Faculteit Bio-ingenieurswetenschappen. Academiejaar De antimicrobiële werking van essentiële oliën in marinades voor de vleesindustrie

Faculteit Bio-ingenieurswetenschappen Academiejaar 2014 – 2015

De antimicrobiële werking van essentiële oliën in marinades voor de vleesindustrie

Jens Beernaert Promotor: prof. dr. MSc. ing. Imca Sampers Tutor: dr. ing. Sam Van Haute

Masterproef voorgedragen tot het behalen van de graad van Master in de industriële wetenschappen: biochemie

Auteursrecht De auteur, de promotoren en de tutor geven de toelating deze masterproef voor consultatie beschikbaar te stellen en delen ervan te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met de verplichting uitdrukkelijk de bron te vermelden bij het aanhalen van resultaten uit deze masterproef.

Kortrijk, juni 2015

De auteur, Jens Beernaert

De promotor,

De tutor,

prof. dr. MSc. ing. Imca Sampers

dr. ing. Sam Van Haute

pag. I

Woord vooraf Graag zou ik een woord van dank richten tot allen die bijgedragen hebben tot de realisatie van deze masterproef. In eerste plaats wil ik mijn begeleiders prof. dr. MSc. ing. Sampers en dr. ing. Van Haute bedanken voor het aanbieden van dit uniek onderwerp en de aangeboden begeleiding tijdens de realisatie van deze masterproef. Dankzij dit onderwerp heb ik veel bijgeleerd omtrent de onderzoekswereld. De docenten van de opleiding industriële wetenschappen wil ik eveneens bedanken, zij hebben mij de nodige kennis en ervaring verschaft opdat de realisatie van deze masterproef mogelijk werd. Speciale dank gaat uit naar mijn ouders en vriendin, want zij gaven mij de kans om deze studierichting te kunnen aanvangen en verleenden steun tijdens deze studies. Naast al deze mensen wil ik ook nog mijn medestudenten bedanken die mij een aangename studietijd bezorgd hebben en waarmee ik vele leuke momenten heb doorgebracht tijdens mijn opleiding. In het bijzonder wil ik Zahra De Vos en Annatachja De Grande bedanken voor de aangename sfeer en de onvergetelijke momenten tijdens de realisatie van het praktisch werk van deze masterproef.

Aan al deze mensen, dank U.

pag. II

Inhoudsopgave Auteursrecht ...................................................................................................................... I Woord vooraf .................................................................................................................... II Inhoudsopgave .................................................................................................................III Lijst met symbolen en afkortingen ..................................................................................... V Lijst van figuren en tabellen .............................................................................................. V Samenvatting ................................................................................................................... VI Abstract .......................................................................................................................... VII Inleiding ............................................................................................................................ 1 1.

Microbieel bederf van vlees en vis ............................................................................. 2 1.1

Vlees- en visbedervende micro-organismen ....................................................... 4

1.2

Invloed van de intrinsieke en extrinsieke factoren op het microbieel bederf ........ 5

1.3

Invloed van menselijke manipulaties op het microbieel bederf ............................ 7

1.3.1

Beïnvloeding van de aw-waarde ................................................................... 7

1.3.2

Beïnvloeding van de pH ............................................................................... 9

1.3.3

Beïnvloeding van redoxpotentiaal ...............................................................11

1.3.4

Toevoeging van natuurlijke antimicrobiëlen ................................................12

1.3.5

Roken van voedingsmiddelen .....................................................................13

1.3.6

Verpakkingen met aangepaste atmosfeer...................................................13

1.3.7

Bestraling ...................................................................................................15

2.

Marinades .................................................................................................................17

3.

Essentiële oliën.........................................................................................................17

4.

Materialen en methoden ...........................................................................................21

5.

4.1

Doel ...................................................................................................................21

4.2

Materiaal ............................................................................................................21

4.3

Methoden ..........................................................................................................22

4.3.1

Behandelen met EOn / Marinade ................................................................22

4.3.2

Microbiële enumeratie ................................................................................24

4.3.3

Statistische analyse ....................................................................................25

Resultaten en discussie ............................................................................................26 5.1

De matrix kippenvlees .......................................................................................26

5.1.1

Microbiologische parameters ......................................................................26

5.1.2

Kleur- en geurveranderingen tijdens de behandeling ..................................27

5.2

De matrix kippenvel ...........................................................................................29

5.2.1

Microbiologische parameters ......................................................................29

pag. III

5.2.2 5.3

Kleur- en geurveranderingen tijdens de behandeling ................................. 31

De matrix kippengehakt..................................................................................... 31

5.3.1

Microbiologische parameters...................................................................... 31

5.3.2

Kleur- en geurveranderingen tijdens de behandeling ................................. 33

5.4

Discussie........................................................................................................... 35

6.

Besluit ...................................................................................................................... 37

7.

Literatuurlijst ............................................................................................................. 39

8.

Bijlagen .................................................................................................................... 44 8.1

De matrix kippenvlees ....................................................................................... 44

8.2

De matrix kippenvel ........................................................................................... 46

8.3

De matrix kippengehakt..................................................................................... 48

pag. IV

Lijst met symbolen en afkortingen

aw-waarde EOn KVE MAP MO RBC

wateractiviteit essentiële oliën Kolonie Vormende Eenheid verpakking onder gemodificeerde atmosfeer micro - organismen Rose – Bengal Chloramphenicol agar base

Lijst van figuren en tabellen figuur 1.1: Interactie tussen zwak zuur (azijnzuur) en MO (Beales, 2004) ........................10 figuur 4.1: Methode voor staalname bij kipfilet, links foutieve staalname met een klein contactoppervlak, rechts correcte staalname met groot contactoppervlak........................23 figuur 4.2: Kippenvel ........................................................................................................23 figuur 5.1: Kleurverschil na behandeling met een EOn emulsie ( links: situatie voor behandeling, rechts: situatie na behandeling) ..................................................................28 figuur 5.2: Emulsies van het commercieel product ...........................................................29 figuur 5.3: Verkleuring bij de matrix kippengehakt ( links: situatie zonder kleuring op dag 0, rechts: situatie met geel/groen verkleuring aan de rand op dag 6) ...................................34 figuur 5.4: Oproming van de 10% olie-in-water marinade emulsies na een stockageperiode van 3 uur ( van links naar rechts de EOn kaneel, tijm en orgeano) .......36 figuur 8.1: gemiddelde reductie van totaal aantal coliformen op kippenvlees ...................44 figuur 8.2: gemiddelde reductie van E.coli op kippenvlees ...............................................44 figuur 8.3: gemiddelde reductie van melkzuurbacteriën op kippenvlees ...........................45 figuur 8.4: gemiddelde reductie van gisten en schimmels op kippenvlees ........................45 figuur 8.5: gemiddelde reductie van totaal aantal coliformen op kippenvel .......................46 figuur 8.6: gemiddelde reductie van E.coli op kippenvel ...................................................46 figuur 8.7: gemiddelde reductie van melkzuurbacteriën op kippenvel...............................47 figuur 8.8: gemiddelde reductie van gisten en schimmels op kippenvel ...........................47 figuur 8.9: gemiddelde reductie van totaal aantal coliformen op kippengehakt .................48 figuur 8.10: gemiddelde reductie van E.coli op kippengehakt ...........................................48 figuur 8.11: gemiddelde reductie van melkzuurbacteriën op kippengehakt.......................49 figuur 8.12: gemiddelde reductie van gisten en schimmels op kippengehakt ...................49

tabel 3.1: Het effect van gebruikte marinade - oplossingen op micro-organismen ............18 tabel 3.2 : Antimicrobiële activiteit van EO in verschillende voedingsmiddelen.................19 tabel 4.1: Semi-kwantitatieve subjectieve beoordelingsmanier van de resterende EOn geur op de behandelde stalen..........................................................................................23 tabel 5.1: Semi-kwantitatieve evaluatie EOn geur op de behandelde kippenvleesstalen ..28 tabel 5.2: Semi-kwantitatieve evaluatie EOn geur op de behandelde kippenvelstalen .....31 tabel 5.3: Semi-kwantitatieve evaluatie EOn geur op de behandelde kippengehaktstalen33

pag. V

Samenvatting Er is verhoogde interesse in voedingsmiddelen waarin chemische producten gereduceerd of vervangen worden. Verschillende van deze chemische producten worden als conserveringsmiddel gebruikt om de kwaliteit en de veiligheid van het voedingsmiddel gedurende de houdbaarheid van het product te garanderen. Essentiële oliën uit aromatische planten werden onderzocht als mogelijks alternatief voor de chemische producten. Dergelijke oliën bezitten antimicrobiële, antivirale en antifungale eigenschappen die aangewend kunnen worden om de groei van microflora op voedingsmiddelen te inhiberen. Voor voedingsmatrices met een verschillend vetgehalte op basis van kip, werd de antimicrobiële werking van de essentiële oliën Thymus zygis ct. Thymol, Cinnamomum zeylanicum en Origanum compactum onderzocht. De grootste reducties van de gemonitorde microflora werd bekomen met olie-in-water marinade emulsies. Afhankelijk van de voedingsmatrix: kippenvlees, kippenvel, kippengehakt, werd het totaal aantal coliformen na zes dagen behandeling met respectievelijk 1-2 log KVE/g, 2-3 log KVE/g en 4-5,5 log KVE/g gereduceerd. Deze significante reductie werd op de matrices kippenvel en kippengehakt enkel bekomen na een behandeling met 10% kaneel. Voor de matrix kippenvlees werd geen onderscheid waargenomen tussen de behandelingen waarin 10% aanwezig is van de gebruikte essentiële oliën. Het aantal melkzuurbacteriën werd met respectievelijk 0,5-2 log KVE/g, 1-2,8 log KVE/g en 2,5-3 log KVE/g gereduceerd na zes dagen behandeling. Deze significante reductie werd op de matrices kippenvlees en kippengehakt enkel bekomen na een respectievelijke behandeling met 10% tijm en 10% kaneel. Voor de matrix kippenvel werd geen onderscheid tussen de behandelingen waargenomen waarin 10% aanwezig is van de gebruikte essentiële oliën. De aanwezige gisten en schimmels werden met respectievelijk 0,5-2,5 log KVE/g, 1-1,5 log KVE/g en 2,5-3 log KVE/g gereduceerd na zes dagen behandeling. Op de matrix kippengehakt werd deze significante reductie enkel bekomen na een behandeling met 10% kaneel. Voor de matrices kippenvlees en kippenvel werd geen onderscheid waargenomen tussen de behandelingen waarin 10% aanwezig is van gebruikte essentiële oliën. Het aantal E.coli bacteriën werd met respectievelijk 0,4-0,7 log KVE/g, 1-1,5 log KVE/g en 0,5-1 log KVE/g gereduceerd na zes dagen behandeling. Op de matrix kippenvlees werd deze significante reductie enkel bekomen na een behandeling waarin 1% van de gebruikte essentiële oliën aanwezig is. De significante reductie op kippenvel werd enkel bekomen na behandelingen waarin 10% kaneel of 10% tijm aanwezig is en voor de matrix kippengehakt was dit enkel na een behandeling met 10% kaneel. Vooraleer de resultaten kunnen geïmplementeerd worden in de bedrijven dienen volgende elementen verder onderzocht te worden: het effect van andere conserveringstechnieken zoals gemodificeerde verpakkingen in combinatie met marinades op basis van essentiële oliën, het verbeteren van de stabilisatie van de gebruikte essentiële oliën emulsies en de invloed van de samenstelling van de voedingsmatrix op de werking van de EO.

pag. VI

Abstract There is an increased interest in food products wherein the chemicals are reduced or replaced. Several of those chemicals are used as anti-microbial agent and preservative agent in order to ensure the quality and safety of the food during his shelf-life. Essential oils of aromatic plants were examined as a potential alternative for the used chemicals. Such oils have natural antimicrobial, antiviral and antifungal properties. These properties can be used to inhibit the growth of bacterial micro-flora on different types of food. The antimicrobial properties of the essentials oils Thymus zygis ct. Thymol, Cinnamomum zeylanicum and Origanum compactum was investigated on different chicken matrices with a different fat content. The greatest reductions of de microflora were achieved by oil-inwater marinade emulsions. Dependent of the food matrix: chicken meat, chicken skin and minced chicken the total number of coliforms was respectively reduced with 1-2 log CFU/g, 2-3 log CFU/g and 4-5,5 log CFU/g after six days of treatment. This reduction was on chicken skin and minced chicken only obtained after a treatment with 10% cinnamon. For the matrix chicken meat, no distinction was observed between the treatments which contained 10% of the used essential oils. The number of lactic acid bacteria was respectively reduced with 0,5-2 log CFU/g, 1-2,8 log CFU/g and 2,5-3 log CFU/g after six days of treatment. The reduction on chicken meat and minced chicken was only obtained after a treatment which respectively 10% thyme and 10% cinnamon. On the matrix chicken skin there was no distinction observed between all treatments with contained 10% of the used essentials oils. The yeast and fungi were respectively reduced with 0,5-2,5 log CFU/g, 1-1,5 CFU/g and 2,5-3 log CFU/g after six days of treatment. On the matrix minced chicken the reduction was only obtained after a treatment with 10% cinnamon. For the matrices chicken meat and chicken skin there was no distinction observed between all treatments which contained 10% of the used essentials oils. The number of E.coli bacteria was respectively reduced wit 0,4-0,7 log CFU/g, 1-1,5 CFU/g and 0,5-1 log CFU/g after six days of treatment. The reduction on chicken meat was only obtained after a treatment with 1% of the used essentials oils. On chicken skin the reduction was only obtained after a treatment which contained 10% cinnamon of 10% thyme and for minced chicken the reduction was only obtained after a treatment with 10% cinnamon. Before these results can be implemented in the industry further investigation of the following elements is needed: the effect of other preservations techniques such as modified packaging in combination with marinades on basis of essential oils, the stabilization of the used essential oils emulsion and the influence of the composition of the food matrix on the used essential oils.

pag. VII

Inleiding Het langdurig bewaren van voedingsmiddelen vindt zijn oorsprong in het tijdperk van de jager, voedselverzamelaar. In deze periode werd vlees geroosterd of op ijs bewaard. Deze technieken waren de eerste aanzet tot het ontwikkelen van verschillende conserveringstechnieken. De conserveringstechnieken hadden als enig doel het verlengen van de houdbaarheid zodat periodes van hongersnood zoveel mogelijk overbrugd konden worden. Dankzij de evolutie van de mens werden andere technieken zoals het zouten van voedingsmiddelen, het fermenteren van voedingsmiddelen en toedienen van conserveermiddelen ontdekt. Chemische producten worden de laatste jaren meer en meer geweerd uit de voedingsmiddelen daar er recent heel wat inzichten verkregen worden over de mogelijke effecten op de gezondheid (Cleveland et al., 2001). De consument verkiest gezonde rauwe producten die minimaal bewerkt worden. Door deze eisen kunnen producenten geen extreme conserveringstechnieken meer gebruiken waarbij de aanwezige microflora wordt afgedood (Devlieghere & Noseda, 2010). Hierdoor is er nood aan een natuurlijke techniek waarbij de microbiële lading wordt gereduceerd of geïnhibeerd. Aan het laboratorium Voedingsmicrobiologie en Biotechnologie, Universiteit Gent Campus Kortrijk, wordt onderzoek verricht naar het gebruik van essentiële oliën (EOn) als antimicrobieel middel en de toepasbaarheid van deze middelen in de voedingsindustrie. TETRA-project nr. 130214 onderzoekt het gebruik van EOn in marinades voor verse vis- en vleesbereidingen. In deze thesis zal de invloed van de samenstelling van verse vis- en vleesbereidingen, alsook de invloed van de omgevingsparameters op de groei van micro-organismen (MO) besproken worden. De houdbaarheid van verse vis- en vleesbereidingen kan verlengd worden met behulp van verschillende conserveringstechnieken. In het praktisch gedeelte werden verschillende voedingsmatrices, op basis van kip, ondergedompeld in EOn emulsies. De onderdompeling in de EOn emulsies heeft als doel de aanwezige microflora te reduceren en de houdbaarheid van het vers vlees te verlengen. De emulsies werden bereid op basis van de EOn: Thymus zygis ct. Thymol, Cinnamomum zeylanicum en Origanum compactum. In eerste instantie werd er onderzoek verricht naar het reducerend effect van de EOn op zich, door gebruik te maken van waterige emulsies. In tweede instantie werd er onderzocht wat de impact was van verschillende antimicrobiële middelen, zuur, zout en EOn, op de aanwezige microflora. Tot slot worden de verkregen resultaten uit deze onderzoeken toegelicht en wordt de toepasbaarheid van deze techniek becommentarieerd rekening houdend met de aanwezige concentratie aan essentiële olie en de basis van de emulsie.

