

Ke stanovení se používá elektrochemiluminiscence. Jedná se o sendvičový princip. V průběhu první inkubace se vytvoří sendvičový komplex reakcí antigenu ze vzorku s biotinylovanou monoklonální protilátkou proti PCT a monoklonální protilátkou proti PCT značenou rutheniovým komplexem. Druhá inkubace proběhne po přidání mikročástic potažených streptavidinem. Komplex vzniklý první inkubací se váže na mikročástice. Vzniká interakce mezi biotinem a streptavidinem. Následuje promytí s odstraněním nenavázaných složek reakční směsi. Přidá se tripropylamin (substrát), který reaguje s rutheniovým komplexem značené protilátky z vytvořeného komplexu. Vložením napětí na elektrodu se spustí reakce a dojde k vyzáření fotonu. Signál se změří fotonásobičem.

3.2.4 Referenční rozmezí

Pro vyhodnocení výsledků jsme využili následující referenční hodnoty: Tabulka č. 7: Referenční rozmezí Parametr CRP PCT Presepsin

Referenční rozmezí 0-5 mg/l 0-0,5 ng/ml 0-337 pg/ml

Rozsah měření 0,3-350 mg/l, při vyšších hodnotách ředění 1:2 0,2-100 ng/ml, při vyšších hodnotách ředění 1:4 20-20000 pg/ml

3.3 Opakovatelnost a mezilehlá přesnost Vzhledem k tomu, že se stanovení presepsinu ve FN Brno běžně nevyužívá, bylo u této metody nutno změřit opakovatelnost a mezilehlou přesnost. Parametry CRP a PCT jsou rutinně používané metody a proto jsou sledovány v rámci pravidelné verifikace. Pro statistické vyhodnocení je vhodné použít 20 analýz a více. Kvůli omezenému množství a ceně testů, které jsme měli k dispozici, bylo k vyhodnocení opakovatelnosti a mezilehlé přesnosti využito 5 analýz kontroly 1 a 5 analýz kontroly 2. Obě kontroly jsou součástí setu ke stanovení presepsinu. Opakovatelnost se zjišťuje měřením v jedné sérii, jedním pracovníkem. My jsme 5x změřili kontrolu 1. Mezilehlá přesnost se zjišťuje postupným měřením v průběhu několika pracovních dnů. Při měření se střídá několik pracovníků. Pro měření mezilehlé přesnosti jsme použili kontrolu 2. Měření probíhalo po jednom až několika týdnech.

32

Tabulka č. 8: Opakovatelnost a mezilehlá přesnost Měření opakovatelnosti 1

Kontrola 1 [pg/ml]

Kontrola 2 [pg/ml]

669

Měření mezilehlé přesnosti 1

2

653

2

2278

3

664

3

1930

4

686

4

1987

5

659

5

1954

Průměr

666,2

Průměr

2062

Rozmezí

33

Rozmezí

348

Směrodatná odchylka Variační koeficient %

12,56

Směrodatná odchylka Variační koeficient %

150,97

1,89

2161

7,32

Použité vzorce: Průměr ( ̅ ) je součet všech hodnot (xi) dělený počtem měření (n). ̅ = Σ (xi)/n Rozmezí je rozdíl mezi největší a nejmenší hodnotou. Směrodatná odchylka je druhou odmocninou rozptylu. s = (s2)1/2 Rozptyl je součet čtverců rozdílu naměřených hodnot od průměru dělený počtem měření zmenšený o 1. s2 = Σ (xi – ̅ )2/n-1 Variační koeficient (CV) vyjadřuje poměr směrodatné odchylky a aritmetického průměru. Uvádí se v procentech. CV (%) = 100 . s/ ̅

33

3.4 Sběr dat a popis souboru Sběr dat a vzorků probíhal ve FN Brno na Oddělení klinické biochemie. Nejdříve bylo nutno od FN Brno získat souhlas se sběrem dat. dat Vzorky pacientů jsme sbírali od října do prosince roku 2013. Zpracovávali jsme jsme plasmu s heparinátem lithným, což je materiál vhodný pro presepsin, CRP a PCT. Ze studovaných parametrů se na OKB běžně stanovuje jen jen CRP a PCT. Jak již bylo zmíněno v teoretické části, pro diagnostiku sepse je vhodnější PCT než PCT. CRP a proto jsme i pacienty pacienty vybírali podle koncentrace PCT. Koncentrace PCT a CRP byla u většiny vzorků již zanalyzována a doměřovala se jen v několika případech. Celkový soubor tvoří 69 pacientů z FN Brno a díky spolupráci s Klinikou dětské anesteziologie a resuscitace jsme získali výsledky CRP, PCT a presepsinu od 19 dětí. dětí Získaný soubor výsledků z Kliniky dětské anesteziologie a resuscitace resuscitace obsahoval jen malé množství stanovených PCT, protože se toto stanovení tak často nevyužívá. Ze všech naměřených hodnoty byla vytvořena tabulka, tabulka, která je uvedena v příloze 1. 1 Hodn Hodnoty oty presepsinu jsme stanovili u 97 vzorků z FN Brno,, z toho 4 vzorky patřily patřily dětským pacientům pacientům.. U vybraných pacientů jsme sledovali vývoj jejich onemocnění a proto se u nich presepsin stanovoval několikrát v průběhu hospitalizace. hospitalizace. Koncentraci presepsinu jsme u některých pacientů změřili jen jednou a to z důvodu ukončení hospitalizace hospitalizace nebo pokud již nebyl ordinován prokalcitonin. V grafu je znázorněno procentuální zastoupení diagnóz, diagnóz, které byly stanoveny při přijetí do nemocnice. Ve sledovaném souboru pacientů bylo nejčastější onemocnění nemocnice. gastrointestinálního traktu. Na druhém druhém místě jsou onkologická onemocnění, jejichž průběh bývá komplikován septickými stavy. Velký podíl dále tvoří onemocnění plic, různá poranění a sepse jako diagnóza při příjmu. příjmu Obrázek č. 14: Graf zastoupení diagnóz u pacientů v septickém stavu či s podezřením na sepsi

