Eindrapportage REVO project

Eindrapportage REVO project Aanvraagnummer: Projecttitel:

Naam penvoerder: Verslagperiode: Contactpersoon: Telefoon: E-mail:

4100004144276 Ontwikkeling van een revolutionaire voedingsbodem met langdurige, zelfregulerende nutriëntenafgifte voor gebruik in plantweefselkweek – REVO project Atmosphere Controlling Technology B.V. (ACT) - verantwoordelijke voor de informatie-inhoud van dit rapport. 1 september 2010 t/m 31 oktober 2012 Dr. Dick van Velzen 071-5283967 [email protected]

Dit onderzoek is mede mogelijk gemaakt dankzij een subsidie van het Programma voor Plattelandsontwikkeling 2007-2013 voor Nederland (POP). Het ministerie van Economische Zaken, Landbouw en Innovatie is de beheersautoriteit voor het POP. Het POP wordt deels gefinancierd vanuit het Europese Landbouwfonds voor Plattelandsontwikkeling (ELFPO). “Europees Landbouwfonds voor Plattelandsontwikkeling: Europa investeert in zijn platteland".

http://ec.europa.eu/agriculture/index_nl.htm

1

1.

Projectvoortgang

Fase

Taak

Periode* Omschrijving

Uitvoerder(s)

Status

1

1.1 1.2

Q1 Q1 Q1-Q2

ACT, LT ACT,RUL, PhytoGeniX, Hukseflux ACT, LT, RUL

klaar klaar

1.3

Literatuuronderzoek Simulatie studie verbruik/release relatie in tijd en in relatie tot temperatuur Inventarisatie uitgangsweefsel distributie in tulpbol

2.1

Q2-Q4

2.2

Q4-Q5

2.3

Q4-Q5

ACT, LT, PhytoGeniX, gestopt Hukseflux ACT, LT, Duchefa, niet gestart PhytoGeniX, Hukseflux ACT, OWS, Rodenburg gestopt

3.1

Q6-Q7

Metingen suikerverbruik en -aanvoer tulp uitgangsweefsel Metingen suikerverbruik – aanvoer tulpweefsel onder stimulatie Certificatie biodegradatie en nontoxiciteit Analyse massaproductie methodes

3.2

Q7-Q8

3.3

Q8-Q11

4.1

Q1-Q12

4.2

Q11

4.3

Q11-Q12

2

3

4

ACT, Wacker, Rodenburg, Hukseflux Analyse sterilisatieen steriele ACT, Wacker, verpakkingsmethodes Rodenburg, Duchefa, Syngenta Praktijktesten met REVO LT, ACT voedingsbodems uit massaproductie in praktijkopstellingen met representatieve soorten tulpen Opstellen, indienen en afwachten ACT, toekenning octrooiaanvraag PCT Vriesendorp &Gaade Evaluatie werking proefproductie REVO ACT, LT, Duchefa, voedingsbodem bij drie bestaande Syngenta klanten van Duchefa Opstellen website en publicaties, ACT, LT, Duchefa houden van presentaties, presentatie via beursstands, plaatsen advertorials

*uitgedrukt in kwartalen vanaf 1 september 2010.

2

klaar

niet gestart klaar

niet gestart

gestopt gestopt

Afgerond (in beperktere vorm)

