Gymnázium Jana Nerudy. Závěrečná práce studentského projektu. Enzymatická aktivita

Gymnázium Jana Nerudy

Evropský sociální fond Praha a EU – Investujeme do vaší budoucnosti

Závěrečná práce studentského projektu Enzymatická aktivita Vedoucí práce: Mgr. Jiří Vozka RNDr. Lenka Simonianová Odborný konzultant: RNDr. Květa Kalíková, Ph.D.

Rok odevzdání: 2014

Černá Karolína Černohousová Monika Svobodová Michaela

Tuto práci jsme vypracovaly samostatně a výhradně s použitím zdrojů uvedených na konci této práce.

V Praze 8. 1. 2014 Černá Karolína

Černohousová Monika

Svobodová Michaela

Poděkování Děkujeme Mgr. Jiřímu Vozkovi a RNDr. Lence Simonianové, vedoucím práce, za jejich cenné rady a čas nám věnovaný. Děkujeme rovněž RNDr. Květě Kalíkové, Ph.D, odborné konzultantce, za poskytnutí prostoru na Katedře fyzikální a makromolekulární chemie Přírodovědecké fakulty Univerzity Karlovy v Praze.

Obsah 1 Úvod…………………………………………………………………………………………….1 2 Teoretická část……………………………………………………………………………….2 2.1 Enzymy……………………………………………………………………………..2 2. 1. 1 Enzymy vs. umělé katalyzátory…………………………………..3 2. 2 Enzymatické třídy……………………………………………………………….3 2. 2. 1 Dělení kofaktorů……………………………………………………..4 2. 2. 1. 1 Kofaktory oxidoreduktas……………………………….4 2. 2. 1. 2 Kofaktory transferas…………………………………….5 2. 2. 1. 3 Kofaktory lyas…………………………………………….5 2. 2. 1. 4 Kofaktory isomeras……………………………………...5 2. 3 Mechanismus účinku enzymů………………………………………………..6 2. 3. 1 Specifita účinku……………………………………………………...6 2. 3. 2 Mechanismus účinku……………………………………………….6 2. 3. 3 Aktivační energie…………………………………………………….7 2. 4 Vliv fyzikálních faktorů na účinnost enzymu……………………………..7 2. 4. 1 Vliv koncentrace enzymu a substrátu…………………………..8 2. 4. 2 Vliv teploty………………………………………………………….…8 2. 4. 3 Vliv kyselosti prostředí……………………………………………..8 2. 5 Látky ovlivňující činnost enzymu…………………………………………….8 2. 5. 1 Inhibitory………………………………………………………………8 2. 5. 1. 1 Kompetitvní inhibitory………………………………….8 2. 5. 1. 2 Nekompetitivní inhibitory……………………………...9 2. 5. 1. 3 Akompetitivní inhibitory…………….………………….9 2. 6 Regulace činnosti enzymů……………………………………………………..9 2. 6. 1 Allosterické enzymy…………………………………………………9 2. 6. 2 Kompartmentace a soutěžení enzymů…………………………10 2. 6. 3 Řízení produkce…………………………………………………….10 2. 7 Vybrané enzymy………………………………………………………………..10 2. 7. 1 Amylasy………………………………………………………………10 2. 7. 1. 1 Amylasy v lidských slinách…………………………..11 2. 7. 1. 2 Amylasy produkované pankreatem.………………..11 2. 7. 1. 3 Amylasy v ostatních částech těla…………………..12 2. 7. 2 Peroxidasy……………………………………………………………12 2. 7. 2. 1 Glutathionperoxidasa…………………………………12 2. 7. 2. 2 Askorbát peroxidasa…………………….……………..13 2. 7. 3 Katalasy………………………………………………………………14 2. 7. 3. 1 Peroxid vodíku…………………………….…………….15 2. 7. 3. 2 Přechodný komplex……………………………………15 2. 7. 3. 3 Izoenzymy………………………………………………..15 3 Experimentální část……………………………………………………………………….16 3. 1 Experiment 1…………………………………………………………………...16 3. 2 Experiment 2…………………………………………………………………...18 4 Závěr………………………………………………………………………………………….19 5 Zdroje…………………………………………………………………………………………20

1 Úvod V této práci bychom se chtěly zabývat enzymatickou činností hlouběji, než jak nám předepisují školní osnovy. Toto téma jsme si vybraly, protože nás v letošním roce čeká nejenom maturitní zkouška, ale také rozhodnutí, kam dále nasměrovat svá studia. A všechny nás to zatím táhne k přírodovědě, exaktněji k chemii. Naše práce je rozdělena do dvou částí. V úvodní teoretické části se věnujeme vymezení a vysvětlení základních pojmů a principů uplatňujících se při enzymatickém působení. Zabýváme se obecným dělením enzymů a kofaktorů do tříd, které dále charakterizujeme. V navazující kapitole se snažíme o objasnění mechanismů, na nichž je založeno fungování enzymů, a vlivu vnějších podmínek na funkčnost a aktivitu enzymů. Dále se detailněji zaměřujeme na popis vybraných druhů enymů: amylas, peroxidas a katalas. Ozřejmujeme jejich funkce a význam při fungování živého organismu. Druhá část práce se věnuje popisu experimentů, dokazujících funkci těchto vybraných enzymů. První pokus ukazuje rozklad peroxidu vodíku pomocí enzymu katalasy a jak závisí aktivita enzymu na koncentraci substrátu. Druhým pokusem ověřujeme funkci inhibitorů enzymů. Zpracovávaná látka nás velmi zaujala a věříme, že nabyté vědomosti i zkušenosti uplatníme i v dalším studiu.

In this work we would like to grapple with enzymatic activity more than is usual in common education. We have chosen this topic because of our final exam this year, but also because we should decide what to study in the future. And we all want to study natural science, especially chemistry. Our work is divided into two parts. The theoretical introduction is about defining and explaining basic terms and principles that exert in enzymatic activity. We engage in classing the enzymes and cofactors into categories and we characterize these categories. In connecting section we are trying to explain mechanisms of enzymatic action and effects of conditions. Thereinafter we focus on account of selected enzymes: amylases, peroxidases and catalases. We elucidate their functions and their importance in living organisms. The second part refers to description of experiments that detect function of the selected enzymes. The first experiment shows degradation of hydroperoxide through catalasis and how the enzymatic activity depends upon the concentration of the substrate. The second experiment shows the function of inhibitors. We were really drawn in this theme and we hope that we could apply the reached knowledge and experiences in our future education.

