76
Lampiran 1 Prosedur uji aktivitas protease (Walter 1984, modifikasi)
Pereaksi Blanko (ml) Standard (ml) Contoh ml) Penyangga Tris-HCl (0.2 M) pH 7.5 1 1 1 Substrat Kasein 1% 1 1 1 Enzim ekstrak kasar 0.2 Akuades steril 0.2 Tirosin standar (5mM) 0.2 Diinkubasi pada suhu ruang selama 10 menit Asam trikloroasetat (10%) 2 2 2 Akuades steril 0.2 0.2 Ekstrak kasar enzim 0.2 Dinkubasi pada suhu 10 0C selama 10 menit selanjutnya disentrifugasi dengan kecepatan 8600 xgselama 15 menit Filtrat 1.5 1.5 1.5 Na 2 CO 3 (0.5 M) 5 5 5 Folin Ciocalteau (1:2) 1 1 1 Dikocok kuat dan didiamkan selama 15 menit, absorbansi diukur pada λ = 578 nm
A contoh - A blanko Unit Aktivitas (UA) =
x P x 1/T A standar - A blanko
Keterangan : UA A contoh A standar A blanko P T
= Unit aktivitas (jumlah enzim yang dapat menghasilkan satu mikromol produk tirosin permenit, pada kondisi uji) = nilai absorbansi contoh = nilai absorbansi standar = nilai absorbansi blanko = faktor pengenceran = waktu inkubasi
77
Lampiran 2 Prosedur uji aktivitas amilase (Bernfeld 1959) Pereaksi
Blanko (mL) 1
Standar (mL) 1
Substrat (pati terlarut 1%) Enzim DNS Aquades
Contoh (mL) 1
1 1 1 Dikocok dan diinkubasi 10 menit pada suhu ruang DNS 1 1 Enzim 1 Dikocok dan dipanaskan pada 100 0C selama 5 menit, kemudian didinginkan dalam air selama 20 menit, diukur absobansi pada λ = 550 nm
Konsentrasi maltosa sampel x FP UA = BM maltosa x Vx T Keterangan : UA = unit aktivitas enzim FP = faktor pengenceran BM = berat molekul ( BM maltosa =360.32 Da) V = volume sampel enzim T = waktu inkubasi
78
Kurva Standar Maltosa Konsentrasi Maltosa (ppm) 0 100 200 300 400 500
Absorban rata-rata (l=550 nm) 0.047 0.571 0.654 0.7 0.794 0.850
Absorban terkoreksi (l= 550 nm) 0 0.098 0.181 1.227 0.322 0.377
Persamaan regresi linear Y = 0.074X – 0.059
0,45 0,40 0,35 0,30
y = 0,074x - 0,059 R² = 0,990
0,25 0,20 0,15 0,10 0,05 0,00 0
100
200
300
400
500
79
Kurva standar protein
Kosentrasi BSA (mg mL-1) 0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1
Absorban rata-rata (λ=595 nm) 0.24 0.32 0.36 0.41 0.46 0.53
Absorban terkoreksi (λ= 595 nm) 0 0.08 0.12 0.18 0.22 0.29
0,35
Absorbansi (λ =550 nm)
0,3 0,25 0,2 0,15
y = 2.7316x + 0.0169 R2 = 0.98
0,1 0,05 0
0
0,05
0,1
Konsentrasi BSA (mg mL-1)
0,15
80
Lampiran 3 Pertumbuhan sepuluh Bacillus terseleksi pada media pakan udang (SF) 1.2 % Kode isolat
Jumlah sel (CFU mL-1)* 24 jam 3.0 x 1011 4.8 x 1012 4.5 x 1010 2.1 x 1010 2.1 x 1011
L3 L5 KAt 5.1 KPs 7.1.2b KAs 7.1.2