2. Evaluatie van de mate waarin de activiteiten hebben bijgedragen aan de doelstelling Doelstelling van het REVO project is middels een serie praktijkproeven aantonen dat de REVO voedingsbodem in zowel technisch als economisch opzicht beter werkt bij langdurige weefselkweek van planten dan de huidige agar voedingsbodem. Hieronder zijn per taak de belangrijkste resultaten aangegeven inclusief een evaluatie van de mate waarin ze hebben bijgedragen aan de projectdoelstelling. Taak 1.1: Literatuuronderzoek Het literatuuronderzoek is uitgevoerd conform planning en de bestaande kennis met betrekking tot biopolymeren en weefselkweek van tulpen is geactualiseerd. In deze taak opgedane kennis is ingezet bij het werk in de volgende taken en heeft daarmee bijgedragen aan het realiseren van de doelstelling. Taak 1.2: Simulatie studie verbruik/release relatie in tijd en in relatie tot temperatuur Deze studie is succesvol uitgevoerd. De release eigenschappen van suikers (zowel direct ingesloten suikers als vanuit hydrolyse ontstane mono- en disachariden) zijn onderzocht in verschillende voedingsbodem matrixen waarbij de samenstelling varieerde in de hoeveelheden zetmeel, suikers en elektrolyten. Na opstellen van de werkzame verhoudingen van de matrix massa en de in te sluiten stoffen in relatie tot de gewenste tijdsduur van afgifte van qua osmolariteit wenselijke hoeveelheden mono- en disachariden, zijn in simulaties zowel de release snelheid als de maximale afgifte duur van suikers in relatie tot matrix massa en de verhouding oppervlakte:inhoud onderzocht. Deze bleken sterk modelmatig te definiëren en in hoge mate reproduceerbaar te zijn. Vanuit een aantal variabelen is de meest algemeen bruikbare werkformulering vastgesteld. In een daaropvolgende serie korte experimenten is verbruik door plantgoed gesimuleerd om het effect van lager wordende in plaats van stijgende suikerconcentraties te onderzoeken. De meetbare versnelling van de hydrolyse bleek hierbij van een grootte te zijn die door beperkte aanpassingen aan de samenstelling van de matrix – zetmeel – suiker combinatie te ondervangen bleek en daarnaast zijn op deze wijze verschillende werkzaamheidsduren te definiëren. De doelstelling om de verlengde afgifte van kleine suikermoleculen, bij veilig (door de plantjes verdraagbare concentraties suiker) laag blijvende maximale concentratie, te halen is binnen deze serie experimenten op zichzelf reeds betrouwbaar aangetoond. De kennis die opgedaan is in deze taak is noodzakelijk voor het ontwerp van de REVO voedingsbodem en draagt daarom in belangrijke mate bij aan de doelstelling. Taak 1.3: Inventarisatie uitgangsweefsel distributie in tulpbol De belangrijkste bevindingen zijn: • De beste periode voor samplen van uitgangsmateriaal uit het bolbodemweefsel is in de periode eind december tot eind januari na koelingsinductie van de bloeiontwikkeling wegens de in die periode maximaal actieve expansie van het blasteemweefsel op beperkte en voorspelbare locaties in de bol; • De optimale wijze van samplen is op basis van 1x1x1 mm blokjes aan de hand van de lichtbreking;

3

•

• •

De hoogste opbrengst aan stamcellen wordt verkregen na 2-3 weken re-activatie en beginnende ontwikkeling van wortel en (bijstelen) aanleg van de bol na de koude stimulatie; Celdifferentiatie vanuit de stamcellen wordt het best gestimuleerd door een combinatie van lage suikergehaltes en GABA behandeling. Aan de hand hiervan, en na controle door systematisch bemonsteren van diverse, onderling zo sterk mogelijk verschillende rassen / cultivars, is voor latere toepassing op bedrijfsschaal, een definitief bemonsteringsprotocol vastgelegd.

De kennis die opgedaan is in deze taak was een belangrijk onderdeel voor de opzet van de praktijkproeven die nodig zijn om de werking van de REVO voedingsbodem mee aan te tonen. Deze taak heeft daarom een belangrijke bijdrage geleverd aan de doelstelling. Taak 2.1: Metingen suikerverbruik en -aanvoer tulp uitgangsweefsel Er is binnen dit project gestart met groeiproeven op de REVO voedingsbodem om de suikerafgifte onder praktijkcondities te kunnen onderzoeken. De gemeten suiker gehalten in de vloeibare medium fasen lijken tot op heden de gewenste kinetiek van afgifte door de REVO te bevestigen. De analyse van het medium toont geen opvallende afwijkende stoffen of verschillen in concentratie ervan aan bij vergelijk van het supernatant boven REVO met het supernatant boven agar. De suikerafgifte in de groeistadia met het gewenste verlaagde suikergehalte is een technisch knelpunt gebleken. In samenwerking met Rodenburg en de firma Syngenta, als zijnde representatief voor een grote eindgebruiker met eigen sterilisatie faciliteiten, is hiervoor een nieuwe matrix geformuleerd. Hier kwam echter een nieuw knelpunt naar voren; namelijk dat deze matrix met behoud van structuur, moeilijk bleek te steriliseren met behulp van autoclavering / hoge druk / stoom / temp 120 gr C. Er is daarom gekozen voor verdere exploratie van het gebruik van gammastraling in het kader van een toekomstige opschaling naar commerciële productie. Hoewel dit eigenlijk onderdeel is van taak 3.2 dient dit toch eerst succesvol afgerond te worden alvorens de werkzaamheden binnen deze taak 2.1. te kunnen hervatten. Gezien de uitkomst van taak 3.2 is deze taak vroegtijdig stopgezet. Toch hebben de eerste groeiproeven een duidelijke indicatie gegeven dat de REVO voedingbodem voor een bepaald suikerafgiftebereik in technisch opzicht vergelijkbare hoeveelheden voedingsstoffen ter beschikking stelt van de erop opgroeiende plant. De maximaal tolereerbare concentraties en osmolariteit worden niet overschreden en de vloeistof concentraties aan vrije suikers dalen, ondanks variabel verbruik door de plantmassa, niet beneden kritische waarden. Er treedt hierbij, modelmatig gezien, eerder een bufferwerking van de REVO massa op het gehalte aan vrije suikers in de voedingsoplossing op. Dit komt waarschijnlijk doordat de hydrolyse snelheid van zetmelen mede afhankelijk is van de concentratie van vrije – nog ongebruikte – suikers in de oplossing. Hierdoor werkt de REVO bodem intrinsiek op zijn minst gelijk, maar in wezen beter dan de agar voedingsbodem in termen van (korte termijn) afgifte van voedingsstoffen aan de plant. Hiermee is een deel van de technische werking van de REVO voedingsbodem aangetoond. Helaas zijn door de sterilisatie problemen voor lange termijn toepassing (hetgeen als winst zou moeten opleveren het niet meer hoeven “bijvullen” van de kweekbakken) in absolute zin de vergelijkingsstudies met de agar bodem niet uitgevoerd en staat in dit opzicht er nog onderzoek open. 4