1

2 Teoretická část 2. 1 Enzymy Enzymy jsou biomakromolekulární látky zabezpečující řízení a koordinaci chemických procesů v organismu1. Jsou zodpovědné zejména za urychlování chemických přeměn, které by za fyziologických podmínek probíhaly velmi pomalu, nebo by neprobíhaly vůbec. Principem enzymatického působení je stabilizace přechodového stavu molekuly substrátu, tedy snížení energie potřebné k chemické přeměně2 (viz obr. 1).

Obr. 1 Porovnání aktivačních energií při enzymatické reakci a reakci bez enzymů Enzymy se vyznačují specifickými vlastnostmi, které zabezpečují přesnost jejich účinku. Na existenci enzymů je založena veškerá existence života3. Zprostředkovávají všechny myslitelné procesy v organismu od trávení potravy, přes dělení buněk až po raritní biochemické procesy, jakým je např. bioluminiscence (schopnost světlušky svítit zajišťovaná enzymem zvaným luciferasa). Protože enzymy jeví druhovou specifitu (každý druh má své vlastní enzymy odlišné od ostatních druhů), odhaduje se jejich počet na miliardy1. Jejich využití je velmi široké. Uplatňují se nejenom v organismu, ale využívá se jich i v medicíně, chemickém průmyslu (jsou přidávány do pracích prášků pro zvýšení účinnosti odstranění skvrn za nižších teplot), potravinářství (např. k výrobě hypoalergenního mléka) a zemědělství3. Katalytickou funkci může vykonávat nejen jednoduchá nebo složená bílkovina, ale i některé molekuly RNA2. Složené enzymy se skládají z bílkovinné (apoenzymu) a nebílkovinné části (kofaktoru)1. Bez přítomnosti kofaktorů by enzymy nebyly schopné vykonávat oxidoredukční reakce2. Pokud se jedná o organickou molekulu lehce oddělitelnou od bílkovinné složky, nazýváme kofaktor koenzymem. Jeho komplex s apoenzymem se nazývá holoenzym. Jako prosthetickou skupinu označujeme kofaktor pevně vázaný na bílkovinnou složku. Kofaktory tvoří termostabilní část enzymu, naproti tomu bílkovinné části jsou tepelně nestabilní (za vyšších teplot denaturují). Většina kofaktorů svou strukturou odpovídá vitamínům rozpustným ve vodě1. Při enzymových reakcích se koenzymy chemicky mění. Pro dokončení cyklu je potřeba jejich navrácení do původního stavu. Regenerace prosthetických skupin je 2

součástí enzymové reakce, přechodně vázané koenzymy vyžadují zvláštní regenerační reakci katalyzovanou jiným enzymem2. Místo, kde probíhá enzymová reakce, se nazývá aktivní centrum. Tato místa bývají vytvořena z několika typů skupin. Najdeme zde katalytické centrum (katalyticky aktivní skupiny), vazebné centrum (skupiny vázající substrát) a skupiny, jejichž úkolem je vytvářet vhodné chemické prostředí1. Na každém enzymu také najdeme stabilizační či aktivační místa, která stabilizují strukturu nebo její změnou podmiňují aktivitu enzymu. Místo pro regulaci aktivity enzymu se označuje jako allosterické centrum1. Enzym může fungovat buď samostatně, nebo vytvářet multienzymové komplexy (např. enzymy dýchacího řetězce).

2. 1. 1 Enzymy vs umělé katalyzátory V mnoha ohledech enzymy předčí umělé katalyzátory. Například jejich účinnost je mnohonásobně vyšší. Jediná molekula enzymu je schopna za 1 s přeměnit až 5x104 molekul substrátu, což je skutečně velké množství1. Z toho je patrné, že reakční rychlosti enzymů jsou značně vysoké. Enzymy jsou mnohem specifičtější než anorganické katalyzátory, neboť musí za daných podmínek katalyzovat pouze jednu reakci. Například v jediné buňce probíhá zároveň kopírování DNA, odstraňování chybných úseků DNA, kopírování DNA do RNA (transkripce) a přepis RNA do proteinu (translace). Tyto reakce samozřejmě nesmějí být zaměněny. Kofaktory určují mechanismus reakce a fungují jako přenašeči funkčních skupin1. Bílkovinná část enzymu je zodpovědná za látkovou specifitu, neboli za výběr vhodného substrátu1. Účinnost enzymů je velmi vysoká i za mírných podmínek (teplota 20–40 °C, tlak 0,1 MPa, pH kolem 7) a jejich činnost lze snadno regulovat1. Oproti umělým katalyzátorům jsou enzymy velmi složité molekuly, tím pádem jsou i citlivější k řadě vlivů a rychleji se opotřebují. Proto jsou v organismu neustále odbourávány a znova syntetizovány1.

2. 2 Enzymatické třídy Enzymy jsou podle typu katalyzované reakce děleny do šesti hlavních tříd. Oxidoreduktasy katalyzují mezimolekulové oxidačně redukční přeměny1. Všechny jsou tvořeny složenými bílkovinami a tvoří nejpočetnější skupinu enzymů. Oxidoredukční děje realizují buď přenosem atomů vodíku (transhydrogenasy, dehydrogenasy) nebo elektronů (transelektronasy), případně vestavěním atomu kyslíku do substrátu (oxygenasy)1. Dělí se dále na podtřídy podle funkčních skupin donorů vodíku či elektronů. Do této skupiny patří mimo jiné i peroxidasa, peroxidasa, kterou se budeme podrobněji zabývat v následujích kapitolách nebo alkoholdehydrogenasa, která zajišťuje odbourávání alkoholu v těle. Transferasy realizují přenos skupin (např. –CH3, -NH2) z jejich donoru na akceptor1. Také tyto enzymy jsou většinou složené a mají podíl na velkém počtu biosyntetických dějů. Na podtřídy se rozdělují podle charakteru přenášených skupin1. Příkladem mohou být DNA-polymerasa, zodpovědná za prodlužování DNA řetězců4, nebo reverzní transkriptasa zprostředkovávající přepis RNA do DNA (toho využívají některé viry, typicky HIV). Hydrolasy štěpí hydrolyticky kondenzací vzniklé vazby (např. peptidové, esterové, glykosidové)1. Jedná se většinou o jednoduché bílkoviny. Na další podtřídy se dělí podle typu štěpených vazeb. Vzhledem ke schopnosti štěpit vazby mají tyto enzymy i antibakteriální účinky (rozpouští buněčnou stěnu bakterií). Například lysozym, který je obsažen v lidských slzách ale i ve vaječném bílku5, tak funguje jako složka imunitního systému. 3

