FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SUMATERA UTARA MEDAN 2009

OPTIMASI FASE GERAK DAN LAJU ALIR PADA PENETAPAN KADAR CAMPURAN GUAIFENESIN DAN DEKSTROMETORFAN HBr DALAM SIRUP DENGAN METODE KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI (KCKT) SKRIPSI Diajukan untuk melengkapi salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Farmasi pada Fakultas Farmasi Universitas Sumatera Utara

OLEH:

LISA BELLA 060804043

FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SUMATERA UTARA MEDAN 2009

Lisa Bella : Optimasi Fase Gerak Dan Laju Alir Pada Penetapan Kadar Campuran Guaifenesin Dan Dekstrometorfan HBr Dalam Sirup Dengan Metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT), 2010.

PENGESAHAN SKRIPSI

OPTIMASI FASE GERAK DAN LAJU ALIR PADA PENETAPAN KADAR CAMPURAN GUAIFENESIN DAN DEKSTROMETORFAN HBr DALAM SIRUP DENGAN METODE KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI (KCKT) OLEH: LISA BELLA 060804043 Dipertahankan di hadapan Panitia Penguji Fakultas Farmasi Universitas Sumatera Utara Pada tanggal Januari 2010 Pembimbing I,

Panitia Penguji,

(Dra. Tuty Roida Pardede,Msi.,Apt) NIP : 130810736

(Prof. Dr.rer.nat. Effendy De Lux Putra,SU.,Apt.) NIP : 195306191983031001

Pembimbing II,

(Dra. Nurmadjuzita,Msi.,Apt.) NIP : 194809041974122001

(Drs. Muchlisyam,MSi,Apt.) NIP : 195006221980021001

(Dra. Sudarmi,Msi,Apt.) NIP : 195409101983032001

(Dra. Tuty Roida Pardede,Msi.,Apt) NIP : 130810736 Medan, Januari 2010 Fakultas Farmasi Universitas Sumatera Utara Dekan,

(Prof.Dr.Sumadio Hadisahputra,Apt.) NIP : 195311281983031002


KATA PENGANTAR

Puji dan syukur kehadirat Tuhan Yang Maha Esa yang telah melimpahkan rahmat dan karuniaNya sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi yang berjudul “ Optimasi Fase Gerak dan Laju Alir pada Penetapan Kadar Campuran Guaifenesin dan Dekstrometorfan HBr dalam Sirup dengan Metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT)”. Skripsi ini diajukan sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Farmasi pada Fakultas Farmasi Universitas Sumatera Utara. Pada kesempatan ini penulis mengucapkan terima kasih kepada Ibu Dra. Tuty Roida Pardede,Msi.,Apt. Dan Bapak Drs. Muchlisyam,Msi.,Apt. selaku dosen pembimbing yang telah membimbing penulis dari awal penelitian hingga selesainya skripsi ini.ucapan terima kasih juga disampaikan kepada Bapak Dekan Fakultas Farmasi Universitas sumatera Utara, Prof.Dr.Sumadio Hadisahputra,Apt. yang telah memberikan bantuan dan fasilitas selama masa pendidikan. Penulis juga mengucapkan terima kasih kepada kedua orangtua, abang, kakak, dan teman-teman atas doa, dorongan, dan pengorbanan baik moril maupun materil dalam penyelesain skripsi ini.

Medan, Januari 2010 Penulis,

Lisa Bella 060804043

iv Lisa Bella : Optimasi Fase Gerak Dan Laju Alir Pada Penetapan Kadar Campuran Guaifenesin Dan Dekstrometorfan HBr Dalam Sirup Dengan Metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT), 2010.

OPTIMASI FASE GERAK DAN LAJU ALIR PADA PENETAPAN KADAR CAMPURAN GUAIFENESIN DAN DEKSTROMETORFAN HBr DALAM SIRUP DENGAN METODE KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI (KCKT)

Abstrak Salah satu variabel metode analisis yang sangat penting dalam Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) adalah fase gerak karena komposisi fase gerak berpengaruh nyata terhadap kinerja kromatografi. Oleh karena itu, untuk mendapatkan kondisi yang optimal dalam analisis perlu dilakukan optimasi terhadap fase gerak. Selain fase gerak, terdapat beberapa variabel penting lainnya, yaitu kolom (fase diam), suhu dan pH. Adapun optimasi yang paling sederhana dan yang paling sering dilakukan yaitu optimasi terhadap komposisi fase gerak dan laju alir. Pada penelitian ini dilakukan penetapan kadar pada sediaan farmasi yang mengandung guaifenesin dan dekstrometorfan HBr dengan terlebih dahulu dilakukan optimasi fase gerak dan laju alir dengan cara menyuntikan larutan guaifenesin BPFI dengan konsentrasi 1200 mcg/ml dan larutan dekstrometorfan HBr BPFI dengan konsentrasi 180 mcg/ml ke dalam sistem KCKT dengan perbandingan fase gerak metanol : air: buffer amonium format (45:54:1), (55:44:1), dan (65:34:1) dengan laju alir yang berbeda yaitu 1,0 ml/menit, 1,1 ml/menit, 1,2 ml/menit, 1,3 ml/menit, 1,4 ml/menit dan 1,5 ml/menit. Dari hasil optimasi, diperoleh kondisi optimal dengan perbandingan fase gerak metanol : air: buffer amonium format (55:44:1) dan laju alir 1,5 ml/menit,

waktu tambat

guaifenesin 3,1 menit dan dekstrometorfan HBr 5,4 menit dengan tekanan kolom 182 kgf/cm2. Kondisi optimal ini dipilih karena diperoleh waktu tambat yang cepat, theoritical plate yang besar, dan resolusi yang lebih baik. Dari hasil analisis guaifenesin dan dekstrometorfan HBr dalam sampel diperoleh bahwa sirup Dextrosin dan Dextrofort memenuhi persyaratan kadar guaifenesin yang tertera dalam USP 30 tahun 2007 yaitu mengandung guaifenesin tidak kurang dari 90,0% dan tidak lebih dari 110,0% dari jumlah yang tertera pada etiket, sedangkan sirup Vicks Anak-Anak Formula 44 tidak memenuhi persyaratan. Selain itu, diperoleh bahwa sirup

v Lisa Bella : Optimasi Fase Gerak Dan Laju Alir Pada Penetapan Kadar Campuran Guaifenesin Dan Dekstrometorfan HBr Dalam Sirup Dengan Metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT), 2010.

Dextrosin memenuhi persyaratan kadar dekstrometorfan HBr yang tertera dalam USP 30 tahun 2007 yaitu mengandung dekstrometorfan HBr tidak kurang dari 90,0% dan tidak lebih dari 110,0% dari jumlah yang tertera pada etiket, sedangkan sirup Vicks Anak-Anak Formula 44 dan sirup Dextrofort tidak memenuhi persyaratan. Dari uji validasi metode yang dilakukan, dapat disimpulkan bahwa metode ini memenuhi persyaratan uji validasi dengan persen perolehan kembali guaifenesin 100,8243 % dan dekstrometorfan HBr 100,9337 %, Relatif Standar Deviasi (RSD) guaifenesin 0,3521 % dan dekstrometorfan HBr 0,2790 %, batas deteksi (LOD) guaifenesin 47,6866 mcg/ml dan dekstrometorfan HBr 5,8694 mcg/ml dan batas kuantitasi (LOQ) guaifenesin 144,5049 mcg/ml dan dekstrometorfan HBr 17,7860 mcg/ml. Kata kunci: KCKT, Optimasi, Guaifenesin, Dekstrometorfan HBr, Validasi.

vi Lisa Bella : Optimasi Fase Gerak Dan Laju Alir Pada Penetapan Kadar Campuran Guaifenesin Dan Dekstrometorfan HBr Dalam Sirup Dengan Metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT), 2010.

OPTIMIZATION OF MOBILE PHASE AND FLOW RATE FOR ANALYSIS OF GUAIFENESIN AND DEXTROMETHORPHAN HBr MIXTURE IN SYRUP WITH HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY (HPLC) METHOD

ABSTRACT

One of the analysis method variables that is very important in high performance liquid chromatography (HPLC) is mobile phase because the composition of mobile phase is really influences to chromatography process. To get the optimal condition of analysis, it is necessary to do mobile phase optimization. Besides mobile phase, there are some other important variables like column (stationary phase), temperature, and pH. The simples optimization and very often done are optimization of mobile phase and flow rate. Analysis

in

pharmacy

dosage

that

contains

guaifenesin

and

dextromethorphan HBr is doned in this research but the first is doned mobile phase and flow rate optimization by injected guaifenesin BPFI solution with concentration of 1200 mcg/ml and dextromethorphan HBr solution with concentration 180 mcg/ml into HPLC system with used methanol: water: buffer ammonium formate as mobile phase, with comparison (45:54:1), (55:44:1), (65:34:1) with different flow rate 1,0 ml/minute, 1,1 ml/ minute, 1,2 ml/ minute, 1,3 ml/ minute, 1,4 ml/minute and 1,5 ml/ minute. Then the retention time and column pressure is written at every injection with various comparisons of mobile phase and flow rate . From optimization, is obtained the comparison of methanol : water: buffer ammonium formate as mobile phase (55:44:1) and 1,5 ml/ minute flow rate, retention time of guaifenesin is 3,1 minute and retention time of dextromethorphan HBr is 5,4 minute,column pressure 182 kgf/cm2. This optimal condition is choosed because of the fast retention time, the large of theoritical plate, and the better resolution. From the result of guaifenesin and dextromethorphan HBr analysis in sample, all samples fulfilled the requirement of USP 30 NF 25 (2007), that is contains guaifenesin not less than 90,0 % and not more than 110,0% of the labeled amount of C10H14O4 except Vicks Anak-Anak Formula 44 syrup. The other results,

vii Lisa Bella : Optimasi Fase Gerak Dan Laju Alir Pada Penetapan Kadar Campuran Guaifenesin Dan Dekstrometorfan HBr Dalam Sirup Dengan Metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT), 2010.

is obtained that all samples fulfilled the requirement of USP 30 NF 25 (2007), that is contains dextromethorphan HBr not less than 90,0 % and not more than 110,0% of the labeled amount of C18H25NO.HBr.H2O except Vicks Anak-Anak Formula 44 syrup and Dextrofort syrup. From the validation test of method is doned, can be concluded that this method fulfilled the requirement of validation test with the recovery percentage of guaifenesin 100,8243 % and dextromethorphan HBr 100,9337 %, Relative Standard Deviation (RSD) of guaifenesin 0,3521% and dextromethorphan HBr 0,2790 %, limit of detection (LOD) of guaifenesin 47,6866 mcg/ml and dextromethorphan HBr 5,8694 mcg/ml, and

limit of quantitation (LOQ) of

guaifenesin 144,5049 mcg/ml and dextromethorphan HBr 17,7860 mcg/ml. Keywords : HPLC, Optimation, Guaifenesin,Dextromethorphan HBr, Validation.

viii Lisa Bella : Optimasi Fase Gerak Dan Laju Alir Pada Penetapan Kadar Campuran Guaifenesin Dan Dekstrometorfan HBr Dalam Sirup Dengan Metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT), 2010.

DAFTAR ISI Halaman JUDUL ............................................................................................................. HALAMAN JUDUL ......................................................................................... HALAMAN PENGESAHAN ........................................................................... KATA PENGANTAR ....................................................................................... ABSTRAK......................................................................................................... ABSTRACT ...................................................................................................... DAFTAR ISI ..................................................................................................... DAFTAR TABEL ............................................................................................. DAFTAR GAMBAR............................................................................................ DAFTAR LAMPIRAN .....................................................................................

i ii iii iv v vii ix xi xii xiv

BAB I PENDAHULUAN 1.1. Latar Belakang .................................................................................... 1.2. Perumusan Masalah ............................................................................. 1.3. Hipotesis ............................................................................................. 1.4. Tujuan Penelitian................................................................................. 1.5 Manfaat Penelitian..................................................................................

1 3 3 4 4

BAB II TINJAUAN PUSTAKA 2.1. Sirup ................................................................................................... 2.2. Dekstrometorfan HBr .......................................................................... 2.2.1. Sifat Fisikokimia......................................................................... 2.2.2. Kegunaan.................................................................................... 2.3. Guaifenesin ......................................................................................... 2.3.1. Sifat Fisikokimia......................................................................... 2.3.2. Kegunaan.................................................................................... 2.4. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT).......................................... 2.4.1. Pengertian Kromatografi Cair Kinerja Tinggi ............................. 2.4.2. Kegunaan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi .............................. 2.4.3 Komponen Kromatografi Cair Kinerja Tinggi ............................. 2.4.3.1 Wadah Fase Gerak ........................................................... 2.4.3.2 Pompa .............................................................................. 2.4.3.3 Injektor ............................................................................ 2.4.3.4 Kolom .............................................................................. 2.4.3.5 Detektor ........................................................................... 2.4.3.6 Fase Gerak ....................................................................... 2.4.4. Proses Kromatografi Cair Kinerja Tinggi .................................... 2.4.5. Parameter Kromatografi .............................................................. 2.4.6. Keuntungan dan Keterbatasan Kromatografi Cair KinerjaTinggi. 2.4.7. Validasi ......................................................................................

5 5 5 6 6 6 7 7 7 8 9 9 10 10 11 12 12 13 14 17 17

BAB III METODOLOGI PENELITIAN 2.1. Waktu dan Tempat Penelitian ..............................................................

19

ix Lisa Bella : Optimasi Fase Gerak Dan Laju Alir Pada Penetapan Kadar Campuran Guaifenesin Dan Dekstrometorfan HBr Dalam Sirup Dengan Metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT), 2010.

2.2. Alat-alat .............................................................................................. 2.3. Bahan-bahan ....................................................................................... 2.4. Prosedur Penelitian .............................................................................. 2.4.1. Pengambilan Sampel................................................................... 2.4.2. Pembuatan Pereaksi .................................................................... 2.4.2.1 Pembuatan Buffer Amonium Format ................................ 2.4.2.2 Pembuatan Fase Gerak (Metanol-Air-Buffer Amonium Format)................................................................................ 2.4.2.3 Pembuatan Pelarut Metanol-Air-Buffer Amonium Format (55:44:1)................................................ 2.4.3 Penyiapan Alat Kromatografi Cair Kinerja Tinggi........................ 2.4.4 Penentuan Perbandingan Fase Gerak dan Laju alir Sistem KCKT............................................................................................. 2.4.5 Uji Identifikasi................................................................................ 2.4.6 Penentuan Kuantitatif..................................................................... 2.4.6.1 Pembuatan Larutan Induk Baku Dekstrometorfan HBr BPFI.................................................................................... 2.4.6.2 Pembuatan Larutan Induk Guaifenesin BPFI..................... 2.4.6.3 Penentuan Linieritas Kurva Kalibrasi................................. 2.4.6.3.1 Pembuatan Kurva Kalibrasi Dekstrometorfan HBr BPFI dan Guaifenesin BPFI........................... 2.4.6.4 Penyiapan Sampel............................................................... 2.4.6.5 Penetapan Kadar Guaifenesin dan Dekstrometorfan HBr pada Sampel........................................................................ 2.4.7 Penentuan Uji Akurasi dengan Parameter Persen Perolehan Kembali Menggunakan Metode Penambahan Bahan Baku (Standard Addition Method)........................................................... 2.4.8 Penentuan Uji Presisi................................................................... 2.4.9 Penentuan Batas Deteksi (LOD) dan Batas Kuantitasi (LOQ).... 2.4.10 Analisa Data Secara Stastistik.....................................................

