Voor akkoord verklaring

Quorum sensing regulatie in Pseudomonas spp. CMR12a en CMR12b

Voor akkoord verklaring

Dit eindwerk is een examen; eventuele fouten die worden vastgesteld tijdens de eindwerkverdediging of erna werden niet gecorrigeerd. Het gebruik als referentie in publicaties is toegelaten na goedkeuring van de stagebegeleider, vermeld op de titelbladzijde.

Jolien D’aes

Monica Höfte

Stagementor

Stagegever

Kaat Van Oostveldt Promotor

1


Woord vooraf In het laboratorium van de Universiteit Gent, Fac. Bio-ingenieurswetenschappen, Vakgroep Gewasbescherming, Labo Fytopathologie was een onderzoek lopende naar de bestrijding van Pythium myriotylum, wortelrot op cocoyam met behulp van Pseudomonas spp..Door mijn grote voorliefde voor planten was ik vereerd om in deze vakgroep te mogen werken. Dit eindwerk was nooit mogelijk geweest zonder de hulp en steun van bepaalde mensen. Om deze reden is een dankwoord wel op zijn plaats. Allereerst dank ik Prof. Dr. ir. Monica Höfte omdat ik in haar labo mijn stage en bijgevolg dit eindwerk tot een goed einde mocht brengen. Daarnaast wil ik Jolien D’aes bedanken voor haar gewaardeerd stage- en eindwerkbegeleiding. Ook wil ik alle medewerkers bedanken voor de aangename sfeer en hulp die ik kreeg tijdens mijn stage. Naast de begeleiding op mijn stage wil ik ook mevrouw Kaat Van Oostveldt bedanken voor de begeleiding van school uit. Als laatste bedank ik mijn moeder, broers en Fien voor alle steun, hulp en geduld die ze met mij hadden.

2


Samenvatting Cocoyam (Xanthosoma sagittifolium) is een tropisch knolgewas. In West-Afrika is cocoyam één van de belangrijkste planten voor voedselvoorziening. Cocoyam wordt belaagd door een schimmelachtige die wortelrot veroorzaakt. Uit de rhizosfeer van de cocoyam zijn enkele Pseudomonas spp. geïsoleerd, waaronder CMR12a en CMR12b. CMR12a kan de wortelrot onderdrukken zodat de cocoyam niet sterft. Beide pseudomonaden produceren fenazine-antibiotica die gereguleerd is door quorum sensing, dat is een celdensiteitsafhankelijkgenregulatie-mechanisme. Dit regulatiemechanisme is echter nog niet goed bestudeerd in CMR12a en CMR12b. Om het te onderzoeken worden er via plaatsspecifieke mutagenese deleties gemaakt in phzI en phzR. Deze genen worden verondersteld de biosynthese van fenazine te regelen via quorum sensing. Vervolgens wordt het fenotype van het wild type en de quorum sensing mutanten vergeleken. Na de vergelijking van het fenotype kan men afleiden dat phzI instaat voor de productie van acylhomoserinelactons (AHL), de signaalmoleculen van het quorum sensing systeem. De AHL’s regelen de productie van fenazine en pyoverdine, terwijl PhzR enkel de fenazineproductie beïnvloedt. PhzR staat ook in voor de autoinductie van phzI. In CMR12b zijn er mogelijk 2 phzI’s omdat de CMR12b-PhzI-mutant wel nog AHL’s produceert maar wel minder dan het wild type. Uit de infectieproef kan afgeleid worden dat de CMR12aPhzI-mutant zijn koloniserend vermogen verliest en dus de cocoyam niet meer kan beschermen.

3


Lijst met afkortingen en symbolen ADIC

2-amino-2-deoxyisochorismaat

AHL

acyl-homoserinelacton

BAP

6-benzylaminopurine

Bp

baseparen

CMR12a

een Pseudomonas isolaat

CMR12b

een Pseudomonas isolaat

DHHA

trans-2,3-dihydroxyanthranilaat

DHα5

een E. coli die gebruikt wordt voor moleculair werk

DNA

desoxyribonucleïnezuur

DNTP

nucleotiden

Dr.

doctor

F.O.

fysiologische oplossing

Fac.

faculteit

Gac

global antibiotics and cyanide control

Gfp

green fluorescent Proteïn

HB101

een E. coli die pRK2013 bevat

HSL

homoserinelacton

Ir.

ingenieur

OD

Optical Density

PCA

fenazine-1-carboxylaat

PCN

fenazine-1-carboxamide

PCR

polymerase chain reaction

PhzI

een gen dat codeert voor AHL-synthase

PhzR

een gen dat codeert voor PhzR

pMQ30

een zelfmoordplasmide

pMQ30-PhzI

het construct voor het maken van phzI-mutanten

pMQ30-PhzR het construct voor het maken van phzR-mutanten pRK2013

een plasmide dat de mob en tra genen bevat

Prof.

Professor

rpm

revolutions per minute (toeren per minuut) 4


SacB

een enzym dat sucrose polymerizeert

sp.

species (enkelvoud)

spp.

species (meervoud)

t.o.v.

ten opzichte van

Taq

Thermophilus aquaticus

URA3

een enzym dat uracil produceert

5


Verklarende woordenlijst Absorptiespectrum

spectrum van licht waarin na het doordringen door een stof bepaalde golflengten veel sterker geabsorbeerd zijn dan de overige

Agens

een stof die of voor zover zij een chemische werking teweegbrengt

Amfifiele molecule

een molecule die zowel hydrofobe als hydrofiele groepen bevat

Anion

negatief geladen ion

Antifungaal

een stof die tegen schimmels werkt

Apex

de groeitop van een plant

Appressoria

soort hechtorgaantjes die penetratiehyfen maken

Aromaat

een stof die een ringstructuur bezit

Autofosforylatie

zich zelf fosforyleren, het aanbrengen van een fosfaatgroep

Biofilm

een structuur op een vast oppervlak, gevormd door levende micro-organismen

Bioluminescentie

het licht uitstralen met hulp van een zelf-geproduceerde stof

Chlorose

afbraak van chlorofyl

Chromista

één van de rijken waarin alle organismen zijn onderverdeeld, bevat onder meer algen, kiezelwieren en oömyceten

Conjugatie

tijdelijk celcontact tussen twee bacteriën, waarbij DNA wordt overgedragen

Deficiënt

onvoldoende

Digestie

incubatie van DNA met restrictie-enzymen, die leidt tot het verdelen van het DNA in fragmenten

Dimerisatie

binding tussen 2 monomeren

Extracellulair protease

een eiwit afbrekende stof die uitgescheiden wordt door de bacterie

Extraheren, extractie

uit een mengsel afscheiden met behulp van een vloeibaar oplosmiddel

Fenazine

een antibioticum 6


Flagel

een organel dat dient voor de voortbeweging

Genus

rang in de taxonomie van levende wezens, hoger dan soort

Glucaan

polysaccharide

Heterocyclisch

verschillende soorten ringstructuren

Homoserinelacton

signaalmolecule van quorum sensing

Hyfen

lange, vertakte draden van een schimmel

In vitro

in laboratorium omgeving

Kinase

een enzym dat fosfaatgroepen van ATP kan overdragen op organische moleculen

Kolonisatie

groei en vermenigvuldiging van bacteriën in een bepaalde omgeving, zoals plantenwortels

Merodiploid

mutant waarin zowel het wild type gen als het gen met de deletie aanwezig is

Monocotyledone

éénzaadlobbige

Mutagenese

het aanbrengen van veranderingen in het genetisch materiaal van een organisme

Oomycota

fylum van filamenteuze organismen met schimmelachtig uitzicht

Oösporen

een overlevingsstructuur van oömyceten

Operon

op het DNA bij elkaar liggende genen, die bij elkaar horen voor het tegelijk uitvoeren van één transcriptie van meerdere enzymen voor één celproces

Oxaalzuur

een carbonzuur met twee zuurgroepen

Oxidatieve fosforylatie

proces in zuurstofgebruikende organismen, waarbij zuurstof wordt verbruikt en energie wordt geproduceerd

Plaatsspecifieke mutagenese

het specifiek uitschakelen van één of enkele genen via homologe recombinatie

Pseudobactines

type siderofoor

Pyoluteorine

antibioticum

Quorum sensing

celdensiteitsafhankelijk genregulatiemechanisme

Radicalen

een atoom, molecule of ion met een ongepaard elektron

7


Redoxcyclus

biologisch proces waarbij verschillende stoffen gereduceerd en geoxideerd in het energieproductieproces

Reduceren

zuurstof onttrekken of waterstof toevoegen aan een chemische verbinding

Regulatiesysteem

een systeem dat mechanismen reguleert

Rhizosfeer

de plantenwortels en de grond rondom die beïnvloedt wordt door de plant

Secretie

het uitscheiden van een product

Siderofoor

een ijzerdrager zoals pyoverdine

Signaalmolecule

een molecule (AHL) die bij zijn aanwezigheid een signaal is waardoor de reactie doorgaat

Species

soort, een van de laagste onderverdelingen in de taxonomie

Sporangia

een sporendoosje waarin sporen worden gevormd

Swarming

speciale bewegingsvorm op halfvast medium

Swimming

beweging van micro-organismen m.b.v. flagellen

Twitching

beweging van micro-organismen op een interfase d.m.v. pili

Virulentiefactor

factoren die zorgen voor de schadelijke werking van de bacterie

Zoösporangium

een capsule waarin zoösporen gevormd worden

Zoösporen

mobiele sporen gemaakt door oomyceten

8


Lijst van tabellen en figuren Lijst met tabellen Tabel 3.1 primers voor PCR ................................................................................................ 34 Tabel 4.1 Concentratiebepaling van het DNA in de PCR-producten. ................................. 56 Tabel 4.2 Pipetteerschema ................................................................................................... 56 Lijst met figuren Figuur 2.1 Cocoyamknol ..................................................................................................... 16 Figuur 2.2 Cocoyam ............................................................................................................ 17 Figuur 2.3 Een cocoyam veld dat geïnfecteerd is met P. myriotylum ................................. 19 Figuur 2.4 Boven een zwemmende Pseudomonas, onder fluoriserende Pseudomonas...... 20 Figuur 2.5 De algemene structuur van fenazine .................................................................. 22 Figuur 2.6 De genen van de biosynthese van fenazine ....................................................... 23 Figuur 2.7 Algemene structuur van acyl-homoserinelacton ................................................ 24 Figuur 2.8 Het Quorum sensing regulatiesysteem............................................................... 25 Figuur 2.9 Voorstelling van de primers voor het phzI-construct met de bindingsplaatsen . 27 Figuur 2.10 Homologe recombinatie ................................................................................... 28 Figuur 4.1 Resultaten van de eerste PCR-reactie ................................................................ 55 Figuur 4.2 Resultaten van de PCR op PCR ......................................................................... 56 Figuur 4.3

Resultaat miniprep ....................................................................................... 57

Figuur 4.4 Zelfmoordplasmide pMQ30 .............................................................................. 58 Figuur 4.5 Resultaten van de digestie.................................................................................. 58 Figuur 4.6

Resultaten van de extractie van het PhzI- en PhzR-construct uit de gist. ... 59

Figuur 4.7

Resultaten van kolonie PCR ........................................................................ 60

Figuur 4.8

Resultaten van de eerste homologe recombinatie........................................ 61

Figuur 4.9 Resultaten van de controle PCR op gentamycineresistentie. ............................. 62 Figuur 4.10 Resultaten van tweede homologe recombinatie voor PhzI-mutant.................. 63 Figuur 4.11Resultaten van tweede homologe recombinatie voor PhzR-mutant ................. 63 Figuur 4.12 Resultaten van de ‘cross streak assays’: links CMR12a, midden CMR12aPhzI, rechts CMR12a-GacA ........................................................................................ 65 Figuur 4.13 Resultaten van AHL-overlay. .......................................................................... 66 Figuur 4.14 Resultaat van de fenazine productie. ............................................................... 67 9


Figuur 4.15 Biosurfactants karakterisatie van de mutanten. ............................................... 68 Figuur 4.16 Voorstelling van een exoprotease-positieve kolonie (links) en een exoproteasenegatieve kolonie (rechts)............................................................................................ 69 Figuur 4.17 CAA medium met een stam die pyoverdines produceert (links) of geen pyoverdines produceert (rechts). ................................................................................. 69 Figuur 4.18 Overzicht van de pyoverdineconcentraties (µM) van de verschillende mutanten voorgesteld op de X-as. De concentraties op de Y-as zijn uitgedrukt in µM. ............. 70 Figuur 4.19 Voorstelling van een ‘swarming’-negatieve kolonie (links) en een ‘swarming’positieve kolonie (rechts). ........................................................................................... 71 Figuur 4.20 Gezond blad met score 0 (links), een blad met score 1 (rechts) ...................... 72 Figuur 4.21 een blad met score 2 (links), een blad met score 3 (midden) en een blad met score 4 (rechts) ............................................................................................................ 72 Figuur 4.22 Overzicht van de infectieproef. ........................................................................ 72

10


Inhoudsopgave Voor akkoord verklaring .................................................................................................... 1 Woord vooraf ....................................................................................................................... 2 Samenvatting........................................................................................................................ 3 Lijst met afkortingen en symbolen .................................................................................... 4 Verklarende woordenlijst ................................................................................................... 6 Lijst van tabellen en figuren ............................................................................................... 9 Inhoudsopgave ................................................................................................................... 11 1

Inleiding, situatieschets en probleemstelling..................................................... 15

2

Literatuurstudie................................................................................................... 16

2.1

Cocoyam 1, 2, 3, 4, 5 ................................................................................................... 16

2.2

Pythium myriotylum 6, 7, 8 ....................................................................................... 18

2.3

Wortelrot bij cocoyam 3, 4, 9 .................................................................................... 18

2.4

Biologische bestrijding met Pseudomonas spp.10, 11, 12, 13, 14, 15 ............................. 19

2.5

Fenazines ............................................................................................................... 21

2.5.1

Inleiding 14, 16, 17, 18, 19 ............................................................................................. 21

2.5.2

Structuur 16, 18 ......................................................................................................... 22

2.5.3

Werkingsmechanisme 16, 19, 20, 21, 22, 23 .................................................................... 22

2.5.4

Biosynthese 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 ................................................................................ 22

2.6

Quorum sensing 31, 32, 33 ......................................................................................... 23

2.7

GacS/gacA regulatiesysteem 34, 35, 36...................................................................... 25

2.8

Kameroenese antagonisten 37 ................................................................................. 26

2.9

Plaatsspecifieke mutagenese met pMQ30 systeem 38 ............................................ 26

3

Materialen en methoden ..................................................................................... 29

3.1

Voedingsmedia ...................................................................................................... 29

3.1.1

Yeast extract Peptone Dextrose (YPD) ................................................................. 29

3.1.2

SD medium-uracil ................................................................................................. 29

3.1.3

King’s B medium (KB) ......................................................................................... 29 11


3.1.4

Luria Bertani medium (LB) ................................................................................... 30

3.1.5

CAA (Casamino acid) medium ............................................................................. 30

3.1.6

Melkagar ................................................................................................................ 31

3.1.7

Swarming agar ....................................................................................................... 31

3.1.8

Wateragar .............................................................................................................. 31

3.1.9

Potato dextrose agar (PDA) ................................................................................... 31

3.1.10

Proliferatiemedium MS+ ................................................................................. 31

3.1.11

Individualisatiemedium MS ............................................................................ 32

3.2

Buffers ................................................................................................................... 32

3.2.1

0,5x TAE-buffer .................................................................................................... 32

3.2.2

1 M LiAc stock oplossing ..................................................................................... 32

3.2.3

1 M tris-HCl stock oplossing................................................................................. 32

3.2.4

0,1 M EDTA stock oplossing ................................................................................ 32

3.2.5

50% PEG stock oplossing ..................................................................................... 33

3.2.6

TE-oplossing ......................................................................................................... 33

3.2.7

40% PLT oplossing (Lazy bones oplossing) ......................................................... 33

3.3

Micro-organismen ................................................................................................. 33

3.4

Mutatieconstruct .................................................................................................... 34

3.4.1

PCR voor flankerend DNA doelgenen .................................................................. 34

3.4.2

Concentratie DNA bepalen van PCR-reactie ........................................................ 36

3.4.3

Miniprep voor pMQ30 .......................................................................................... 36

3.4.4

Digest pMQ30 ....................................................................................................... 37

3.4.5

In vivo cloning protocol ......................................................................................... 38

3.4.6

Miniprep op gist .................................................................................................... 39

3.4.7

Wassen van glazen ‘beads’.................................................................................... 40

3.4.8

Elektroporatie in DH5α ......................................................................................... 41

3.4.9

PCR om constructen te controleren (kolonie-PCR) .............................................. 43

3.5

Plaatsspecifieke mutagenese ................................................................................. 44

3.5.1

Conjugatie (eerste homologe recombinatie).......................................................... 44

3.5.2

Tweede homologe recombinatie ........................................................................... 45

3.6

Karakterisatie mutanten ......................................................................................... 46

3.6.1

Acyl-homoserinelactons: cross streak assays ........................................................ 46 12


