Voor akkoord verklaring

Metabolisatiestudie van methyldienolone en methyltrienolone aan de hand van het in vivo chimeer uPA+/+-SCID muismodel en in vitro humane lever microsomen

Voor akkoord verklaring

Dit eindwerk is een examen; eventuele fouten die worden vastgesteld tijdens de eindwerkverdediging of erna werden niet gecorrigeerd. Het gebruik als referentie in publicaties is toegelaten na goedkeuring van de promotor en eindwerkbegeleider (van de stageplaats).

Dr. Sc. Leen Lootens

Prof. Dr. Peter Van Eenoo

Stagementor

Stagegever

Dr. Sc. Griet Vanbillemont Promotor

1


Woord vooraf Bij het beëindigen van deze bachelorproef wil ik graag enkele personen bedanken die hebben bijgedragen bij het tot stand brengen van dit eindwerk en zo mijn bachelor opleiding af te sluiten. Zonder de hulp en steun van bepaalde personen kon dit niet gerealiseerd worden. Eerst en vooral en in het bijzonder wil ik mijn stagementor Dr. Sc. Leen Lootens bedanken, niet alleen voor het aanreiken van het boeiend onderwerp, maar vooral voor de uitstekende begeleiding vol enthousiasme gedurende mijn ganse stageperiode en om mij met raad en daad bij te staan in het verwezenlijken van deze thesis. Eveneens wil ik haar bedanken voor haar flexibiliteit en voor de vele tijd die zij voor mij vrijmaakte door het veelvuldig nalezen, bijsturen en aanbrengen van verbeteringen in deze bachelorproef. Ik wens haar ook te bedanken voor alle praktische ondersteuning en het doorgeven van kennis. Daarnaast wil ik mijn stagegever Prof. Dr. Peter Van Eenoo bedanken om mij de kans te geven mijn stage en aansluitend mijn bachelorproef in het DoCoLab uit te voeren, waar ik ook altijd bij terecht kon voor vragen. Mijn promotor, Dr. Sc. Griet Vanbillemont, wil ik bedanken voor het advies, het lezen en corrigeren van mijn bachelorproef en voor het opstellen van goede deadlines. Alle medewerkers van het DoCoLab wil ik ook graag bedanken voor hun praktische hulp en de fijne sfeer in het labo, maar ook de medestudenten Mieke, Lisa, Jasper en Stijn voor de aangename en ontspannende momenten tijdens mijn stage. In het bijzonder wil ik ook Lore Geldof bedanken voor de praktische ondersteuning en tips bij deze thesis. Verder wil ik zeker nog mijn ouders bedanken voor de mogelijkheid die ze me gaven om deze opleiding te volgen. Ik wil hen en daarnaast ook mijn vrienden bedanken voor de steun en motivatie tijdens deze periode.

2


Samenvatting Dopinggerelateerde producten worden veelvuldig gebruikt in de sportwereld door hun prestatie bevorderend effect en bovendien worden er telkens ook nieuwe producten op de markt gebracht om zo de dopingcontroles te kunnen omzeilen. Hierdoor is het noodzakelijk om methoden te ontwikkelen, zodat detectie van deze producten mogelijk wordt. In dit onderzoek wordt de metabolisatie van twee anabole androgene steroïden, namelijk methyldienolone en methyltrienolone, nagegaan. De metabolieten van beide dopinggerelateerde producten zijn weinig tot niet gekend en zouden op deze manier kunnen opgenomen worden in de routine screening ter detectie. De detectie van de steroïden zelf gebeurt in beperkte mate, want na inname worden ze omgezet in het lichaam tot metabolieten. Deze metabolieten laten een langere detectie van het misbruik toe dan het eigenlijk steroïde. Hierdoor is het dus belangrijk dat het metabolisme gekend is. De voornaamste detectiemethoden die hiervoor worden gebruikt zijn GC-MS en LC-MS. De studie van de metabolisatie wordt uitgevoerd via in vivo en in vitro technieken. In vitro gaat men een metabolisatiestudie uitvoeren aan de hand van humane lever microsomen, om hierdoor het aantal dierproeven te reduceren en dus de vervanging toe te passen van de 3V’s voor verantwoorde proefdierexperimenten. In vivo maakt men gebruik van het uPA+/+-SCID muismodel, waarbij de excretie-urine wordt onderzocht van chimere muizen op zoek naar gevormde humane metabolieten. Er wordt eerst en vooral gebruik gemaakt van niet-chimere muizen om een dosisbepaling uit te voeren en ter controle van de excretie studie, waarna overgeschakeld wordt op het uPA+/+-SCID chimeer muismodel. Het humaan metabolisme wordt bevestigd door het verkrijgen van dezelfde metabolieten in de humane lever microsomen als in het chimeer muismodel. Via analyse op GC-MS van methyldienolone wordt een metaboliet gedetecteerd die gevormd wordt door de mens en ook wordt bevestigd via detectie op LC-MS2. Bij de analyse van methyltrienolone, die enkel wordt gedetecteerd via LC-MS2, wordt eveneens een metaboliet gedetecteerd die wordt verkregen door het humaan metabolisme. Als metabolisatiereactie vinden hydroxylaties plaats van methyldienolone en methyltrienolone. Hierbij is het belangrijk om in een verder onderzoek de structuur van de metabolieten te achterhalen om methyldienolone en methyltrienolone specifieker te kunnen identificeren in de urine. 3


Summary Doping related substances are often used in sports because of their performance-enhancing effects. Furthermore, new products, especially developed to circumvent doping control, are continuously brought on the market. Therefore it is necessary to optimize the screening methods in order to detect these products. In this case, the metabolism of two anabolic androgenic steroids is investigated, for which the metabolism was previously not described, namely methyldienolone and methyltrienolone. Because the steroids are intensively metabolized after administration, the parent compounds have limited diagnostic value and the metabolites need to be identified. These metabolites allow a longer detection of the abuse than the actual steroid itself. Therefore it is important that the metabolism is known. The study of the metabolism is performed by in vivo and in vitro techniques. The in vitro technique uses human liver microsomes. In vivo the uPA+/+-SCID mouse model transplanted with human hepatocytes is used. The excretion urine of these chimeric mice is analyzed to detect the formed human metabolites. Prior to this, non-chimeric mice are used to determine a sufficient dose and to verify the excretion study. An indication of the human metabolism is confirmed by obtaining the same metabolites in the human liver microsomes as in the chimeric mouse model. Through analysis on GC-MS a metabolite of methyldienolone was detected in both models, and this was also confirmed through detection on LC-MS2. In the analysis of methyltrienolone, which can only be detected through LC-MS2, a metabolite was detected that was obtained by the human metabolism.

As

metabolic

reaction,

hydroxylations

of

methyldienolone

and

methyltrienolone take place. The metabolism is known and in further research it’s important that the structure of the metabolites is determined, so that methyldienolone and methyltrienolone can be identified more specifically in the urine and could be taken up in the routine screening to detect their presence.

4


Lijst met afkortingen en symbolen α

Alfa

β

Bèta

°C

Graden Celcius

AAS

Anabole androgene steroïden

ADME

Absorptie, distributie, metabolisatie en excretie

AR

Androgeenreceptor

C-atomen

Koolstofatomen

CEVAC

Centrum voor vaccinologie aan de UGent

CYP

Cytochroom P450

DHT

Dihydrotestosteron

DNA

Desoxyribonucleïnezuur

DoCoLab

DopingControleLaboratorium aan de UGent

E. coli

Escherichia coli

ECD

Ethische Commissie Dierproeven

EI

Elektron ionisatie

EIC

Extracted ion chromatogram

ER

Oestrogeenreceptor

ESI

Elektrospray ionisatie

GC

Gaschromatografie

H-atomen

Waterstofatomen

HDL

High-density lipoprotein

HDS

Hydroxysteroïd dehydrogenase

HLM

Humane lever microsomen

IOC

Internationaal Olympisch Comité

IS

Inwendige standaard

ISO

Internationale organisatie voor standaardisatie

LC

Vloeistofchromatografie

LDL

Low-density lipoprotein

LLE

Vloeistof-vloeistof extractie

M

Moleculair ion

m/z

Massa-ladingsverhouding

MD

Methyldienolone 5


min

Minuten

mRNA

Messenger ribonucleïnezuur

MS

Massaspectrometrie

MS2

Tandem massaspectrometrie

MSTFA

N-methyl-N-trimethylsilyltrifluoroacetamide

MT

Methyltrienolone

N2

Stikstofgas

NADP+

Nicotinamide adenine dinucleotide fosfaat

NADPH

Gereduceerde nicotinamide adenine dinucleotide fosfaat

NPLC

Normal phase liquid chromatography

OFN

Zuurstofvrije stikstofgas

PBS

Phosphate buffered saline

RNA

Ribonucleïnezuur

RPLC

Reversed phase liquid chromatography

rpm

Toeren per minuut

RRT

Relatieve retentietijd

RT

Retentietijd

SCID

Severe Combined Immune Deficiency syndrome

SIM

Selected ion monitoring

SOP

Standard operating procedure

SRM

Single reaction monitoring

ST

Sulfotransferase

TMS

Trimethylsilyl

u

Uur

UGT

Uridine difosfoglucuronosyl transferase

uPA

Urokinase-type plasminogeen activator

WADA

Wereld Anti-Doping Agentschap

6


Verklarende woordenlijst Abdominaal

Met betrekking tot de buik

Chimeer

Levend wezen die cellen bevat met verschillende genetische achtergrond

Chronisch

Langdurig

Co-factor

Een stof die naast een enzym noodzakelijk is voor het plaatsen van bepaalde biochemische reacties

Farmacokinetiek

Beschrijft de processen waaraan een werkzame stof in het lichaam wordt onderworpen

First-pass effect

Eerste leverpassage via de leverpoortader van een stof na opname in de darmen

Hepatische sinusoïden

Haarvatennetwerk waar zuurstofrijk bloed uit de slagader gemengd wordt met het zuurstofarme maar voedselrijk bloed uit de poortader.

Hepatocyten

Levercellen

Hepatoxiciteit

Toxiciteit voor de lever

Heterozygoot

Twee verschillende allelen van een gen voor een bepaalde eigenschap

Homozygoot

Twee identieke allelen van een gen voor een bepaalde eigenschap

Immunodeficiënt

Immuunsysteem is onderdrukt

Immunologische tolerantie

Als lichaamseigen door het immuunsysteem herkend worden

Impotentie

Erectiestoornissen

Intestinaal

Met betrekking tot de darm

Intramusculair

In de spieren

Kwantitatief

Uitgedrukt in getallen

Lipofiel

Vetminnend

Mono-oxygenasen

Groep van enzymen die een hydroxylgroep zullen incorporeren in het substraat

Oraal

Via de mond

Orale gavatie

Toediening via een sonde door de slokdarm

Oscillerend

Periodiek herhaalde omkering van de bewegingsrichting

Overexpressie

Het gen wordt meer tot expressie gebracht dan normaal

Parenchym

Hepatocyt weefsel in de lever

Parenteraal

Om de darm heen 7


Precursor

Voorloper

Regenereren

Vernieuwen

8


Lijst van tabellen en figuren Lijst van tabellen Tabel 1: Reacties van het fase I metabolisme [10]. .......................................................................................... 22 Tabel 2: Reacties van het fase II metabolisme [10].......................................................................................... 25 Tabel 3: Gradiëntprogramma............................................................................................................................ 37 Tabel 4: Overzicht RT en ionen uit het chromatogram en full scan spectra referentiestandaard methyldienolone. ................................................................................................................................ 44 Tabel 5: Overzicht RT en ionen uit het chromatogram en massaspectra referentiestandaard methyldienolone. ............................................................................................................................................................ 45 Tabel 6: Overzicht RT en ionen uit het chromatogram en massaspectra referentiestandaard methyltrienolone. ............................................................................................................................................................ 46 Tabel 7: Overzicht RT en ionen uit het chromatogram en full scan spectra positieve controle. ...................... 54 Tabel 8: Overzicht RT en ionen uit het chromatogram en full scan spectra HLM. ......................................... 56 Tabel 9: Overzicht RT en ionen uit het chromatogram en massaspectra positieve controle. ........................... 58 Tabel 10: Overzicht RT en ionen uit het chromatogram en massaspectra HLM methyldienolone. ................ 61 Tabel 11: Overzicht RT en ionen uit het chromatogram en massaspectra HLM methyltrienolone. ................ 62 Tabel 12: Overzicht RT en ionen uit het chromatogram en full scan spectra excretie-urine niet-chimere en chimere muis. ..................................................................................................................................... 65 Tabel 13: Overzicht RT en ionen uit het chromatogram en massaspectra excretie-urine methyldienolone. ... 67 Tabel 14: Overzicht RT en ionen uit het chromatogram en massaspectra excretie-urine methyltrienolone chimere muis. ..................................................................................................................................... 70 Tabel 15: Relatieve retentietijden van methyldienolone en metabolieten gedetecteerd via GC-MS. .............. 71 Tabel 16: Relatieve retentietijden van methyldienolone en metabolieten gedetecteerd via LC-MS2. ............. 72 Tabel 17: Relatieve retentietijden van methyltrienolone en metabolieten gedetecteerd via LC-MS2.............. 72 Tabel 18: Overzicht metabolieten methyldienolone in HLM en excretie-urines via detectie op GC-MS (bovenaan) en LC-MS2 (onderaan). ................................................................................................... 73 Tabel 19: Overzicht metabolieten methyltrienolone in HLM en excretie-urines via detectie op LC-MS2. ..... 73

9


Lijst van figuren Figuur 1: Basisstructuur van steroïden [10]. .................................................................................................... 19 Figuur 2: Structuurformule van testosteron [10]. ............................................................................................. 19 Figuur 3: Werkingsmechanisme van testosteron of AAS [18]. ........................................................................ 20 Figuur 4: A-ring metabolisme met 5α- en 5β-reductie gevolgd door 3α- en 3β-hydroxy-reductie [10]. ......... 23 Figuur 5: D-ring metabolisme met 17-oxidatie en de reacties 17α- en 17β-hydroxylatie [10]. ....................... 24 Figuur 6: A-ring conjugatie met glucuronidatie en sulfatatie van de 3-hydroxylgroep [10]. .......................... 25 Figuur 7: D-ring conjugatie met glucuronidatie en sulfatatie van de 17β-hydroxylgroep [10]. ...................... 26 Figuur 8: Structuurformule methyldienolone. .................................................................................................. 26 Figuur 9: Structuurformule methyltrienolone................................................................................................... 26 Figuur 10: Schematische voorstelling van de gaschromatograaf [32]. ............................................................ 28 Figuur 11: Methyldienolone na derivatisatie. ................................................................................................... 29 Figuur 12: Methyltrienolone na derivatisatie. .................................................................................................. 29 Figuur 13: Quadrupool analysator [36]. .......................................................................................................... 30 Figuur 14: Analysemethoden triple quadrupool MS. ....................................................................................... 31 Figuur 15: Chromatogram referentiestandaard methyldienolone (MD) met IS en derivatisatieprobleem (MD”, zie verder) op GC-MS gebruik gemaakt van EIC. .......................................................................... 42 Figuur 16: Full scan massaspectrum van methandiënon (IS). .......................................................................... 43 Figuur 17: Full scan massaspectrum van methyldienolone (MD). ................................................................... 43 Figuur 18: Full scan massaspectrum van het derivatisatieprobleem van methyldienolone (MD”).................. 43 Figuur 19: Chromatogram referentiestandaard methyldienolone (MD) met IS op LC-MS2. .......................... 45 Figuur 20: Massaspectrum van methandiënon (IS). ......................................................................................... 45 Figuur 21: Massaspectrum van methyldienolone (MD). .................................................................................. 45 Figuur 22: Chromatogram referentiestandaard methyltrienolone (MT) met IS op LC-MS2. .......................... 46 Figuur 23: Massaspectrum van methyltrienolone (MT). .................................................................................. 46 Figuur 24: Chromatogram supplement methyldienolone (MD) met onbekende component (pijl, zie verder) op GC-MS. ........................................................................................................................................... 47 Figuur 25: Chromatogram supplement methyldienolone (MD) op GC-MS gebruik gemaakt van EIC. ......... 47 10


