LAMPIRAN
Lampiran 1. Prosedur analisa kadar amilosa modifikasi metode IRRI (AOAC1995)
Absorbansi
Sebanyak 100 mg sampel dilarutkan dalam 1 ml etanol 95% dan 9 ml NaOH 1N. Kemudian larutan dipanaskan pada suhu 80-100oC selama ± 10 menit sampai tergelatinisasi. Larutan didinginkan lalu ditera pada labu takar 100 ml dengan akuades sebagai larutan induk. Selanjutnya diambil 1 ml sampel yang telah diencerkan dari larutan induk. Sampel tersebut ditambahkan dengan 0,1 ml iod 0,2%, 0,2 ml asam asetat 1N, dan 3 ml akuades. Setelah didiamkan selama 20 menit lalu diukur nilai absorbansi pada spektrofotometer dengan panjang gelombang 620 nm. Untuk kurva standar dibuat dengan cara yang sama dengan penentuan kadar amilosa pada sampel. Sebanyak 40 mg amilosa standar ditambahkan dengan 1 ml etanol 95% dan 9 ml NaOH 1N lalu dipanaskan pada suhu 80-100oC selama ± 10 menit sampai tergelatinisasi. Kemudian larutan didinginkan lalu dimasukkan ke dalam labu takar 100 ml dan ditera dengan akuades. Selanjutnya dari labu takar tersebut dibuat beberapa konsentrasi mulai dari 50, 100, 150, sampai 200 ppm. Sampel diambil sebanyak 1ml dari masing-masing konsentrasi lalu ditambahkan 0,1 ml iod 0,2%, 0,2 ml asam asetat 1N, dan 3 ml akuades. Setelah didiamkan selama 20 menit, diukur nilai absorbansi pada spektrofotometer dengan panjang gelombang 620 nm. Kurva Standar Kadar Amilosa 1 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0
y = 0,004x + 0,019 R² = 0,998
0
50
100
150
200
250
Konsentrasi (ppm)
Persamaan kurva standar : y = 0,0046x + 0,0196 Keterangan : x = konsentrasi pati y = nilai absorbansi Cara menentukan kadar amilosa : 1.) Data hasil pembacaan spektrofotometer adalah nilai y 2.) Tentukan nilai x dengan menggunakan persamaan linier kurva standar amilosa 3.) Perhitungan dengan rumus: %
konsentrasi pati x faktor pengenceran x100% bobot sampel
44
Lampiran 2. Prosedur pengukuran total gula dengan metode fenol-sulfat (Dubois et al. 1956) dan kurva standar glukosa untuk total gula Prosedur Pengukuran Total Gula Sampel sebanyak 1 ml (mengandung ≤ 100 µg karbohidrat) ditambahkan dengan 0,5 ml larutan fenol 5% kemudian dikocok-kocok dengan vortex agar homogen. Dilakukan penambahan 2,5 ml H2SO4 secara langsung pada bagian permukaan (tanpa menyentuh dinding tabung reaksi). Reaksi pencampuran didiamkan tanpa gangguan selama 10 menit. Pembacaan nilai absorbansi dilakukan minimal 30 menit setelah pengocokan pada panjang gelombang 490 nm. Pembacaan pada spektrofotometer memberikan nilai dalam satuan absorbansi sehingga untuk mengetahui jumlah total gula dalam sample tesebut, terlebih dahulu dibuat kuva standar glukosa. Untuk pembuatan kuva standar glukosa digunakan glukosa standar (0, 10,20, 30, dan 40 ppm). Masing-masing diambil 1 ml sesuai dengan prosedur pengukuran total gula. Hasil pembacaan pada spektrofotometer dikumpulkan dan dicari persamaannya, dari persamaan inilah dapat diketahui jumlah total gula yang terdapat di dalam sampel. Kurva Standar Glukosa Untuk Total Gula Konsentrasi(ppm)
Abs
10
0,245
10
0,242
10
0,236
20
0,443
20
0,435
20
0,442
30
0,639
30
0,646
30
0,642
40
0,833
40
0,831
40
0,835
0,9 A b s o r b a n s i
0,8
y = 0,019x + 0,044 R² = 0,999
0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 0
10
20 30 Konsentrasi gula (ppm)
40
50
Persamaan kurva standar : y = 0.0198x + 0.0445 Keterangan : x = nilai konsentrasi total gula y = nilai absorbansi
45
Lampiran 3. Tata cara analisa gula pereduksi metode Park-Johnson yang dimodifikasi (Hizukuri et al. 1981) Prinsip
:
Prosedur
Tereduksinya ferrisianida menjadi ferrosianida oleh senyawa gula pereduksi. Jumlah ferrosianida yang terbentuk ekivcalen dengan jumlah gula pereduksi dalam sampel. :
Sampel sebanyak 1 ml (mengandung 10µg gula pereduksi) ditambahkan 0,5 ml larutan buffer sodium karbonat–sodium hidrogen karbonat (4,8 g Na2CO3, 9,2 g NaHCO3, dan 0,65 g KCN yang dilarutkan dalam aquades sampai 1L) dan ditambahkan 0,5 ml larutan potassium ferrisianid 0,1 % (b/v). Campuran larutan tersebut dipanaskan dalam penangas air selama 15 menit dan dinginkan dalam air mengalir selama 10 menit. Larutan tersebut ditambahkan 2,5 ml larutan ferric amonium sulfat (3g (NH4) Fe (SO3)4. 2H20 di dalam 1 L larutan 50 mM H2SO4), dikocok-kocok dengan vortex dan didiamkan selama 20 menit pada suhu ruang sebelum pembacaan absorbansi pada 715 nm.
