3
- Mengetahui pengaruh getah pepaya, papain, dan ekstrak etanol getah pepaya terhadap membran S. aureus yang ditentukan dari jumlah material sitoplasma yang dilepaskan menggunakan spektrofotometer UV-VIS. - Mengetahui pengaruh getah pepaya, papain, dan ekstrak etanol getah pepaya terhadap membran S. aureus menggunakan DNA probe staining yaitu SYBR Green dan Propidium Iodida (PI). Hipotesis Getah pepaya diketahui memiliki efek antimikroba yang mampu menghambat pertumbuhan beberapa bakteri. Getah pepaya diperkirakan dapat menghambat pertumbuhan S. aureus pada produk pangan. Selain itu, juga diperkirakan mampu mengakibatkan kebocoran pada membran sel bakteri yang dapat dideteksi dengan menentukan jumlah material sel yang keluar akibat kebocoran dengan cara mengukur absorbansi supernatan pada panjang gelombang 260 nm menggunakan spektrofotometer UV-VIS serta dengan menggunakan pewarna DNA yang diamati menggunakan mikroskop fluoresens.
Manfaat Penelitian Penelitian ini diharapkan dapat menjadi sumber informasi mengenai alternatif bahan antibakteri yang bersifat alami dan dapat diterapkan pada proses pengolahan pangan. Selain itu, diharapkan pula penelitian ini menjadi sumber informasi mengenai salah satu metode untuk menguji mekanisme penghambatan oleh bahan antibakteri.
2 TINJAUAN PUSTAKA Dangke Dangke merupakan produk olahan susu sapi atau susu kerbau yang dibuat dengan cara memanaskan susu. Selama proses pemasakan, ditambahkan senyawa koagulan yaitu berupa getah pepaya hingga susu menggumpal. Gumpalan kemudian dimasukkan ke dalam cetakan yang terbuat dari tempurung kelapa sambil ditekan hingga cairan terpisah (Permanasari 2008). Komposisi gizi dangke yang terbuat dari susu sapi dan susu kerbau dapat dilihat pada Tabel 1 Tabel 1 Komposisi gizi dangke dari susu sapi dan susu kerbau Karakteristik Dangke susu sapi Dangke susu kerbau Kadar air (%) 55 62.8 Kadar abu (%) 2.1 2.3 Kadar lemak (%) 14.8 15.9 Kadar protein (%) 23.8 21.3 pH 6.4 6.4 Sumber : Hatta 2013
4
Teknologi pengolahan dangke merupakan teknologi pengolahan susu menjadi produk sejenis keju yang diproduksi dengan sistem pasteurisasi dengan bantuan enzim papain dari getah pepaya. Enzim papain yang ditambahkan berfungsi untuk menhidrolisis protein susu sehingga dapat terpisah dan menggumpal, yang kemudian dapat dijadikan dangke. Tahap pasteurisasi atau pemasakan memegang peranan penting pada proses penyimpanan, sebab produk ini sangat mudah terkontaminasi mikroorganisme sehingga proses ini penting untuk memperpanjang masa simpan produk (LIPI 2006). Proses penggumpalan yang optimal terjadi apabila aktivitas enzim dalam proses penggumpalan susu cukup baik, hal ini terjadi apabila jumlah enzim memadai untuk reaksi dan ketersediaan substrat untuk aktivitas enzim jumlahnya sebanding. Akan tetapi penambahan enzim yang terlalu banyak akan menimbulkan cita rasa yang kurang disukai konsumen (pahit). Oleh karena itu, beberapa produsen menambahkan garam sebagai bahan untuk mengurangi rasa pahit yang ditimbulkan akibat penambahan getah pepaya. Penambahan getah pepaya sebagai sumber papain pada pembuatan dangke umumnya dilakukan pada suhu sekitar 60 . Perlakuan ini memberikan hasil dengan jumlah protein yang lebih tinggi dibanding penggunaan suhu yang lebih rendah (Yuniwati et al. 2008). Getah Pepaya Pepaya menghasilkan cairan putih seperti susu yang biasa disebut getah yang terdiri dari beberapa kompleks senyawa kimia. Menurut El Muossaoui et al. (2001), getah pepaya mengandung air sekitar 85% dan beberapa komponen terlarut yang terdiri dari karohidrat (~10%), garam (~10%), lemak (~5%), dan beberapa