Figuur 26: Chromatogram supplement methyldienolone (MD) met onbekende component (pijl, zie verder) op LC-MS2. ........................................................................................................................................... 48 Figuur 27: Chromatogram supplement methyldienolone (MD) op LC-MS2 met selectie van [M+H]+ met m/z 287. .................................................................................................................................................. 48 Figuur 28: Massaspectrum van onbekende component. ................................................................................... 49 Figuur 29: Full scan massaspectrum van onbekende component..................................................................... 49 Figuur 30: Overlaid chromatogram HLM incubatieperiode van de metaboliet van methyldienolone op GCMS gebruik gemaakt van EIC. ........................................................................................................ 50 Figuur 31: Chromatogrammen HLM incubatieperioden van methyldienolone met metabolieten (omkaderd) op LC-MS2. ...................................................................................................................................... 51 Figuur 32: Chromatogrammen HLM incubatieperioden van methyltrienolone met metabolieten (omkaderd) op LC-MS2. ...................................................................................................................................... 52 Figuur 33: Chromatogram positieve controle, methandiënon en 6β-hydroxymethandiënon als metaboliet, met IS’ op GC-MS.................................................................................................................................. 53 Figuur 34: Full scan massaspectrum van 17α-methyltestosteron (IS’). ........................................................... 54 Figuur 35: Full scan massaspectrum van 6β-hydroxymethandiënon. .............................................................. 54 Figuur 36: Overlaid chromatogram HLM ter detectie van de metaboliet (M1) en derivatisatieprobleem (M1”, zie verder) van methyldienolone (MD) met IS op GC-MS. ............................................................ 55 Figuur 37: Full scan massaspectrum van metaboliet M1. ................................................................................ 56 Figuur 38: Full scan massaspectrum van het derivatisatieprobleem van de metaboliet M1 (M1”). ................ 56 Figuur 39: Chromatogram positieve controle, methandiënon en 17-methyl-6β,16,17-trihydroxyandrosta-1,4dien-3-on (PCM1), 6β-hydroxymethandiënon (PCM2) en x-hydroxymethandiënon (PCM3) als metabolieten, met IS’ op LC-MS2. .................................................................................................. 57 Figuur 40: Massaspectrum van 17α-methyltestosteron (IS’). .......................................................................... 57 Figuur 41: Massaspectrum van metaboliet PCM1. .......................................................................................... 58 Figuur 42: Massaspectrum van metaboliet PCM2, daar het massaspectrum van metaboliet PCM3 gelijkaardig is. ..................................................................................................................................................... 58 Figuur 43: Chromatogram negatieve controle met IS op LC-MS2. .................................................................. 59 Figuur 44: Chromatogram blanco controle, methyldienolone (MD) met IS op LC-MS2. ............................... 59 Figuur 45: Chromatogram HLM methyldienolone (MD) en M1’, M2’, M3’, M4’, M5’, M6’ als metabolieten, met IS op LC-MS2. .......................................................................................................................... 60 Figuur 46: Massaspectrum van metaboliet M1’, daar de massaspectra van metabolieten M2’, M3’ en M4’ gelijkaardig zijn. .............................................................................................................................. 60 Figuur 47: Massaspectrum van metaboliet M5’, daar het massaspectrum van metaboliet M6’ gelijkaardig is. ......................................................................................................................................................... 60 11


Figuur 48: Chromatogram blanco controle, methyltrienolone (MT) met IS op LC-MS2. ............................... 61 Figuur 49: Chromatogram HLM methyltrienolone (MT) en A1, A2 als metabolieten, met IS op LC-MS2.... 62 Figuur 50: Massaspectrum van metaboliet A1, daar het massaspectrum van metaboliet A2 gelijkaardig is. . 62 Figuur 51: Overlaid chromatogram excretie-urine niet-chimere muis (bovenaan) en chimere muis (onderaan) ter detectie van de metaboliet (M1) en derivatisatieprobleem (M1”) van methyldienolone (MD) met IS op GC-MS. ........................................................................................................................... 64 Figuur 52: Chromatogram systeem blank met IS op LC-MS2. ........................................................................ 66 Figuur 53: Chromatogram negatieve urine methyldienolone niet-chimere muis (bovenaan) en chimere muis (onderaan) met IS op LC-MS2. ........................................................................................................ 66 Figuur 54: Chromatogram excretie-urines metabolieten methyldienolone op LC-MS2 met selectie van [M+H]+ met een m/z 303. ................................................................................................................ 67 Figuur 55: Chromatogram negatieve urine methyltrienolone niet-chimere muis (bovenaan) en chimere muis (onderaan) met IS op LC-MS2. ........................................................................................................ 69 Figuur 56: Chromatogram excretie-urine metabolieten methyltrienolone op LC-MS2 met selectie van [M+H]+ met een m/z 301............................................................................................................................... 70

12

Inhoudsopgave

Inhoudsopgave Voor akkoord verklaring .................................................................................................... 1 Woord vooraf ....................................................................................................................... 2 Samenvatting ........................................................................................................................ 3 Summary .............................................................................................................................. 4 Lijst met afkortingen en symbolen..................................................................................... 5 Verklarende woordenlijst ................................................................................................... 7 Lijst van tabellen en figuren ............................................................................................... 9 Inhoudsopgave ................................................................................................................... 13 1 Inleiding, probleemstelling en situatieschets ............................................................. 16 1.1 Doping ................................................................................................................................. 16 1.2 Anabole androgene steroïden (AAS)................................................................................ 18 1.2.1 Inleiding ....................................................................................................................... 18 1.2.2 Structuur ....................................................................................................................... 19 1.2.3 Werkingsmechanisme .................................................................................................. 19 1.2.4 Effecten ........................................................................................................................ 20 1.3 Metabolisatie van anabole androgene steroïden ............................................................. 21 1.3.1 Fase I metabolisme ....................................................................................................... 21 1.3.1.1 A-ring metabolisme ............................................................................................................ 22 1.3.1.2 B-ring metabolisme ............................................................................................................ 23 1.3.1.3 C-ring metabolisme ............................................................................................................ 23 1.3.1.4 D-ring metabolisme ............................................................................................................ 23

1.3.2 Fase II metabolisme ..................................................................................................... 24 1.4 Methyldienolone en methyltrienolone ............................................................................. 26 1.5 Detectie van anabole androgene steroïden ...................................................................... 27 1.5.1 Gaschromatografie (GC) .............................................................................................. 27 1.5.2 Vloeistofchromatografie (LC) ...................................................................................... 29 1.5.3 Massaspectrometrie (MS) ............................................................................................ 30 1.6 In vivo en in vitro technieken ............................................................................................ 32 1.6.1 In vivo: het muismodel ................................................................................................. 32 1.6.2 In vitro: humane lever microsomen (HLM) ................................................................. 33 1.6.3 Voor- en nadelen .......................................................................................................... 34 13

Inhoudsopgave

2 Materiaal en methoden ............................................................................................... 35 2.1 Producten en reagentia ..................................................................................................... 35 2.2 Instrumentatie .................................................................................................................... 35 2.2.1 Indamptoestellen .......................................................................................................... 35 2.2.2 Incubatietoestellen ........................................................................................................ 36 2.2.3 Centrifuges ................................................................................................................... 36 2.2.4 Overige ......................................................................................................................... 36 2.2.5 GC-MS ......................................................................................................................... 36 2.2.6 LC-MS2 ........................................................................................................................ 37 2.3 Referentiestandaarden ...................................................................................................... 37 2.4 Supplement methyldienolone............................................................................................ 38 2.5 Staalvoorbereiding humane lever microsomen .............................................................. 38 2.6 Staalvoorbereiding excretie-urines .................................................................................. 39 2.7 Analyse met GC-MS .......................................................................................................... 41 2.8 Analyse met LC-MS2 ......................................................................................................... 41

3 Resultaten en discussie ................................................................................................ 42 3.1 Analyse van referentiestandaarden ................................................................................. 42 3.1.1 Referentiestandaard van methyldienolone op GC-MS................................................. 42 3.1.2 Referentiestandaarden van methyldienolone en methyltrienolone op LC-MS2 ........... 44 3.1.2.1 Referentiestandaard van methyldienolone op LC-MS2 ...................................................... 44 3.1.2.2 Referentiestandaard van methyltrienolone op LC-MS2 ..................................................... 45

3.2 Analyse van het supplement methyldienolone ................................................................ 46 3.3 Analyse van de incubatieperiode van humane lever microsomen ................................ 50 3.3.1 HLM incubatieperiode van methyldienolone op GC-MS ............................................ 50 3.3.2 HLM incubatieperiode van methyldienolone op LC-MS2 ........................................... 51 3.3.3 HLM incubatieperiode van methyltrienolone op LC-MS2 ........................................... 52 3.4 Analyse van humane lever microsomen .......................................................................... 53 3.4.1 HLM methyldienolone op GC-MS .............................................................................. 53 3.4.1.1 Positieve controle ............................................................................................................... 53 3.4.1.2 Negatieve controle .............................................................................................................. 54 3.4.1.3 Blanco controle................................................................................................................... 55 3.4.1.4 HLM ................................................................................................................................... 55

3.4.2 HLM methyldienolone op LC-MS2.............................................................................. 57 3.4.2.1 Positieve controle ............................................................................................................... 57 3.4.2.2 Negatieve controle .............................................................................................................. 59 3.4.2.3 Blanco controle methyldienolone ....................................................................................... 59 14

Inhoudsopgave 3.4.2.4 HLM methyldienolone ....................................................................................................... 60

3.4.3 HLM methyltrienolone op LC-MS2 ............................................................................. 61 3.4.3.1 Blanco controle methyltrienolone ...................................................................................... 61 3.4.3.2 HLM methyltrienolone ....................................................................................................... 62

3.5 Analyse van excretie-urines .............................................................................................. 63 3.5.1 Excretie-urines methyldienolone op GC-MS ............................................................... 63 3.5.1.1 Toedieningsoplossing ......................................................................................................... 63 3.5.1.2 Controles ............................................................................................................................ 63 3.5.1.3 Excretie-urines.................................................................................................................... 64

3.5.2 Excretie-urines methyldienolone op LC-MS2 .............................................................. 65 3.5.2.1 Toedieningsoplossing methyldienolone ............................................................................. 65 3.5.2.2 Systeem blank..................................................................................................................... 65 3.5.2.3 Negatieve urine methyldienolone ....................................................................................... 66 3.5.2.4 Excretie-urine methyldienolone ......................................................................................... 67

3.5.3 Excretie-urines methyltrienolone op LC-MS2.............................................................. 68 3.5.3.1 Toedieningsoplossing methyltrienolone............................................................................. 68 3.5.3.2 Negatieve urine methyltrienolone ...................................................................................... 69 3.5.3.3 Excretie-urine methyltrienolone ......................................................................................... 69

3.6 Overzicht ............................................................................................................................ 71

4 Besluit ........................................................................................................................... 74 Literatuurlijst..................................................................................................................... 76

15

Inleiding, probleemstelling en situatieschets

1 Inleiding, probleemstelling en situatieschets Het dopingcontrolelaboratorium (DoCoLab) is gevestigd te Zwijnaarde (Gent) en is verbonden aan de faculteit Geneeskunde en Gezondheidswetenschappen van de Universiteit Gent. Aan het hoofd van het laboratorium staat Professor Dr. Van Eenoo. DoCoLab staat in voor de dopingcontrole van urine- en bloedstalen van atleten en paarden, door deze te analyseren op de aanwezigheid van verboden middelen. Hiernaast worden er ook nieuwe methoden ontwikkeld voor het opsporen van verboden middelen. DoCoLab is opgenomen in de lijst van de 32 geaccrediteerde laboratoria van het Wereld Anti-Doping Agentschap (WADA) voor het uitvoeren van dopingcontrole analyses en maakt gebruik van ISO 17025 geaccrediteerde methoden om zo de kwaliteit te waarborgen [1,2]. Binnen dit onderzoek wordt de metabolisatie nagegaan van dopinggerelateerde producten en meer bepaald van anabole androgene steroïden (AAS). De componenten die worden onderzocht zijn methyldienolone en methyltrienolone. De metabolieten van het steroïde laten een langere detectie van het misbruik toe dan het eigenlijke steroïde, waardoor het dus belangrijk is dat het metabolisme gekend is. Daarnaast is het ook van belang dat de structuur van de metabolieten achterhaald wordt om methyldienolone en methyltrienolone specifieker te kunnen identificeren in de urine. De studie naar de metabolisatie van deze AAS componenten wordt aan de hand van in vivo en in vitro technieken onderzocht. Hiervoor wordt er op zoek gegaan naar humane metabolieten door het analyseren van excretie-urines van niet-chimere en chimere muizen en via incubaties met behulp van microsomen. De metabolieten worden opgespoord aan de hand van detectiemethoden. Hierbij zijn de voornaamste detectiemethoden voor steroïden gaschromatografie (GC) en vloeistofchromatografie (LC) gekoppeld aan massaspectrometrie (MS). 1.1

Doping

Doping wordt gedefinieerd als het overtreden van een of meerdere anti-doping regels die beschreven staan in De Code van het WADA. Dit houdt onder andere in het verhandelen, het in bezit zijn of het gebruik van een prestatie bevorderend middel die gebruikt wordt in de sportwereld. Ook fraude gedurende de dopingcontrole kan als doping beschouwd worden. Uit statistieken van het WADA is gebleken dat de anabole middelen de meest voorkomende substanties zijn die gebruikt worden als doping [3-5]. 16


Het WADA is een onafhankelijke internationale organisatie die werd opgericht in 1999 om een strijd te voeren tegen doping. De doelstellingen hiervan zijn om de gezondheid, eerlijkheid en wereldwijde gelijkheid voor atleten te bevorderen. Elk jaar stelt het WADA een vernieuwde lijst op van substanties en methoden die verboden zijn binnen en buiten de competitie, genaamd de Verboden Lijst. Deze lijst vormt een internationale standaard met als doel het wereldwijd harmoniseren van het anti-doping beleid. Opdat een substantie of methode tot de Verboden Lijst behoort, moet het voldoen aan minimaal twee van volgende drie criteria: (1) de substantie is een prestatie bevorderend middel; (2) er bestaat een mogelijks gevaar voor de gezondheid van de atleet; en (3) indien het de geest van de sport schendt [3,6-8]. De verboden middelen en methoden worden onderverdeeld in verschillende klassen: S0.

Niet goedgekeurde substanties;

S1.

Anabole middelen;

S2.

Peptide hormonen, groeifactoren en verwante stoffen;

S3.

Bèta-2 agonisten;

S4.

Hormoon- en metabole modulatoren;

S5.

Diuretica en andere maskerende middelen;

S6.

Stimulantia;

S7.

Narcotica;

S8.

Cannabinoïden;

S9.

Glucocorticosteroïden;

P1.

Alcohol;

P2.