3.6.2

Acyl-homoserinelactons: extractie en TLC-overlay ............................................. 46

3.6.3

Fenazines ............................................................................................................... 48

3.6.4

Biosurfactants ........................................................................................................ 49

3.6.5

Exoproteasen ......................................................................................................... 49

3.6.6

Pyoverdines ........................................................................................................... 49

3.6.7

Swarming............................................................................................................... 50

3.7

Infectieproeven ...................................................................................................... 50

3.7.1

In vitro propagatie cocoyam .................................................................................. 50

3.7.2

Opzetten infectieproef ........................................................................................... 51

3.7.3

Scoren infectie ....................................................................................................... 53

3.7.4

Bepalen wortelkolonisatie ..................................................................................... 54

4

Resultaten en discussie ........................................................................................ 55

4.1

Productie van het mutatieconstruct ....................................................................... 55

4.1.1

PCR voor flankerend DNA doelgenen .................................................................. 55

4.1.2

Concentratiebepaling van het DNA na de PCR-reactie ........................................ 56

4.1.3

Miniprep op E.coli cellen die het pMQ30 plasmide bezitten ................................ 57

4.1.4

Digestie van pMQ30 plasmide met EcoRI en BamHI .......................................... 58

4.1.5

In vivo cloning in gistcellen................................................................................... 59

4.1.6

Miniprep op gist .................................................................................................... 59

4.1.7

Elektroporatie in DH5α ......................................................................................... 60

4.1.8

Controle van de geproduceerde constructen met behulp van kolonie-PCR .......... 60

4.2

Plaatsspecifieke mutagenese ................................................................................. 61

4.2.1

Conjugatie (eerste homologe recombinatie).......................................................... 61

4.2.2

Tweede homologe recombinatie ........................................................................... 62

4.3

Karakterisatiemutanten .......................................................................................... 64

4.3.1

AHL-productie: ‘cross streak assays’.................................................................... 64

4.3.2

AHL-productie: extractie en TLC-overlay ............................................................ 65

4.3.3

Fenazine-productie ................................................................................................ 66

4.3.4

Biosurfactants ........................................................................................................ 67

4.3.5

Exoproteasen ......................................................................................................... 68

4.3.6

Pyoverdines ........................................................................................................... 69

4.3.7

‘Swarming’ ............................................................................................................ 71 13


4.4

Infectieproeven ...................................................................................................... 71

4.4.1

Scoren infectie ....................................................................................................... 71

4.4.2

Bepalen wortelkolonisatie ..................................................................................... 73

5

Conclusie .............................................................................................................. 74

Literatuurlijst .................................................................................................................... 76 Bijlagen ............................................................................................................................... 81 Bijlage 1 – Score blad.......................................................................................................... 81 Bijlage 2 – Berekening van pyoverdineconcentratie ........................................................... 82 Bijlage 3 – Resultaten van de karakterisatieproeven ........................................................... 82 Bijlage 4 – Resultaten van de grond kolonisatie ................................................................. 82 Bijlage 5 – Resultaten van de wortel kolonisatie ................................................................ 82

14

Quorum sens ing regu l at ie in Pseudomonas spp. CMR12a en CMR12b In le id ing , s i tua t ieschets en prob leemstel l ing

1

Inleiding, situatieschets en probleemstelling

Cocoyam (Xanthosoma sagittifolium) is een tropisch knolgewas dat oorspronkelijk van Amerika komt en zich van daaruit verspreidde. In West-Afrika is cocoyam één van de belangrijkste planten voor voedselvoorziening. Wortelrot bij cocoyam is een destructieve ziekte, die kan leiden tot een opbrengstverlies van 90%. De wortelrotziekte wordt veroorzaakt door Pythium myriotylum. De ziekte kan zich verspreiden via geïnfecteerd plantgoed of via de grond waarin Pythium myriotylum al aanwezig is. Een slecht gedraineerde grond, hoge temperaturen en veel regen zijn goede omstandigheden voor de ziekte. Er zijn Pseudomonas spp. geïsoleerd uit de rhizosfeer van de cocyam die ervoor zorgen dat de plant toleranter is voor de wortelrotziekte. Enkele van deze isolaten zoals Pseudomonas sp.-CMR12a produceren fenazine-antibiotica met een antifungale werking. De productie van fenazines wordt geregeld door quorum sensing, een celdensiteitsafhankelijk genregulatiemechanisme, maar het is nog niet geweten hoe dit regulatiemechanisme precies werkt in CMR12a. Om dat te onderzoeken worden er via plaatsspecifieke mutagenese deleties gemaakt in phzI en phzR. Deze genen worden gebruikt in bepaalde quorum sensing systemen. Vervolgens kan men het fenotype van het wild type en de quorum sensing mutanten vergelijken, om na te gaan wat het effect is van de mutatie. De karakterisatietesten die volgen om het fenotype te bepalen zijn de productie van AHL’s, fenazine, biosurfactants, exoproteasen, pyoverdines en de ‘swarming’ capaciteit.

15

Quorum sens ing regu l at ie in Pseudomonas spp. CMR12a en CMR12b l i t e ra tuurstud ie

2

Literatuurstudie

2.1 Cocoyam 1, 2, 3, 4, 5 Cocoyam (Xanthosoma sagittifolium) is een knolgewas dat oorspronkelijk uit de tropische gebieden van Amerika komt en zich van daaruit naar Zuidoost-Azië, Oceanië en Afrika verspreidde. Het is een tropische plant die behoort tot de monocotyledone familie van de Araceae. De verspreiding naar Oceanië en Afrika gebeurde waarschijnlijk in de 19de eeuw. Hij heeft de plaats ingenomen van de taro of oude cocoyam die daar ook geteeld werd. Er zijn verschillende species van Xanthosoma, waaronder X. atrovirens die geelachtig vruchtvlees heeft, X. violaceum met rozig vruchtvlees en X. sagittifolium die witachtig vruchtvlees heeft. De X. sagittifolium is de belangrijkste omdat hij een betere opbrengst heeft en een betere smaak.

Figuur 2.1 Cocoyamknol

De tot 2 kg zware wortelknollen (zie Fig. 2.1) kunnen worden gekookt, gebakken of gefrituurd. Ze worden in de Surinaamse keuken gebruikt in het populaire gerecht pom. De knollen zijn net als aardappelen rijk aan zetmeel, maar bevatten relatief weinig eiwitten en vitamines. In Afrika worden de knollen soms verwerkt in een pasta, fufu genaamd. De jonge bladeren en bladstelen kunnen worden gegeten. Deze worden meestal bereid op dezelfde manier als spinazie en bevatten ongeveer drie keer zoveel eiwit als de wortelknollen. Alle plantendelen bevatten oxaalzuur dat door verhitting wordt afgebroken. 16


Figuur 2.2 Cocoyam

Een belangrijke eigenschap van de cocoyam is dat hij vocht nodig heeft. Als er niet genoeg regen is dan zal de knol niet veel groeien. De cocoyam heeft een gemiddelde temperatuur nodig van 21°C. Ze kunnen groeien op grote hoogtes maar hebben dan wel een kleinere opbrengst. Het is een vaste plant met een centrale knol waaruit laterale knolletjes, wortels en bovengrondse delen groeien die tot 2 meter hoog kunnen worden. X. sagittifolium heeft een korte stengel, de bladeren groeien net boven de apex en hebben een lange bladsteel die uitloopt in een pijlvormig blad (zie Fig. 2.2). Ze hebben een diepe insnijding waardoor het blad onderaan verdeeld is in twee lobben. Ter hoogte van deze insnijding zit de bladsteel vast aan het blad. Aan de basis van de plant wordt een knol geproduceerd die op zijn beurt tot 10 laterale knolletjes kan dragen. Aangezien bloemen en dus ook zaadproductie zeer zeldzaam zijn in de natuur, wordt de cocoyam vegetatief vermeerderd via de knollen. Na 9-12 maanden groei bereikt de cocoyam zijn maturiteit en kunnen zijn knollen geoogst worden. In dit stadium verkleuren de meeste bladeren geel; een fysiologisch verschijnsel dat niet verward mag worden met het ziektebeeld veroorzaakt door pathogenen.

17


2.2 Pythium myriotylum 6, 7, 8 Pythium myriotylum behoort tot de Oomycota, een afdeling binnen het rijk van de Chromista. De Oomycota onderscheiden zich van de andere schimmelachtigen die tot het rijk van de Fungi behoren, door enkele typische kenmerken. Hun celwand is opgebouwd uit glucaan en cellulose, in plaats van glucaan en chitine en hun myceliumdraden hebben geen septa. Pythium myriotylum komt frequent voor in de warme tropische klimaten van Afrika, Noord-Amerika, Azië en Australië. Pythium spp. vormen lange, smalle, witte myceliumdraden en hebben geen tussenschotten. Ze groeien snel en vertakken daarbij onder typische rechte hoeken. De hyfen zijn niet erg vertakt, behalve op de uiteinden waar er talrijke knopvormige appressoria gevormd worden. Op deze myceliumdraden vormen zich sporangia, waaruit zoösporen kunnen ontstaan. Deze worden in vochtige omstandigheden vrijgegeven uit het zoösporangium zodat ze zich in water kunnen voortbewegen met behulp van hun flagellen en zo een nieuwe gastheer vinden. Pythium myriotylum kan ook seksuele oösporen vormen die over een dikke wand beschikken als bescherming tegen ongunstige omgevingsfactoren. Daarnaast is de oöspore ook een rustspore, omdat ze een bepaalde rusttijd nodig heeft vooraleer ze kan kiemen. In aanwezigheid van een gastheer vertonen Pythium spp. een parasitaire groei en veroorzaken grondgebonden ziekten zoals wortelrot. Om de planten te kunnen infecteren moeten de rustsporen en sporangia eerst kiemen. Er worden zoösporen gevormd die dan naar kiemende zaden of wortels zwemmen. Eenmaal ze er zijn, hecht de zoöspore zich vast en cysteert. De zoöspore kiemt en duwt een kiembuis door het gastheerweefsel.

2.3 Wortelrot bij cocoyam 3, 4, 9 Wortelrot bij cocoyam is een destructieve ziekte, die kan leiden tot een opbrengstverlies van 90%. De wortelrotziekte wordt veroorzaakt door Pythium myriotylum. De ziekte kan zich verspreiden via geïnfecteerd plantgoed of via de grond waarin P. myriotylum al aanwezig is. Een slecht gedraineerde grond, hoge temperaturen en veel regen zijn goede omstandigheden voor de ziekte. Door een hoge plantdichtheid kan de ziekte zich sneller verspreiden. 18


Figuur 2.3 Een cocoyam veld dat geïnfecteerd is met P. myriotylum

De symptomen van wortelrotziekte bij cocoyam kunnen onderverdeeld worden in 2 ziektebeelden (zie Fig. 2.3). Enerzijds zijn er de acute symptomen die dwerggroei veroorzaken doordat de nieuwgevormde wortels van een pas ontsproten plantje direct worden aangetast en er dus te weinig nutriënten worden aangevoerd. Anderzijds worden de symptomen van de chronische vorm pas na 3 maanden zichtbaar. De bladeren vergelen, beginnend met regelmatig verdeelde chlorotische puntjes aan de bladrand en eindigend in een chlorose van de hele bladschijf. Dit is het gevolg van het wegrotten van de wortels.

2.4 Biologische bestrijding met Pseudomonas spp.10, 11, 12, 13, 14, 15 Om wortelrotziekte op cocoyam te bestrijden kan er het fungicide metalaxyl gebruikt worden. Dit werkt goed als het preventief wordt toegepast, maar de kostprijs is te hoog voor de plaatselijke boeren. Als alternatief kan men gebruik maken van biologische bestrijding. Dit is het gebruik van antagonistische micro-organismen om op een directe of indirecte wijze de pathogeen te bestrijden. Pseudomonas spp. zijn zeer geschikt voor toepassing in biologische bestrijding. Ze hebben dat te danken aan hun talrijke aanwezigheid in de rhizosfeer, hun hoge groeisnelheid ten opzichte van andere rhizobacteriën en de diversiteit aan substraten die ze kunnen benutten. Ze kunnen ook gemakkelijk geïsoleerd, in vitro gekweekt en genetisch gemanipuleerd worden. Hun genoom is al goed gekend en van veel secundaire metabolieten die ze produceren zijn de biosynthesegenen al geïdentificeerd. Pseudomonas 19


spp.(zie Fig. 2.4 boven) met antagonistische eigenschappen tegen wortelrotziekte zijn meestal fluorescerende pseudomonaden, een subgroep van de pseudomonaden met als gemeenschappelijk kenmerk de productie van fluorescerende geel-groene sideroforen (zie Fig. 2.4 onder), pyoverdines of pseudobactines.

Figuur 2.4 Boven een zwemmende Pseudomonas, onder fluoriserende Pseudomonas

Antagonistische bacteriën kunnen gebruik maken van verschillende mechanismen voor hun antifungale werking. De eerste mogelijkheid is de competitie voor nutriënten in de rhizosfeer, via de productie van sideroforen. Deze ijzerbindende moleculen kunnen enkel opgenomen worden door de bacteriën, waardoor er minder ijzer beschikbaar is voor de pathogenen. Een ander mechanisme is het afweren van een pathogeen door bepaalde bacteriën de rhizosfeer te laten koloniseren, zodat er geen plaats meer is voor de pathogeen. Sommige micro-organismen zijn dan weer in staat om antibiotica te produceren 20


die de groei van de pathogenen inhiberen. Fluorescerende Pseudomonas spp. kunnen verschillende antibiotica produceren, waaronder fenazines, pyoluteorine, 2,4-diacetylfloroglucinol e.a. die zeer effectief zijn tegen plantenpathogenen. De verschillende mechanismen sluiten elkaar niet uit en worden dikwijls gecombineerd in één en dezelfde stam. Een andere factor die een belangrijke rol bij biologische bestrijding speelt is de efficiënte kolonisatie van de rhizosfeer van de planten. De bacterie heeft hiervoor een aantal eigenschappen nodig om de aanhechting, verspreiding, groei en overleving in de rhizosfeer te verzekeren. De interesse in biologische bestrijding van plantpathogenen is de laatste jaren aanzienlijk toegenomen. Redenen hiervoor zijn enerzijds bezorgdheid over het gebruik van milieuonvriendelijke chemische pesticiden, anderzijds omdat het een oplossing biedt voor vele ziekten die niet bestreden kunnen worden met de conventionele strategieën. Hoewel biologische bestrijding een veelbelovende methode is, zijn er enkele belangrijke problemen met de toepassing in de praktijk. De resultaten bij in vitro-experimenten komen niet altijd overeen met de resultaten van de veldexperimenten, die dikwijls wisselvallig zijn. Dit kan deels verklaard worden doordat de productie van antibiotica gereguleerd wordt door complexe regulatiesystemen en door omgevingsfactoren.

2.5 Fenazines 2.5.1

Inleiding 14, 16, 17, 18, 19

Fenazines zijn een grote groep van heterocyclische, gekleurde pigmenten, die een breedspectrum-antibiotische activiteit hebben. Er zijn reeds meer dan 50 fenazinederivaten gekend. Ze worden gesynthetiseerd door verschillende bacteriële genera waaronder Pseudomonas, Streptomyces, Nocardia, Sorangium, Brevibacterium en Burkholderia species. Sommige stammen produceren meerdere fenazines. Door hun antibiotische werking hebben fenazineproducerende bacteriën een competitief voordeel in de rhizosfeer. De meest voorkomende fenazines geproduceerd door pseudomonaden zijn fenazine-1-carboxylaat (PCA), fenazine-1-carboxamide (PCN), pyocyanine en een aantal hydroxyfenazines. 21


2.5.2

Structuur 16, 18

De fenazines hebben een typische heterocyclische, stikstofhoudende ringstructuur (zie Fig. 2.5). Bij de verschillende fenazinederivaten zijn één of meerdere functionele groepen aanwezig op de ringstructuur, zoals –OH, -COOH, =O, -CH3 en –NH2.