0 jam 9.0 x 105 2.3 x 105 1.2 x 106 8.5 x 105 2.6 x 105
48 jam 2.3 x 1013 2.7 x 1013 5.6 x 1012 4.9 x 1012 3.5 x 1013
DP 5.1.1
4.2 x 105
5.5 x 1011
2.9 x 1012
DP 5.1.2
1.9 x 106
9.9 x 1010
1.2 x 1011
DA 2.2.1
3.4 x 105
8.3 x 1011
3.3 x 1010
DA 5.2.3
1.4 x 105
9.6 x 1011
6.5 x 1013
* Jumlah rata-rata dari 2 ulangan
Lampiran 4 Aktivitas protease Bacillus sp. L5 dan DA 5.2.3
Kode
Waktu (jam)
L5
(U mL-1)
Kadar Protein (mg mL-1)
Aktivitas Spesifik ( U mg-1)
1.22 ± 0.02
0.05 ± 0.0
25.3 ± 0.32
1.60 ± 0.093
0.04 ± 0.0
36.72 ± 1.05
1.41± 0.013
0.06 ± 0.0
22.90 ± 1.91
2.0 ± 0.137
0.04 ± 0.0
40.9 3 ± 9.19
0.74 ± 0.005
0.06 ± 0.0
11.46 ± 0.35
1.72 ± 0.100
0.07 ± 0.0
26.32 ± 0.11
1.03±0.001
0.05 ± 0.0
20.03 ± 0.05
1.7 ± 0.121
0.06 ± 0.0
30.06 ± 2.06
Aktivitas
24 DA 5.2.3 L5 48 DA 5.2.3 L5 72 DA 5.2.3 L5 96 DA 5.2.3
81
Lampiran 5 Aktivitas amilase Bacillus sp. L5 dan DA 5.2.3
Kode
Waktu (jam)
L5
(U mL-1)
Kadar Protein (mg mL-1)
Aktivitas Spesifik ( U mg-1)
0.45 ± 0.07
0.05 ± 0.0
9.11 ± 1.38
2.06 ± 0.04
0.04 ± 0.0
47.27 ± 1.50
0.38 ± 0.01
0.06 ± 0.0
6.29 ± 0.27
1.51 ± 0.00
0.04 ± 0.0
35.17 ± 0.32
0.05 ± 0.01
0.06 ± 0.0
0.79 ± 0.09
1.19 ± 0.07
0.07 ± 0.0
18.47 ± 1.40
0
0.05 ± 0.0
0
0.20 ± 0.121
0.06 ± 0.0
3.54 ± 0.64
Aktivitas
24 DA 5.2.3 L5 48 DA 5.2.3 L5 72 DA 5.2.3 L5 96 DA 5.2.3
82
Lampiran 6 Pengaruh waktu produksi protease, amilase dan pertumbuhan sel Bacillus sp. DA 5.2.3
Waktu (jam)
Aktivitas Amilase (U mL-1)
Aktivitas Protease (U mL-1)
1.02 ± 0.13
Aktivitas Spesifik Potease (U mg-1) 21.60 ± 2.79
Jumlah sel (log CFU mL-1)
0.12 ± 0.01
Aktvitas Spesifik Protease (U mg-1) 0.12 ± 0.01
12 24
1.22 ± 0.08
22.5 ± 0.74
0.2 ± 0.013
0.18 ± 0.01
9.34 ± 0.04
36
0.90 ± 0.24
16.7 ± 3.73
0.5 ± 0.03
0.50 ± 0.03
12.07 ± 0.31
48
0.77 ± 0.10
16.7 ± 3.5
1.1
1.07 ± 0.01
13.00 ± 0.27
60
1.16 ± 0.23
17.38 ± 3.84
0.8 ± 0.04
0.80 ± 0.04
13.80 ± 0.33
72
0.8 ± 0.07
11.85 ± 0.77
0.4 ± 0.02
0.37 ± 0.02
13.73 ± 0.2
84
0.78 ± 0.05
14.0 ± 1.48
0.6 ± 0.01
0.61 ± 0.01
0.54 ± 0.36
96
0.44 ± 0.07
7.12 ± 1.03
0.4 ± 0.06
0.42 ± 0.06
0.83 ± 0.39
± 0.01
8.38 ± 0.12
Lampiran 7 Aktivitas protease Bacillus sp. DA 5.2.3 pada rentangan pH pH
6 7 8 9
Aktivitas (U mL-1) 0.22 ± 0.76 ± 2.10 ± 0.50 ±
0.01 0 0.08 0.01
Kadar Protein (mg mL-1)
Aktivitas Spesifik (U mg-1)
0.06 ± 0.07 ± 0.06 ± 0.07 ±
3.53 ± 11.15 ± 33..35 ± 7.11 ±
0.01 0.01 0.01 0.01
0.62 1.14 4.26 1.33
Aktivitas Relatif (%) 10.66 ± 33.53 ± 100 ± 21.75 ±
0.50 0.85 0 1.21
Lampiran 8 Aktivitas amilase Bacillus sp. DA 5.2.3 pada rentangan pH pH 6 7 8 9