Bèta-blokkers;

M1. Manipulatie van bloed en bloedcomponenten; M2. Chemische en fysische manipulatie; M3. Genetische doping [8]. Er wordt een onderscheid gemaakt tussen binnen en buiten wedstrijdverband. De klassen S0 tot S5 zijn substanties en M1 tot M3 methoden die zowel binnen als buiten de competitie verboden zijn. De klassen S6 tot S9 zijn substanties die enkel binnen wedstrijdverband verboden zijn. Bij bepaalde sporten behoren de klassen P1 en P2 ook tot de verboden middelen. De AAS behoren tot de S1 klasse van de anabole middelen [8]. 17


1.2

Anabole androgene steroïden (AAS)

1.2.1

Inleiding

Testosteron is het meest gekende voorbeeld van een AAS die in de Verboden Lijst van het WADA is opgenomen. Het is een androgeen steroïde die bij mannen hoofdzakelijk geproduceerd wordt in de tussencellen van Leydig in de testis. Testosteron is in mindere mate aanwezig bij vrouwen en wordt vooral geproduceerd in de eierstokken. In beide geslachten komt testosteron in kleine hoeveelheden voor in de bijnieren. Het hormoon werd in 1935 voor het eerst ontdekt en gesynthetiseerd met medische doeleinden, maar al gauw werd ook het misbruik ervan in de sport vastgesteld. Bij toediening van testosteron via orale of parenterale weg wordt deze zeer vlug opgenomen in het bloed, waarna er een snelle afbraak in de lever zal plaatsvinden door het first-pass metabolisme. Om het firstpass effect te vermijden, worden chemische modificaties uitgevoerd om de AAS oraal en parenteraal actief te maken. Alkylering op C-17α zal het first-pass metabolisme in de lever vertragen door het sterisch hinderen van de 17β-hydroxylgroep, waardoor het steroïde oraal actief wordt. Methyldienolone en methyltrienolone zijn voorbeelden van oraal actieve steroïden met een 17α-methylgroep. Om parenterale preparaten actief te maken via intramusculaire injectie wordt de 17β-hydroxylgroep veresterd door een carbonzuur, hierbij zal het steroïde lipofiele eigenschappen vertonen en oplossen in vetweefsel. Door hydrolyse zal het steroïde geleidelijk aan worden vrijgesteld, waardoor de werkingsduur verlengd wordt [8-12]. De AAS zijn synthetisch vervaardigde stoffen die afgeleid zijn van het mannelijk geslachtshormoon testosteron met een spieropbouwend effect. Door veranderingen aan te brengen in de ringstructuur van het steroïde probeert men de ongewenste androgene effecten (zie 1.2.4) zoveel mogelijk te reduceren en de gewenste anabole effecten (zie 1.2.4) te stimuleren. De AAS werden op de Olympische Spelen in Montreal van 1976 voor het eerst opgespoord in humane urine via GC-MS, waarna het gebruik ervan onmiddellijk werd verboden door het Internationaal Olympisch Comité (IOC). De AAS worden geclassificeerd in twee groepen, namelijk de endogene en exogene steroïden. Endogene steroïden zijn lichaamseigen steroïden, waarbij testosteron het belangrijkste voorbeeld is. Exogene steroïden zijn AAS die van buitenaf in het lichaam zijn terechtgekomen en dus van nature niet in het lichaam voorkomen. Methyldienolone en methyltrienolone zijn 18


voorbeelden van exogene steroïden die in de bachelorproef verder zullen bestudeerd worden [9-11,13]. Designer steroïden werden tot voor kort geïntroduceerd in voedingssupplementen. Dit zijn gemodificeerde steroïden, vertrekkend uit testosteron die structurele veranderingen hebben ondergaan met eenzelfde werking waardoor ze niet meer gedetecteerd zullen worden via specifieke anti-doping methoden. Prohormonen zijn precursors van hormonen, waarbij deze door enzymen in het lichaam zullen worden omgezet tot hormonen of substanties met een hormonale werking die tot de verboden middelen behoren. Door het ontwikkelen van deze substanties probeert men de dopingcontroles te omzeilen [7,12,14,15]. 1.2.2

Structuur

Steroïden hebben als basisstructuur een perhydrocyclopentanofenantreen ringsysteem die bestaat uit drie cyclohexaanringen (A-, B- en C-ring) en een cyclopentaanring (D-ring), waarbij een specifieke nummering geldt van het koolstofskelet (Figuur 1). Op basis van deze nummering kunnen de posities van de zijketens met functionele groepen aangegeven worden. Deze kunnen zich zowel onder als boven het vlak van het koolstofskelet bevinden, waardoor respectievelijk een α- of β-positie wordt verkregen. Testosteron (17β-hydroxy-4androsteen-3-on) is het model van de AAS en wordt gekenmerkt door zijn androstaanskelet met twee β-methylgroepen op C-10 en C-13, respectievelijk C-19β en C-18β (Figuur 2) [10,16,17].

Figuur 1: Basisstructuur van steroïden [10].

1.2.3

Figuur 2: Structuurformule van testosteron [10].

Werkingsmechanisme

Het werkingsmechanisme van AAS is vergelijkbaar met dat van testosteron. Hierbij zal het steroïde diffunderen in het cytoplasma van de cel van het doelweefsel, waar het zal binden aan receptoren. Testosteron kan in zijn oorspronkelijke vorm of na omzetting door het 19


enzym 5α-reductase tot 5α-dihydrotestosteron (DHT) binden aan de androgeenreceptor (AR), waarbij DHT een veel hogere affiniteit vertoont voor de AR in vergelijking met testosteron. Afhankelijk van het doelorgaan zullen AAS ook binden met een verschillende affiniteit voor de AR. Testosteron kan alsook worden omgezet door het enzym aromatase tot de vrouwelijke geslachtshormonen oestradiol en oestron, die zullen binden aan de oestrogeenreceptor (ER). Hierdoor ontstaat er een steroïdereceptorcomplex die langs de poriën van de kernmembraan, de celkern binnentreedt om zijn effect uit te oefenen. In de celkern zal het steroïdereceptorcomplex binden aan de regulerende sequentie van het DNA-fragment en zo genactivatie induceren, wat resulteert in transcriptie en translatie om de eiwitsynthese te stimuleren. Bij transcriptie zal het DNA in de nucleus van de cel door RNA-polymerase vertaald worden in RNA en meer bepaald in mRNA. Het mRNA zal de celkern verlaten om zo in het cytoplasma terecht te komen en het proces van translatie te starten. Hierbij zal het mRNA door ribosomen vertaald worden tot aminozuren, die coderen voor specifieke eiwitten (Figuur 3) [7,9,11,18,19].

Figuur 3: Werkingsmechanisme van testosteron of AAS [18].

1.2.4

Effecten

AAS hebben zowel androgene als anabole effecten (zie 1.2.1). De androgene werking zorgt voor de ontwikkeling van mannelijke kenmerken zoals een verlaging van de stem, het typisch mannelijk beharingspatroon, verhoging van de talgproductie en agressiviteit. Dit laatste kan een verhoogde staat van concentratie teweegbrengen. De anabole effecten zorgen voor de toename van de spiermassa en weefselopbouw van botten. Dit wordt 20


verwezenlijkt door enerzijds de eiwitopbouw te stimuleren en anderzijds de eiwitafbraak te remmen. Omwille van deze anabole eigenschappen worden steroïden als een prestatie bevorderend middel gebruikt in de sportwereld [9,11]. Het veelvuldig gebruik en het toedienen van hoge doseringen van AAS kunnen echter heel wat ongewenste effecten op de gezondheid teweegbrengen. Als algemene nevenwerkingen gelden een toegenomen libido, acne en een vettigere huid door een verhoogde talgproductie, beschadiging van de lever met leverfunctiestoornissen tot gevolg door de afbraak van AAS en agressiviteit kan ook als een neveneffect beschouwd worden. Daarnaast bestaat er een verhoogd risico op hart- en vaatziekten door een stijging van het LDL-cholesterolgehalte en een daling van het HDL-cholesterolgehalte. Bij vrouwen kan er bij het gebruik van AAS een verstoring van de menstruele cyclus optreden en kunnen er zich

mannelijke

kenmerken

ontwikkelen

zoals

mannelijke

lichaamsbeharing,

borstverkleining en stemverlaging. Bij mannen zal de endogene productie onderdrukt worden waardoor er borstvorming en testikelvermindering, met een afname van de zaadproductie, wordt verkregen. Alsook behoren impotentie, vergroting van de prostaat en prostaatkanker tot de nevenwerkingen bij de man [7,9,11,12]. 1.3

Metabolisatie van anabole androgene steroïden

De afbraak van AAS door metabolisatie vindt hoofdzakelijk plaats in de lever en heeft als doel om steroïden te inactiveren en de excretie te bevorderen. Desondanks er ook andere organen betrokken zijn bij de biotransformatie, is de lever hierbij het belangrijkste orgaan. Het metabolisme van AAS is verwant aan dat van testosteron, waarbij de metabolische pathway van testosteron de basis vormt van AAS met een gelijkaardige structuur. Het metabolisme wordt onderverdeeld in twee fasen, namelijk het fase I en het fase II metabolisme, waarbij er metabolische veranderingen zullen plaatsvinden in de ringstructuur van het steroïde [10,20]. 1.3.1

Fase I metabolisme

Tijdens het fase I metabolisme zullen er zich modificaties voordoen aan de structuur van het steroïde door enzymatisch gekatalyseerde reacties zoals oxidaties, reducties of hydroxylaties. Hierdoor zullen AAS omgezet worden in meer polaire verbindingen, 21


waarbij deze geïnactiveerd worden om zo de excretie te bevorderen. Een samenvattende tabel van de fase I reacties aan de ringstructuur worden weergegeven in Tabel 1. Hiernaast kunnen er ook hydroxylaties plaatsvinden op C-18 of C-19 [10,21]. Tabel 1: Reacties van het fase I metabolisme [10].

A-ring 5α- en 5β-reductie 3α- en 3β-hydroxyreductie 1,2-hydrogenatie 1,2-dehydrogenatie

B-ring 6β-hydroxylatie 6,7-dehydrogenatie

C-ring 12-hydroxylatie

D-ring 16-oxidatie 17-oxidatie 17α- en 17βhydroxylatie 16α- en 16βhydroxylatie 17-epimerisatie

Cytochroom P450 (CYP) enzymen zijn enzymen die deze reacties katalyseren en spelen dus een centrale rol in de metabolisatie als fase I enzymen, waarbij deze talrijk aanwezig zijn in de lever. Zowel in vivo als in vitro wordt het CYP systeem gebruikt. Dit is een groep van enzymen, de mono-oxygenasen die instaan voor de oxidatie van vele stoffen en omvatten meerdere isovormen, waaronder CYP3A4. CYP3A4 komt in de lever en het gastro-intestinaal stelsel voor en is betrokken bij de metabolisatie van de meeste stoffen (>50%). De metabolische reacties die plaatsvinden door CYP3A4 zijn hydroxylaties met als voorbeeld de C6-β-hydroxylatie van testosteron [20-24]. 1.3.1.1

A-ring metabolisme

5α- en 5β-reductie van 3-keto-4-een steroïden is de initiële en snelheidsbepalende stap in het metabolisme van testosteron. Hierbij zal er reductie plaatsvinden van de dubbele binding tussen C-4 en C-5 door het 5α- en 5β-reductase met NADPH als co-factor, waardoor er twee isomeren worden gevormd met een 5α- en 5β-configuratie. Zoals eerder vermeld zal het enzym 5α-reductase testosteron omzetten in DHT. Deze irreversibele reactie wordt gevolgd door de 3α- en 3β-hydroxy-reductie, waarbij de ketofunctie op C-3 van het 5α- of 5β-isomeer gereduceerd wordt door 3α- of 3β-hydroxysteroïd dehydrogenase tot een 3α- of 3β-hydroxy structuur (Figuur 4) [9,10].

22


Figuur 4: A-ring metabolisme met 5α- en 5β-reductie gevolgd door 3α- en 3β-hydroxy-reductie [10].

Bovendien kunnen er ook reacties zoals 1,2-dehydrogenatie van 3-keto-4-een steroïden tot 3-keto-androsta-1,4-dien steroïden optreden. Alsook behoort hydrogenatie van de C-1,2 dubbele binding in 3-keto-androsta-1,4-dien steroïden tot een van de reacties van het fase I metabolisme in de A-ring [10]. 1.3.1.2

B-ring metabolisme

Ter hoogte van de B-ring is 6β-hydroxylatie de voornaamste metabolisatiereactie bij de AAS. Het metabolisme van de B-ring is het meest uitgesproken bij steroïden met een 17βhydroxy-17α-methyl structuur, waar de reductie in de A-ring gehinderd wordt door de aanwezigheid van een dubbele bindingen tussen C-1 en C-2. Naast de hydroxylatie op C6β behoort ook 6,7-dehydrogenatie tot een van de reacties van het fase I metabolisme in de B-ring, maar is weinig voorkomend in de metabolische pathway van AAS [10]. 1.3.1.3

C-ring metabolisme

De reacties in het metabolisme van de C-ring zijn beperkt tot een 12-hydroxylatie, waarbij er hydroxylatie op C-12α of C-12β zal plaatsvinden [10]. 1.3.1.4

D-ring metabolisme

17-oxidatie van de 17β-hydroxylgroep is de meest gekende metabolisatieweg van 17βhydroxy steroïden zoals testosteron, waar de 17β-hydroxylgroep enzymatisch geoxideerd 23


wordt door 17β-hydroxysteroïd dehydrogenase (17β-HDS) tot een 17-keto structuur. Ditzelfde enzym (17β-HDS) kan eveneens de 17-keto groep terug converteren in een 17βhydroxylgroep bij de 17β-hydroxylatie reactie van 17-keto steroïden. Bovendien kan er uit de 17-keto groep ook 17α-hydroxy steroïden gevormd worden door het enzym 17αhydroxysteroïd dehydrogenase (17α-HDS), waarbij 17α-hydroxylatie van 17-keto steroïden als reactie geldt (Figuur 5) [10].

Figuur 5: D-ring metabolisme met 17-oxidatie en de reacties 17α- en 17β-hydroxylatie [10].

Hydroxylatie van C-16α en C-16β behoort alsook tot een van de reacties van het fase I metabolisme in de D-ring van AAS, waaruit 16-oxidatie als volgende reactie kan optreden. Hierbij zullen 16-keto steroïden gevormd worden door enzymatische oxidatie uit de overeenkomstige C-16α- of C-16β-hydroxy steroïden. Alsook kan er 17-epimerisatie van de D-ring plaatsvinden [10]. 1.3.2

Fase II metabolisme

Bij het fase II metabolisme treden er conjugatiereacties op waarbij steroïden of hun metabolieten gekoppeld worden met een glucuronzuur of sulfaatgroep. Deze conjugatiereacties zullen de polariteit van AAS verhogen waardoor excretie via de nieren bevorderd wordt. De fase II reacties worden enzymatisch gekatalyseerd door de fase II enzymen die hoofdzakelijk aanwezig zijn in de lever. Hierbij zijn co-factoren noodzakelijk voor het katalyserend effect van deze enzymen. De voornaamste fase II enzymen zijn uridine difosfoglucuronosyl transferase (UGT), sulfotransferase (ST), N-acetyl transferase en glutathion S-transferase. UGT is het belangrijkste enzym bij de glucuronidatie, daar ST voornamelijk sulfatatiereacties katalyseren. Een samenvattende tabel van de belangrijkste fase II reacties aan de ringstructuur worden weergegeven in Tabel 2 [10,20,25].

24

Inleiding, probleemstelling en situatieschets Tabel 2: Reacties van het fase II metabolisme [10].

A-ring sulfatatie en glucuronidatie 3hydroxylgroep

D-ring glucuronidatie en sulfatatie secundaire 17βhydroxylgroep glucuronidatie en sulfatatie tertiaire 17βhydroxylgroep 17-epimerisatie

Uit de 3α- en 3β-hydroxy-reductie van het fase I metabolisme volgt de conjugatiereactie aan de A-ring, waar sulfatatie en glucuronidatie van de 3-hydroxylgroep zal optreden. Hierbij zullen 3α-hydroxy steroïden geconjugeerd worden met glucuronzuur die zal binden aan de vrije hydroxylgroep op C-3α, waarbij 3α-O-β-glucuronides zullen gevormd worden. Bij 3β-hydroxy steroïden zal er een sulfaatgroep gebonden worden op de vrije hydroxylgroep van C-3β met vorming van 3β-sulfaat (Figuur 6) [10].