pag. 1

1. Microbieel bederf van vlees en vis Het bederf van een voedingsmiddel kan via vier verschillende mechanismen gebeuren: microbiële activiteit, chemische reacties, fysische veranderingen of enzymatische activiteit (Huis in't Veld, 1996; Vyncke, 1999; Gram & Dalgaard, 2002; Gram et al., 2002; Dijk & Grootenhuis, 2003; Modi, 2009; Ghaly et al., 2010). Het bederf kan veroorzaakt worden door één van deze mechanismen of door een combinatie van de verschillende mechanismen. Hierdoor moeten er dus verschillende parameters in rekening gebracht worden, indien het bederf van een voedingsmiddel gemodelleerd wordt. Elke eigenschap van een voedingsmiddel heeft de potentie om bij te dragen tot het microbieel bederf van het voedingsmiddel. Elk voedingsmiddel wordt gekarakteriseerd door zijn eigen, specifieke eigenschappen zoals de aanwezige natuurlijke microbiologische flora op het voedingsmiddel, de pH van het voedingsmiddel, de nutriëntensamenstelling van het voedingsmiddel, de fractie aan beschikbaar water in het voedingsmiddel (Huis in't Veld, 1996; Sivertsvik et al., 2002; Modi, 2009; Devlieghere & Noseda, 2010; Mills et al., 2014). Naast de producteigenschappen kunnen de aangebrachte veranderingen aan het voedingsmiddel, de gebruikte productieparameters, een accumulatie van componenten en de opslagomstandigheden tijdens de productie een bijdrage leveren tot het microbieel bederf van het voedingsmiddel (Borch et al., 1996; Gram & Dalgaard, 2002; Gram et al., 2002; Nychas et al., 2008; Doulgeraki et al., 2012). De producenten proberen in eerste instantie voldoende kennis te verzamelen omtrent de factoren die mogelijks tot microbieel bederf kunnen leiden (Nychas et al., 2008). Een producent zal proberen de wettelijke eisen van een voedingsmiddel te respecteren met behulp van bestaande wetenschappelijke wetmatigheden. Naast deze wetmatigheden dient er ook nog rekening gehouden te worden met de eisen van de consumenten (McLauchlin, 2007; Ghaly et al., 2010). In het verleden werden harde conserveringstechnieken, zoals sterilisatie en pasteurisatie, gekozen waarbij MO afgedood werden opdat het product microbiologisch veilig zou zijn. Deze producten vertonen weinig bederf door microbiële activiteit maar vertonen vaak sensorische afwijkingen ten opzichte van de rauwe grondstoffen en hebben een gereduceerde nutriënteninhoud. Vandaag verkiezen de consumenten echter producten die een verhoogde sensorische kwaliteit en nutritionele inhoud bezitten (Church, 1994; Modi, 2009; Jayasena & Jo, 2013). Om dit te verwezenlijken wordt er in de productie geswitcht naar zachtere conserveringstechnieken waarbij er bovendien zo weinig mogelijk additieven gebruikt worden. Dergelijke technieken doden de aanwezige microflora niet af maar onderdrukken de uitgroei van de aanwezige MO (Gram et al., 2002; Nychas et al., 2008; Devlieghere & Noseda, 2010; Mills et al., 2014).

pag. 2

De aanwezige microflora op een voedingsmiddel kunnen onderverdeeld worden in vijf grote klassen: bacteriën, gisten, schimmels, virussen en parasieten. Bij luchtdichte verpakte voedingsmiddelen zal het bederf door gisten en schimmels waarneembaar zijn door een bol staande verpakking. Het bederf door bacteriën is echter niet zo eenvoudig waarneembaar en bovendien beperkt het bederf zich niet tot één soort bacterie (Huis in't Veld, 1996; Dijk & Grootenhuis, 2003). In de meeste gevallen kunnen de bedervende MO verder opgedeeld worden in vijf belangrijke klassen: gramnegatieve staafvormige bacteriën, grampositieve spoorvormende bacteriën, melkzuurbacteriën, andere grampositieve bacteriën en gisten & schimmels (Huis in't Veld, 1996; Dijk & Grootenhuis, 2003; Modi, 2009). Belangrijk om op te merken is dat bedervende MO slechts een kleine fractie vormen van de natuurlijke aanwezige microflora op voedingsmiddelen. Tijdens het bederf van het voedingsmiddel zal de fractie aan bedervende MO echter toenemen en deze zullen de andere aanwezige microflora onderdrukken (Dijk & Grootenhuis, 2003; McLauchlin, 2007). Pseudomonas spp., Aeromonas, Photobacterium, Shewanella en Vibrio spp. zijn voorbeelden van gramnegatieve staafvormige bacteriën die voedselbederf veroorzaken. Binnen deze klasse zijn het voornamelijk de Pseudomonas spp. die het bederf veroorzaken. Deze bacteriën kunnen namelijk uitgroeien op waterrijke voedingsmiddelen die bij hun natuurlijke pH gestockeerd worden in een gekoelde omgeving. Voorbeelden van dergelijke voedingsmiddelen zijn rood vlees, vis, gevogelte, melk en zuivelproducten (Borch et al., 1996; Huis in't Veld, 1996; Gram et al., 2002; Modi, 2009). De groei van deze bacteriën wordt echter onderdrukt door de uitgroei van Enterobacteriaceae indien de voedingsmiddelen bewaard worden bij een temperatuur hoger dan 5 à 10 °C (Borch et al., 1996; Modi, 2009). Bacillus spp. en Clostridium spp. behoren tot de grampositieve spoorvormende bacteriën. Ook deze bacteriën zijn in staat om te groeien bij gekoelde omstandigheden maar hun groeisnelheid is lager dan deze van de gramnegatieve bacteriën. Bovendien zijn sommige van deze species in staat om toxinen te produceren die een bepaald gezondheidsrisico met zich meebrengen. Afhankelijk van de aanwezige bacteriën kan het bedorven voedingsmiddel braaktoxines, diarreetoxines of zelfs neurotoxines bevatten (Borch et al., 1996; Huis in't Veld, 1996; Dijk & Grootenhuis, 2003; Modi, 2009). Deze bacteriën kunnen teruggevonden worden in melk- en zuivelproducten, harde kazen en vacuüm verpakt vlees of vis (Huis in't Veld, 1996; Gram et al., 2002). De melkzuurbacteriën omvatten Lactobacillus, Streptococcus, Leuconostoc en Pediococcus spp.. Deze bacteriën zijn ook grampositief en voeren tijdens hun bederf een fermentatie uit van de aanwezige suikers. Het bederf van voedingsmiddelen zal gepaard gaan met CO2 productie waardoor er een pH daling bekomen wordt. De melkzuurbacteriën zijn meestal niet verantwoordelijk voor het bederf van verse voeding met hoge eiwitconcentraties, daar ze meestal onderdrukt worden door de andere aanwezige MO (Huis in't Veld, 1996; Gram et al., 2002).

pag. 3

Micrococcus spp. en Brochotrix thermosphacta behoren tot de klasse van de andere grampositieve bacteriën. Deze bacteriën zijn terug te vinden op vers vlees, gezouten vlees en in verse melk. Brochotrix thermosphacta zal voornamelijk de microflora gaan domineren indien verse vis of vlees gestockeerd wordt in verpakkingen met een gemodificeerde atmosfeer (MAP) of vacuümverpakkingen. Deze dominantie zal enkel plaats vinden in de verpakkingen, indien er geen strenge bewaarcondities aanwezig zijn (Borch et al., 1996; Huis in't Veld, 1996; Nychas et al., 2008; Devlieghere & Noseda, 2010). De belangrijkste eigenschap van gisten en schimmels is dat zij in staat zijn om diverse stoffen aan te wenden als voedingsbron zoals: pectines, carbohydraten, organische zuren, eiwitten en vetten (Huis in't Veld, 1996; Dijk & Grootenhuis, 2003). Bovendien is deze klasse aan bedervers relatief tolerant tegen lage pH, lage wateractiviteit (awwaarde), lage temperaturen en de aanwezigheid van additieven (Huis in't Veld, 1996; Dijk & Grootenhuis, 2003). Bepaalde bederf veroorzakende schimmels kunnen toxines produceren bijvoorbeeld Aspergillus flavus. De natuurlijke microflora is dus niet eenduidig te definiëren en hangt sterk af van het te bewaren of te verwerken voedingsmiddel (Borch et al., 1996; Huis in't Veld, 1996; Beales, 2004; Nychas et al., 2008; Devlieghere & Noseda, 2010; Mills et al., 2014).

1.1 Vlees- en visbedervende micro-organismen

Op visproducten kunnen voornamelijk de volgende bedervende MO teruggevonden worden: Pseudomonas, Vibrio, Micrococcus, Alcaligenes en Serratia volgens Ghaly et al. (2010), terwijl dit volgens Vyncke (1999) voornamelijk psychrotrofe bacteriën zijn zoals Shewanella, Pseudomonas, Moraxella en Acetinobacter. De natuurlijke flora voor visproducten is dus niet eenduidig te definiëren en hangt bovendien sterk af van de processen die onmiddellijk na de visvangst uitgevoerd werden. Niet-geconserveerde vis zal voornamelijk bedorven worden door gramnegatieve fermentatieve bacteriën zoals Vibrionaceae volgens Gram & Dalgaard (2002) en Ghaly et al. (2010), terwijl op ijs bewaarde visproducten voornamelijk door gramnegatieve psychrotolerante bacteriën zoals Pseudomonas spp. en Shewanella spp. bederven (Emborg et al., 2002; Gram & Dalgaard, 2002; Devlieghere & Noseda, 2010; Ghaly et al., 2010). Voor bewaring kunnen visproducten sterk gedroogd en droog-gezouten worden. Bederf van deze producten vindt voornamelijk plaats door de uitgroei van filamenteuze fungi (Gram & Dalgaard, 2002). Nat gepekelde visproducten zullen daarentegen bedorven worden door de uitgroei van verschillende gisten (Gram & Dalgaard, 2002).

pag. 4

Bij vleesproducten kan er ook geen algemene microflora gedefinieerd worden daar deze sterk afhankelijk is van het rauwe beginproduct en de eventuele uitgevoerde behandelingsstappen tijdens de verwerking van het vleesproduct. Op vers versneden vlees zal de bedervende flora voornamelijk bestaan uit: Pseudomonas, Acinetobacter, Brochotrix, Flavobacterium, Psychrobacter, Moraxella, Staphylococcus, Micrococcus, Enterobacteriaceae, melkzuurbacteriën, verschillende genera van Enterobacteriaceae en gisten en schimmels (Modi, 2009; Doulgeraki et al., 2012; Jayasena & Jo, 2013). Op gekoeld bewaard rund- en varkensvlees zullen er voornamelijk Brochotrix thermosphacta, Carnobacterium spp., Enterobacteriaceae, Lactobacillus spp., Leuconostoc spp., Pseudomonas spp. en Shewanella putrefaciens waargenomen worden (Borch et al., 1996; Modi, 2009). De aangebrachte conserveringstechniek zal een selectiedruk uitoefenen op de aanwezige microbiële flora. Hierdoor zal de aanwezige dominante microflora verschuiven volgens deze respectievelijke rangschikking: niet-fermentatieve psychrotrofe gram negatieve bacteriën
fermentatieve gram negatieve bacteriën
melkzuurbacteriën
gisten
filamenteuze fungi (Gram & Dalgaard, 2002; Gram et al., 2002). Hierdoor is het bederf van een voedingsmiddel een complexe zaak maar het is waarneembaar via verschillende parameters: verkleuringen van het voedingsmiddel, slijmafzettingen op het voedingsmiddel, productie van slechte geuren en gasproductie in de verpakkingen van het voedingsmiddel (Borch et al., 1996; Gram & Dalgaard, 2002; Gram et al., 2002; McLauchlin, 2007; Nychas et al., 2008; Modi, 2009). Bederf van voedingsmiddelen zal voorkomen kunnen worden door in te spelen op de eigenschappen van het voedingsmiddel ( intrinsieke factoren) of door in te spelen op de eigenschappen van de omgeving ( extrinsieke factoren) (Hobbs B.C., 1987; Borch et al., 1996; Huis in't Veld, 1996; Dijk & Grootenhuis, 2003; Beales, 2004; Burt, 2004; McLauchlin, 2007; Nychas et al., 2008; Modi, 2009; Devlieghere & Noseda, 2010; Ghaly et al., 2010; Doulgeraki et al., 2012; Mills et al., 2014).

1.2 Invloed van de intrinsieke en extrinsieke factoren op het microbieel bederf

De microbiologische groei op een voedingsmiddel wordt grotendeels bepaald door de eigenschappen van het voedingsmiddel zelf, ook wel intrinsieke factoren genoemd. Visproducten zijn vatbaar voor bederf daar ze een hoog watergehalte, laag gehalte aan bindweefsel en relatief hoge pH bezitten. Vette vissen bezitten bovendien een sterk onverzadigd lipidenkarakter wat het bederf bevordert (Huis in't Veld, 1996; Vyncke, 1999; Sivertsvik et al., 2002). Het watergehalte van een vis bedraagt gemiddeld gezien 81 % en in combinatie met de losse weefselstructuur van vissen zorgt dit voor een verhoogde wateractiviteit waardoor verschillende bacteriesoorten in staat zijn om bederf te veroorzaken (Vyncke, 1999; Dijk & Grootenhuis, 2003). Dankzij de losse structuur van het visweefsel is er bovendien voldoende zuurstof aanwezig waardoor aerobe bedervers aanwezig zijn in de natuurlijke microflora van visproducten. Een extra stimulans voor de microflora is de aanwezigheid van hoge concentraties aan niet-eiwitstikstof rijke verbindingen die een ideale

pag. 5

voedingsbodem vormen voor de aanwezige microflora (Vyncke, 1999). De natuurlijke pH van vissen bedraagt 7 à 7,5 waardoor zuuroplossingen geschikt zijn voor het bewaren van visproducten. Bovendien groeit de aanwezige natuurlijke microflora op vis bij pHwaarden die hoger zijn dan 6,0. Heilbot is het enige visproduct die een lagere pHwaarde kan bereiken waardoor deze vissoort idealer is voor bewaring (Vyncke, 1999; Sivertsvik et al., 2002). Naast de intrinsieke factoren zijn er ook nog omgevingsfactoren die de microflora beïnvloeden. De meeste visproducten worden bij lage temperaturen bewaard, daar deze lage temperaturen de groei van MO vertragen (Vyncke, 1999; Sivertsvik et al., 2002; Ghaly et al., 2010). Visproducten worden vaak bewaard in CO2verpakkingen of MAP verpakkingen waarin 40 – 50 % CO2 aanwezig is. Deze verpakkingen hebben als doel de inhibitie van de aanwezige aerobe bedervers. Visproducten worden in dergelijke verpakkingen vaak bedorven door melkzuurbacteriën en Photobacterium phosphoreum (Emborg et al., 2002; Gram & Dalgaard, 2002; Sivertsvik et al., 2002). Vleesproducten zijn net zoals visproducten vatbaar voor bederf daar ze een hoog watergehalte bezitten en een eerder neutrale pH. De structuur van vleesproducten is afhankelijk van de reeds uitgevoerde processen tijdens de verwerking. De structuur van vers versneden of vermalen vlees is sterk veranderd ten opzichte van de oorspronkelijke structuur en bovendien is deze versneden, vermalen structuur veel geschikter voor de uitgroei van micro-organismen. De reden hiervoor is het verkrijgen van een groter contactoppervlak en de vrijgave van verschillende inwendige producten die dienst kunnen doen als substraat voor de MO (Borch et al., 1996; Dijk & Grootenhuis, 2003; McLauchlin, 2007; Mills et al., 2014). De meeste vleesproducten bezitten een pH waarde van 5,4 à 5,8. Deze lage pH waarde wordt bekomen, doordat de bloedcirculatie en het transport van zuurstof stilvalt. Hierdoor kunnen enkel nog fermentatieve reacties plaats vinden waarbij melkzuur wordt geproduceerd. Deze intrinsieke factor wordt echter sterk beïnvloed door de gemaakte keuzes tijdens het slachtproces. De verwerkende vleesindustrie zal een optimalisatie van de parameters waterbindingscapaciteit en kleur laten primeren boven de regulatie van de pH (Borch et al., 1996; Doulgeraki et al., 2012). De vleesproducten die niet rauw verhandeld worden, ondergaan een verschillende behandeling waarbij de intrinsieke factoren gemanipuleerd worden. Hierbij wordt voornamelijk het zoutgehalte en de nitrietconcentratie gemanipuleerd (Borch et al., 1996; Modi, 2009). Naast deze intrinsieke factoren kunnen ook de extrinsieke factoren gemanipuleerd worden om het microbieel bederf te vertragen. Zoals eerder vermeld worden de meeste vleesproducten bewaard bij een verlaagde temperatuur zodat de groei van de aanwezige microflora vertraagd wordt. Bovendien worden de meeste gekookte en gezouten vleesproducten bewaard in een vacuümverpakking of MAP zodat de microflora gedomineerd wordt door de uitgroei van melkzuurbacteriën (Borch et al., 1996; McLauchlin, 2007; Devlieghere & Noseda, 2010; Doulgeraki et al., 2012; Mills et al., 2014).