19 19 20 20 20 20 20 21 21 21 21 21 21 21 21 21 22 23

23 24 24 25

BAB III HASIL DAN PEMBAHASAN ...........................................................

28

BAB IV KESIMPULAN DAN SARAN 4.1. Kesimpulan ......................................................................................... 4.2. Saran ...................................................................................................

45 45

DAFTAR PUSTAKA ........................................................................................

46

LAMPIRAN ......................................................................................................

49

x Lisa Bella : Optimasi Fase Gerak Dan Laju Alir Pada Penetapan Kadar Campuran Guaifenesin Dan Dekstrometorfan HBr Dalam Sirup Dengan Metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT), 2010.

DAFTAR TABEL

Halaman Tabel 1.

Tabel 2.

Tabel 3.

Hasil optimasi fase gerak dan waktu alir terhadap tekanan, waktu tambat, resolusi, dan theoritical plate.............................................

20

Data hasil penetapan kadar guaifenesin dan dekstrometorfan HBr dalam sediaan sirup ................................................................ ..

28

Data hasil pengujian perolehan kembali guaifenesin dan dekstrometorfan HBr dengan metode penambahan bahan baku (standard addition method)............................................................

29

xi Lisa Bella : Optimasi Fase Gerak Dan Laju Alir Pada Penetapan Kadar Campuran Guaifenesin Dan Dekstrometorfan HBr Dalam Sirup Dengan Metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT), 2010.

DAFTAR GAMBAR

Halaman Gambar 1 Kromatogram hasil penyuntikan larutan uji dengan perbandingan fase gerak metanol : air : buffer amonium format (45:54:1) dan laju alir 1,0 ml/menit ..............................................

15

Gambar 2 Kromatogram hasil penyuntikan larutan uji dengan perbandingan fase gerak metanol : air : buffer amonium format (65:34:1) dan laju alir 1,0 ml/menit ..............................................

16


16


17

Gambar 5 Kromatogram hasil penyuntikan larutan uji dengan perbandingan fase gerak metanol : air : buffer amonium format (55:44:1) dan laju alir 1,2 ml/menit ...........................................

17


18


18


19

Gambar 9 Kromatogram hasil penyuntikan larutan uji dengan penambahan bahan baku dekstrometorfan HBr BPFI dengan perbandingan fase gerak metanol : air : buffer amonium format (55:44:1) dan laju alir 1,5 ml/menit ...........................................

19

Gambar 10 Kurva kalibrasi larutan guaifenesin BPFI konsentrasi versus luas puncak. ...............................................................................

23

Gambar 11 Kurva kalibrasi larutan dekstrometorfan HBr BPFI konsentrasi versus luas puncak.......................................................................

24

xii Lisa Bella : Optimasi Fase Gerak Dan Laju Alir Pada Penetapan Kadar Campuran Guaifenesin Dan Dekstrometorfan HBr Dalam Sirup Dengan Metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT), 2010.

Gambar 12 Kromatogram hasil penyuntikan larutan sirup Dextrofort (PT. Pembangunan Rocella Laboratories) dengan konsentrasi guaifenesin 600 mcg/ml dan dekstrometorfan HBr 90 mcg/ml...

26

Gambar 13 Kromatogram hasil penyuntikan larutan sirup Vicks AnakAnak Formula 44 (PT. Darya Varia Laboratoria) dengan konsentrasi guaifenesin 600 mcg/ml dan dekstrometorfan HBr 42 mcg/ml....................................................................................

26

Gambar 14 Kromatogram hasil penyuntikan larutan sirup Dextrosin (PT. Otto Pharmaceutical Industries) dengan konsentrasi guaifenesin 600 mcg/ml dan dekstrometorfan HBr 180 mcg/ml.

27

xiii Lisa Bella : Optimasi Fase Gerak Dan Laju Alir Pada Penetapan Kadar Campuran Guaifenesin Dan Dekstrometorfan HBr Dalam Sirup Dengan Metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT), 2010.

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman Lampiran 1.

Gambar alat KCKT dan syringe 100 µl ....................................

35

Lampiran 2.

Gambar Sonifikator (Branson 1510) dan Penyaring..................

36

Lampiran 3.

Kromatogram hasil penyuntikan larutan guaifenesin BPFI dan dekstrometorfan HBr BPFI dengan berbagai konsentrasi.......... 37

Lampiran 4.

Perhitungan persamaan regresi dari kurva kalibrasi guaifenesin BPFI dan dekstrometorfan HBr BPFI yang diperoleh secara KCKT..............................................................

40

Contoh perhitungan konsentrasi guaifenesin dan dekstrometorfan HBr yang ditambahkan pada uji perolehan kembali.......................................................................................

43

Kromatogram hasil persen perolehan kembali dari Sirup Dextrofort (PT. Rocella Pembangunan Indonesia)...................

44

Data hasil persen perolehan kembali guaifenesin dan dekstrometorfan HBr pada sirup Dextrofort (PT. Pembangunan Rocella Laboratories) dengan metode penambahan baku (Standard addition Method).........................

47

Analisa data statistik persen perolehan kembali guaifenesin dan dekstrometorfan HBr pada Sirup Dextrofort ( PT. Pembangunan Rocella Laboratories).........................................

48

Contoh perhitungan persen perolehan kembali..........................

50

Lampiran 10. Kromatogram dari larutan Sirup Dextrosin (PT. Otto Pharmaceutical Industries).........................................................

52

Lampiran 11. Analisa data statistik untuk mencari kadar guaifenesin dan dekstrometorfan HBr sebenarnya dari penyuntikan larutan Sirup Dextrosin (PT. Otto Pharmaceutical Industries) secara KCKT.........................................................................................

55

Lampiran 12. Kromatogram dari larutan Sirup Dextrofort (PT. Rocella Pembangunan Indonesia)...........................................................

58

Lampiran 5.

Lampiran 6.

Lampiran 7.

Lampiran 8.

Lampiran 9.

Lampiran 13. Analisa data statistik untuk mencari kadar guaifenesin dan dekstrometorfan HBr sebenarnya dari penyuntikan larutan

xiv Lisa Bella : Optimasi Fase Gerak Dan Laju Alir Pada Penetapan Kadar Campuran Guaifenesin Dan Dekstrometorfan HBr Dalam Sirup Dengan Metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT), 2010.

sirup Dextrofort (PT. Pembangunan Rocella Laboratories) secara KCKT…………………………………………………..

61

Lampiran 14. Kromatogram dari larutan Sirup Vicks Anak-Anak Formula 44 (PT. Darya-Varia Laboratoria ).............................................

64

Lampiran 15. Analisa data statistik untuk mencari kadar guaifenesin dan dekstrometorfan HBr sebenarnya dari penyuntikan larutan Vicks Anak-Anak Formula 44 (PT. Darya-Varia Laboratoria ) secara KCKT..............................................................................

67

Lampiran 16. Rekapitulasi hasil pengolahan data Guaifenesin dan Dekstrometorfan Hidrobromida dari sediaan sirup (sampel)....

70

Lampiran 17. Contoh perhitungan kadar guaifenesin dan dekstrometorfan hidrobromida pada sirup Dextrofort........................................

72

Lampiran 18. Contoh perhitungan kadar perolehan Guaifenesin dan dekstrometorfan HBr..................................................................

74

Lampiran 19. Daftar spesifikasi sampel...........................................................

76

Lampiran 20. Sertifikat pengujian guaifenesin BPFI.......................................

77

Lampiran 21. Sertifikat pengujian dekstrometorfan HBr BPFI........................

78

Lampiran 22. Sertifikat pengujian baku guaifenesin.......................................

79

Lampiran 23. Sertifikat pengujian baku dekstrometorfan HBr.......................... 80 Lampiran 24. Daftar Nilai Distribusi t............................................................... 82

xv Lisa Bella : Optimasi Fase Gerak Dan Laju Alir Pada Penetapan Kadar Campuran Guaifenesin Dan Dekstrometorfan HBr Dalam Sirup Dengan Metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT), 2010.

BAB I PENDAHULUAN 1.1

Latar Belakang Kromatografi cair kinerja tinggi merupakan metode pemisahan dengan

kecepatan dan efisiensi tinggi yang dapat mengidentifikasi serta menetapkan secara kuantitatif bahan dalam jumlah yang sangat kecil. KCKT mempunyai kemajuan dalam teknologi kolom, sistem pompa tekanan tinggi, dan detektor yang sensitif. Dengan teknologi ini, kromatografi cair dapat menghasilkan pemisahan yang cepat dalam banyak hal , dengan keunggulan zat-zat yang tidak menguap atau tidak tahan panas dapat dikromatografi tanpa peruraian atau tanpa perlu membuat derivat yang dapat menguap (Depkes RI,1995). Disamping itu, Komposisi fase gerak berpengaruh nyata terhadap kinerja kromatografi dan harus dikendalikan dengan cermat (Depkes RI,1995). Dalam obat batuk terdapat guaifenesin yang berkhasiat sebagai ekspektoran dan dekstrometorfan yang berkhasiat menekan rangsangan batuk (Tjay dan Rahardja,2007).Banyak obat batuk yang komposisinya berupa gabungan antara penekan batuk (dekstormetorfan) dan ekspektoran (guaifenesin) (Moffet,et.al.,2005). Di pasaran guaifenesin dan dekstrometorfan HBr tersedia dalam bentuk tablet dan sirup (ISFI,2008). Persyaratan kadar sirup guaifenesin dan dekstrometorfan HBr yang tertera dalam USP 30 tahun 2007 yaitu mengandung guaifenesin tidak kurang dari 90,0% dan tidak lebih dari 110,0% dari jumlah yang tertera pada etiket dan mengandung dekstrometorfan HBr tidak kurang dari 90,0% dan tidak lebih dari 110,0% dari jumlah yang tertera pada etiket (USP Pharmacopoeia,2007).

1


Penetapan kadar analit secara simultan dengan metode kromatografi cair kinerja tinggi adalah berdasarkan perbedaan interaksi atau afinitas analit terhadap fase diam, sehingga menghasilkan perbedaan waktu retensi pada masing-masing zat (Kazakevich and LoBrutto,2007). Jika fase gerak bersifat polar dan fase diam bersifat nonpolar disebut dengan kromatografi fase balik (Depkes RI,1995). Pada fase balik, analit yang lebih polar akan terelusi lebih cepat dibandingkan analit yang kurang polar (Ardrey,2003). Menurut McSharry and Savage tahun 1980, kadar guaifenesin dan dekstrometorfan

HBr

dalam

sediaan

sirup

ditentukan

dengan

metode

kromatografi cair kinerja tinggi secara simultan dengan menggunakan kolom 300 x 4 mm Bondapak C18 dengan perbandingan fase gerak metanol: air: buffer amonium format (45:54:1), laju alir 2,0 ml, menggunakan internal standar yaitu odinitrobenzen, dan deteksi pada panjang gelombang 280 nm.Disamping itu, dapat ditentukan dengan menggunakan kolom C5 dengan perbandingan fase gerak metanol : air yang mengandung 3% larutan buffer ammonium format pH 3,9 (43:57),

laju

alir

1,0

ml,dan

deteksi

panjang

gelombang

278

nm

(Rauha,et.al.,1996). Ada literatur yang menyatakan dapat juga ditentukan dengan perbandingan fase gerak metanol : air yang mengandung larutan buffer ammonium format pH 4,3 (45:55) (Shervington,1997). Berdasarkan hal tersebut diatas, peneliti ingin melakukan penetapan kadar sirup guaifenesin dan dekstrometorfan HBr secara simultan dengan metode kromatografi cair kinerja tinggi dengan memodifikasi perbandingan fase gerak metanol: air: dapar amonium formiat, laju alir, dan menggunakan eksternal standar dan kolom Sim-Pack VP ODS (4,6 x 250 mm) Selain itu, peneliti ingin

2


melakukan optimasi fase gerak dan laju alir untuk mendapatkan kondisi yang optimal dalam analisis.

1.2

Perumusan Masalah 1. Apakah kadar campuran guaifenesin dan dekstrometorfan HBr dalam sirup dapat dianalisis dengan metode KCKT secara simultan dengan menggunakan eksternal standar? 2. Berapakah perbandingan fase gerak metanol: air: dapar amonium formiat dan laju alir yang diperlukan agar diperoleh kondisi yang optimal dalam analisis? 3. Apakah kondisi optimal yang diperoleh memenuhi persyaratan uji validasi?

1.3

Hipotesis 1. Kadar campuran guaifenesin dan dekstrometorfan HBr dalam sirup dapat dianalisis dengan metode KCKT secara simultan dengan menggunakan eksternal standar. 2. Kondisi yang optimal dalam analisis dapat diperoleh dengan perbandingan fase gerak metanol-air-dapar amonium formiat dan laju alir tertentu dan yang terpilih. 3. Kondisi optimal yang diperoleh memenuhi persyaratan uji validasi.

3


1.4

Tujuan Penelitian 1. Mengetahui apakah kadar campuran guaifenesin dan dekstrometorfan HBr dalam sirup dapat dianalisis dengan metode KCKT secara simultan dengan menggunakan eksternal standar. 2. Mengetahui perbandingan fase gerak metanol: air: dapar amonium formiat dan laju alir yang diperlukan agar diperoleh kondisi yang optimal dalam analisis. 3. Melakukan uji validasi terhadap metode penetapan kadar guaifenesin dan dekstrometorfan HBr yang diperoleh dari optimasi fase gerak dan laju alir.

1.5

Manfaat Penelitian -

Hasil penelitian ini dapat dimanfaatkan untuk penetapan kadar campuran guaifenesin dan dekstrometorfan HBr dalam suatu sediaan sirup.

4


BAB II TINJAUAN PUSTAKA

2.1

Sirup Sirop adalah

sediaan cair berupa larutan yang mengandung sakarosa.

Kecuali dinyatakan lain, kadar sakarosa, C12H22O11, tidak kurang dari 64,0% dan tidak lebih dari 66,0% ((Depkes RI,1979). Sirup adalah larutan oral yang mengandung sukrosa atau gula lain kadar tinggi. Penggunaan istilah sirup juga digunakan untuk bentuk sediaan cair lain yang dibuat dengan pengental dan pemanis, termasuk suspensi oral (Depkes RI,1995).