Figuur 6: A-ring conjugatie met glucuronidatie en sulfatatie van de 3-hydroxylgroep [10].

Als conjugatiereacties in de D-ring vinden er glucuronidaties of sulfataties plaats in secundaire en tertiaire 17β-hydroxy steroïden, zoals testosteron. Hierbij zal de glucuronideof sulfaatgroep binden aan de vrije hydroxylgroep op C-17β tot vorming van 17β-O-βglucuronide of 17β-sulfaat (Figuur 7). Alsook kan er 17-epimerisatie van de D-ring plaatsvinden [10].

25


Figuur 7: D-ring conjugatie met glucuronidatie en sulfatatie van de 17β-hydroxylgroep [10].

1.4

Methyldienolone en methyltrienolone

Methyldienolone (17β-hydroxy-17α-methylestra-4,9-dien-3-on) en methyltrienolone of ook wel metribolone genoemd (17β-hydroxy-17α-methylestra-4,9,11-trien-3-on) zijn oraal actieve exogene AAS die afgeleid zijn van 19-nortestosteron, waarbij het anabole effect bij beide steroïden veel hoger ligt dan het androgene. De orale activiteit van deze steroïden wordt bekomen door de 17α-methyl substitutie. Bij deze substitutie bestaat er echter wel een risico op leverschade, waarbij methyldienolone en methyltrienolone de hoogste hepatoxiciteit vertonen van alle 17α-gemethyleerde AAS. Beide AAS vertonen structurele gelijkenissen en worden gekenmerkt door een ketofunctie op C-3, een β-methylgroep op C-13 en een α-methylgroep en β-hydroxylgroep op C-17. Methyldienolone en methyltrienolone zijn niet-gearomatiseerde steroïden die geconjugeerde dubbele bindingen bevatten, waarbij er een dubbele binding gelokaliseerd is in de A- en B-ring van methyldienolone en in de A-, B- en C-ring van methyltrienolone. De structuurformule van methyldienolone en methyltrienolone wordt weergegeven in Figuur 8 en 9, waarbij deze steroïden een moleculair gewicht hebben met respectievelijk een massa-ladingsverhouding (m/z) van 286 en 284. Beide AAS staan vermeld in de Verboden Lijst van het WADA, maar over het metabolisme is weinig tot niets gekend [7,8,12,26,27]. CH3

CH3

CH3

OH

CH3

OH

H

H

H

H O

Figuur 8: Structuurformule methyldienolone.

O

Figuur 9: Structuurformule methyltrienolone.

26


Er werd al sinds 1960 onderzoek gedaan naar de mogelijkheid tot een farmaceutisch preparaat van beide steroïden, maar deze werden uiteindelijk nooit geproduceerd voor medische doeleinden door het hoog toxisch effect. Methyldienolone werd voor een korte tijd als voedingssupplement op de markt gebracht onder de naam M-DIEN, maar is momenteel niet meer verkrijgbaar. Methyltrienolone werd daarentegen niet geïntroduceerd als supplement [12,26,27]. 1.5

Detectie van anabole androgene steroïden

Voor de detectie van AAS en hun metabolieten wordt voor een urine matrix geopteerd in de plaats van bloed, aangezien deze in een hogere concentratie voorkomen in urine en de urine collectie minder invasief is dan een bloedafname. Om exogene AAS, met name methyldienolone en methyltrienolone, op te sporen is er enkel een kwalitatieve bepaling vereist doordat ze van nature niet in het lichaam voorkomen. De detectie van AAS gebeurt meestal aan de hand van GC-MS waar een harde ionisatietechniek, elektron ionisatie (EI), van toepassing is. Hierdoor treedt een sterke fragmentatie op, daar deze fragmenten ervoor zorgen dat er bijkomende structurele informatie wordt verkregen over de te analyseren component. Daarnaast wordt er ook gebruik gemaakt van vloeistofchromatografie gecombineerd met tandem massaspectrometrie (LC-MS2), waarbij geen derivatisatie meer vereist is en zo een snellere staalvoorbereiding toelaat. Bovendien wordt hierbij een zachte ionisatietechniek, elektrospray ionisatie (ESI), gebruikt waardoor er minder fragmentatie zal optreden en er informatie over het moleculair gewicht gewonnen zal worden. Bij deze ionisatie zal er een verlies of winst van een H+ optreden, wat zich resulteert in een positieve of negatieve modus van detectie. GC-MS en LC-MS2 zijn analytische technieken, waarbij GC en LC zorgen voor de scheiding van de componenten en MS instaat voor de detectie [28-30,33]. 1.5.1

Gaschromatografie (GC)

GC is een scheidingstechniek waar de componenten zich zullen verdelen over twee fasen, namelijk de mobiele fase en de stationaire fase. Het staal wordt via de mobiele fase, het draaggas, over de stationaire fase geleid waarbij de componenten zich zullen verplaatsen met een verschillende snelheid doorheen de kolom. De scheiding is gebaseerd op het verschil in interactie met de stationaire fase en de vluchtigheid van de stof, wat resulteert in 27


verschillende retentietijden. Hoe groter de affiniteit voor de stationaire fase, hoe trager de componenten van de kolom zullen elueren. Stoffen met eenzelfde affiniteit voor de stationaire fase zullen worden gescheiden op basis van vluchtigheid, hierbij zal deze met het laagste kookpunt eerst over de kolom geleid worden. Als draaggas wordt meestal het inert gas helium gebruikt, dit is vrij van onzuiverheden zodat er geen interactie optreedt met de componenten of de stationaire fase. De stationaire fase bij capillaire GC bestaat uit een dunne vloeistoffilm gecoat op de binnenwand van een capillaire kolom van fused silica. Naargelang de aard van de te scheiden componenten wordt een polaire of apolaire kolom gebruikt [31,32]. De GC maakt gebruik van een temperatuurgradiënt, waarbij de injectietemperatuur, kolomtemperatuur en detectortemperatuur geregeld zal worden in de oven van de GC. Hierdoor zal men een optimale scheiding en verkorte analysetijd verkrijgen door de temperatuur geleidelijk aan te verhogen. Bij de injectie van het staal vindt onmiddellijke verdamping plaats in de liner, gelokaliseerd in een warme verdampingsruimte, waar een hoge initiële temperatuur geldt. Het verdampte staal zal hierna door het draaggas worden meegenomen naar de kolom onder een hoge druk, waarna de componenten zich zullen verdelen tussen de stationaire en mobiele fase en gescheiden van de kolom komen. Deze zullen door de detector omgevormd worden tot elektrische signalen en daarna door het dataverwerkend systeem verwerkt worden tot een chromatogram (Figuur 10). De detector die gebruikt zal worden is de massaspectrometer [31,32].

Figuur 10: Schematische voorstelling van de gaschromatograaf [32].

Derivatisatie van AAS met trimethylsilyl (TMS) op GC is nodig om chromatografische eigenschappen van steroïden te verbeteren, waar binding van TMS zal plaatsvinden op zowel hydroxyl- als ketogroepen. Hierdoor worden stoffen vluchtiger en thermisch stabieler gemaakt, maar alsook zullen betere fragmenten worden verkregen. Door binding 28


van TMS (m/z 73) aan de ringstructuur van het steroïde zal het moleculair gewicht wijzigen, waarbij er telkens een verlies van H+ zal optreden. Na derivatisatie met TMS van methyldienolone en methyltrienolone worden moleculaire ion bekomen met respectievelijk een m/z 430 (m/z 286 + (2 * m/z 72)) en een m/z 428 (m/z 284 + (2 * m/z 72)) (Figuur 1112) [28,33].

CH3

H3C

Si

CH3 O

Si

CH3

CH3

CH3

H

CH3

CH3

O

CH3 H3C

CH3

Figuur 11: Methyldienolone na derivatisatie.

1.5.2

Si

CH3 O

Si

CH3

CH3

H

H

CH3

H O

CH3

Figuur 12: Methyltrienolone na derivatisatie.

Vloeistofchromatografie (LC)

LC is net zoals GC een scheidingstechniek waar de componenten zich zullen verdelen over twee fasen, namelijk de mobiele fase en de stationaire fase. De mobiele fase is hierbij een vloeistof. De scheiding berust op het verschil in interactie van de componenten met de stationaire fase, waarbij de stationaire fase geadsorbeerd is in het poriënsysteem van het poreus dragermateriaal, silica. De LC maakt gebruik van een verdelingsgradiënt die de samenstelling zal wijzigen van de mobiele fase tijdens de scheiding. Hierdoor zullen de componenten die gebonden zijn aan de stationaire fase deze interactie verliezen en van de kolom zullen elueren met de mobiele fase [32,34,35]. Er wordt een onderscheid gemaakt tussen normale fase-chromatografie (NPLC) en omgekeerde fase-chromatografie (RPLC) op basis van het verschil in polariteit van de mobiele en stationaire fase. Bij NPLC is de stationaire fase meer polair dan de mobiele fase, waar bij RPLC het omgekeerde geldt. RPLC is de meest gebruikte vloeistofchromatografische scheidingstechniek bestaande uit een apolaire stationaire fase van silica gemodificeerd met lange C-ketens zoals C-18 en een mobiele fase van water/methanol [32,35].

29


1.5.3

Massaspectrometrie (MS)

MS is een detectiemethode die gebaseerd is op de ionisatie van componenten, waardoor scheiding van ionen volgens hun m/z wordt verkregen [32,33]. Om de koppeling te maken tussen de scheidingstechniek en de massaspectrometer is een interface nodig die de flow van de mobiele fase en zo het drukverschil aanpast aan de capaciteit van de massaspectrometer, waar vacuüm omstandigheden gelden. Daarna komen de componenten in de ionenbron terecht, waarbij ionisatie zal plaatsvinden. Hierbij zullen ionen gevormd worden door deze te bombarderen met elektronen. Op deze manier wordt een elektron uit de molecule geslagen, waardoor positief geladen ionen bekomen worden [33]. De massa-analysator komt na de ionenbron, waar de scheiding van ionen zal plaatsvinden. Hierbij worden de ionen gesorteerd volgens hun m/z verhouding door middel van een elektromagnetisch veld binnenin de quadrupool. De quadrupool analysator bestaat uit vier evenwijdige cilindrische staven, waar in elk paar tegenoverliggende staven een spanning wordt aangebracht. Over het ene paar staven wordt een gelijkspanning aangelegd en over het andere paar een wisselspanning. Afhankelijk van de spanning van dit elektrisch veld worden ionen geselecteerd met een bepaalde m/z waarde en zullen deze in stabiele oscillerende bewegingen getransporteerd worden naar de detector. De ionen die minder stabiel bewegen in het elektrisch veld zullen de detector niet bereiken. De spanning op de staven kan men variëren in de tijd waardoor een breed spectrum aan m/z waarden wordt verkregen (Figuur 13). De quadrupool massa-analysator kan op twee manieren werken namelijk in full scan of selected ion monitoring (SIM). In de full scan mode wordt het volledig m/z gebied geanalyseerd en bij SIM worden enkel geselecteerde ionen gedetecteerd [33,36].

Figuur 13: Quadrupool analysator [36].

30


De gescheiden ionen zullen aan de hand van een elektron multiplier gedetecteerd worden. Hierbij zullen de ionen invallen op een fotokathode waardoor elektronen vrijgemaakt worden. Deze zullen zo op een tweede oppervlak invallen en opnieuw elektronen vrijmaken die tot een signaal omgezet worden. Dit is een herhaaldelijk proces om het signaal te versterken. Dit verkregen signaal is evenredig met het aantal ionen die de detector bereiken [33]. Een tandem MS (MS2) of triple quadrupool kan ook gebruikt worden als massaspectrometer. Deze bestaat uit drie quadrupolen die na elkaar geplaatst worden, twee massaspectrometer quadrupolen en een collisie cel die zich tussen de twee andere quadrupolen bevindt. In de eerste quadrupool worden precursorionen geselecteerd met een bepaalde m/z. De collisie cel die hierop volgt zal de geselecteerde ionen fragmenteren door botsing met het collisiegas. De derde quadrupool laat enkel de geselecteerde productionen door voor detectie in het geval van single reaction monitoring (SRM) en precursor ion scan. Hierbij zullen ionen met een m/z 77, 91 en 105 geselecteerd worden, daar deze ionen in alle anabole steroïden voorkomen. Afhankelijk van de gekozen scan mode worden quadrupool 1 en quadrupool 3 in full scan of SIM gezet, zodat respectievelijk alle geïoniseerde moleculen worden doorgelaten of enkel de ionen met een welbepaalde m/z waarde. Bij de product ion scan worden precursorionen geselecteerd in de eerste quadrupool, waarna alle fragmentionen die gevormd werden in de collisie cel gedetecteerd worden (Figuur 14) [35,37,38].

Figuur 14: Analysemethoden triple quadrupool MS.

31


1.6

In vivo en in vitro technieken

Zoals beschreven (zie 1.3) is de lever een van de belangrijkste organen die verantwoordelijk is voor de metabolisatie van AAS. Dit orgaan is voornamelijk betrokken bij de farmacokinetiek en wordt bepaald door ADME (absorptie, distributie, metabolisatie en eliminatie) waar in dit onderzoek de nadruk ligt op de metabolisatie. De componenten worden na omzetting in de lever uitgescheiden in de urine. Omwille van ethische redenen is het gebruik van gezonde menselijke vrijwilligers uitgesloten, waardoor men op zoek gaat naar alternatieven zoals in vivo en in vitro technieken [24,39]. 1.6.1

In vivo: het muismodel

Als diermodel wordt er gebruik gemaakt van chimere muizen die een gehumaniseerde lever bevatten, namelijk homozygote urokinase-type plasminogen activator/severe combined immunodeficiency (uPA+/+-SCID) muizen. Deze zijn afkomstig van het centrum voor vaccinologie (CEVAC) en werden oorspronkelijk als model voor de evaluatie van vaccins tegen hepatitis B en C virus gebruikt. In voorgaande in vivo studies met dit in vivo model werden specifieke humane metabolieten van steroïden teruggevonden, waardoor deze gebruikt wordt om de humane metabolisatie na te bootsen in het kader van doping bestrijding [23,24,40]. Heterozygote uPA+/--SCID muizen, in dit onderzoek niet-chimere muizen genoemd, bevatten geen getransplanteerde humane hepatocyten, waardoor deze dienen als controlegroep. Ze worden binnen hun generatie gekruist om tot homozygote uPA+/+-SCID te komen [23,39]. De uPA+/+-SCID muizen zijn drager van het muis urokinase-type plasminogeen activator (uPA) gen dat onder de controle staat van de muis albumine promotor. Deze homozygote muizen zijn immunodeficiënte muizen (SCID) die lijden aan een chronische leverziekte, veroorzaakt door een specifieke overexpressie in de lever van het uPA gen. Dit kan leiden tot sterfte indien er fatale intestinale en abdominale bloedingen optreden. De aangetaste parenchymcellen van de lever kunnen tot 90% vervangen worden met humane hepatocyten door deze te transplanteren in de uPA+/+-SCID muizen, waardoor de leverziekte geheeld wordt. Door de SCID mutatie van deze muizen zullen de getransplanteerde humane 32


hepatocyten niet afgestoten worden en dus immunologische tolerantie vertonen. De humane hepatocyten zullen in de tweede week worden geïnjecteerd in de milt van pasgeboren muizen. Deze worden via de bloedstroom van de milt naar de leverpoortader gebracht, om in de lever terecht te komen waar verspreiding via diffusie in de hepatische sinusoïden zal optreden. Hierna zal vermenigvuldiging plaatsvinden om zo de normale leverfunctie te herstellen [14,23,39-41]. De concentratie aan humaan albumine die gemeten wordt in het plasma van de muis, is een maat voor de hoeveelheid humane hepatocyten in de chimere lever. Hoe groter het gehalte aan humaan albumine, hoe meer aangetaste parenchymcellen in de lever vervangen zijn door humane hepatocyten en hoe meer het in vivo model de humane metabolisatie nabootst [24,39]. 1.6.2

In vitro: humane lever microsomen (HLM)

Als toepassing van een in vitro techniek worden HLM gebruikt in de studie om het metabolisme van steroïden na te gaan. Deze levermicrosomen zijn membraanproteïnen verpakt in vesikels afkomstig van het endoplasmatisch reticulum die CYP enzymen bevatten en wordt bekomen na ultracentrifugatie van gehomogeniseerd leverweefsel. CYP enzymen zijn grotendeels verantwoordelijk voor de fase I metabolisatie (zie 1.3.1). Alsook is UGT als fase II enzymen (zie 1.3.2) aanwezig in de microsomen. Deze enzymen spelen een belangrijke rol bij de biotransformatie. Om de metabolische activiteit van de CYP enzymen te behouden, worden de microsomen bewaard op een lage temperatuur van -80°C [20-22]. De enzymen in de HLM worden geactiveerd met een co-factor. NADPH is een noodzakelijke co-factor voor de CYP activiteit, vandaar dat het NADPH regenererend systeem wordt toegevoegd. Dit bestaat uit

β-NADP, glucose-6-fosfaat en glucose-6-

fosfaat dehydrogenase. Hierbij zal NADPH gevormd worden uit NADP+ door gebruik te maken van een enzymatische reactie van namelijk, glucose-6-fosfaat dehydrogenase in de aanwezigheid van glucose-6-fosfaat als substraat [20-22,42].