Kurva Standar Gula Pereduksi Konsentrasi (ppm)
Abs
1
0,190
1
0,193
2
0,328
2
0,330
3
0,447
3
0,436
4
0,620
4
0,620
5
0,731
5
0,724
6
0,865
6
0,844
0,9 A b s o r b a s i
y = 0,134x + 0,058 R² = 0,996
0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 0
1
2
3 4 Konsentrasi gula (ppm)
5
6
7
Persamaan kurva standar : y = 0,134x + 0,0584 Keterangan : x = nilai konsentrasi gula pereduksi y = nilai absorbansi
46
Lampiran 4. Penentuan aktivitas α-amilase (bacterial) Gula Pereduksi (μg/ml) 14,179 366,067
Jumlah Gula Pereduksi (μmol)
Unit/ ml Enzim
Larutan Induk (fp=1000x)
1,95493
0,521316
521,316
Menit
Absorbansi
0 15
0,066 0,158
30
0,244
680,312
1,746
0,46555
465,55
45
0,289
845,703
0,919
0,245025
245,025
60
0,365
1125,032
1,552
0,41382
413,82
75
0,375
1161,785
0,204
0,05445
54,45
90 105
0,402 0,404
1264,696 1270,209
0,572 0,031
0,15246 0,00817
152,46 8,17
120
0,553
1817,840
3,042
0,811305
135
0,555
1827,028
0,051
0,01361
811,305 13,61
150
0,604
2005,284
0,99
0,264082
264,082
165
0,622
2069,603
0,357
0,095287
95,287
180
0,664
2225,806
0,868
0,231412
231,412
∑U = 811,305 U/ml A b s o r b a n s i
0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0,0 0
15
30
45
60
75
90
105 120 135 150 165 180
Waktu (menit) Cara Perhitungan : Menit Ke-0 : Persamaan kurva standar y = 0,134x+ 0,0584 gula pereduksi (x) = (0,066 – 0.0584) / 0,134 = 0,056716 Faktor pengenceran = 0,056716 *250 = 14,179 μg/ml Menit ke-15 : gula pereduksi (x) = (0,158 – 0.0584) / 0,134 =0,743284 Faktor pengenceran = 0,743284 * 1,97*250 = 366,067 μg/ml Selisih gula pereduksi (menit ke-0 dan ke-15) = 366,067– 14,179= 351,888 Σ mol gula pereduksi = Gula pereduksi / BM glukosa = 351,888 μg/ml /180 μg/μmol = 1,95493 μmol/ml Enzim yang ditambahkan adalah 10 ml dan Total larutan campuran 40 ml. Unit / ml enzim = (1,95493 μmol/ml * (40/10 ) ) / 15 menit = 0,521316 U/ml Pengenceran terhadap α-amilase adalah 1000 kali, maka aktivitas enzim pada larutan induk adalah = 0,521316* 1000 = 521,316U/ml
47
Lampiran 5. Penentuan aktivitas α-amilase (pankreatin) jumlah gula pereduksi (μmol)
0,157 0,5
Gula Pereduksi (μg/ml) 146,418 658,358
45 60 75 90
0,683 0,713 0,723 0,742 0,766
931,493 977,015 991,194 1020,299 1056,119
105 120 135 150 165
0,816 0,824 0,826 0,834 0,848
1130, 746 1141, 940 1145, 672 1157,612 1178,507
180
0,852
1183,731
Menit
Absorbansi
0 15 30
Unit/ ml Enzim
Larutan Induk (fp=1000x)
2,844
0,75843
1,517 0,252 0,078 0,161 0,199
0,40464 0,06744 0,02101 0,04312 0,05307
758,430 404,640 67,440 21,010 43,120 53,070
0,414 0,062 0,02 0,066 0,116
0,11056 0,01658 0,00553 0,01769 0,03096
110,560 16,580 5,530 17,690 30,960
0,029
0,00774
7,740
∑U = 758,430 U/ml A b s o r b a n s i
0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 0
15
30
45
60
75
90
105
120
135
150
165
180
Waktu (menit) Cara Perhitungan: Menit Ke-0 : Persamaan kurva standar y = 0,134x+ 0,0584 gula pereduksi (x) = (0,157– 0.0584) / 0,134 = 0,7358 Faktor pengenceran = 0,7358*200 = 147,16 μg/ml Menit ke-15 : gula pereduksi (x) = (0,5– 0.0584) / 0,134 = 3,2955 Faktor pengenceran = 3,2955*200 = 659,10μg/ml Selisih gula pereduksi (menit ke-0 dan ke-15) = 659,10– 147,16 = 511,94 Σ mol gula pereduksi = Gula pereduksi / BM glukosa = 511,94 μg/ml /180 μg/μmol = 2,844 μmol/ml Enzim yang ditambahkan adalah 10 ml dan Total larutan campuran 40 ml. Unit / ml enzim = (2,844 μmol/ml * (40/10 ) ) / 15 menit = 0,75843 U/ml Pengenceran terhadap α-amilase adalah 1000 kali, maka aktivitas enzim pada larutan induk adalah = 0,75843 * 1000 = 758,43 U/ml
48