Lyasy katalyzují nehydrolytické štěpení a vznik energeticky nenáročných vazeb1. Většinou odštěpují ze substrátu, nebo je do něj vnáší, malé molekuly. Lyasy mají povahu složených bílkovin. Na podtřídy se rozdělují podle typu štěpených nebo syntetizovaných vazeb1. K nejznámějším lyasám patří pyruvátdekarboxylasa, produkující acetaldehyd při alkoholovém kvašení6. Isomerasy realizují intramolekulové přesuny atomů a jejich skupin, tedy vzájemné přeměny izomerů1. Je to nejméně početná skupina jednoduchých bílkovin. Dělení na podtřídy je založeno na typu izomerie. Patří sem například fosfoglukomutasa, která zajišťuje glukoneogenezi7. Ligasy katalyzují vznik energeticky náročných vazeb za současného rozkladu makroergických látek1. Ligasy jsou málo početná skupina enzymů většinou povahy složených bílkovin. Mezi typické reakce katalysované ligasami patří připojení malých molekul k větší molekule. Příkladem může být vazby kyselin na acetylkoenzym-A8.

2. 2. 1 Dělení kofaktorů Jak již bylo zmíněno v úvodu, kofaktory lze třídit na koenzymy a prosthetické skupiny. Častěji využívané je však třízení podle funkčního hlediska.

2. 2. 1. 1 Kofaktory oxidoreduktas Pyridinové (nikotinamidové) (di)nukleotidy mají povahu koenzymů a jejich molekuly sestávají z nikotinamidového a adeninového nukleosidu vzájemně spojených kyselinou fosforečnou1. Patří sem nikotinamidadenindinukleotid (NAD+) (viz obr. 2) a nikotinamidadenindinukleotidfosfát (NADP+)(viz obr. 3).

Obr. 2 Nikotinamidadenindinukleotid

Obr. 3 Nikotinamidadenindinukleotidfosfát

Fungují na principu transhydrohenasy, při které substrátu odnímají dva atomy vodíku. K deoxidaci NAD(P)H dochází na jiném apoenzymu, který realizuje předání atomů vodíku na vhodný akceptor1. Flavinové nukleotidy jsou využívány k redoxním reakcím s přenosem vodíku1. Nejčastěji figurují jako akceptory vodíkových atomů z redukovaných forem pyridinových koenzymů. Dále se účastní redoxních reakcí, při nichž jsou substrátům odebírány dvě molekuly vodíku. Na rozdíl od nikotinamidů však mohou flaviny vstupovat i do reakcí, v nichž je přenášen kyslíkový atom nebo pouze elektron1. Tato skupina je reprezentována flavinmononukleotidem (FMN) a flavinadenindinukeotidem (FAD). Hem je součástí řady transelektronas, mimo jiné i peroxidasy1. Základem hemové struktury je porfinový skelet (viz obr. 4). Biologické funkce vykonává jeho komplex 4

s iontem železa, který je v centru porfyrinového kruhu vázán ke čtyřem atomům dusíku a může tvořit další dvě vazby kolmo na rovinu porfinového skeletu 1.

Obr. 4 Hem Ionty železa vázané přímo na bílkovinu se vyskytují ve všech organismech a fungují jako transelektronasy1. Ion železa je v těchto kofaktorech vázán na atomy síry cysteinylových zbytků enzymu.

2. 2. 1. 2 Kofaktory transferas Adenosintrifosfát (ATP) (viz obr. 5) je kofaktorem skupiny označované jako kinasy1. Přenáší fosforylovou skupinu –PO32- na hydroxylové skupiny alkoholů, na acetyly nebo skupiny guanidylové1.

Obr. 5 Adenosintrifosfát Aktivní sulfát realizuje přenos zbytku kyseliny sírové na fenoly a alkoholy za vzniku esterů této kyseliny1. Kofaktor přenášející aminoskupiny je odvozen od vitaminu B6 1. Tyto enzymy katalyzují přenos aminokyselin nebo jejich zbytků. Kofaktory přenášející rozsáhlé struktury jsou dva. Uridindifosfát přenáší glukózu a účastní se výstavby polysacharidů1. Cytidindifosfát vytváří fosfodiesterové vazby při syntéze fosfolipidů1.

2. 2. 1. 3 Kofaktory lyas Na reakcích lyas se podílí velmi mnoho různých skupin, např. acetylkoenzym A. Důležitou skupinou lyas jsou dekarboxylázy, podílející se na štěpení kyselin1.

2. 2. 1. 4 Kofaktory isomeras Isomerasy většinou nepotřebují kofaktory. Pouze při isomeraci sacharidů je často nezbytný uridindifosfát nebo NAD+ a při přesmycích, kde si atom vodíku vyměňuje

5

místo se skupinou na sousedním uhlíkovém atomu, se uplatňuje jako kofaktor 5‘deoxyadenosylkobalamin1.

2. 3 Mechanismus účinku enzymů Jak již bylo předesláno v úvodu, enzymy musí být značně specifické, aby v organismu nedocházelo k nevhodným záměnám reakcí.