33


1.6.3

Voor- en nadelen

De grootste voordelen van microsomen zijn hun lage kostprijs, eenvoud in gebruik en het is een goedgedefinieerde in vitro techniek voor het onderzoek naar de metabolisatie van stoffen. Door gebruik te maken van pooled HLM, afkomstig van verschillende individuen als donoren, kan men de variatie in metabolisatie tussen mensen opvangen. Als nadeel geldt dat microsomen echter niet geschikt zijn voor kwantitatieve metingen, doordat HLM een aanrijking van CYP en UGT enzymen bevatten. Hierdoor zal er geen competitie optreden tussen andere enzymen, wat zich wel in vivo voordoet. Hierdoor zal er een hogere metabolisatie plaatsvinden in de microsomen dan in de in vivo situatie [20,22]. Het voordeel van proefdierexperimenten is dat de humane in vivo situatie meer wordt nagebootst dan in vitro, waarbij er een onvolledige representatie geldt van de in vivo situatie. Proefdierexperimenten worden uitgevoerd als vervanger van of model voor de mens. Hierbij zijn er enkele bezwaren tegen in vivo studies, namelijk ethische, economische als wetenschappelijke bezwaren. Als ethisch bezwaar geldt dat het proefdier niet zomaar mag misbruikt worden voor de mens, daarvoor heeft men goedkeuring nodig van de Ethische Commissie Dierproeven (ECD). In vivo studies hebben alsook een hoge kostprijs, met name de aankoop, verzorging en infrastructuur van proefdieren. En de vraag of het gevonden effect bij een proefdier hetzelfde is als bij de mens, ligt aan de basis van het wetenschappelijk bezwaar. Dit laatste bezwaar kan weerlegd worden door gebruik te maken van een muismodel met getransplanteerde humane levercellen [20,43].

34

Materiaal en methoden

2 Materiaal en methoden 2.1

Producten en reagentia

Referentiestandaard voor methyldienolone (17β-hydroxy-17α-methylestra-4,9-dien-3-on) werd aangekocht bij het National Measurement Institute (Pymble, Australië). Referentiestandaard voor methyltrienolone (17β-hydroxy-17α-methylestra-4,9,11-trien-3on) werd aangekocht bij Perkin Elmer (Waltham, Verenigde Staten). Als inwendige standaard (IS) wordt 17α-methyltestosteron gebruikt die bekomen werd via Organon (Oss, Nederland), alsook methandiënon (17β-hydroxy-17α-methylandrosta-1,4-dien-3-on) die verkregen werd bij het National Measurement Institute (Pymble, Australië). Het enzym βglucuronidase afkomstig van Escherichia coli K12 is van de leverancier Roche Diagnostics (Mannheim, Duitsland). N-methyl-N-trimethylsilyltrifluoroacetamide (MSTFA) komt van Karl Bucher (Waldstetten, Duitsland) en ethaanthiol (C2H6S) is afkomstig van Acros (Geel, België). Diethylether (C4H10O), methanol (CH3OH), aceton (C3H6O) en natriumwaterstofcarbonaat (NaHCO3) komen van Fisher Scientific (Loughborough, UK). NADPH regeneratie systeem oplossing A en B, HLM pool en fosfaatbuffer pH 7,4 werden aangekocht bij BD Biosciences (Franklin Lakes, Verenigde Staten). Phosphate buffered saline (PBS) komt van GIBCO invitrogen (Gent, België). Natriumsulfaat (Na2SO4), kaliumcarbonaat

(K2CO3),

dinatriumwaterstoffosfaat

dihydraat

(Na2HPO4.2H2O),

natriumdiwaterstoffosfaat dihydraat (NaH2PO4.H2O), ammoniumiodide (NH4I) en azijnzuur (HAc) zijn afkomstig van Merck (Darmstadt, Duitsland). Ethanol (C2H5OH) en ammoniumacetaat (NH4Ac) werden aangekocht bij Biosolve (Valkenswaard, Nederland). Methanol HPLC grade (CH3OH) en water HPLC grade (H2O) komen van J.T. Baker (Center Valley, Verenigde Staten). Supplement methyldienolone, M-DIEN is van Underground Laboratories (onbekend). De gassen die gebruikt worden zijn helium α-gas en zuurstofvrije stikstofgas (OFN) van de leverancier Air Liquide (Aalter, België). 2.2

Instrumentatie

2.2.1

Indamptoestellen

Reacti-Therm IIITM Heating Module (Triple block) van Pierce (Rockford, Verenigde Staten) bevat drie verwarmde aluminium blokken bij een temperatuur van 40°C en aan de 35


hand van zuurstofvrije stikstofgas (N2) worden de stalen ingedampt. Bij de TurboVap LV van Caliper Life Sciences (Hopkinton, Verenigde Staten) worden de stalen ingedampt met OFN in een warmwaterbad van 60°C. De Concentrator 5301 van Eppendorf (Rotselaar, België) is een uitdampcentrifuge, daar de Eppendorftubes stalen worden ingedampt onder vacuüm bij een temperatuur van 60°C. 2.2.2

Incubatietoestellen

Met behulp van de Thermomixer comfort van Eppendorf (Rotselaar, België) worden de Eppendorftubes verwarmd bij een temperatuur van 37°C. In de Heraeus Oven van Thermo Scientific (Aalst, België) worden de stalen geïncubeerd bij een temperatuur van 80°C ± 5°C. In de Heraeus Oven van Thermo Electron Corporation (Waltham, Verenigde Staten) worden de stalen geïncubeerd bij een temperatuur van 56°C ± 5°C. 2.2.3

Centrifuges

De Universal 32R van Hettich (Tuttlingen, Duitsland) is een microcentrifuge, daar de Eppendorftubes gecentrifugeerd worden bij 12800 rpm op een temperatuur van 4°C gedurende vijf minuten. Bij de Centrifuge 5810 van Eppendorf (Rotselaar, België) worden de stalen gecentrifugeerd bij 4000 rpm gedurende vijf minuten. 2.2.4

Overige

Als roltoestel wordt de RM5 gebruikt van CAT (Paso Robles, Verenigde Staten). De Vortex mixer SI-100 is afkomstig van MRC-Laboratory Equipment (Holon, Israël). De bovenweger PB1502-L komt van Mettler-Toledo (Zaventem, België). 2.2.5

GC-MS

De gebruikte gaschromatograaf 6890 GC is van Agilent Technologies (Palo Alto, Verenigde Staten) met een 15m J&W HP Ultra 1 capillaire kolom bestaande uit dimethylsilicone van Agilent. De capillaire kolom heeft een interne diameter van 250µm en een filmdikte van 0,25µm. Als draaggas wordt helium gebruikt met een constante flow van 1mL/min. De GC is gekoppeld aan de MS en is uitgerust met een autosampler, waarbij het injectievolume 1µL bedraagt via splitless methode. Als oventemperatuur wordt als initiële temperatuur 120°C ingesteld gedurende 0,10 min, waarna de temperatuur toeneemt 36


met 70°C/min tot 210°C en wordt aangehouden gedurende 0,10 min. Er wordt opgewarmd met 7°C/min tot 260°C om vervolgens tot een finale temperatuur van 320°C te komen met een snelheid van 30°C/min, waarbij deze temperatuur 0,50 min wordt aangehouden. Hierna daalt de temperatuur tot 50°C. De totale run duurt telkens 11,13 min. Bij de analyse wordt een full scan massaspectra opgenomen. 2.2.6

LC-MS2

FinniganTM TSQ Quantum Discovery MAXTM van Thermo Electron Corporation (Waltham, Verenigde Staten) wordt als vloeistofchromatograaf gebruikt. Deze maakt gebruik van een C-18 kolom van SunFireTM met als interne diameter 3,5µm, lengte 50mm en breedte 2,1µm. Als mobiele fase wordt HAc 0,1% 1mM NH4Ac in H2O (A) en HAc 0,1% 1mM NH4Ac in CH3OH (B) gebruikt met een constante flow van 250µL/min. Het gradiëntprogramma wordt als volgt ingesteld (Tabel 3). Tabel 3: Gradiëntprogramma.

0,0 min 1,5 min 8,0 min 15,0 min 29,5 min 30,5 min 31,0 min 35,0 min

Solvent A 70% 70% 45% 45% 5% 5% 70% 70%

Solvent B 30% 30% 55% 55% 95% 95% 30% 30%

De totale run duurt telkens 35,0 min. De LC is gekoppeld aan de triple quadrupool MS en is eveneens uitgerust met een autosampler, waarbij het injectievolume 25µL bedraagt. Het collisiegas in de collisie cel is stikstofgas. Als scan modus wordt geopteerd voor precursor ion scan. 2.3

Referentiestandaarden

Er wordt 10µL van de zuivere referentiestandaarden met een concentratie van 100µg/mL, die opgelost zijn in methanol, overgebracht in een kleine sovirelbuis. Hieraan wordt er 100µL methandiënon toegevoegd als IS met een concentratie van 1µg/mL, die fungeert als 37


controle voor de extractie. Deze worden drooggedampt onder een stikstofstroom en vervolgens worden de stappen analyse met GC-MS (zie 2.7) of LC-MS2 (zie 2.8) gevolgd. 2.4

Supplement methyldienolone

Het labo beschikt over M-DIEN, het voedingssupplement dat volgens het label methyldienolone zou bevatten. Er worden vijf capsules ad random van het supplement MDIEN van Underground Laboratories gekozen om hieruit 1g van het poeder uit de capsules af te wegen in een proefbuis en te homogeniseren. Hierna wordt er 5mL methanol toegevoegd om vervolgens de proefbuis 1 uur te laten rollen en te centrifugeren. Er wordt 100µL van de methanolfase in een proefbuis overgebracht en hieraan 100µL methandiënon (IS) toegevoegd met een concentratie van 1µg/mL. Dit staal werd geanalyseerd en alsook na een extractiestap (zie 2.5) om de inhoud van het supplement na te gaan. 2.5

Staalvoorbereiding humane lever microsomen

Een batch van HLM, blanco, negatieve en positieve controle (microsomen aangerijkt met een gekend bestudeerd steroïde) wordt uitgevoerd. Er wordt 50µL van het anabool steroïde met een concentratie van 100µg/mL in de HLM en blanco controle Eppendorftube overgebracht, waarna de stalen worden drooggedampt in de uitdampcentrifuge. Aan de reeks wordt er 226µL 0,5M fosfaatbuffer pH 7,4 toegevoegd. Vervolgens wordt er 2,5µL ethanol toegevoegd aan de HLM, blanco en negatieve controle en 2,5µL methandiënon (4mg/mL) toegevoegd aan de positieve controle. 12,5µL oplossing A en 2,5µL oplossing B van het NADPH regenererend systeem wordt toegevoegd aan de batch. Vervolgens worden de stalen geïncubeerd bij 37°C gedurende 5 minuten. De microsomen worden ondertussen op ijs ontdooid, waarna deze gevortexd worden om 6,5µL microsomen over te brengen aan de HLM, negatieve en positieve controle. Aan de blanco controle wordt er 6,5µL fosfaatbuffer pH 7,4 toegevoegd. Vervolgens worden de stalen goed gevortexd en geïncubeerd bij 37°C gedurende 4u. Als stopreactie wordt er aan de stalen 250µL ijskoude methanol toegevoegd, waarna deze gevortexd en in een ijsbad geplaatst worden gedurende 15 minuten om vervolgens te centrifugeren. Na centrifugatie wordt 400µL van het supernatans afgenomen en in een proefbuis overgebracht. Aan alle stalen wordt er 100µL methandiënon (IS) toegevoegd met een concentratie van 1µg/mL, met uitzondering van de positieve controle waar er 50µL 17α-methyltestosteron 2µg/mL als IS wordt toegevoegd 38


die fungeren als controle voor de extractie. De stalen worden vervolgens drooggedampt onder een stikstofstroom. Indien de reeks niet onmiddellijk kan verder gezet worden, worden de stalen na deze stap bewaard in de koelkast. Nadat de stalen zijn ingedampt wordt er 1mL carbonaatbuffer pH 9,5 toegevoegd. Vloeistof-vloeistof extractie (LLE) wordt uitgevoerd met 5mL diethylether door de proefbuizen 20 minuten te laten rollen en vervolgens te centrifugeren. Na centrifugatie wordt de organische (bovenste) fractie afgenomen en in een kleine proefbuis overgebracht. Deze organische fractie wordt gedroogd door toevoegen van een schep Na2SO4 en vervolgens drooggedampt onder een stikstofstroom. Hierna worden de stappen analyse met GC-MS of LC-MS2 gevolgd. Indien de reeks niet onmiddellijk geanalyseerd kan worden op GC-MS of LC-MS2, worden de stalen na deze stap bewaard in de koelkast. 2.6

Staalvoorbereiding excretie-urines

De urinestalen zijn afkomstig van excretie studies met muizen, waarbij het gebruik van proefdieren voor onderzoek in het DoCoLab werd goedgekeurd door de ECD van de Universiteit Gent (ECD 06/09). 24u tot 48u voor de toediening van de anabole steroïden wordt de urine gecollecteerd, daar dit fungeert als blanco urinestaal. Na toediening aan de muizen via orale gavatie wordt 24u tot 48u muizenurine verzameld, zodat alle eventueel aanwezige metabolieten uitgescheiden zijn in de urine. De muizen worden hiervoor in metabole kooien geplaats om een continue opvang van hun urine te garanderen. Er wordt slechts om de 24u urine gecollecteerd, doordat slechts een beperkte hoeveelheid urine wordt geproduceerd door de muizen. Om de dosis te bepalen van methyldienolone en methyltrienolone werd op internetfora van bodybuilders een dagelijkse hoeveelheid voor de mens nagegaan, waarbij 3mg/dag voor methyldienolone en 0,5mg/dag voor methyltrienolone werd teruggevonden. Er wordt hierbij rekening gehouden met het verschil in gewicht tussen de mens met een gemiddeld gewicht van 70kg en een muis van 20g. Door de snelle metabolisatie bij muizen wordt de dosis met een factor tien vermenigvuldigd, om een voldoende hoge dosis te kennen. Methyldienolone !!"/!"# !""""!/!"!