biomolekul seperti glutation, sistein protease (~30%), serta beberapa protein lainnya (~5%). Getah pepaya mengandung beberapa macam enzim, di antaranya adalah papain, kimopapain dan lisosim. Secara umum yang dimaksud dengan papain adalah papain yang dimurnikan maupun papain yang masih kasar. Enzim papain adalah enzim proteolitik yang terdapat pada getah tanaman papaya (Carica papaya L). Semua bagian papaya seperti buah, daun, tangkai daun, dan batang mengandung enzim papain dalam getahnya, tetapi bagian yang paling banyak mengandung enzim papain adalah buahnya (Yuniwati et al. 2008). Papain dan kimopapain dikenal memiliki kemampuan untuk memperbaiki jaringan yang mengalami nekrosis dan mencegah infeksi. Kemampuan kedua enzim ini sebagai antimikroba dan antioksidan berhubungan dengan pengikatan gugus hidroksil dan kemampuan mengkelat besi (Anuar et al. 2008). Lebih lanjut, kedua enzim ini mampu menurunkan resiko kerusakan oksidatif pada jaringan, sehingga pada masyarakat tradisional, getah pepaya sering dimanfaatkan sebagai penyembuh luka karena kemampuannya dalam memperpendek waktu epitalisasi dan percepatan kontraksi luka (Gurung et al. 2009). Pepaya digunakan sebagai bahan untuk pengobatan karena adanya enzim proteolitik yang merupakan komponen aktif dari pepaya, yaitu papain dan kimopapain (Namita et al. 2012). Ekstrak pepaya memiliki aktivitas sebagai antimikroba, anti-inflamasi, antifertilitas, agen antihipertensi, terapi bisul kronik pada kulit dan efek diuretik. Pepaya hijau mengandung dua enzim utama yang memiliki aktivitas pencernaan cukup tinggi, yaitu papain dan kimopapain. Papain
5
dan kimopapain terdapat di dalam getah pepaya. Papain merupakan enzim yang digunakan sebagai pengempuk daging, memiliki kemampuan melarutkan jaringan yang telah mati dan merusak sel hidup. Batang, daun dan buah pepaya mengandung getah dalam jumlah yang hampir sama (Mahmood et al. 2005). Proses penyadapan getah pepaya sebaiknya dilakukan pada buah yang berumur 2.5 sampai 3 bulan untuk mendapatkan aktivitas proteolitik yang tinggi. Pengambilan getah dilakukan saat buah masih melekat di pohon dan ditoreh dengan kedalaman kurang lebih 2 mm dengan menggunakan pisau stainless steel. Penorehan dilakukan pada pukul 5 hingga 6.30 pagi atau sebelum terkena sinar matahari. Hal ini dilakukan untuk mendapatkan kondisi kelembaban lingkungan yang tinggi agar kecepatan aliran getah pepaya menjadi lebih tinggi (Iswanto et al. 2009). Papain merupakan salah satu protein yang memiliki fungsi sebagai enzim golongan protease. Papain memiliki berat molekul sebesar 23406 DA dan tersusun atas 212 asam amino dengan empat jembatan disulfida dan residu yang berperan pada proses katalitiknya adalah Gln19, Cys25, His158, dan His159. Papain merupakan jenis sistein hidrolase yang stabil dan aktif dalam rentang kondisi yang luas, bahkan pada suhu yang cukup tinggi. pH optimum untuk aktivitas papain berkisar antara 3.0-9.0 yang berbeda untuk tiap substrat (Amri et al. 2012). Aktivitas proteolitik enzim pada getah pepaya yang diuji dengan menggunakan substrat kasein menunjukkan hasil optimum pada pH 8 dan suhu 75 (Chaiwut et al. 2007). Selain komponen proteolitik, beberapa komponen bioaktif yang dikandung getah pepaya juga memiliki peranan terhadap aktivitas antibakteri getah pepaya. Beberapa komponen fitokimia yang dikandung oleh getah pepaya antara lain, campuran terpenoid, asam organik, dan alkaloid yang mampu menghambat pertumbuhan beberapa jenis bakteri (Cowan 1999). Selain itu, ekstrak getah pepaya juga mengandung flavonoid, glikosida, saponin, dan steroid yang memiliki peranan