Aktivitas (U mL-1) 2.35 ± 0.17 1.08 ± 0.01 1.16 ± 0.11 0.60 ± 0.29
Kadar Protein (mg mL-1) 0.06 ± 0.01 0.07 ± 0.01 0.06 ± 0.01 0.0 7± 0.01
Aktivitas Spesif (U mg-1) 40.09 ± 7.58 16.00 ± 1.83 18.44 ± 0.07 9.87 ± 6.09
Aktivitas Relatif (%) 100 ± 0 40.49 ± 3.09 47.73 ± 9.20 22.55 ± 10.39
Lampiran 9 Aktivitas protease Bacillus sp. DA 5.2.3 pada rentangan salinitas
83
Salinitas
Aktivitas (U ml-1)
0 1.5 2.5 3.5
0.74 ± 0.04 0.62 ± 0.01 0.41 ± 0.00 0.51 ± 0.02
Kadar Protein (mg mL-1) 0.06 ± 0.07 ± 0.06 ± 0.07 ±
0.01 0.01 0.01 0.01
Aktivitas Spesifik (U mg-1) 13.29 ± 0.94 9.65 ± 0.42 7.92 ± 0.84 8.80 ± 0.88
Aktivitas Relatif (%) 100 ± 0 73.18 ± 8.31 60.32 ± 10.58 66.10 ± 1.96
Lampiran 10 Aktivitas amilase Bacillus sp. DA 5.2.3 pada rentangan salinitas Salinitas (%) 0 1.5 2.5 3.5
Aktivitas (U mL-1)
Kadar Protein (mg mL-1)
Aktivitas Spesifik (U mg-1)
0.06 ± 0.07 ± 0.06 ± 0.07 ±
13.72 ± 0.29 24.21 ± 0.84 20.12 ± 2.62 12.21 ± 0.82
0.77 ± 0.03 1.56 ± 0.02 1.03 ± 0.03 0.71 ± 0.00
0.01 0.01 0.01 0.01
Aktivitas Relatif (%) 56.69 100 82.83 50.59
± ± ± ±
0.75 0 7.94 5.13
Lampiran 11 Stabilitas protease Bacillus sp. DA 5.2.3 pada pH 8, salinitas 0 (kondisi optimum reaksi enzim) Waktu nkubasi (jam)
0 1 2 3 4 5 6
Aktivitas Protease (U ml-1) 0.12 ± 0.01
Aktivitas Relatif (%) 100 ± 0
0.16 ± 0.01 0.47 ± 0.04 0.30 ± 0.01 0.28 ± 0.04 0.23 ± 0.01
133.03 ± 8.59 384.08 ± 43.08 245.75 ± 10.50 227.10 ± 28.69
0.19 ± 0.02
150.07 ± 14.89
187.75 ± 3.62
Lampiran 12 Stabilitas protease Bacillus sp. DA 5.2.3 pada kondisi umum tambak udang (pH 8, salinitas 2.5%) Waktu Inkubasi (jam) 0 1 2 3 4 5 6
Aktivitas Protease (U ml-1) 0.70 ± 0.00 0.56 ± 0.02 0.58 ± 0.01 0.46 ± 0.01 0.32 ± 0.02 0.27 ± 0.02 0.17 ± 0.03
Aktivitas Relatif (%) 100 ± 0 80.29 ± 9.13 82.22 ± 5.78 65.28 ± 5.44 57.20 ± 2.15 47.10 ± 3.69 38.00 ± 13.81
Lampiran 13 Stabilitas amilase Bacillus sp. DA 5.2.3 pada kondisi
84
pH 6, salinitas 1.5% (optimum) Waktu Inkubasi (jam) 0 1 2 3 4 5 6
Aktivitas (U ml-1) 1.10 ± 0.02 1.37 ± 0.15 1.25 ± 0.10 1.21 ± 0.01 1.03 ± 0.12 0.83 ± 0.16 0.77 ± 0.05
Aktivitas Relatif (%) 100.00 ± 0 124.44 ± 8.57 113.67 ± 15.85 109.92 ± 1.96 93.69 ± 7.92 75.95 ± 13.81 69.80 ± 7.11
Lampiran 14 Stabilitas amilase Bacillus sp. DA 5.2.3 pada kondisi umum tambak (pH 8, salinitas 2.5%) Waktu nkubasi (jam) 0 1 2 3 4 5 6
Aktivitas Protease (U ml-1) 0.26 ± 0.01 0.78 0.45 0.28 0.30 0.31 0.22
± ± ± ± ± ±
0.01 0.01 0.00 0.01 0.01 0.02