N

N Figuur 2.5 De algemene structuur van fenazine

Door hun aromatische ringstructuur hebben fenazines een karakteristiek absorptiespectrum met een sterk signaal bij 250 – 290 nm en een zwakker signaal bij 350 – 400 nm. Fenazines zijn meestal wateroplosbaar en worden in het medium uitgescheiden. Op die manier kan men de fenazines gemakkelijk extraheren. 2.5.3

Werkingsmechanisme 16, 19, 20, 21, 22, 23

Hoe het antibiotische mechanisme van fenazine precies werkt is nog niet volledig opgehelderd. Er wordt verondersteld dat ze doorheen de membraan van het microorganisme diffunderen en werken als een reducerend agens. Dit resulteert in de ontkoppeling van de oxidatieve fosforylatie, doordat ze tijdens de respiratie een elektron uit de elektronentransportketen kunnen opnemen met vorming van anionische radicalen. Deze kunnen deelnemen aan de redoxcyclus in aanwezigheid van verschillende reducerende agentia en moleculaire zuurstof, met als gevolg dat er toxische intracellulaire superoxide radicalen (O2-) en waterstofperoxide (H2O2) gevormd worden. Deze reactieve zuurstofmoleculen stapelen zich op en brengen oxidatieve schade toe aan het organisme. Dit mechanisme wordt onder andere toegeschreven aan de werking van pyocyanine. 2.5.4

Biosynthese 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30

De precursor voor de biosynthese van fenazine is shikimaat. Dit wordt in de cel gevormd uit de primaire metabolieten erythrose-4-fosfaat en fosfoënolpyruvaat. Shikimaat wordt 22


vervolgens omgezet tot chorismaat, de laatste gemeenschappelijke voorloper in de biosynthese van de aromatische aminozuren. Om fenazine te synthetiseren wordt chorismaat omgezet tot 2-amino-2-deoxyisochorismaat (ADIC). Vervolgens wordt uit ADIC trans-2,3-dihydroxyanthranilaat (DHHA) gevormd. Uit DHHA wordt fenazine-1carboxylaat (PCA), de eerste fenazine-afgeleide, gevormd door de dimerisatie van twee DHHA-moleculen. Het exacte mechanisme voor de dimerisatie is tot heden nog niet gekend. Uit PCA kunnen via verschillende enzymes andere fenazinederivaten gevormd worden. De specifieke enzymes en dus ook de specifieke fenazines, zijn afhankelijk van de Pseudomonas stam.

CMR12a phzI

phzR

phzA phzB phzC phzD phzE phzF phzG phzH

Figuur 2.6 De genen van de biosynthese van fenazine

De genen voor de productie van fenazines zijn al in verschillende pseudomonaden geïdentificeerd. Deze biosynthese-operons zijn zeer geconserveerd. De genen in CMR12a zijn phzABCDEFGH, zie figuur 2.6. PhzA en phzB coderen allebei voor polypeptides die niet essentieel zijn voor fenazine-biosynthese en betrokken zijn bij conversiestappen volgend op de synthese van DHHA. De genproducten van phzC, phzD, phzE, phzF, phzG staan in voor de synthese van PCA. PhzH is nodig voor de omzetting van PCA naar fenazine-1-carboxamide (PCN). CMR12a produceert weinig PCA maar wat de oorzaak daarvan is, is nog niet gekend.

2.6 Quorum sensing 31, 32, 33 Quorum sensing is een celdensiteitsafhankelijk genregulatiemechanisme waarbij de expressie van de genproducten gerelateerd is aan de grootte van de bacteriële populatie. Bij een lage populatiedensiteit is er weinig tot geen genexpressie; bij een hoge populatiedensiteit is de genexpressie sterk. Het quorum sensing systeem werd voor het eerst beschreven in de jaren ’70 bij de mariene symbiotische bacterie Vibrio fischeri waar het de bioluminescentie reguleert (LuxI/LuxR).

23


Sindsdien werd dit mechanisme in een groot aantal Gram negatieve bacteriën aangetoond, waar het meestal analoog werkt aan het LuxI/LuxR systeem. Naast luminescentie regelt quorum sensing ook productie van antibiotica, ‘swarming’, ‘swimming’, ‘twitching motility’, plasmide transfer door conjugatie, ontwikkeling van biofilms en productie van virulentiefactoren in pathogene species. Quorum sensing stelt bacteriën in staat hun gedrag te coördineren via de secretie van specifieke signaalmoleculen. Pseudomonaden maken als signaalmolecule meestal gebruik van AHL’s, welke worden gesynthetiseerd door AHL-synthase, gecodeerd door een luxIhomoloog. Voor de biosynthese van fenazine is dat PhzI. De structuur van een AHL bestaat uit een vaste kern, het homoserinelacton, en daaraan gekoppeld een vetzuurketen, die in lengte varieert tussen 4 en 14 koolstofatomen en die optioneel een hydroxyl- of carbonylgroep kan bezitten op het C3-atoom (zie Fig. 2.7).

O O R

N H

O

Figuur 2.7 Algemene structuur van acyl-homoserinelacton

De AHL’s, die zich kunnen verplaatsen tussen het cytoplasma en de omgeving, worden tijdens de groei gesecreteerd en accumuleren in de omgeving en in de cellen. Eens een kritische concentratie wordt bereikt, bindt de signaalmolecule op een intracellulaire transcriptionele activator, het LuxR-homoloog PhzR, en wordt de expressie van fenazine in gang gezet door het PhzR-AHL-complex (zie Fig.2.8). Het PhzR-AHL-complex is ook in staat phzI te induceren. Hierdoor is een groep Pseudomonas spp. in staat een algemene, gecoördineerde respons op gang te brengen t.o.v. bepaalde omgevingsstimuli, en kan ze bepaalde taken volbrengen die onmogelijk zouden zijn voor een individuele Pseudomonas.

24


PhzI PhzI PhzR PhzR

PhzR PhzIABCD

Lage celdensiteit

Hoge celdensiteit

Figuur 2.8 Het Quorum sensing regulatiesysteem

2.7 GacS/gacA regulatiesysteem 34, 35, 36 Het GacS/GacA systeem is een twee component systeem, globale regulatoren van de genexpressie. Het GacS/GacA systeem speelt een grote rol bij Gram negatieve bacteriën. Dit systeem zorgt ervoor dat een organisme zich gemakkelijk kan aanpassen aan verschillende omstandigheden om zo specifieke niches te koloniseren. Vele species bezitten verschillende soorten van deze systemen. De algemene opbouw van een twee component systeem bestaat uit twee delen, een sensor kinase (GacS) en een respons regulator (GacA). Het sensor kinase is in staat een autofosforylatie te ondergaan onder invloed van een bepaalde stimulus. Deze fosfaatgroep wordt vervolgens overgedragen naar de respons regulator, waardoor deze actief wordt en de genexpressie activeert. Stimuli die het cascade-effect veroorzaken kunnen fysiologisch zijn zoals pH en temperatuur maar kunnen ook biologisch zijn zoals bepaalde moleculen maar dat is nog niet gekend.

25


2.8 Kameroenese antagonisten 37 Enkele jaren geleden werden uit de rhizosfeer van rode cocoyam in Kameroen een heel aantal fluorescerende Pseudomonas spp. geïsoleerd, waaronder de verwante stammen CMR12a en CMR12b. Deze bacteriën worden gekenmerkt door de productie van extracellulaire proteases en fenazine-antibiotica, 1-hydroxyfenazine in het geval van CMR12b en PCA en PCN in het geval van CMR12a. CMR12a produceert bovendien ook biosurfactants, amfifiele molecules die oppervlaktespanning kunnen verlagen en antimicrobiële eigenschappen hebben, en is in staat tot ‘swarming’. Dit is een speciale bewegingsvorm op halfvast medium, waarbij de bacteriën op een gecoördineerde manier over het oppervlak bewegen. CMR12a is een zeer goede antagonist van P. myriotylum wortelrot op cocoyam, zowel bij in vitro testen als in plantenexperimenten. Voor CMR12b werd enkel een in vitro antagonistische werking aangetoond. Het fenazinebiosyntheseoperon werd in CMR12a reeds volledig gekarakteriseerd (phzABCDEFGH) en ligt direct stroomafwaarts van de quorum sensing genen PhzI en PhzR. Zowel CMR12a als CMR12b produceren verschillende acyl-homoserinelactons (AHL’s). CMR12a maakt 3-OH-C6HSL, C6-HSL, 3-OH-C8-HSL, C8-HSL en 3-OH-C12-HSL, terwijl CMR12b enkel 3-OHC8-HSL en 3-OH-C12-HSL produceert. In CMR12a zijn reeds een heel aantal mutanten gemaakt, waaronder de fenazinebiosynthesemutanten 12a-∆phz (volledig fenazine-operon uitgeschakeld) en 12a-PhzH (enkel phzH uitgeschakeld), de biosurfactantmutant 12a-CLP en de gacA-mutant 12a-GacA. Een quorum sensing mutant was tot nu toe nog niet beschikbaar.

2.9 Plaatsspecifieke mutagenese met pMQ30 systeem 38 Om de rol van het PhzI/PhzR quorum sensing systeem te begrijpen bij de productie van secundaire metabolieten en de biologische bestrijdingscapaciteit wordt er een mutant van CMR12a gemaakt in de quorum sensing genen, zodat men kan zien wat er veranderd is als men vergelijkt met het wild type. De plaatsspecifieke mutagenese maakt in dit geval gebruik van in vivo cloning en SacB selectie. Er wordt een deletie gemaakt in phzI en phzR. Allereerst wordt een PCR gedaan zodat 2 flankerende stukken van het uit te schakelen gen worden geamplificeerd (zie Fig. 2.9). 26


Figuur 2.9 Voorstelling van de primers voor het phzI-construct met de bindingsplaatsen

De twee PCR-producten worden dan samen met een digest van de zelfmoordvector pMQ30 in een suspensie van Saccharomyes cerevisiae InvSc gebracht. Tijdens een incubatieperiode worden de DNA-strengen opgenomen door de gist, die ze aaneenplakt tot een volledig plasmide. Hierbij worden de twee PCR-producten aan elkaar bevestigd, waardoor er een versie van het gen ontstaat met een deletie in het midden. Op de volledige plasmiden ligt een gen dat uracil kan aanmaken, om de gisten te selecteren die het volledige construct bezitten. Dat plasmide wordt dan geëxtraheerd en via elektroporatie in E. coli DH5α gebracht.

27


Figuur 2.10 Homologe recombinatie

Via conjugatie wordt het construct met de deletie in het gen overgebracht naar CMR12a. Het plasmide wordt door homologe recombinatie in het genoom van CMR12a gebracht, zodanig dat het gen zich nu tweemaal in het genoom bevindt, één met een deletie en het wild type gen. Deze enkele recombinanten worden geselecteerd met hulp van gentamycine en chloramphenicol. Na deze selectie wordt er voor een tweede homologe recombinatie (zie Fig. 2.10) geselecteerd op 10% sucrose. De bacteriën met het zelfmoordplasmide nog aanwezig in het genoom zullen sterven omdat SacB de sucrose polymeriseert in de cel. Deze tweede homologe recombinatie kan resulteren in twee types kolonies, namelijk één waarbij er terug enkel het wild type gen aanwezig en één dat nog enkel het gen met de deletie bezit. Dit laatste type is de gewenste mutant en kan vervolgens verder bestudeerd worden.

28

Quorum sens ing regu l at ie in Pseudomonas spp. CMR12a en CMR12b Mater ia len en methoden

3

Materialen en methoden

3.1 Voedingsmedia Voor vloeibaar medium werd agar weggelaten bij bereiding. Alle recepten zijn voor 1 l. 3.1.1

Yeast extract Peptone Dextrose (YPD)

Omschrijving:

Rijk medium gebruikt om gisten te kweken.

Samenstelling: 10 g bacto yeast extract (BD, lot: 7109516) 20 g bacto peptone (BD, lot: 5038872) aanlengen tot 900 ml met dd H2O Voeg na autoclaveren een filtersteriele stockoplossing van glucose (VWR, lot: 06B200023) aan het afgekoelde medium toe. 3.1.2

SD medium-uracil

Omschrijving:

Uracil deficiënt voor selectie van getransformeerde gist

Samenstelling: 1 zakje SD medium-ura (MP, lot: 4813-065-120034) oplossing in 0,5 l bidest. Bevat per liter: 1,7 g yeast nitrogen base 5 g ammonium sulfate 20 g dextrose 17 g/l agar-Y (MP, lot: 4019-012-R21436) Controle: SD-uracil+ uracil 1 µl uracilstock (1000x)/ml medium Warm op in de microgolf om alles opgelost te krijgen 3.1.3

King’s B medium (KB)

Omschrijving:

Algemeen ijzerarm medium voor bacteriën, rijk aan voedingsstoffen. Samengesteld om een optimale sideorofoorproductie te induceren bij Pseudomonas spp. 29


Samenstelling: 20 g bacto proteose pepton No 3 (BD, lot: 8161262) 1,5 g K2SO4 (Acros, lot: A0217926) 1,5 g MgSO4 (Across, lot: A0250754) 10 ml glycerol Difco (BD, lot: 8176120) 15 g bacto agar (BD, lot: 8284737) 3.1.4

Luria Bertani medium (LB)

Omschrijving:

Rijk medium, gebruikt om snelle bacteriële groei te bekomen.

Samenstelling: 10 g bacto tryptone (BD, lot: 7095509) 5 g bacto yeast extract (BD, lot: 7109516) 5 g NaCl (Merck, lot: K37303004) 15 g bacto agar (BD, lot: 8284737) Maak LB+2% glucose door na het autoclaveren een filtersteriele stockoplossing van glucose (VWR, lot: 06B200023) toe te voegen aan het afgekoelde LB medium. Gebruik dit medium om E. coli cellen te helpen herstellen na elektroporatie. Maak LB+10% saccharose zonder NaCl door na het autoclaveren een filtersteriele stockoplossing van saccharose (VWR, lot: 08/150011) toe te voegen aan het afgekoelde LB medium. Gebruik dit medium voor sacB-tegenselectie. 3.1.5

CAA (Casamino acid) medium

Omschrijving: ijzerarm vloeibaar medium om siderofoorproductie na te gaan Samenstelling: 5 g bacto casamino acids (BD, lot.8242117) 1 g K2HPO4 (Acros, lot.A0217926) 5 g Chelex 100 Resin (Biorad, lot.1432832) Stel pH op 7. Overnacht

in

koude

kamer

op

een

roerder

(chelex

complexeert

de

kationen. Medium filteren Voeg na autoclaveren MgCl2 toe tot een eindconcentratie van 400 µM. 30


3.1.6

Melkagar

Omschrijving: LB medium met 2% melkpoeder Samenstelling: Componenten voor 1 l LB medium in 800 ml en autoclaveren Maak een suspensie van 20 g melkpoeder (Nestlé) in 200 ml steriel gedestilleerd water en voeg de melksuspensie toe aan het LB medium 3.1.7

Swarming agar

Omschrijving: gebruikt om ‘swarming’ te testen Samenstelling: LB medium met 0,5 % agar 3.1.8

Wateragar

Omschrijving: een minimaal medium waarop Pythium spp. snel groeien. Geschikt wanneer Pythium sp. geïsoleerd moet worden uit de natuur of wanneer Pythium sp. moet concurreren met andere schimmels. Samenstelling: 15 g micro-agar (BD, lot.004561.02) 3.1.9

Potato dextrose agar (PDA)

Omschrijving: rijk medium om schimmels te onderhouden; Pythium vormt er luchtmycelium op. Samenstelling: 39 g potato dextrose agar (BD, lot.8316391) 3.1.10 Proliferatiemedium MS+ Omschrijving:

Dankzij

de

aanwezigheid

van

het

groeihormoon

BAP

(6-

benzylaminopurine), dat tot de groep van de cytokininen behoort, is dit medium geschikt voor het vermenigvuldigen van cocoyam. Samenstelling: 4,405 g Murashige en Skoog medium (incl. vitamines) (Duchefa Biochemie, lot: P02727.01) 1 ml BAP stock (stock = 3 mg/ml) 7,5 g plant agar (Duchefa Biochemie, lot: 006033.05) 30 g D (+)-saccharose (VWR, lot: 08/150011)

31


3.1.11 Individualisatiemedium MS Omschrijving: Een medium dat geschikt is voor het opgroeien van cocoyamscheutjes. Samenstelling: 4,405 g Murashige en Skoog medium (incl. vitamines) (Duchefa Biochemie, lot: P02727.01) 7,5 g plant agar (Duchefa Biochemie, lot: 006033.05) 30 g D (+)-saccharose (VWR, lot: 08/150011)

3.2 Buffers 3.2.1

0,5x TAE-buffer

- 2,42 g Tris (0,02 M) - 0,571 ml 12 M HCl - 0,145 g EDTA (0,0005 M) - pH 8 Opmerking: tenzij anders vermeld, worden de gels voor agarose-gelelektroforese steeds bereid met 1% agarose in 0,5x TAE-buffer, waaraan 2 µl EtBr/100 ml wordt toegevoegd. 3.2.2

1 M LiAc stock oplossing

- 10,2 g LiAc.2H2O (Sigma) - 80 ml gedestilleerd water - gesteld op pH 7,49 - aanlengen tot 100 ml 3.2.3

1 M tris-HCl stock oplossing

- 12,1 g Tris (hydroxymethyl) aminomethane (Acros, lotnr. A0235840) - 80 ml gedestilleerd water - gesteld op pH 8,0 met HCl - aanlengen tot 100 ml met gedestilleerd water 3.2.4

0,1 M EDTA stock oplossing

- 3,72 g ethylene diamine tetraaetic acid, disodium salt dihydrate (372,23 g/mol) (Acros, lotnr. A019696801) 32


- 80 ml gedestilleerd water - gesteld op pH 7,0 met NaOH - aanlengen tot 100 ml met gedestilleerd water 3.2.5

50% PEG stock oplossing

- 50 g polyethylene glycol (MW 3350) (Sigma, lotnr. 037K0140) - aanlengen tot 100 ml met gedestilleerd water 3.2.6

TE-oplossing

- 1 ml tris-HCl stock oplossing - 1 ml 0,1 M EDTA stock oplossing - aanlengen tot 100 ml met gedestilleerd water 3.2.7

