LAMPIRAN
Lampiran 1 Metode pengujian aktivitas protease (Walter 1984) Pereaksi Blanko (µl) Standar (µl) Sampel (µl) Penyangga Tris -HCl (0.2 M) pH 7.5 500 500 500 Substrat kasein for biochemistry(1 %) 500 500 500 Ekstrak kasar enzim 100 Akuades steril 100 L-Tirosin standar (5 mM) 100 diinkubasi pada suhu optimum selama 10 menit Asam trikloroasetat (10 %) 1000 1000 1000 Akuades steril 100 Ekstrak kasar enzim 100 100 diinkubasi pada suhu 10 ºC selama 10 menit kemudian di sentrifugasi dengan kecepatan 9000 rpm selama 10 menit Filtrat 750 750 750 Na 2CO3 (0.5 M) 2500 2500 2500 Folin Ciocalteu (1:2) 500 500 500 didiamkan selama 15 menit kemudian diukur absorbansinya pada panjang gelombang 578 nm
A sampel – A blanko Aktivitas protease dihitung dengan rumus UA =
x P x 1/T A standar – A blanko
Keterangan: UA : jumlah enzim yang dapat menghasilkan 1 mikromol produk tirosin per menit (U/ml), 1U sama dengan 16.67 nkat/ml. A sampel : nilai absorbansi sampel A standar : nilai absorbansi standar A blanko : nilai absorbansi blanko P : faktor pengenceran T : waktu inkubasi
Lampiran 2 Metode pengukuran kadar protein (Bradford 1976) Stok Pereaksi Bradford Jenis Bahan
Jumlah 0.05 gram 25 ml 50 ml
CBB G-250 Etanol 95 % Asam Fosfor (orto fosfor)
CBB G-250, etanol 95 %, dan asam fosfor (orto fosfor) dilarutkan dengan akuades dalam labu takar ditepatkan sampai 500 ml, kemudian dikocok kuat hingga larutan homogen. Larutan disaring menggunakan kertas saring dan disimpan pada suhu dingin dalam botol gelap. Pereaksi diencerkan lima kali sebelum digunakan. v Pembuatan Kurva Standar Sebelum digunakan pereaksi diencerkan dengan akuades (Akuades : pereaksi = 4:1) dan larutan BSA 1 mg/ml diencerkan dengan akuades (perbandingan 1:9). Kurva standar dibuat dengan menambahkan sebanyak 4 ml pereaksi Bradford ke dalam 0.4 ml larutan BSA (bovine serum albumin ) dengan konsentrasi 0.00 mg/ml – 0.10 mg/ml. Selanjutnya campuran tersebut diinkubasi selama 10 menit pada suhu ruang dan absorbansinya dibaca pada panjang gelombang 595 nm. Konsentrasi BSA pembuatan kurva standar mikroasai Konsentrasi BSA (mg/ml) BSA (ml) Akuades (ml) 0.00 0.00 0.40 0.01 0.04 0.36 0.02 0.08 0.32 0.03 0.12 0.28 0.04 0.16 0.24 0.05 0.20 0.20 0.06 0.24 0.16 0.07 0.28 0.12 0.08 0.32 0.08 0.09 0.36 0.04 0.10 0.40 0.00 v Pengukuran Sampel dan Blanko Sampel Blanko
: 0.4 ml ekstrak kasar enzim dicampur dengan 4 ml pereaksi Bradford, dikocok kuat dan absorbansinya diukur pada panjang gelombang 595 nm. : 0.4 ml akuades dicampur dengan 4 ml pereaksi Bradford, dikocok kuat dan absorbansinya diukur pada panjang gelombang 595 nm.
v Aktivitas spesifik dihitung dengan rumus : Aktivitas spesifik =
Aktivitas Protease (U/ml) Kadar Protein (mg/ml)
Lampiran 3 Pereaksi-pereaksi yang digunakan 1. 2. 3.
4. 5. 6. 7.
8.