De bijdrage aan de projectdoelstelling is beperkt, omdat een breder suikerafgiftebereik onderzocht en gevalideerd zou moeten worden alvorens een conclusie getrokken kan worden over de technische werking en het economisch perspectief. Taak 2.2: Metingen suikerverbruik – aanvoer tulpweefsel onder stimulatie Deze taak is een logisch vervolg op taak 2.1. Aangezien taak 2.1 niet afgemaakt is, is deze taak niet uitgevoerd. Taak 2.3: Certificatie biodegradatie en non-toxiciteit De eerste besprekingen over het onderzoeken van de biodegradeerbaarheid van de (afgewerkte) REVO zijn bij OWS gevoerd conform planning. Na de “no go” beslissing begin 2012 naar aanleiding van de uitkomsten van taak 3.2 is deze taak niet verder voortgezet. Deze taak heeft derhalve niet bijgedragen aan de doelstelling. Taak 3.1: Analyse massaproductie methodes Deze taak stond gepland voor medio 2012 en is conform het laatst goedgekeurde wijzigingsverzoek niet gestart, wegens tegenvallende resultaten in taak 3.2. Taak 3.2: Analyse sterilisatie- en steriele verpakkingsmethodes Voor het onderzoek naar de optimalisatie van het sterilisatieproces van de voedingsbodemmassa’s is een protocol geschreven dat voorzag in vergelijking van droog verhitten en langdurig met hoge Grey waardes gamma bestralen van de verpakte voedingsbodemmassa. In dit onderzoek wordt ook de effectiviteit van bestraling bij diverse verpakkingsvormen van de gebruiksklare tabletten (1-8 laags) onderzocht. Deze analyse is conform projectplan uitbesteed aan het bedrijf PhytoGeniX. De belangrijkste conclusies van de analyse zijn: 1. Sterilisatie na de fabricage van de REVO massa is niet mogelijk gebleken behalve dan met bestraling (gamma straling) van een sterkte en een golflengte spreiding die in Nederland slechts bij enkele experimentele centra beschikbaar is. Commerciële sterilisatie apparatuur kan een bijna vergelijkbaar resultaat bereiken, maar dan dient per unit van de REVO plaat de bestralingstijd boven 30 minuten uit te komen en kan de plaatmassa vooralsnog, zonder verder te investeren in een geheel nieuw geconcipeerde opstelling (waarvoor verder vooralsnog geen commerciële toepassingen denkbaar zijn), slechts in enkelvoudige dikte worden verwerkt. Dit is vanuit bedrijfseconomisch perspectief een onacceptabel gegeven. 2. Farmaceutisch steriele productie van de REVO plaatmassa door gebruik te maken van steriele uitgangscomponenten is theoretisch mogelijk en praktisch uitvoerbaar met bestaande technologie. Helaas zijn voor de voorziene omzet van de REVO voedingsbodem de aanloopkosten hiervoor te hoog (> € 3.000.000) en is de bouw van een dergelijke productie unit gebonden aan een aantal voorzieningseisen die op het gebruikelijke bedrijfsterrein niet gerealiseerd kunnen worden. Uitbesteding van dit werk aan een farmaceutisch bedrijf is onderzocht, maar zou leiden tot een veel te hoge kostprijs per REVO voedingsbodem (>€ 9 per stuk), o.a. door additionele verpakking en transportkosten. Als onderdeel van het onderzoek naar het al of niet bereikbaar zijn / bereikt zijn van steriliteit (ook op langere termijn) zijn grotere series lange-termijn kweken met gestandaardiseerd microplantmateriaal met bekende steriliteit uitgevoerd. Hierbij zijn naast de zaken rond steriliteit, intrinsiek ook de eigenschappen en performance van de REVO voedingsbodem op lange termijn onderzocht bij toenemende plantmassa en in verbruiksbehoefte veranderende plantendelen. Ook bij incubaties van 8 weken is hierbij 5