40% PLT oplossing (Lazy bones oplossing)

- 1 ml 1 M Tris-HCl stock oplossing - 1 ml 0,1 M EDTA stock oplossing - 8 ml gedestilleerd water - 80 ml 50% PEG stock oplossing - 10 ml 1 M LiAc stock oplossing

3.3 Micro-organismen Saccharomyces cerevisiae InvSc

gist voor in vivo cloning

Escherichia coli DH5α

labostam voor moleculair werk

Escherichia coli HB101 + pRK2013 labostam voor moleculair werk CMR12a

wild type

CMR12b

wild type

CMR12a-GacA

een mutant in GacA

Pythium myriotylum

schimmelachtige die wortelrot veroorzaakt bij cocoyam

Escherichia coli MH155

biosensor stam voor AHL-detectie

Agrobacterium tumefaciens NT1

biosensor stam voor AHL-detectie

33


3.4 Mutatieconstruct 3.4.1

PCR voor flankerend DNA doelgenen

3.4.1.1 Materiaal - PCR-toestel (Applied Biosystems, gene amp® PCR system 2700 - ‘Loading dye’ 6x orange (Fermentas, lot: 0801) - Ethidium bromide (Promega, lot:218129) - ‘Q solution’ 5x (Qiagen, lot: 130180888) - Taq-DNA-polymerase (5 U/µl, Qiagen, lot: 130181426) - ‘Mass Ruler DNA ladder mix’ (Fermentas, lot: 00021924) - PCR buffer 10x (Qiagen, lot: 130183137) - dNTP mix 5 mM (Qiagen, lot: 00029653) - Dubbel gedestilleerd water (MilliQ) - DNA-template - Primers (zie tabel 3.1)

Tabel 3.1 primers voor PCR Naam

Richting

Sequentie

PhzI-up-F

‘Forward’

5’GGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAA ACAGCTGGTTCTGGGGCAAACAGGTAG 3’

Concentratie (µM) 10

34


PhzI-up-R

‘Reverse’

5’CTGGATGGCGATGATCTTCTTCGTATTGGTCCCAT TCACA 3’

10

PhzI-down-F

‘Forward’

10

PhzI-down-R

‘Reverse’

5’TGTGAATGGGACCAATACGAAGAAGATCATCGCC ATCCAG 3’ 5’CCAGGCAAATTCTGTTTTATCAGACCGCTTCTGCG TTCTGATCTCCTTCAAACGTTGGTGGT 3’

PhzR-up-F

‘Forward’

10

PhzR-up-R

‘Reverse’

PhzR-down-F

‘Forward’

PhzR-down-R

‘Reverse’

GM_UP GM_LOW

‘Forward’ ‘Reverse’

5’GGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAA ACAGCTGCATGCAGTTGTTCGTTACGG 3’ 5’GTAGCGTGACCCCCTTCATTGCACCGATACGGTGA ATTA 3’ 5’TAATTCACCGTATCGGTGCAATGAAGGGGGTCAC GCTA 3’ 5’CCAGGCAAATTCTGTTTTATCAGACCGCTTCTGCG TTCTGATATCCGAAGCACTCTCGATCA 3’ 5’GGTGGCTCAAGTATGGGCATCA 3’ 5’ATAGAGAGCCACTGCGGGATCG 3’

10

10 10 10 10 10

3.4.1.2 Methode Maak een PCR-mix voor ieder primerpaar: 5 µl 10x PCR buffer met 15mM MgCl2 10 µl’Q-solution’ 2 µl dNTP’s 2,5 µl F-primer 2,5 µl R-primer 0,25 µl Taq-DNA-polymerase 27,25 µl MilliQ water 49,5 µl PCR-mix + 0,5 µl DNA-template Opmerking: Werk steeds op ijs omdat deze producten beter zo koud mogelijk blijven. Voeg om deze reden Taq-polymerase pas aan de PCR-mix toe juist voordat de PCR-epjes gevuld worden met de PCR-mix. Breng het DNA-staal dan in de epjes. Breng dit alles in het PCR-toestel en stel het correcte PCR-programma met de correcte annealingstemperaturen in. Het standaard PCR-programma ziet er als volgt uit: 35


2 min op 94°C 30 sec 94°C (denaturatie) 30 sec 56°C (annealing)

x30

1 min 72°C (elongatie) 10 min 72°C ‘hold’ 4°C Breng vervolgens bij 5 µl PCR-product 0,83 µl ‘loading dye’. Laad in1% agarosegel (gekleurd met 2 µl/100ml ethidiumbromide) samen met 3 µl ‘Mass Ruler DNA Ladder mix’. Laat de gel lopen onder 120 V gedurende ±30 min. Visualiseer de bandjes onder UV-licht. 3.4.2

Concentratie DNA bepalen van PCR-reactie

3.4.2.1 Materiaal - Spectrofotometer (Nanodrop, ND-1000 Spectrophotometer) 3.4.2.2 Methode Meet de OD bij 260, 280 en 320 nm van 2 µl DNA-staal na calibratie van de detector..Bereken de concentratie DNA in het staal als volgt: Conc. (ng/µl) = OD260*50 De zuiverheid moet boven 1,8 liggen en wordt als volgt berekend: Zuiverheid=(OD260-OD320)/(OD280-OD320) 3.4.3

Miniprep voor pMQ30

3.4.3.1 Materiaal - Centrifuge (Sigma, 4K15 Sartorius) - Centrifuge (Minispin, Eppendorf) - ‘Resuspension solution’ - ‘Lysis solution’ - ‘Neutralization solution’ 36


- ‘Wash solution’ - Dubbel gedestilleerd water (MilliQ) - 1,5 ml epje - ‘GeneJET spin’ column - ‘GeneJET plasmide’ miniprep kit (Fermentas, lotnr. 00025274) - Diepvries -20°C (Liebherr, premium no frost) 3.4.3.2 Methode Breng 6 ml E. coli cultuur met daarin het pMQ30 plasmide, in de centrifuge bij 13400 rpm voor 5 minuten. Resuspendeer de pellet in 250 µl ‘resuspension solution’ en breng over in een epje. Voeg vervolgens 250 µl lysis solution toe en meng de suspensie goed door te zwenken tot de oplossing bijna helder is. Voeg daarna 350 µl ‘neutralization solution’ toe en zwenk een aantal keer. Centrifugeer het epje voor 5 minuten bij 13400 rpm om het chromosomaal DNA en celafval te pelleteren. Transfereer vervolgens het supernatans naar een ‘GeneJET spin’ kolom zonder de pellet te verstoren. Centrifugeer nogmaals voor 1 minuut bij 13400 rpm, verwijder de doorloop en voeg 500 µl ‘wash solution’ in de ‘GeneJET spin’ kolom. Centrifugeer nogmaals 1 minuut bij 13 400 rpm en verwijder de doorloop. Voeg opnieuw 500 µl ‘wash solution’ toe en centrifugeer opnieuw. Centrifugeer nogmaals 1 minuut bij 13 400 rpm om alle ethanolresten te verwijderen. Zet de ‘GeneJET spin’ kolom in een nieuw 1,5 ml epje en voeg 50 µl MilliQ toe, ongeveer in het midden van de ‘GeneJET spin’ kolom membraan om het plasmide van het membraan te halen. Raak het membraan niet aan met de pipettetip. Incubeer 2 minuten bij kamertemperatuur en centrifugeer voor 2 minuten bij 13 400 rpm. Verwijder de kolom en bewaar het gezuiverde plasmide bij -20°C. 3.4.4

Digest pMQ30

3.4.4.1 Materiaal - pMQ30 miniprep - Buffer tango yellow 10x (Fermentas, lotnr. 0023457) - Restrictie enzym EcoR1 (Fermentas, lotnr. 0012359) - Restrictie enzym BamH1 (Fermentas, lotnr. 6321) 37


- Dubbel gedestilleerd water (MilliQ) - Verwarmblok (Lob-line, Multi blok heater) - 1,5 ml epje 3.4.4.2 Methode Voeg onderstaande ingrediënten samen in een epje en incubeer gedurende 2 uur bij 37°C. - 5 µl pMQ30 Miniprep - 4 µl buffer tango yellow - 0,5 µl EcoR1 - 1 µl BamH1 - 0,5 µl MilliQ Controleer het digest met gelelectroforese. 3.4.5

In vivo cloning protocol

3.4.5.1 Materiaal -

TE-buffer

-

Lazy bones solution

-

Warmwaterbad (Lauda, Ecoline 003)

-

PCR product UP

-

PCR product DOWN

-

Overnachtcultuur van gist Saccharomyes cerevisiae InvSc

-

SD-uracil selectief medium

-

Stock uracil (30 g/l)

-

Incubator 30°C (memmert)

-

40% glycerol

-

E. coli DH5α

-

Digested plasmide pMQ30

-

Centrifuge (minispin, eppendorf)

-

Spectrofotometer (Nanodrop, ND-1000 spectrophotometer)

38


3.4.5.2 Methode Pelleteer 0,5 ml overnachtcultuur van de gist door te centrifugeren gedurende 1 minuut bij 3 000 rpm. Was de cellen met 0,5 ml steriele TE buffer en centrifugeer gedurende 1 minuut bij 3 000 rpm. Hersuspendeer de pellet in 0,5 ml Lazy bones solution. Voeg daarbij 20 µl ‘carrier’ DNA (2 mg/ml); 5 µl geknipte plasmide pMQ30; 45 µl PCR product UP en DOWN. (Kook het ‘carrier’ DNA wordt 10 minuten om het enkelstrengig te maken en zet daarna direct op ijs). Vortex de mix gedurende 1 minuut en incubeer overnacht bij kamertemperatuur. Geef het mengsel een heat-shock gedurende 12 minuten bij 42°C in een warmwaterbad. Pelleteer de cellen door 1 minuut te centrifugeren bij 3 000 rpm. Was de cellen met 0,6 ml TE-buffer. Resuspendeer de cellen in 0,6 ml TE-buffer en plaat ze uit op een SD-uracil selectief medium. Plaat op vier SD-uracil platen 150 µl uit en op één SDuracil + uracil plaat 50 µl als controle. Incubeer de platen gedurende drie tot vier dagen bij 30°C. Breng deze over op een nieuwe SD-uracil plaat, éénmaal groei van een gistkolonie zichtbaar is, en incubeer opnieuw gedurende drie tot vier dagen op 30°C. Zodra opnieuw groei zichtbaar is, inoculeer dan 6 ml vloeibaar SD-uracil medium waarvan 2 ml voor de collectie met 40% glycerol (bewaren op -80°C) en 4 ml voor de extractie van het construct. 3.4.6

Miniprep op gist

3.4.6.1 Materiaal - ‘GeneJET plasmide’ miniprep kit (Fermentas, lotnr. 00025274) - Centrifuge (Sigma, 4K15 Sartoruis) - ‘Resuspension solution’ - Glazen beads (Sigma, G-8772) - Homogeniszator (Retsch, MM 301) - Lysis buffer - Neutralisatie buffer - Centrifuge (Minispin, Eppendorf) - ‘Spin’ kolom - 1,5 ml epje - Dubbel gedestilleerd water (MilliQ) 39


- ‘Wash solution’ 3.4.6.2 Methode Kweek een gistcultuur op in 4 ml vloeibaar SD-uracil. Centrifugeer deze cultuur gedurende 5 minuten bij 5 000 g. Giet het supernatans af en resuspendeer de pellet in 250 µl ‘resuspension solution’. Breng het geheel over in een epje. Voeg vervolgens 75 µl van de glazen ‘beads’ toe. Homogeniseer dit mengsel met de homogenisator gedurende 5 minuten aan een frequentie van 25/s. Breng het lysaat over in een nieuw epje. Voeg vervolgens 250 µl lysis buffer toe en zwenk 5 tot 6 keer. Incubeer gedurende 5 minuten op kamertemperatuur. De incubatie mag niet langer duren dan 5 minuten want anders zal het chromosomaal DNA ook in het supernatans aanwezig zijn. Voeg na de incubatieperiode 350 µl neutralisatiebuffer toe en zwenk zacht. Centrifugeer vervolgens 10 minuten aan 13 400 rpm. Breng het supernatans over in een spinkolom, de spinkolom zelf wordt in een 2 ml epje gebracht. Centrifugeer de spinkolom gedurende 1 minuut bij 13 400 rpm en verwijder de doorloop uit het epje. Was vervolgens de kolom door 500 µl ‘wash solution’ op de kolom te brengen en de kolom te centrifugeren gedurende 1 minuut bij 13 400 rpm. Verwijder opnieuw de doorloop uit het epje. Voer de wasstap tweemaal uit. Centrifugeer extra na de tweede wasstap gedurende 1 minuut op 13 400 rpm. Op deze manier worden alle residu’s verwijderd van ‘wash solution’, deze extra centrifugeerstap zorgt voor het drogen van de kolom. Plaats vervolgens de kolom in een 1,5 ml epje. Druppel 25 µl MilliQ in het midden van het membraan van de kolom en incubeer gedurende 1 minuut. Centrifugeer vervolgens de kolom gedurende 1 minuut aan 13 400 rpm. Voeg slechts 25 µl MilliQ toe omdat een groter volume zorgt voor een verlaagde opbrengst, daar een groter volume gelijk staat aan een grotere verdunning. 3.4.7

Wassen van glazen ‘beads’

3.4.7.1 Materiaal - Glazen ‘beads’ (Sigma G-9268, 425-600 µm) - Geconcentreerd HCl 11,96 M (Sigma-Aldrich, lotnr. S32366-435) - Gedestilleerd water 40


3.4.7.2 Methode Breng de gebruikte glazen beads in een pyrex flesje. Het volume van de glazen ‘beads’ moet lager zijn dan 1/5 van het volume van het flesje. Maak 5,8 M HCl door 1 volume geconcentreerd HCl en 1 volume gedestilleerd water samen te voegen. Giet vervolgens dit mengsel in het glazen flesje tot de glazen beads onder de vloeistof zitten. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 1 uur. Giet vervolgens het HCl af uit het fles. Voeg er gedestilleerd water aan toe, minimum 5x het volume glazen ‘beads’. Schud vervolgens met het flesje zodat de ‘beads’ zich mengen met het water. Giet het water af en was de ‘beads’ nog tien maal om de concentratie van het HCl onder de 10 mM te krijgen. Autoclaveer de ‘beads’ en laat ze overnacht drogen in een oven op 50°C. Bewaar de ‘beads’ op kamertemperatuur. 3.4.8

Elektroporatie in DH5α

3.4.8.1 Competente cellen 3.4.8.1.1 Materiaal - 500 ml vloeibaar LB medium + 2% glucose - 12 erlenmeyers van 100 ml - 1 liter dubbel gedestilleerd water (MilliQ) - 50 ml 10% glycerol - 100-tal epjes - Steriele glazen pippetten (4 x 20 ml; 3x10 ml; 2x5 ml) - Diepvries -80°C (Thermo, Forma) - Spectrofotometer (Kontron, Uvikon 932) - Schudder (B. Braun, Certomat) - Centrifuge (Sigma, 4K15 Sartorius) 3.4.8.1.2 Methode Breng 25 ml LB + 2% glucose in de laminaire flow over in erlenmeyers. Voeg daaraan vervolgens 750 µl van de DH5α precultuur steriel toe zodat de nieuwe cultuur een OD550 41


heeft lager dan 0,15. Incubeer de erlenmeyers in de schudder bij 37°C aan 200 rpm tot de culturen een OD550 tussen 0.5 en 0.6 bereikt hebben. Dan bevinden de bacteriën zich in de log-fase en is de celwand het dunst en dus het meest ontvankelijk. Bewaar ze minimum een half uurtje in de koude kamer zodat ze stoppen met groeien. Voer alle verdere stappen uit op ijs. Koel de centrifuge af tot 4°C. Verdeel de culturen over 6 steriele falcons. Ze moeten per koppel evenveel wegen, er is wel een marge van 0,5 g. Centrifugeer de culturen gedurende 15 minuten aan 2 000 g in de afgekoelde centrifuge. Giet vervolgens het supernatans weg en resuspendeer de pellet in 45 ml koud, steriel MilliQ met koude, steriele glazen pipetten. Let vooral op dat de pellet niet aangeraakt word met de pipet. Giet best het water langs de wand in de falcon. Centrifugeer daarna opnieuw gedurende 15 minuten aan 2 000 g in de afgekoelde centrifuge. Verwijder het supernatans. Hierbij moet men opletten dat de pellet niet los komt. Resuspendeer de pellet in 20 ml koud en steriel MilliQ, dit gebeurt met steriele pipetten. Verdeel de suspensies over vier falcons die per koppel evenveel wegen. Centrifugeer opnieuw gedurende 15 minuten aan 2 000 g in de afgekoelde centifuge. Giet het supernatans weg en resuspendeer de pellet in 4,5 ml 10% glycerol. Verdeel de suspensie over 2 falcons en centrifugeer gedurende 15 minuten bij 4°C en 2 000 g. Giet het supernatans af. Voeg 200 µl koude steriele 10 % glycerol aan toe en hersuspendeer de pellet. Breng ± 35 µl over in epjes en plaats in de diepvries aan -80°C. 3.4.8.2 Electroporatie 3.4.8.2.1 Materiaal - Elektroporator (Bio-rad, gene pulser II) - LB medium + 2% glucose - LB platen met Gm 20 ppm - Plasmide - E. coli DH5α - Elektroporatiecuvetjes - Centrifuge (Sigma, 4K15 Sartorius) - Schudder (B. Braun, Certomat) 42