Diagnóza při přijetí 6%

14%

17%

poranění, úrazy 8%

onemocnění srdce onemocnění GIT

22%

21%

septické stavy onkologická onemocnění

12%

onemocnění plic jiné

34

3.5 Postup stanovení presepsinu Presepsin jsme stanovovali soupravou PATHFAST Presepsin od firmy Mitsubishi Chemical, která obsahuje reagencie kalibrátory i kontroly kvality. 3.5.1 Kalibrace a QC

Před začátkem měření je potřeba ověřit platnost kalibrace. Provedení kalibrace je nutné při použití nového lotu nebo po vypršení lhůty, která je u PATHFAST Presepsin čtyři týdny. Na přístroji si musíme nejprve nastavit analýzu ke kalibraci. 1. Registrace master křivky: Při zavedení nové analýzy nebo nového lotu musí být v přístroji zaregistrována master křivka. Registrace master křivky se provádí načtením čárového kódu z MC ENTRY CARD. Obrázek č. 15: Čárový kód z MC ENTRY CARD nutný k instalaci nové šarže na přístroji PATHFAST

2. Příprava reagencií: Kalibrátor CAL-1 je připraven k použití. Kalibrátor CAL-2 je lyofilizovaný a před použitím se rozpouští diluentem. Rozpuštěný kalibrátor je pak stabilní 24 hodin při 2-8 °C a 6 měsíců při teplotě -20 °C a nižší. 3. Příprava reagenčních kazet: Do stojanu přístroje se vloží reagenční kazety a do nich se napipetuje 100 µl kalibračního roztoku. Oba kalibrátory se musí stanovit v duplikátu. Společně s kalibrátory se měří i kontrola. K dispozici máme kontrolu 1 pro nižší hladiny a kontrolu 2 pro vyšší hladiny.

35

4. Start kalibrace: Do přístroje vložíme stojan s reagenčními kazetami a jednorázové špičky. Stiskneme tlačítko “START“. 5. Výsledky: Po dokončení kalibrace proběhne tisk výsledků.

3.5.2 Postup měření Presepsinu

Nasbírané vzorky jsme před měřením museli nechat rozmrazit, protože byly skladovány při -20 °C. Po rozmražení jsme je promíchali a centrifugovali. 1. Příprava přístroje: Po zapnutí přístroje musíme 30 minut počkat, než se přístroj zahřeje. Zkontrolujeme, zda nejsou v odpadní nádobce použité špičky a případně je vysypeme. Vložíme do přístroje potřebné množství nových špiček. 2. Kontrola: Na začátku měření je potřeba nejprve změřit kontrolu, pokud neměříme vzorky ihned po provedení kalibrace. Kontrolní materiál jsme si předem připravili rozpuštěním v diluentu, rozpipetovali po 100 µl do ependorfek a zamrazili. Postup měření kontrolního materiálu je stejný jako u vzorku. 3. Příprava reagenčních kazet: Reagenční kazeta se zasune do stojanu, je nutné ji pevně přitlačit na místo. Do vzorkové jamky napipetujeme 100 µl vzorku a případně odstraníme bubliny. Po napipetování všech vzorků umístíme stojan do přístroje a uzavřeme přední kryt. 4. Start analýzy: Na přístroji stiskneme tlačítko “START“. Po spuštění analýzy zadáme do přístroje informace o vzorku. Vzorky můžeme načíst pomocí čtečky čárového kódu nebo je zadáme manuálně. 5. Konec analýzy: Po dokončení analýzy proběhne tisk výsledků. Z přístroje odstraníme použité špičky a reagenční kazety.

Obrázek č. 16: Reagenční kazeta pro stanovení presepsinu [20]

36

3.6 Výsledky 3.6.1 Kazuistiky

Při zpracování kazuistik jsme využili Laboratorní informační systém (LIS) a Nemocniční informační systém AMIS. Pacient č. 1, ročník 1976, byl hospitalizován s iontovou dysbalancí po úrazu hlavy a levé kyčle. Laboratorně se začaly objevovat známky sepse. Byla nasazena antibiotika a došlo k poklesu zánětlivých parametrů. Kultivace hemokultury byla pozitivní. Pacient byl vyléčen. Obrázek č. 17: Vývoj koncentrace presepsinu, PCT a CRP u pacienta číslo 1 A)

presepsin

Koncentrace presepsinu [pg/ml] 1000 800 600 400

presepsin

200 0 0

5

10

15

den hospitalitazace

B)

PCT

Koncentrace PCT 300 [ng/ml] 250 200 150 100 50 0

PCT

0

5

10

den hospitalitazace

37

15

C)

CRP

Koncentrace CRP 400 [mg/l] 300 200

CRP

100 0 0

5

10

15

den hospitalizace

Pacient č. 2, ročník 1985, byl přijat do FN Brno s klíšťovou encefalitidou, která byla přeléčena antibiotiky. Pak došlo k rozvoji pravostranné hemiparézy a dalšímu zhoršení stavu. Došlo k rozvoji sepse, akutnímu selhání ledvin a bolesti břicha. Sepse vyústila až v septický šok. Opět byla nasazena antibiotika a došlo ke zlepšení stavu, ale ten byl komplikován recidivou těžké sepse, která postupně přešla až do multiorgánové dysfunkce. Pacient zemřel. Obrázek č. 18: Vývoj koncentrace presepsinu, PCT a CRP u pacienta číslo 2 A)

Presepsin

Koncentrace presepsinu 25000 [pg/ml] 20000 15000 10000

Presepsin

5000 0 0

20

40

60

den hospitalizace

B)

Koncetrace PCT [ng/ml]

PCT 70 60 50 40 30 20 10 0

PCT

0

10

20

30

den hospitalizace

38

40

50

C)