2.2

DEKSTROMETORFAN HBr

2.2.1 Sifat Fisikokimia Rumus struktur :

Sinonim

:

3-Metoksi-17-Metil-9α,13α,14α-morfinan

hidrobromida,

monohidrat Berat Molekul :

C18H25NO.HBr.H2O sebesar 370,33 C18H25NO.HBr sebesar 352,31

5 Lisa Bella : Optimasi Fase Gerak Dan Laju Alir Pada Penetapan Kadar Campuran Guaifenesin Dan Dekstrometorfan HBr Dalam Sirup Dengan Metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT), 2010.

Pemerian

:

hablur hampir putih atau serbuk hablur, bau lemah. Melebur pada suhu kurang dari 126 0 disertai peruraian

:

pH

antara 5,2 sampai 6,5.

Wadah dan penyimpanan : dalam wadah tertutup rapat (Depkes RI,1995). Kelarutan

:

larut dalam 60 bagian air dan dalam 10 bagian etanol (95% P), mudah larut dalam kloroform P disertai pemisahan air, praktis tidak larut dalam eter P (Depkes RI,1979).

Kestabilan

:

dalam bentuk larutan stabil pada pH antara 4,5-6,0

dan

terlindung dari cahaya (Semla, et.al.,2004; Leonard,1994; Windholz,et.al.,1983). 2.2.2 Kegunaan Dekstrometorfan merupakan derivat fenantren non narkotik sintetis yang berkhasiat menekan rangsangan batuk. Mekanisme kerjanya berdasarkan peningkatan ambang pusat batuk di otak (Tjay dan Rahardja,2007).

2.3

GUAIFENESIN

2.3.1 Sifat Fisikokimia Rumus Struktur :

Sinonim

:

gliseril guaikolat ; 3-(o-Metoksifenoksi)-1,2-propanadiol


Rumus Molekul :

C10H14O4

Pemerian

Serbuk hablur, putih sampai agak kelabu ; bau khas lemah ;

:

rasa pahit Kelarutan

:

larut dalam air, etanol, kloroform, dan propilen glikol ; agk sukar larut dalam gliserin

pH

:

antara 5,0 dan 7,0

wadah dan penyimpanan Kestabilan

:

:

dalam wadah tertutup rapat (Depkes RI,1995).

terlindung dari cahaya (Semla, et.al.,2004; Leonard,1994).

2.3.2 Kegunaan Guaifenesin atau Gliseril Guaiakolat adalah derivat guaiakol yang banyak digunakan sebagai ekspektoran dalam berbagai jenis sediaan obat modern (Tjay dan Rahardja,2007).

2.4

Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT)

2.4.1 Pengertian Kromatografi Cair Kinerja Tinggi Kromatografi cair kinerja tinggi merupakan metode pemisahan dengan kecepatan dan efisiensi tinggi yang dapat mengidentifikasi serta menetapkan secara kuantitatif bahan dalam jumlah yang sangat kecil. KCKT mempunyai kemajuan dalam teknologi kolom, sistem pompa tekanan tinggi, dan detektor yang sensitif. Dengan teknologi ini, kromatografi cair dapat menghasilkan pemisahan yang cepat dalam banyak hal , dengan keunggulan zat-zat yang tidak menguap atau tidak tahan panas dapat dikromatografi tanpa peruraian atau tanpa perlu membuat derivat yang dapat menguap (Depkes RI,1995).


KCKT merupakan teknologi analitik yang cakap dalam berbagai bidang dan secara luas digunakan untuk analisis obat-obatan, biomolekul, polimerpolimer, dan banyak komponen organik maupun ionik (Dong,2006). Selain itu, KCKT merupakan bentuk kromatografi cair modern yang menggunakan kolom dengan partikel kecil melalui fase gerak yang dipompa pada tekanan tinggi (Dong,2006). Di industri farmasetikal modern, kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) merupakan peralatan analitik yang paling utama dan sempurna dalam seluruh tingkat penelitian, pengembangan, dan produksi obat (Kazakevich and LoBrutto,2007).

2.4.2 Kegunaan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi Kegunaan umum KCKT adalah untuk pemisahan sejumlah senyawa organik,

anorganik,

maupun

senyawa

biologis;

analisis

ketidakmurnian

(impurities); analisis senyawa-senyawa yang tidak mudah menguap (non-volatil); penentuan molekul-molekul netral, ionik, maupun zwitter ion; isolasi dan pemurnian senyawa; pemisahan senyawa-senyawa yang strukturnya hampir sama; pemisahan senyawa-senyawa dalam jumlah sekelumit (trace elements), dalam jumlah banyak, dan dalam skala proses industri. Selain itu KCKT paling sering digunakan untuk menetapkan kadar senyawa-senyawa tertentu seperti asam-asam amino, asam-asam nukleat, dan protein-protein dalam cairan fisiologis; menentukan kadar senyawa-senyawa aktif obat, produk hasil samping proses sintetis, atau produk-produk degradasi dalam sediaan farmasi; memonitor sampel-sampel yang berasal dari lingkungan ;


memurnikan senyawa dalam suatu campuran ; memisahkan polimer dan menentukan distribusi berat molekulnya dalam suatu camapuran ; kontrol kualitas ; dan mengikuti jalannya reaksi sintetis (Rohman,2007).

2.4.3 Komponen Kromatografi Cair Kinerja Tinggi

Gambar 1.

Bagan Alat KCKT dengan sistem elusi gradien (McMaster,2005).

Sistem Dasar KCKT terdiri dari wadah fase gerak, pompa, injektor, kolom, dan detektor. Pompa menarik fase gerak dari wadah dan memompanya menuju kolom. Pada bagian depan kolom dihubungkan dengan injektor yang berfungsi sebagai tempat memasukkan sampel ke sistem. Pada aliran keluar, terdapat detektor yang mendeteksi komponen sampel dan menghasilkan sinyal yang ditampilkan sebagai sebuah puncak pada bagian rekorder ( Kenkel,1994). 2.4.3.1 Wadah Fase gerak Wadah fase gerak terbuat dari bahan yang inert terhadap fase gerak. Bahan yang umum digunakan adalah gelas dan baja anti karat. Wadah ini biasanya dapat menampung fase gerak antara 1 sampai 2 liter.


2.4.3.2 Pompa Pompa berfungsi menarik fase gerak dari wadah dan memompanya menuju kolom.. Pompa harus mampu menghasilkan tekanan 6000 Psi pada kecepatan alir 0,1 – 10 ml/menit. Pompa terbuat dari bahan yang inert terhadap fase gerak. Bahan yang umum digunakan adalah gelas,baja antikarat,teflon, dan batu nilam. Tujuan penggunaan pompa adalah untuk menjamin proses penghantaran fase gerak berlangsung secara tepat, reproduksibel, konstan, dan bebas dari gangguan. Ada 2 jenis pompa dalam KCKT yaitu pompa dengan aliran fase gerak yang tetap dan pompa dengan tekanan konstan. 2.4.3.3 Injektor Sampel-sampel cair dan larutan disuntikkan secara langsung ke dalam fase gerak yang mengalir dibawah tekanan menuju kolom menggunakan alat penyuntik yang terbuat dari tembaga tahan karat dan katup teflon yang dilengkapi dengan keluk sampel (sample loop) internal atau eksternal. Ada tiga jenis dasar injektor, yaitu: a. Hentikan aliran/stop flow: Aliran dihentikan, injeksi dilakukan pada kinerja atmosfir, sistem tertutup, dan aliran dilanjutkan lagi. Tehnik ini bisa digunakan karena difusi di dalam aliran kecil dan resolusi tidak dipengaruhi. b. Septum: Injektor-injektor langsung ke aliran fase gerak umumnya sama dengan yang digunakan pada kromatografi gas. Injektor ini dapat digunakan pada kinerja sampai 60-70 atmosfir. Tetapi septum ini tidak tahan dengan semua pelarut-pelarut kromatografi cair. Disamping itu,


partikel kecil dari septum yang terkoyak (akibat jarum injektor) dapat menyebabkan penyumbatan. c. Katup putaran (loop valve): ditunjukkan secara skematik dalam Gambar 2, tipe injektor ini umumnya digunakan untuk menginjeksi volume lebih besar dari pada 10 µl dan sekarang digunakan dengan cara automatis (dengan adaptor khusus, volume-volume lebih kecil dapat diinjeksikan secara manual). Pada posisi LOAD, sampel loop (cuplikan dalam putaran) diisi pada tekanan atmosfir. Bila katup difungsikan, maka cuplikan di dalam putaran akan bergerak ke dalam kolom.

Gambar 2. Tipe injektor katup putaran

2.4.3.4 Kolom Kolom adalah jantung sistem KCKT karena pemisahan terjadi di kolom (McMaster,2005). Berhasil atau gagalnya suatu analisis tergantung pada pemilihan kolom dan kondisi percobaan yang sesuai. Kolom dapat dibagi menjadi dua kelompok: •

Kolom analitik: diameter khas adalah 2-6 mm. Panjang kolom tergantung pada jenis kemasan. Untuk kemasan pelikular, panjang yang lumrah


adalah 50-100 cm. Untuk kemasan poros mikropartikilat, umumnya 10-30 cm. Sekarang ini sudah tersedia yang berukuran 5 cm. •

Kolom preparatif: umumnya memiliki diameter 6 mm atau lebih besar dan panjang kolom 25 -100 cm. Kolom umumnya dibuat dari stainless steel dan biasanya dioperasikan

pada temperatur kamar, tetapi bisa juga digunakan temperatur lebih tinggi, terutama untuk kromatografi penukar ion dan kromatografi eksklusi. Kemasan kolom tergantung pada mode kromatografi cair kinerja tinggi yang digunakan.

2.4.3.5 Detektor Detektor pada KCKT dikelompokkan menjadi 2 golongan yaitu: •

Detektor universal: Mampu mendeteksi zat secara umum, tidak bersifat spesifik, dan tidak bersifat selektif, seperti detektor indeks bias dan detektor spektrometri massa.

•

Detektor spesifik: Hanya mendeteksi analit secara spesifik dan selektif, seperti

detektor

UV-Vis,

detektor

fluoresensi

dan

elektrokimia

(Rohman,2007).

2.4.3.6 Fase Gerak Fase gerak atau eluen biasanya terdiri atas campuran pelarut yang dapat bercampur yang secara keseluruhan berperan dalam daya elusi dan resolusi. Daya elusi dan resolusi ini ditentukan oleh polaritas keseluruhan pelarut, polaritas fase diam, dan sifat komponen-komponen sampel (Rohman, 2007)


Elusi gradien dan isokratik Elusi pada kromatografi cair kinerja tinggi dapat dibagi menjadi dua sistem yaitu: 1.

Sistem elusi isokratik. Pada sistem ini, elusi dilakukan dengan satu macam

atau lebih fase gerak dengan perbandingan tetap (komposisi fase gerak tetap selama elusi). 2.

Sistem elusi gradien. Pada sistem ini, elusi dilakukan dengan campuran

fase gerak yang perbandingannya berubah-ubah dalam waktu tertentu (komposisi fase gerak berubah-ubah selama elusi). Elusi bergradien digunakan untuk meningkatkan resolusi campuran yang kompleks terutama jika sampel mempunyai kisaran polaritas yang luas (Rohman,2007;Kenkel 1994).

2.4.4 Proses Kromatografi Cair Kinerja Tinggi Pemisahan dalam KCKT berdasarkan aliran larutan (fase gerak) yang membawa campuran analit melalui pori media dan perbedaan interaksi-interaksi analit dengan permukaan pori media yang menghasilkan perbedaan waktu migrasi untuk campuran komponen-komponen. Ada

dua fase yang terlibat dalam kromatografi yaitu satu fase yang

berfungsi membawa analit dan biasanya disebut fase gerak, dan fase lain yang tidak bergerak atau disebut fase diam.Terdapat hubungan diantara permukaan kedua fase tersebut. Campuran komponen biasanya disebut analit, yang didispersikan dalam fase gerak pada tingkat molekular sehingga memudahkan transpor yang seragam dan interaksi dengan fase gerak dan fase diam. Permukaan area yang besar pada antarpermukaan fase gerak dan fase diam penting untuk memberikan perbedaan jarak pada komponen-komponen yang 13 Lisa Bella : Optimasi Fase Gerak Dan Laju Alir Pada Penetapan Kadar Campuran Guaifenesin Dan Dekstrometorfan HBr Dalam Sirup Dengan Metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT), 2010.

berbeda dalam campuran. Molekul-molekul analit mengalami transisi berbagai fase saat berada diantara fase gerak dan permukaan adsorben. Rata-rata waktu interaksi molekul pada permukaan fase diam tergantung pada energi interaksi. Untuk molekul-molekul yang berbeda dengan perbedaan energi interaksi yang sangat kecil maka adanya permukaan signifikan adalah penting karena semakin besar jumlah transisi fase atau perubahan molekul analit yang bergerak melalui kolom

kromatografi,

semakin

berbeda

retensinya

(Kazakevich

and

LoBrutto,2007). Komposisi fase gerak dalam analisis KCKT berperan penting dalam keberhasilan pemisahan. Dalam percobaan fase normal dan balik, sebagai contoh, kelarutan relatif dari campuran komponen baik dalam fase gerak dan fase diam berperan dalam besarnya pemisahan. Campuran komponen yang kelarutannya tinggi dalam fase diam tetapi kelarutannya rendah dalam fase gerak akan menghasilkan waktu retensi yang lama. Sebaliknya, campuran komponen yang kelarutannya tinggi dalam fase gerak tetapi kelarutannya rendah dalam fase diam akan menghasilkan waktu retensi yang singkat. Karena pengaruh kelarutan pada polaritas molekul, maka

polaritas relatif pada campuran komponen penting

dibandingkan dengan fase diam dan fase gerak (Kenkel,1994).

2.4.5 Parameter Kromatografi Ada beberapa parameter kromatografi yang digunakan secara umum, yaitu: 1.

Waktu Tambat / Waktu Retensi


Jarak antara puncak maksimal dari titik injeksi yang dinyatakan dalam unit waktu disebut waktu retensi. Waktu retensi berfungsi sebagai pengidentifikasi analit pada sisitem partikuler. Waktu retensi merupakan deskriptor yang paling luas digunakan untuk analit, dan parameter yang paling mudah diukur. walaupun mudah diukur, waktu retensi merupakan parameter universal yang paling akhir. Waktu retensi analit tergantung pada laju alir fase gerak dan stabilitas laju alir. Semakin cepat laju alir, semakin singkat waktu retensi (Dong,2006). 2.

Resolusi Tujuan sederhana dan bahkan sangat penting dalam KCKT adalah

mendapatkan pemisahan campuran sampel yang baik. Untuk mencapai tujuan ini, kita perlu menghitung ukuran kuantitatif dari pemisahan relatif atau resolusi. Resolusi, Rs, dari dua puncak berdekatan didefinisikan sebagai perbandingan jarak antara dua puncak, dibagi dengan rata-rata lebar puncak. Rumusnya : Rs =

(t 2 − t1 ) 1 / 2(t w1 + t w 2 )

Dimana : t1 dan t2 = waktu retensi puncak 1 dan 2 tw1 dan tw2 = lebar puncak 1 dan 2

(Ahuja,2002)


3.