Aktivitas Relatif (%) 100 ± 0.00 115.28 ± 36.11 120.94 ± 11.71 110.94 ± 30.66 95.84 ± 9.25 121.69 ± 9.23 123.00 ± 3.08
Lampiran 15 Komposisi larutan untuk SDS-PAGE Pembuatan Larutan 1.
Larutan A : larutan Akrilamid 100 ml 30% (w/v) akrilamid, 0.8% (w/v) bis-akliramid a. 29.29 gram akrilamid b. 0.89 gram bis-akrilamid Kedua bahan diatas ditambah dengan air destilata sampai 100mL diaduk sampai larut sempurna. Larutan ini dapat disimpan dalam refrigerator selama beberapa bulan.
2.
Larutan B : (bufer gel pemisah 4x) 100 mL a. 2 M Tris HCL (pH 8-8) 75 mL b. 10% SDS 4 ml (0.4%) c. H 2 O 21 ml Stabil disimpan beberapa bulan dalam refrigerator
3.
Larutan C a. 0.1M Tris-HCl (pH 6.8) 50 mL b. 10% SDS 4 mL (0.4%) c. H 2 O 4.5 mL Stabil disimpan beberapa bulan dalam refrigerator
85
4.
Ammonium Persulfat 10%, 5 mL a. 0.5 g ammonium persulfat b. H 2 O 5 mL Stabil disimpan beberapa bulan dalam tabung tertutupdalam refrigerator
5.
Bufer eleksoforesis, 1 L a. 3 g Tris 25 mM b. 14.4 g glisin 25 mM c. SDS 1 gr 0.1% d. Tambahkan H 2 O menjadi 1 L pH sekitar 8.3 , stabil disimpan pada suhu ruang
6.
Bufer sampel 5x, 10 mL a. 1 M Tris – HCl 0.6 mL (pH 6.8) 60 mM b. Gliserol 50% 5 mL c. SDS 10% 2 ml 2% d. 2- merkaptoetanol 0.5mL e. Bromophenol blue 1%, 1 mL f. H 2 O 0.9 mL Stabil disimpan beberapa minggu dalam refrigerator atau beberapa bulan pada -200C
Penghitungan X % gel pemisah Larutan A Larutan B H2O 10% Ammonium persulfat TEMED Total volume
X/3 mL 2.5 mL 7.5. X/3) mL 50 µl 5 µl (10 µl jika X<8) 10 mL
Persiapan gel pemisah (8%) 2.7 mL larutan A 2.5 mL larutan B 4.8 mL H 2 O 50 µl 10% Ammonium persulfat 5 ml TEMED
Persiapan gel penahan H2O 2.3 mL Larutan A 0.67 mL Larutan C 10 mL Lampiran 16 TSS dari kultur Bacillus sp. DA 5.2.3 pada media pakan udang (SF)
86
1.2% A. Bacillus sp. DA 5.2.3 Waktu
N
Berat akhir (gr)
( hari)
0
1
2
3
4
Berat Awal (gr)
( Spl + K)
(K)
1 2
0.13 0.14
1 2
Volume (mL)
RerataTSS -1
Penurunan TSS ± SE
( Spl)
(mg L )
0.11 0.12
15 15
1745
0 ±0
0.13 0.14
0.11 0.11
15 15
1366
22 ± 89
1 2
0.14 0.12
0.12 0.11
20 20
889
49±41
1 2
0.16 0.14
0.14 0.12
20 20
868
50±76
1 2
0.13 0.14
0.11 0.13
20 20
842
52±49
Keterangan: N K
= ulangan = kertas saring
Spl = sampel SE = standard error
(%)
TSS = total suspended solid
B. Bacillus sp. SP Waktu
N
( hari)
0
1
2
3
4
Berat akhir (gr)
Berat Awal (gr)
Volume Spl (mL)
RerataTSS -1
(mg L )
Penurunan TSS ±SE
(Spl + K)
(K)
(%)
1 2
0.13 0.13
0.11 0.10
15 15
1743
0±73
1 2
0.14 0.14
0.11 0.11
15 20
1739
0±39
1 2
0.14 0.13
0.11 0.10
20 20
1370
21±46
1 2
0.14 0.15
0.12 0.14