2. 3. 1 Specifita účinku Nejvýznamnější schopností enzymů je reakční specifita, tedy schopnost katalyzovat jeden určitý typ reakce. Týž substrát může být přeměněn několika enzymy s různou specifitou účinku na několik rozdílných produktů1. Další podstatná schopnost je substrátová specifita neboli výběr vhodného substrátu. Tento výběr probíhá ve třech úrovních1. Prvním krokem je rozpoznání obecných rysů na substrátu. Jedná se o strukturní specifitu1. Je zajištěna přirozenou chiralitou enzymů, tedy tvorbou asymetrických vazebných míst2. Vzhledem ke schopnosti katalyzovat více substrátů můžeme enzymy dělit na enzymy s absolutní specifitou (např. ureasa), které katalyzují přeměnu jen jediného substrátu, na enzymy se skupinovou specifitou katalyzující určitou reakci u skupiny substrátů téhož typu (např. u alkoholů, bílkovin) a enzymy s relativní skupinovou specifitou, jež přednostně katalyzují reakci jedné skupiny substrátů, ale jsou schopny působit i na jiné skupiny substrátů 1 (aminokyseliny mohou působit za určitých situací jako dekarboxylasy, jindy zase jako aminotransferasy 9). Zajištěno musí být také, aby katalýza proběhla ve specifické oblasti substrátu, tj. regiospecifita1. V neposlední řadě musí být dodržen specifický průběh katalýzy. Tato třetí úroveň substrátové specifity se nazývá stereospecifita1.

2. 3. 2 Mechanismus účinku Teorie z počátku 20. století vychází z předpokladu, že molekuly enzymu vážou substrát za tvorby meziproduktu1 (viz. Obr. 6). Existence tohoto komplexu enzymsubstrát byla později opakovaně prokázána. Vzniku komplexu enzym-substrát vedl k představě, že enzymová reakce probíhá odlišným, energeticky výhodnějším mechanismem než nekatalyzovaná reakce1.

Obr. 6 Vznik komplexu enzym-substrát

6

Nejstarší teorií vysvětlující mechanismus účinku enzymů byla teorie komplementarity nazývaná také teorie klíče a zámku. Byla vyslovena již v roce 1894 chemikem E. Fischerem1. Její podstata spočívá v tom, že účinná je pouze omezená oblast molekuly enzymu (aktivní centrum), kterou tvoří rigidní struktura umožňující kontakt pouze se substrátem majícím vhodnou geometricky doplňkovou strukturu1. Do aktivního centra zapadne pouze substrát o vhodné velikosti a tvaru, tak jako do určitého zámku se hodí jen odpovídající klíč (viz. Obr. 7).

Obr. 7 Teorie zámku a klíče Teorie indukovaného přizpůsobení předpokládá, že substrát hraje úlohu při vytváření konečného tvaru molekuly enzymu s flexibilní strukturou1. Jedině substrát vhodné struktury vyvolá vazbou na enzym takovou změnu enzymové konformace, že se katalytické skupiny správně nasměrují tak, aby mohla proběhnout reakce1. Rozsah konformačních změn je u jednotlivých enzymů značně rozdílný. U některých mají změny konformace zásadní úlohu, u jiných však nemusí být nezbytné1.

2. 3. 3 Aktivační energie Aktivační energie tvoří energetickou bariéru, po jejímž překonání se rozbíhá chemická reakce (viz obr. 1). Pokud by neexistovala tato bariéra, makromolekuly (energeticky náročnější) by se spontánně přeměňovaly na jednodušší molekulární formy (energeticky výhodnější), což by znemožnilo existenci organizovaných buněčných struktur a průběh metabolických procesů3. Za zdroj energie pro aktivaci enzymových reakcí je pokládána energie uvolněná při vazbě substrátu na enzym1. Předpokládá se, že hlavní podíl této energie pochází z interakcí částí substrátu nepodléhajících enzymové přeměně 1. Vzhledem k tomu, že na vlastní katalýze se podílí jen malá oblast molekuly enzymu, spočívá význam zbývající části pravděpodobně ve vytvoření vhodné struktury k maximalizaci vazebné energie mezi enzymem a substrátem.

2. 4 Vliv fyzikálních faktorů na účinnost enzymu Enzymově katalyzované reakce probíhají různou rychlostí, která závisí na koncentraci substrátu, množství enzymu, fyzikálně chemických vlastnostech prostředí a přítomnosti efektorů.

7

2. 4. 1 Vliv koncentrace enzymu a substrátu V tomto případě existují dvě varianty. Pokud ponecháme množství substrátu konstantní a zvyšujeme množství enzymu, reakce se zrychluje. V opačném případě, tedy pokud ponecháme konstantní množství enzymu a zvyšujeme množství substrátu, rychlost reakce poroste pouze do okamžiku, kdy budou všechny enzymy navázány na substrát. V této chvíli se rychlost reakce sníží a k jejímu opětovnému zvýšení dojde až po zpracování dosavadního substrátu.

2. 4. 2 Vliv teploty Rychlost enzymových reakcí vzrůstá s rostoucí teplotou. Pokud však teplota překročí hraniční mez, dojde k denaturaci bílkovin a tím k inaktivaci enzymu. Výsledkem těchto dvou protichůdných jevů je vznik závislosti s maximem, kterému říkáme optimální teplota enzymu1.

2. 4. 3 Vliv kyselosti prostředí Většina enzymů působí katalyticky pouze v určité oblasti pH, mimo tuto oblast jejich účinnost klesá2. Závislost rychlosti enzymové reakce na pH má tedy tvar zvonovité křivky1. Jejímu maximu odpovídá optimální pH, kdy je rychlost reakce nejvyšší. Hraničními body jsou minimální pH, kdy reakce již probíhá, a maximální pH, kdy reakce ještě probíhá. Změnou pH lze účinně regulovat aktivitu enzymu, čehož hojně využívají buňky1.

2. 5 Látky ovlivňující činnost enzymu Činnost enzymů ovlivňuje velké množství látek nazývaných modifikátory 1. Zvyšují-li aktivitu enzymu, jedná se o aktivátory. Pokud tyto látky snižují účinnost enzymu, nazýváme je inhibitory.

2. 5. 1 Inhibitory Inhibitory lze dělit podle různých hledisek. Podle původu na přirozené a uměné, podle specifity na specifické (působí jen na jeden nebo několik příbuzných enzymů) a nespecifické, atp1. Nejčastěji se používá dělení podle mechanismu účinku.