Koncentrace CRP [mg/l]

CRP 350 300 250 200 150 100 50 0

CRP

0

10

20

30

40

50

den hospitalizace

Pacient č. 3, ročník 2010, byl přijat do dětské nemocnice po pokousání rotvajlerem. Měl četné rány na krku, prokouslou tracheu a frakturu obratlů. Došlo k masivnímu krvácení, ale nebyly zasaženy velké cévy. Byla nasazena antibiotika a pacient se vyléčil. Obrázek č. 19: Vývoj koncentrace presepsinu, PCT a CRP u pacienta číslo 3 A)

Presepsin

Koncentrace presepsinu 800 [pg/ml] 600 400

Presepsin

200 0 0

2

4

6

8

den hospitalizace

B)

Koncentrace CRP [mg/l]

CRP 140 120 100 80 60 40 20 0

CRP

0

2

4

6

den hospitalizace

39

8

10

Pacient č. 4, ročník 1953, byl přijat po pádu z výšky. Došlo k rozvoji tetraplegie. Stav pacienta byl velmi závažný. Rozvíjel se septický šok a multiorgánová dysfunkce. Pacient byl postižen kvasinkovou infekcí a musel podstoupit několik operací. Pacient je stále hospitalizován, ale zdravotní stav se zlepšuje. Obrázek č. 20: Vývoj koncentrace presepsinu, PCT a CRP u pacienta číslo 4 A)

Presepsin

Koncentrace presepsinu 5000 [pg/ml] 4000 3000 2000

Presepsin

1000 0 0

50

100

150

den hospitalizace

B)

PCT

Koncentrace PCT 350 [ng/ml] 300 250 200 150 100 50 0

PCT

0

10

20

30

40

den hospitalizace

C)

Koncentrace CRP [mg/l]

CRP 400 300 200 CRP

100 0 0

50

100

den hospitalizace

40

150

Pacient č. 5, ročník 1972, byl přijat pro jaterní selhání. Pak se začal rozvíjet septický šok. Dále byla diagnostikována bronchopneumonie a byla pozitivní kultivace hemokultury. Byla nasazena antibiotika. Pacient byl vyléčen. Obrázek č. 21: Vývoj koncentrace presepsinu, PCT a CRP u pacienta číslo 5 A)

Koncentrace presepsinu [pg/ml]

Presepsin 1400 1200 1000 800 600 400 200 0

Presepsin

0

5

10

den hospitalizace

B)

Koncentrace PCT [ng/ml]

PCT 100 80 60 40

PCT

20 0 0

2

4

6

8

10

den hospitalizace

C)

Koncentrace CRP [mg/l]

CRP 140 120 100 80 60 40 20 0

CRP

0

2

4

6

den hospitalizace

41

8

10

Pacient č. 6, ročník 1974, byl přijat po autonehodě. Při nehodě si způsobil několik zlomenin, rupturu bránice a sleziny. Po operaci došlo ke zvýšení zánětlivých parametrů a začala se objevovat oběhová nestabilita. Byla nasazena antibiotika, došlo k oběhové stabilizaci a postupnému zlepšování stavu. Pacient byl vyléčen. Obrázek č. 22: Vývoj koncentrace presepsinu, PCT a CRP u pacienta číslo 6 A)

Koncentrace presepsinu [pg/ml]

Presepsin 5000 4000 3000 2000

Presepsin

1000 0 0

5

10

15

20

den hospitalizace

B)

Koncentrace PCT [ng/ml]

PCT 20 15 10 PCT

5 0 0

5

10

15

20

den hospitalizace

C)

Koncentrace CRP [mg/l] 400

CRP

300 200 CRP

100 0 0

5

10 den hospitalizace

42

15

20

Pacient č. 7, ročník 1973, byl přijat při podezření na multiorgánové selhávání. Nově byl diagnostikován lymfom ze zralých buněk T/NK a byla zahájena chemoterapie. Došlo k akutnímu renálnímu selhání a opakovaně k akutnímu respiračnímu selhání. Nakonec se rozvinula pravostranná bronchopneumonie. Pacient zemřel. Obrázek č. 23: Vývoj koncentrace presepsinu, PCT a CRP u pacienta číslo 7 A)

Koncentrace presepsinu [pg/ml]

Presepsin 10000 8000 6000 4000

Presepsin

2000 0 0

10

20

30

den hospitalizace

B)

Koncentrace PCT [ng/ml]

PCT 80 60 40 PCT

20 0 0

10

20

30

40

den hospitalizace

C)

Koncentrace CRP [mg/l]

CRP 250 200 150 100

CRP

50 0 0

10

20 den hospitalizace

43

30

40

Pacient č. 8, ročník 1958, byl přijat s hemoragickým šokem a metabolickým rozvratem v důsledku gastrointestinálního krvácení. Stav se mírně zlepšil, ale pak došlo k rozvoji septického šoku a jaterního selhání. Pacient zemřel. Obrázek č. 24: Vývoj koncentrace presepsinu, PCT a CRP u pacienta číslo 8 A)

Presepsin

Koncentrace presepsinu [pg/ml] 14000 12000 10000 8000 6000 4000 2000 0

Presepsin

0

5

10

15

den hospitalizace

B)

PCT

Koncentrace PCT [ng/ml] 120 100 80 60 40 20 0

PCT

0

5

10

15

den hospitalizace

C)

CRP

Koncentrace CRP [mg/l] 100 80 60 40

CRP

20 0 0

5

10

den hospitalizace

44

15

3.6.2 PCT, CRP a presepsin při přijetí

U vybraných 36 pacientů jsme při přijetí změřili koncentraci presepsinu a porovnali ji s výsledky PCT a CRP. Koncentrace stanovovaných parametrů jsou v různých jednotkách a obtížně srovnatelné. Abychom výsledky sjednotili a mohli je porovnat, rozhodli jsme se vypočítat, kolikrát daný parametr překračuje referenční rozmezí (viz. kapitola 3.2.4). V grafu na obrázku číslo 25 jsou znázorněny násobky referenčních hodnot CRP, PCT a presepsinu. Jsou to hodnoty naměřené při přijetí. Nejvyššího zvýšení oproti referenčnímu rozmezí dosahuje PCT, jeho koncentrace se oproti referenční mezi zvýšila až 315krát. U presepsinu jsme zaznamenali nejvyšší zvýšení 60krát a vzorky jsme dále neředily. Koncentrace CRP se zvýšila maximálně 97krát.