pag. 6

1.3 Invloed van menselijke manipulaties op het microbieel bederf

Het microbieel bederf van een voedingsmiddel is sterk afhankelijk van de aanwezige intrinsieke en extrinsieke factoren. Tijdens de productie wordt er op de aanwezige microflora een selectiedruk uitgeoefend door variaties aan te brengen aan de intrinsieke en extrinsieke factoren. De technieken die hiervoor gebruikt worden, kunnen onderverdeeld worden in: een inactivatie van de aanwezige MO, een eliminatie van de aanwezige MO of controle op de uitgroeimogelijkheden van de aanwezige MO (Ridderbos, 2006). Filtratie en centrifugatie worden gebruikt voor de eliminatie van de aanwezige MO. Deze technieken zijn echter niet toepasbaar op vaste voedingsmiddelen. Het microbieel bederf op vaste voedingsmiddelen dient voorkomen te worden met behulp van een inactivatie of controle op de uitgroei van de MO. De inactivatietechnieken omvatten hittebehandelingen, bestralen en enkele nieuwe technieken zoals hoge druk en pulserende elektrische velden. Voorbeelden van technieken die een controle op de uitgroei uitvoeren zijn: gekoelde opslag of invriezen van het voedingsmiddel, een dehydratatie van het voedingsmiddel, het gebruiken van een aangepaste atmosfeer in de verpakking van het voedingsmiddel, het toevoegen van additieven zoals sorbaten, benzoaten, suikers, zuren, zouten, natuurlijke antimicrobiëlen en MO (Hobbs B.C., 1987; Gorris & Peppelenbos, 1992; Church, 1994; Borch et al., 1996; Appendini & Hotchkiss, 2002; Gram et al., 2002; Quintavalla & Vicini, 2002; Beales, 2004; McLauchlin, 2007; Nychas et al., 2008; Modi, 2009; Ghaly et al., 2010; Doulgeraki et al., 2012; Jayasena & Jo, 2013; Mills et al., 2014). De conserveringstechniek zal in eerste instantie dus bepaald worden door de aanwezige microflora. Hittebehandelingen tasten het voedingsmiddel teveel aan en kunnen niet toegepast worden voor het bewaren van vers vlees. Voor het bewaren van vers vlees dienen iets mildere behandelingstechnieken gebruikt te worden. Deze technieken, hun werkingsmechanisme, het effect van deze techniek en het toepassingsgebied ervan zullen kort toegelicht worden. 1.3.1 Beïnvloeding van de aw-waarde

Een basistechniek is het dehydrateren van het voedingsmiddel, hierbij wordt er een verlaging van de aw-waarde bekomen. Met andere woorden het beschikbare vrije water voor het MO wordt gereduceerd. De aw-waarde van een voedingsmiddel is belangrijk daar elk MO een minimale concentratie aan vrij water nodig heeft voor zijn metabolische activiteiten. Indien er gewerkt wordt onder de minimale aw-waarde van een MO, zal er voor dat MO een osmotische stress veroorzaakt worden (Hobbs B.C., 1987; Gram et al., 2002; Beales, 2004; McLauchlin, 2007; Jayasena & Jo, 2013). Door toevoeging van zouten of suikers aan het voedingsmiddel, een verhitting van het voedingsmiddel of door het invriezen van het voedingsmiddel kan een reductie bekomen worden van het vrije water. Bij het zouten van voedingsmiddelen worden voornamelijk natrium- en kaliumzouten gebruikt of nitriet. In de meeste gevallen wordt er een combinatie gebruikt van Na/K zouten en nitriet daar deze combinatie in staat is om een uitgroei van de sporen te

pag. 7

voorkomen. Nitriet wordt toegediend om een inhibitie van C. botulinum te verkrijgen. De inhibitie van C. botulinum kan ook met behulp van andere technieken gerealiseerd worden maar het meest effectieve resultaat wordt verkregen door toevoeging van nitriet (Hobbs B.C., 1987; Beales, 2004; McLauchlin, 2007; Modi, 2009; Ghaly et al., 2010; Tapia & Welti-Chanes, 2012). Het zouten van voedingsmiddelen staat echter ter discussie daar een overmatig gebruik van zouten verschillende gezondheidsproblemen zoals verhoogde bloeddruk, aderverkalkingen, verstoorde nierfunctie kunnen veroorzaken. Voorbeelden van gezouten voedingsmiddelen zijn: gepekelde haring, gedroogde, spek en gezouten hammen (Hobbs B.C., 1987; Gram & Dalgaard, 2002; Dijk & Grootenhuis, 2003; Beales, 2004; Modi, 2009; Ghaly et al., 2010). Het toevoegen van opgeloste suikers aan het voedingsmiddel is een andere manier om een verlaging van het beschikbare water te verkrijgen. Voedingsmiddelen waarbij dit wordt toegepast zijn: frisdranken, gecondenseerde en gesuikerde melk, gekonfijt fruit en honing (Dijk & Grootenhuis, 2003; Modi, 2009). Naast de additietechnieken kunnen variaties in temperatuur ook een daling in het beschikbare water teweeg brengen. Enerzijds kan het voedingsmiddel thermisch behandeld worden waardoor de fractie aan beschikbaar water daalt. Het nadeel van een thermische behandeling zijn de aantastingen van de nutritionele componenten van het voedingsmiddel, ondanks de mogelijke afdoding van sommige MO. De thermische behandelingen worden voornamelijk toegepast bij vloeibare voedingsmiddelen die geconcentreerd worden om een langere houdbaarheid van het voedingsmiddel te verkrijgen. Gecondenseerde melk, geconcentreerde vruchtensappen en tomatenpasta zijn voorbeelden van dergelijke voedingsmiddelen (Hobbs B.C., 1987; Gram et al., 2002; Dijk & Grootenhuis, 2003; McLauchlin, 2007; Modi, 2009). Anderzijds kunnen voedingsmiddelen ingevroren worden. Hierbij wordt het beschikbare water getransformeerd in ijskristallen, waardoor het niet meer beschikbaar is voor microbiologische activiteiten. Bovendien zal tijdens het ontdooien van deze voedingsmiddelen een ideaal milieu ontstaan voor bederf van het voedingsmiddel en is koeling dus heel belangrijk (Modi, 2009). De voedingsmatrices kippenfilet en kippengehakt hebben een aw-waarde die gelegen is tussen 0,99 en 0,97 (Black & Jaczynski, 2008; Marianski & Marianski, 2013). De houdbaarheid van vers kippenvlees kan verlengd worden door middel van gekoelde opslag en/of het invriezen van de producten. Daarnaast wordt kippenvlees vaak behandeld met (fosfaat)zouten. De gebruikte fosfaatzouten bevorderen de waterbindingscapaciteit, de textuur, de kleur en de smaak van het kippenvlees (Zheng et al., 1999; Arritt et al., 2002; Yoon, 2002; Alvarado & McKee, 2007). Indien er geen additieven toegevoegd worden kan het vers vlees nog als vers vlees beschouwd worden volgens de Europese wetgeving (Europese Unie, 2004). Afhankelijk van de resulterende fractie aan beschikbaar water in het voedingsmiddel kan de groei van bepaalde micro-organismen geïnhibeerd worden. Bij de verlaging van de aw-waarde moet er gekozen worden voor een optimum daar er een verschuiving binnen de aanwezige microflora zal plaatsvinden (Hobbs B.C., 1987; Dijk & Grootenhuis, 2003; Beales, 2004; McLauchlin, 2007; Mills et al., 2014).

pag. 8

1.3.2 Beïnvloeding van de pH

Elk MO heeft een bepaalde pH-range waarbinnen metabolische activiteiten mogelijk zijn. Door het toevoegen van organische zuren zullen de microbiologische activiteiten van MO in het voedingsmiddel geremd worden. De pKa-waarde van een zuur is een indicatie voor de sterkte van het gebruikte zuur en geeft aan bij welke pH-waarde er een gelijke hoeveelheid aan gedissocieerde en niet-gedissocieerde vorm van het zuur voorkomt. Hierdoor ontstaat er een evenwicht tussen de gedissocieerde en niet-gedissocieerde vorm van het zwakke zuur, zoals weergegeven in (vgl. 1.1) (Beales, 2004; McLauchlin, 2007). ା ‫(ܣܪ‬௔௤) ↔ ‫(ܪ‬௔௤) + ‫( ିܣ‬௔௤)

(vgl. 1.1)

Zwakke organische zuren zoals azijn-, benzoë-, citroen-, propion- en sorbinezuur worden voornamelijk gebruikt voor het verzuren van het voedingsmiddel. De gedissocieerde vorm van het zwakke zuur verlaagt de pH in de omgeving van het MO. De gedissocieerde vorm is echter geladen waardoor het niet over het celmembraan getransporteerd kan worden. De niet-gedissocieerde vorm van het zwakke zuur bezit daarentegen geen lading waardoor het wel over het celmembraan getransporteerd kan worden. Eenmaal intern kan de niet-gedissocieerde vorm omgezet worden naar de gedissocieerd vorm waardoor er ook intern een verzuring bekomen wordt. De combinatie van de externe en interne verzuring zorgt voor een vertraging of stopzetting van de microbiële activiteiten. Door de interne verzuring wordt de H+ gradiënt over het celmembraan verstoord. Hierdoor daalt de efficiëntie van de energieproductie van een MO (Hobbs B.C., 1987; Beales, 2004). Het systeem van verzuring met behulp van azijnzuur wordt schematisch weergegeven in figuur 1.1 (Hobbs B.C., 1987; Dijk & Grootenhuis, 2003; Beales, 2004; McLauchlin, 2007; Modi, 2009; Ghaly et al., 2010; Tapia & Welti-Chanes, 2012).

pag. 9

figuur 1.1: Interactie tussen zwak zuur (azijnzuur) en MO (Beales, 2004)

Afhankelijk van het gebruikte organische zuur worden er andere effecten waargenomen op de aanwezige microflora. Azijnzuur zal niet gebruikt worden om een inhibitie te bekomen van azijnzuurbacteriën, Acetobacter, gisten en schimmels. Deze MO vertonen namelijk enige resistentie tegenover azijnzuur daar ze het in sommige omstandigheden zelf produceren. Spoorvormende bacteriën kunnen daarentegen wel geïnhibeerd worden door azijnzuur indien er 0,1 % van het niet-gedissocieerde zuur aanwezig is. Voor de inhibitie van mycotoxine producerende schimmels moet er 0,3 % van het nietgedissocieerde zuur aanwezig zijn (Hobbs B.C., 1987). Azijnzuur wordt gebruikt in diverse sauzen zoals mosterd en mayonaise maar ook in ingelegde groenten zoals zilveruitjes en augurken. Propionzuur inhibeert een ruime range aan bacteriën indien er 0,05 % à 0,1 % van het niet-gedissocieerd zuur aanwezig is. Dit organisch zuur wordt voornamelijk gebruikt om schimmelgroei te inhiberen in broodproducten (Hobbs B.C., 1987; Dijk & Grootenhuis, 2003). Citroenzuur en melkzuur worden voornamelijk gebruikt om een inhiberende werking te verkrijgen bij een lage pH van verschillende bacteriën. Daarnaast zijn beide zuren in staat om de vorming van verschillende toxines te inhiberen. Citroenzuur bezit bovendien de capaciteit om Staphylococcus aureus te inhiberen indien het voedingsmiddel zich in anaerobe condities bevindt, hiervoor dient er slechts 0,001 % van het niet-gedissocieerd zuur gebruikt te worden (Hobbs B.C., 1987; Ghaly et al., 2010). Melkzuur wordt gebruikt bij de productie van yoghurt en kaas terwijl citroenzuur voornamelijk gebruikt wordt als emulgeermiddel in ijs of als kleurstof in verschillende voedingsmiddelen.

pag. 10

Het organisch zuur benzoëzuur wordt voornamelijk gebruikt in softdrinks, vruchtensappen en thee - extracten. Hierbij heeft het zuur een antimycotische werking indien er een concentratie van 0,05 % à 0,1 % van het niet-gedissocieerd zuur aanwezig is. De voedselbedervende organismen zijn echter meestal resistent tegen dit zwak organisch zuur (Hobbs B.C., 1987; Beales, 2004; Ghaly et al., 2010). Sorbinezuur wordt voornamelijk gebruikt als inhibitor tegen verschillende schimmels, gisten en bacteriën. Hierbij wordt het voornamelijk toegepast als inhibitor bij aerobe contaminaties in zuur gefermenteerde voedingsmiddelen. Daarnaast kan het ook als inhibitor gebruikt worden voor C. botulinum maar het is niet zo effectief als de additie van nitriet (Hobbs B.C., 1987; Dijk & Grootenhuis, 2003; Ghaly et al., 2010). Het gebruik van benzoëzuur is echter omstreden daar het in de aanwezigheid van ascorbinezuur en een metaalkatalysator kan reageren tot de vorming van benzeen (Gardner & Lawrence, 1993). Daarnaast kunnen beide conserveringsmiddelen een allergische reactie veroorzaken (Chandra, 1997). Deze conserveringstechniek kan ook toegepast worden op kippenvlees(Jiménez et al., 1999). Volgens Min et al. (2007) kan een reductie van 1 log verkregen worden van de MO na een behandeling met azijn-, citroen- of melkzuur. Een behandeling met citroenzuur bracht bovendien een 3 log reductie te weeg voor het MO E.cloacae. 1.3.3 Beïnvloeding van redoxpotentiaal

De redoxpotentiaal beschrijft het oxiderend of reducerend vermogen van een voedingsmiddel bij een welbepaalde pH. De redoxpotentiaal van een voedingsmiddel is sterk afhankelijk van de chemische samenstelling van een voedingsmiddel en de zuurstofspanning die heerst boven het voedingsmiddel. Voedingsmiddelen bezitten een hoge redoxpotentiaal indien het medium veel oxiderende eigenschappen bezit en er dus veel zuurstof aanwezig is boven het voedingsmiddel. De redoxpotentiaal van een voedingsmiddel varieert doorheen het product. Aan het oppervlak bezitten de meeste voedingsmiddelen een hoge redoxpotentiaal. Intern bezitten ze een lagere redoxpotentiaal daar zuurstof traag diffundeert doorheen het voedingsmiddel. De redoxpotentiaal voorspelt voornamelijk het oxiderend en reducerend karakter van een voedingsmiddel maar dient mogelijk ook als indicator voor de aanwezige microflora. Aerobe MO hebben nood aan zuurstof en zullen daarom een hoge redoxpotentiaal verkiezen terwijl anaerobe MO een lage redoxpotentiaal nodig hebben om voedsel te bederven (Hobbs B.C., 1987; Beales, 2004; Ridderbos, 2006; McLauchlin, 2007). Vleesproducten hebben in een onbehandelde situatie een interne redoxpotentiaal van -200 mV terwijl vermalen vleesproducten een redoxpotentiaal van rond + 200 mV bezitten. De redoxpotentiaal van een voedingsmiddel varieert dus naar gelang het aantal uitgevoerde bewerkingen op een voedingsmiddel maar ook in functie van de aanwezige zuurstofconcentratie (Hobbs B.C., 1987; Huis in't Veld, 1996; Ridderbos, 2006). Visproducten zoals Thunnus albacares (geelvintonijn) hebben een redoxpotentiaal van rond de + 0,3 V volgens Agustini et al. (2001). De houdbaarheid van vers vlees kan verlengd worden door de redoxpotentiaal te beïnvloeden daar er meestal gebruikt gemaakt wordt van aangepaste verpakkingen.

pag. 11

1.3.4 Toevoeging van natuurlijke antimicrobiëlen

De consumenten eisen vandaag echter meer en meer een “green label” waarbij het gebruik van chemische producten geminimaliseerd wordt. Hierdoor grijpen producenten naar natuurlijke antimicrobiële agentia die afkomstig kunnen zijn van MO, dieren of planten. Voorbeelden van dergelijke antimicrobiële agentia zijn fenolische componenten, organische zuren, essentiële oliën, weipermeaat, chitosan, enzymen afkomstig uit fagosomen, peptides en bacteriocinen (Board, 1995; Gould, 1995; Hill, 1995; Nychas, 1995; Cleveland et al., 2001; Tapia & Welti-Chanes, 2012; Jayasena & Jo, 2013). Bacteriocinen zijn antimicrobiële agentia die geproduceerd worden door bacteriën zodat de groei van andere bacteriën afgeremd kan worden of afgedood worden. Voor de productie van bacteriocinen die bestemd zijn voor de voedingsindustrie mogen enkel food grade MO gebruikt worden (Hill, 1995; Cleveland et al., 2001). Voor voedingsmiddelen worden voornamelijk melkzuurbacteriën gebruikt die nisine of colicine produceren. Nisine wordt commercieel gebruikt in verschillende takken van de verwerkende industrie. Het wordt gebruikt als antimicrobieel agentia in de conserven om de uitgroei van clostridiumsporen te inhiberen. Voorbeelden van dergelijke toepassingen zijn geconserveerde groenten of geconserveerde soep (Hill, 1995). In de vleesverwerkende industrie wordt het gecombineerd met lage concentraties aan nitriet om de uitgroei van Clostridium perfringens te inhiberen (Hill, 1995; Cleveland et al., 2001). Essentiële oliën (EOn) zijn plantaardige antimicrobiële agentia die geëxtraheerd worden uit de planten met behulp van een stoom, koude, droge of vacuüm destillatie. Oregano, rozemarijn, tijm, kruidnagel, kaneel, gember, koriander, marjolein, basilicum, kruidnagel en salie zijn voorbeelden van EOn die toegepast worden als antimicrobiële agentia in de vleesverwerkende industrie (Nychas, 1995; Jayasena & Jo, 2013). De inhibitie door EOn gebeurt via verschillende mechanismen afhankelijk van de actieve antimicrobiële component die de EOn bezitten. EOn kunnen de aanwezige celwand degraderen, de aanwezige enzymatische systemen verstoren, het actief transport verstoren, de elektronenflow verstoren, de protonengradiënt over het membraan verstoren, de samenstelling van de fosfolipiden in het cytoplasmamembraan aantasten of permeabiliteit van het celmembraan veranderen (Nychas, 1995; Jayasena & Jo, 2013). Indien de antimicrobiële activiteit van deze natuurlijke antimicrobiëlen te laag is voor de specifieke toepassing zal deze gecombineerd worden met andere technieken. Het effect van deze combinaties wordt voor EOn besproken in deel 3: “Essentiële oliën”. Door de toevoeging van de natuurlijke antimicrobiëlen kan de houdbaarheid van vers vlees verlengd worden. Door de gebruikte additieven is het vlees echter geen vers vlees meer volgens de Europese wetgeving (Europese Unie, 2004).