3.4.8.2.2 Methode Meng 4 µl plasmidesuspensie en 1 epje DH5α uit de -80°C diepvries. Breng alles in een elektroporatiecuvetje en plaats het cuvetje in een elektroporator met de instellingen: 2,50 volt; 25 capacitance; 200 ohm (low range). Elektroporeer het cuvetje. Breng daarna de inhoud van het cuvetje naar een proefbuis met 1 ml LB + 2% glucose. Plaats de proefbuis in de schudder gedurende 1 uur bij 37°C en 149 rpm. Dit alles moet snel gebeuren om het sterftecijfer van de bacteriën laag te houden. Plaat daarna 100 µl uit op LB met 20 ppm gentamycine. De rest wordt geconcentreerd tot ongeveer 100 µl en ook uitgeplaat op een LB plaat met 20 ppm gentamycine. 3.4.9

PCR om constructen te controleren (kolonie-PCR)

3.4.9.1 Materiaal Hetzelfde als onder 3.4.1.1

Materiaal

3.4.9.2 Methode Maak een PCR-mix voor ieder primerpaar: Meng voor de DNA-template een tipje met bacterie kolonie in een epje met 50 µl MilliQ. 3 µl 10x PCR buffer met 15mM MgCl2 6 µl Q-solution 1 µl dNTP’s 1 µl F-primer 1 µl R-primer 0,1 µl taq DNA-polymerase 7,9 µl MilliQ water 20 µl PCR-mix +10 µl DNA-template (kolonie in 50 µl MilliQ) Opmerking: Er wordt voortdurend op ijs gewerkt omdat deze producten beter zo koud mogelijk blijven. Om deze reden wordt Taq-polymerase pas toegevoegd aan de PCR-mix juist voordat de PCR-epjes gevuld worden met de PCR-mix. Het DNA-staal wordt dan in de epjes gebracht. 43


Dit alles wordt in het PCR-toestel gebracht en het correcte PCR-programma met de correcte annealingstemperaturen wordt ingesteld. Het PCR-programma ziet er als volgt uit: 2 min op 94°C 30 sec 94°C (denaturatie) 30 sec 54°C (annealing)

x30

3 min 72°C (elongatie) 10 min 72°C ‘hold’ 4°C Breng 0,83 µl ‘loading dye’ bij 5 µl PCR-product. Laad dit in 1% agarosegel (gekleurd met 2 µl/100ml ethidiumbromide) samen met 3 µl ‘Mass Ruler DNA Ladder mix’. Laat de gel lopen onder 120 V gedurende ±30 min. Visualiseer de bandjes onder UV-licht.

3.5 Plaatsspecifieke mutagenese 3.5.1

Conjugatie (eerste homologe recombinatie)

3.5.1.1 Materiaal - Vloeibaar LB medium - Centrifuge (Sigma, 4K15 Sartorius) - 1,5 ml epje - Incubator 28°C (Memmert) - Incubator 37°C (Memmert) - Schudder (B. Braun, Certomat) - LB platen + GM 300 + CM 20 - KB platen + GM 500 - KB platen - Proefbuizen

44


3.5.1.2 Methode Groei een overnachtcultuur in 3 ml LB met de nodige antibiotica van de donorstam, E.coli DH5α met het construct; acceptorstam, CMR12a; en helperstam, E.coli HB101 + pRK2013. De inoculatie voor de overnachtculturen gebeurt van een verse plaat uitgestreken vanuit de collectie. Inoculeer de volgende ochtend verse culturen in 3 ml LB zonder antibiotica van de 3 stammen (3000 µl LB + 100 µl ONcultuur). Laat deze culturen 3 à 4 uren incuberen in de schudder tot een OD620 van 0.4 à 0.6. Daarna voorzichtig centrifugeren gedurende 10 minuten bij 2 000 rpm. Was de pellet met 1,5 ml vloeibare LB door de pellet te hersuspenderen en terug voorzichtig te centrifugeren. Verwijder het supernatans en hersuspendeer de pellet in een klein volume LB. De concentratie van de E. coli is 5x geconcentreerder dan de Pseudonomas (acceptor). Vb. E. coli’s in 20 µl LB Pseudomonas-acceptor in 100 µl LB Voeg voor de conjugatie 20 µl van elke stam bijeen in een epje en spot de druppel van 60 µl op een LB plaat zonder antibiotica. Laat de druppel een beetje drogen en incubeer de plaat overnacht bij 28°C. Om de selectie uit te voeren wordt de plaat afgeschraapt en gesuspendeerd in 1 ml LB. Maak een verdunningsreeks tot 10-4 en plaat 100 µl uit op LB + GM 500 + CM 20 van elke verdunning. Suspendeer van elke gebruikte bacterie een bepaalde hoeveelheid in 1 ml LB als controle. Deze hoeveelheid is afhankelijk van de concentratie, probeer om een zelfde concentratie na te bootsen van de 10-1 verdunning. Incubeer de platen bij 28°C voor 3 dagen. Pik een aantal kolonies op en zet over op een KB plaat en een KB plaat met 500 ppm gentamicine. Controleer voor de eerste recombinatie met een kolonie-PCR. 3.5.2

Tweede homologe recombinatie

3.5.2.1 Materiaal - Vloeibaar LB medium - Centrifuge (Sigma, 4K15 Sartorius) - 1,5 ml epje - Incubator 28°C (Memmert) 45


- Schudder (B. Braun, Certomat) - LB platen + 10 % sucrose - Proefbuizen 3.5.2.2 Methode Inoculeer 3 ml LB met een goeie kolonie. Laat deze culturen 3 à 4 uren incuberen in de schudder. Plaat van die cultuur een 10-1, 100 en een geconcentreerde suspensie uit op een LB plaat + 10 % sucrose. Laat de plaat overnacht incuberen bij 28°C. Controleer enkele van de kolonies die verschijnen op de platen met kolonie-PCR voor de tweede recombinatie.

3.6 Karakterisatie mutanten 3.6.1

Acyl-homoserinelactons: cross streak assays

3.6.1.1 Materiaal - E. coli MH155 - LB-plaat 3.6.1.2 Methode Dit is een snelle en eenvoudige test die wordt uitgevoerd om een eerste beeld te krijgen van de AHL-productie van CMR12a, CMR12a-PhzI en CMR12a-GacA. Het ‘assay’ wordt uitgevoerd op LB-platen zonder antibiotica. Trek bovenaan de platen een streep met E. coli MH155, de biosensor, en trek loodrecht op deze streep een andere streep met de bacteriën van de te testen stam. Begin hierbij aan de andere kant van de plaat naar de biosensorstreep toe, zo dicht mogelijk maar zonder ze te raken. Bekijk voor de detectie de platen onder UV-licht. 3.6.2

Acyl-homoserinelactons: extractie en TLC-overlay

3.6.2.1 Materiaal - Steriele erlenmeyers - LB broth 46


- LB agar - Spectrofotometer, 620 nm (thermo labsystems, Multiskan ex) - Aangezuurd ethylacetaat (VMR, lot.07I100547)(1 ml glaciaal acetic acid (MP biomedicals, 6517F) in 1 l ethylacetaat) - Kleine glazen buisjes - N2-gas - TLC-plaat op aluminium (Merck) - Proefbuizen - X-gal (stockopl. 20 mg/ml) - Gentamycine (stockopl. 50 mg/ml) - Indampschaaltjes - Trechter - Filtreerpapier (whatman) - Falcons - -80°C diepvries (Thermo, Forma) - -20°C diepvries (Liebherr, premium no frost) - Schudder (B. Braun, Certomat) - Centrifuge (Sigma, 4K15 Sartorius) 3.6.2.2 Methode Inoculeer 4 ml LB broth + 25 ppm Gm met A. tumefaciens NT1 en laat overnacht incuberen. Inoculeer ’s morgens 2x30 ml LB met 1,5 ml overnachtcultuur per 30 ml LB en laat groeien tot de late log-fase. Inoculeer erlenmeyers met 25 ml LB met de gewenste stammen en incubeer overnacht. Bepaal de celdensiteit van de culturen. Centrifugeer in falcons voor 10 minuten bij 10 000 g. De falcons moeten per koppel ongeveer evenveel wegen met een marge van 0,5 g. Breng het celvrij supernatans in een nieuw falcon. Voeg 25 ml aangezuurd ethylacetaat toe. Kantel de falcons gedurende 1 minuut. Laat de fasen scheiden door te centrifugeren voor 1 minuut bij 2 000 g. Plaats de falcons gedurende 30 minuten in de -80°C diepvries om het water te bevriezen. Breng de ethylacetaatfase (bovenaan) over in een nieuwe falcon. Verwijder met een pasteurpipet de laatste bubbels water onderaan. Voeg in elk extract een schepje MgSO4.H2O en schud goed. Het water zal 47


eraan binden en klonteren. Filtreer het extract dan via een trechter en filterpapier zodat de MgSO4 er weer uit is. Bewaar het extract bij -20°C. Breng het extract in indampschaaltjes in de trekkast. Laat het extract indampen tot alles in een klein glazen buisje kan. Damp de rest van het extract droog in glazen buisjes met behulp van N2-gas. Los het AHL-extract weer op in 25 µl aangezuurde ethylacetaat toe en spot 4,2 µl van het extract direct op de TLC-plaat. Plaats na het spotten de TLC-plaat in een TLC-tank met een water/methanol (40:60 v:v) mengsel als loopmiddel. Ontwikkel de TLC-plaat tot het loopfront de bovenrand bereikt heeft. Laat de plaat drogen en leg ze in een waterdicht bakje. Maak een LB mengsel van 160 ml gesmolten LB agar + 80 ml LB broth en laat het 1 uur in een warmwaterbad van 45°C staan. Voeg daarna 60 ml A. tumefaciens NT1 cultuur, 60 µg/ml X-gal en 50 ppm Gm toe en overgiet de TLC-plaat ermee. Laat het mengsel stollen en incubeer bij 28°C. 3.6.3

Fenazines

3.6.3.1 Materiaal - KB platen - Steriel gedestilleerd water - Erlenmeyers - Scalpel - Indampschaaltjes - TLC plaat (Merck) - Methanol (VWR, lot.08K180518) - Chloroform (VWR, lot.08H270504) - Incubator 28°C (Memmert) 3.6.3.2 Methode Ent een KB plaat vol met de bacterie en laat gedurende 2 à 3 dagen groeien bij 28°C. Giet een beetje steriel gedestilleerd water op de volgroeide plaat, spatel de bacteriën los en verwijder de suspensie. Snij het medium in stukjes en giet ze in een erlenmeyer. Voeg 12 ml chloroform toe en schud de erlenmeyers gedurende 1 uur bij 37°C en 150 rpm. Zorg dat de erlenmeyer goed afgedicht is zodat de chloroform niet veel verdampt. Damp het extract 48


droog in de trekkast in indampschaaltjes. Los de extracten op in 30 µl methanol en spot op een TLC-plaat. Ontwikkel de TLC plaat in tolueen:aceton (3:1 v:v). Detectie gebeurt onder UV-licht. 3.6.4

Biosurfactants

3.6.4.1 Materiaal - Parafilm - MilliQ 3.6.4.2 Methode Neem met een tipje een kleine hoeveelheid bacterie en suspendeer die in 60 µl MilliQ op een stuk parafilm. Zuig het druppeltje op en plaats het op een proper stukje parafilm. Controleer na een minuutje of de druppel uitvloeit of niet. 3.6.5

Exoproteasen

3.6.5.1 Materiaal - Melkagar plaat - Incubator 28°C (Memmert) 3.6.5.2 Methode Inoculeer de bacterie in het centrum van de plaat en incubeer 3 dagen bij 28°C. 3.6.6

Pyoverdines

3.6.6.1 Materiaal - CAA medium - Steriele proefbuizen - Spectrofotometer (Thermo Labsystems, Multiskan) - Incubator 28°C (Memmert) - Centrifuge (Minispin, Eppendorf)

49


3.6.6.2 Methode Was alle glaswerk met 0,1 N HCl om het ijzervrij te maken. Inoculeer een proefbuis met 3 ml CAA medium en incubeer overnacht bij 28°C. Bepaal de OD620 van de culturen. Voer 3 herhalingen uit per stam. Centrifugeer ongeveer 1,5 ml van de cultuur in epjes voor 5 minuten bij 13 400 rpm. Meet de OD405 van het supernatans met 3 herhalingen per stam. 3.6.7

Swarming

3.6.7.1 Materiaal - Swarming plaat - Incubator 28°C (Memmert) 3.6.7.2 Methode Inoculeer in het midden van de swarming agar plaat met de bacterie en incubeer overnacht bij 28°C.

3.7 Infectieproeven 3.7.1

In vitro propagatie cocoyam

3.7.1.1 Proliferatie 3.7.1.1.1 Materiaal - Glasparelsterilisator (Steri 350) - Proefbuizen met 10 ml MS medium - Proefbuizen met 10 ml MS+ medium - Pincet - Scalpel 3.7.1.1.2 Methode Neem een plant die staat in MS-medium. Verwijder de bladeren, wortels, medium en callusweefsel. Scheid de apex en de knol, en druk de apex met de onderkant in MS

50


medium. Druk ook de knol met de onderkant in MS+ medium. Incubeer de proefbuizen met het medium bij 26°C, 16 u licht / 8 u donker voor 6 tot 8 weken. 3.7.1.2 Individualisatie 3.7.1.2.1 Materiaal - Glasparelsterilisator (Steri 350) - Pincet - Scalpel - Proefbuizen met 10 ml MS medium 3.7.1.2.2 Methode Neem een plant die staat in MS+ medium. De verschillende scheuten worden gescheiden met elk een stukje knol eraan. Verwijder de wortels, medium en callusweefstel. Plaats de scheutjes in 10 ml MS medium. Incubeer de proefbuizen met het medium bij 26°C, 16 u licht / 8 u donker voor 6 tot 8 weken. 3.7.2

Opzetten infectieproef

3.7.2.1 Materiaal - Potgrond - Steriele mix vulkanische grond en zand (substraat) - Pythium myriotylum gegroeid op PDA - Pseudomonas stammen gegroeid op KB - Steriel gedestilleerd water - Spectrofotometer (Kontron, Uvikon 932) - Steriele fysiologische oplossing - Mixer ( Ultra-Turrax, IKA- werke) - Steriele erlenmeyer - -1.5 ml epjes 3.7.2.2 Methode Acclimatisatie 51


Haal de plantjes uit de proefbuis en verwijder het medium. Plant de plantjes in een grote bak met potgrond en maak de grond vochtig. Omwikkel daarna de grote bak met plastiek en plak hem dicht zodat de plantjes in een hoge luchtvochtigheid zitten. In de volgende 2 weken wordt het plastiek beetje bij beetje geopend zodat de plantje zich kunnen aanpassen aan een lagere luchtvochtigheid. Inoculatie grond met bacteriën Laat gedurende 2 dagen CMR12a, CMR12a-PhzI en CMR12a-GacA opgroeien op KB bij 28°C. Er zijn per stam 4 platen. Breng hierop telkens 10 ml steriele F.O. om de bacteriën los te weken met een spatel. Breng de bacteriesuspensie in een steriele erlenmeyer en maak een 10x verdunning in een epje. Bepaal van deze 10 keer verdunde bacteriesuspensie OD bij 620 nm met een spectrofotometer. Breng daarvoor voor elke stam 3 keer 100 µl van de verdunning in een welletje van een microtiterplaat. Bereken het gemiddelde van de 3 ODwaarden en zet om naar de concentratie van de onverdunde bacteriesuspensie via volgende formule: Concentratie van de suspensie (CFU/ml) = 3,5*1010 x gemiddelde OD van de 10 keer verdunde susppensie Bereken dan, uitgaande van deze concentratie, hoeveel ml van deze suspensie er moet toegevoegd worden aan het substraat (900 g per handeling) om 3*106 CFU/g substraat te bekomen. Verdun deze hoeveelheid tot 100 ml met steriel gedestilleerd water en meng bij de grond gedurende 2 min. Incubeer het geïnoculeerde substraat gedurende 3 dagen bij 28°C, zodat de bacteriën de grond kunnen koloniseren. Inoculatie grond met P. myriotylum Laat gedurende 5 dagen P. myriotylum opgroeien op PDA bij 28°C. Snijd de platen in stukjes en breng ze in een steriele erlenmeyer met 250 ml steriel water. Maak het mycelium fijn met een mixer. Autoclaveer eerst de mixer om contaminatie te vermijden. Bepaal de kwantiteit van de myceliumstukjes onder de microscoop met een Bürker telkamer. Breng daartoe een druppel van de myceliumsuspensie (eerst schudden) op de 52


telkamer en tel het aantal myceliumstukjes per vierkant van 1 mm x 1 mm, zowel in de 9 vierkanten aan de boven- als aan de onderzijde van de kamer. Herhaal deze telling 5 keer met telkens een nieuwe druppel myceliumsuspensie. Bereken het gemiddelde aantal hyfen per vierkant van 1 mm x 1 mm en maak aan de hand van volgende formule een schatting van de concentratie Pythium in de suspensie: Aantal stukjes mycelium/ml = gemiddeld aantal stukjes in 1 vierkant / 10-4 ml Bereken dan uitgaande van deze concentratie, hoeveel ml van deze suspensie moet toegevoegd worden aan het substraat (900 g per behandeling) om 625 propagules/g substraat te bekomen. Verdun deze hoeveelheid in 50 ml steriel gedestilleerd water en meng het inoculum bij de grond gedurende 2 min. Verdeel de grond voor elke behandeling over vijf potjes. Bereiding worteldipsuspensie Bereid de bacteriesuspensies en bepaal de concentratie zoals beschreven voor de inoculatie van de grond Bereken uitgaande van deze concentratie hoeveel ml er moet toegevoegd worden aan 40 ml F.O om 3*106 CFU/ml te bekomen. Worteldip en planten cocoyams Haal de cocoyams uit de potgrond en spoel de wortels zo goed mogelijk af. Dip de plantenwortels in de Pseudomonas suspensie (3*106 CFU/ml) gedurende 1 min en plant elk plantje apart in een potje (5 plantjes per behandeling). 3.7.3