45

Obrázek č. 25: Údaje při příjmu či na počátku septického stavu vyjádřené jako násobek překročení referenčního rozmezí 340 320 Násobky překročení 300 referenčního rozmezí 280 260 240 220 200 180 PCT 160

Presepsin

140

CRP

120 100 80 60 40 20 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37

46

pacienti

3.6.3 Statistické vyhodnocení

Podle vývoje onemocnění jsme pacienty rozdělili do 2 skupin. V první skupině jsou pacienti, kteří se uzdravili nebo se jejich stav zlepšil. Ve druhé skupině jsou pacienti, kteří zemřeli. V každé skupině jsme porovnávali koncentrace PCT a presepsinu při přijetí, maximální dosaženou koncenraci a koncentraci při ukončení sledování. Pro statistické vyhodnocení výsledků jsme použili program MedCalc. Koncentrace parametrů při přijetí, maximální hodnoty a koncentraci při ukončení sledování jsme vyhodnocovali Wilcoxonovým testem. Výsledky jsou znázorněny v následujících grafech.

47

Obrázek č. 26: Koncentrace PCT ve skupině uzdravených pacientů Koncentrace [ng/ml]

Obrázek č. 27: Koncentrace PCT ve skupině pacientů, kteří zemřeli Koncentrace [ng/ml]

48

Obrázek č. 28: Koncentrace presepsinu ve skupině uzdravených pacientů Koncentrace [pg/ml]

Obrázek č. 29: Koncentrace presepsinu ve skupině pacientů, kteří zemřeli Koncentrace [ng/ml]

49

Pomocí testu Mann-Whitney jsme mezi skupinami přeživších a zemřelých porovnali koncentraci PCT a presepsinu při přijetí, maximální koncentraci a koncentraci v závěru sledování. Tabulka č. 9: Koncentrace PCT při příjmu počet pacientů nejnižší hodnota nejvyšší hodnota medián 95% interval spolehlivosti hladina významnosti

skupina přeživších 23 0,13 326,8 6,53 2,12-14,82

skupina zemřelých 8 0,77 124 37,08 16,21-103,41

P=0,021

Tabulka č. 10: Maximální koncentrace PCT počet pacientů nejnižší hodnota nejvyšší hodnota medián 95% interval spolehlivosti hladina významnosti

skupina přeživších 22 0,19 500 8,84 5,46-16,78

skupina zemřelých 8 2,53 115,2 67,29 25,54-110,54

P=0,05

Tabulka č. 11: Koncentrace PCT při ukončení hospitalizace počet pacientů nejnižší hodnota nejvyšší hodnota medián 95% interval spolehlivosti hladina významnosti

skupina přeživších 20 0,078 9,74 0,69 0,27-1,58

skupina zemřelých 7 2,53 75,25 27,71 8,41-61,92

P=0,0003

Tabulka č. 12: Porovnání koncentrací presepsinu při příjmu počet pacientů nejnižší hodnota nejvyšší hodnota medián 95% interval spolehlivosti hladina významnosti

skupina přeživších 35 79,9 15917 1060 717,42-1285,71 P=0,023 50

skupina zemřelých 7 448 7771 2564 1018-6282,34

Tabulka č. 13: Porovnání maximálních koncentrací presepsinu počet pacientů nejnižší hodnota nejvyšší hodnota medián 95% interval spolehlivosti hladina významnosti

skupina přeživších 34 119 20000 1036,5 791,21-1889,57

skupina zemřelých 8 751 20000 3742 1438,5-13390,07

P=0,05

Tabulka č.14: Porovnání koncentrací prespsinu při ukončení hospitalizace počet pacientů nejnižší hodnota nejvyšší hodnota medián 95% interval spolehlivosti hladina významnosti