Height Equivalent of a Theoritical Plate (HETP) Rumus :

dimana :

N=

L H

H = height equivalent of a theoritical plate (HETP) N = jumlah total theoritical plate L = panjang kolom

Nilai H menunjukkan ukuran efisiensi yang diberikan kolom tiap unit panjang kolom. Nilai H yang kecil menyatakan kolom yang lebih efisien dan nilai N yang besar. Objek yang paling penting dalam KCKT adalah menimalkan nilai H sehingga nilai N maksimum dan efisiensi kolom paling tinggi. Nilai H menurun dengan : 1. ukuran partikel kolom yang kecil 2. laju alir fase gerak yang rendah 3. fase gerak yang kurang kental 4. pemisahan pada temperature tinggi 5. molekul-molekul sampel yang kecil (Ahuja,2002). 6. meningkatkan panjang kolom (Cazes,2005).

Jarak diantara puncak maksimal menunjukkan selektivitas sistem. Lebar puncak kromatografi menunjukkan efisiensi. Efisiensi dan selektivitas merupakan descriptor pelengkap yang tergantung pada parameter-parameter kromatografi yang berbeda-beda. Efisiensi lebih tergantung pada kualitas packing kolom, ukuran partikel, laju alir, dan optimasi instrumental sedangkan selektivitas lebih tergantung pada komponen fase diam dan analit itu sendiri (Dong,2006).


2.4.6 Keuntungan dan Keterbatasan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi Ada beberapa keuntungan kromatografi cair kinerja tinggi, yaitu : 1.

Dapat menganalisis sampel yang tidak mudah menguap atau tidak stabil dengan pemanasan

2.

Interaksi yang lebih selektif dengan molekul sampel karena fase gerak dan fase diam berperan dalam proses kromatografi

3.

Berbagai jenis kolom yang selektif (Ahuja and Jespersen,2006).

4.

Menghasilkan pemisahan dengan kecepatan tinggi

5.

Waktu analisis yang cepat (Kenkel,1994).

6.

Pemasukan sampel yang tepat dan mudah dikendalikan sehingga menjamin presisi kuantitaif

7.

Risiko peruraian sampel yang lebih kecil karena tidak dilakukan pemanasan

8.

Keragaman kolom dan detektor berarti bahwa selektivitas metode tersebut dapat disesuaikan dengan mudah (Watson,2007; Cazes,2005). Keterbatasan KCKT adalah untuk identifikasi senyawa, kecuali jika

KCKT dihubungkan dengan spektrofotometer massa (MS). Selain itu, keterbatasan lainnya adalah jika sampel yang dianalisis sangat kompleks, maka resolusi yang baik sulit diperoleh (Rohman,2007).

2.4.7 Validasi Validasi adalah suatu tindakan terhadap parameter tertentu pada prosedur penetapan yang dipakai untuk membuktikan bahwa parameter tersebut memenuhi persyaratan untuk penggunaannya (WHO, 1992).


Validasi metode menurut United States Pharmacopeia (USP) dilakukan untuk menjamin bahwa metode analisis akurat, spesifik, reprodusibel dan tahan pada kisaran analit yang akan dianalisis. Suatu metode analis harus divalidasi untuk verifikasi bahwa parameter-parameter kinerjanya cukup mampu untuk mengatasi masalah dalam analisis. Parameter analisis yang ditentukan pada validasi adalah akurasi, presisi, batas deteksi, batas kuantitasi, spesifikasi, linieritas dan rentang, kekasaran (Ruggedness) dan ketahanan (Robutness). Akurasi merupakan ketelitian metode analisis atau kedekatan antara nilai terukur dengan nilai yang diterima. Akurasi diukur sebagai banyaknya analit pada suatu pengukuran dengan melakukan spiking pada suatu sampel. Presisi merupakan ukuran keterulangan metode analisis dan biasanya diekspresikan sebagai relatif standar deviasi (RSD) dari sejumlah sampel yang berbeda secara signifikan secara statistik (Rohman,2007). Batas deteksi (limit of detection, LOD) didefinisikan sebagai konsentrasi analit terendah dalam sampel yang masih dapat terdeteksi (Epshtein,2004). Batas kuantitasi (limit of quantitation, LOQ) didefinisikan sebagai konsentrasi analit terendah dalam sampel yang dapat ditentukan dengan presisi dan akurasi yang dapat diterima pada kondisi analisis dengan metode yang digunakan (Epshtein,2004).


BAB III METODOLOGI PENELITIAN

2.1 Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental terhadap optimasi fase gerak dan laju alir, yang dilakukan di Laboratorium Penelitian Fakultas Farmasi Universitas Sumatera Utara pada bulan Agustus sampai Oktober 2009.

2.2 Alat-alat Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini meliputi seperangkat instrumen kromatografi cair kinerja tinggi (Shimadzu) yang terdiri dari pompa (LC 20 AD), detektor UV/Vis (SPD 20 A), kolom Sim-Pack VP ODS (4,6 x 250 mm), degasser (DGU 20 A5), injector (Rheodyne 7225 i), pompa vakum (Gast DO A-PG04-BN), Sonifikator (Branson 1510), syringe 100 µl (SGE), alat penyaring fase gerak dan sampel dilengkapi membran Whatman PTFE 0,5 µm, membran selulosa nitrat 0,45 µm, dan membran Whatman PTFE 0,2 µm, neraca analitik (Mettler Tolledo), pH meter (Hanna), dan alat gelas lainnya.

2.3 Bahan-bahan Bahan-bahan yang digunakan jika tidak dinyatakan lain adalah kualitas pro analisis produksi E.Merck yaitu amoniak 25 %, asam format 98%, metanol, aquabidestilata (PT. Ikapharmindo Putramas), dekstrometorfan HBr BPFI (Badan POM RI), guaifenesin BPFI (Badan POM RI), baku dekstrometorfan HBr (PT. Pembangunan Rocella Laboratories), baku guaifenesin (PT. Pembangunan


Rocella Laboratories), sirup Dextrofort (PT. Pembangunan Rocella Laboratories), sirup Vicks Anak-Anak Formula 44 (PT. Darya Varia Laboratoria), dan sirup Dextrosin (PT. Otto Pharmaceutical Industries).

2.4 Prosedur Penelitian 2.4.1 Pengambilan Sampel Sampel yang diambil adalah guaifenesin dan dekstrometorfan HBr yang mempunyai komposisi berbeda yaitu sirup Dextrofort (PT. Pembangunan Rocella Laboratories) dengan No. Batch 8C 018, sirup Vicks Anak-Anak Formula 44 (PT. Darya Varia Laboratoria) dengan No. Batch 9011P2H1, dan sirup Dextrosin (PT. Otto Pharmaceutical Industries) dengan No. Batch 8H 2334.

2.4.2

Pembuatan Pereaksi

2.4.2.1 Pembuatan Buffer Amonium Format pH 3,9 Dilarutkan 34 ml amoniak 25% dengan 30 ml air lalu ditambahkan 30 ml asam formiat 98%. Setelah larutan dingin, diperiksa pH (pH 3,9) lalu diencerkan dengan air sampai 100 ml (McSharry and Savage,1980).

2.4.2.2 Pembuatan Fase Gerak (Metanol-Air-Buffer Amonium Format) Disaring 500 ml aquabidest dengan penyaring membran selulosa nitrat 0,45 µm, disaring 100 ml buffer amonium format dengan penyaring membran selulosa nitrat 0,45 µm, dan disaring 500mL metanol dengan penyaring membran Wathman PTFE 0,5 µm, kemudian masing-masing diawaudarakan selama 20 menit.


2.4.2.3 Pembuatan Pelarut Metanol-Air-Buffer Amonium Format (55:44:1) Dicampur 275 ml metanol, 220 ml aquabidest dan 5 ml buffer amonium format lalu dikocok.

2.4.3 Penyiapan Alat Kromatografi Cair Kinerja Tinggi Masing-masing unit diatur, kolom yang digunakan Sim-Pack VP ODS (4,6 mm x 25 cm) dengan detektor UV/Vis. Pompa yang digunakan metode aliran tetap dengan sistem elusi gradien, sensitivitas 1,000 AUFS. Setelah alat KCKT dihidupkan, maka pompa dijalankan dan fase gerak dibiarkan mengalir sekitar 30 menit sampai diperoleh garis alas yang datar, hal ini menunjukkan sistem tersebut telah stabil.

2.4.4 Penentuan Perbandingan Fase Gerak dan Laju alir Sistem KCKT Larutan guaifenesin BPFI dengan konsentrasi 1200 mcg/ml dan dekstrometorfan HBr BPFI dengan konsentrasi 180 mcg/ml diinjeksikan ke dalam sistem KCKT menggunakan fase gerak metanol : air : buffer amonium format, dengan perbandingan (45:54:1), (55:44:1), (65:34:1) dengan laju alir yang berbeda yaitu 1,0 ml/menit, 1,1 ml/menit 1,2 ml/menit, 1,3 ml/menit, 1,4 ml/menit,dan 1,5 ml/menit. Kemudian dicatat waktu tambat dan tekanan kolom pada tiap penyuntikan dengan berbagai perbandingan fase gerak dan laju alir (data dapat dilihat pada Tabel 1).

2.4.5 Uji Identifikasi Uji identifikasi terhadap guaifenesin dan dekstrometorfan HBr dilakukan dengan

membandingkan

waktu

retensi

larutan

guaifenesin

BPFI

dan

dekstrometorfan HBr BPFI terhadap waktu retensi larutan sampel pada panjang


gelombang 280 nm. Bila waktu retensi sampel hampir sama dengan waktu tambat guaifenesin BPFI dan dekstrometorfan HBr BPFI, berarti sampel mengandung guaifenesin dan dektrometorfan HBr. Selain itu, uji identifikasi dilakukan dengan metode spiked yaitu menambahkan bahan baku dekstrometorfan HBr ke dalam larutan baku campur. Kemudian dianalisa secara KCKT dengan kondisi yang sama. Selanjutnya dilihat peningkatan luas area puncak dari sebelum penambahan baku dan sesudah penambahan baku. Jika terjadi peningkatan luas area berarti puncak tersebut merupakan puncak dekstrometorfan HBr (data dapat dilihat pada Gambar 9).

2.4.6 Penentuan Kuantitatif 2.4.6.1 Pembuatan Larutan Induk Baku Dekstrometorfan HBr BPFI Ditimbang 50 mg dekstrometrofan HBr BPFI, dimasukkan ke dalam labu tentukur 50 ml, dilarutkan dengan pelarut metanol-air-buffer amonium format (55:44:1) sampai garis tanda (1000 mcg/ml) lalu dikocok.

2.4.6.2 Pembuatan Larutan Induk Guaifenesin BPFI Ditimbang

100 mg guaifenesin BPFI, dimasukkan ke dalam labu

tentukur 25 ml, dilarutkan dengan pelarut metanol-air-bufer amonium format (55:44:1 ) sampai garis tanda ( 4000 mcg/ml) lalu dikocok.

2.4.6.3 Penentuan Linieritas Kurva Kalibrasi 2.4.6.3.1 Pembuatan Kurva Kalibrasi Dekstrometorfan HBr BPFI dan Guaifenesin BPFI Larutan induk dekstrometorfan HBr BPFI dipipet sebanyak 0,2 ml; 0,6 ml; 1,0 ml; 1,4 ml; 1,8 ml; 2,2 ml, masing-masing dimasukkan ke dalam labu 22 Lisa Bella : Optimasi Fase Gerak Dan Laju Alir Pada Penetapan Kadar Campuran Guaifenesin Dan Dekstrometorfan HBr Dalam Sirup Dengan Metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT), 2010.

tentukur 10 ml yang telah dibungkus dengan aluminum foil. Konsentrasi larutan 20 ; 60 ; 100 ; 140; 180 ; 220 mcg/ml selanjutnya larutan induk baku guaifenesin BPFI dipipet 0,25 ml; 1,0 ml; 1,75 ml; 2,5 ml; 3,25 ml; 4,0 ml, masing-masing dimasukkan ke dalam labu tentukur 10 ml yang telah dibungkus dengan aluminum foil . Konsentrasi larutan 100 ; 400 ; 700 ; 1000 ;1300 ; 1600 mcg/ml lalu diencerkan dengan pelarut campur metanol-air-buffer amonium format (55:44:1) sampai garis tanda dan dikocok. Kemudian masing-masing larutan

disaring dengan membran Whatman PTFE 0,2 µm. Diawaudarakan

selama 10 menit. Kemudian diinjeksikan filtrat sebanyak 100 µl menggunakan syringe ke dalam injektor dengan loop 20 µl, diukur pada panjang gelombang 280 nm. Selanjutnya dari konsentrasi dan luas area yang diperoleh pada kromatogram, dibuat kurva kalibrasi serta dihitung persamaan garis regresinya (data dapat dilihat pada Lampiran 4).

2.4.6.4 Penyiapan Sampel Dipipet 3 ml sampel sirup, dimasukkan ke dalam labu tentukur 50 ml yang telah dibungkus dengan aluminium foil, lalu dilarutkan dengan pelarut metanolair-buffer amonium format (55:44:1) sampai garis tanda, dikocok. Dilakukan pengulangan sebanyak 6 kali lalu masing-masing disaring dengan membran Whatman PTFE 0,2 µm. Diawaudarakan selama 10 menit. Kemudian dinjeksikan masing-masing filtrat sebanyak 100 µL menggunakan syringe ke dalam injektor dengan loop 20 µL, dan diukur pada panjang gelombang 280 nm.


2.4.6.5 Penetapan Kadar Guaifenesin dan Dekstrometorfan HBr pada sampel Dinjeksikan 20 µL larutan sampel ke dalam injektor menggunakan syringe dengan kondisi kromatografi yaitu fase gerak : metanol-air-buffer amonium format (55:44:1), laju alir 1,5 mL/menit dan detektor UV dengan panjang gelombang 280 nm, dan sistem elusi berupa gradien low pressure. Diamati puncak yang muncul dalam kromatogram. Luas area (luas puncak) dari kromatogram sampel (Y) disubsitusikan ke persamaan garis regresi yang diperoleh dari kurva kalibrasi (Y = aX + b), sehingga diperoleh konsentrasi sampel (X) dan dihitung kadarnya (data dapat dilihat pada Lampiran 17).