10 10
986
45±98
1 2
0.15 0.15
0.13 0.13
10 20
836
51±32
87
A. Kontrol (tanpa bakteri) Waktu ( hari)
0
1
2
3
4
N
Berat akhir (gr) (Spl + K)
Berat awal (gr) (K)
Volume Spl (mL)
RerataTSS (mg L-1)
Penurunan TSS±SE (%)
1 2
0.13 0.13
0.10 0.11
15 15
1750
0±43
1 2
0.14 0.14
0.11 0.11
20 20
1705
1±67
1 2
0.17 0.15
0.14 0.12
20 20
1393
20±92
1 2
0.16 0.13
0.13 0.10
20 20
1366
22±46
1 2
0.16 0.14
0.13 0.12
20 20
1306
25±51
Lampiran 17 Sekuen 16s rRNA Bacillus sp. DA 5.2.3 > Bacillus sp. DA 5.2.3 AAGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCCATAAGACTGGGATA ACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATAACATTTTGAACCGCATGGTTCGAAATT GAAAGGCGGCTTCGGCTGTCACTTATGGATGGACCCGCGTCGCATTAGCTAGTTGGTG AGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCAC ACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCG CAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGCTTTCGGGTCG TAAAACTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCTAGTTGAATAAGCTGGCACCTTGACG GT ACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGG TGGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGTGGTTTCTTAAGTC TGATGTGAAAGCCCACGGCTCAACCGTGGAGGGTCATTGGAAACTGGGAGACTTGAG TGCAGAAGAGGAAAGTGGAATTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATATGGAG GAACACCAGTGGCGAAGGCGACTTTCTGGTCTGTAACTGACACTGAGGCGCGAAAGC GTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCT AAGTGTTAGAGGGTTCCGCCCTTTAGTGCTGAAGTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGG GGAGTACGGCCCCAAGGCTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGT GGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTC TGAAAACCCTAGAGATAGGGCTTCTCCTTCGGGAGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGG TTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTT GATCTTAGTTGCCATCATTAAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGG AGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGT GCTACAATGGACGGTACAAAGAGCTGCAAGACCGCGAGGTGGAGCTAATCTCATAAA ACCGTTCTTCAGTTCGGATTGTAGGCTGCAACTCGCCTACATGAAGCTGGAATCGCTA GTAATCGCGGA
88
Lampiran 18
Hasil analisis Blast sekuen gen penyandi 16S rRNA Bacillus sp. DA 5.2.3
Nomor akses
Spesies Bacillus homolog
% Permintaan terpenuhi
GU 125426.1
Gen 16S rRNA Bacillus cereus strain IMAU800004
GU 125425.1
Gen 16S rRNA Bacillus cereus strain IMAU80003
GU113075.1
Gen 16S rRNA Bacillus sp. PS(2009)
EU333128.1
Gen 16S rRNA Bacillus cereus strain DBT3ST4
EU333125.1
Gen 16S rRNA Bacillus sp. Pc60
% kesamaan maksimum
100
99
100
99
100
99
100
99
100
99