pag. 12

1.3.5 Roken van voedingsmiddelen

Het roken van voedingsmiddelen wordt reeds vele jaren toegepast op slechts enkele geschikte voedingsmiddelen. Verschillende typische smaak- en kleurcomponenten worden tijdens het rookproces afgegeven aan de gerookte voedingsmiddelen. Tijdens het rookproces zullen de aanwezige organische componenten, teerachtige componenten, formaldehyde, antioxidanten, zuurstof en stikstof contact maken met het voedingsmiddel. Door het roken zal de houdbaarheid van het voedingsmiddel verlengd worden. De extra verkregen houdbaarheid door het rookproces is sterk afhankelijk van de samenstelling van de gebruikte rook en de eventueel gebruikte specerijen. Het rookproces zal voornamelijk een effect hebben op de aanwezige gramnegatieve staven, micrococci en staphylococci. Typische voorbeelden van gerookte voedingsmiddelen zijn: rookworst, gerookte ham, gerookte paling en gerookte makreel (Hobbs B.C., 1987; McLauchlin, 2007). Het roken zal de houdbaarheid van vers vlees verlengen maar door de gebruikte additieven kan het niet langer als vers vlees beschouwd worden volgens de Europese wetgeving (Europese Unie, 2004). 1.3.6 Verpakkingen met aangepaste atmosfeer

Naast manipulaties op het niveau van de intrinsieke factoren kunnen er ook manipulaties uitgevoerd worden op het niveau van de extrinsieke factoren. Het bekendste voorbeeld hiervan zijn de vacuümverpakkingen en de gemodificeerde atmosfeer verpakkingen (MAP). Bij deze verpakkingen wordt het bederf geïnhibeerd door een aangepaste atmosfeer. De modificatie van de atmosfeer gebeurt in functie van de aanwezige microflora en de te onderdrukken MO (Gorris & Peppelenbos, 1992; Church, 1994; Quintavalla & Vicini, 2002; Sivertsvik et al., 2002; Ridderbos, 2006; Modi, 2009; Del Nobile et al., 2012). Vacuümverpakkingen bestaan uit materialen met een lage zuurstof doorlaatbaarheid. De voedingsmiddelen worden in de verpakking gebracht en voor het afsluiten van de verpakking wordt de aanwezige atmosfeer uit de verpakking verwijderd. Een residu van de verwijderde atmosfeer zal echter altijd in de verpakkingen aanwezig blijven. De samenstelling van deze fractie aan atmosfeer zal veranderen gedurende de opslagperiode van het voedingsmiddel. Deze verandering komt er onder invloed van oxidaties van het voedingsmiddel en de metabolische processen van de aanwezige microflora (Hobbs B.C., 1987; Gorris & Peppelenbos, 1992; Church, 1994; Dijk & Grootenhuis, 2003; McLauchlin, 2007; McMillin, 2008; Del Nobile et al., 2012). De microbiologische activiteiten worden door deze aanpassingen vertraagd en bovendien zal er een inhibitie gebeuren van de meeste gramnegatieve bacteriën, schimmels en gisten. Bij delicate producten of scherpe producten kan een normale vacuümverpakking niet gebruikt worden en worden skinvacuümverpakking gebruikt. Deze verpakking bestaat uit een dunne film die over het product wordt aangebracht waarna opnieuw een vacuüm gecreëerd wordt (Church, 1994; Ahvenainen, 2005; McMillin, 2008; Mills et al., 2014). Voedingsmiddelen zoals wild, vis, groenten en fruit kunnen vacuüm verpakt worden om de houdbaarheid te verlengen. De skinvacuümverpakking wordt bijvoorbeeld toegepast bij het verpakken van lamskronen.

pag. 13

Een andere methode omvat het aanpassen van de atmosfeer in de verpakking, door de gassamenstelling in de verpakking te modificeren. De samenstelling van de gassen is sterk afhankelijk van de aanwezige microflora en de gevoeligheid van het product voor de gebruikte gassamenstelling (Gorris & Peppelenbos, 1992; Church, 1994; Appendini & Hotchkiss, 2002; Sivertsvik et al., 2002; McMillin, 2008). In MAP’s worden voornamelijk drie gassen gebruikt zuurstof, koolstofdioxide en stikstofgas. Zuurstof wordt in MAP’s gebruikt om de uitgroei van anaerobe bacteriën te inhiberen en bijgevolg de groei van aerobe bacteriën te stimuleren. De typisch rode vleeskleur wordt tijdens de opslagperiode behouden door de aanwezigheid van een minimale hoeveelheid zuurstof in de verpakking. De aanwezige zuurstof zorgt voor een oxidatie van het eiwit myoglobine waardoor de typische rode vleeskleur behouden blijft (Gorris & Peppelenbos, 1992; Church, 1994; Dijk & Grootenhuis, 2003; McMillin, 2008; Del Nobile et al., 2012; Mills et al., 2014). Vers vlees wordt vaak bewaard in een MAP waarin er 80 % O2 en 20 % CO2 aanwezig is. Koolstofdioxide wordt in MAP’s gebruikt omwille van zijn antimicrobiële eigenschappen. Dit gas is zowel water- als vetoplosbaar waardoor het kan interageren met het voedingsmiddel en een interne pH verlaging kan teweeg brengen in het voedingsmiddel. Het doel van koolstofdioxide is het verlengen van de lag fase van de microbiologische groei en bovendien wordt de snelheid van de microbiologische groei vertraagd. Dit effect is sterk afhankelijk van de aanwezige koolstofdioxide concentratie, de leeftijd en de concentratie van de aanwezige initiële contaminatie, de temperatuur tijdens de opslag en het type van product dat verpakt dient te worden (Hobbs B.C., 1987; Gorris & Peppelenbos, 1992; Church, 1994; Appendini & Hotchkiss, 2002; Quintavalla & Vicini, 2002; Ahvenainen, 2005; McLauchlin, 2007; McMillin, 2008; Del Nobile et al., 2012)

Sommige voedingsmiddelen zoals vette vis en vette vleeswaren zijn zeer oxidatief gevoelig. Dergelijke producten worden bij voorkeur bewaard in MAP’s zonder zuurstof. Het volume aan zuurstof dient in dergelijke verpakkingen echter vervangen te worden, zodat de verpakking niet kan ineenstorten. Deze rol wordt vervuld door het inerte en smaakloze stikstofgas. Dit gas bezit geen antimicrobiële capaciteiten daar het een lage oplosbaarheid heeft voor zowel de waterige fase als de vetfase. Dergelijke verpakkingen zijn uitermate geschikt om de strikt aerobe MO te inhiberen. Spek is een voorbeeld van een vette vleeswaar die bij voorkeur bewaard wordt in een MAP waarin 35 % CO2 en 65 % N2 aanwezig is (Church, 1994; Borch et al., 1996; Dijk & Grootenhuis, 2003; McMillin, 2008). Schelvis, kabeljauw, tong en wijting zijn voorbeelden van vette visproducten die het best bewaard worden in een MAP waarin 40 – 50 % CO2 aanwezig is (Sivertsvik et al., 2002). MAP’s met een lage concentratie aan zuurstof (5 à 10 %) zijn in staat om anaerobe pathogenen zoals C. botulinum aan het oppervlak van het voedingsmiddel te inhiberen (Church, 1994; Quintavalla & Vicini, 2002; McMillin, 2008). Vers vlees kan in beide types van verpakkingen gestockeerd worden en indien er geen additieven toegevoegd worden blijft het vlees, vers vlees volgens de Europese wetgeving (Europese Unie, 2004).

pag. 14

Naast de drie vaakst gebruikte gassen, O2, N2 en CO2, is het ook mogelijk om andere gassen zoals SO2, N2O, NO, O3, He, H2, Ne, Ar, propeenoxide, ethyleen en Cl2 te gebruiken in MAP’s. Het gebruik van dergelijke gassen is echter beperkt door de aanwezige wetgeving, de consumentendruk en mogelijke negatieve effecten tijdens MAP bewaring (Hobbs B.C., 1987; Church, 1994; McMillin, 2008; Del Nobile et al., 2012). Naast de gebruikelijke uitvoering zijn er ook speciale uitvoeringen van MAP’s mogelijk. Voorbeelden hiervan zijn gecontroleerd atmosferische verpakking (CAP) en evenwichtige gemodificeerde atmosfeer (EMAP). Bij CAP wordt de proportie van de gassen constant gehouden aan de initiële concentratie tijdens de opslag. Bij EMAP wordt de verpakking geflusht met het benodigde gas of de ongewijzigde atmosfeer. Tijdens de opslag zal de gassamenstelling in EMAP verpakkingen veranderen door respiratieprocessen die plaatsvinden in het product en de gaspermeabiliteit van de gebruikte verpakkingen. Een evenwichtssituatie zal in dergelijke verpakkingen pas na enige tijd tot stand komen (Church, 1994). Kippenborstfilets, al dan niet met kippenvel, kunnen bewaard worden in MAP’s waarin 30% CO2 en 70% N2 of 70% CO2 en 30% N2 aanwezig is. Dergelijke verpakkingen inhiberen de groei van Pseudomonads maar niet de groei van Lactobacilli en Brochothrix thermosphacta. Hierdoor wordt de houdbaarheid verlengd tot 21 dagen in plaats van 5 dagen bij verpakkingen gevuld met lucht volgens Jiménez et al. (1997). Volgens Chouliara et al. (2008) verlengen MAP 30% CO2 en 70% N2 of 70% CO2 en 30% N2 de houdbaarheid van een kippenfilet. 1.3.7 Bestraling

De voorgaande technieken zijn voornamelijk gericht op een controlemechanisme op de uitgroei van de MO. Met behulp van straling kan een reductie van de aanwezige microflora bekomen worden. Vetrijke en eiwitrijke producten kunnen na bestraling echter smaak en geurafwijkingen vertonen waardoor het net zoals thermische behandelingen ongeschikt blijkt te zijn binnen de perceptie van verse, smaakvolle voedingsmiddelen. Bestralen zorgt voor een reductie van de aanwezige microflora door het beschadigen van het DNA van een MO. In analogie met de thermische behandelingen kan er binnen de bestraling ook een opdeling gemaakt worden naargelang de gebruikte dosis. Bij radappertisatie worden stralingsdosissen tussen de 25 en 50 kGy gebruikt om de afdoding van alle MO inclusief sporen en virussen te bekomen. Deze techniek wordt voornamelijk toegepast bij de productie van steriele voeding. De reden hiervoor is dat het kwaliteitsverlies bij bestraling kleiner is in vergelijking met een vergelijkbare thermische behandeling op hetzelfde voedingsmiddel (Hobbs B.C., 1987; Beales, 2004; Ridderbos, 2006; McLauchlin, 2007; Fan, 2012; Tapia & Welti-Chanes, 2012). Bij radurisatie wordt er gewerkt met stralingsdosissen die gelegen zijn tussen de 1 en 3 kGy. Deze techniek wordt voornamelijk gebruikt bij zachte vruchten zoals aardbeien, champignons en koelbewaarde voedingsmiddelen zoals vlees en vis. Het doel van deze techniek is het verlengen van de houdbaarheid door de initiële

pag. 15

contaminatie terug te brengen tot een aanvaardbaar niveau (Hobbs B.C., 1987; Ridderbos, 2006; Fan, 2012). Radicidatie omvat de bestralingstechnieken waarbij dosissen gebruikt worden tussen de 1 en 7 kGy met als doel de afdoding van pathogenen. Omwille van de kleine temperatuurstijging kan deze techniek toegepast worden op diepvriesproducten als ook op garnalen en rauwe vleesproducten zoals américain (Hobbs B.C., 1987; Ridderbos, 2006; Fan, 2012). Omwille van de sterke wetgeving omtrent het bestralen van voedingsmiddelen en de perceptie van de consumenten wordt deze techniek zo minimaal mogelijk toegepast op voedingsmiddelen. Het bestralen wordt in de voedingsindustrie voornamelijk gebruikt om steriele verpakkingen te produceren, die bijvoorbeeld gebruikt kunnen worden bij het vacuümverpakken van voedingsmiddelen (Beales, 2004; Tapia & Welti-Chanes, 2012). Ondanks de perceptie van de consumenten werd het effect van bestraling reeds getest op kippenborstfilets. In een studie van Min et al. (2007) werd een 2 log reductie bekomen bij een stralingsdosis van 0,5 kGy. Bovendien werden geen leefbare cellen meer waargenomen indien een stralingsdosis van 2 kGy werd gebruikt. Een studie van Chouliara et al. (2008) onderzocht wat het gecombineerde effect van bestralingen en MAP’s is. Uit deze studie werd afgeleid dat een stralingsdosis van 4 kGy gecombineerd met een MAP verpakking ( 70% CO2 en 30% N2) de beste combinatie is voor een reductie van de aanwezige microflora. Door het toepassen van één enkele techniek wordt het bederf van het voedingsmiddel echter niet voorkomen. In de voedingsindustrie worden meestal verschillende manipulaties gecombineerd zodat de aanwezige microflora correct wordt onderdrukt en het bederf van het voedingsmiddel zolang mogelijk wordt uitgesteld. Deze techniek staat beter bekend als “hurdle technology”. In het algemeen kan er wel gesteld worden dat de bedervende microflora als volgt zal evolueren onder invloed van de aanwezige selectiedruk. In eerste instantie zullen voornamelijk niet-fermentatieve psychrotrofe gramnegatieve bacteriën voor het bederf zorgen. Daarna verschuift de aanwezige microflora in de richting van fermentatieve gramnegatieve bacteriën, melkzuurbacteriën, gisten en filamenteuze fungi. Bij een verschuiving zal de volgorde van opsomming gerespecteerd worden (Gram et al., 2002; Beales, 2004; Ghaly et al., 2010; Tapia & Welti-Chanes, 2012).

pag. 16

2. Marinades Het marineren van producten is een oude techniek die gebruikt wordt om verschillende redenen: het bevorderen van de smaak van het product, de zachtheid van het product verhogen en een verhoogde houdbaarheid van het product (McKenna et al., 2003; Björkroth, 2005; Alvarado & McKee, 2007; Siripongvutikorn et al., 2008). Marinades kunnen volgens Björkroth (2005) omschreven worden als complexe sausen, met als basis een water-olie emulsie, waarin zouten, suikers, zuren, kruiden, aroma versterkers en reologie verbeterende middelen zoals sorbaten en benzoaten aanwezig kunnen zijn. Door de samenstelling van de marinades te variëren kunnen gewenste eigenschappen bekomen worden zoals een antimicrobiële werking. Bovendien is deze techniek ideaal om te combineren met andere conserveringstechnieken zoals de antimicrobiëlen. Een overzicht van de huidig gebruikte marinades en hun bestudeerde impact op de aanwezige microflora wordt weergegeven in tabel 3.1.