bij herhaling geen sprake geweest van tussentijdse of vroegtijdige “uitputting” – meer dan voor de groeiende plantmassa verdraagbare verlagingen van het vrije suikergehalte opgetreden. Intrinsiek is hiermee, ondanks de infectieproblematiek, de werkzaamheid van het volledige concept, met name ook de opheffing van de noodzaak voor tussentijds bijvullen van de kweekcontainers, aangetoond. Op grond van de resultaten van deze taak is door het consortium vastgesteld dat het op de markt brengen van de REVO voedingsbodem, hoewel passend binnen de huidige vraag van de markt om een dergelijke oplossing voor de tot uitval en infectie verliezen leidende noodzaak tot herhaald tijdens een teeltcyclus bijvullen van de nutriënten, althans op dit moment, economisch niet haalbaar is. Hoewel dit niet de door iedereen gewenste uitkomst is, heeft deze taak wel een cruciale bijdrage geleverd aan de projectdoelstelling. Taak 3.3: Praktijktesten met REVO voedingsbodems uit massaproductie in praktijkopstellingen met representatieve soorten tulpen Deze taak stond gepland voor medio 2012 en is conform het laatst goedgekeurde wijzigingsverzoek niet gestart, wegens tegenvallende resultaten in taak 3.2. Taak 4.1: Opstellen, indienen en afwachten toekenning octrooiaanvraag PCT Een voorlopig nieuwheidonderzoek is uitgevoerd (door het Octrooi Bureau zelf) en er wordt nergens een self-releasing voedingsbodem beschreven die nutriënten slow release kenmerken heeft zonder een osmotische penalty te betalen. Het concept om thermoplastische zetmelen die hydrolyseerbaar blijken te zijn, te gebruiken teneinde deze doelstelling te bereiken is niet beschreven en komt ook niet voor als logische extensie van een in een bestaand octrooi beschreven eigenschap van op zetmeel gebaseerde stoffen of (half-)fabrikaten. Echter vanwege de vaststelling dat de REVO voedingsbodem niet commercieel haalbaar is, is uiteindelijk besloten de nadrukkelijk opgestarte octrooiaanvrage procedure (er is een 1e draft van de aanvrage gereed en met de specialisten van het octrooibureau / de octrooigemachtigden besproken), niet door te zetten tot een volledige aanvrage. Evenals taak 1.1 heeft deze taak achtergrondkennis opgeleverd die ingezet is bij het (voorbereidend) werk in andere taken en heeft daarmee bijgedragen aan het realiseren van de doelstelling. Taak 4.2: Evaluatie werking proefproductie REVO voedingsbodem bij drie bestaande klanten van Duchefa Eerste gesprekken met de potentiële eindgebruiker Syngenta (Enkhuizen) zijn gevoerd en er zijn wat verkennende testen met proefmodellen gedaan, omdat er nog geen massa productie materiaal beschikbaar was. Na de “no go” beslissing begin 2012 naar aanleiding van de uitkomsten van taak 3.2 is, mede op grond van eigen ervaringen met de gevolgen van de beperkte steriliteit en intensieve samenwerking ten aanzien van de determinatie van de resistent blijkende organismen ( met name aspergillus en penicillium species) besloten deze taak niet verder voort te zetten. Wel zijn ook bij hen de gunstige release eigenschappen van de REVO plaatmaterialen, ook op langere termijn en bij veranderende – toenemende verbruiksbehoefte aan oligosacchariden, in positieve zin bevestigd. Deze taak heeft derhalve beperkt bijgedragen aan de doelstelling.