2.4.7 Penentuan Uji Akurasi dengan Parameter Persen Perolehan Kembali Menggunakan Metode Penambahan Bahan Baku (Standard Addition Method) Uji

perolehan

kembali

dilakukan

dengan

menambahkan

larutan

guaifenesin dengan konsentrasi 600 mcg/ml dan larutan dekstrometorfan HBr dengan konsentrasi 65 mcg/ml ke dalam sampel kemudian dianalisis dengan perlakuan yang sama seperti pada sampel. Menurut Harmita (2004), perolehan kembali dapat dihitung dengan rumus sebagai berikut : % Perolehan kembali = Keterangan : CF

CF − C A x 100 C *A

= konsentrasi sampel yang diperoleh setelah penambahan larutan baku

CA

=

konsentrasi sampel sebelum penambahan larutan baku


C∗A =

konsentrasi larutan baku yang ditambahkan

(data dapat dilihat pada Lampiran 18)

2.4.8 Penentuan Uji Presisi Uji presisi (keseksamaan) ditentukan dengan parameter Relatif Standar Deviasi (RSD) dengan rumus: RSD =

SD x 100% X

Keterangan : RSD = Relatif Standar deviasi SD = Standar deviasi X

= Kadar rata-rata sampel

(Epshtein,2004)

(data dapat dilihat pada Lampiran 8)

2.4.9 Penentuan Batas Deteksi (LOD) dan Batas Kuantitasi (LOQ) Batas deteksi adalah jumlah terkecil analit dalam sampel yang dapat dideteksi yang masih memberikan respon signifikan dibandingkan dengan blangko (Harmita, 2004). Batas deteksi dapat dihitung dengan rumus sebagai berikut : Batas Deteksi (LOD) =

SY =

3,3 × SY Slope

∑(Y − Yi) 2 n−2


Batas kuantitasi adalah kuantitas terkecil analit dalam sampel yang masih dapat memenuhi kriteria cermat dan seksama (Harmita, 2004). Batas kuantitasi dapat dihitung dengan rumus sebagai berikut : Batas Kuantitasi (LOQ) =

10 × SY Slope

Keterangan : SY

= Simpangan Baku Residual

Y

= Luas puncak

Yi

= Luas puncak dari persamaan regresi

n

= Jumlah perlakuan

LOD = Batas Deteksi LOQ = Batas Kuantitasi

(Epshtein,2004)

(Data dapat dilihat pada Lampiran 9)

2.4.10 Analisa Data Secara Stastistik Untuk menghitung Standar Deviasi (SD) digunakan rumus:

SD =

∑( x − x ) 2 n −1

Keterangan : SD = Standar deviasi X = Kadar sampel X = Kadar rata-rata sampel n = Jumlah perlakuan

(Epshtein,2004)

Kadar dapat dihitung dengan persamaan garis regresi dan untuk menentukan data diterima atau ditolak digunakan rumus:


t hitung =

X −X SD / n

Dengan dasar penolakan data adalah apabila t hitung ≥ t tabel Untuk mencari kadar sebenarnya dengan α = 0,005; dk = n-1, dapat digunakan rumus : µ= X ± t (1−1 / 2α ).dk X

SD n

Keterangan : µ = Kadar sebenarnya X = Kadar rata-rata sampel n = Jumlah perlakuan t = Suatu harga yang besarnya tergantung pada derajat kebebasan dan tingkat kepercayaan dk = Derajat kebebasan

(Wibisono, 2005)

(data dapat dilihat pada Lampiran 11,15, dan 17)


BAB III HASIL PERCOBAAN DAN PEMBAHASAN

Untuk memperoleh kondisi yang optimal dilakukan optimasi fase gerak dan laju alir. Optimasi dilakukan dengan menyuntikkan larutan guaifenesin BPFI dan dekstrometorfan HBr BPFI dengan konsentrasi 1200 mcg/ml dan 180 mcg/ml ke dalam sistem KCKT dengan perbandingan fase gerak metanol : air : buffer amonium format (45:54:1), (55:44:1), (65:34:1) dengan laju alir yang berbeda yaitu 1,0 ml/menit, 1,1 ml/menit, 1,2 ml/menit, 1,3 ml/menit, 1,4 ml/menit, dan 1,5 ml/menit. Hasil optimasi dapat dilihat pada gambar di bawah ini:

Gambar 1 Kromatogram hasil penyuntikan larutan uji dengan perbandingan fase gerak metanol : air : buffer amonium format (45:54:1) dan laju alir 1,0 ml/menit.












Gambar 9 Kromatogram hasil penyuntikan larutan uji dengan penambahan bahan baku dekstrometorfan HBr BPFI dengan perbandingan fase gerak metanol : air : buffer amonium format (55:44:1) dan laju alir 1,5 ml/menit.


Dari kromatogram hasil penyuntikan baku campur guaifenesin BPFI dan dekstrometorfan HBr BPFI diperoleh 3 puncak yaitu 1 puncak guaifenesin, 1 puncak dekstrometorfan HBr, dan 1 puncak yang terletak disebelah puncak guaifenesin. Puncak ini kemungkinan merupakan hasil degradasi dari baku guaifenesin, akibatnya kadar guaifenesin yang terdeteksi menjadi berkurang. Hal ini berarti perhitungan kadar guaifenesin dalam sampel yang diperoleh dari persamaan regresi menjadi kurang akurat.

Tabel 1. Hasil optimasi fase gerak dan waktu alir terhadap tekanan, waktu tambat, resolusi, dan theoritical plate.

1,5

124 135 146 159 170 182

1,0

115

3,351

1,3 1,4

65 : 34 : 1

Dekstrometorfan HBr

8,867 5,903 5,101 4,971 4,970 4,956 6,180

Guaifenesin

127

Dekstrometorfan HBr

1,0 1,0 1,1 1,2

Waktu tambat (menit)

Guaifenesin

Resolusi

55 : 44 : 1

Tekanan (kgf/cm2)

45 : 54 : 1

Theoritical Plate Laju alir (ml/menit)

Perbandingan fase gerak (Metanol : Air : Buffer Amonium Format)

2710,808 2568,211 2379,107 2207,286 2072,186 1985,203 2011,210 2189,778

2041,552 2533,601 2400,079 2313,006 2192,289 2109,077 2144,141 2568,256

6,672 4,642 4,196 3,853 3,571 3,335 3,133 3,728

14,725 7,478 6,409 5,884 5,524 5,198 5,422 4,911

Dari tabel diatas dapat dilihat bahwa kromatrografi dengan perbandingan fase gerak metanol-air-buffer amonium format (45:54:1) dan laju alir 1,0 ml menghasilkan kromatogram dengan resolusi yang besar yaitu 8,867. Akibatnya diperlukan waktu analisis yang lama

karena waktu tambat guaifenesin dan

dekstrometorfan HBr sebesar 6,672 menit dan 14,725 menit. Kondisi ini merupakan kondisi yang kurang optimal.


Pada kromatrografi dengan perbandingan fase gerak metanol-air-buffer amonium format (65:34:1) dan laju alir 1,0 ml menghasilkan kromatogram dengan resolusi yang kecil yaitu 3,351. Akibatnya puncak guaifenesin dan dekstrometorfan HBr saling berdekatan. Kondisi ini bukan merupakan kondisi optimal. Sedangkan kromatografi dengan perbandingan fase gerak metanol : air : buffer amonium format (55:44:1), laju alir 1,5 ml/menit, waktu tambat guaifenesin

3,133 menit dan dekstrometorfan HBr 5,422 menit dengan tekanan kolom 182 kgf/cm2 merupakan kondisi kromatografi yang optimal. Kondisi optimal ini dipilih karena waktu tambat guaifensin dan dekstrometorfan HBr yang cepat yaitu 3,133 menit dan 5,422 menit, theoritical plate yang besar, dan resolusi yang lebih baik. Persyaratan resolusi yang tertera di USP 30 yaitu harus lebih besar dari 1,5. Menurut Kazakevich dan LoBrutto (2007) bahwa semakin besar laju alir, semakin cepat waktu tambat analit. Menurut Ahuja (2002) semakin besar theoritical plate, semakin besar efisiensi kolom. Umumnya, theoritical plate lebih besar dari 2000 (Chemistry Manufacturing Controls Coordinating Committee,1994). Hal ini berarti resolusi dan theoritical plate yang diperoleh memenuhi persyaratan. Dalam penelitian ini optimasi dengan laju alir > 1,5 ml/menit tidak dilanjutkan karena pada laju alir > 1,5 ml/menit dihasilkan tekanan pompa > 200 kgf/cm2 . Kondisi ini tidak dapat digunakan karena dapat menyebabkan kerusakan dalam kolom. Uji identifikasi dekstrometorfan HBr dilakukan dengan penambahan sedikit baku dekstrometorfan HBr ke dalam larutan uji. Hasilnya dapat dilihat pada Gambar 8 dan 9 yaitu terjadi peningkatan luas area pada puncak dengan 34 Lisa Bella : Optimasi Fase Gerak Dan Laju Alir Pada Penetapan Kadar Campuran Guaifenesin Dan Dekstrometorfan HBr Dalam Sirup Dengan Metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT), 2010.

retensi 5,4 menit yaitu dari 876709 menjadi 934516. Hal ini berarti konsentrasi dekstrometorfan HBr juga meningkat sehingga dapat disimpulkan bahwa puncak dengan wakru retensi 5,4 menit merupakan puncak dekstrometorfan HBr. Dari kromatogram hasil penyuntikan larutan baku campur diperoleh bahwa guaifenesin lebih dulu terelusi dibandingkan dekstrometorfan HBr. Hal ini disebabkan guaifenesin bersifat lebih polar dibandingkan dengan dekstrometorfan HBr sehingga interaksi guaifenesin dengan fase diam lebih singkat dibandingkan interaksi dekstrometorfan HBr dengan fase diam. Akibatnya waktu tambat guaifenesin lebih cepat dibandingkan dekstrometorfan HBr. Larutan dekstrometorfan HBr dan guaifenesin akan stabil jika terlindung dari cahaya (Semla, et.al.,2004; Leonard,1994). Agar larutan guaifenesin dan dekstrometorfan HBr tetap stabil maka guaifenesin dan dekstrometorfan HBr dilarutkan dengan fase gerak yang mengandung buffer amonium format karena larutan dekstrometorfan hidrobromida stabil dalam jangka panjang jika pH larutan disesuaikan antara 4,5-6,0 (Windholz,et.al.,1983) dan diletakkan dalam alat gelas yang ditutup dengan aluminium foil sehingga terlindung dari cahaya. Penentuan linieritas kurva kalibrasi guaifenesin BPFI ditentukan berdasarkan luas area puncak pada rentang konsentrasi 100 sampai 1600 mcg/ml, diperoleh hubungan linearitas dengan koefisien kolerasi (r) = 0,9997 dan persamaan garis regresi Y = 7460,0432 X + 258381,6130. Hasil linieritas kurva kalibrasi larutan guaifenesin BPFI dapat dilihat pada Gambar 10.


Gambar 10 Kurva kalibrasi larutan guaifenesin BPFI konsentrasi versus luas puncak. Penentuan linieritas kurva kalibrasi dekstrometorfan HBr BPFI ditentukan berdasarkan luas area puncak pada rentang konsentrasi 20 sampai 220 mcg/ml, diperoleh hubungan linearitas dengan koefisien kolerasi (r) = 0,9997 dan persamaan garis regresi Y = 4022,1207 X + 13102,0160. Hasil linieritas kurva kalibrasi larutan dekstrometorfan HBr BPFI dapat dilihat pada Gambar 11.


Gambar 11

Kurva kalibrasi larutan dekstrometorfan HBr BPFI konsentrasi versus luas puncak

Dalam penelitian diperoleh koefisien korelasi kalibrasi guaifenesin dan dekstrometorfan HBr sebesar 0,9997. Menurut Chemistry Manufacturing Controls Coordinating Committee (1994) persyaratan koefisien korelasi lebih besar dari 0,999. Hal ini berarti koefisien korelasi yang diperoleh memenuhi persyaratan.


Hasil identifikasi pada penyuntikan larutan guaifenesin BPFI dengan konsentrasi 1200 mcg/ml dan larutan dekstrometorfan HBr BPFI dengan konsentrasi 180 mcg/ml ke dalam alat KCKT diperoleh kromatogram dengan waktu tambat guaifenesin 3,133 menit dan dekstrometorfan HBr 5,422 menit. Hasil pengujian untuk sampel diperoleh waktu tambat yang hampir sama dengan guaifenesin BPFI dan dekstrometorfan HBr BPFI . Waktu tambat rata-rata guaifenesin 3,14 menit dan dekstrometorfan HBr 5,46 menit pada sirup Dextrofort (PT. Pembangunan Rocella Laboratories), waktu tambat rata-rata guaifenesin 3,14 menit dan dekstrometorfan HBr 5,50 menit pada sirup Vicks Anak-Anak Formula 44 (PT. Darya Varia Laboratoria), dan waktu tambat rata-rata guaifenesin 3,16 menit dan dekstrometorfan HBr 5,58 menit pada sirup Dextrosin (PT. Otto Pharmaceutical Industries). Menurut Weston and Brown (1997), perbedaan waktu tambat yang diperbolehkan 5 % sedangkan dari penelitian perbedaan waktu tambat masing-masing sampel dan baku dibawah 5 %. Hal ini berarti bahwa sampel yang digunakan dalam penelitian ini mengandung guaifenesin dan dekstrometorfan HBr. Kromatogram penentuan waktu tambat dapat dilihat pada Gambar 12,13, dan 14.


Gambar 12 Kromatogram hasil penyuntikan larutan sirup Dextrofort (PT. Pembangunan Rocella Laboratories) dengan konsentrasi guaifenesin 600 mcg/ml dan dekstrometorfan HBr 90 mcg/ml.

Gambar 13 Kromatogram hasil penyuntikan larutan sirup Vicks Anak-Anak Formula 44 (PT. Darya Varia Laboratoria) dengan konsentrasi guaifenesin 600 mcg/ml dan dekstrometorfan HBr 42 mcg/ml.


Gambar 14

Kromatogram hasil penyuntikan larutan sirup Dextrosin (PT. Otto Pharmaceutical Industries) dengan konsentrasi guaifenesin 600 mcg/ml dan dekstrometorfan HBr 180 mcg/ml.

Pada kromatogram hasil penyuntikan larutan sirup Vicks Anak-Anak Formula 44 diperoleh 4 puncak yaitu 1 puncak guaifenesin, 1 puncak dekstrometorfan HBr, dan 2 puncak zat lain. Sedangkan dari kromatogram hasil penyuntikan larutan sirup Dextrofort diperoleh 3 puncak yaitu 1 puncak guaifenesin, 1 puncak dekstrometorfan HBr, dan 1 puncak zat lain. Zat lain yang terdeteksi tersebut kemungkinan adalah zat-zat tambahan yang digunakan dalam pembuatan formulasi sirup, yang merupakan rahasia perusahaan tersebut karena dalam etiket hanya dicantumkan 2 zat aktif obat yaitu guaifenesin dan dekstrometorfan HBr. Zat-zat tambahan tersebut kemungkinan merupakan zat pengawet, zat pewarna, atau zat perasa.