3. Essentiële oliën Essentiële oliën zijn vluchtige en aromatische oliën die geëxtraheerd worden uit aromatische en medicinale planten met behulp van een fermentatie, extractie of stoomdestillatie (Burt, 2004; Tzortzakis, 2009; Jayasena & Jo, 2013; Klein et al., 2013; Böhme et al., 2014; Nair et al., 2015). Dergelijke producten zijn van natuurlijke afkomst en kunnen gebruikt worden om chemische agentia te vervangen. De essentiële oliën hebben een antimicrobiële, antivirale en antifungale werking dankzij de aanwezigheid van vluchtige bioactieve componenten en een hydrofoob karakter. De aanwezigheid van hydroxylgroep(en) in het fenolisch karakter versterkt de werking van de essentiële oliën (Hammer et al., 1999; Jayasena & Jo, 2013; Klein et al., 2013; Böhme et al., 2014; Calo et al., 2015). Verschillende onderzoeken hebben aangetoond wat het effect is van verschillende essentiële oliën die gebruikt worden in voedingsmiddelen. Bovendien werd er voor bepaalde essentiële oliën ook reeds onderzocht wat het resterend effect is indien ze gecombineerd worden met andere conserveringstechnieken. Een overzicht hiervan is terug te vinden in tabel 3.2 (Burt, 2004; Jayasena & Jo, 2013; Nair et al., 2015). Uit deze verschillende onderzoeken is af te leiden dat verschillende EOn een antimicrobieel karakter bezitten. Dit karakter wordt echter sterk beïnvloedt door de eigenschappen van de gebruikte matrix. Oregano is bijvoorbeeld geschikt om op verschillende voedingsmatrixen een reductie van de aanwezige microflora te bekomen maar op varkensgehakt en zalmfilets werden geen reductie bekomen van de onderzochte MO. Het reducerend effect van de EOn kan bovendien versterkt worden door andere conserveringstechnieken zoals marinades. Een zuur - zout marinade vertraagt bijvoorbeeld de uitgroei van de micro-organismen en indien dit gecombineerd wordt met EOn kan zelfs een reductie van bepaalde MO bekomen worden.

pag. 17

tabel 3.1: Het effect van gebruikte marinade - oplossingen op micro-organismen

Marinade

Product

Combinatie conserveringstechnieken

Groene curry (verse kruiden, Witte garnalen komijn en knoflook) Oliemarinades knoflook

met

en Gebakken rundsvlees pasteien Varkensvlees Veenbessensap marinade Varkensnedes (14 Vacuümverpakking (water, zout, veenbessensap, en 20 dagen zwarte peper, ui, marjolein en rijping) rozemarijn) Zuur met pH 4 Gevogelte Vacuümverpakking (natriumlactaat, Frankfurterworsten natriumcitraat of natriumdiacetaat) Essentiële olie marinade Kippenvlees (natriumtripolyfosfaat, NaCl, 0,2 % Syzgium aromaticum L olie en 0,5 % Pimenta dioica olie) Zuur / zout marinade Kippenvlees Natriumlactaatof melkzuuroplossingen

MO

Impact op MO

Temperatuur (°C)

Totaal aantal bacteriën

Reductie van 1 log 4 ± 2 gedurende (Siripongvutikorn KVE/g 7 dagen et al., 2008)

ui

Sojasaus met of zonder Rundsvlees melkzuur Rode wijn met of zonder Rundsvlees essentiële olie Origanum vulgare

Verzuring Natuurlijke antimicrobiëlen

Referentie

(Gibis, 2007; Kim et al., 2010) 4 gedurende 7 dagen Totaal aantal aerobe Reductie van 2 log 2 ± 2 (McKenna et al., bacteriën KVE/cm² (14 dagen) 2003) en 1,8 log KVE/cm² (20 dagen) Listeria monocytogenes 3 – 4 log KVE/cm² 4 (Alvarado & inhibitie bij vacuüm McKee, 2007) verpakte Frankfurtersworsten L. monocytogenes 0,5 tot >2 log reductie 4 en 12 (Carlos & Gisten voor gisten. Geen Harrison, 1999) significant effect of L. monocytogenes

Pseudomonas spp. Enterobacteriaceae Staphylococcus aureus Salmonella spp. Totaal aantal levende bacteriën Totaal aantal levende bacteriën

Vertraging van de 4 uitgroei van de bedervende organismen reductie van het totaal 5 aantal reductie van het totaal 5 aantal

(Smaoui 2013)

et

al.,

(Kargiotou et al., 2011) (Kargiotou et al., 2011)

pag. 18

tabel 3.2 : Antimicrobiële activiteit van EO in verschillende voedingsmiddelen EOn actieve component Origanum vulgare

of type voedingsmiddel

Gehakt schapenvlees

gebruikte concentratie 0,6 % en 0,9 %

MO Gecombineerde conserveringstechniek Nisine (500 of S. Enteritidis 1000 IU/g)

O. vulgare Konijnenvlees subsp. hirtum

5% EO toevoegen via 100 en 200 mg poeder/kg voeding

Pseudomonas spp. Melkzuurbacteriën

Origanum vulgare

Rundvlees

0,8 %

Origanum vulgare Origanum vulgare

Rundergehakt

1%

Kippenborstvlees

0,1 %

MAP (30 % CO2/ 70 % N2 of 70 % CO2 of 30 % N2)

Origanum vulgare

Rundergehakt

0,05 % - 1 %

Origanum vulgare

Varkensgehakt

100 – 200 ppm

Zuurstofverpakking Koolstofdioxide verpakking MAP (40 % CO2/ 30 % N2 / 30 % O2) Vacuümverpakking sporen van C. botulinum

Origanum vulgare

Filets van zalm

0,05 % v/w

waargenomen impact op MO

referentie

Inhibitie van de groei bij opslag op 4 °C en 10 °C. Hogere activiteit werd waargenomen bij 0,9 % en in combinatie met nisine. Inhibitie van de groei bij gekoeld opslag. Houdbaarheid wordt verlengd met minstens 2 of 4 dagen.

(Jayasena Jo, 2013)

&

(Soultos et al., 2009; Jayasena & Jo, 2013) L. monocytogenes Reductie van 2 - 3 log KVE/g. (Tsigarida et melkzuurbacteriën al., 2000; Jayasena & Jo, 2013) Totaal aantal Reductie van 1 log KVE/g. (Jayasena & Jo, 2013) Pseudomonas spp. Reductie van 1-5 log KVE/g en een (Jayasena & B. thermosphacta verlenging van de houdbaarheid van 5 Jo, 2013) Enterobacteriaceae à 6 dagen. melkzuurbacteriën Totaal aantal Reductie van 2 log in MAP en 3 log in (Skandamis & levensvatbare carbondioxide verpakking. Nychas, 2001; Burt, 2004)

P. phosphoreum

Geen significante waargenomen.

verschillen (Burt, 2004)

Geen significante waargenomen.

verschillen (Burt, 2004)

pag. 19

Syzygium aromaticum

Steak buffelvlees

van 0,1 % (v/v)

Melkzuur (2 % v/v)

Thymus vulgaris Kippenborstvlees

0,5 %

Carvacrol of Kippenborstvlees cinnamaldehyde

3%, 1,5% en 0,5 % Antimicrobiële in film verpakking

Eugenol

Stukken gekookte 0,1 ml verspreid kippenborst over 25 g

Thymus Gekookte garnalen saturoı̈ des en cinnamaldehyde Carvacrol Kalkoenborstvlees

0,9% en 1,8%

Totaal aantal coliformen Totaal psychrotroof aantal Totaal aantal E.coli melkzuurbacteriën E.coli O157:H7 S. enterica L. monocytogenes L. monocytogenes

Antimicrobiële verpakking

Pseudomonas putida

0,25 %/ 0,5 % / 1 % MAP (95 % CO2 / Salmonella v/v 5 % O2) Campylobacter jejuni Melkzuurbacteriën

Reductie van 3 log KVE/g voor coliformen en een reductie van 2,5 KVE/g voor het totaal psychrotroof aantal. Reductie van 0,3 log KVE/ml voor het totaal aantal, 1,2 log KVE/ml voor E.coli en 1 log KVE/ml voor melkzuurbacteriën. Reductie van 3 log voor 3% carvacrol, 1,6 tot 3 log voor 1,5% carvacrol en 0,8 tot 1 log voor 0,5 % carvacrol bij een opslag op 4 °C gedurende 72 u. Verlenging van de lag-fase en reductie van 4 log KVE/g. Kleine verlenging van de lag-fase en reductie van 2 log bij 1,8% bij een opslag op 4°C gedurende 21 dagen. Reductie van 1-2 log KVE/g voor Salmonella en Campylobacter bij een stockageperiode van 7 dagen op 4 °C. Reductie van 1-3 log KVE/g voor melkzuurbacteriën onder dezelfde omstandigheden.

(Naveena et al., 2006; Jayasena & Jo, 2013) (Fratianni et al., 2010; Jayasena & Jo, 2013) (Ravishankar et al., 2009; Jayasena & Jo, 2013) (Hao et al., 1998; Burt, 2004) (Ouattara et al., 2001; Burt, 2004) (Nair et al., 2015)

pag. 20

4. Materialen en methoden 4.1 Doel De antimicrobiële werking van essentiële oliën (EOn), al dan niet in combinatie met marinades, onderzoeken op verschillende vleesmatrixen op basis van kip: kippenvlees, kippenvel en kippengehakt.

4.2 Materiaal • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • •

incubator bij 22 °C (Binder) incubator bij 37 °C (VWR, VMS C72) analytisch balans (Pioneer OHaus) warmwaterbad bij 50 °C petrischalen glazen drigalski spatel bunsenbrander ultraturrax (Ika T18 Basic) pH / EC-meter (C830, Consort) stomacher (Led Techno) steriele pipettips (1 ml en 200 μl) steriele pipetten 50 ml steriele pipetten 10 ml steriele stomacherzakken met filter (129-9875, VWR) steriele stomacherzakken zonder filter (129-0729, VWR) cultuurbuizen met 9 ml fysiologisch water (0,85% NaCl) (27800.291, VWR Prolabo) steriele lege cultuurbuizen essentiële olie rode tijm (Thymus zygis ct. thymol) (CNK 1692-417, Biover) essentiële olie kaneel (Cinnamomum zeylanicum) (CNK 1692-045, Biover) essentiële olie oregano (Origanum compactum) (478, Pranorôm) commercieel product: Rap solution AO OS (1693015-999, Rap®) kippenvlees, kippenhuid en kippengehakt Chromocult® (1.10426.0500, Merck) Rose- Bengal Chloramphenicol agar base (CM 0549, Oxoid) MRS agar: MRS broth (CM 0359, Oxoid) + 1,5 % agar bacteriological (LP 0011, Oxoid) sorbinezuur (S1626-250G, Sigma) buffered peptone water (CM 0509, Oxoid) Tween 80 (278630010, Acros Organics) NaOH (28245.298, VWR Chemicals) ethanol (87137.360, VWR Prolabo) chlooramfenicol (227920250, Acros Organics) melkzuur 80 % (10304, Purac FCC) natriumchloride (27800.291, VWR Prolabo) natriumhydroxide (28245.298, VWR Chemicals)

pag. 21

4.3 Methoden 4.3.1 Behandelen met EOn / Marinade

Het antimicrobieel effect van EOn op de vleesmatrixen werd onderzocht met behulp van verschillende behandelingen ten opzichte van een blanco behandeling. Het reducerend effect van de EOn werd onderzocht met behulp van emulsies op basis van water. In tweede instantie werd het “hurdle-effect” van een zuur - zout marinade in combinatie met de EOn onderzocht. Hierbij werden emulsies gebruikt op basis van een zuur - zout marinade (10% zout, 2 m% melkzuur en pH van 4,5). De blanco behandeling bestond uit stalen die zonder verdere behandeling overgebracht werden in een steriele stomacherzak met filter. De kippenvleesstalen werden bekomen door dunne onderhuidse stalen te nemen zoals afgebeeld in figuur 4.1. Dit werd gedaan omdat de MO voornamelijk op het oppervlak voorkomen (Sharma et al., 2013; Rohde et al., 2015). Bij het versnijden van de kippenhuidstalen, afgebeeld in figuur 4.2, werd opnieuw gekozen voor zo groot mogelijke contactoppervlaktes. Voor het kippengehakt werd een zo homogeen mogelijk staal van 200 g afgewogen in een steriele stomacherzak zonder filter. Na de behandeling werden random stalen van ongeveer 10 g genomen vanuit de 200 g behandelde massa. Van elk staal werd de massa bepaald zodat bij de microbiële analyse het aantal kolonie vormende eenheden (KVE) per gram bepaald kon worden. De behandeling van de vlees- en velstalen bestond uit een onderdompeling gedurende twee minuten in een EOn emulsie of marinadeoplossing. Tijdens het experiment werden zowel 1 % als 10 % EOn emulsies gebruikt. De 1 % emulsies werden bekomen door 300 μl essentiële olie, Origanum compactum, Cinnamomum zeylanicum en Thymus zygis ct. Thymol, en 30 μl Tween 80 (emulgator) toe te voegen aan 30 ml gedemineraliseerd water of 30 ml marinadeoplossing. Voor de 10 % emulsies werd dezelfde verhouding gerespecteerd en werd dit 3 ml EOn en 300 µl Tween 80 op 30 ml gedemineraliseerd water of marinadeoplossing. Bij het commercieel product werden 4 % en 20 % emulsies gebruikt. De bekomen emulsies werden gedurende één minuut gehomogeniseerd met behulp van de ultraturrax bij een toerental van 11000 rpm. Om kruiscontaminaties tussen de verschillende matrices te voorkomen, werden de vleesen velstalen in een aparte emulsie behandeld. Bij het kippengehakt werd gedurende twee minuten 10 ml EOn emulsie doorheen de 200 g kippengehakt gekneed. Na de respectievelijke behandeling werden de stalen op een steriele wijze overgebracht in een steriele stomacherzak met filter. De behandelde stalen werden bij 4 °C onder normale atmosfeer bewaard. Hierbij werden de stomacherzakken gedeeltelijk afgesloten zodat het contact met vreemde invallende objecten werd vermeden tijdens de opslag. Microbiële analyse werd bij de vlees- en velstalen uitgevoerd na 0, 1 en 6 dagen (n=3). Terwijl dit voor de gehaktstalen plaatsvond na 0, 1, 6 en 14 dagen (n=3).

pag. 22

Naast de microbiële analyse werd gecontroleerd in welke mate de geur van de essentiële oliën nog waarneembaar was na x aantal dagen stockage. De bekomen resultaten werden op een semi-kwantitatieve manier geïnterpreteerd zoals weergegeven in tabel 4.1. Daarnaast werden eventuele kleurveranderingen van de behandelde stalen visueel waargenomen. tabel 4.1: Semi-kwantitatieve subjectieve beoordelingsmanier van de resterende EOn geur op de behandelde stalen

Code 0 1 2 A B

Betekenis Geen waarneming van de EOn geur Minder sterke EOn geurwaarneming in vergelijking met tijdstip 0 Even sterke EOn geurwaarneming in vergelijking met tijdstip 0 Waarneming van bedervende geuren Geen waarneming van bedervende geuren

figuur 4.1: Methode voor staalname bij kipfilet, links foutieve staalname met een klein contactoppervlak, rechts correcte staalname met groot contactoppervlak

figuur 4.2: Kippenvel

pag. 23

4.3.2 Microbiële enumeratie

De antimicrobiële werking van drie verschillende EOn en marinadeoplossingen werd onderzocht op drie verschillende matrices, kippenvlees, kippenhuid en kippengehakt. De antimicrobiële werking werd geanalyseerd met behulp van drie selectieve voedingsmedia: MRS agar, Chromocult en Rose – Bengal Chloramphenicol agar base (RBC). De graad van reductie voor E.coli en het totaal aantal coliformen werd geanalyseerd met behulp van Chromocult. De reductiegraad voor gisten en schimmels werd geanalyseerd aan de hand van RBC. Aan het RBC-medium werd er na autoclavering en afkoeling 100 mg chlooramfenicol per liter toegevoegd op een steriele wijze. Deze toevoeging verliep op een indirecte wijze daar er 34 mg chlooramfenicol opgelost werd per ml ethanol. Het toegevoegde chlooramfenicol onderdrukte de groei van bacteriën zodat schimmels en gisten waargenomen konden worden. De graad van reductie voor melkzuurbacteriën werd geanalyseerd met behulp van MRS agar. De selectiviteit van het MRS-medium werd verhoogd door 1,4 g/l sorbinezuur toe te voegen aan het medium en de pH bij te stellen tot 5,7. Het MRS medium werd op kamertemperatuur bewaard bij normale atmosfeer terwijl de RBC- en chromocultplaten bewaard werden bij 4 °C onder normale atmosfeer. De strijkplaten, RBC en chromocult, werden voor gebruik gedurende 20 minuten gedroogd onder de laminaire flow. De aanwezige micro-organismen in de verschillende stalen werden met behulp van 100 ml gebufferd pepton water in oplossing gebracht met behulp van een staalvernietiging. Deze staalvernietiging vond gedurende één minuut plaats in een stomachertoestel. Met behulp van een decimale verdunning en de drie selectiemedia werd het aantal KVE per g staal bepaald voor elk behandeld staal. Voor de voedingsmedia RBC en Chromocult werd er gebruik gemaakt van de strijkplaatmethode. Hierbij werd 100 μl staal aangebracht op de strijkplaat en deze werd met behulp van een steriele, afgekoelde drigalski spatel homogeen verdeeld. Bij het medium MRS agar werd de gietplaatmethode gebruikt. Hierbij werd 1 ml staal aangebracht per petriplaat. Na homogenisatie en stollen van het voedingsmedium werd een microaërobe omgeving gecreëerd door het aanbrengen van een afdeklaag met behulp van het voedingsmedium. De aanwezige MO werden visueel zichtbaar gemaakt door de Chromocult platen gedurende 24 uur te incuberen bij 37 °C, terwijl de MRS- en RBC platen geïncubeerd werden bij 22 °C gedurende 120 uur.