skupina přeživších 32 114 20000 428 273,98-913 P=0,002

51

skupina zemřelých 7 564 20000 3355 796,26-15707,36

4. Diskuze Septické stavy jsou závažnou komplikací řady onemocnění. V současné době se stále hledá další vhodný parametr pro diagnostiku sepse. Existuje několik analytů, které se využívají, ale jako nejspolehlivější se prozatím jeví kombinování více parametrů. Náplní této bakalářské práce bylo porovnat běžně stanovované analyty, kterými jsou CRP a PCT nejen mezi sebou, ale i s nově používaným parametrem presepsinem. Metoda pro stanovení presepsinu je na Oddělení klinické biochemie FN Brno novinkou používanou pouze výzkumně, a proto bylo nutné zjistit, jaké jsou její vlastnosti. Bylo provedeno měření opakovatelnosti a mezilehlé přesnosti. Při měření opakovatelnosti byl variační koeficient 1,89%, při měření mezilehlé přesnosti 7,32%. Po technické stránce nebyly s přístrojem žádné problémy. Kalibrace byla stabilní a při měření kontrol byly výsledky vždy v požadovaném rozmezí. Snad jedinou nevýhodou je cena. Ta se pohybuje okolo 390 Kč za test. Cena stanovení PCT je přibližně 250 Kč za test. Koncentrace prokalcitoninu, presepsinu a CRP byla stanovena u skupiny pacientů s různými diagnózami. Většinou byli hospitalizováni na Klinice anesteziologie, resuscitace a intenzivní péče, na plicním oddělení, na Klinice úrazové chirurgie a na Interní gastroenterologické klinice. U některých pacientů byly koncentrace sledovaných parametrů změřeny pouze jednou, jiné jsme sledovali delší dobu. Stanovení presepsinu bylo u vybraných pacientů provedeno podle požadavků lékařů, se kterými jsme spolupracovali. Porovnali jsme hodnoty PCT, presepsinu a CRP naměřené u jednotlivých pacientů při příjmu. Výsledky byly nesourodé a nevykazovaly jasnou závislost. Lze z nich pouze konstatovat, že proti referenčnímu rozmezí se nejvíce zvýšily koncentrace PCT. Nejméně proti referenčnímu rozmezí stoupaly hodnoty presepsinu. Výsledky zahraničních studií označují CRP za citlivý, ale nespecifický parametr a vysokých hodnot dosahuje i při nízké zátěži. PCT má lepší rozlišovací schopnost než ostatní reaktanty akutní fáze a reaguje na závažnost stavu. Presepsin se označuje za slibný parametr pro monitorování závažnosti stavu a pro stanovení prognózy. Naše výsledky ukazují, že CRP reaguje rychle, kolísá a zvyšuje se i při malé zátěži. V práci jsou u několika pacientů uvedeny a graficky zpracovány výsledky PCT, presepsinu a CRP naměřené v průběhu jejich onemocnění. V kapitole 3.6.1 můžeme u přeživších pacientů číslo 1, číslo 4, číslo 5 a číslo 6 vidět, že se koncentrace PCT při zlepšení stavu snižuje rychleji než koncentrace presepsinu a CRP. Pokud se jednalo o onkologické pacienty, koncentrace parametrů se snížily, ale nedosáhly referenčního rozmezí. U zemřelých pacientů číslo 2, číslo 7 a číslo 8 se koncentrace PCT postupně snižovala a ke zvýšení došlo až těsně před smrtí. Koncentrace presepsinu stoupala k maximu pomaleji a pak zůstávala vysoká. Presepsin je tedy možné hodnotit jako lepší ukazatel negativní prognózy.

52

Při statistickém srovnání skupiny přeživších pacientů se skupinou zemřelých pomocí Mann-Whiteneyho testu byl jak u PCT tak u presepsinu zaznamenán statisticky významný rozdíl a to jak v době příjmu, tak při dosažení maximální hodnoty i v závěru sledování pacientů. To ukazuje, že PCT i presepsin jsou velmi vhodné parametry pro monitorování septických stavů. Zajímavé je, že maximální naměřená koncentrace PCT (>500 ng/ml) byla naměřena ve skupině přeživších pacientů a byla téměř 4krát vyšší než maximální koncentrace naměřená u skupiny pacientů, kteří zemřeli. Ve skupině přeživších byly u některých pacientů naměřeny velmi vysoké koncentrace presepsinu. V praxi by to mohlo znamenat, že důležitý je trend, ne absolutní hodnoty. Extrémně vysoké koncentrace nemusí znamenat negativní prognózu, pokud postupně začnou klesat. Koncentrace presepsinu se u sledovaných dětských pacientů pohybovala ve výrazně nižších hodnotách než u dospělých. Ve skupině dětí byla nejvyšší zaznamenaná koncentrace presepsinu 3257 pg/ml. U dospělých bylo několikrát dosaženo koncentrace presepsinu >20000 pg/ml. Naproti tomu jsme u dětí naměřili nejvyšší koncentraci PCT ze všech výsledků. Ve dvou případech byla >500 ng/ml. Statistické vyhodnocení PCT a presepsinu stanovených při příjmu, v době dosažení maximální koncentrace a v závěru sledování pomocí Wilcoxonova testu u 31 (resp.42) pacientů potvrzuje výsledky získané v jednotlivých kazuistikách. Při zlepšení stavu prokalcitonin klesá rychleji než presepsin. Snižuje se však na rozdíl od presepsinu i u pacientů se špatnou prognózou. Většina studií se zaměřuje na sledování PCT a presepsinu při příjmu a v prvních dnech onemocnění. Z dosažených výsledků v této práci vyplývá, že zajímavé poznatky přináší i dlouhodobé monitorování koncentrace presepsinu i PCT.

53

5. Závěr V rámci bakalářské práce byly splněny tyto cíle: 1. Byly sumarizovány současné poznatky o septických stavech a biochemických parametrech. 2. Na analyzátoru Cobas 8000 a PATHFAST byla zvládnuta metodika stanovení CRP, PCT a presepsinu. 3. U vybraných pacientů byly stanoveny koncentrace presepsinu. 4. Výsledky jsme statisticky vyhodnotili a porovnali sledované parametry mezi sebou.

Problematika sepse je nadále zajímavým tématem a bude se dále pokračovat v hledání ideálního diagnostického markeru. Uvedené kazuistiky i další výsledky potvrzují hypotézu, že stanovení koncentrace presepsinu a PCT značně přispívá k určení prognózy a diagnózy u pacientů v septickém stavu. Presepsin reaguje poněkud pomaleji než prokalcitonin, proto by měl být opakovaně stanovován až po 48 hodinách. Na základě dosažených výsledků se jeví, že by mohl být vhodnější prognostický marker než prokalcitonin. V průběhu zpracovávání této bakalářské práce byla navázána spolupráce s lékaři z Kliniky anesteziologie, resuscitace a intenzivní medicíny, kteří o stanovení presepsinu projevili zájem. V budoucnu, pokud se podaří zajistit financování, by se ve stanovování presepsinu na OKB FN Brno mohlo pokračovat.