Substrat Kasein (Hidrolisat) 1% (w/v) 1 g kasein hidrolisat dilarutkan dalam 100 ml bufer Tris-HCl 0.2 M. Substrat Bulu Ayam 1% (w/v) 1 g tepung bulu ayam dilarutkan dalam 100 ml bufer Tris-HCl 0.2 M. Standar Tirosin 5mM (5mmol/l) 0.018 g tirosin dilarutkan dalam 20 ml akuades, menggunakan pengaduk magnetik dengan kecepatan rendah. Larutan Asam Trikloroasetat (TCA) 10% (w/v) 10 g asam trikloroasetat dilarutkan dalam 100 ml akuades. Larutan Natrium Karbonat (Na2CO 3 ) 0.5 M 5.3 g Na2 CO3 dilarutkan dalam 100 ml akuades. Pereaksi Folin Ciocaletau (1:2) 50 ml larutan Folin Ciocalteau dilarutkan dalam 100 ml akuades. Bufer Tris-HCl 0.2 M Larutan A : Tris (Hidroksimetil aminometan) 0.2 M (Larutkan 24.2 g dalam 1000 ml) Larutan B : HCl 0.2 M Pembuatan : 50 ml A + Æ ml B, dilarutkan dengan akuades hingga total 200 ml Æ pH 5.0 9.0 8.1 8.8 12.2 8.6 16.5 8.4 21.9 8.2 26.8 8.0 32.5 7.8 38.4 7.6 41.4 7.4 44.2 7.2 Bufer Sitrat 0.2M Larutan A : Asam Sitrat 0.2 M (42.02 g dalam 1000ml) Larutan B : Sodium Sitrat 0. 2 M (58.82 g C6 H1 2O 6 Na. 2H2 O dalam 1000 ml) Pembuatan : ë ml A + â ml B dilarutkan hingga total 100 ml ë â pH
20.5 29.5 5.0 18.0 32.0 5.2 10.0 34.0 5.4 13.7 36.3 5.6 11.8 38.2 5.8 8.5 41.5 6.0 9. Bufer Glisin-NaOH 0.2 M Larutan A : Glisin 0.2 M (15.01 g dalam 1000ml) Larutan B : NaOH 0.2 M Pembuatan : 50 ml A + x ml B dilarutkan hingga total 200 ml x pH x pH 4.0 8.6 22.4 9.6 6.0 8.8 27.2 9.8 8.8 9.0 32.0 10.0 12.0 9.2 38.6 10.4 16.8 9.4 45.5 10.6 10. Bufer Fosfat-NaOH 0.2 M Larutan A : Na2 HPO4. 2H2 O 0.2 M (35.6 g dalam 1000 ml akuades) Larutan B : NaOH 0.2 M Pembuatan : pH 11 : Larutkan 50 ml A + titrasi dengan NaOH 0.2 M pH 12 : Larutkan 50 ml A + titrasi dengan NaOH 0.2 M
Lampiran 4 Kurva produksi protease Streptomyces spp. galur SLW 8-1, C 1-3, dan 45I-3 Hari ke3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Aktivitas Protease (nkat/ml) SLW 81 C 1-3 45I-3 0.000 0.000 0.030 0.073 0.020 0.038 0.097 0.028 0.025 0.127 0.037 0.012 0.160 0.105 0.024 0.156 0.037 0.023 0.060 0.022 0.031 0.130 0.008 0.030 0.065 0.025 0.003 0.078 0.032 0.028 0.063 0.005 0.026 0.035 0.013 0.024
Lampiran 5 Aktivitas protease isolat SLW 8-1 pada berbagai pH pH Aktivitas Protease 1 (nkat/mg) Aktivitas Protease 2 (nkat/mg) 8 0.18 0.17 8.5 0.39 0.35 9 0.65 0.54 10 0.36 0.26 11 0.25 0.18 12 0.09 0.07 Kadar Protein: 0.113 mg/ml, aktivitas diukur pada suhu 37 º C.
Rata-rata 0.18 0.37 0.59 0.31 0.21 0.08
Lampiran 6 Aktivitas protease isolat C 1-3 pada berbagai pH pH Aktivitas Protease 1 (nkat/mg) Aktivitas Protease 2 (nkat/mg) 7 0.11 0.16 7.5 0.15 0.21 8 0.24 0.19 8.5 0.20 0.12 9 0.22 0.27 10 0.12 0.05 11 0.07 0.02 12 0.07 0.02 Kadar Protein : 0.117 mg/ml, aktivitas diukur pada suhu 37 º C.