Methyltrienolone -3

× 10 = 8,57 × 10 mg/dag 8,57µg/dag

!,!!"/!"# !""""!/!"!

× 10 = 1,43 × 10-3mg/dag 1,43µg/dag 39


Aan de hand van trial and error werd de dosis telkens verhoogd gaande van 10µg/muis voor methyldienolone en 1,6µg/muis voor methyltrienolone tot een detecteerbaar niveau van het steroïde en de gevormde metabolieten. De finale dosisbepaling voor methyldienolone bedraagt 200µg/muis en voor methyltrienolone 160µg/muis, waarbij telkens 200µL van de toedieningsoplossing werd toegediend. De toedieningsoplossing voor methyldienolone en methyltrienolone wordt bekomen door respectievelijke 500µL methyldienolone (1mg/mL) en 4mL methyltrienolone (100µg/mL) droog te dampen, waarna 100µL ethanol (20%) wordt toegevoegd en aangelegd tot 500µL met 400µL PBS (80%) waar tussendoor wordt gevortexd. De toedieningsoplossingen worden bewaard in de koelkast. Eens alle excretie-urines bekomen zijn, is een extractie stap vereist om de eventueel aanwezige AAS te detecteren. Hiervoor wordt 0,5mL van de urinestalen in een proefbuis overgebracht. Bij elke reeks wordt telkens ook een systeem blank en toedieningsoplossing meegenomen ter controle. Aan de systeem blank wordt er 0,5mL gedemineraliseerd water toegevoegd in een proefbuis. Alsook wordt 200µL van de toedieningsoplossing overgebracht in een proefbuis ter controle van de aanwezigheid van het steroïde. Aan alle stalen wordt er 100µL methandiënon (IS) toegevoegd met een concentratie van 1µg/mL, die fungeert als controle voor de extractie. Hierna wordt er 1mL fosfaatbuffer pH 7,0 toegevoegd. Enzymatische hydrolyse van glucuronide-groepen wordt uitgevoerd met 50µL β-glucuronidase (E. coli) gedurende 1u30 bij 56°C ± 5°C. Na de stalen te laten afkoelen tot kamertemperatuur wordt er 1mL carbonaatbuffer pH 9,5 toegevoegd. LLE wordt uitgevoerd met 5mL diethylether door de proefbuizen 20 minuten te laten rollen en vervolgens te centrifugeren. Na centrifugatie wordt de organische (bovenste) fractie afgenomen en in een kleine proefbuis overgebracht. Deze organische fractie wordt gedroogd door toevoegen van een schep Na2SO4 en vervolgens drooggedampt onder een stikstofstroom. Hierna worden de stappen analyse met GC-MS of LC-MS2 gevolgd (zie 2.7 of 2.8). Indien de reeks niet onmiddellijk geanalyseerd kan worden op GC-MS of LC-MS2, worden de stalen na deze stap bewaard in de koelkast.

40


2.7

Analyse met GC-MS

Voor de analyse met GC-MS worden de stalen gederivatiseerd met 100µL TMSderivatiseringsoplossing (REA19). De TMS-derivatiseringsoplossing bevat MSTFA, ammoniumiodide (NH4I) en ethaanthiol. De stalen worden goed gevortexd en geïncubeerd bij 80°C ± 5°C gedurende 1u. Na incubatie wordt 50µL van de gederivatiseerde oplossing overgebracht in een glazen vial met insert en afgesloten met een cap. Bij elke batch wordt er telkens ook een spoel meegenomen voor en na de reeks, bestaande uit 150µL TMSderivatiseringsoplossing. Na analyse worden de vials bewaard in de koelkast, indien heranalyse nodig is. 2.8

Analyse met LC-MS2

Voor de analyse met LC-MS2 worden de stalen opgelost in 100µL solvent, methanol/water (50:50) en goed gevortexd. De oplossing wordt volledig overgebracht in een plastieken vial en afgesloten met een cap, waarna tegen de vial wordt getikt om de lucht onderaan te verwijderen. Na analyse worden de vials bewaard in de koelkast, indien heranalyse nodig is.

41

Resultaten en discussie

3 Resultaten en discussie 3.1

Analyse van referentiestandaarden

3.1.1

Referentiestandaard van methyldienolone op GC-MS

Door analyse van de referentiestandaard wordt het massaspectrum en de retentietijd (RT) van methyldienolone bepaald. Figuur 15 geeft het chromatogram weer van de referentiestandaard van methyldienolone met IS, waaruit de RT afgeleid kan worden. In Figuur 16 en 17 worden de massaspectra weergegeven. De RT van de verschillende pieksignalen in de referentiestandaard methyldienolone met bijhorende ionen worden weergegeven in Tabel 4. De full scan spectra worden beoordeeld voor kwalitatieve analyse aan de hand van het moleculair ion (M) en fragmentionen, waarbij gebruik gemaakt wordt van extracted ion chromatogram (EIC). Fragmentionen ontstaan door afsplitsing van een methylgroep (M15) en door het verlies van TMS-OH ((CH3)3SiOH) (M-90), hierbij zijn alsook fragmentionen met M-15-90 waarneembaar in de massaspectra. Deze fragmenten worden veelal waargenomen bij de detectie van steroïden. Het ion m/z 73 komt overeen met TMS afkomstig van de derivatisatie, waardoor deze niet specifiek is voor een bepaalde component. Door de aanwezigheid van een 17-methylgroep in TMS gederivatiseerde 17hydroxysteroïden ontstaat er een fragmention met m/z 143. Methandiënon (m/z 444), die gebruikt wordt als IS, heeft bovendien een 1,4-dien-3-on structuur waardoor het fragmention met m/z 206 duidelijk waarneembaar is in het massaspectrum [29]. Dit is van toepassing op alle massaspectra bekomen via GC-MS. MD

IS

MD”

Figuur 15: Chromatogram referentiestandaard methyldienolone (MD) met IS en derivatisatieprobleem (MD”, zie verder) op GC-MS gebruik gemaakt van EIC.

42

Resultaten en discussie 73

206 444

339 429 354

Figuur 16: Full scan massaspectrum van methandiënon (IS). 430

73

325 143

340

415

Figuur 17: Full scan massaspectrum van methyldienolone (MD). 73

323 338 428

143

413

Figuur 18: Full scan massaspectrum van het derivatisatieprobleem van methyldienolone (MD”).

Op het chromatogram van de referentiestandaard methyldienolone (Figuur 15) is er na de piek van methyldienolone (MD) een signaal (MD”) aanwezig m/z 428 en met als fragmentionen m/z 413, 338 en 323 (Figuur 18). Door het geconjugeerd systeem van methyldienolone (m/z 430) op GC-MS wordt door derivatisatie alsook een piek verkregen met m/z 428. Verder in de bachelorproef wordt het derivatisatieprobleem ook bij de metaboliet van de component vastgesteld. Dit derivatisatieprobleem, waar een vermindering van m/z 2 optreedt bij het moleculair ion en de fragmentionen, geldt bij alle bekomen resultaten van methyldienolone op GC-MS en werd reeds eerder beschreven [44]. 43


De m/z 428 kan ook overeenkomen met het moleculair ion van methyltrienolone. Er werd geprobeerd om de referentiestandaard van methyltrienolone te analyseren op GC-MS (m/z 428) na derivatisatie, waarbij detectie niet mogelijk was door de aanwezigheid van een sterk geconjugeerd systeem. Uit verdere analyse met LC-MS2 is gebleken dat de referentiestandaard voor methyldienolone zuiver is, waardoor besloten kan worden dat het te wijten is aan de derivatisatie. Tabel 4: Overzicht RT en ionen uit het chromatogram en full scan spectra referentiestandaard methyldienolone.

Steroïde Methandiënon (IS) Methyldienolone (MD) 3.1.2

Retentietijd (min) 8,074 8,184

Moleculair ion (m/z) 444 430

Fragmentionen (m/z) 429- 354- 339 415- 340- 325

Referentiestandaarden van methyldienolone en methyltrienolone op LC-MS2

Naast methyldienolone wordt alsook methyltrienolone gedetecteerd op LC-MS2. De analyse verloopt in positieve modus, waarbij het moleculair ion geprotoneerd wordt [M+H]+. Hierdoor zullen methyldienolone (m/z 286) en methyltrienolone (m/z 284) gedetecteerd worden op LC-MS2 in positieve mode met een m/z van respectievelijk 287 en 285. Zoals eerder vermeld wordt de analyse beoordeeld op drie niveaus van scan events, waarbij de ionen m/z 77, 91 en 105 worden geselecteerd ter detectie van steroïden. Het pieksignaal moet in het chromatogram op elk niveau van m/z aanwezig zijn op eenzelfde RT om als steroïde of metaboliet beschouwd te worden en niet in het chromatogram van de blanco controle voorkomen. Dit is van toepassing op alle analyses via LC-MS2. 3.1.2.1

Door

Referentiestandaard van methyldienolone op LC-MS2

analyse van de referentiestandaard wordt het massaspectrum en de RT van

methyldienolone bepaald, waarbij de relatieve retentietijd (RRT) meer van belang is op LC-MS2 doordat de RT verschillend is bij iedere analyse. De RRT zal verder in de bachelorproef worden bestudeerd (zie 3.6). Figuur 19 geeft het chromatogram weer van de referentiestandaard van methyldienolone met IS, waaruit de RT afgeleid kan worden. In Figuur 20 en 21 worden de massaspectra weergegeven. De RT van de verschillende pieksignalen in de referentiestandaard methyldienolone met bijhorend ion worden weergegeven in Tabel 5.

44

Resultaten en discussie D:\RESEARCH\...\refmethyldienolone MD

RT: 0.00 - 33.01 D:\RESEARCH\...\refmethanedienone

NL: 3.62E7 TIC F: + c ESI Full pr 77.000 NL: 1.50E7 [250.000-400.000] TIC MS F: + c ESI Full pr 77.000 refmethyldienolone [250.000-400.000] 31.90 MS NL: 7.61E7 refmethanedienone

IS

12.10 11.62

100 50

Abundance (%)

refmethyldienolone refmethanedienone

11.42

100 RT: 0.00 - 33.02

Abundance RelativeRelative Abundance

3/31/2014 5:33:03 PM 3/20/2014 2:14:09 PM

1.58

50 0

3.36

26.73 26.36

12.35

9.97 10.48

5.10 6.08

15.12 15.64 17.63

20.38 21.77

26.77 28.66

24.10

11.41 12.93

100

5.32 5.47 7.89

2.20 3.37

0

13.60

9.60

27.20

16.12 16.38 19.47 21.13 22.11 24.37

28.86

TIC F: + c ESI Full pr 91.000 NL: 1.63E7 [250.000-400.000] TIC MS F: + c ESI Full pr 91.000 refmethyldienolone [250.000-400.000] 31.60 MS NL: 3.37E7 refmethanedienone 31.92 TIC F: + c ESI Full pr 105.000 NL: 2.70E6 [250.000-400.000]

31.41

12.09

100 50

1.75

50 0 100

1.18 1.99

0 100 50

3.38 3.36

12.31 13.71 15.08 17.49 20.57 22.44 24.35 26.06 28.86 7.91 9.93 10.53 11.40 12.92 15.07 16.08 21.22 22.91 26.00 27.89 28.91 18.94 9.52 11.13

5.27

5.54 5.67

12.03

1.90 3.37

50 0

0 0

2 1.62

3.35 4

11.97 12.96

8.09 9.95 10.47

5.52

5.22 65.46

8 6.91

15.08

17.48 18.29

16.15 14 18 16.39 15.97 16 Time (min)

9.4810 9.84 12

21.26 23.02 24.50

20 22 21.50 22.36

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 refmethyldienolone #1323 RT: 11.42 AV: 1 SB: 110 9.72-11.07 , 11.83-13.32 NL: 2.01E7 Time (min) F: + c ESI Full pr 77.000 [250.000-400.000] 287.45 100 refmethanedienone #1395 RT: 12.07 AV: 1 SB: 330 12.31-16.23 , 7.13-11.77 NL: 6.08E6 D:\RESEARCH\...\refmethyldienolone 3/31/2014 5:33:03 PM F: + c ESI Full pr 77.000 [250.000-400.000] 301.36 90 100 RT: 0.00 - 33.01 80 11.42 90 100

22

26.83

29.42 31.21

24 26 27.16 28 24.43 26.04 24

26

28

30 31.49 32 30.77 30

TIC MS F: + c ESI Full pr 105.000 refmethyldienolone [250.000-400.000] MS refmethanedienone

32

Abundance (%)

Relative Abundance Abundance RelativeRelative Abundance

Figuur 19: Chromatogram referentiestandaard methyldienolone (MD) met IS op LC-MS2.

70 80

refmethyldienolone

NL: 3.62E7 TIC F: + c ESI Full pr 77.000 [250.000-400.000] MS refmethyldienolone

11.62

50 60 70

50 60 0 100 40 50

3.36

1.58

11.41

30 40 50 20 30

26.36

12.35

9.97 10.48

5.10 6.08

15.12 15.64 17.63

20.38 21.77

26.77 28.66

24.10

31.90 NL: 7.61E7

302.35

TIC F: + c ESI Full pr 91.000 [250.000-400.000] MS refmethyldienolone

288.67

291.18 303.47 12.31 13.71 15.08 17.49 20.57 22.44 24.35 26.06 28.86 31.60 1.75 3.38 5.27 7.91 9.93 10.53 10 292.69 0 NL: 3.37E7 20 11.40 100 295.84 269.31 261.46 273.92283.36 305.95 319.40 334.66 340.00 347.55 359.01 304.44 TIC F: + c ESI Full pr 0 10 105.000 250 260 270 280 290 300 310 320 330 340 350 360 370 380 390 400 307.51 285.49 [250.000-400.000] 333.85 253.21 263.53 279.39 299.24 322.21 344.54 367.99 382.35 389.26 m/z 50 MS 0 250 260 270 280 290 300 310 320 330 340 350 360 370 380 refmethyldienolone 390 400 11.97 15.08 17.48 m/z 5.52 18.29 21.26 23.02 24.50 26.83 29.42 31.21 1.90 3.37 8.09 9.95 10.47 0 0

2

4

6

8

10

12

14

16 18 Time (min)

20

22

24

26

28

30

32

Figuur 20: Massaspectrum van methandiënon (IS). refmethyldienolone #1323 RT: 11.42 AV: 1 SB: 110 9.72-11.07 , 11.83-13.32 NL: 2.01E7 F: + c ESI Full pr 77.000 [250.000-400.000] 287.45 100 90

Relative Abundance Abundance (%)

80 70 60 50 40 30

288.67

20

291.18

10 0 250

292.69 295.84 305.95

261.46 269.31 273.92 260

270

280

290

300

310

319.40

334.66 340.00 347.55

320

330

340

359.01

350

360

370

380

390

400

m/z

Figuur 21: Massaspectrum van methyldienolone (MD). Tabel 5: Overzicht RT en ionen uit het chromatogram en massaspectra referentiestandaard methyldienolone.

Steroïde Methandiënon (IS) Methyldienolone (MD) 3.1.2.2

Door



Referentiestandaard van methyltrienolone op LC-MS2

analyse van de referentiestandaard wordt het massaspectrum en de RT van

methyltrienolone

bepaald.