pag. 24

4.3.3 Statistische analyse

Het antimicrobieel effect van de EOn werd reeds onderzocht in verschillende onderzoeken (Burt, 2004; Jayasena & Jo, 2013; Klein et al., 2013; Böhme et al., 2014; Nair et al., 2015). De significantie van de bekomen reducties van de verschillende behandelingen ten opzichte van de blanco of marinadebehandeling kan getest worden met behulp van een lineaire contrasttest. De hypothesen voor deze ANOVA-test zijn (Moore & McCabe, 2005; Weiss, 2012): ‫ܪ‬଴ : μ௕௟௔௡௖௢/௠௔௥௜௡௔ௗ௘ = μ௕௘௛௔௡ௗ௘௟௜௡௚ ‫ܪ‬௔ ∶ ߤ௕௘௛௔௡ௗ௘௟௜௡௚ < ߤ௕௟௔௡௖௢/௠௔௥௜௡௔ௗ௘ De lineaire contrasttest werd uitgevoerd met behulp van het statistische programma SPSS. Bij deze analyse worden verschillende contrasten vergeleken met elkaar, hierdoor dient er een gecorrigeerd significantieniveau, ook wel de Bonferroni correctie genoemd, gehanteerd te worden zoals weergegeven in vergelijking 4.1. Het statistische programma SPSS voert deze correctie niet uit waardoor het handmatig uitgevoerd werd. De gemiddelde reductie van de EOn behandelingen is significant verschillende van de blanco- of marinadebehandeling indien de helft van de p-waarde lager is dan het gecorrigeerde significantieniveau. ߙ௚௘௖௢௥௥௜௚௘௘௥ௗ =

ߙ ݊

(vgl. 4.1)

met α: het significantieniveau n: het aantal contrasten αgecorrigeerd: het significantieniveau met Bonferroni correctie Voordat deze test uitgevoerd kan worden, dienen de voorwaarden verbonden aan deze procedure gecontroleerd te worden. Deze voorwaarden zijn: de steekproeven zijn willekeurig en onafhankelijk van elkaar, per groep zijn de bovenliggende populaties normaal verdeeld en ze hebben dezelfde variantie σ². Het testen van de normaliteit op drie meetresultaten is echter niet mogelijk. ANOVA is als procedure robuust genoeg om deze schending van de voorwaarden op te vangen. Met behulp van de Levene’s test kan de gelijkheid van varianties worden getest. De hypothesen voor deze test zijn (Moore & McCabe, 2005; Weiss, 2012): ‫ܪ‬଴ : ݀݁ ‫݆݈݇݅݁݃ ݆݊݅ݖ ݊݁݌݁݋ݎ݃ ݁݀ ݊݁ݏݏݑݐ ݏ݁݅ݐ݊ܽ݅ݎܽݒ‬ ‫ܪ‬௔ : ݀݁ ‫݆݈݇݅݁݃ ݐ݁݅݊ ݆݊݅ݖ ݊݁݌݁݋ݎ݃ ݁݀ ݊݁ݏݏݑݐ ݏ݁݅ݐ݊ܽ݅ݎܽݒ‬ De varianties tussen de groepen zijn significant verschillend indien de verkregen p-waarde lager is dan het 5% significantieniveau.

pag. 25

5. Resultaten en discussie Voor het kippenvlees en kippenvel werden er vier verschillende reeksen opgezet: (i) 1 % EOn emulsies in water, (ii) 1% EOn emulsies in marinade, (iii) 10 % EOn emulsies in marinade en (iv) emulsies van het commerciële product. Bij elke reeks werd de antimicrobiële werking van de EOn gecontroleerd naast de waarnemingen voor kleurafwijkingen en aanwezigheid van de EOn geur. Voor kippengehakt werd er enkel een reeks opgezet waarin 10 % EOn emulsies in marinade werd gebruikt.

5.1 De matrix kippenvlees 5.1.1 Microbiologische parameters

De gemiddelde waargenomen reducties voor de vier gemonitorde microbiologische parameters: totaal aantal coliformen, E. coli, melkzuurbacteriën en gisten & schimmels zijn voorgesteld in figuur 8.1 tot en met figuur 8.4 in de bijlage. Na één dag behandeling werden ten opzichte van de blanco en marinadebehandeling geen significante reducties bekomen van het totaal aantal coliformen aanwezig op het kippenvlees (respectievelijk P-waarde>0,005 en P-waarde>0,0056). Ten opzichte van de blanco werd na zes dagen behandeling een 2 log KVE/g reductie bekomen, indien het kippenvlees behandeld werd met een olie-in-water marinade emulsie waarin 10% tijm, 10% oregano of 10% kaneel aanwezig is (P-waarde <0,005). Ten opzichte van de marinadebehandeling werd na zes dagen behandeling een significante reductie van 1 log KVE/g bekomen, indien het kippenvlees behandeld werd met een olie-in-water marinade emulsie waarin 10% tijm, 10% kaneel of 10% oregano aanwezig is (P-waarde<0,0056). Het aantal melkzuurbacteriën werd ten opzichte van de blanco en marinadebehandeling na één dag behandeling niet significant gereduceerd ( respectievelijk P-waarde >0,005 en P-waarde >0,0056). Ten opzichte van de blanco werd na zes dagen behandeling een significante reductie van 1 – 2 log KVE/g bekomen, indien de stalen behandeld werden met een olie-in-water emulsie waarin 10% tijm, 10% kaneel of 10% oregano aanwezig is (P-waarde <0,005). Ten opzichte van de marinadebehandeling werd het aantal melkzuurbacteriën na zes dagen behandeling significant gereduceerd met 0,5 – 1 log KVE/g, indien het kippenvlees behandeld werd met een olie-in-water marinade emulsie waarin 1% kaneel of 10% tijm aanwezig is (P-waarde <0,0056).

pag. 26

Na één dag behandeling werden ten opzichte van de blanco en marinadebehandeling geen significante reducties bekomen voor het aantal gisten en schimmels (respectievelijk P-waarde>0,005 en P-waarde>0,0056). Na zes dagen behandeling zorgen de olie-inwater emulsie waarin 1% kaneel aanwezig is en de olie-in-water marinade emulsies waarin 1% tijm, 1% oregano, 1% kaneel, 10% tijm, 10% oregano of 10% kaneel aanwezig is voor een significante reductie van 0,5 – 2,6 log KVE/g ten opzichte van de blanco (Pwaarde <0,005). Ten opzichte van de marinadebehandeling werd na zes dagen een significante reductie van 2-2,5 log KVE/g bekomen, indien het kippenvlees behandeld werd met een olie-in-water marinade emulsies waarin 10% kaneel, 10% tijm of 10% oregano aanwezig is (P-waarde <0,0056). Voor de parameter E.coli werd op het kippenvlees enkel een significante reductie van 0,4 - 0,7 log KVE/g bekomen, ten opzichte van de blanco, na een behandeling van zes dagen met een olie-in-water emulsie waarin 1% kaneel of 1% oregano aanwezig is of met behulp van een olie-in-water marinade emulsie waarin 1% tijm, 1% kaneel of 1% oregano aanwezig is (P-waarde <0,005). Na zes dagen behandeling zorgen de emulsies op basis van het commercieel product Rap Solution voor tegenstrijdige resultaten. Voor de microbiologische parameters gisten & schimmels en het totaal aantal coliformen is er een significante toename ten opzichte van de blanco waarneembaar (P-waarde< 0,005), terwijl er ten opzichte van de blanco een significante reductie van 1 – 2 log KVE/g waarneembaar is voor het aantal melkzuurbacteriën (P<0,005). Een behandeling met het commercieel product is bij de parameter E.coli vergelijkbaar met de blanco behandeling (P-waarde > 0,005). Voor alle gemonitorde microbiologische parameters op het kippenvlees werden geen significant verschil waargenomen tussen de olie-in-water emulsies waarin 1% EOn aanwezig is en de olie-in-water marinade emulsies waarin 1% EOn aanwezig is (P-waarde >0,0166). 5.1.2 Kleur- en geurveranderingen tijdens de behandeling

De semi-kwantitatieve evaluatie van de EOn geur voor de behandelde kippenvleesstalen wordt weergegeven in tabel 5.1. Naarmate er een hogere concentratie aan EOn gebruikt werd, was deze langer waarneembaar op de behandelde stalen. Het commercieel product had een veel neutralere geur in vergelijking met de gebruikte EOn. Na de behandeling met de EOn emulsies werd een lichtere kleur waargenomen op de kippenvleesstalen door de aanwezigheid van de dunne film, zoals afgebeeld in figuur 5.1. Kippenvleestalen die behandeld werden met het commercieel product vertoonden een kleurverandering door de intrinsieke kleur van het commercieel product, zoals afgebeeld in figuur 5.2. Na een opslagtermijn van zes dagen werd er op de blanco en met marinade behandelde stalen een geel/groene kleurafwijking waargenomen aan de rand van de stalen. De stalen die behandeld werden met EOn emulsies vertoonden geen kleurafwijkingen tijdens het volledig experiment.

pag. 27

1

tabel 5.1: Semi-kwantitatieve evaluatie EOn geur op de behandelde kippenvleesstalen

Type emulsie Olie-in-water (1%) Olie-in-water marinade (1%) Olie-in-water marinade (10%) Commercieel product

Tijdstip [dag] 1 6 1 6 1 6 1 6

Code 0&B 0&B 1&B 0&B 2&B 2&B 0&B 0&B

figuur 5.1: Kleurverschil na behandeling met een EOn emulsie ( links: situatie voor behandeling, rechts: situatie na behandeling)

1

Code 0: Geen waarneming van de EOn geur Code 1: Minder sterke EOn geurwaarneming in vergelijking met tijdstip 0 Code 2: Even sterke EON geurwaarneming in vergelijking met tijdstip 0 Code B: Geen waarneming van bedervende geuren

pag. 28

figuur 5.2: Emulsies van het commercieel product

5.2 De matrix kippenvel 5.2.1 Microbiologische parameters

De gemiddelde waargenomen reducties voor de vier gemonitorde microbiologische parameters: totaal aantal coliformen, E. coli, melkzuurbacteriën en gisten & schimmels zijn voorgesteld in figuur 8.5 tot en met figuur 8.8 in de bijlage. Het totaal aantal coliformen werd na één dag behandeling niet significant gereduceerd ten opzichte van de blanco en marinadebehandeling (respectievelijk P-waarde>0,005 en P-waarde >0,0056). Het totaal aantal coliformen werd na zes dagen significant gereduceerd met 3 log KVE/g ten opzichte van de blanco, indien de stalen behandeld werden met een olie-in-water marinade emulsie waarin 10% kaneel aanwezig is (Pwaarde <0,005). Ten opzichte van de marinadebehandeling werd het totaal aantal coliformen na zes dagen behandeling significant gereduceerd met 2 – 2,5 log KVE/g, indien de stalen behandeld werden met een olie-in-water-emulsie waarin 10% kaneel aanwezig is (P<0,0056). Na één dag behandeling werd het aantal melkzuurbacteriën ten opzichte van de blanco significant gereduceerd met 0,5 – 0,7 log KVE/g, indien de stalen behandeld werden een olie-in-water marinade emulsie waarin 10% oregano aanwezig is (P-waarde < 0,005). Na zes dagen behandeling werd dit een significante reductie van 1 – 2,8 log KVE/g ten opzichte van de blanco, indien de stalen behandeld werden met emulsies van het commercieel product of olie-in-water marinade emulsies waarin 10% kaneel, 10% tijm of 10% oregano aanwezig is (P-waarde < 0,005). Na één dag behandeling werd ten opzichte van de marinadebehandeling geen significante reductie van het aantal melkzuurbacteriën bekomen (P-waarde >0,0056). Na zes dagen behandeling werd, ten opzichte van de marinadebehandeling, een significante reductie van 2 – 2,5 log KVE/g bekomen voor de

pag. 29

melkzuurbacteriën, indien het kippenvel behandeld werd met een olie-in-water marinade emulsie waarin 10% kaneel aanwezig is (P-waarde<0,0056). Het aantal gisten en schimmels werd na één dag behandeling significant met 1 – 2 log KVE/g ten opzichte van de blanco, indien de stalen behandeld werden met een olie-inwater marinade emulsie waarin 10% tijm, 10% oregano of 10% kaneel aanwezig is (Pwaarde < 0,005). Na zes dagen behandeling werd het aantal gisten en schimmels ten opzichte van de blanco significant gereduceerd met 1 – 1,5 log KVE/g, indien de stalen behandeld werden met een olie-in-water marinade emulsie waarin 10% oregano, 10% kaneel of 10% tijm aanwezig is (P-waarde < 0,005). Ten opzichte van de marinadebehandeling werd het aantal gisten en schimmels na één dag behandeling significant gereduceerd met 1,3 – 1,8 log KVE/g, indien de stalen behandeld werden met een olie-in-water marinade emulsie waarin 10% oregano of 10% kaneel aanwezig is (P<0,0056). Na zes dagen werd ten opzichte van de marinadebehandeling een significante reductie van 1 – 1,2 log KVE/g bekomen, indien de stalen behandeld werden met een olie-in-water marinade emulsie waarin 10% kaneel of 10% oregano aanwezig is (P-waarde<0,0056). Het aantal E.coli werd na één dag behandeling ten opzichte van de blanco niet significant gereduceerd (P-waarde >0,005). Na één dag behandeling werd wel een significante reductie van 1 – 1,3 log KVE/g bekomen ten opzichte van de marinadebehandeling, indien de stalen behandeld werden met een olie-in-water emulsie waarin 1% kaneel aanwezig is (P-waarde <0,0056). Na zes dagen behandeling werd het aantal E.coli, ten opzichte van blanco, significant gereduceerd met 0,8 -1,2 log KVE/g, indien de stalen behandeld werden met emulsies van het commercieel product of een olie-in water emulsie waarin 1% kaneel aanwezig is of een olie-in-water marinade emulsie waarin 10% kaneel aanwezig is (P-waarde <0,005). Ten opzichte van de marinadebehandeling werd na zes dagen behandeling een significante reductie van 1 – 1,3 log KVE/g bekomen, indien het kippenvel behandeld werd met een olie-in-water marinade emulsie waarin 10% tijm aanwezig is of een olie-in-water marinade waarin 1% kaneel aanwezig is (P-waarde<0,0056). Voor alle gemonitorde microbiologische parameters op het kippenvel werden geen significant verschil waargenomen tussen de olie-in-water emulsies waarin 1% EOn aanwezig is en de olie-in-water marinade emulsies waarin 1% EOn aanwezig is (Pwaarde >0,0166).

pag. 30

5.2.2 Kleur- en geurveranderingen tijdens de behandeling

De semi-kwantitatieve evaluatie van de EOn geur voor de behandelde kippenvelstalen wordt weergegeven in tabel 5.2. Naarmate er een hogere concentratie aan EOn gebruikt werd, was deze langer waarneembaar op de behandelde stalen. Het commercieel product had een veel neutralere geur in vergelijking met de gebruikte EOn. Kippenvelstalen die behandeld werden met het commercieel product vertoonden een kleurverandering door de intrinsieke kleur van het commercieel product, zoals afgebeeld in figuur 5.2. Na een opslagtermijn van zes dagen werd er geen kleurafwijkingen waargenomen op de gestockeerde kippenvelstalen.