Scoren infectie

3.7.3.1 Materiaal - Scoreblad (bijlage 1)

53


3.7.3.2 Methode Elk blad krijgt een score van 0 tot 4; - 0: gezond; - 1: meer groen dan geel; - 2: evenveel groen als geel; - 3: meer geel dan groen; - 4: dood Disease index (%) =

((aantal bladeren met score 0) * 0) + ((aantal bladeren met score1) *1) + ... (totaal aantal bladeren * 4) 3.7.4

Bepalen wortelkolonisatie

3.7.4.1 Materiaal - Steriele mortier en stamper - Proefbuizen met steriel F.O. voor verdunning. - KB platen - KB platen + 100 ppm Km - KB platen + 100 ppm Gm - KB platen + 100 ppm Rif 3.7.4.2 Methode

Weeg ongeveer 5 g grond van elk potje en meng het met 10 ml steriel F.O. in een mortier gedurende 30 seconden. Maak een verdunningsreeks tot 10-5 in F.O. en plaat 1 keer 100-3; 2 keer 10-4; 1 keer 10-5 uit (telkens 100 µl). Spoel de grond van de wortels en dep de wortels droog. Weeg de wortels en grind de wortels met rijnzand en 10 ml F.O. gedurende 2 minuten. Maak een verdunningsreeks tot 10-3 en plaat 1 keer 100; 1 keer 10-1; 2 keer 10-2; 2 keer 10-3 uit (telkens 100 µl). Incubeer de platen twee dagen bij 28°C en tel het aantal kolonies van 12a of zijn mutanten op elke plaat.

54

Quorum sens ing regu l at ie in Pseudomonas spp. CMR12a en CMR12b Resul ta ten en d iscuss ie

4

Resultaten en discussie

4.1 Productie van het mutatieconstruct Het uiteindelijke doel van het eerste deel van het onderzoek is de constructie van het pMQ30 plasmide dat phzI of phzR bevat, met een deletie. Dit wordt bekomen door eerst het flankerende DNA te amplificeren. Dit geamplificeerd DNA wordt dan samen met het digest van pMQ30 in een gist gebracht die het dan samenplakt tot een volledig plasmide. Dit plasmide wordt dan geëlektroporeerd in een E. coli. 4.1.1

PCR voor flankerend DNA doelgenen

De eerste stap is de PCR om fragmenten te amplificeren voor de mutatieconstructen. Deze PCR gebeurt vanaf een cosmide uit de genomische bank van CMR12a, namelijk 17B3. Hierop liggen de genen voor fenazinebiosynthese en ook PhzI en PhzR. Voor het PhzIconstruct worden twee fragmenten geamplificeerd, namelijk PhzI-UP en PhzI-DOWN, resp. stroomopwaarts en stroomafwaarts gelegen van PhzI. Voor het PhzR-construct worden analoge fragmenten geamplificeerd. Het resultaat van de eerste PCR-reactie wordt weergegeven in Fig. 4.1. Deze resultaten worden bekomen na het uitvoeren van PCR-reacties met de primerkoppels.

Figuur 4.1 Resultaten van de eerste PCR-reactie Laan 1: DNA Ladder Laan 2: PhzI-up Laan 3: PhzI-down Laan 4: PhzR-up Laan 5: PhzR-down

Het PCR-product van PhzR-down is niet gelukt. Daarom wordt er een PCR op PCR uitgevoerd (Zie Fig. 4.2). 55


Figuur 4.2 Resultaten van de PCR op PCR Laan 1: DNA Ladder Laan 2: PhzR-down

Uit hoger genoemde resultaten kan besloten worden dat enkel primerkoppel vier een groter aantal cycli nodig heeft om een goede amplificatie zichtbaar te maken. 4.1.2

Concentratiebepaling van het DNA na de PCR-reactie

Na de PCR-reactie wordt de concentratie bepaald met als doel in de volgende stap van de productie een gelijke concentratie van DNA te gebruiken. Ook de zuiverheid is van belang, enkel de stalen met een zuiverheid boven 1,8 zijn zuiver genoeg om in de volgende stap te gebruiken (zie Tabel 4.1). Tabel 4.1 Concentratiebepaling van het DNA in de PCR-producten.

Conc. (mg/ml)

Zuiverheid

PhzI-up

400,6

1,92

PhzI-down

377,8

1,88

PhzR-up

352,9

1,93

PhzR-down

376,1

1,81

Uit hoger genoemde resultaten kan besloten worden dat alle stalen zuiver genoeg zijn om in de volgende stap gebruikt te worden. Uit de bekomen resultaten kan de verdunning worden opgesteld. Voor de digestie moet er een gelijke concentratie aan DNA zijn per koppel. Dit gebeurt volgens dit pipetteerschema(zie Tabel 4.2). Tabel 4.2 Pipetteerschema

Aantal µl DNA

Aantal µl MQ

Concentratie (ng/µl) 56


PhzI-up

30,2

14,8

268

PhzI-down

32,0

13,0

268

PhzR-up

32,0

13,0

251

PhzR-down

30,0

15,0

251

4.1.3

Miniprep op E.coli cellen die het pMQ30 plasmide bezitten

Voor een productie van een voldoende hoeveelheid van het pMQ30 plasmide, wordt een miniprep uitgevoerd op E. coli cellen die dit plasmide bezitten. Hiervoor wordt gebruik gemaakt van een ‘GeneJET plasmide’ miniprep kit. Na de isolatie met behulp van de kit, wordt het DNA op gel geladen; om te bepalen of het DNA succesvol geïsoleerd werd (Zie Fig. 4.3).

Figuur 4.3 Resultaat miniprep Laan 1: DNA Ladder Laan 2: opgezuiverd pMQ30

Er kan worden geconcludeerd dat het DNA goed geïsoleerd werd uit de E. coli cellen. Het DNA wordt gebruikt in de volgende stap voor de productie van het pMQ30 plasmide met een deletie in phzI of phzR.

57


4.1.4

Digestie van pMQ30 plasmide met EcoRI en BamHI

Na de extractie van het pMQ30 plasmide wordt het geknipt, dit wordt digestie genoemd. De digestie gebeurt met twee verschillende restrictie-enzymen, EcoRI en BamHI. In Fig. 4.4 worden de knipplaatsen van deze enzymen weergegeven.

Figuur 4.4 Zelfmoordplasmide pMQ30

Na de digestie wordt bepaald of het knipproces goed verlopen is. Dit wordt nagegaan door het staal op een gel te laden. In Fig. 4.5 wordt de digestie op de gel weergegeven.

Figuur 4.5 Resultaten van de digestie. Laan 1: DNA Ladder Laan 2: digestie van pMQ30

Op de foto kan worden waargenomen dat het bandje lager gelokaliseerd is dan het zuiver ongeknipte plasmide dat zichtbaar is op figuur 4.4. Nu het pMQ30 plasmide geknipt is, kan de in vivo klonering gestart worden.

58


4.1.5

In vivo cloning in gistcellen

De laatste stap van de productie van het pMQ30 plasmide met een deletie in phzI of phzR is de in vivo klonering. De in vivo klonering houdt in dat het geknipte pMQ30 plasmide samen met de verdunde PCR-producten in een gist worden samengevoegd. In de gist wordt tevens een ‘carrier’ DNA binnengebracht, dit ‘carrier’ DNA voorkomt de snelle afbraak van het pMQ30 plasmide en de PCR-producten. Als alles in de gist zit, zal de gist het pMQ30 plasmide samenvoegen tot een volledig plasmide. Na een nacht incubatie worden de gistcellen uitgeplaat op een selectief SD-uracil medium waarna ze drie dagen geïncubeerd worden bij 30°C. Na deze incubatie wordt opnieuw een miniprep uitgevoerd. 4.1.6

Miniprep op gist

Na de in vivo klonering in de gistcel, wordt het nieuw gevormde plasmide uit de gistcel geïsoleerd. Deze isolatie gebeurt opnieuw met de ‘GeneJET plasmide’ miniprep kit. Na de isolatie wordt het opgezuiverde DNA opnieuw op gel geladen (Zie Fig. 4.6).

Figuur 4.6 Resultaten van de extractie van het PhzI- en PhzR-construct uit de gist. Laan 1: DNA Ladder Laan 2-8: miniprep van PhzI-construct uit gist

Door de lage DNA-concentratie van de extracten zijn de bandjes niet duidelijk zichtbaar, maar uit de foto’s kan het volgende besloten worden: in laan 3 en in laan 5 zijn de PhzIconstructen aanwezig, en in laan 3 en 4 zijn de PhzR-constructen zichtbaar. Deze stalen zijn dus bruikbaar voor verder werk.

59


4.1.7

Elektroporatie in DH5α

4.1.7.1 Productie van competente cellen

Er is een productie van competente cellen nodig om hierop elektroporatie uit te voeren. Deze cellen worden opgekweekt tot de exponentiële log-fase. Tijdens deze log-fase is de celwand het dunst en dus ook het meest toegankelijk om het construct te accepteren. 4.1.7.2 Elektroporatie

Om een conjugatie te kunnen uitvoeren met CMR12a en CMR12b wordt het construct binnengebracht in de competente DH5α cellen. Hiervoor wordt gebruik gemaakt van elektroporatie. Bij deze techniek worden met behulp van een elektrische spanning, tijdelijke poriën gevormd waardoor het construct de cel kan binnendringen. Vervolgens worden de cellen uitgeplaat op een selectief medium, namelijk een algemene bodem met 20 ppm gentamicine. Hierop kunnen enkel DH5α cellen groeien die het construct hebben opgenomen, omdat er op pMQ30 een gentamycineresistentiegen ligt. 4.1.8

Controle van de geproduceerde constructen met behulp van kolonie-PCR

De reden van deze PCR is de controle van de geproduceerde constructen. Deze PCR wordt met de primers PhzI-up-F en PhzI-down-R voor het PhzI-construct (laan 2-8) en PhzR-upF en PhzR-down-R voor het PhzR-construct (laan 9-15) uitgevoerd (zie Fig. 4.7).

Figuur 4.7 Resultaten van kolonie PCR Laan 1: DNA Ladder Laan 2: 17B3 (negatieve controle) 2154 bp Laan 3: plasmide pMQ30-PhzI (positieve controle) 1816 bp Laan 4-8: DH5α-pMQ3O-PhzI Laan 9: 17B3 (negatieve controle) 2209 bp Laan 10: plasmide pMQ30-PhzR (positieve controle) 1746 bp Laan 11-15: DH5α-pMQ3O-PhzR Laan 16: DNA Ladder

60


Uit de foto (Fig. 4.7) kan worden afgeleid dat de stalen allemaal positief zijn en de productie van de mutatieconstructen dus succesvol is verlopen.

4.2 Plaatsspecifieke mutagenese 4.2.1

Conjugatie (eerste homologe recombinatie)

Nu de constructen succesvol geproduceerd werden; worden een PhzI- en een PhzR-mutant in CMR12a geconstrueerd. De PhzI-mutant in CMR12b wordt op analoge wijze verkregen. CMR12b-PhzI wordt gemaakt met behulp van het construct, gebaseerd op het genomisch DNA van CMR12a, omdat deze twee stammen zeer verwant zijn en hun genomisch materiaal dus ook zeer gelijkend is. Vooreerst wordt er een conjugatie uitgevoerd. Dit is de eerste homologe recombinatie. Hiervoor wordt een donorcel, E.coli DH5α met het construct; een helpercel, E.coli HB101 + pRK2013 en een acceptorcel, CMR12a samengevoegd. Het plasmide pRK2013 bevat de mob en tra genen die instaan voor de conjugatie. Van dit mengsel worden verschillende verdunningen uitgeplaat op een selectieve bodem. Deze bodem is selectief door de aanwezigheid van gentamicine. Enkel de bacteriën die het volledige pMQ30-PhzI plasmide hebben opgenomen in hun genoom, zullen groeien op deze bodem. pMQ30 kan namelijk niet amplificeren in Pseudomonas, vandaar “zelfmoordplasmide”. Op enkele van deze kolonies wordt een kolonie-PCR uitgevoerd om te controleren indien de integratie van het construct in het genomisch DNA gelukt is (zie Fig. 4.8). Als controle wordt ook een PCR gedaan op de gentamycineresistentie (zie Fig 4.9).

Figuur 4.8 Resultaten van de eerste homologe recombinatie Laan 1: DNA Ladder Laan 2: 17B3 (negatieve controle) 2154 bp Laan 3: DH5α-pMQ30-PhzI (positieve controle) 1816 bp Laan 4: CMR12a (negatieve controle) 2154 bp Laan 5-8: CMR12a-pMQ3O-PhzI (merodiploide)

61


Laan 9: 17B3 (negatieve controle) 2209 bp Laan 10: DH5α-pMQ30-PhzR (positieve controle) 1746 bp Laan 11: CMR12a (negatieve controle) 2209 bp Laan 12-14: CMR12a-pMQ3O-PhzR (merodiploide) Laan 15: CMR12a Laan 16: DNA Ladder

Figuur 4.9 Resultaten van de controle PCR op gentamycineresistentie. Laan 1: DNA Ladder Laan 2: 17B3 (negatieve controle) Laan 3: DH5α-pMQ30-PhzI (positieve controle) Laan 4: CMR12a (negatieve controle) Laan 5-8: CMR12a-pMQ3O-PhzI Laan 9: 17B3 (negatieve controle) Laan 10: DH5α-pMQ30-PhzR (positieve controle) Laan 11: CMR12a (negatieve controle) Laan 12-15: CMR12a-pMQ3O-PhzR Laan 16: DNA Ladder

De eerste homologe recombinatie is voor alle geteste kolonies gelukt van de PhzI-mutant. Bij de PhzR-mutant is deze van laan 15 niet gelukt. Er wordt met een duidelijke merodiploid verder gewerkt. 4.2.2

Tweede homologe recombinatie

Na de eerste homologe recombinatie volgt de tweede homologe recombinatie. Hiervoor worden enkele kolonies uitgepikt en gedurende enkele uren opgegroeid in een vloeibaar algemeen medium. Deze worden vervolgens opnieuw uitgeplaat op een selectieve bodem. Nu is de bodem selectief door de aanwezigheid van 10% sucrose. Door de sucrose zullen 62


de bacteriën die het volledige pMQ30 construct bevatten, sterven; aangezien deze bacteriën het sucrose zullen polymeriseren door de aanwezigheid van sacB op pMQ30. Er kunnen dus twee soorten bacteriën groeien op deze bodem; de bacteriën die opnieuw enkel het wild type gen bevatten, en de bacteriën die het gen bevatten met de phzI-deletie. Om onderscheid te maken tussen deze twee soorten bacteriën, wordt een kolonie-PCR-reactie uitgevoerd (zie Fig. 4.10 en 4.11)

Figuur 4.10 Resultaten van tweede homologe recombinatie voor PhzI-mutant Laan 1: DNA Ladder Laan 2: 17B3 (negatieve controle) 2154 bp Laan 3: DH5α-pMQ30-PhzI (positieve controle) 1816 bp Laan 4, 6, 7: CMR12a-PhzI Laan 5: gereverteerde wild type CMR12a

Figuur 4.11Resultaten van tweede homologe recombinatie voor PhzR-mutant Laan 1: DNA Ladder Laan 2: 17B3 (negatieve controle) 2209 bp Laan 3: DH5α-pMQ30-PhzR (positieve controle) 1746 bp Laan 4-6: CMR12a-PhzR Laan 7: gereverteerde wild type CMR12a

Met deze nieuwe PhzI- en PhzR-mutanten worden er verschillende karakterisatie-testen gedaan om de invloed van phzI en phzR te onderzoeken. 63


4.3 Karakterisatiemutanten Met de karakterisatieproeven bekijken we welke verschillen er zijn opgetreden in de eigenschappen van CMR12a-PhzI, CMR12a-PhzR en CMR12b-PhzI in vergelijking met de wild types. Als negatieve controle voor deze testen wordt CMR12a-GacA gebruikt, een mutant in het gac-regulatiesysteem die deficiënt is voor de synthese van AHLs, fenazines, biosurfactants en exoproteasen, en niet meer in staat is tot swarming. 4.3.1

AHL-productie: ‘cross streak assays’

Het ‘cross streak assay’ is een eenvoudige test om op een kwalitatieve manier een eerste indicatie te krijgen van de Acyl-homoserinelacton (AHL)-productie van CMR12a. AHL’s zijn de signaalmoleculen van quorum sensing, en worden gesynthetiseerd door PhzI. Hiervoor worden loodrecht op elkaar strepen geënt van de biosensor MH155 en de te testen stam op platen met LB medium. De AHL’s, uitgescheiden door de geteste stammen, migreerden in het medium tot aan de biosensorbacterie. Indien het een AHL betrof dat expressie van het reportergen van de biosensor activeerde, resulteerde dit in een detecteerbaar signaal. ‘Cross streak assays’ worden uitgevoerd met CMR12a, CMR12aGacA en CMR12a-PhzI. E. coli MH155 is een biosensorstam voor de productie van 3-OHC12-HSL en 3-OH-C10-HSL. Deze stam bezit een plasmide met daarop een promoter die geactiveerd wordt door de aanwezigheid van de AHL’s met daarachter een gen dat gfp(‘green fluorescent Proteïn’) produceert, dat is dan detecteerbaar met UV-licht. Expressie van het gfp-reportergen wordt enkel geïnduceerd door CMR12a. Uit deze resultaten kan men afleiden dat CMR12a-PhzI en CMR12a-GacA geen van deze AHL’s meer produceren. Dit is een eerste indicatie dat CMR12a-PhzI geen AHL’s meer produceert (zie Fig. 4.12).