2. 5. 1. 1 Kompetitivní inhibitory Tyto látky mají strukturu natolik podobnou substrátu, že je enzym nerozezná a vytvoří za jejich přítomnosti inaktivní vazbu s inhibitorem, který se nepřeměňuje na produkt1 (viz. Obr. 8). Tím je enzym blokován. Tvorba komplexu s inhibitorem je vratná. Pokud je přítomen substrát, soutěží s inhibitorem o aktivní místo enzymu. Rozsah inhibice pak závisí na poměru koncentrací substrátu a inhibitoru a jejich afinit k enzymu1. Ke kompetitivní inhibici může dojít i soutěžením inhibitoru s koenzymem o příslušné vazebné centrum na povrchu enzymové molekuly1. Těmto inhibitorům se pak říká antimetabolity. Jestliže se inhibitor váže k enzymu nevratně, je označován jako inaktivační faktor2.

8

Obr. 8 Působení různých typů inhibitorů

5. 1. 1. 2 Nekompetitivní inhibitory Inhibitory tohoto typu neovlivňují vazbu na enzym, ale snižují rychlost přeměny substrátu na produkt1 (viz. Obr. 8). Účinek je pak nezávislý na koncentraci substrátu. Tento způsob je důležitý zejména pro enzymy působící na více substrátů2. Mechanismus účinku nekompetitivních inhibitorů je založen na allosterickém efektu1. Inhibitory se vážou mimo aktivní centrum a mění jeho konformaci pomocí šířící se změny struktury, kterou vazbou vyvolají 1. Tímto principem je zprostředkována většina regulačních metabolických procesů v organismu1.

5. 1. 1. 3 Akompetitivní inhibitory Tyto inhibitory se vážou na enzym teprve ve chvíli, kdy vazba na substrát vhodně pozmění jeho konformaci1 (viz. Obr. 8). Reagují tedy až s komplexem enzymsubstrát. Vazbou na tento komplex zabrání jeho přeměně na výsledný produkt.

2. 6 Regulace činnosti enzymů Organismus musí udržovat vyváženost všech metabolických procesů a tím konstantní koncentrace veškerých jejich produktů1. Metabolické regulace lze rozdělit do několika skupin, které se liší svým uplatněním. Jsou to regulace rozmístěním enzymů v různých částech buňky a soutěžení několika enzymů o tentýž substrát, regulace změnou struktury enzymů a regulace zvyšováním nebo snižováním množství molekul enzymu1. Regulační enzymy řídí jednotlivé metabolické dráhy. Nacházejí se na jejich významných místech – na začátku nebo na jejich křižovatkách1.

2. 6. 1 Allosterické enzymy Inhibitory a aktivátory konformační změnou, vyvolanou vazbou na specifická místa, indukují změnu prostorové struktury a tím i aktivity aktivního centra enzymu 1 (viz. Obr. 9). Vazbou vhodného ligandu se indukovaná změna struktury neomezí jen na místo vazby a jeho bezprostřední okolí, ale bude se organisovanou strukturou šířit celou molekulou1. Změna struktury molekuly způsobí změnu afinity enzymu k substrátu2. Tento regulační mechanismus patří k nejúčinnějším, jaké v organismu probíhají. 9

Obr. 9 Působení allosterických enzymů

2. 6. 2 Kompartmentace a soutěžení enzymů Kvůli schopnosti enzymů působit na více substrátů musí biochemické reakce probíhat odděleně v různých prostorách (kompartmentech) buňky1. Řada substrátů může být přeměňována různými enzymy na různé produkty. Jaká reakce proběhne je určováno okamžitými reakčními podmínkami1. Přednost dostane ta přeměna, pro niž jsou podmínky optimální1.

2. 6. 3 Řízení produkce Další možností regulace je řízení produkce a odbourávání enzymů 1. Tato regulace se však projeví až za velmi dlouhou dobu a působí ne celý organismus, nikoli jen na jeho určitou oblast.

2. 7 Vybrané enzymy V této části práce se zaměříme na tři vybrané skupiny enzymů – amylasy, peroxidasy a katalasy. Po teoretické části bude následovat část praktická v podobě několika pokusů. V experimentální části jsme pracovali pouze s peroxidasami a katalasami, v teoretické části se však zaměřujeme i na amylasy, které jsou pro pochopení enzymů nejsrozumitelnější a navíc jsou i jedněmi z nejznámějších enzymů.

2. 7. 1 Amylasy Amylasa je jedním z prvních poznaných enzymů lidského těla (viz obr. 10). Pod pojmem diastasa je známa již od roku 1833.

Obr. 10 Základní struktura amylasy

10

Velmi rozšířená skupina hydrolas (enzymy, které katalyzují hydrolýzu, což je základní štěpná reakce, při které dochází ke spotřebě vody), přesněji ze skupiny glykosidas, štěpící glykogen, škrob a další polysacharidy, ve kterých se vyskytují α(1→4) glykosidové vazby. Rozeznáváme tři typy amylas: 1. α – amylasy  endogenní amylasy (endoglykosidasy), což jsou enzymy, které začínají štěpit vazby škrobu uprostřed řetězce, za vzniku oligosacharidů 2. β – amylasy  exogenní amylasy (exoglykosidasy), které odštěpují maltosové jednotky z neredukujícího konce polysacharidů, taktéž neštěpí β (1→6) vazby, vznikají β – limitní dextriny (je disacharid, který je tvořen dvěma molekulami D-glukosy spojenými α(1→4) vazbou) 3. γ – amylasy  glukoamylasy, které odštěpují glukosové jednotky z neredukujícího konce polysacharidu Dále můžeme amylasy rozdělit na tři druhy: 1. Amylasy v lidských slinách 2. Amylasy produkované pankreatem 3. Amylasy v ostatních částech těla

2. 7. 1. 1 Amylasy v lidských slinách Amylasa vyskytující se v lidských slinách se nazývá ptyalin. Díky ní se v těle může štěpit škrob z přijatého jídla. V dutině ústní tedy začne štěpení složitých sacharidů na disacharidy. Avšak tento proces stále není úplný, protože nedojde k přeměně všech molekul. Celý proces tedy pokračuje v tenkém střevě, přímo ve dvanáctníku, kam ústí slinivka břišní produkující další amylasy.