terhadap aktivitas antibakteri getah pepaya (Aravind et al. 2013). Getah Pepaya sebagai Antimikroba Getah pepaya mengandung beberapa macam komponen yang diduga memiliki peranan terhadap aktivitasnya. Salah satu yang paling utama adalah papain yang dikenal sebagai enzim proteolitik. Selain itu, getah pepaya juga mengandung alkaloid, terpenoid, dan carpain. Terpenoid inilah yang mungkin berkontribusi pada sifat antimikroba getah pepaya. Getah pepaya juga dapat dimanfaatkan pada pembuatan pakan ternak karena aktivitas antihelmintiknya (Adu et al. 2009). Getah pepaya memiliki aktivitas bakteriostatik terhadap Bacillus subtilis, Enterobacter cloacae, Escherichia coli, Salmonella Typhi, Staphylococcus aureus, dan Proteus vulgaris. Papain yang merupakan senyawa yang dikandung oleh getah pepaya juga memiliki aktivitas sebagai antimikroba yang mampu menghambat pertumbuhan mikroorganisme. Papain dapat menghambat pertumbuhan Staphylococcus aureus pada media agar. Penghambatan ini dikarenakan papain mampu merusak protein mikroorganisme yaitu dengan mengkatalisis ikatan peptida pada protein menjadi senyawa-senyawa yang lebih sederhana seperti dipeptida dan asam amino. Enzim ini memiliki gugus sulfihidril pada sisi aktifnya yang bekerja pada dinding sel dan
6
membran sitoplasma bakteri. Besar kecilnya daya hambat dapat dipengaruhi oleh konsentrasi senyawa antimikroba, jenis mikroba, suhu, waktu, jumlah mikroba, pH, dan zat atau bahan organik tertentu (Pakki et al. 2009). Mekanisme aksi antibakteri papain diperkirakan terjadi akibat interaksi dan perusakan dinding sel dan membran dari bakteri. Pada bakteri gram positif membran sel dilindungi oleh dinding sel yang tersusun dari 30-40 lapisan peptidoglikan yang mengandung GlcNAc, N-acetyl murmeric acid dan juga asam amino. Hal ini mengakibatkan asam amino yang bermuatan positif dapat terikat pada membran sel, yang akan mengakibatkan terjadinya osmotic shock dan kebocoran isi sitoplasma. Di sisi lain, bakteri Gram negatif memiliki membran luar dan tersusun atas lipopolisakarida yang berikatan dengan protein melalui interaksi elektrostatik, dimana sitooligomer dengan massa molekul yang lebih kecil dan lebih elektronegatif mampu memfasilitasi ikatan yang lebih efektif (Seenivasan et al. 2010). Kerusakan Membran Sel Bakteri Membran sel merupakan bagian yang bersentuhan langsung dengan lingkungan. Membran sel memisahkan komponen intraseluler dan lingkungan di luar sel. Fungsi utama membran sel adalah membentuk penghalang yang bersifat permeabel yang mengatur lintasan solut antara bagian dalam sel dengan lingkungan luar. Banyak faktor eksternal yang mempengaruhi sifat fisikokimia serta fungsi membran seperti suhu, tekanan, pH, aktivitas air, nutrien, ion, aktivitas enzim, fase pertumbuhan mikroba, dan xenobiotik. Perubahan yang dapat terjadi di antaranya adalah keseimbangan antara lapisan lipid bilayer dan nonbilayer, stabilitas dan fluiditas membran yang akan mengubah interaksi lipidprotein (Mrozik et al. 2004). Komponen bioaktif yang dikandung getah pepaya yang dianggap memiliki kemampuan untuk menghambat pertumbuhan bakteri adalah senyawa fitokima yang terdiri atas beberapa komponen dan masing-masing memiliki mekanisme penghambatan yang berbeda (Cowan 1999). Komponen flavonoid mampu menghambat pertumbuhan bakteri melalui beberapa mekanisme, di antaranya adalah dengan mengganggu sintesis asam nukleat, menganggu fungsi membran sitoplasma, dan mengganggu metabolisme energi (Hendra et al. 2011). Zakaria et al. (2006) memperoleh hasil penghambatan ekstrak etanol daun pepaya lebih tinggi pada bakteri Gram positif dibanding