54

6. Seznam použité literatury 1. Svoboda, P.: Sepse v traumatologii a chirurgii. 1. vyd. Praha, 2004, 199 s. ISBN 80-7254550-7 2. Sepse v intenzivní péči: vybraná doporučení v diagnostice a terapii. 2., rozš. vyd. Praha: Maxdorf, c2005, 212 s. Intenzivní medicína, sv. 3. ISBN 80-734-5054-2 3. Zima, T.: Laboratorní diagnostika. 2., dopl. a přeprac. vyd. Praha: Galén, c2007. ISBN 978-802-4614-236 4. World Wide Web: < http://emedicine.medscape.com/article/168943-overview [citováno 27.1.2014] 5. World Wide Web: < http://www.wikiskripta.eu/index.php/Sepse [citováno 27.1.2014] 6. World Wide Web:
15. Picariello C., Lazzeri C., Attanà P., Chiostri M., Gensini G.:Procalcitonin as a reliable biomarker in acute coronary syndromes: What is its role?, J Emerg Med 2013 16. Bálková O.,Roche s.r.o., Prokalcitonin klinické využití v dg. septických stavů, online World Wide Web: < http://www.roche-diagnostics.cz/download/prolekare/prokalcitonin.pdf [citováno 6.2.2014] 17. World Wide Web: < http://presepsin.com/mechanism.html#[1] [citováno 11.2.2014] 18.World Wide Web: < http://www.wikiskripta.eu/index.php/CDt [citováno 11.2.2014] 19. Spanuth E., Ebelt H., Ivandic B., Werdan K.: Diagnostic and prognostic value od presepsin (soluble CD14 subtype) in emergency patiens with early sepsis using the new assay PATHFAST presepsin, 21th International Congress of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine IFCC-World Lab-Euromedlab, Berlin 2011 20. World Wide Web:
28. Mačák J., Mačáková J., Dvořáčková J.: Patologie. 2., dopl. vyd. Praha: Grada, 2012. ISBN 978-802-4735-306 29. Novelli G., Morabito V., Ferretti G., Pugliese F., Ruberto F., Venuta F., Poli L., Rossi M., Berloco P.B.: Pathfast Presepsin assay for early diagnosis of bacterial infections in surgical patiens: Preliminary study, Elsevier Inc., 2013 30. World Wide Web: < http://www.wikiskripta.eu/index.php/Hemokultura [citováno 4.3.2014] 31. Fenton M., Golenbock D.: LPS-binding proteins and receptors, Journal of Leukocyty Biology, 1998 32. World Wide Web < http://cit.vfu.cz/fyziolmed/index.php?option=com docman&task=doc download&gid=23 [citováno 9.3.2014] 33. World Wide Web: < http://www.akutne.cz/res/publikace/p-e-o-pacienta-v-sepsi-kavalcovj.pdf [citováno 9.3.2014] 34. World Wide Web: < http://www.katalogfons.cz/ [citov8no 9.3.2014] 35. World Wide Web: < http://ciselniky.dasta.mzcr.cz/CD_DS3/hypertext/PZAAN.htm [citován 11.3.2014] 36. Číhalová J., Beňovská M., Klimíček I.: Labor Aktuell 02/09: Stanovení prokalcitoninu na modulu E170 analyzátoru Modular analytics a analyzátoru Kryptor compact, str. 26-28, časopis firmy ROCHE s.r.o., 2009, ISSN 1214-7672 37. World Wide Web: < http://www.brahms.de/Default.aspx?tabindex=5&tabid=92 [citováno 15.3.2014] 38. World Wide Web: < http://www.meso-scale.com/CatalogSystemWeb/Documents/Human_LBP.pdf [citováno 23.3.2014] 39. World Wide Web: < http://www.abnova.com/products/products_detail.asp?catalog id=KA0448 [citováno 23.3.2014]

57

40. Meisner M., Tschaikowsky K., Palmaers T., Schmidt J.: Comparison of prokalcitonin and C-reactive protein plasma concentration at different SOFA scores during the course of sepsis and MODS, Crit Care, 1999 41. Dastych, M.: Instrumentální technika: obor zdravotní laborant. 1. vyd. Brno: Masarykova univerzita, 2010, 131 s. ISBN 978-80-210-4226-1

58

7. Přílohy Příloha č. 1: Tabulka se souborem pacientů pacient číslo 1

číslo 2

číslo 3

číslo 4

číslo 5

den hospitalizace 1 6 7 8 18 1 2 3 1 3 4 5 7 12 13 15 16 17 18 20 21 25 26 1 5 6 7 8 13 16 20 21 22 1 4 6 8 9 15 18 22 24

diagnóza

CRP [mg/l] poranění 356,6 264,25 269,1 313,7 176,39 úraz 325,7 272,2 200,4 zástava 485,5 srdce 339,7 63,3 45,1 65,4 76,24 83,2 68 69,2 70 93,2 89,3 86,2 89,3 71,7 akutní 407,9 pankreatitida 266,8 268,2 260,3 268,68 94,82 56,6 14,6 26,8 15,6 encefalitida 132,4 10 38,96 20,4 67,4 108 188,1 309,2 203,5 59

PCT [ng/ml] 15,18 1,12

Presepsin [pg/ml] 1266 4453

0,8 0,22 12,49

3682 1329 885

81,39 79,25 44,54 26 9,22

2273 2829 2095 2313

1,43

10320

1,06

10980

0,435 5,99

2597 1499

0,89

>20 000

0,087

>20 000

0,153

457

konečný stav sepse zažehnána

sepse zažehnána sepse zažehnána

sepse zažehnána

zemřel 22,56 59,33 33,71 39,58

2564 2437

7,11

>20 000

11 313

pacient číslo 5

číslo 6

číslo 7

číslo 8

číslo 9

číslo 10

číslo 11 číslo 12

číslo 13

den hospitalizace 25 29 32 33 36 37 38 39 1 2 3 4 5 6 8 1 2 3 7 1 2 3 1 2 3 4 1 2 3 1 1 3 5 6 7 10 11 14 15 17 20 21 1 2 3

diagnóza

CRP [mg/l] 103,4 146,7 88,3 121,6 143,4

jaterní selhání

pohrudniční výpotek

Waldenströmova makroglobulinemie akutní pankreatitida

poranění

pankreatitida mnohočetný myelom

hypovolemický šok

60

172,1 220,1 12 96,5 93,3 123,2 53,7 33,3 12,1 201,6 266 319,3 169,6 179,27 189,3 212,8 150,4 110,3 73,7 65,2 47,8 102,3 72 13,1 136,7 247,8 218,5 216,1 252,37 181,5 161,8 115,4 53,8 36,1 137,5 16,5 42,01 39,6 49,9