Dari kromatogram hasil penyuntikan larutan sirup Dextrosin diperoleh 3 puncak yaitu 1 puncak guaifenesin, 1 puncak dekstrometorfan HBr, dan 1 puncak zat lain. Zat lain yang terdeteksi tersebut kemungkinan adalah zat aktif obat selain guaifenesin dan dekstrometorfan HBr karena dalam etiket sirup ini juga dicantumkan zat aktif obat lain yaitu fenilpropanolamin HCl dan difenhidramin HCl atau zat lain tersebut merupakan zat tambahan yang digunakan dalam pembuatan formulasi sirup, yang merupakan rahasia perusahaan tersebut. Zat-zat tambahan kemungkinan merupakan zat pengawet, zat pewarna, atau zat perasa. Luas puncak merupakan parameter yang lebih akurat untuk pengukuran kuantitatif (Ditjen POM,1995). Oleh karena itu, pengolahan data untuk menghitung kadar guaifenesin dan dekstrometorfan HBr dalam sediaan sirup berdasarkan luas puncak. Kadar guaifenesin dan dekstrometorfan HBr dalam sampel dapat dihitung dengan menggunakan persamaan regresi guaifenesin Y = 7460,0432 X + 258381,6130 dan persamaan regresi dekstrometorfan HBr Y = 4022,1207 X + 13102,0160 dengan mensubsitusikan nilai Y sebagai luas puncak sampel, maka harga X (konsentrasi sampel) dapat diperoleh selanjutnya dihitung kadar zat masing-masing. Pengolahan data dapat dilihat pada Lampiran 20. Perhitungan data statistik diperoleh kadar guaifenesin dan dekstrometorfan HBr dalam sampel seperti terlihat pada Tabel 2.


Tabel 2. Data hasil penetapan kadar guaifenesin dan dekstrometorfan HBr dalam sediaan sirup.

No

Nama Sampel

1.

Sirup Dextrofort (PT. Rocella Pembangunan Indonesia)

2.

Sirup Dextrosin (PT. Otto Pharmaceutical Industries)

3.

Sirup Vicks Anak-Anak Formula 44 (PT. Darya-Varia Laboratoria)

Kadar Kadar Guaifenesin Dekstrometorfan (%) HBr (%) 102,3803 ± 0,8303

127,8214 ± 6,1504

94,3559 ± 4,9605

98,2744 ± 5,6745

86,9205 ± 2,3141

125,5116 ± 8,6803

Sirup Dextrosin dan Dextrofort memenuhi persyaratan kadar guaifenesin yang tertera dalam USP 30 tahun 2007 yaitu mengandung guaifenesin C10H14O4 tidak kurang dari 90,0% dan tidak lebih dari 110,0% dari jumlah yang tertera pada etiket, sedangkan sirup Vicks Anak-Anak Formula 44 tidak memenuhi persyaratan. Selain itu, diperoleh bahwa sirup Dextrosin memenuhi persyaratan kadar dekstrometorfan HBr yang tertera dalam USP 30 tahun 2007 yaitu mengandung dekstrometorfan HBr C18H25NO.HBr.H2O tidak kurang dari 90,0% dan tidak lebih dari 110,0% dari jumlah yang tertera pada etiket, sedangkan sirup Vicks Anak-Anak Formula 44 dan sirup Dextrofort tidak memenuhi persyaratan. Uji validasi metode dilakukan dengan metode penambahan bahan baku (standard addition method) terhadap sampel sirup Dextrofort (PT. Pembangunan

Rocella Laboratories). Uji validasi yang dilakukan berupa uji akurasi dengan parameter persen perolehan kembali (% recovery) dan uji presisi dengan parameter RSD (Relatif Standar Deviasi), batas deteksi (LOD),dan batas kuantitasi (LOQ) (WHO, 1992).


Uji akurasi dengan parameter persen perolehan kembali dilakukan dengan menambahkan guaifenesin konsentrasi 600 mcg/ml dan dekstrometorfan HBr konsentrasi 65 mcg/ml ke dalam sirup Dextrofort dengan 6 kali pengulangan. Data hasil pengujian perolehan kembali guaifenesin dan dekstrometorfan HBr dengan metode penambahan bahan baku (standard addition method) dapat dilihat pada Tabel 3.

Tabel 3. Data hasil pengujian perolehan kembali guaifenesin dan dekstrometorfan hidrobromida dengan metode penambahan bahan baku (standard addition method) a. Guaifenesin

Konsentrasi No.

Luas puncak

Setelah penambahan analit (A) mcg/ml

Sebelum penambahan analit (B) mcg/ml

1 9355598 1219,4589 615,0203 2 9342024 1217,6394 615,0203 3 9346956 1218,3005 615,0203 4 9365297 1220,7591 615,0203 5 9386920 1223,6576 615,0203 6 9359503 1219,9824 615,0203 Kadar rata – rata (%) Standar Deviasi (SD) Relatif Standar Deviasi (RSD) (%)

Analit yang ditambahkan (C) mcg/ml

600 600 600 600 600 600

Persen perolehan (A-B) X 100% C

100,7398 100,4365 100,5467 100,9565 101,4396 100,8270 100,8243 0,3550 0,3521


b. Dekstrometorfan HBr Konsentrasi No.

Luas puncak

Setelah penambahan analit (A) mcg/ml

Sebelum penambahan analit (B) mcg/ml

1 741639 181,1326 115,3970 2 741115 181,0023 115,3970 3 740768 180,9160 115,3970 4 740020 180,9787 115,3970 5 741020 180,9787 115,3970 6 742167 181,2638 115,3970 Kadar rata – rata (%) Standar Deviasi (SD) Relatif Standar Deviasi (RSD) (%)


65 65 65 65 65 65

Persen perolehan (A-B) X 100% C

101,1317 100,9312 100,7985 100,5123 100,8949 101,3335 100,9337 0,2816 0,2790

Dari hasil uji akurasi diperoleh persen perolehan kembali guaifenesin 100,8243% dan dekstrometorfan HBr 100,9337%, standar deviasi (SD) guaifenesin dan dekstrometorfan HBr sebesar 0,3550 dan 0,2816. Menurut Harmita (2004), untuk analit yang ditambahkan pada matrik sampel > 10% maka rata-rata % perolehan kembali yang diperoleh antara 98-102%. Hal ini berarti persen perolehan kembali guaifenesin dan dekstrometorfan HBr dapat diterima. Sedangkan dari hasil uji presisi dengan parameter Relative Standar Deviasi (RSD) diperoleh RSD guaifenesin sebesar 0,3521% dan dekstrometorfan HBr sebesar 0,2790%. Nilai RSD yang diizinkan adalah ≤ 2% (Epshtein,2004). Hal ini berarti metode yang digunakan dalam penelitian ini mempunyai akurasi dan presisi yang baik (WHO, 1992). Batas deteksi (LOD) guaifenesin dan dekstrometorfan HBr yang diperoleh sebesar 47,6866 mcg/ml dan 5,8694 mcg/ml sedangkan batas kuantitasi (LOQ) guaifenesin dan dekstrometorfan HBr sebesar yang diperoleh dari penelitian ini sebesar 144,5049 mcg/ml dan 17,7860 mcg/ml.


BAB IV KESIMPULAN DAN SARAN

6.1

Kesimpulan -

Kadar campuran guaifenesin dan dekstrometorfan HBr dalam sirup dapat dianalisis dengan metode KCKT secara simultan dengan menggunakan eksternal standar.

-

Kondisi kromatografi optimal yang diperoleh yaitu dengan perbandingan fase gerak Metanol : Air : dapar Amonium Formiat (55:44:1), laju alir 1,5 ml/menit, volume penyuntikan 20 µl, menggunakan kolom Sim-Pack VP ODS (4,6 x 250 mm), dan deteksi pada panjang gelombang 280 nm.

-

Kondisi optimal yang diperoleh dalam penelitian ini memenuhi persyaratan uji validasi sehingga dapat digunakan dalam analisis guaifenesin dan dekstrometorfan HBr dalam sirup yaitu dari hasil uji akurasi diperoleh persen perolehan kembali guaifenesin 100,8243 % dan dekstrometorfan HBr 100,9337 %, hasil uji presisi diperoleh Relatif Standar Deviasi (RSD) guaifenesin 0,3521% dan dekstrometorfan HBr 0,2790%, batas deteksi (LOD) guaifenesin 47,6866 mcg/ml dan dekstrometorfan HBr 5,8694 mcg/ml dan batas kuantitasi (LOQ) guaifenesin 144,5049 mcg/ml dan dekstrometorfan hidrobromida 17,7860 mcg/ml.

6.2

Saran -

Penetapan kadar campuran guaifenesin dan dekstrometorfan HBr dalam sirup dengan menggunakan fase gerak dan kolom yang lain


DAFTAR PUSTAKA

Ahuja,S.(2002).Chromatography and Separation Science.California: Academic Press:10,163. Ahuja,S. and Jespersen,N.D.(2006). Modern instrumental analysis. New York: Elsevier : 488. Ardrey,R.E.(2003). Liquid chromatography-mass spectrometry: an introduction. New York: John Wiley and Sons: 12. Cazes,J.(2005). Encyclopedia of Chromatography. 2nd Edition. New York: Marcel Dekker : 1435. Chemistry Manufacturing Controls Coordinating Committee.(1994).Validation of Chromatographic Methods,Reviewer Guidance.Rockville: Center for Drug Evaluation and Research, Food and Drug Administration: 12,28. Depkes RI. (1979). Farmakope Indonesia. Edisi Ketiga. Jakarta:Departemen Kesehatan RI: 31,206. Depkes RI. (1995). Farmakope Indonesia. Edisi Keempat. Jakarta:Departemen Kesehatan RI: 15,299,421-422,1009-1011. Dong,M.W.(2006). Modern HPLC for practicing scientists. New York: John Wiley and Sons: 26. Epshtein,N.A.(2004).Validation of HPLC Techniques for Pharmaceutical Analysis. J Pharm Chemistry.Apr. 38(4):216,222-223. Harmita.(2004).Petunjuk Pelaksanaan Validasi Metode dan Cara Perhitungannya. Review artikel. Majalah Ilmu Kefarmasian.Vol.I(3): 119,130. ISFI.(2008).Informasi Spesialite Obat Indonesia. Volume 43.Jakarta:PT. ISFI Penerbitan: 405. Kazakevich,Y. and LoBrutto,R.(2007). HPLC for pharmaceutical scientists. New York: John Wiley and Sons,Inc.:3-4,15. Kenkel,J.(1994). Analytical chemistry for technicians. 2nd Edition. New York: CRC Press : 394,412 Leonard,L.,Goldman,M.P.,Amstrong,L.L.,and Lacy,C.F.(2004). Drug Information Handbook International: With Canadian and International Drug Monographs. 12nd Edition.Michigan: Lexi Comp:738.


McMaster,M.C.(2005). LC/MS: a practical user's guide. New York: John Wiley and Sons : 9, 15. McSharry,W.O.,Savage,I.V.E.(1980).Simultaneous High Pressure Liquid Chromatographic Determination of Acetaminophen, Guaifenesin, and Dextromethorphan Hydrobromide in Cough Syrup. J Pharm.69:212-214. Moffet,H.L., Fisher,R.G., Boyce,T.G.(2005). Moffet's Pediatric Infectious Diseases: a Problem-Oriented Approach. 4 th Edition. New York: Lippincott Williams & Wilkins:16. Rauha,J.P., Salomies,H. dan Aalto,M. (1996). Simultaneous determination of bromhexine hydrochloride and methyl and propyl p-hydroxybenzoate and determination of dextromethorphan hydrobromide in cough-cold syrup by high-performance liquid chromatography.J Pharm Biomed Anal. Nov.15 (2):287-293. Rohman,A.(2007).Kimia Farmasi Analisis.Cetakan I. Jakarta: Pustaka Pelajar: 378-384. Semla,T.P., Beizer,J.L. and Higbee,M.D.(2004). Geriatric dosage handbook: including monitoring, clinical recommendations, and OBRA guidelines. 10th Edition.Michigan: Lexi Comp:592. Shervington,L.A.(1997). A Quantitative simultaneous high performance liquid chromatographic determination of pseudoephedrien HCl, guaifenesin, and dextromethorphan HBr. Analytical Letters:30(V). Tjay,T.H. dan Rahardja,K.(2007).Obat-Obat Penting Khasiat, Penggunaan, dan Efek-Efek Sampingnya. Edisi Keenam.Jakarta: PT. Elex Media Komputindo:663-665. USP Pharmacopoeia, (2007). The National Formulary. 30th Edition. United States: The United States Pharmacopeia Convention,Inc.:1906,2257. Watson,D.G.(2007). Analisis farmasi : BA untuk mahasiswa farmasi dan praktisi kimia farmasi. Jakarta: EGC : 314. Weston,A. and Brown,P.R.(1997).HPLC and CE Principles and Practice. California: Academic Press:216. Wibisono. Y (2005). Metode Statistik. Jogjakarta:Gajah Mada University Press: 449-454. Windholz,M.,Budavari,S.,Blumetti,R.F. and Otterbein,S.E.(1983).The Merck Index An Encyclopedia of Chemicals,Drugs,and Biologicals.Volume 1.New Jersey:Merck & Co.,Inc.:1170.


World Health Organization, (1992). Validation of Analitical Prosedur used an the Examination of Pharmaceutical. Sweetzerland.:117-118.


Lampiran 1. Gambar alat KCKT dan syringe 100 µl

Gambar 15. Alat KCKT (Shimadzu)

Gambar 16. Syringe 100 µl (SGE)


Lampiran 2. Gambar Sonifikator (Branson 1510) dan Penyaring

Gambar 17. Sonifikator (Branson 1510)

Gambar Penyaring

Gambar 18. Pompa Vakum (Gast DO A-PG04-BN) dan alat penyaring fase gerak.


Lampiran 3.

Kromatogram hasil penyuntikan larutan guaifenesin BPFI dan dekstrometorfan HBr BPFI dengan berbagai konsentrasi.

a. Konsentrasi guaifenesin BPFI 100 mcg/ml dan dekstrometorfan HBr BPFI 20 mcg/ml

b. Konsentrasi guaifenesin BPFI 400 mcg/ml dan dekstrometorfan HBr BPFI 60 mcg/ml


c. Konsentrasi guaifenesin BPFI 700 mcg/ml dan dekstrometorfan HBr BPFI 100 mcg/ml

d. Konsentrasi guaifenesin BPFI 1000 mcg/ml dan dekstrometorfan HBr BPFI 140 mcg/ml


e. Konsentrasi guaifenesin BPFI 1300 mcg/ml dan dekstrometorfan HBr BPFI 180 mcg/ml

f. Konsentrasi guaifenesin BPFI 1600 mcg/ml dan dekstrometorfan HBr BPFI 220 mcg/ml


Lampiran 4. Perhitungan persamaan regresi dari kurva kalibrasi guaifenesin BPFI dan dekstrometorfan HBr BPFI yang diperoleh secara KCKT. a. Guaifenesin

No. 1 2 3 4 5 6 ∑ Ratarata

Konsentrasi (mcg/ml) X 100 400 700 1000 1300 1600 5100

850

Luas Puncak Y

XY

898519 89851900 3235807 1294322800 5599573 3919701100 7820573 7820573000 9950362 12935470000 12091676 19346681000 39596510 45406601000

X2

Y2

10000 807336030000 160000 10470444000000 490000 31355220000000 1000000 61161355000000 1690000 99009705000000 2560000 146208610000000 5910000 349012690000000

6599418,3330

Y=aX+b a=

(∑ xy ) − (∑ x )(∑ y ) / n (∑ x 2 ) − (∑ x )2 / n

a=

(45406601000) − (5100)(39596510) / 6 (5910000) − (5100)2 / 6

a=

4540660100 0 − 3365703300 0 5910000 − 4335000

a=

1174956800 0 1575000

a = 7460,0432

b=Y-aX b = 6599418,3330 – 7460,0432 (850) b = 6599418,3330 – 6341036,72000 b = 258381,6130


Sehingga diperoleh persamaan regresi Y = 7460,0432 X + 258381,6130 Untuk mencari hubungan kadar (X) dengan luas puncak (Y) digunakan pengujian koefisien kolerasi (r).