Gram negatif, hal ini dikarenakan komponen aktif yang terdapat pada ekstrak seperti flavonoid, alkaloid, dan saponin tidak mampu berinteraksi dengan senyawa lipopolisakarida yang terdapat pada membran bakteri Gram negatif sehingga penghambatan ekstrak menjadi lebih kecil dibandingkan dengan bakteri Gram positif yang membrannya lebih tipis. Membran sitoplasma bakteri merupakan komponen struktural yang dapat mengalami kerusakan dan gangguan sifat fungsional bila dipaparkan pada antimikroba. Ion K+ dan PO43- dapat keluar dari membran bila membran mengalami kerusakan, setelah itu beberapa molekul besar seperti DNA dan RNA juga dapat keluar dari sel. Keluarnya materi sel ini dapat dianalisis menggunkan spektrofotometer UV-VIS. S. aureus yang merupakan bakteri Gram positif dapat
7
mengeluarkan material sel yang lebih banyak dibanding bakteri Gram negatif seperti E. coli. Hal ini kemungkinan disebabkan oleh komposisi dan struktur dinding sel kedua bakteri ini berbeda. E. coli memiliki dinding sel yang tersusun dari lapisan tipis peptidoglikan dan membran luar yang terbuat dari lipopolisakarida, lipoprotein, dan fosfolipid. Sedangkan lapisan peptidoglikan S. aureus tersusun dari sambungan yang berpori sehingga molekul asing dapat dengan mudah masuk ke dalam sel. S. aureus tidak memiliki membran luar yang mampu mencegah masuknya molekul asing sehingga bakteri ini lebih sensitif terhadap antimikroba dibanding bakteri Gram negatif seperti E. coli (Xing et al. 2009). Pengujian Aktivitas Antimikroba Berdasarkan Kerusakan Membran Sel Antimikroba yang berupa protein dan peptida sebagian besar targetnya pada sel adalah bagian lipid bilayer dimana peptida dapat memicu depolarisasi dan/atau masuk ke dalam sitosol dan berinteraksi dengan bagian dalam sel target. Banyak metode biofisika yang dapat digunakan untuk memperlajari mekanisme interaksi pepetida-membran. Salah satu teknik yang dapat digunakan adalah dengan menggunakan mikroskop fluoresens. Pendeteksian menggunakan mikroskop ini dapat dilakukan dengan bantuan pewarna fluoresens. Pewarna fluoresens yang paling umum digunakan untuk menguji viabilitas sel adalah SYTO9 dan PI. SYTO9 mewarnai DNA dari semua bakteri, baik dengan membran yang utuh atau rusak, sementara itu PI hanya mewarnai bakteri yang rusak dan mampu memindahkan SYTO9 bila kedua pewarna tersebut ada. Penggunaan kedua pewarna dengan jumlah yang tepat pada bakteri dengan membran yang utuh akan menghasilkan warna hijau, sementara bakteri dengan membran yang rusak akan menghasilkan warna merah (Torrent et al. 2010). Pemeriksaan sel dengan mikroskop fluoresens juga dapat dilakukan dengan menggunakan pewarna DNA seperti SYBR Green dan Sytox Green, prinsip yang digunakan sama dengan yang berlaku pada pengujian menggunakan SYTO9 dan PI (Klauth et al. 2004). PI merupakan pewarna DNA yang banyak digunakan untuk menguji viabilitas suatu sel serta pengujian kerusakan membran akibat aktivitas antibakteri. Pengujian dapat dilakukan dengan menggunakan flow cytometry ataupun pengamatan menggunakan mikroskop fluoresens (Cho et al. 2009). Pengaruh antimikroba terhadap membran sel bakteri dapat dilihat dari jumlah materi sel seperti asam nukleat metabolit dan ion yang dikeluarkan akibat kebocoran membran. Material sel yang dikeluarkan dari dalam sel dapat ditentukan dengan melihat Optical Density (OD) dari suspensi bakteri dan antimikroba. Nilai OD260 ditentukan dengan menggunakan spektofotometer UVVIS pada panjang gelombang 260 nm. Semakin banyak material sel yang dilepaskan maka nilai OD260 yang diperoleh akan semakin tinggi (Oonmetta-aree et al, 2006).