PCT [ng/ml]

Presepsin konečný [pg/ml] stav

5,93

>20 000

9,78 14,16 27,71

>20 000 >20 000

78,96

1152

13,66

783

0,89

313

sepse zažehnána

sepse zažehnána

6,42 2,67

1263

19,82 32,61 48,33 0,13

1963 2870 3225 1157

zemřel

0,19

693

sepse zažehnána

0,159 0,75 0,817

860 4572 5939

1,1 0,62

9588 4499

0,252 84,8 109,45

916 4765 6308

sepse zažehnána

sepse zažehnána

zemřel

pacient číslo 13

číslo 14

číslo 15

den diagnóza hospitalizace 4 6 7 8 9 10 1 tetraplegie 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 17 18 19 20 21 22 24 28 29 30 32 34 36 39 84 85 86 88 116 1 CLL z B-buněk 4 8 11 13 14 15

CRP [mg/l] 35,6 35,8 49 60,76 59,8 76,9 280

PCT [ng/ml] 73,37

Presepsin konečný [pg/ml] stav 6656

42,89

11847

36,66

11332

200,62 156,4 46,2 116,7 67,1 42,4 41,8 78,5 194,6 241,6 330 300,8 130

326,8 216,6

1704 1764

33,91

1392

68,98

3689

50,7 42,2

2632

105,2 109,6 105,7 153,8 122,5 186,1 338,2 195,4 135,3 142,5 194,78 142,5 343,4 324,8 181,1 24,83 33,8 55,8 37,46 26 38,4 32,7 15,7 61

sepse zažehnána

0,675 1,09 0,525 0,276 0,281 1,61 36,06 19,3 4,92 0,157 0,372 0,55 0,4 0,41

4021

1218

1672 509 657 778 624

sepse zažehnána

pacient číslo 16

číslo 17 číslo 18 číslo 19 číslo 20 číslo 21 číslo 22 číslo 23 číslo 24 číslo 25 číslo 26

číslo 27

číslo 28 číslo 29 číslo 30 číslo 31 číslo 32 číslo 33

číslo 34

den hospitalizace 1 5 6 7 8 10 11 12 13 14 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 2 3 4 6 1 4 6 9 10 11 12 14 16 18 23 24 31 35 1 1 1 1 1 1 5 8 1

diagnóza

CRP [mg/l] 20,74 30,6 36,9

selhání srdce

PCT [ng/ml] 2,89

Presepsin konečný [pg/ml] stav sepse zažehnána

1,01 19,8 36,3 53,3 1,45

obstrukce plic infarkt myokardu novotvar žaludeční vřed infarkt myokardu Crohnova nemoc Bronchopneumonie otřes mozku infarkt myokardu neprůchodný žlučovod

lymfom ze zralých T/NK buněk

poranění funkční dyspepsie tumorózní proces nemoc GIT sepse střevní neprůchodnost onkologické onem. 62

34,9 61,6 272,9 286,8 297,98 328,76 173,51 34,37 303,71 123,4 173,42 202,36

10,26 0,716 1,06 5,51 0,248 0,042 10,62 0,33 2,78 7,94 6,35 253,9(5:33) 4,18 154,2 2,82 60,8 211,3 43,24 28 53,98 11,3 22,3 2,38 31,5 37,9 39,6 1,46 58,3 79,8 0,689 85,4 35,9 73,99 75,25 42,3 1,87 70,5 1,08 311,7 1,79 373,3 1,26 261,8 6,82 0,49 18,3 53,89 143,2 0,454 30,8 0,078 8,2 0,405

19718 753 1143 >20 000 >20 000 181 690 900 944 10737

sepse zažehnána

sepse zažehnána

5612 2915 7771

zemřel

3087

2994 2524

6675

1486 1327 806 1652 >20000

sepse zažehnána zemřel sepse zažehnána

pacient číslo 35

číslo 36 číslo 37 číslo 38 číslo 39 číslo 40 číslo 41 číslo 42 číslo 43 číslo 44 číslo 45 číslo 46 číslo 47 číslo 48 číslo 49

číslo 50 číslo 51 číslo 52 číslo 53 číslo 54 číslo 55 číslo 56 číslo 57 číslo 58

číslo 59

den hospitalizace 1 3 5 6 8 10 1 1 1 1 1 1 3 1 3 1 1 1 1 1 1 1 3 4 6 13 1 1 1 1 1 1 1 1 1 3 4 1 3 4

diagnóza

CRP [mg/l] 229,05 113,7 151,34 204,1 136,1 114,3

sepse

onkologické onem. sepse onkologické onem. bronchopneumonie špatná funkce kolostomie myeloblastická leukemie novotvar

88,8 115,7 106,9 339,3

onemocnění GIT novotvar sepse sepse kožní infekce hypovolemický šok bolest hrudi

onemocnění GIT úraz bronchopneumonie onemocnění GIT sepse novotvar infarkt myokardu onkologické onem. popáleniny

bronchopneumonie

63

97,7 370,78 249,65 151,9 68 16 210,4

64,9 104,7 171,3 107,7 52,1 48,5 27,6

PCT [ng/ml] 16,6 3,82 0,613

Presepsin [pg/ml] 15917 2160 1481

konečný stav sepse zažehnána

988 0,387 1,42 0,312 0,05 1,7 1,51 14,16 4,28 6,53 7,06 0,129 0,414 6,53 1,11 2,62 1,2 29,95 241,6 4,98

sepse zažehnána sepse zažehnána sepse zažehnána sepse zažehnána

sepse zažehnána

905 647 443

sepse zažehnána

266 4,87 0,38 0,63 3,26 1,11 1,47 3,54 0,32 5,59 1,59 0,757 30,91 16,01

sepse zažehnána

582 579 453 1599

sepse zažehnána zemřel

pacient číslo 60 číslo 61 číslo 62

číslo 63 číslo 64

číslo 65

číslo 66

číslo 67

číslo 68 číslo 69

dítě č. 1

dítě č. 2

den hospitalizace 1 1 1 2 3 1 1 2 3 1 2 3 4 5 1 4 7 18 1 4 18 1 2 1 2 3 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6 7 8 9

diagnóza

CRP [mg/l]

bronchopneumonie hypovolemický šok onemocnění GIT

hypovolemický šok obstrukce plic

58,37 89,2 119 82,7 500,1 370,4 391,3

sepse

sepse

ZN-dlouhé kosti DK

sepse onkologické onem.