2. 7. 1. 2 Amylasy produkované pankreatem Amylasa pankreatu hraje významnou roli v rozkladu cukrů, tuků a bílkovin. V této fázi už dochází k úplnému rozkladu oligosacharidů a polysacharidů (viz obr. 11) na základní disacharid maltosu a dextriny. V další části tenkého střeva dojde k rozštěpení maltosy na dvě molekuly glukosy, sacharosy na fruktosu a glukosu a laktosy na galaktosu a glukosu, což jsou monosacharidy postupně přijímané do krve.

Obr.11 Rozklad polysacharidu na maltosovou jednotku Z tohoto důvodu se při akutní pankreatitidě (akutní onemocnění slinivky břišní, patří mezi nejzávažnější náhlá onemocnění dutiny břišní) může objevit zvýšené

11

množství amylas, a to zejména v krvi, následně i v moči. Zvýšenou hladinu amylas můžeme sledovat i u jiných onemocnění, například onemocnění ledvin.

2. 7. 1. 3 Amylasy v ostatních částech těla Mírně se můžou amylasy vyskytovat ve střevních sliznicích a u žen ve vejcovodech. Amylas se obecně tělo zbavuje pomocí ledvin při procesu tzv. glomerulární filtrace (tvorba tzv. primární moči v glomerulech ledviny). Dále se amylasa může v malém množství vyskytovat i v krvi a moči.

2. 7. 2 Peroxidasy Peroxidasa je enzym, který se vyskytuje u rostlin, hub i živočichů. Účinkuje tak, že přenáší kyslík peroxidů na vhodný akceptor (viz obr. 12). Nejčastějším substrátem se tedy stává především peroxid vodíku, který vzniká při oxidoredukčních činnostech v buňce a působil by jedovatě. Peroxidasa ho rozloží na vodu a kyslík. Můžeme je rozdělit na pravé a nepravé neboli na fermentativní a nefermentativní (někdy označováno jako kvašení, přeměna organických látek na látky energeticky chudší), přičemž účinek nepravých peroxidas je mnohonásobně menší, než účinek pravých.

Obr. 12 Příklad reakce s peroxidasou

Peroxidasy se z fyziologického hlediska dají rozdělit na dvě skupiny: 1. Peroxidasy, jejichž zoxidovaný produkt má fyziologickou roli 2. Peroxidasy, které slouží k eliminaci peroxidu vodíku a organických peroxidů  sem patří například glutathion (je tripeptid složený z aminokyselin kyseliny glutamové, cysteinu a glycinu) peroxidasa, cytochrom c peroxidáza a NADH peroxidasa V rostlinách se peroxidasy účastní biosyntézy ligninu (zabezpečuje dřevnatění buněčných stěn dřeva) a ethylenu (fytohormon, způsobující mimo jiné zrání plodů, opadávaní listů a stárnutí květů). Peroxid vodíku a organické peroxidy pro tyto reakce vznikají reakcí oxidas10.

2. 7. 2. 1 Glutathionperoxidasa Je to enzym (viz obr. 13) katalyzující štěpení peroxidu vodíku a současnou oxidaci cysteinu obsahujícího glutathion. Aby tento enzym mohl plynule zajišťovat likvidaci peroxidu vodíku, je třeba regenerovat glutathion v redukované formě. K tomu slouží glutathionreduktasa, která využívá k redukci glutathionu pyridinový koenzym NADPH. Výsledkem obou těchto reakcí je rozštěpení peroxidu a současná oxidace NADPH, vzorec14: H2O2 + NADPH + H+ → 2 H2O + NADP 12

Obr. 13 Příklad reakce s glutathionperoxidasou

2. 7. 2. 2 Askorbát peroxidasa V buňce musí být kontrolována hladina H2O2, na čemž se podílí velká řada enzymů. Mezi ty nejdůležitější řadíme výše popsanou katalasu a askorbát peroxidasu. Katalasa se vyskytuje v chloroplastech, ale přeměna H2O2 na H2O a O2 probíhá v systému jiných organel, který mimo jiné obsahují právě askorbát peroxidasu. Nejzásadnější funkcí askorbát peroxidasy pro organismus, je eliminace peroxidu vodíku a vyskytuje se také v cytoplazmě (viz obr. 16). Jako enzym důležitý pro ochranu chloroplastů a dalších buněčných složek je askorbát peroxidasa významná zejména pro rostliny a řasy. Působí tedy jako ochrana proti peroxidu vodíku a hydroxylovému radikálu, který z něj vzniká10.

Obr. 16 Příklad působení askorbát peroxidasy

V prostředí bez donoru elektronů se ztrácí aktivita askorbát peroxidasy. Nejlepším a nejvhodnějším donorem je askorbát, avšak forma chloroplastická nebo cytoplazmatická jsou v menší míře schopny přijímat i guajakol, který je nejčastěji používán guajakol peroxidázou. I Askorbát peroxidáza v sobě obsahuje dva izoenzymy: 1. Vyskytující se v chloroplastech, kde eliminuje množství H2O2 2. Cytosolický – obsažen v cytoplazmě

13

2. 7. 3 Katalasy Enzymy rozkládající peroxid vodíku na vodu a molekulární kyslík na rozdíl od peroxidasy nevedou reakce k oxidaci okolních sloučenin. Vyskytují se ve všech živých organismech vystavených kyslíku. Katalasa (viz obr. 14) má jedno z nejvyšších čísel přeměny ze všech enzymů.