6

Taak 4.3: Opstellen website en publicaties, houden van presentaties, presentatie via beursstands, plaatsen advertorials Deze taak stond gepland voor medio 2013 en is conform het laatst goedgekeurde wijzigingsverzoek niet gestart, wegens tegenvallende resultaten in taak 3.2. Uiteraard is wel voldaan aan de verplichting tot openbaar maken van de resultaten direct na afloop van het project. Op de openbare website www.liquidseal.nl is dit eindverslag voor iedereen toegankelijk. Zie verder hoofdstuk 4.

3.

Vergaarde kennis en informatie

Tijdens dit project is de volgende kennis en informatie vergaard: • Uitkomsten literatuuronderzoek; Rapport: Update stand der techniek, definiëring van de bedrijfsmatige vraag: de performance criteria en bedrijfskundige / bedrijfseconomische randvoorwaarden voor een te ontwikkelen voedingsbodem technologie. D. van Velzen, ACT • Studieresultaten verbruik/release relatie in tijd en in relatie tot temperatuur; Rapport: Relatie tussen samenstelling slow-release massa, concentraties vrije suiker in stationaire en dynamische compartimentering. Effecten van temperatuur, matrixstructuur en suikerverbruik op afgifte van en bereiken van dynamisch evenwicht van de concentraties van oligosachariden in een 4 compartimenten systeem. C. Beukelmans - PhytoGeniXX, Dick van Velzen, A.C.T.. • Bemonsteringsprotocol uitgangsweefsel tulpbol; Rapport: Microscopisch onderzoek structuur-remodelling van de bloembodem van de tulp in de post-koude periode. Localisatie van groeigebieden en blasteemweefsel in relatie tot aanleg van nevenstelen en wortelaanleg nucleus. D. van Velzen ACT • Studieresultaten suikerverbruik en -aanvoer tulp uitgangsweefsel; Studie resultaten, zij het in mindere omvang dan gepland, van suikerverbruik door en aanvoer naar plantenweefsel van diverse aard en verbruikskenmerken op langere termijn/ Rapport: Functionele karakteristieken van de REVO voedingsbodem bij toepassing in korte en lange termijn kweken van plantenmateriaal in de post-callus en differentiatiefase. D. van Velzen ACT, C. Beukelmans PhytoGeniXX. • Analyserapport sterilisatie- en steriele verpakkingsmethodes; Rapport: Toepassing van far-end gamma stralingstechnieken bij de sterilisatie van biopolymer / thermoplastische zetmeel matrix composites, resultaten en beperkingen. • Nieuwheidsonderzoek. Verslag (Vriesendorp & Gade, den Haag): Octrooieerbaarheid van een voedingsbodem voor bedrijfsmatige toepassing binnen de planten en gewas propagatie, op basis van een biopolymer / thermoplastisch zetmeel composite, een onderzoek naar de stand der techniek, nieuwheidsonderzoek en beoordeling van de octrooieerbaarheid:, Mr. E. de Hoop Alle hierboven genoemde rapporten zijn op aanvraag beschikbaar. Hiervoor kunt u contact opnemen met Dr. Dick van Velzen (contactgegevens op blz. 1 van dit rapport).

7

4.

Openbaar maken van de resultaten

Direct na afloop van het project is dit volledige eindrapport geplaatst op de openbaar toegankelijke website www.liquidseal.nl. Hierbij wordt de contactinformatie van penvoerder ACT BV genoemd tezamen met de opmerking dat iedereen die nadere informatie en achterliggende rapporten wenst dat hier kan verkrijgen. Dit eindrapport zal voor de doelgroep beter vindbaar gemaakt worden door de publicatie van een samenvatting op de publiek toegankelijke websites van PPO Lisse en LTO GroeiService Bleiswijk. Via een doorlink komt men dan bij deze eindrapportage uit. http://www.wageningenur.nl/en/location/PPO-Lisse-1 Op de website van PPO Lisse zal, na interne evaluatie en positieve beoordeling van de aangeleverde tekst en illustraties, plaatsing onder hetzij de rubriek “nieuws” dan wel de rubriek “research and results” gerealiseerd worden. http://www.groeiservice.nl/ Op de website van LTO groeiservice te Bleiswijk zal onder de rubriek “nieuws” een kort verslag van de resultaten van het onderzoek worden geplaatst, indien na aanmelding en beoordeling, de Organisatie dit passend acht in de doelstellingen van de organisatie naar haar leden en het belang voor de niet-georganiseerde bezoeker / tuinder van de website bevestigd weet bij interne evaluatie.

8