(∑ xy ) − (∑ x )(∑ y ) / n

r=

[(∑ x ) − (∑ x ) / n] [(∑ y ) − (∑ y ) / n] 2

2

2

2

(4540660100 0 ) − (5100 )(39596510 ) / 6

r=

[((5910000 ) − (5100 ) / 6)] [(3490126900 00000 ) − (39596510 ) / 6] 2

45406601000 − 33657033000

r=

(5910000 − 4335000 )(349012690000000 − 261313930000000 ) 11749568000

r=

r=

2

(1575000)(87698760000000) 1174956800 0 1175268200 0

r = 0,999735039

b. Dekstrometorfan HBr

No 1 2 3 4 5 6 ∑ Ratarata


Luas Puncak Y 92032 254114 410434 588775 735410 893780 2974545

120

495757,5

XY

X2

1840640 400 15246840 3600 41043400 10000 82428500 19600 132373800 32400 196631600 48400 469564780 114400

Y2 8469889024 64573925000 168456060000 346656000000 540827860000 798842680000 1927826400000

Y=aX+b


a=

(∑ xy ) − (∑ x )(∑ y ) / n (∑ x 2 ) − (∑ x )2 / n

a=

(469564780) − (720)(2974545) / 6 (114400) − (720)2 / 6

a=

469564780 − 35694480 114400 − 86400

a=

112619380 28000

a = 4022,1207

b=Y-aX b = 495757,5 – 4022,1207 (120) b = 495757,5000 – 482654,4840 b = 13103,016 Sehingga diperoleh persamaan regresi Y = 4022,1207 X + 13102,016 Untuk mencari hubungan kadar (X) dengan luas puncak (Y) digunakan pengujian koefisien kolerasi (r) r=

(∑ xy ) − (∑ x )(∑ y ) / n

[(∑ x ) − (∑ x ) / n] [(∑ y ) − (∑ y ) / n] 2

2

r=

2

2

(469564780 ) − (720 )(2974545 ) / 6

[((114400 ) − (720) / 6)] [(1927826400 00) − (2974545 ) / 6] 2

r=

r=

r=

2

469564780 − 356945400

(114400 − 86400 )(192782640000 − 147465290000 ) 112619380

(28000)(453173500000) 112619380 112644831,2

= 0,999774058


Lampiran 5. Contoh perhitungan konsentrasi guaifenesin dan dekstrometorfan HBr yang ditambahkan pada uji perolehan kembali

a. Guaifenesin Baku guaifenesin yang ditambahkan = 30 mg Konsentrasi guaifenesin yang ditambahkan =

30mg = 0,6 mg/ml = 600 mcg/ml 50ml

b. Dekstrometorfan HBr Ditimbang 25 mg baku dekstrometorfan HBr dan dilarutkan dengan fase gerak dalam labu tentukur 50 ml ( larutan baku I). Konsentrasi larutan baku I =

25mg = 0,5 mg/ml = 500 mcg/ml 50ml

Dipipet 6,5 ml larutan baku I, dimasukkan ke dalam labu tentukur 50 ml yang telah berisi 3 ml sirup Dextrofort dan dilarutkan dengan fase gerak sampai garis tanda. Konsentrasi dekstrometorfan HBr yang ditambahkan =

6,5ml × 500mcg / ml 50ml

= 65 mcg/ml


Lampiran 6.

Kromatogram hasil persen perolehan kembali dari Sirup Dextrofort (PT. Rocella Pembangunan Indonesia)

a

b


c

d


e

f a, b,c,d,e,f, dan g berturut-turut merupakan kromatogram hasil penyuntikan 6 kali dari % perolehan kembali guaifenesin dan dekstrometorfan HBr pada sirup Dextrofort (PT. Pembangunan Rocella Laboratories) yang dianalisa secara KCKT pada λ 280 nm, kolom VP-ODS (4,6 mm x 250 mm), fase gerak metanol : air : buffer ammonium format (55 : 44:1) laju alir 1,5 ml/menit, sensitivitas 1,000 AUFS.


Lampiran 7.

Data hasil persen perolehan kembali guaifenesin dan dekstrometorfan HBr pada sirup Dextrofort (PT. Pembangunan Rocella Laboratories) dengan metode penambahan baku (Standard addition Method)

a. Guaifenesin Persen perolehan

Konsentrasi No

Luas puncak

Setelah Sebelum Analit yang penambahan penambahan ditambahkan analit analit (C) (A) (B) mcg/ml mcg/ml mcg/ml

1 615,0203 9355598 1219,4589 2 615,0203 9342024 1217,6394 3 615,0203 9346956 1218,3005 4 615,0203 9365297 1220,7591 5 615,0203 9386920 1223,6576 6 1219,9824 615,0203 9359503 Kadar rata – rata (%) Standar Deviasi (SD) Relatif Standar Deviasi (RSD) (%)

600 600 600 600 600 600

(A-B) X 100% C

100,7398 100,4365 100,5467 100,9565 101,4396 100,8270 100,8243 0,3550 0,3521


Persen perolehan

Konsentrasi No

Luas puncak

Setelah Sebelum penambahan penambahan analit analit (A) (B) mcg/ml mcg/ml

1 115,3970 741639 181,1326 115,3970 2 741115 181,0023 115,3970 3 740768 180,9160 115,3970 4 740020 180,9787 115,3970 5 741020 180,9787 115,3970 6 742167 181,2638 Kadar rata – rata (%) Standar Deviasi (SD) Relatif Standar Deviasi (RSD) (%)


(A-B) X 100% C

65 65 65 65 65 65

101,1317 100,9312 100,7985 100,5123 100,8949 101,3335 100,9337 0,2816 0,2790


Lampiran 8.

Analisa data statistik persen perolehan kembali guaifenesin dan dekstrometorfan HBr pada Sirup Dextrofort ( PT. Pembangunan Rocella Laboratories)

a. Guaifenesin Kadar (%) X 100,7398 100,4365 100,5467 100,9565 101,4396 100,8270 ∑ = 604,9461

X−X -0,0845 -0,3878 -0,2776 0,1295 0,6153 0,0027

( X - X )2 0,00714025 0,15038884 0,07706176 0,01677025 0,37859409 0,00000729

∑ = 0,62996248 X = 100,8243

SD =

∑( X − X ) 2 n −1

=

0,62996248 5

=

0,3550

Relatif Standar Deviasi (RSD) RSD =

= =

SD x 100% X

0,3550 x 100 % 100 ,8243 0,3521 %


b. Dekstrometorfan HBr Kadar (%) X 101,1317 100,9312 100,7985 100,5123 100,8949 101,3335 ∑ = 605,6021

X−X 0,1980 0,0025 0,1352 0,4214 0,0388 0,3998

( X - X )2 0,039204 0,00000625 0,01827904 0,17757796 0,00150544 0,15984004

∑ = 0,39641273 X = 100,9337

SD =

∑( X − X ) 2 n −1

=

0,39641273 5

=

0,2816

Relatif Standar Deviasi (RSD) RSD =

= =

SD X 100% X

0,2816 X 100 % 100 ,9337 0,2790 %


Lampiran 9. Contoh perhitungan batas deteksi (LOD) dan batas kuantitasi (LOQ) a.

Guaifenesin Persamaan garis regresi guaifenesin : Y = 7460,0432 X + 258381,6130



Luas Puncak Y 898519 3235807 5599573 7820573 9950362 12091676

Yi 1004385,933 3242398,893 5480411,853 7718424,813 9956437,773 12194450,73

(Y – Yi)2 11207807000 4345053,32 14199378000 10434252000 36915017,55 10562645000

∑ =46484451000

850

∑(Y − Yi) 2 n−2

SY =

46484451000 4

=

= 107801,2651 LOD =

=

3,3 × SY Slope 3,3 × 107801,2651 7460,0432

= 47,6866 mcg/ml LOQ =

=

10 × SY Slope 10 × 107801,2651 7460 ,0432

= 144,5049 mcg/ml


b.

Dekstrometorfan HBr

Persamaan garis regresi dekstrometorfan HBr : Y = 4022,1207 X + 13102,0160



Luas Puncak Y 92032 254114 410434 588775 735410 893780

Yi 93544,430 254429,258 415314,086 576198,914 737083,742 897968,570

(Y – Yi)2 22874444,505 99387,60656 23815239,37 158157939,1 2801412,283 17544118,64

∑ = 204705541,5

120

∑(Y − Yi) 2 n−2

SY =

204705541,5 4

=

= 7153,7672

LOD =

=

3,3 × SY Slope 3,3 × 7153,7672 4022,1207

= 5,8694 mcg/ml LOQ =

=

10 × SY Slope 10 × 7153,7672 4022 ,1207

= 17,7860 mcg/ml


Lampiran 10.

Kromatogram dari larutan Sirup Dextrosin (PT. Otto Pharmaceutical Industries)

a

b


c

d


e

f a, b, c, d, e, dan f berturut-turut kromatogram hasil penyuntikan 6 kali dari larutan Sirup Dextrosin (PT. Otto Pharmaceutical Industries) dengan konsentrasi guaifenesin 600 mcg/ml dan dekstrometorfan HBr 180 mcg/ml, yang dianalisa secara KCKT pada λ 280 nm, kolom VP-ODS (4,6 mm x 250 mm), fase gerak metanol : air : buffer ammonium format (55 : 44 : 1) laju alir 1,5 ml/menit, sensitifitas 1,000 AUFS. 68 Lisa Bella : Optimasi Fase Gerak Dan Laju Alir Pada Penetapan Kadar Campuran Guaifenesin Dan Dekstrometorfan HBr Dalam Sirup Dengan Metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT), 2010.

Lampiran 11. Analisa data statistik untuk mencari kadar guaifenesin dan dekstrometorfan HBr sebenarnya dari penyuntikan larutan Sirup Dextrosin (PT. Otto Pharmaceutical Industries) secara KCKT a. Guaifenesin Kadar (%) X 92,0942 92,8505 94,3910 94,9314 98,7957 93,0724 566,1352


X−X

( X - X )2

-2,2617 -1,5054 0,0351 0,5755 4,4398 -1,2835

5,11528689 2,26622916 0,00123201 0,33120025 19,71182404 1,64737225

(

94,3559

SD =

∑( X − X ) 2 n −1

=

29,0731446 5

=

2,4113

)

2

∑ X − X = 29,0731446

Pada interval kepercayaan 99,5 % dengan nilai α = 0,005, dk = n -1 = 6 – 1 = 5 diperoleh t tabel = 4,0321 Dasar penerimaan data apabila - t t hitung = Data 1 2 3 4 5 6

tabel <

t hitung < t

tabel

X −X SD / n

t hitung -2,2975 -1,5292 0,0357 0,5846 4,5101 -1,3038

t tabel -4,0321 -4,0321 4,0321 4,0321 4,0321 -4,0321

(Data 5 tidak diterima)


Jadi, kadar sebenarnya terletak antara: SD µ = X ± t (1−1 / 2α ).dk X n = 94,3559 ± 4,6041 X

2,4113 5

= 94,3559 ± 4,9649 89,3910 % < X < 99,3208 %

b. Dekstrometorfan HBr No 1 2 3 4 5 6 ∑ RataRata

SD =

Kadar (%) X 97,0582 95,3133 97,8470 99,0270 103,3332 97,0678 98,2744

( X - X )2

X−X

1,2162 2,9611 0,4274 0,7526 5,0588 1,2066

1,47914244 8,7681132 0,18267076 0,56640676 25,59145744 1,45588356

(

)

2

∑ X − X = 38,04367417

94,3559

∑( X − X ) 2 n −1

=

38,04367417 5

=

2,7584

Pada interval kepercayaan 99,5 % dengan nilai α = 0,005, dk = n -1 = 6 – 1 = 5 diperoleh t tabel = 4,0321 Dasar penerimaan data apabila -t

tabel <

t hitung < t

tabel


t hitung =

X −X SD / n

Data 1 2 3 4 5 6

t hitung 1,0800 2,6295 0,3795 0,6683 4,4923 1,0715

t tabel 4,0321 4,0321 4,0321 4,0321 4,0321 4,0321

(Data 5 tidak diterima)

Jadi, kadar sebenarnya terletak antara:

µ = X ± t (1−1 / 2α ).dk X

SD n

= 98,2744 ± 4,6041 X

2,7584 5

= 98,2744 ± 5,6796 92,5948 % < X < 103,9540 %


Lampiran 12. Kromatogram dari larutan Sirup Dextrofort (PT. Rocella Pembangunan Indonesia)

a

b


c

d


e

f a, b, c, d, e, dan f berturut-turut kromatogram hasil penyuntikan 6 kali dari larutan larutan Sirup Dextrofort (PT. Pembangunan Rocella Laboratories) pada konsentrasi guaifenesin 600 mcg/ml dan dekstrometorfan HBr 90 mcg/ml, yang dianalisa secara KCKT pada λ 280 nm, kolom VP-ODS (4,6 mm x 250 mm), fase gerak metanol : air : buffer ammonium format (55 : 44 : 1) laju alir 1,5 ml/menit, sensitifitas 1,000 AUFS.


Lampiran 13.