Rata-rata 0.13 0.18 0.22 0.16 0.24 0.09 0.05 0.05
Lampiran 7 Aktivitas protease isolat 45I -3 pada berbagai pH pH Aktivitas Protease 1 (nkat/mg) Aktivitas Protease 2 (nkat/mg) 5 0.06 0.03 5.5 0.18 0.27 6 0.21 0.28 6.5 0.37 0.25 7 0.32 0.45 7.5 0.52 0.46 8 0.24 0.34 8.5 0.27 0.18 9 0.08 0.26 Lampiran 8 Aktivitas protease SLWdiukur 8-1 pada berbagai Kadar Protein : 0.117 mg/ml,isolat aktivitas pada suhu 37suhu º C. (°C)
Rata-rata 0.04 0.23 0.24 0.31 0.38 0.49 0.29 0.22 0.17
Lampiran 8 Aktivitas protease isolat SLW 8-1 pada berbagai suhu Suhu Aktivitas Protease 1 (nkat/mg) Aktivitas Protease 2 (nkat/mg) (ºC) 30 0.10 0.16 40 0.60 0.65 50 0.54 0.58 60 0.10 0.06 70 0.44 0.30 80 0.68 0.77 90 0.18 0.12 Kadar Protein : 0.113 mg/ml, aktivitas diukur pada pH 9 (pH optimum).
Rata-rata 0.13 0.63 0.56 0.08 0.37 0.73 0.15
Lampiran 9 Aktivitas protease isolat C 1-3 pada berbagai suhu Suhu Aktivitas Protease 1 (nkat/mg) Aktivitas Protease 2 (nkat/mg) (ºC) 30 0.33 0.28 40 0.39 0.33 50 0.14 0.12 60 0.06 0.00 70 0.00 0.00 80 0.00 0.00 90 0.00 0.00 Kadar Protein : 0.109 mg/ml, aktivitas diukur pada pH 9 (pH optimum).
Rata-rata 0.31 0.36 0.13 0.03 0.00 0.00 0.00
Lampiran 10 Aktivitas protease isolat 45I-3 pada berbagai suhu Suhu Aktivitas Protease 1 (nkat/mg) Aktivitas Protease 2 (nkat/mg) (ºC) 30 0.03 0.03 40 0.29 0.20 50 0.52 0.43 60 0.14 0.11 70 0.03 0.03 80 0.13 0.11 90 0.19 0.13 Kadar Protein : 0.117 mg/ml, aktivitas diukur pada pH 7.5 (pH optimum).
Rata-rata 0.03 0.24 0.48 0.13 0.03 0.12 0.16
Lampiran 11 Uji kemampuan keratinolitik isolat SLW 8-1 Aktivitas Protease Aktivitas Protease Rata-rata 1 (nkat/mg) 2 (nkat/mg) Substrat Kasein 19.97 21.04 20.50 Substrat Bulu Ayam 39.78 28.86 34.32 Kadar Protein : 0.147 mg/ml, aktivitas diukur pada pH 9 dan suhu 80 ºC.
% Aktv. Relatif 100 167.4
Lampiran 12 Uji kemampuan keratinolitik isolat C 1-3 Aktivitas Protease Aktivitas Protease Rata-rata 1 (nkat/mg) 2 (nkat/mg) Substrat Kasein 15.63 7.74 11.68 Substrat Bulu Ayam 55.97 48.11 52.04 Kadar Protein : 0.117 mg/ml, aktivitas diukur pada pH 9 dan suhu 40 ºC.
% Aktv. Relatif 100 445.41
Lampiran 13 Uji kemampuan keratinolitik isolat 45I-3 Aktivitas Protease Aktivitas Protease Rata-rata 1 (nkat/mg) 2 (nkat/mg) Substrat Kasein 29.93 28.13 29.03 Substrat Bulu Ayam 33.46 35.84 34.65 Kadar Protein : 0.124 mg/ml, aktivitas diukur pada pH 9 dan suhu 50 ºC.
% Aktv. Relatif 100 119.36