Obr. 14 Katalasa je enzym katalyzující rozklad H2O2

Jediná molekula katalasy může převést na vodu a kyslík miliony molekul peroxidu vodíku za sekundu13. Katalasa nemá oxidační účinek, protože neaktivuje vzniklý kyslík. 2H2O2  2H2O + O2 Katalasa se vyskytuje ve všech buňkách aerobních organismů, často však chybí v anaerobních buňkách. Velké množství katalasy se vyskytuje v játrech15. Ochranná funkce katalasy je omezená jejím výskytem – nachází se v peroxisomech (buněčná organela eukaryotických buněk, účastní se metabolických drah). Navíc má relativně slabou afinitu (schopnost slučovat se s jinými látkami) k substrátu a vykazuje nízkou citlivost k aktivaci světlem10. Kromě peroxisomů ji můžeme nalézt i v glyoxysomech (specialisovaný typ peroxisomu v rostlinných buňkách) a dalších organelách, ve kterých působí enzymy tvořící H2O2, jako je například glykolát oxidasa (taktéž laktátdehydogenasa, která katalyzuje reverzibilní přeměnu laktátu na pyruvát). Katalasa katalyzuje degradaci H2O2 na vodu a kyslík. Představuje tedy jistou ochranu před škodlivými vlivy H2O2, který může vznikat při fotooxidaci (oxidace způsobená slunečním světlem) během expozice UV záření. Zatímco peroxidasa využívá k vychytávání peroxidu vodíku fotoreduktant (fotoredukce je redukce NADP při fotosyntéze) vznikající v thylakoidech (membránová struktura sinic, řas a vyšších rostlin, ve které probíhá fotosyntéza), katalasa využívá redukční schopnosti askorbátu (ten je opět regenerován ze své oxidované formy za katalýzy buď monodehydroaskorbát reduktázou nebo dehydroaskorbát reduktasou. Oba tyto donory elektronů jsou poté redukovány elektrony vyskytující se v thylakoidech).

14

2. 7. 3. 1 Peroxid vodíku Pro lepší pochopení katalas jako samostatné skupiny enzymů, se nejdříve musíme zaměřit na samotný peroxid vodíku. Poprvé byl peroxid vodíku připraven v roce 1818. Značíme ho H2O2 (viz obr. 15), je poměrně málo reaktivní a je schopen pronikat membránovými stěnami. Peroxid vodíku může podléhat disproporcionaci (nejčastěji redoxní děj, při kterém se látka současně redukuje i oxiduje) – spontánní nebo katalyzované katalasou, může být použit jako substrát pro různé peroxidasy 10. Jako 3% vodní roztok je používán do dezinfekcí, ale také pro své bělící účinky například na odbarvování vlasů.

Obr. 15 Struktura peroxidu vodíku

2. 7. 3. 2 Přechodný komplex Katalasa působí přes přechodný komplex katalasa-H2O2, který nazveme jako sloučenina I. a dále máme dvě možnosti: 1. bude produkovat molekulární kyslík a vodu, což nazýváme katalasová aktivita 2. rozloží se na neaktivní formu, kterou pojmenujeme jako sloučenina II. Sloučenina I. je mnohem silnější oxidant než H2O2, tudíž reakce Sloučeniny I. s další molekulou H2O2 vede k přeměně peroxidu na další silný oxidant, hydroxylový radikál10. Kromě přímého rozkladu H2O2 může katalasa využívat H2O2 k oxidaci dalších substrátů jako je methanol, ethanol, formaldehyd či rtuť.

2. 7. 3. 3 Izoenzymy Katalasa se v buňce vyskytuje v podobě tří izoenzymů: 1. Cat1  Především se uplatňuje při samotném odstraňování H2O2 při fotorespiraci 2. Cat2  Jeho funkce není dosud známa, víme jen, že jeho množství je v buňce výrazně menší než množství Cat1 a Cat3 a že se vyskytuje v mitochondriích 3. Cat3  Během degradace mastných kyselin eliminuje Cat3 H2O2 v glyoxysomech

15

3 Experimentální část V experimentální části jsme se zaměřili na pokusy, které dokazují přítomnost a aktivitu enzymů. Dále jsme se zabývali vlivy, které enzymatickou aktivitu ovlivňují.

3. 1 Experiment 1 V prvním pokusu přímo uvidíme rozklad peroxidu vodíku na kyslík a vodu za pomocí enzymu katalasy a jak závisí aktivita enzymu na koncentraci substrátu (peroxid vodíku o různé koncentraci). 2H2O2

katalasa

2H2O + O2

Náš pokus se zakládá na opakovaném vkládání enzymu (katalasa) do substrátu (peroxid vodíku) a sledování reakce. Jako nositele enzymu použijeme kolečko z filtračního papíru o přesném průměru, které necháme nasáknout ve šťávě ze syrových brambor (obsahujících enzym katalasa). Takové kolečko osušíme a vložíme do určené koncentrace peroxidu vodíku (viz Obr. 17). Kolečko se po určité době začne zvedat ze dna a to právě v důsledku rozkladu peroxidu vodíku na vodu a kyslík, který kolečko nadnese (viz obr. 18). Můžeme tedy pozorovat drobné bublinky unikajícího kyslíku. Koncentrace substrátu ovlivní rychlost katalýzy enzymem. Budeme tedy stopovat čas mezi vložením papírku a jeho vyplaváním na hladinu. Pro určení přesnosti pokusu si na jedné koncentraci zopakujeme celý experiment pětkrát. Podmínky experimentu:

centimetrové kolečko filtračního papíru 5s máčení v bramborech 10s sušení 25ml peroxidu vodíku o různé koncentraci

(Obr. 18) Důsledek rozkladu katalasou

(Obr. 17) Příprava pomůcek

16

(Tab. 1.) Výsledky měření v různých koncentracích Konc. H2O2 (%) 0 0,1 0,5 1 3

Čas (s) 1500 113 39 21 10

(Graf 1.) viz tab. 1. Graf znázorňující závislost času vyplavání na koncentraci substrátu Z pozorované závislostní je zřejmý hyperbolický průběh enzymatické reakce, což je pro tento typ reakcí typické (reakce 1. řádu)1. Nakonec si ve stejné koncentraci ověříme opakovatelnost měření. (Tab. 2.) Opakovatelnost měření Pokus Naměřený č. čas (s) 1. 40 2. 46 3. 40 4. 39 5. 45

17

3. 2 Experiment 2 V druhém pokusu ověříme funkci inhibitorů enzymů. Použijeme vařenou bramboru, bramboru namočenou v Pb(NO2)2, BaCl2, H2SO4 po dobu pěti minut a syrovou bramboru. Takto upravené vzorky vložíme opět do peroxidu vodíku a sledujeme, zdali je inhibitor funkční.