2

tabel 5.2: Semi-kwantitatieve evaluatie EOn geur op de behandelde kippenvelstalen

Type emulsie Olie-in-water (1%) Olie-in-water marinade (1%) Olie-in-water marinade (10%) Commercieel product

Tijdstip [dag] 1 6 1 6 1 6 1 6

Code 0&B 0&B 0&B 0&B 2&B 2&B 0&B 0&B

5.3 De matrix kippengehakt 5.3.1 Microbiologische parameters

De gemiddelde waargenomen reductie voor de vier gemonitorde microbiologische parameters: aantal coliformen, E. coli, melkzuurbacteriën en gisten & schimmels zijn voorgesteld in figuur 8.9 tot en met figuur 8.12 in de bijlage. Ten opzichte van de blanco werd na één dag behandeling geen significante reductie bekomen van het totaal aantal coliformen (P>0,0125). Het totaal aantal coliformen werd ten opzichte van de blanco, na zes dagen behandeling significant gereduceerd met 3,8 – 4,2 log KVE/g, indien het kippengehakt behandeld werd met een olie-in-water marinade waarin 10% kaneel aanwezig is (P-waarde <0,0125). Na veertien behandeling werd een significante reductie van 5 – 5,5 log KVE/g bekomen ten opzichte van de blanco, indien het kippengehakt behandeld werd met een olie-in-water marinade waarin 10% kaneel aanwezig is (P<0,0125). Na één dag behandeling werden ten opzichte van de marinadebehandeling geen significante reducties waargenomen voor het totaal aantal coliformen (P>0,0166). Ten opzichte van de marinadebehandeling werd het totaal aantal 2

Code 0: Geen waarneming van de EOn geur Code 2: Even sterke EOn geur waarneming in vergelijking met tijdstip 0 Code B: Geen waarneming van bedervende geuren

pag. 31

coliformen na zes dagen behandeling significant gereduceerd met 3,8 – 4,2 log KVE/g, indien het kippengehakt behandeld werd een olie-in-water marinade emulsie waarin 10% kaneel aanwezig is (P-waarde <0,0166). Het totaal aantal coliformen werd na veertien dagen behandeling ten opzichte van de marinadebehandeling significant gereduceerd met 5 – 5,5 log KVE/g, indien de stalen behandeld werden met een olie-in-water marinade emulsie waarin 10% kaneel aanwezig is (P-waarde<0,0166). Het aantal melkzuurbacteriën werd na één dag behandeling niet significant gereduceerd ten opzichte van de blanco en de marinadebehandeling (respectievelijk P-waarde> 0,0125 en P-waarde> 0,0166). Ten opzichte van de blanco werd het aantal melkzuurbacteriën na zes dagen behandeling significant gereduceerd met 2,5 -3,0 log KVE/g, indien het kippengehakt behandeld werd olie-in-water marinade emulsie waarin 10% kaneel aanwezig is. Na veertien dagen werd geen significante reductie meer waargenomen van het aantal melkzuurbacteriën ten opzichte van de blanco (Pwaarde>0,0125). Ten opzichte van de marinadebehandeling werd het aantal melkzuurbacteriën na zes dagen behandeling significant gereduceerd met 2,5 – 3 log KVE/g, indien het kippengehakt behandeld werd met een olie-in-water marinade waarin 10% kaneel aanwezig is (P-waarde <0,0166). Na veertien dagen werden geen significante reducties meer waargenomen van het aantal melkzuurbacteriën ten opzichte van de marinadebehandeling (P-waarde>0,0125). Het aantal gisten en schimmels werd na één dag behandeling ten opzichte van de blanco significant gereduceerd met 0,8 - 1 log KVE/g, indien de stalen behandeld werden met een olie-in-water marinade emulsie waarin 10% kaneel aanwezig is (P-waarde < 0,0125). Na zes dagen behandeling werd het aantal gisten en schimmels significante gereduceerd met 2,5 -3 log KVE/g ten opzichte van de blanco, indien het kippengehakt behandeld werd met een olie-in-water marinade emulsie waarin 10% kaneel aanwezig is (P-waarde<0,0125). Na veertien dagen behadeling werd ten opzichte van de blanco een significante reductie van respectievelijk 0,5 – 1 log KVE/g en 2,5 – 3 log KVE/g bekomen, indien het kippengehakt respectievelijk behandeld werd met olie-in-water marinade emulsie waarin 10% oregano aanwezig is of een olie-in-water marinade emulsie waarin 10% kaneel aanwezig is (beiden P-waarde <0,0125). Ten opzichte van de marinadebehandeling werd na één dag behandeling een significante reductie van 0,8 – 1 log KVE/g bekomen voor gisten en schimmels, indien de stalen behandeld werden met een olie-in-water marinade emulsie waarin 10% kaneel aanwezig is (P<0,0166). Na zes dagen behandeling werd ten opzichte van de marinadebehandeling een significante reductie van 2,5 -3 log KVE/g bekomen, indien de stalen behandeld werden met een oliein-water marinade waarin 10% kaneel aanwezig is (P-waarde <0,0166). Het aantal gisten en schimmels werd ten opzichte van de marinadebehandeling na veertien dagen significant gereduceerd met 2,5 -3 log KVE/g, indien de stalen behandeld werden met een olie-in-water marinade waarin 10% kaneel aanwezig is (P-waarde<0,0166).

pag. 32

Het aantal E.coli bacteriën werd ten opzichte van de blanco significant gereduceerd met 0,1 – 0,3 log KVE/g, indien de stalen behandeld werden met een olie-in-water marinade emulsie waarin 10% kaneel aanwezig is (P-waarde<0,0125). Na zes dagen werd ten opzichte van de blanco een significante reductie bekomen van 0,5 – 0,7 KVE/g, indien het kippengehakt behandeld werd met een olie-in-water marinade emulsie waarin 10% kaneel aanwezig is (P-waarde <0,0125). Het aantal E.coli bacteriën werd na veertien dagen niet meer significante gereduceerd ten opzichte van de blanco (P-waarde>0,0125). Ten opzichte van de marinadebehandeling werd na één dag behandeling het aantal E.coli significant gereduceerd met 0,5 – 1 log KVE/g, indien de stalen behandeld werden met een olie-in-water marinade emulsie waarin 10% kaneel aanwezig is (P-waarde <0,0166). Na zes en veertien dagen behandeling werden het aantal E.coli ten opzichte van de marinadebehandeling niet meer significant gereduceerd (P>0,0166). 5.3.2 Kleur- en geurveranderingen tijdens de behandeling

De semi-kwantitatieve evaluatie van de EOn geur voor de behandelde kippengehaktstalen wordt weergegeven in tabel 5.3. De geur van de gebruikte EOn werd waargenomen tot op de 6de dag. Op dag 6 werd er echter een beginnende rottende geur waargenomen bij de blanco stalen. Deze rottende geur werd bij alle stalen waargenomen op de 14de dag. De blanco en marinadestalen kleurden op de 6de en de 14de dag grijs terwijl de stalen met EOn een geel–groene verkleuring vertonen aan de zijkant van het staal. De verkleuring van de stalen met EOn beperkte zich bij sommige stalen niet meer enkel tot de rand van het staal na een opslagperiode van 14 dagen. Een voorbeeld van de waargenomen verkleuring wordt afgebeeld in figuur 5.3.

3

tabel 5.3: Semi-kwantitatieve evaluatie EOn geur op de behandelde kippengehaktstalen

Type emulsie Olie-in-water marinade (10%)

3

Tijdstip [dag] 1 6 (blanco) 6 (EOn) 14

Code 2&B A 2&B A

Code 2: Even sterke EOn geur waarneming in vergelijking met tijdstip 0 Code A: Waarnemingen van bedervende geuren Code B: Geen waarnemingen van bedervende geuren

pag. 33

figuur 5.3: Verkleuring bij de matrix kippengehakt ( links: situatie zonder kleuring op dag 0, rechts: situatie met geel/groen verkleuring aan de rand op dag 6)

pag. 34

5.4 Discussie Het microbieel karakter van de EOn tegen verschillende pathogenen en bedervende micro-organismen werd reeds onderzocht zoals beschreven in Calo et al. (2015). De samenstelling van de voedingsmatrix inzake vetinhoud, proteïnen, wateractiviteit; pH en enzymen bepalen het resterende reducerend karakter van de EOn (Calo et al., 2015). Dit effect is ook waarneembaar in de praktische uitvoering daar olie-in-water emulsies (bijna) geen significante reducties veroorzaken op de matrices kippenvlees en kippenvel en enkel de olie-in-water marinade emulsie met 10% kaneel een significante reductie teweeg brengt op het kippengehakt. De grootste significante reducties, bij kippenvleesstalen en kippenvelstalen, werden bekomen met behulp van olie-in-water marinade emulsies waarin 10% EOn aanwezig is. Op kippenvlees en kippenvel werden bovendien geen significante verschillen waargenomen tussen de behandelingen met olie-in-water emulsies waarin 1% EOn aanwezig is en olie-in-water marinade emulsies waarin 1% EOn aanwezig is. Een verhoging van de EOn concentratie veroorzaakt voor sommige bacteriënsoorten een significantere reductie maar zorgt ook voor een blijvende waarneming van de typische EOn geur tijdens een opslagperiode van zes dagen. Deze resterende geur kan mogelijks als storend waargenomen worden door de consument. Indien deze geur de consument niet bevalt, zal het product onterecht als slecht en onaangenaam bestempeld worden. Bovendien werd de houdbaarheid van het kippenvlees en kippenvel verlengd daar er geen afwijkende kleurveranderingen waargenomen werden na zes dagen behandeling. De houdbaarheid van het kippengehakt werd niet verlengd door de behandelingen daar afwijkende kleurveranderingen reeds na zes dagen werden waargenomen bij alle stalen. Na een opslagperiode van veertien dagen werd de typische EOn geur op kippengehakt niet meer waargenomen en vervangen door een geur van bedorven vlees. Componenten van EOn worden vandaag reeds gebruikt in verschillende kruidenmengelingen voor het marineren van vleesbereidingen. Het commerciële product Rap Solution is een voorbeeld van een dergelijk product. De werking ervan is echter niet eenduidig te definiëren daar het zowel een stimulatie als een reductie van de gemonitorde bacteriën teweeg brengt na analyse op het kippenvlees en kippenvel. Naast de invloed van de samenstelling van de voedingsmatrix dient er ook rekening gehouden te worden met andere waargenomen problemen tijdens de uitvoering van het praktisch werk. Gedurende de experimentele opzet werden verschillende batches van de voedingsmatrixen gebruikt. De initiële contaminatiegraad van de voedingsmatrices is sterk afhankelijk van het gebruikte gevogelte en de opgetreden contaminaties tijdens de verwerking van de voedingsmiddelen. Met behulp van blanco testen werd er rekening gehouden met de initiële contaminatiegraad van de verschillende batches. Om de verschillende behandelingen te vergelijken met elkaar, werd er gewerkt met de reducties van de verschillende behandelingen ten opzichte van de blanco stalen.

pag. 35

Naast de variaties in de initiële contaminatiegraad werden er ook problemen waargenomen met de stabiliteit van de aangemaakte emulsies. Een optimale antimicrobiële werking zal op industrieel niveau pas bekomen worden indien de emulsies gedurende een lange periode stabiel bewaard kunnen worden. De olie-in-water emulsies, waarin 1% EOn aanwezig is, bleven gedurende 48 uur stabiel indien ze gestockeerd werden bij een temperatuur van 4°C. Bij de olie-in-water marinade emulsies met 1% EOn werd een oproming waargenomen van de tijm emulsie na een stockageperiode van 24 uur bij een temperatuur van 4°C. Bij de olie-in-water marinade emulsies met 10% EOn werd een oproming bekomen na een stockage periode van slechts 3 uur, zoals weergegeven in figuur 5.4. Na 3 uur bedroeg deze oproming voor oregano en tijm 4 ml terwijl dit voor kaneel slechts 2 ml was.

figuur 5.4: Oproming van de 10% olie-in-water marinade emulsies na een stockageperiode van 3 uur ( van links naar rechts de EOn kaneel, tijm en orgeano)

pag. 36

6. Besluit De antimicrobiële werking van de gebruikte EOn is sterk afhankelijk van de samenstelling van de voedingsmatrix alsook de uitgevoerde processen tijdens de verwerking van het vers vlees. De grootste reducties van de aanwezige gemonitorde microflora werden in de meeste gevallen bekomen door de stalen te behandelen met de olie-in-water marinade emulsies waarin 10% tijm, oregano of kaneel aanwezig is. Afhankelijk van de voedingsmatrix: kippenvlees, kippenvel, kippengehakt, kan het totaal aantal coliformen na zes dagen behandeling met respectievelijk 1-2 log KVE/g, 2-3 log KVE/g en 4-5,5 log KVE/g gereduceerd worden. Op de matrices kippenvel en kippengehakt werd de reductie enkel bekomen na het gebruik van 10 % kaneel. Het aantal melkzuurbacteriën kan na zes dagen behandeling met respectievelijk 0,5-2 log KVE/g, 1-2,8 log KVE/g en 2,5-3 log KVE/g gereduceerd worden. Op de matrix kippenvlees werd de reductie enkel bekomen na het gebruik van 10% tijm en voor de matrix kippengehakt was dit na het gebruik van 10% kaneel. De aanwezige gisten en schimmels werden na zes dagen behandeling met respectievelijk 0,5-2,5 log KVE/g, 1-1,5 log KVE/g en 2,5-3 log KVE/g gereduceerd. Op de matrix kippengehakt werd deze reductie enkel waargenomen na een behandeling met 10% kaneel. Het aantal E.coli bacteriën werd na zes dagen behandeling met respectievelijk 0,4-0,7 log KVE/g, 1-1,5 log KVE/g en 0,5-1 log KVE/g gereduceerd. Op de matrix kippenvlees werd deze reductie enkel bekomen na een behandeling met olie-inwater marinade emulsies waarin slechts 1% kaneel, 1% oregano of 1% tijm aanwezig is. Voor de matrix kippenvel werd de beschreven reductie enkel bekomen na een behandeling met 10% kaneel of 10% tijm terwijl dit enkel 10% kaneel was voor de matrix kippengehakt. Toekomstige onderzoeken kunnen uitgevoerd worden om de onstabiele EOn emulsies te stabiliseren. Hierbij kunnen zaken zoals: de invloed van pH op de EOn emulsies, het variëren van de verhouding tussen de emulgator Tween 80 en de essentiële olie, het toevoegen van natuurlijke oliën, het toevoegen van andere organische zuren of variaties in het zoutgehalte onderzocht worden opdat een optimale stabilisatie van de EOn emulsies bekomen kan worden. Volgens Calo et al. (2015) kan de toevoeging van organische zuren en een variatie in de zoutconcentratie voor een stabilisatie zorgen van bepaalde olie-in-water emulsies. De stabilisatie van de gebruikte emulsies is noodzakelijk opdat deze conserveringstechniek geïmplementeerd kan worden in de voedingsindustrie. Daarnaast zouden toekomstige onderzoeken ook kunnen testen of hetzelfde reducerend vermogen bekomen wordt op andere matrices dan de geteste kippenmatrix. Volgens Calo et al. (2015) zal het reducerend vermogen van de EOn emulsies sterk beïnvloedt worden door de samenstelling van de voedingsmatrix. In het huidig onderzoek werd het effect van de gebruikte EOn emulsies getest op stalen die bewaard werden onder normale atmosfeer. In toekomstige onderzoeken zou onderzocht kunnen worden wat er gebeurt indien deze techniek gecombineerd wordt met andere conserveringstechnieken. Het gecombineerd effect van bijvoorbeeld EOn en MAP wordt beschreven in verschillende bronnen zoals Cleveland et al. (2001), Min et al. (2007), Burt (2004) en Nair et al. (2015). Hierdoor zal een ruimer beeld verkregen worden

pag. 37

over de toepassingsmogelijkheden van deze conserveringstechniek en de antimicrobiële werking van de EOn emulsies in verschillende omstandigheden.

Het gebruik van EOn is toegestaan volgens het wettelijk kader dat omschreven wordt in Europese wetgeving inzake aroma’s en bepaalde voedselingrediënten met aromatiserende eigenschappen voor gebruik in levensmiddelen (EG Nr. 1334/2008) (Demyttenaere, 2015). De extracten van sommige EOn bevatten echter verschillende bestandsdelen die niet als aroma toegevoegd mogen worden aan voedingsmiddelen of waarbij een maximum grens dient gerespecteerd te worden (Demyttenaere, 2015). Bij de implementatie van de EOn als conserveringsmiddel zou er dus een uitgebreid veiligheidsen metabolisch onderzoek moeten plaatsvinden per gebruikte component. Dit is echter een heel dure en complexe procedure waardoor het gebruik van kruiden of specerijen in bepaalde omstandigheden een economischere oplossing is indien dezelfde antimicrobiële werking verkregen wordt. Bij de implementatie van het systeem dient er rekening gehouden te worden met de huidige Europese wetgeving (Burt, 2004; Barry-Ryan & Bourke, 2012).

pag. 38

7. Literatuurlijst AGUSTINI, T. W., SUZUKI, M., SUZUKI, T., HAGIWARA, T., OKOUCHI, S. & TAKAI, R. (2001). The possibility of using oxidation-reduction potential to evaluate fish freshness. Fisheries science, 67 (3), 547-549. AHVENAINEN, R. (ed.) (2005). Novel food packaging techniques, Woodhead Publishing, Cambridge, England, 590 p. (ISBN: 978-1-85573-675-7). ALVARADO, C. & MCKEE, S. (2007). Marination to improve functional properties and safety of poultry meat. The Journal of Applied Poultry Research, 16 (1), 113-120. APPENDINI, P. & HOTCHKISS, J. H. (2002). Review of antimicrobial food packaging. Innovative Food Science & Emerging Technologies, 3 (2), 113-126. ARRITT, F., EIFERT, J., PIERSON, M. & SUMNER, S. (2002). Efficacy of antimicrobials against Campylobacter jejuni on chicken breast skin. The Journal of Applied Poultry Research, 11 (4), 358-366. BARRY-RYAN, C. & BOURKE, P. (2012.) Essential Oils for the Treatment of Fruit and Vegetables. In: Decontamination of Fresh and Minimally Processed Produce. GOMEZ-LOPEZ, V. M. (ed.) Wiley-Blackwell, Oxford, p. 225-246. (ISBN 978-11182-2918-7). BEALES, N. (2004). Adaptation of Microorganisms to Cold Temperatures, Weak Acid Preservatives, Low pH, and Osmotic Stress: A Review. Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety, 3 (1), 1-20. BJÖRKROTH, J. (2005). Microbiological ecology of marinated meat products. Meat Science, 70 (3), 477-480. BLACK, J. L. & JACZYNSKI, J. (2008). Effect of water activity on the inactivation kinetics of Escherichia coli O157:H7 by electron beam in ground beef, chicken breast meat, and trout fillets. International Journal of Food Science & Technology, 43 (4), 579-586. BOARD, R. (1995.) Natural antimicrobials from animals. In: New methods of food preservation. GOULD, G. W. (ed.) Chapman & Hall, London, UK, p. 40-57. (ISBN 978-1-4613-5876-3). BÖHME, K., BARROS-VELÁZQUEZ, J., CALO-MATA, P. & AUBOURG, S. (2014.) Antibacterial, Antiviral and Antifungal Activity of Essential Oils: Mechanisms and Applications. In: Antimicrobial Compounds. VILLA, T. G. & VEIGA-CRESPO, P. (Eds.). Springer Berlin Heidelberg, p. 51-81. (ISBN 978-3-642-40443-6). BORCH, E., KANT-MUERMANS, M.-L. & BLIXT, Y. (1996). Bacterial spoilage of meat and cured meat products. International Journal of Food Microbiology, 33 (1), 103120. BURT, S. (2004). Essential oils: their antibacterial properties and potential applications in foods—a review. International Journal of Food Microbiology, 94 (3), 223-253. CALO, J. R., CRANDALL, P. G., O'BRYAN, C. A. & RICKE, S. C. (2015). Essential oils as antimicrobials in food systems – A review. Food Control, 54 (0), 111-119. CARLOS, A. M. A. & HARRISON, M. A. (1999). Inhibition of Selected Microorganisms in Marinated Chicken by Pimento Leaf Oil and Clove Oleoresin. The Journal of Applied Poultry Research, 8 (1), 100-109. CHANDRA, R. K. (1997). Food hypersensitivity and allergic disease: a selective review. The American journal of clinical nutrition, 66 (2), 526S-529S. CHOULIARA, E., BADEKA, A., SAVVAIDIS, I. & KONTOMINAS, M. (2008). Combined effect of irradiation and modified atmosphere packaging on shelf-life extension of chicken breast meat: microbiological, chemical and sensory changes. European Food Research and Technology, 226 (4), 877-888.