64


Figuur 4.12 Resultaten van de ‘cross streak assays’: links CMR12a, midden CMR12a-PhzI, rechts CMR12a-GacA

4.3.2

AHL-productie: extractie en TLC-overlay

Deze test werd uitgevoerd om na te gaan welke AHL’s CMR12a en CMR12b produceren en of hun mutanten ze nog produceren. Voor dit ‘assay’ worden de AHL’s eerst geëxtraheerd uit het cultuursupernatans en gescheiden via dunne-laag-chromatografie (TLC). Vervolgens wordt op de TLC-platen een laag aangebracht van halfvast LB medium gemengd met een cultuur van een A. tumefaciens NT1. Tijdens de daaropvolgende incubatieperiode migreren de AHL’s vanuit de TLC-plaat in het medium. Agrobacterium tumefaciens NT1 is een biosensorstam voor de productie van een groot aantal verschillende AHL’s. Deze stam bezit een plasmide met daarop een promoter die geactiveerd wordt door de aanwezigheid van de AHL’s met daarachter lacZ. Dit gen codeert voor β-galactosidase, een enzym dat het substraat Xgal splitst met een blauw product als resultaat. Op deze manier worden de AHL-spots op de TLC-plaat zichtbaar als blauwe spots op de agar-overlay en kunnen ze eenvoudig gedetecteerd worden. Omdat elke AHL een karakteristieke Rf-waarde heeft, kan aan de hoogte van de spots afgeleid worden, welke AHL’s CMR12a, CMR12b en hun mutanten maken.

65


Figuur 4.13 Resultaten van AHL-overlay.

In Fig. 4.13 zijn voor het wild type CMR12a 4 blauwe spots te zien, die overeenkomen met vier van de vijf AHLs die CMR12a produceert. De spot voor de vijfde AHL, 3-OH-C12HSL, is niet zichtbaar op deze overlay. De CMR12a-PhzI-mutant is volledig deficiënt voor AHL-productie. De CMR12a-PhzR-mutant produceert minder AHL’s; daaruit kan men afleiden dat PhzR PhzI induceert. Deze resultaten zijn verwacht. Ook bij CMR12b-PhzI is er een verminderde, maar geen uitgeschakelde, productie van AHL ten opzichte van het wild type, wat niet is zoals verwacht. Er wordt vermoed dat er in het genoom van CMR12b twee phzI genen aanwezig zouden kunnen zijn. Dit zou kunnen verklaren dat de AHL-productie niet is uitgeschakeld. Opmerkelijk is dat er voor CMR12b die AHL-spots zichtbaar zijn. Dit terwijl eerder werd aangetoond dat deze stam slechts twee AHL’s maakt. Het derde AHL is waarschijnlijk C8-HSL. Dit zal echter bevestigd moeten worden via nauwkeurigere analysemethodes. 4.3.3

Fenazine-productie

Aangezien er verwacht wordt dat de mutaties in phzI en phzR een effect kunnen hebben op de fenazineproductie, wordt dit nagegaan. Eerst worden de bacteriën opgegroeid op een 66


KB-plaat en vervolgens worden de fenazines geëxtraheerd en gespot op een TLC-plaat. Na ontwikkeling van de gespotte TLC-plaat wordt de plaat belicht met UV-licht. Door belichting wordt het volgende beeld verkregen (zie Fig. 4.14).

Figuur 4.14 Resultaat van de fenazine productie.

Uit figuur 4.14 kan afgeleid worden dat de CMR12a-mutanten geen fenazines produceren. Daar bij het wild type CMR12b geen fenazineproductie waar te nemen is, konden er wat CMR12b-PhzI betreft, geen conclusies getrokken worden. Het experiment hoort later hernomen te worden. 4.3.4

Biosurfactants

Om een verdere karakterisatie uit te voeren worden de mutanten gecontroleerd op productie van biosurfactants. Om deze test uit te voeren worden CMR12a, CMR12b en hun mutanten in een druppel water vermengd en op parafilm gelegd. Een eventuele vermindering in oppervlaktespanning is visueel waarneembaar. Biosurfactants verlagen de oppervlaktespanning, en zorgen op die manier dat een druppel water op een hydrofoob oppervlak zal uitvloeien indien er biosurfactants aan worden toegevoegd. Zowel het wild

67


type CMR12a als zijn mutanten zijn in staat biosurfactants te produceren. CMR12b maakt geen biosurfactants (zie Fig. 4.15).

Positief

Negatief

Figuur 4.15 Biosurfactants karakterisatie van de mutanten.

4.3.5

Exoproteasen

De volgende stap in de karakterisatie is de bepaling van de productie van exoprotease om na te gaan of het quorum sensing systeem hierop een invloed heeft. Hiervoor worden de stammen geïnoculeerd op melkagar. Bacteriestammen die exoproteases uitscheiden zullen de melkproteïne in de agar afbreken, waardoor een doorschijnende halo rond de kolonies gevormd wordt. In Fig. 4.16 wordt het verschil tussen een exoprotease-negatieve en positieve cultuur weergegeven. Uit de bekomen resultaten kan besloten dat zowel CMR12a als CMR12b exoproteasen produceren. Bovendien blijken de mutaties geen effect te hebben op de exoproteaseproductie, want de mutanten zijn nog steeds positief voor de melkagartest.

68


Positief

Negatief

Figuur 4.16 Voorstelling van een exoprotease-positieve kolonie (links) en een exoprotease-negatieve kolonie (rechts).

4.3.6

Pyoverdines

Voor verdere karakterisatie worden de mutanten gecontroleerd op productie van pyoverdines. Dit zijn fluorescerende, geelgroene, ijzerbindende molecules die door fluorescerende pseudomonaden geproduceerd worden in ijzerarme omstandig-heden. In eerste instantie worden de pyoverdines kwalitatief aangetoond. Hiervoor worden de CMR12a, CMR12b en hun mutanten geënt op een vloeibaar CAA medium. Na incubatie zal het medium van kleurloos naar groen omslaan indien er productie is van pyoverdines. Zie figuur 4.17.

Figuur 4.17 CAA medium met een stam die pyoverdines produceert (links) of geen pyoverdines produceert (rechts).

69


Na kwalitatief aantonen volgt het kwantitatieve aantonen. Hiervoor wordt de hoeveelheid pyoverdines in het medium spectrofotometrisch gemeten. Zowel de celdensiteit van de culturen als de absorptie van de pyoverdines in het celvrije supernatans wordt gemeten. Uit de bekomen absorbanties wordt de pyoverdine-concentratie berekend aan de hand van volgende formule: Conc (µM)=OD405*106/(OD620*20000) Met ε=20000

12 b 12 bPh zI 1 12 bPh zI 2

12 a-

Ph zI

('4 ) 12 aPh zR 1 12 aPh zR 2 12 aPh zR 3 12 aPh zR 5 12 aPh zR 6 12 aga cA

4,500 4,000 3,500 3,000 2,500 2,000 1,500 1,000 0,500 0,000 12 a

hoeveel pyoverdine (µM)

Fig. 4.18 geeft de bekomen resultaten weer.

Figuur 4.18 Overzicht van de pyoverdineconcentraties (µM) van de verschillende mutanten voorgesteld op de X-as. De concentraties op de Y-as zijn uitgedrukt in µM.

Uit

de

bekomen

resultaten

kan

besloten

worden

dat

in

CMR12a-PhzI

de

pyoverdineproductie sterk gedaald is. Dit wijst erop dat PhzI de productie van pyoverdines reguleert. Ook in CMR12a-PhzR is de pyoverdineproductie wat gedaald, wat verklaard zou kunnen worden doordat PhzR een positieve invloed heeft op de expressie van phzI. CMR12a-PhzR maakt echter wel nog veel meer pyoverdines dan CMR12a-PhzI, wat erop wijst dat de pyoverdineregulatie niet via het PhzI-PzR systeem verloopt. Mogelijk

70


beïnvloedt PhzI pyoverdineproductie via de binding van de geproduceerde AHL’s op een andere, nog ongekende, regulatorproteïne.

4.3.7

‘Swarming’

De volgende stap in de karakterisatie is de bepaling van de ‘swarming’. ‘Swarming’ gebeurt door een verhoogde activiteit van de flagellen. Om na te gaan of de wild types en mutanten in staat zijn tot ‘swarming’, worden deze uitgeplaat op een ‘swarming’ agar en geïncubeerd. In Fig. 4.19 wordt het verschil tussen een ‘swarming’-negatieve- en positieve-cultuur weergegeven.

Negatief

Positief

Figuur 4.19 Voorstelling van een ‘swarming’-negatieve kolonie (links) en een ‘swarming’-positieve kolonie (rechts).

CMR12a, CMR12a-PhzI, en CMR12a-PhzR zijn alledrie in staat tot ‘swarming’, terwijl CMR12b en CMR12b-PhzI hier niet toe in staat zijn. PhzI noch PhzR lijken dus van belang te zijn voor deze eigenschap.

4.4 Infectieproeven 4.4.1

Scoren infectie

Met behulp van de infectieproef bekijken we hoe goed de mutanten de wortels van de cocoyam koloniseren en of ze nog in staat zijn om de cocoyam te beschermen tegen wortelrot. Hiervoor worden de plantjes eerst geïnoculeerd met de mutanten, waarna ze 71


geïnfecteerd worden met Pythium myriotylum. Vanaf 7 dagen na de infectie wordt de ziekte-ontwikkeling opgevolgd door aan elk blad een score toe te kennen (Fig. 4.20; 4.21; 4.22). Op basis hiervan kan de ziekte-index berekend worden. De ziekte-ontwikkeling na 11 dagen wordt weergegeven in Fig. 4.22.

Figuur 4.20 Gezond blad met score 0 (links), een blad met score 1 (rechts)

Figuur 4.21 een blad met score 2 (links), een blad met score 3 (midden) en een blad met score 4 (rechts) 11 dpi 2,5

disease ind ex

2,0 1,5 1,0 0,5 0,0 healthy control

diseased control

12a

12a- Phz I

12a- GacA

Figuur 4.22 Overzicht van de infectieproef.

72


Uit de grafiek blijkt dat 12a-PhzI en 12a-GacA hun vermogen verliezen om cocoyam tegen wortelrot te beschermen. Dit wijst erop dat deze regulatiesystemen belangrijk zijn voor de biologische bestrijdingscapaciteit van CMR12a. 4.4.2

Bepalen wortelkolonisatie

Na twee weken wordt de kolonisatie van de wortels en de grond door de bacteriën bepaald via het uitplaten van verdunningsreeksen (zie bijlage 4 en 5). Voor CMR12a werd in de infectieproef een rifampycineresistente variant gebruikt, zodat kolonisatie-uitplatingen op selectief medium mogelijk waren. Doordat de PhzI- en GacA-mutanten niet resistent zijn, is het voor deze stammen niet mogelijk om deze selectie uit te voeren. Ook is er geen pyoverdineproductie meer door CMR12a-PhzI, waardoor er geen fluorescentie meer is. Om deze twee redenen is het moeilijk om een onderscheid te maken tussen de gewenste en de ongewenste bacteriën die in de bodem aanwezig zijn. Deze proef zou dus best hernomen worden met rifampicineresistente afgeleiden van de twee mutanten.

73

Quorum sens ing regu l at ie in Pseudomonas spp. CMR12a en CMR12b Conclus ie

5

Conclusie

Het doel van dit eindwerk was om het belang na te gaan van het PhzI/PhzR quorum sensing systeem in CMR12a en CMR12b, twee Kameroenese Pseudomonas isolaten, voor de productie van AHL-signaalmoleculen, secundaire metabolieten en de biologische bestrijdingscapaciteit. Er werden mutatieconstructen gemaakt voor de constructie van PhzI- en PhzR-mutanten. Met behulp hiervan werden drie plaatsspecifieke mutanten verkregen, CMR12a-PhzI, CMR12a-PhzR en CMR12b-PhzI. De productie van AHL’s, fenazines, biosurfactants, exoproteasen, pyoverdines en de ‘swarming’ capaciteit werden getest, evenals de kolonisatiecapaciteit en het in vivo antagonisme tegenover Pythium myriotylum op cocoyam. Hieruit bleek dat PhzI in CMR12a instaat voor de productie van alle 5 acylhomoserinelactons, wat vrij opmerkelijk is, aangezien deze AHL’s van uiteenlopende lengtes zijn. Deze AHL’s reguleren zoals verwacht de productie van fenazines en bovendien tevens van pyoverdine. Ten slotte bleek een intact PhzI ook belangrijk voor de biologische bestrijdingscapaciteit. PhzR in CMR12a is noodzakelijk voor de productie van fenazines en auto-induceert bovendien PhzI. Pyoverdineproductie is niet afhankelijk van PhzR. Dit wijst erop dat de AHL’s in CMR12a niet enkel PhzR activeren, maar ook een tweede transcriptionele regulator (een LuxR-homoloog), die belangrijk is voor pyoverdine-expressie. PhzI en PzhR hebben in CMR12a geen invloed op de productie van biosurfactants, exoproteasen, en de capaciteit tot swarming. Quorum sensing is in CMR12a belangrijk voor een heel aantal eigenschappen, en is waarschijnlijk essentieel voor de overleving van de stam in zijn natuurlijke omgeving. Bij het nagaan van acyl-homoserinelactonproductie is gebleken dat CMR12b niet twee maar minstens drie AHL’s produceert, namelijk 3-OH-C8-HSL, 3-OH-C12-HSL en bovendien C8-HSL, wat nog niet eerder was aangetoond. CMR12b-PhzI produceert verrassend genoeg nog steeds AHLs. Dit kan te wijten zijn aan de aanwezigheid van een tweede phzI-homoloog in het genoom van CMR12b.

74

Quorum sens ing regu l at ie in Pseudomonas spp. CMR12a en CMR12b Conclus ie

Quorum sensing systemen zijn over het algemeen zeer geconserveerd op genetisch niveau. Een PhzI-mutatie in CMR12a en in CMR12b geven echter totaal verschillende fenotypes. Deze resultaten tonen aan dat quorum sensing zeer uiteenlopende functies kan vervullen en kan variëren in zeer verwante stammen.

75

Quorum sens ing regu l at ie in Pseudomonas spp. CMR12a en CMR12b

Literatuurlijst 1. ONWUEME, I.C. (1978). The tropical tuber crops : yams, cassava, sweet potato and cocoyams. New York, John Wiley & Sons. 2. ONOKPISE, O.U., WUTOH, J.G., NDZANA, X., TAMBONG, J.T., SAMA, A.E., NYOCHEMBENG, L., AGUEGUIA, A., NZIETCHUNG, S., WILSON, J.G. & BURNS, M. (1999). Evaluation of macabo cocoyam germplasm in Cameroon. In: Janick, J. (ed) Perspectives on new crops and new uses. Alexandria, ASHS Press, 394396. 3. NZIETCHUNG, S. (1983a). La pourriture racinaire du macabo (Xanthosoma sagittifolium) au Cameroun: I. Symptomatologie et étiologie de la maladie. L’Agronomie tropical, 38, 321-325. 4. PACUMBABA, R.P., WUTOH, J.G., EYANGO, S.A., TAMBONG, J.T. & NYOCHEMBENG, L.M. (1992a). Isolation and pathogenicity of rhizosphere fungi of cocoyam in relation to cocoyam root rot disease. Journal of phytopathology, 135, 265273. 5. PACUMBABA, R.P., WUTOH, J.G. & MEBOKA, M.M.B. (1992b). Protocol to screen cocoyam accessions for resistance or tolerance to cocoyam root rot disease in Cameroon. Plant disease, 76, 768-770. 6. AGRIOS, G.N. (1997). Plant Pathology. Fourth edition. San Diego, Academic Press, 635 p. 7. VAN DER PLAATS-NITERINK, A.J. (1981). Monograph of the genus Pythium. Baarn, Centraalbureau voor schimmelculturen. Studies in mycology, 21, 240 p.