(Obr. 19) Rozklad peroxidu vodíku na syrové bramboře a bramborách inhibovaných těžkým kovem.

(Obr. 20) Demonstrace různých typů inhibitorů – var, pH, těžký kov a nativní enzym

Obrázek 19. ukazuje pěnění způsobené štěpením peroxidu vodíku pomocí katalasy u syrové brambory. Chlorid barnatý částečně inhibuje tuto reakci, pravděpodobně by při delším smáčení brambory v BaCl2 došlo k úplnému zastavení katalytického štěpení. Zajímavostí je, že reakce mezi BaCl2 a H2O2 vydává slyšitelné popraskávání. Jako kvalitní inhibitor se ukazuje Pb(NO3)2, který mimo jiné difunduje do roztoku peroxidu, ve kterém reaguje chloridovými ionty druhého inhibitoru za vzniku bílého zákalu chloridu olovnatého (viz Obr. 20). Obrázek 4. představuje kyselinu sírovou a vaření jako další typ inhibice katalasy. Na závěr z porovnání vybraných inhibitorů bylo nejúčinnější uvaření brambory.

18

4 Závěr Závěrem naší práce bychom rády shrnuly dosavadní poznatky. Enzymy jsou biokatalyzátory zajišťující fungování všech živých organismů, neboť umožňují proběhnutí životně důležitých reakcí i za mírných podmínek. Dělí se do několika tříd podle funkce, kterou plní. Jejich činnost je regulována mnoha principy a často se využívá i kombinací různých faktorů. Příkladem enzymů mohou být amylasy uplatňující se při hydrolýze, nebo peroxidasy a katalasy, které zajišťují odbourávání peroxidu vodíku v organismu. Experimentálně jsme ověřily závislost aktivity enzymu na koncentraci substrátu a také funkci inhibitorů enzymu. Doufáme, že se nám povedlo vám přiblížit funkci enzymů a hlavně jejich nezbytnost pro náš organismus, který by bez enzymů nemohl fungovat.

19

5 Zdroje: 1 Vodrážka, Zdeněk. Biochemie 1. 1. vydání, Praha: Academia, 1992 2 Voet, Donald a Judith G. Voetová. Biochemie. Praha: Victoria publishing 3 Nelson, David a Michael Cox. Lehninger Principles of Biochemistry. 1. vydání, 1995 4 http://vydavatelstvi.vscht.cz/knihy/uid_es-002_v1/hesla/transferasy.html (3. 1. 2014) 5 http://slovnik-cizich-slov.abz.cz/web.php/slovo/lysozym (3. 1. 2014) 6 http://vydavatelstvi.vscht.cz/knihy/uid_es-002_v1/hesla/dekarboxylace.html (3. 1. 2014) 7 http://vydavatelstvi.vscht.cz/knihy/uid_es-002_v1/hesla/mutasy.html (3. 1. 2014) 8 http://vydavatelstvi.vscht.cz/knihy/uid_es-002_v1/hesla/ligasy.html (3. 1. 2014) 9http://webcache.googleusercontent.com/search?q=cache:S5_Ks2ztDvQJ:www.nh. cas.cz/people/safarik/Prednasky-na-JcU/Enzymologie/Jak-enzymypracuji.ppt+&cd=4&hl=cs&ct=clnk&gl=cz (3. 1. 2014) 10 http://is.muni.cz/th/211424/prif_m/Diplomova_prace.pdf (12. 12. 2013) 11 http://www.enzymeessentials.com/HTML/amylase.html (13. 12. 2013) 12 http://www.wikiskripta.eu/index.php/Amyl%C3%A1za (13. 12. 2013) 13 http://www.worthington-biochem.com/ctl/default.html (13. 12. 2013) 14 http://oldweb.izip.cz/ds3/hypertext/JRAAA.htm (14. 12. 2013) 15 Hamsík Antonín. Lékařská chemie, díl Biochemie. Praha: nakladatelství Společnosti čs. lékařů a vědeckých zdravotních pracovníků J. E. Purkyně, 1950

Zdroje obrazových příloh: Obr. 1 http://en.wikibooks.org/wiki/File:Carbonic_anhydrase_reaction_in_tissue.svg (1. 12. 2013) Obr. 2 http://it.wikipedia.org/wiki/File:NAD%2B_phys.svg (3. 1. 2014) Obr. 3 http://en.wikipedia.org/wiki/File:NADP%2B_phys.svg (3. 1. 2014) Obr. 4 http://www.biology.estranky.cz/clanky/vzorce-sloucenin/pismeno-h.html (3. 1. 2014)

20

Obr. 5 http://es.wikipedia.org/wiki/Archivo:ATP_chemical_structure.png (3. 1. 2014) Obr. 6 http://www.hsc.csu.edu.au/biology/core/balance/9_2_1/921net.html (1. 12. 2013) Obr. 7 http://2012books.lardbucket.org/books/introduction-to-chemistry-generalorganic-and-biological/s21-06-enzyme-action.html (1. 12. 2013) Obr. 8 http://oregonstate.edu/instruct/bb450/spring13/stryer7/8/figure_08_14.jpg (1. 12. 2013) Obr. 9 http://textbookofbacteriology.net/regulation.html (1. 12. 2013) Obr. 10 http://users.rcn.com/jkimball.ma.ultranet/BiologyPages/A/amylase.gif (14. 12. 2013) Obr. 11 http://www.worthington-biochem.com/ba/images/reaction.jpg (14. 12. 2013) Obr. 12 http://www.biosynth.com/media/horseradish_peroxidase.gif (14. 12. 2013) Obr. 13 http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/0/0d/Glutathione_perox idase_reductase.svg/620px-Glutathione_peroxidase_reductase.svg.png (14. 12. 2013) Obr. 14 http://openwetware.org/wiki/Biomod/2012/Titech/NanoJugglers/Methods/Varification_catalase (14. 12. 2013) Obr. 15 http://25.media.tumblr.com/tumblr_l108bhyAm21qaxrh5o1_500.png (14. 12. 2013) Obr. 16 http://www.uky.edu/~dhild/biochem/25/GSSG.gif (14. 12. 2013) Fotografie použité pro znázornění experimentu jsou naše vlastní.

21