pag. 39

CHURCH, N. (1994). Developments in modified-atmosphere packaging and related technologies. Trends in Food Science & Technology, 5 (11), 345-352. CLEVELAND, J., MONTVILLE, T. J., NES, I. F. & CHIKINDAS, M. L. (2001). Bacteriocins: safe, natural antimicrobials for food preservation. International Journal of Food Microbiology, 71 (1), 1-20. DEL NOBILE, M. A., CONTE, A., MASTROMATTEO, M. & MASTROMATTEO, M. (2012.) Modified Atmosphere Packaging. In: Decontamination of Fresh and Minimally Processed Produce. GOMEZ-LOPEZ, V. M. (ed.) Wiley-Blackwell, Oxford, p. 451467. (ISBN 978-11-182-2918-7). DEMYTTENAERE, J. C. (2015). The European Flavouring regulation and how to deal with “Restricted Substances”. Natural Volatiles & Essential Oils, 2 (1), 1-10. DEVLIEGHERE, F. & NOSEDA, B. (2010). Microbieel bederf: een kwestie van kiemgetallen? Voedingsmiddelentechnologie, 9 (2010-9), 18-19. DIJK, R. & GROOTENHUIS, A. (Eds.) (2003). Microbiologie van voedingsmiddelen : methoden, principes en criteria, Keesing Noordervliet, Houten, 623 p. (ISBN 97890-720-7265-8). DOULGERAKI, A. I., ERCOLINI, D., VILLANI, F. & NYCHAS, G.-J. E. (2012). Spoilage microbiota associated to the storage of raw meat in different conditions. International Journal of Food Microbiology, 157 (2), 130-141. EMBORG, J., LAURSEN, B. G., RATHJEN, T. & DALGAARD, P. (2002). Microbial spoilage and formation of biogenic amines in fresh and thawed modified atmosphere-packed salmon (Salmo salar) at 2°C. Journal of Applied Microbiology, 92 (4), 790-799. EUROPESE UNIE (2004.) VERORDENING (EG) Nr. 853/2004 VAN HET EUROPEES PARLEMENT EN DE RAAD houdende vaststelling van specifieke hygiënevoorschriften voor levensmiddelen van dierlijke oorsprong Europees parlement en de raad. FAN, X. (2012.) Ionizing Radiation. In: Decontamination of Fresh and Minimally Processed Produce. GOMEZ-LOPEZ, V. M. (ed.) Wiley-Blackwell, Oxford, p. 379405. (ISBN 978-11-182-2918-7). FRATIANNI, F., DE MARTINO, L., MELONE, A., DE FEO, V., COPPOLA, R. & NAZZARO, F. (2010). Preservation of Chicken Breast Meat Treated with Thyme and Balm Essential Oils. Journal of Food Science, 75 (8), M528-M535. GARDNER, L. K. & LAWRENCE, G. D. (1993). Benzene production from decarboxylation of benzoic acid in the presence of ascorbic acid and a transition-metal catalyst. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 41 (5), 693-695. GHALY, A. E., DAVE, D., BUDGE, S. & BROOKS, M. (2010). Fish spoilage mechanisms and preservation techniques: review. American Journal of Applied Sciences, 7 (7), 859-877. GIBIS, M. (2007). Effect of oil marinades with garlic, onion, and lemon juice on the formation of heterocyclic aromatic amines in fried beef patties. Journal of agricultural and food chemistry, 55 (25), 10240-10247. GORRIS, L. G. M. & PEPPELENBOS, H. W. (1992). Modified atmosphere and vacuum packaging to extend the shelf life of respiring food products. HortTechnology, 2 (3), 303-309. GOULD, G. W. (1995.), Springer Science & Business Media. GRAM, L. & DALGAARD, P. (2002). Fish spoilage bacteria – problems and solutions. Current Opinion in Biotechnology, 13 (3), 262-266. GRAM, L., RAVN, L., RASCH, M., BRUHN, J. B., CHRISTENSEN, A. B. & GIVSKOV, M. (2002). Food spoilage—interactions between food spoilage bacteria. International Journal of Food Microbiology, 78 (1–2), 79-97. HAMMER, K. A., CARSON, C. F. & RILEY, T. V. (1999). Antimicrobial activity of essential oils and other plant extracts. Journal of Applied Microbiology, 86 (6), 985-990.

pag. 40

HAO, Y. Y., BRACKETT, R. E. & DOYLE, M. P. (1998). Efficacy of plant extracts in inhibitingAeromonas hydrophilaandListeria monocytogenesin refrigerated, cooked poultry. Food Microbiology, 15 (4), 367-378. HILL, C. (1995.) Bacteriocins: natural antimicrobials from microorganisms. In: New methods of food preservation. GOULD, G. W. (ed.) Chapman & Hall, London,UK, p. 22-38. (ISBN 978-1-4613-5876-3). HOBBS B.C., R. D. (ed.) (1987). Food poisoning and food hygiene, Edward Arnold, London, 372 p. (372). HUIS IN'T VELD, J. H. J. (1996). Microbial and biochemical spoilage of foods: an overview. International Journal of Food Microbiology, 33 (1), 1-18. JAYASENA, D. D. & JO, C. (2013). Essential oils as potential antimicrobial agents in meat and meat products: A review. Trends in Food Science & Technology, 34 (2), 96108. JIMÉNEZ, S. M., SALSI, M. S., TIBURZI, M. C., RAFAGHELLI, R. C. & PIROVANI, M. E. (1999). Combined use of acetic acid treatment and modified atmosphere packaging for extending the shelf-life of chilled chicken breast portions. Journal of Applied Microbiology, 87 (3), 339-344. JIMÉNEZ, S. M., SALSI, M. S., TIBURZI, M. C., RAFAGHELLI, R. C., TESSI, M. A. & COUTAZ, V. R. (1997). Spoilage microflora in fresh chicken breast stored at 4 °C : influence of packaging methods. Journal of Applied Microbiology, 83 (5), 613-618. KARGIOTOU, C., KATSANIDIS, E., RHOADES, J., KONTOMINAS, M. & KOUTSOUMANIS, K. (2011). Efficacies of soy sauce and wine base marinades for controlling spoilage of raw beef. Food Microbiology, 28 (1), 158-163. KIM, Y. J., JIN, S. K., PARK, W. Y., KIM, B. W., JOO, S. T. & YANG, H. S. (2010). THE EFFECT OF GARLIC OR ONION MARINADE ON THE LIPID OXIDATION AND MEAT QUALITY OF PORK DURING COLD STORAGE. Journal of Food Quality, 33, 171-185. KLEIN, G., RÜBEN, C. & UPMANN, M. (2013). Antimicrobial Activity of Essential Oil Components Against Potential Food Spoilage Microorganisms. Current Microbiology, 67 (2), 200-208. MARIANSKI, S. & MARIANSKI, A. (Eds.) (2013). Home Canning Meat, Poultry, Fish and Vegetables, Bookmagic, LLC, United States of America, 262 p. (ISBN 978-09-8369737-4). MCKENNA, D. R., STRACHAN, D. S., MILLER, R. K., ACUFF, G. R. & SAVELL, J. W. (2003). CRANBEFCRY JUICE MARINADE IMPROVES SENSORY AND MICROBIOLOGICAL PROPERTIES OF VACUUM-PACKAGED LAMB CHOPS. Journal of Muscle Foods, 14 (3), 207-220. MCLAUCHLIN, J. (2007.) Life and death of micro-organisms in food, spoilage and preservation. In: Hobbs' food poisoning and food hygiene. MCLAUCHLIN, J., LITTLE, C. L., C. HOBBS, B. & ROBERTS, D. (Eds.). Hodder Arnold, London, p. 41-58. (ISBN 978-03-409-0530-2). MCMILLIN, K. W. (2008). Where is MAP Going? A review and future potential of modified atmosphere packaging for meat. Meat Science, 80 (1), 43-65. MILLS, J., DONNISON, A. & BRIGHTWELL, G. (2014). Factors affecting microbial spoilage and shelf-life of chilled vacuum-packed lamb transported to distant markets: A review. Meat Science, 98 (1), 71-80. MIN, J., LEE, S., JANG, A., JO, C. & LEE, M. (2007). Control of microorganisms and reduction of biogenic amines in chicken breast and thigh by irradiation and organic acids. Poultry science, 86 (9), 2034-2041. MODI, H. A. (ed.) (2009). Microbial spoilage of foods, Aavishkar Publishers, Distributors, Jaipur, India, 178 p. (ISBN 978-81-791-0285-5). MOORE, D. S. & MCCABE, G. P. (Eds.) (2005). Statistiek in de praktijk, Sdu Uitgevers, Den Haag, p. (ISBN 978-90-395-2360-5). NAIR, D. V., KIESS, A., NANNAPANENI, R., SCHILLING, W. & SHARMA, C. S. (2015). The combined efficacy of carvacrol and modified atmosphere packaging on the

pag. 41

survival of Salmonella, Campylobacter jejuni and lactic acid bacteria on Turkey breast cutlets. Food Microbiology, 49, 134-141. NAVEENA, B. M., MUTHUKUMAR, M., SEN, A. R., BABJI, Y. & MURTHY, T. R. K. (2006). Improvement of shelf-life of buffalo meat using lactic acid, clove oil and vitamin C during retail display. Meat Science, 74 (2), 409-415. NYCHAS, G.-J. E., SKANDAMIS, P. N., TASSOU, C. C. & KOUTSOUMANIS, K. P. (2008). Meat spoilage during distribution. Meat Science, 78 (1–2), 77-89. NYCHAS, G. J. E. (1995.) Natural antimicrobials from plants. In: New Methods of Food Preservation. GOULD, G. W. (ed.) Springer US, London, UK, p. 58-89. (ISBN 9781-4613-5876-3). OUATTARA, B., SABATO, S. F. & LACROIX, M. (2001). Combined effect of antimicrobial coating and gamma irradiation on shelf life extension of pre-cooked shrimp (Penaeus spp.). International Journal of Food Microbiology, 68 (1–2), 1-9. QUINTAVALLA, S. & VICINI, L. (2002). Antimicrobial food packaging in meat industry. Meat Science, 62 (3), 373-380. RAVISHANKAR, S., ZHU, L., OLSEN, C. W., MCHUGH, T. H. & FRIEDMAN, M. (2009). Edible Apple Film Wraps Containing Plant Antimicrobials Inactivate Foodborne Pathogens on Meat and Poultry Products. Journal of Food Science, 74 (8), M440M445. RIDDERBOS, G. (ed.) (2006). Levensmiddelenhygiëne, Reed Business: Elsevier gezondheidszorg, Maarssen, 328 p. (ISBN 978-90-352-285-97). ROHDE, A., HAMMERL, J. A., APPEL, B., DIECKMANN, R. & AL DAHOUK, S. (2015). Sampling and Homogenization Strategies Significantly Influence the Detection of Foodborne Pathogens in Meat. BioMed Research International, 2015. SHARMA, C., ATES, A., JOSEPH, P., NANNAPANENI, R. & KIESS, A. (2013). Reduction of Salmonella in skinless chicken breast fillets by lauric arginate surface application. Poultry science, 92 (5), 1419-1424. SIRIPONGVUTIKORN, S., PENGSENG, N., AYUSUK, S. & USAWAKESMANEE, W. (2008). Development of green curry paste marinade for white shrimp (Litopenaeus vannamei). Sonklanakarin Journal of Science and Technology, 30 (1), 35. SIVERTSVIK, M., JEKSRUD, W. K. & ROSNES, J. T. (2002). A review of modified atmosphere packaging of fish and fishery products – significance of microbial growth, activities and safety. International Journal of Food Science & Technology, 37 (2), 107-127. SKANDAMIS, P. & NYCHAS, G. J. (2001). Effect of oregano essential oil on microbiological and physico‐chemical attributes of minced meat stored in air and modified atmospheres. Journal of Applied Microbiology, 91 (6), 1011-1022. SMAOUI, S., HLIMA, H. B., SALAH, R. B. & GHORBEL, R. (2013). Effects of sodium lactate and lactic acid on chemical, microbiological and sensory characteristics of marinated chicken. African Journal of Biotechnology, 10 (54), 11317-11326. SOULTOS, N., TZIKAS, Z., CHRISTAKI, E., PAPAGEORGIOU, K. & STERIS, V. (2009). The effect of dietary oregano essential oil on microbial growth of rabbit carcasses during refrigerated storage. Meat Science, 81 (3), 474-478. TAPIA, M. S. & WELTI-CHANES, J. (2012.) Hurdle Technology Principles Applied in Decontamination of Whole and Fresh-Cut Produce. In: Decontamination of Fresh and Minimally Processed Produce. GOMEZ-LOPEZ, V. M. (ed.) Wiley-Blackwell, Oxford, p. 417-449. (ISBN 978-11-182-2918-7). TSIGARIDA, E., SKANDAMIS, P. & NYCHAS, G. J. E. (2000). Behaviour of Listeria monocytogenes and autochthonous flora on meat stored under aerobic, vacuum and modified atmosphere packaging conditions with or without the presence of oregano essential oil at 5 °C. Journal of Applied Microbiology, 89 (6), 901-909. TZORTZAKIS, N. G. (2009). Impact of cinnamon oil-enrichment on microbial spoilage of fresh produce. Innovative Food Science & Emerging Technologies, 10 (1), 97-102. VYNCKE, W. (1999). Aspecten van de kwaliteitsbepaling van vis. Ministerie van middenstand en landbouw - departement zeevisserij, 252, 1-38.

pag. 42

WEISS, N. A. (ed.) (2012). Introductory Statistics: 9th edition, Pearson education, Boston, 759 p. (ISBN 978-03-216-9122-4). YOON, K. (2002). Texture and microstructure properties of frozen chicken breasts pretreated with salt and phosphate solutions. Poultry science, 81 (12), 1910-1915. ZHENG, M., TOLEDO, R. & WICKER, L. (1999). EFFECT OF PHOSPHATE AND PECTIN ON QUALITY AND SHELF-LIFE OF MARINATED CHICKEN BREAST. Journal of Food Quality, 22 (5), 553-564.

pag. 43

8. Bijlagen 8.1 De matrix kippenvlees

figuur 8.1: gemiddelde reductie van totaal aantal coliformen op kippenvlees

figuur 8.2: gemiddelde reductie van E.coli op kippenvlees

pag. 44

figuur 8.3: gemiddelde reductie van melkzuurbacteriën op kippenvlees

figuur 8.4: gemiddelde reductie van gisten en schimmels op kippenvlees

pag. 45

8.2 De matrix kippenvel

figuur 8.5: gemiddelde reductie van totaal aantal coliformen op kippenvel

figuur 8.6: gemiddelde reductie van E.coli op kippenvel

pag. 46

figuur 8.7: gemiddelde reductie van melkzuurbacteriën op kippenvel

figuur 8.8: gemiddelde reductie van gisten en schimmels op kippenvel

pag. 47

8.3 De matrix kippengehakt

figuur 8.9: gemiddelde reductie van totaal aantal coliformen op kippengehakt

figuur 8.10: gemiddelde reductie van E.coli op kippengehakt

pag. 48

figuur 8.11: gemiddelde reductie van melkzuurbacteriën op kippengehakt

figuur 8.12: gemiddelde reductie van gisten en schimmels op kippengehakt

pag. 49