Figuur

22

geeft

het

chromatogram

weer

van

de

referentiestandaard van methyltrienolone met IS, waaruit de RT afgeleid kan worden. In Figuur 23 wordt het massaspectrum weergegeven van methyltrienolone, daar in Figuur 20 reeds het massaspectrum van de IS werd geïllustreerd. De RT van de verschillende 45


pieksignalen in de referentiestandaard methyltrienolone met bijhorend ion worden weergegeven in Tabel 6. D:\RESEARCH\...\refmethyltrienolone

D:\RESEARCH\...\refmethyltrienolone 11.29

RT:100 0.00 - 33.01

Abundance (%)

NL: 2.26E7

IS

TIC + c ESI Full pr NL: F: 2.26E7 77.000 TIC F: + c ESI Full pr [250.000-400.000] 77.000 MS [250.000-400.000] refmethyltrienolone MS

26.40

26.40

50

Relative Abundance Relative Abundance

refmethyltrienolone

11.68

50

100 0

refmethyltrienolone

3/31/2014 6:08:55 PM

11.29 11.68

100

0

3/31/2014 6:08:55 PM

MT

RT: 0.00 - 33.01

0.70

0.70

3.37 3.55

6.28 7.21 8.85

3.37 3.55

6.28 7.21 8.85

12.43

12.43 11.28

12.95 15.29 17.52

20.61 21.96

24.40

12.95 15.29 17.52

20.61 21.96

24.40

26.66

26.66

27.64 30.83

refmethyltrienolone

27.64 30.83

NL: 2.51E7 TIC + c ESI Full pr NL: F: 2.51E7 91.000 TIC F: + c ESI Full pr [250.000-400.000] 91.000 MS [250.000-400.000] refmethyltrienolone MS

11.28

100

11.67 50

11.67

50 0 100 0 100

0.59 2.64

0.59 2.64

3.36 3.49 3.36 3.49

12.48

6.32 6.50 8.76

6.32 6.50 8.76

11.30

12.48

14.01 15.33 14.01 15.33

19.36 20.86 21.87

25.40

27.61 29.71 30.85

refmethyltrienolone

19.36 20.86 21.87

25.40

27.61 29.71 30.85

NL: 1.36E7

11.30

50 11.74

50 0

0.94 2.40

3.36 4.55

3.36 4.55 0.94 2.40 2 4 0 0 0 2 4

6.39 7.20 8.83

11.7412.54

6.39 7.20 8.83 6 8 10

12

6

12

8

10

15.37

25.34 26.87 28.35

22.98

18.10

19.97

12.54 15.37 18.10 14 16 18 Time 14 16 (min)18

19.97 20

22

20

22

22.98

24

25.34 26.87 28.35 26 28

24

26

28

31.47 30

31.47 32

30

32

TIC + c ESI Full pr NL: F: 1.36E7 105.000 TIC F: + c ESI Full pr [250.000-400.000] 105.000 MS [250.000-400.000] refmethyltrienolone MS refmethyltrienolone

refmethyltrienolone #1304 RT: 11.28 AV: 1 SB: 143 9.49-10.98 , 11.95-14.15 NL: 1.42E7 Figuur 22: Chromatogram referentiestandaard methyltrienolone (MT) met IS op LC-MS2. F: + c ESI Full pr 91.000 [250.000-400.000]

Time (min)

refmethyltrienolone #1304 RT: 11.28 AV: 1 SB: 143 9.49-10.98 , 11.95-14.15 NL: 1.42E7 F: + c ESI Full pr 91.000 [250.000-400.000] 285.41 100 285.41 100 90 90 80

Relative Abundance Relative Abundance Abundance (%)

80 70 70 60 60 50 50 40 40 30 286.60

30 20

287.57 286.60 288.69 287.57 290.98 288.69

20 10 10 256.42 0 250 256.42 260 0 250 260

267.19 275.06

267.19 270275.06 280 270

280

300.04 290.98 300.04 290 300

311.07 318.19

330.47

311.07 318.19 310 320

330.47 330

290

310

300

320 m/z 330 m/z

353.85

379.45

340

353.85 360 350

370

340

350

370

360

379.45 380 380

390

400

390

400

Figuur 23: Massaspectrum van methyltrienolone (MT). Tabel 6: Overzicht RT en ionen uit het chromatogram en massaspectra referentiestandaard methyltrienolone.

Steroïde Methandiënon (IS) Methyltrienolone (MT) 3.2



Analyse van het supplement methyldienolone

Voorafgaand aan het protocol beschreven in 2.4 werden verscheidene experimenten uitgevoerd naargelang het verkregen resultaat om de inhoud van het M-DIEN supplement na te gaan. Hierbij werd eerst en vooral een bepaalde hoeveelheid methanolfase geanalyseerd, waarna de hoeveelheid van de toegevoegde methanolfase verhoogd werd. Bijkomend werd een extractie hierop uitgevoerd en alsook een dubbele extractie om het staal extra op te zuiveren. Bij dit laatste werden de ionen van de hoofdcomponent niet meer waargenomen in het chromatogram. Tot slot werd een standard operating procedure (SOP) gevolgd die specifiek geldt voor voedingssupplementen (ANAL-90.G: Kwalitatieve bepaling van anabolica in voedingssupplementen met behulp van GC-MS). De ionen van de hoofdcomponent werden hierbij alsook niet waargenomen in het chromatogram, waarbij 46


het best verkregen resultaat werd bekomen door 100µL van de methanolfase te extraheren. Door analyse van het supplement op GC-MS en LC-MS2 wordt de aanwezigheid van methyldienolone nagegaan.

MD

Figuur 24: Chromatogram supplement methyldienolone (MD) met onbekende component (pijl, zie verder) op GC-MS.

MD

Figuur 25: Chromatogram supplement methyldienolone (MD) op GC-MS gebruik gemaakt van EIC.

Op het chromatogram van het supplement methyldienolone (Figuur 24) zijn veel andere pieken aanwezig dan de eigenlijke component. Hierbij hebben verschillende studies reeds aangetoond dat wat vermeld staat op het label van het supplement veelal niet overeenstemt met de inhoud ervan, waardoor vele andere stoffen en vulmiddelen worden waargenomen in het chromatogram. Het supplement kan hierdoor verboden middelen bevatten, die niet op het label vermeld staan [45]. De IS werd bij herhaaldelijke experimenten in het chromatogram niet waargenomen, daar deze wordt verdrongen door de aanwezigheid van de vele andere stoffen. Door de hoge achtergrond van de capsules wordt methyldienolone (MD), als hoofdcomponent van het supplement, op een RT van 8,205 min moeilijk gedetecteerd in het chromatogram en bevat een uiterst lage abundantie in vergelijking met de andere pieksignalen (Figuur 25). De RT van methyldienolone is door de hoge achtergrond alsook opgeschoven. In Figuur 17 werd het massaspectrum van 47


methyldienolone reeds weergegeven, waarbij er alsook een lagere abundantie geldt in het massaspectrum van het supplement methyldienolone. capsulmethyldie100extract

3/13/2014 12:24:31 PM

capsulmethyldie100extract

RT: 0.00 - 33.01

50


NL: 1.51E8

15.70

100

TIC F: + c ESI Full pr 77.000 [250.000-400.000] MS capsulmethyldie100extr act

MD 7.55 3.14 3.37 4.62 7.24

0

16.40 17.39

12.22 12.79

9.84

27.64 28.75 30.05

24.94

21.49 22.37

NL: 1.69E8

15.74

100


50 9.36 9.83 12.22 12.79

7.28 7.54

3.36 4.53

0.14

0 100

16.47

24.96

19.07 21.48 22.36

28.77 28.98 32.20

26.49

NL: 4.44E7

15.68


24.95

50 0.08

0

7.27 7.56 3.48 4.26 6.16

0

2

4

6

12.21 11.90

9.35

8

10

16.10

14.28

12

14

19.60 21.52

16 18 Time (min)

20

28.76

22.82 24.64

22

26.51

24

26

29.10 30.84 28

30

32

capsulmethyldie100extract #1815 RT: 15.70 AV: 1 SB: 198 12.62-15.07 , 16.23-18.94 NL: 5.60E7

F: + c ESI Full pr 77.000 [250.000-400.000] capsulmethyldie100extract 3/13/2014 12:24:31 PM Figuur 26: Chromatogram supplement methyldienolone (MD) metcapsulmethyldie100extract onbekende component (pijl, zie verder) op LC-MS2. 317.43 100

RT: 0.00 - 33.01 90 100 80

MD

NL: 1.75E6

24.89

13.18

Base Peak m/z= 286.50-287.50 F: + c ESI Full pr 77.000 [250.000-400.000] MS capsulmethyldie100extract

28.78

Relative Abundance Relative(%) Abundance Abundance

24.73 70 50

8.36

60

1.32

0 50 100

6.05 6.36

3.48

15.62 15.94

15.55

12.22

8.77

20.24

24.40 22.24 23.30

27.61

28.94

30.13 NL: 3.61E6

24.98

13.18

Base Peak m/z= 286.50-287.50 F: + c ESI Full pr 91.000 [250.000-400.000] MS capsulmethyldie100extract

28.80

40

318.58

50 30

8.32 3.36 3.83 4.71

20 0 100 10 0 50250

260

0 0

270

280 8.34

3.61 5.72 5.90 7.87

0.08 2

4

6

8

13.54

13.14 299.35

282.38 284.58

265.47 271.61

253.31

12.24

9.18 7.05 281.31

290

300

10

313.08 310

15.87

12.96

9.66

15.74 16.11

12

14

24.62

24.28 21.17 23.19 25.30 319.61 334.37 320.57 25.00 321.49 335.47 324.32 337.33 24.87 345.51 320

16.07

330 24.04 340 m/z 22.87 21.08

16 18 Time (min)

20

22

24

350

29.08 30.62 Base Peak m/z= 286.50-287.50 F: + c ESI Full pr 105.000 358.48 367.38 377.79 392.30 28.79 [250.000-400.000] MS 360 370 capsulmethyldie100extract 380 390 400 28.89 29.23

25.24 26

NL: 2.18E6

28.74

28

30

32.09 32

F: + c ESI Full pr 91.000 [250.000-400.000] Figuur 27: Chromatogram supplement methyldienolone (MD) op LC-MS2 met selectie van [M+H]+ met m/z 287. 287.32 capsulmethyldie100extract #1523 RT: 13.18 AV: 1 SB: 137 10.68-12.82 , 13.42-14.83 NL: 3.50E6 100

Op het chromatogram na LC-MS2 analyse van het supplement methyldienolone (Figuur 90 80

26) is methyldienolone (MD), als hoofdcomponent van het supplement, op een RT van Relative Abundance

70 60

13,18 min moeilijk waarneembaar in het chromatogram (Figuur 26-27). De IS is hierbij 50 40 288.31

alsook niet zichtbaar in het chromatogram en wordt dus mogelijks verdrongen door de 30

289.35

20

291.50

aanwezigheid van de vele andere stoffen. Op het chromatogram in Figuur 27 is er alsook 10

256.65 261.93 269.25 0 250 260 270

292.85

279.49 280

327.08 331.58

300.40

290

300

310

320

330

345.93 350.85 357.88 363.41

340

350

360

370

377.70 384.94 380

393.79

390

400

een piek aanwezig op een RT van 8,36 min met als ion m/z 287, waarbij dit signaal niet m/z

dezelfde piekverhouding en massaspectrum vertoont als de referentie methyldienolone en dus niet wordt gezien als de hoofdcomponent. In Figuur 21 werd het massaspectrum van methyldienolone reeds weergegeven. In Figuur 26 wordt op het chromatogram van het supplement methyldienolone op LC-MS2 een intens pieksignaal waargenomen op een RT van 15,70 min die werd aangeduid met een pijl, waarbij het ion met m/z 317 wordt weergegeven in het massaspectrum (Figuur 28). Deze piek komt alsook in het chromatogram op GC-MS voor op een RT van 7,559 min die werd aangeduid met een pijl (Figuur 24), waarbij het moleculair ion met m/z 532 wordt 48


50 7.55 3.14 3.37 4.62 7.24

Relative Abundance

0

16.40 17.39

12.22 12.79

9.84

21.49 22.37

27.64 28.75 30.05

24.94

NL: 1.69E8

15.74

100


50

Resultaten en discussie 0.14 0

3.36 4.53

9.36 9.83 12.22 12.79

7.28 7.54

16.47

24.96

19.07 21.48 22.36

26.49

28.77 28.98 32.20 NL: 4.44E7

15.68

100


weergegeven in het full scan massaspectrum met als fragmentionen m/z 517, 442 en 427 24.95

50

(Figuur 29).

0.08

0 0

7.27 7.56 3.48 4.26 6.16 2

4

6

9.35

8

12.21 11.90

10

12

16.10

14.28 14

19.60 21.52

16 18 Time (min)

20

28.76

22.82 24.64

22

26.51

24

26

29.10 30.84 28

30

32

capsulmethyldie100extract #1815 RT: 15.70 AV: 1 SB: 198 12.62-15.07 , 16.23-18.94 NL: 5.60E7 F: + c ESI Full pr 77.000 [250.000-400.000] 317.43 100 90


80 70 60 50 40

318.58

30 20

281.31

10 265.47 271.61 253.31 0 250 260 270

282.38 284.58 280

290

299.35 300

313.08 310

319.61 334.37 320.57 321.49 335.47 324.32 337.33 345.51 320

330

340

350

358.48 360

367.38

377.79

370

380

392.30 390

400

m/z

Figuur 28: Massaspectrum van onbekende component. 73

143

427

442

517

532

Figuur 29: Full scan massaspectrum van onbekende component.

Deze component zou op basis van het bekomen resultaat op LC-MS2 als hoofdcomponent beschouwd worden in het supplement, aangezien deze in een veel hogere concentratie voorkomt dan methyldienolone en waarbij de aanwezigheid hiervan met een hoge abundantie wordt bevestigd op GC-MS. Bij de analyse van humane lever microsomen (zie 3.4) wordt de metabolisatie van methandiënon nagegaan als positieve controle, met onder andere een hydroxylatie als metabolisatiereactie. Hierbij worden dezelfde ionen waargenomen in het massaspectrum van de onbekende component als in het massaspectrum van de 6β-hydroxymethandiënon metaboliet, maar waarbij de component met een andere RT van de kolom komt en het massaspectrum verschillend is. Hierdoor wordt 6β-hydroxymethandiënon uitgesloten als onbekende component. Er werd niet verder ingegaan op de onbekende component, doordat deze niet relevant is in de bachelorproef. Op basis van de verkregen resultaten is de aanwezigheid van methyldienolone in het supplement niet voldoende om mee verder te werken voor de uitvoering van verdere 49


experimenten op microsomen of voor toediening aan de muizen. Dit doordat de vermelde component op het label, methyldienolone, nauwelijks detecteerbaar is in het supplement en vele andere stoffen aanwezig zijn. 3.3

Analyse van de incubatieperiode van humane lever microsomen

Methyldienolone

en

methyltrienolone

werden

gedurende

verschillende

perioden

geïncubeerd met de HLM om de metabolisatie na te gaan. Hierbij worden de extracties van de HLM geanalyseerd op GC-MS en LC-MS2 na verschillende incubatietijdstippen van 2u, 4u, 6u en 18u. Alsook werd de positieve, negatieve en blanco controle telkens meegenomen in de analyse op de verschillende tijdstippen. Zo kon geëvalueerd worden welke incubatietijd optimaal is voor dit onderzoek. 3.3.1

HLM incubatieperiode van methyldienolone op GC-MS

In Figuur 30 wordt de evolutie gedurende de verschillende incubatietijdstippen geïllustreerd aan de hand van de abundantie van de metaboliet van methyldienolone. De vorming van deze metaboliet via de HLM werd nagegaan op basis van het EIC van m/z 518, bij een RT van 8,95 min. Deze metaboliet moet afwezig zijn in de blanco en negatieve controle, waar aan deze voorwaarde wordt voldaan. In het overlaid chromatogram zijn de chromatogrammen van de verschillende incubatieperioden van de metaboliet gelijklopend, waardoor er weinig invloed van de incubatieduur geobserveerd wordt. Hieruit wordt afgeleid dat het enzym die instaat voor de metabolisatie al snel verzadigd wordt bij een korte incubatie, doordat geen verschil in abundantie wordt waargenomen op GC-MS.