76


8. MARTIN, F.N. & LOPER, J.E. (1999). Soilborne plant diseases caused by Pythium spp.: ecology, epidemiology and prospects for biological control. Critical reviews in plant sciences, 18, 111-160.

9. NZIETCHUNG, S. (1983b). La pourriture racinaire du macabo (Xanthosoma sagittifolium) au Cameroun: II. Epidemiologie et moyens de lutte. L’Agronomie tropical, 38, 326-330.

10. NZIETCHUNG, S. (1985). Genre Xanthosoma (macabo) et contrainte de production : cas particulier de la pourriture racinaire causée par Pythium myriotylum au Cameroon. Thèse Doctorat es Sciences naturelles, Cameroon, Université de Yaoundé.

11. TROPICAL Root and Tubers Research Project. Fifth annual report. (1991). Cameroon, Institute of Agronomic Research.

12. STANGHELLINI, M.E. & MILLER, R.M. (1997). Biosurfactants: their identity and potential efficacy in the biological control of zoosporic plant pathogens. Plant disease, 81, 4-12.

13. WHIPPS, J.M. (1997). Developments in the biological control of soilborne plant pathogens. Advances in botanical research, 26, 1-133.

14. CHIN-A-WOENG, T.F.C., BLOEMBERG, G. & LUGTENBERG, B. (2003). Phenazines and their role in biocontrol by Pseudomonas bacteria. New phytologist, 157, 503-523.

15. O’SULLIVAN, D.J. & O’GARA, F. (1992). Traits of fluorescent Pseudomonas spp. involved in suppression of plant pathogens. Microbiological reviews, 56, 662-676.

16. TURNER, J.M. & MESSENGER, A.J. (1986). Occurrence, biochemistry and physiology of phenazine pigment production. Advances in microbial physiology, 27, 211-275.

17. MAZZOLA, M., COOK, R.J., THOMASHOW, L.S., WELLER, D.M. & PIERSON, L.S.III. (1992). Contribution of phenazine antibiotic biosynthesis to the ecological competence of

77


fluorescent pseudomonads in soil habitats. Applied and environmental microbiology, 58, 26162624.

18. GERBER, N.N. (1984). Phenazines. In: Laskin, A.I. & Lechevalier, H.A. (eds.) CRC Handbook of Microbiology. Cleveland, Chemical Rubber Company, 573-576.

19. HASSAN, H.M. & FRIDOVICH, I. (1980). Mechanism of the antibiotic action of pyocyanin. Journal of bacteriology, 141, 156-163.

20. HOLLSTEIN, U. & VAN GEMERT, R.J. (1971). Interaction of phenazines with polydeoxyribonucleotides. Biochemistry, 10, 497-504.

21. HASSETT, D.J., SCHWEIZER, H.P. & OHMAN, D.E. (1995). Pseudomonas aeruginosa sodA and sodB mutants defective in manganese- and iron-cofactored superoxide dismutase activity demonstrate the importance of the iron-cofactored form in aerobic metabolism. Journal of bacteriology, 177, 6330-6337.

22. MAHAJAN, M.S., TAN, M.W., RAHME, L.G. & AUSUBEL, F.M. (1999). Molecular mechanisms of bacterial virulence elucidated using a Pseudomonas aeruginosa–Caenorhabditis elegans pathogenesis model. Cell, 96, 47-56.

23. HASSETT, D.J., SCHWEIZER, H.P. & OHMAN, D.E. (1995). Pseudomonas aeruginosa sodA and sodB mutants defective in manganese- and iron-cofactored superoxide dismutase activity demonstrate the importance of the iron-cofactored form in aerobic metabolism. Journal of bacteriology, 177, 6330-6337.

24. CALHOUN, D.H., CARSON, M. & JENSEN, R.A. (1972). The branch point metabolite for pyocyanin biosynthesis in Pseudomonas aeruginosa. Journal of general microbiology, 72, 581583.

25. LONGLEY, R.P., HALLIWELL, J.E., CAMPBELL, J.J.R. & INGLEDEW, W.M. (1972). The branch point of pyocyanin biosynthesis. Canadian journal of microbiology, 18, 1357-1368.

78


26. MCDONALD, M., MAVRODI, D.V., THOMASHOW, L.S. & FLOSS, H.G. (2001). Phenazine biosynthesis in Pseudomonas fluorescens : branchpoint from the primary shikimate biosynthetic pathway and role of phenazine-1,6-dicarboxylic acid. Journal of the American Chemistry Society, 123, 9459-9460.

27. PIERSON, L.S.III, GAFFNEY, T., LAM, S. & GONG, G. (1995). Molecular analysis of genes encoding phenazine biosynthesis in the biological control bacterium Pseudomonas aureofaciens 30-84. FEMS microbiology letters, 134, 299-307.

28. MAVRODI, D.V., KSENZENKO, V.N., BONSALL, R.F., COOK, R.J., BORONIN, A.M. & THOMASHOW, L.S. (1998). A seven-gene locus for synthesis of phenazine-1-carboxylic acid by Pseudomonas fluorescens 2-79. Journal of bacteriology, 180, 2541-2548.

29. MAVRODI, D.V., BONSALL, R.F., DELANEY, S.M., SOULE, M.J., PHILLIPS, G. & THOMASHOW, L.S. (2001). Functional analysis of genes for biosynthesis of pyocyanin and phenazine-1-carboxamide from Pseudomonas aeruginosa PAO1. Journal of bacteriology, 183, 6454-6465.

30. PIERSON, L.S.III & THOMASHOW, L.S. (1992). Cloning and heterologous expression of the phenazine biosynthetic locus from Pseudomonas aureofaciens 30-84. Molecular plant–microbe interactions, 5, 330-339.

31. NEALSON, K.H., PLATT, T. & HASTINGS, J.W. (1970). Cellular control of the synthesis and activity of the bacterial luminescent system. Journal of bacteriology, 104, 313-322.

32. JUHAS M., EBERL, L. & TÜMMLER, B. (2005). Quorum sensing: the power of cooperation in the world of Pseudomonas. Environmental microbiology, 7, 459-471.

33. FUQUA, C., PARSEK, M.R. & GREENBERG, E.P. (2001). Regulation of gene expression by cell-to-cell communication: acylhomoserine lactone quorum sensing. Annual review of genetics, 35, 439-68.

79


34. HEEB, S. & HAAS, D. (2001). Regulatory roles of the GacS/GacA two-component system in plant-associated and other Gram-negative bacteria. Molecular plant-microbe interactions, 15, 1351-1363.

35. CHANCEY, S.T., WOOD, D.W. & PIERSON, L.S. (1999). Two-component transcriptional regulation of N-acyl-homoserine lactone production in Pseudomonas aureofaciens. Applied and environmental microbiology, 65, 2294-2299.

36. PERRAUD, A.L., RIPPE, K., BANTSCHEFF, M., GLOCKER, M., LUCASSEN, M., JUNG, K., SEBALD, W., WEISS, V., & GROSS, R. (2000). Dimerization of signalling modules of the EvgAS and BvgAS phosphorelay systems. Biochimica et biophysica acta, 1478, 341-354.

37. DE MAEYER, K , D’AES, J, PERNEEL, M, VANHAECKE, L, NOPPE, H, & HÖFTE, M, (2009), Antagonistic phenazine-producing Pseudomonas isolates from the red cocoyam rhizosphere have quorum sensing machinery 38. ROBERT M. Q. SHANKS, NICKY C. CAIAZZA, SHANNON M. HINSA, CHRISTINE M. TOUTAIN & GEORGE A. O’TOOLE, (2006),

Saccharomyces

cerevisiae-Based Molecular Tool Kit for Manipulation of Genes from Gram-Negative Bacteria, 7, 5027-5036.

80


Bijlagen

Bijlage 1 – Score blad

scoringstabel dag: klasse plant gezonde controle

0

1

2

3

4,0

1 2 3 4 5

zieke controle

1 2 3 4 5

12aR+P

1 2 3 4 5

12a-PhzI+P

1 2 3 4 5

12a-gacA+P

1 2 3 4 5

81

Bijlage 2 – Berekening van pyoverdineconcentratie

12a 1 12a 2 12a 3 12a-PhzI ('4) 1 12a-PhzI ('4) 2 12a-PhzI ('4) 3

OD620 0,128 0,252 0,267 0,187 0,204 0,242

0,165 0,291 0,268 0,211 0,222 0,254

12a-PhzR1

0,227

12a-PhzR2

0,144 0,274 0,245 0,230 0,253 0;279

OD620 0,510 0,953 0,910 0,733 0,792 0,868

OD405 0,624 0,705 0,705 0,032 0,039 0,041

0,678 0,831 0,784 0,042 0,041 0,045

OD405 2,293 2,711 2,615 0,133 0,156 0,660

OD405/OD620 4,497 2,845 2,873 0,182 0,197 0,761

0,663 0,788 0,752 0,040 0,054 0,480

0,220

0,241

0,803

0,547

0,567

0,581

1,978

0,257

0,256

0,215

0,849

0,540

0,565

0,559

12a-PhzR3

0,228

0,218

0,275

0,841

0,616

0,678

12a-PhzR5

0,259

0,275

0,270

0,938

0,862

12a-PhzR6 12a-gacA 1 12a-gacA 2 12a-gacA 3 12b 1 12b 2 12b 3

0,287 0,220 0,230 0,286 0,236 0,219 0,204

0,308 0,224 0,251 0,286 0,265 0,218 0,208

0,236 0,228 0,301 0,225 0,206 0,216

0,970 0,784 0,912 1,001 0,847 0,750 0,733

12b-PhzI1

0,290

0,296

0,173

12b-PhzI2

0,187

0,167

0,227

Gem OD405/OD620 3,405 100

0,380

11

2,464

2,464

72

1,941

2,286

2,286

67

0,671

2,293

2,725

2,725

80

0,911

0,906

3,126

3,332

3,332

98

0,684 0,581 0,616 0,609 0,915 0,847 0,922

0,740 0,593 0,647 0,628 0,947 0,925 0,970

0,743 0,613 0,629 0,629 0,990 0,914 0,990

2,528 2,085 2,207 2,177 3,327 3,134 3,362

2,608 2,659 2,419 2,175 3,928 4,177 4,589

2,608 2,418

77 71

4,232

124

0,886

0,904

1,019

1,049

3,467

3,916

3,916

115

0,678

0,706

0,713

0,745

2,525

3,725

3,725

109

82

Bijlage 3 – Resultaten van de karakterisatieproeven

AHL

Fenazine

Biosurfactants

Exoprotease

Pyoverdines

Swarming

12a

+

+

+

+

+

+

12a-PhzI

-

-

+

+

-

+

12a-PhzR

±

-

+

+

+

+

12a-GacA

±

-

-

-

+

-

12b

+

?

-

+

+

-

12b-PhzI

+

?

-

+

+

83

Bijlage 4 – Resultaten van de grond kolonisatie

Behandeling

Medium

gewicht grond (g)

Aantal fluorescerende kolonies met juiste morfologie in 100 µl uitplatingen op KB 10^ -3

12aRif + P (grond)

10^ -4

gemiddelde conc. bacteriën / g grond

log 10 value of the CFU per gram soil

Average per sample

Standard deviation

Average per treatment

Standard deviation

6,58

0,96

7,08

1,25

5,97

3,35

10^ -5

G 12a+P 1

KB Rif 100

5,045

173

18

22

0

3,43E+06

3,57E+06

4,36E+06

0,00E+00

6,535

6,552

6,640

0,000

4,93

3,29

G 12a+P 2

KB Rif 100

5,721

275

67

48

8

4,81E+06

1,17E+07

8,39E+06

1,40E+07

6,682

7,069

6,924

7,146

6,95

0,20

G 12a+P 3

KB Rif 100

5,180

232

38

46

8

4,48E+06

7,34E+06

8,88E+06

1,54E+07

6,651

6,865

6,948

7,189

6,91

0,22

G 12a+P 4

KB Rif 100

4,975

260

16

38

3

5,23E+06

3,22E+06

7,64E+06

6,03E+06

6,718

6,507

6,883

6,780

6,72

0,16

G 12a+P 5

KB Rif 100

5,427

∞

173

178

8

3,19E+07

3,28E+07

1,47E+07

7,503

7,516

7,169

7,40

0,20

KB

5,418

∞

202

66

7

3,73E+07

1,22E+07

1,29E+07

7,57

7,09

0,00

4,886

4,238

12a-PhzI + P (grond) G PhzI+P 1 G PhzI+P 2

KB

5,417

∞

90

84

16

1,66E+07

1,55E+07

2,95E+07

7,22

7,19

7,47

7,294

0,154

G PhzI+P 3

KB

5,184

∞

350

388

33

6,75E+07

7,48E+07

6,37E+07

7,83

7,87

7,80

7,836

0,036

G PhzI+P 4

KB

5,149

∞

340

256

27

6,60E+07

4,97E+07

5,24E+07

7,82

7,70

7,72

7,745

0,066

G PhzI+P 5

KB

5,111

∞

248

226

22

4,85E+07

4,42E+07

4,30E+07

7,69

7,65

7,63

7,655

0,027

KB

5,199

∞

ngu

ngu

32

0,00

0,000

#DEEL/0!

12a-gacA + P (grond) G gacA+P 1

6,16E+07

G gacA+P 2

KB

5,884

∞

55

103

5

9,35E+06

1,75E+07

8,50E+06

6,97

7,24

6,93

7,048

0,171

G gacA+P 3

KB

5,125

∞

262

280

19

5,11E+07

5,46E+07

3,71E+07

7,71

7,74

7,57

7,672

0,090

G gacA+P 4

KB

5,231

∞

155

188

7

2,96E+07

3,59E+07

1,34E+07

7,47

7,56

7,13

7,385

0,227

G gacA+P 5

KB

5,730

ngu

264

350

33

4,61E+07

6,11E+07

5,76E+07

7,66

7,79

7,76

7,737

0,065

84

Bijlage 5 – Resultaten van de wortel kolonisatie

Behandeling

Medium

gewicht wortels (g)

Aantal fluorescerende kolonies met juiste morfologie in 100 µl uitplatingen op KB

Average per plant

Standard deviation

Average per treatment

Standard deviation

8,035

0,116

7,13

1,08

0,00

0,00

2,33

0,67

10^0

10^ -1

W 12a+P 1

KB Rif 100

0,558

∞

∞

∞

∞

W 12a+P 2

KB Rif 100

1,112

∞

ngu

57

71

3

12

5,43

6,03

5,745

0,249

W 12a+P 3

KB Rif 100

0,124

∞

∞

∞

∞

183

486

8,17

8,59

8,381

0,300

W 12a+P 4

KB Rif 100

0,872

∞

∞

ngu

ngu

21

42

6,38

6,68

6,532

0,213

W 12a+P 5

KB Rif 100

0,658

∞

∞

ngu

ngu

73

53

7,05

6,91

6,976

0,098

W PhzI+P 1

KB

1,576

0

0

0

0

0

0

0,00

0,00

0,00

0,00

0,00

0,00

0,000

0,000

W PhzI+P 2

KB

0,476

0

0

0

0

0

0

0,00

0,00

0,00

0,00

0,00

0,00

0,000

0,000

W PhzI+P 3

KB

0,356

0

0

0

0

0

0

0,00

0,00

0,00

0,00

0,00

0,00

0,000

0,000

W PhzI+P 4

KB

1,365

0

0

0

0

0

0

0,00

0,00

0,00

0,00

0,00

0,00

0,000

0,000

W PhzI+P 5

KB

0,302

0

0

0

0

0

0

0,00

0,00

0,00

0,00

0,00

0,00

0,000

0,000

W gacA+P 1

KB

0,194

0

0

?

?

?

15

0,00

0,00

W gacA+P 2

KB

0,968

?

?

?

0

?

2

W gacA+P 3

KB

1,370

0

?

?

0

?

16

0,00

W gacA+P 4

KB

0,168

0

0

0

0

?

25

0,00

W gacA+P 5

KB

0,256

0

?

?

0

10

5

0,00

12aRif + P (wortel)

10^ -2

log 10 value of the CFU per gram roots

10^ -3 730

500

8,12 5,71

5,81

7,95

12a-PhzI + P (wortel)

12a-gacA + P (wortel)

0,00

0,00

6,89

2,296

3,977

0,00

5,32

2,658

3,758

0,00

6,07

2,022

3,503

0,00

7,17

1,435

3,208

6,29

3,221

3,721

0,00

6,59

85

Voor akkoord verklaring

Recommend Documents