Analisa data statistik untuk mencari kadar guaifenesin dan dekstrometorfan HBr sebenarnya dari penyuntikan larutan sirup Dextrofort (PT. Pembangunan Rocella Laboratories) secara KCKT

a. Guaifenesin

Kadar (%) X 101,9469 102,6885 101,6470 102,5168 102,5168 103,0675 614,2821

No 1 2 3 4 5 6 ∑ RataRata

X−X

(X − X )

-0,4334 0,3082 -0,7333 0,1365 0,0351 0,6572

0,18783556 0,09498724 0,53772889 0,01863225 0,00123201 0,43191184

2

(

SD =

∑( X − X ) 2 n −1

=

1,27232779 5

)

2

∑ X − X = 1,27232779

102,3803

= 0,5044

Pada interval kepercayaan 99,5 % dengan nilai α = 0,005, dk = n – 1, 6 – 1= 5 diperoleh t tabel = 4,0321 Dasar penerimaan data apabila -t

t hitung =

tabel <

t hitung < t

tabel

X −X SD / n


Data 1 2 3 4 5 6

t hitung -2,1047 1,4967 -3,5611 0,6629 0,1704 3,1915

t tabel -4,0321 4,0321 -4,0321 4,0321 4,0321 4,0321

( Semua data diterima) Jadi, kadar sebenarnya terletak antara:

µ = X ± t (1−1 / 2α ).dk X

SD n

= 102,3803 ± 4,0321 X

0,5044 6

= 101,05 ± 0,8303 101,5500 % <X < 103,2106 %

b. Dekstrometorfan HBr Kadar (%) X 133,9162 128,2875 128,5099 123,8418 123,8635 128,5097 766,9286

No 1 2 3 4 5 6 ∑

RataRata

SD =

=

127,8214

X−X

(X − X )

6,0948 0,4661 0,6885 -3,9796 -3,9579 0,6883

37,14658704 0,21724921 0,47403225 15,83721616 15,66497241 0,47375689

2

(

)

2

∑ X − X = 69,81381396

∑( X − X ) 2 n −1 69,81381396 = 3,7367 5


Pada interval kepercayaan 99,5 % dengan nilai α = 0,005, dk = n – 1, 6 – 1= 5 diperoleh t tabel = 4,0321 Dasar penerimaan data apabila -t

t hitung =

tabel <

t hitung < t

tabel

X −X SD / n

Data 1 2 3 4 5 6

t hitung 3,9953 0,3055 0,4513 -2,6087 -2,5945 0,4512

t tabel 4,0321 4,0321 4,0321 -4,0321 -4,0321 4,0321

( Semua data diterima) Jadi, kadar sebenarnya terletak antara:

µ = X ± t (1−1 / 2α ).dk X

SD n

= 127,8214 ± 4,0321 X

3,7367 6

= 101,05 ± 6,1504 121,6710 % < X < 133,9718%


Lampiran 14. Kromatogram dari larutan Sirup Vicks Anak-Anak Formula 44 (PT. Darya-Varia Laboratoria )

a

b


c

d


e

f a, b, c, d, e, dan f berturut-turut kromatogram hasil penyuntikan 6 kali dari larutan Sirup Vicks Anak-Anak Formula 44 (PT. Darya-Varia Laboratoria) pada konsentrasi guaifenesin 600 mcg/ml dan dekstrometorfan HBr 42 mcg/ml, yang dianalisa secara KCKT pada λ 280 nm, kolom VP-ODS (4,6 mm x 250 mm), fase gerak metanol : air : buffer ammonium format (55 : 44 : 1) laju alir 1,5 ml/menit, sensitifitas 1,000 AUFS.


Lampiran 15.

Analisa data statistik untuk mencari kadar guaifenesin dan dekstrometorfan HBr sebenarnya dari penyuntikan larutan Vicks Anak-Anak Formula 44 (PT. Darya-Varia Laboratoria ) secara KCKT

a. Guaifenesin Kadar (%) X 85,4709 88,1842 88,7328 87.4968 85,5544 86,0840 521,5231


X−X

(X − X )

-1,4496 1,2637 1,8123 0,5763 -1,3661 0,8365

2,10134016 1,59693769 3,28443129 0,33212169 1,86622921 0,69973225

2

(

SD =

∑( X − X ) 2 n −1

=

9,88079229 5

)

2

∑ X − X = 9,88079229

86,9205

= 1,4058 Pada interval kepercayaan 99,5 % dengan nilai α = 0,005, dk = n – 1, 6 – 1= 5 diperoleh t tabel = 4,0321 Dasar penerimaan data apabila -t t hitung = Data 1 2 3 4 5 6

tabel <

t hitung < t

tabel

X −X SD / n

t hitung -2,5258 2,2019 3,1578 1,0041 -2,3803 1,4575

t tabel -4,0321 4,0321 4,0321 4,0321 -4,0321 4,0321

( Semua data diterima) Jadi, kadar sebenarnya terletak antara: 81 Lisa Bella : Optimasi Fase Gerak Dan Laju Alir Pada Penetapan Kadar Campuran Guaifenesin Dan Dekstrometorfan HBr Dalam Sirup Dengan Metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT), 2010.

µ = X ± t (1−1 / 2α ).dk X

SD n

= 86,9205 ± 4,0321 X

1,4058 6

= 86,9205 ± 2,3141 84,6064 % <X < 89,2346 %

b. Dekstrometorfan HBr Kadar (%) X 118,3522 129,8166 128,8389 123,2356 125,5902 127,2360 753,0695


SD =

=

X−X

(X − X )

-7,1594 4,305 3,3273 -2,2760 0,0786 1,7244

51,25700836 18,533025 11,07092529 5,180176 0,00617796 2,97355536

2

(

)

2

∑ X − X = 89,02086797

125,5116

∑( X − X ) 2 n −1 89,02086797 5

= 4,2195 Pada interval kepercayaan 99,5 % dengan nilai α = 0,005, dk = n – 1, 6 – 1= 5 diperoleh t tabel = 4,0321 Dasar penerimaan data apabila -t t hitung =

Data

tabel <

t hitung < t

tabel

X −X SD / n

t hitung

t tabel


1 2 3 4 5 6

-4,1561 2,4991 1,9316 -1,3212 0,0456 1,0010

-4,0321 4,0321 4,0321 -4,0321 4,0321 4,0321

( Data 1 tidak diterima) Jadi, kadar sebenarnya terletak antara:

µ = X ± t (1−1 / 2α ).dk X

SD n

= 125,5116 ± 4,6041 X

4,2195 5

= 125,5116 ± 8,6803 116,8236 % <X < 134,1996 %

Lampiran 16. Rekapitulasi hasil pengolahan data guaifenesin dekstrometorfan HBr dari sediaan sirup (sampel)

dan


a. Guaifenesin No.

1

Sampel


Perlakuan

Pemipetan (ml)

Luas puncak Guaifenesin

Konsentrasi teoritis (mcg/ml)

Konsentrasi perolehan (mcg/ml)

Kadar (%)

1

3,0

4827035

600

612,4165

101,9469

2

3,0

4860269

600

616,8714

102,6885

3

3,0

4813595

600

610,6149

101,6470

4

3,0

4852575

600

615,8400

102,5168

5

3,0

4848030

600

615,2308

102,4154

6

3,0

4877253

600

619,1481

103,0675

Kadar rata-rata (%)

102,3803

Standar deviasi (SD)

0,5044

Kadar sebenarnya

2

Sirup Dextrosin (PT. Otto Pharmaceutical Industries)

102,3803 ± 0,8303

1

3,0

4385494

600

553,2290

92,0942

2

3,0

4419389

600

557,7726

92,8505

3

3,0

4488422

600

567,0262

94,3910

4

3,0

4512642

600

570,2729

94,9314

5

3,0

4685815

600

593,4863

98,7957

6

3,0

4429333

600

559,1055

93,0724

Kadar rata-rata (%)

94,3559


2,4113

Kadar sebenarnya

3

Sirup Vicks Anak-Anak Formula 44 (PT. DaryaVaria Laboratoria)

94,3559 ± 4,9649

1

3,0

4210273

600

529,7411

88,1842

2

3,0

4092422

600

513,9434

85,5544

3

3,0

4116151

600

517,1243

86,0840

4

3,0

4234856

600

533,0364

88,7328

5

3,0

4088679

600

513,4417

85,4709

6

3,0

4179466

600

525,6115

87,4968

Kadar rata-rata (%)

86,9205


1,4058

Kadar sebenarnya

86,9205 ± 2,3141



No.

1

Sampel


Perlakuan

Pemipetan (ml)

Luas puncak Dekstrometorfan HBr

Konsentrasi teoritis (mcg/ml)

Konsentrasi perolehan (mcg/ml)

Kadar (%)

1

3,0

499374

90

120,8994

133,9162

2

3,0

478935

90

115,8178

128,2875

3

3,0

479743

90

116,0186

128,5099

4

3,0

462792

90

111,8042

123,8418

5

3,0

462871

90

111,8238

123,8635

6

3,0

479743

90

116,0184

128,5097

Kadar rata-rata (%)

127,8214


3,7367

Kadar sebenarnya

2

Siruo Dextrosin (PT. Otto Pharmaceutical Industries)

127,8214 ± 6,1504

1

3,0

717971

180

175,2481

97,0582

2

3,0

705299

180

172,0975

95,3133

3

3,0

723699

180

176,6722

97,8470

4

3,0

732269

180

178,8029

99,0270

5

3,0

763542

180

186,5782

103,3332

6

3,0

718042

180

175,2657

97,0678

Kadar rata-rata (%)

98,2744


2,7584

Kadar sebenarnya

3

Sirup Vicks Anak Formula (PT. DaryaVaria Laboratoria)

98,2744 ± 5,6796

1

3,0

233082

42

54,6925

129,8166

2

3,0

225920

42

52,9119

125,5902

3

3,0

228709

42

53,6053

127,2360

4

3,0

231425

42

54,2806

128,8389

5

3,0

213655

42

49,8625

118,3522

6

3,0

221930

42

51,9199

123,2356

Kadar rata-rata (%)

125,5116


4,2195

Kadar sebenarnya

125,5116 ± 8,6880

Lampiran 17. Contoh perhitungan kadar guaifenesin dan dekstrometorfan HBr pada sirup Dextrofort 85 Lisa Bella : Optimasi Fase Gerak Dan Laju Alir Pada Penetapan Kadar Campuran Guaifenesin Dan Dekstrometorfan HBr Dalam Sirup Dengan Metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT), 2010.

Diketahui: Tiap 5 ml sirup mengandung : Dekstrometorfan HBr

7,5 mg

Guaifenesin

50 mg

Dibuat larutan uji dengan kadar guaifenesin lebih kurang 600 mcg/ml dan kadar dekstrometorfan HBr lebih kurang 90 mcg/ml. Tiap 1 ml sirup mengandung : Guaifenesin =

50mg 10mg = = 10000 mcg/ml 5ml ml

Dekstrometorfan HBr =

7,5mg 1,5mg = = 1500 mcg/ml 5ml ml

Dipipet sirup sebanyak 3 ml, dimasukkan dalam labu tentukur 50 ml lalu dilarutkan dalam pelarut campur dan dicukupkan sampai garis tanda, maka konsentrasi larutan uji adalah : Konsentrasi guaifenesin teoritis

=

3ml × 10000mcg / ml 50ml

= 600 mcg/ml Konsentrasi dekstrometorfan HBr teoritis =

3ml × 1500mcg / ml 50ml

= 90 mcg/ml

a. Guaifenesin Persamaan garis regresi : Y = 7460,0432 X + 258381,6130 Luas puncak data 1 (Y) = 4827035 X=

4827035 − 258381,6130 7460,0432


X=

4568653,387 7460,0432

X = 612,4165 mcg/ml Kadar guaifenesin =

612,4165 x99,88% = 101,9469% 600

b. Dekstrometorfan HBr Persamaan garis regresi : Y = 4022,1207 X + 13102,0160

Luas puncak data 1 (Y) = 499374 X=

499374 − 13102,0160 4022,1207

X=

486271,984 4022,1207

X = 120,8994 mcg/ml Kadar dekstrometorfan HBr =

Lampiran

18.

120,8994 x99,69% = 133,9162% 90

Contoh perhitungan dekstrometorfan HBr

kadar

perolehan

guaifenesin

dan

a. Guaifenesin 87 Lisa Bella : Optimasi Fase Gerak Dan Laju Alir Pada Penetapan Kadar Campuran Guaifenesin Dan Dekstrometorfan HBr Dalam Sirup Dengan Metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT), 2010.

Perhitungan kadar perolehan guaifenesin Persamaan garis regresi : Y = 7460,0432 X + 258381,6130


9355598 − 258381,6130 7460,0432

X=

9097216,387 7460,0432

X = 1219,4589 Menurut Harmita (2004), perolehan kembali dapat dihitung dengan rumus sebagai berikut : % Perolehan kembali =

CF − C A x 100 C *A

Keterangan :CF = konsentrasi sampel yang diperoleh setelah penambahan larutan baku CA = konsentrasi sampel sebelum penambahan larutan baku C∗A = konsentrasi larutan baku yang ditambahkan

% Perolehan guaifenesin =

1219 ,4589 − 615,0203 X 100 % 600

= 100,7398 %

b. Dekstrometorfan HBr Perhitungan kadar perolehan dekstrometorfan HBr Persamaan garis regresi : Y = 4022,1207 X + 13102,0160 88 Lisa Bella : Optimasi Fase Gerak Dan Laju Alir Pada Penetapan Kadar Campuran Guaifenesin Dan Dekstrometorfan HBr Dalam Sirup Dengan Metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT), 2010.


741639 − 13102,0160 4022,1207

X=

28536,984 4022,1207

X = 181,1326

% Perolehan dekstrometorfan HBr =

181,1326 − 115,3970 X 100 % 65

= 101,1317 %

Lampiran 19. Daftar spesifikasi sampel

1. Sirup Dextrofort 60 ml Komposisi

: tiap 5 ml sirup mengandung 89


Guaifenesin

50 mg

Dekstrometorfan HBr

7,5 mg

Alkohol

2%

No. Batch

: 8C 018

Produsen

: PT. Rocella Pembangunan Indonesia

No. Pendaftaran : D 7812086 Tgl. Kadaluwarsa : 02 Maret 2012

2. Sirup Dextrosin 60 ml Komposisi

: tiap 5 ml sirup mengandung Guaifenesin

50

mg

Dekstrometorfan HBr

15

mg

Fenilpropanolamin HCl

12,5 mg

Difenhidramin HCl

5

mg

No. Batch

: 8H 2334

Produsen

: PT. Otto Pharmaceutical Industries

No. Pendaftaran : DTL 7218804037 A1 Tgl. Kadaluwarsa : Agustus 2011

3. Sirup Vicks Anak-Anak Formula 44 Komposisi

60 ml

: tiap 5 ml sirup mengandung Guaifenesin

50 mg

Dekstrometorfan HBr

3,5 mg

No. Batch

: 9011P2H1

Produsen

: PT. Darya-Varia Laboratoria

No. Pendaftaran : DTL 0704519837 A1 Tgl. Kadaluwarsa : 10 Januari 2011

Lampiran 20. Sertifikat pengujian guaifenesin BPFI


Lampiran 21. Sertifikat pengujian dekstrometorfan HBr BPFI


Lampiran 22. Sertifikat pengujian baku guaifenesin



Lampiran 23. Sertifikat pengujian baku dekstrometorfan HBr



Lampiran 24. Daftar Nilai Distribusi t

ii Lisa Bella : Optimasi Fase Gerak Dan Laju Alir Pada Penetapan Kadar Campuran Guaifenesin Dan Dekstrometorfan HBr Dalam Sirup Dengan Metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT), 2010.

iii Lisa Bella : Optimasi Fase Gerak Dan Laju Alir Pada Penetapan Kadar Campuran Guaifenesin Dan Dekstrometorfan HBr Dalam Sirup Dengan Metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT), 2010.

FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SUMATERA UTARA MEDAN 2009

Recommend Documents