komoce mozku

respirační selhání

64

241,5 199,3 138,5 79,1 87,06 57,92 143,49 31,3 258,2 397,1 1,81 246,6 42,06 119 137,2 247,2 1 10,3 75,4 136,2 33,6 17 188,3 182,6 130,8 69,4 54,6 48,2 20,1 10 12,6

PCT [ng/ml] 8,1 29,29 0,768 1,55 2,53 4,07 9,3 9,08 9,74 124 115,2

Presepsin konečný [pg/ml] stav sepse zažehnána zemřel

0,347 0,749 20,52 1,6 157,55 >500 0,371 98,6 14,40 >500 224,75 91,2

4392 5304 7356 6928 1200 1601 206 4129 1033

3355 3928

sepse zažehnána

1850 zemřel

sepse zažehnána

sepse zažehnána zemřel sepse zažehnána sepse zažehnána

213 205

15,5

921 614 589 445 488 204

sepse zažehnána

pacient dítě č. 3

dítě č. 4

dítě č. 5

dítě č. 6

den hospitalizace 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

diagnóza bronchopneumonie

kraniotrauma

selhání ledvin

bronchopneumonie

CRP [mg/l] 207 211,9 256 276,8 119,2 45 19 10,4 8,5 5,4 1,6 8,2 212,4 299,3 190,9 6,3 23,9 20,2 77,8 87,3 61 52,7 33,9 35 28 19,1 15,1 8,6 6,1 29 21,3 1 3,7 1,9 8 3,3 31,2 23,9 32,6 33,3

65

PCT [ng/ml]

Presepsin [pg/ml] 1556 1316 1543 988

konečný stav sepse zažehnána

284 sepse zažehnána 221

10,65

1896 2307 2652 2252 2727 3030 3048 2472 2576 3257 3131 1970 1783 1809 1453 1898 79,7 9,6 119

sepse zažehnána

sepse zažehnána

pacient dítě č. 7

dítě č. 8

dítě č. 9

dítě č. 10

dítě č. 11

den hospitalizace 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 15 16 17 18 20 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

diagnóza

CRP [mg/l] subdurální krvácení 1 53,7 28 17 12,6 81,3 106,6 85,2 28,2 18,9 12,6 8 6,2 4,2 5,4 6,2 10,1 4,2 ileus 116,7 253 173 bronchopneumonie 52,3 67 40,2 38,4 bronchopneumonie 72,3 57,6 90,7 77,6 97,9 88 51,6 37,3 24,6 21,5 akutní poškození 69,8 ledvin, sepse 84,2 100,8 77,1 54 49 43 39 28,3

66

PCT [ng/ml]

Presepsin [pg/ml]

konečný stav sepse zažehnána

214 148

1361 305

sepse zažehnána

169 274

sepse zažehnána

zemřel

0,14

448 258 591 751 725 425 602 539 564 sepse zažehnána 1292 954 913

pacient dítě č. 12

dítě č. 13

dítě č. 14

den hospitalizace 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6 7 8 9 11 12

diagnóza

CRP [mg/l] 45,9 168 276,3 213 244,6 229 225,8 200,2 241,1 263,8 266,7 164 95 63,2 43 29,8 53,4 68 59,3 59,2 54,6 64,2 71,8 79,6 91,4 118,3 92 255,6 314 274,6 96,4 50,1 166 145 160,9 91,1 45,4 39,6 21,4 10,9 6,6 6,3 11,5

akutní poškození ledvin, sepse

ALL

bronchopneumonie

67

PCT [ng/ml]

Presepsin konečný [pg/ml] stav sepse zažehnána

1060 31,39

1062

1410

0,57 403 794 482

354 595 601 327 223 119

sepse zažehnána

sepse zažehnána

pacient dítě č. 14

dítě č. 15

dítě č. 16

dítě č. 17

dítě č. 18

den hospitalizace 13 15 16 1 2 3 4 5 6 7 9 10 11 12 13 1 2 3 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

diagnóza

CRP [mg/l] 8 11,2 5,4 203 24,4 151,5 261,6 262 69,6 40,4 41 62,9 64 67,7 46,8 109,5 148 79 20,5 23,8 43 27 8 6,1 3,5 2,2 2,3 5,1 63,6 110,9 134 133,8 94,7 47,4 27,6 15,6 7,4 4,9 16,3 75 77,4 49 22,2

polytrauma, akutní selhání ledvin

meningokoková sepse bronchopneumonie

bronchopneumonie

68

PCT [ng/ml]

Presepsin konečný [pg/ml] stav

sepse zažehnána 887 810 457 371

326 198 235 95,6 176 217 241 166 162 197 114

sepse zažehnána

567 156 296 671 900 475

sepse zažehnána

sepse zažehnána

pacient dítě č. 18

dítě č. 19

den diagnóza hospitalizace 16 17 19 20 2 st.p. hemicolectomii 3 4

69

CRP [mg/l] 20 8,4 3 1,2 139,9 160,3 172,6

PCT [ng/ml]

Presepsin konečný [pg/ml] stav

194 230

sepse zažehnána