6u 2u 4u 18u

Blanco en negatieve controle

Figuur 30: Overlaid chromatogram HLM incubatieperiode van de metaboliet van methyldienolone op GC-MS gebruik gemaakt van EIC.

50


3.3.2

HLM incubatieperiode van methyldienolone op LC-MS2

Figuur 31 geeft de chromatogrammen weer van de gevormde metabolieten van methyldienolone via HLM onderworpen aan verschillende incubatietijden, waarbij de incubatieperioden van 2u, 4u en 6u gelijklopend zijn in abundantie met telkens eenzelfde massaspectrum. Bij de incubatie gedurende 18u wordt een van de zes metabolieten minder gevormd.

Abundance (%)

2u incubatieperiode

Abundance (%)

4u incubatieperiode

Abundance (%)

6u incubatieperiode

Abundance (%)

18u incubatieperiode

Figuur 31: Chromatogrammen HLM incubatieperioden van methyldienolone met metabolieten (omkaderd) op LC-MS2.

51


3.3.3

HLM incubatieperiode van methyltrienolone op LC-MS2

Figuur 32 geeft de chromatogrammen weer van de metabolieten van methyltrienolone na verschillende incubatietijden met HLM, waarbij de incubatieperioden van 4u en 6u gelijklopend zijn in abundantie met telkens eenzelfde massaspectrum. Bij de korte incubatieduur van methyltrienolone gedurende 2u worden de metabolieten namelijk minder gevormd, doordat een lage abundantie wordt vastgesteld. Bij een incubatie gedurende 18u worden beide metabolieten in mindere mate geobserveerd.

Abundance (%)

2u incubatieperiode

Abundance (%)

4u incubatieperiode

Abundance (%)

6u incubatieperiode

Abundance (%)

18u incubatieperiode

Figuur 32: Chromatogrammen HLM incubatieperioden van methyltrienolone met metabolieten (omkaderd) op LC-MS2.

52


Op basis van de bekomen resultaten, en in combinatie met praktische overwegingen, wordt voor beide componenten geopteerd voor een optimale HLM incubatietijd van 4u. Alle resultaten hierna besproken zijn dus bekomen na 4u incubatie van het desbetreffende steroïde met de HLM. 3.4

Analyse van humane lever microsomen

3.4.1

HLM methyldienolone op GC-MS

3.4.1.1

Positieve controle

Een positieve controle wordt meegenomen in de analyse om na te gaan of metabolisatie heeft plaatsgevonden. Het metabolisme van het exogeen anabool steroïde, methandiënon werd reeds veelvuldig bestudeerd, waardoor dit steroïde als positieve controle werd gekozen. Dit is ook van toepassing op LC-MS2. Methandiënon heeft een moleculair gewicht van m/z 300, waar na derivatisatie met TMS m/z 444 wordt bekomen. In Figuur 33 wordt het chromatogram weergegeven van de positieve controle waar methandiënon, de metabolieten en 17α-methyltestosteron als inwendige standaard (IS’) gedetecteerd worden. Het massaspectrum van methandiënon werd reeds weergegeven in Figuur 16, waarbij er een hogere abundantie geldt in het massaspectrum van methandiënon in de positieve controle door een grotere concentratie en hierbij niet fungeert als IS. In Figuur 34 en 35 worden

de

massaspectra

weergegeven

van

de

IS’

en

de

metaboliet

6β-

hydroxymethandiënon van methandiënon. De RT van de verschillende pieksignalen in de positieve controle met bijhorende ionen worden weergegeven in Tabel 7.

6β-hydroxymethandiënon

Methandiënon IS’

Figuur 33: Chromatogram positieve controle, methandiënon en 6β-hydroxymethandiënon als metaboliet, met IS’ op GCMS.

53

Resultaten en discussie 446 73

356 341

143

431

Figuur 34: Full scan massaspectrum van 17α-methyltestosteron (IS’). 517

73

143

427 442

532

Figuur 35: Full scan massaspectrum van 6β-hydroxymethandiënon. Tabel 7: Overzicht RT en ionen uit het chromatogram en full scan spectra positieve controle.

Steroïde

Retentietijd (min)

Moleculair ion (m/z)

Fragmentionen (m/z)

17α-methyltestosteron (IS’) Methandiënon 6β-hydroxymethandiënon

8,196 8,087 9,169

446 444 532

431- 356- 341 429- 354- 339 517- 442- 427

Als metabolisatiereactie treedt een hydroxylatie op van methandiënon, waardoor een moleculair ion m/z 532 wordt verkregen op GC-MS. Aan de hand van het massaspectrum werd deze metaboliet in de literatuur beschreven als 6β-hydroxymethandiënon [30]. Hierbij wordt aangetoond dat de enzymactiviteit van de HLM werkzaam is. 3.4.1.2

Negatieve controle

De negatieve controle, bestaande uit microsomen met een afwezigheid van het steroïde, geeft het matrix-effect weer van de geïncubeerde HLM. Bijgevolg zullen geen metabolieten worden waargenomen in het chromatogram en kunnen eventuele interferenties opgemerkt worden. Dit is ook van toepassing op LC-MS2. De negatieve 54


controle wordt weergegeven in het overlaid chromatogram HLM, waar dus enkel de IS zichtbaar is (Figuur 36). 3.4.1.3

Blanco controle

Tijdens de incubatie kunnen eventuele omzettingen van het steroïde plaatsvinden. Aan de hand van de blanco controle wordt de stabiliteit van het steroïde nagegaan. Hierbij is enkel het steroïde en geen microsomen aanwezig, waardoor normaal geen metabolisatie zal plaatsvinden en geen metabolieten in het chromatogram worden waargenomen. Dit is ook van toepassing op LC-MS2. De blanco controle wordt weergegeven in het overlaid chromatogram HLM, waar dus methyldienolone en de IS zichtbaar zijn (Figuur 36). 3.4.1.4

HLM

Figuur 36 geeft het overlaid chromatogram weer, waarbij de eventueel gevormde metabolieten gedetecteerd worden door de aanwezigheid van een pieksignaal in het chromatogram van HLM methyldienolone en de afwezigheid van dit signaal in de blanco en negatieve controle. Figuur 37 illustreert het massaspectrum van de metaboliet M1 van methyldienolone in HLM, daar in Figuur 16 en 17 de massaspectra werden weergegeven van respectievelijk de IS en methyldienolone. De RT van de verschillende pieksignalen met bijhorende ionen worden weergegeven in Tabel 8.

MD

IS

Blanco controle HLM methyldienolone

Negatieve controle

M1

M1”

Figuur 36: Overlaid chromatogram HLM ter detectie van de metaboliet (M1) en derivatisatieprobleem (M1”, zie verder) van methyldienolone (MD) met IS op GC-MS.

55

Resultaten en discussie 518

73

143

428 413

503

Figuur 37: Full scan massaspectrum van metaboliet M1. 73

426

516

411

Figuur 38: Full scan massaspectrum van het derivatisatieprobleem van de metaboliet M1 (M1”).

Zoals

eerder

vermeld

werd

het

derivatisatieprobleem

reeds

vastgesteld

bij

methyldienolone, waarbij dit alsook geldt bij de metaboliet van het steroïde. In het overlaid chromatogram op het chromatogram van HLM methyldienolone (Figuur 36) is er na de piek van de metaboliet (M1) een signaal (M1”) aanwezig m/z 516 en met als fragmentionen m/z 426 en 411 (Figuur 38). Tabel 8: Overzicht RT en ionen uit het chromatogram en full scan spectra HLM.

Steroïde

Retentietijd (min)

Moleculair ion (m/z)

Fragmentionen (m/z)

Methandiënon (IS) Methyldienolone (MD) Metaboliet M1

8,079 8,187 8,953

444 430 518

429- 354- 339 415- 340- 325 503- 428- 413

Als metabolisatiereactie treedt een hydroxylatie op van methyldienolone, waardoor een moleculair ion m/z 518 van M1 wordt verkregen op GC-MS. Hierbij is het onmogelijk om te bepalen op welke plaats de metabolisatiereactie heeft plaatsgevonden, waar in dit onderzoek slechts detectie van metabolieten mogelijk is en geen identificatie. Dit geldt bij alle bekomen resultaten waarbij metabolisatie optreedt, met uitzondering van de positieve controle daar het metabolisme gekend is. 56


3.4.2

HLM methyldienolone op LC-MS2

3.4.2.1

Positieve controle

Figuur 39 toont het chromatogram van de positieve controle geanalyseerd op LC-MS2, die methandiënon en zijn metabolieten bevat samen met 17α-methyltestosteron als inwendige standaard (IS’). Methandiënon (m/z 300) wordt op LC-MS2 in positieve mode gedetecteerd met een m/z 301. Het [M+H]+ van de IS’ en de metabolieten PCM1, PCM2 en PCM3 van methandiënon worden geïllustreerd in de massaspectra (Figuur 40-42), daar het massaspectrum van methandiënon reeds werd weergegeven in Figuur 20. De RT van de verschillende pieksignalen in de positieve controle met bijhorend ion worden weergegeven in Tabel 9. De positieve controle voor de HLM studie met methyltrienolone op LC-MS2 is dezelfde zoals hier beschreven. Methandiënon PCM2 PCM3

IS’

Abundance (%)

PCM1

Abundance (%)

Figuur 39: Chromatogram positieve controle, methandiënon en 17-methyl-6β,16,17-trihydroxyandrosta-1,4-dien-3-on (PCM1), 6β-hydroxymethandiënon (PCM2) en x-hydroxymethandiënon (PCM3) als metabolieten, met IS’ op LC-MS2.

Figuur 40: Massaspectrum van 17α-methyltestosteron (IS’).

57

Abundance (%)


Abundance (%)

Figuur 41: Massaspectrum van metaboliet PCM1.

Figuur 42: Massaspectrum van metaboliet PCM2, daar het massaspectrum van metaboliet PCM3 gelijkaardig is. Tabel 9: Overzicht RT en ionen uit het chromatogram en massaspectra positieve controle.

Steroïde 17α-methyltestosteron (IS’) Methandiënon Metaboliet PCM1 Metaboliet PCM2 Metaboliet PCM3

Retentietijd (min) 14,50 11,84 6,15 7,80 8,82

Moleculair ion (m/z) 303 301 333 317 317

Als metabolisatiereactie treden hydroxylaties op van methandiënon, waardoor een moleculair ion m/z 317 wordt verkregen op LC-MS2. Aan de hand van de massaspectra werden de metabolieten in de literatuur beschreven als 6β-hydroxymethandiënon (PCM2) en x-hydroxymethandiënon (PCM3). Alsook treedt een dihydroxylatie van methandiënon op, die in de literatuur werd beschreven als 17-methyl-6β,16,17-trihydroxyandrosta-1,4dien-3-on (PCM1) met m/z 333 [30]. In vergelijking met de resultaten bekomen op GCMS wordt enkel 6β-hydroxymethandiënon (PCM2) via GC-MS gedetecteerd. Dit kan te wijten zijn aan de gevoeligheid van de methodes of aan de derivatisatie. Uit een verdere analyse op LC-MS2 is hierbij alsook gebleken dat meerdere metabolieten worden gedetecteerd bij de HLM studie met methyldienolone dan bij de detectie via GC-MS, waardoor voorgaand besluit bevestigd wordt. 58


3.4.2.2

Negatieve controle

Figuur 43 illustreert het chromatogram van de negatieve controle, waarbij de achtergrond en de IS worden weergegeven. Methandiënon (IS) is aanwezig op een RT van 11,85 min met als [M+H]+ m/z 301 (Figuur 20) en toont aan dat de extractie goed verlopen is. De negatieve controle voor de HLM studie met methyltrienolone op LC-MS2 is dezelfde zoals hier beschreven.

Abundance (%)

IS

Figuur 43: Chromatogram negatieve controle met IS op LC-MS2.

3.4.2.3

Blanco controle methyldienolone

In Figuur 44 wordt het chromatogram weergegeven van de blanco controle, waar methyldienolone en de IS zichtbaar zijn. De RT van methyldienolone en de IS benaderen de RT in het chromatogram van HLM methyldienolone, waardoor verwezen wordt naar Tabel 10 voor de RT van de verschillende pieksignalen met bijhorend ion. Zoals verwacht worden geen metabolieten in de geanalyseerde blanco controle gedetecteerd, wat de stabiliteit van methyldienolone gedurende de incubatie van 4u bij 37°C aantoont. MD

Abundance (%)

IS

Figuur 44: Chromatogram blanco controle, methyldienolone (MD) met IS op LC-MS2.

59


3.4.2.4

HLM methyldienolone

De gevormde metabolieten worden gedetecteerd door de aanwezigheid van pieksignalen in het chromatogram van HLM methyldienolone (Figuur 45) te vergelijken met de afwezigheid van deze signalen in de blanco en negatieve controle. Figuur 46 en 47 illustreren de massaspectra van de metabolieten M1’, M2’, M3’, M4’, M5’ en M6’ van methyldienolone in HLM bekomen na LC-MS2 analyse, daar in Figuur 20 en 21 de massaspectra weergegeven werden van respectievelijk de IS en methyldienolone. De RT van de verschillende pieksignalen met bijhorend ion worden weergegeven in Tabel 10. MD

M4’

IS

M1’

Abundance (%)

M2’

M6’

M3’ M5’

Abundance (%)

Figuur 45: Chromatogram HLM methyldienolone (MD) en M1’, M2’, M3’, M4’, M5’, M6’ als metabolieten, met IS op LC-MS2.

Abundance (%)

Figuur 46: Massaspectrum van metaboliet M1’, daar de massaspectra van metabolieten M2’, M3’ en M4’ gelijkaardig zijn.

Figuur 47: Massaspectrum van metaboliet M5’, daar het massaspectrum van metaboliet M6’ gelijkaardig is.

60

Resultaten en discussie Tabel 10: Overzicht RT en ionen uit het chromatogram en massaspectra HLM methyldienolone.

Steroïde Methandiënon (IS) Methyldienolone (MD) Metaboliet M1’ Metaboliet M2’ Metaboliet M3’ Metaboliet M4’ Metaboliet M5’ Metaboliet M6’

Retentietijd (min) 11,87 11,62 6,70 6,95 7,93 8,78 9,78 10,56

Moleculair ion (m/z) 301 287 303 303 303 303 275 275

Als metabolisatiereactie treden hydroxylaties op van methyldienolone, waardoor een moleculair ion m/z 303 van M1’, M2’, M3’ en M4’ wordt verkregen op LC-MS2. Alsook wordt een moleculair ion m/z 275 van M5’ en M6’ verkregen, met een metabolisatiereactie die geen verklaring kent. Een oxidatie met demethylatie is hierbij de enige mogelijke reactie, maar werd in de literatuur nog niet voorheen gerapporteerd voor anabole steroïden. 3.4.3

HLM methyltrienolone op LC-MS2

De positieve en negatieve controle werden reeds besproken in 3.4.2, waardoor deze niet opnieuw vermeld worden. 3.4.3.1

Blanco controle methyltrienolone

In Figuur 48 wordt het chromatogram weergegeven van de blanco controle, waar methyltrienolone en de IS zichtbaar zijn. De RT van methyltrienolone en de IS benaderen de RT in het chromatogram van HLM methyltrienolone, waardoor verwezen wordt naar Tabel 11 voor de RT van de verschillende pieksignalen met bijhorend ion. Hierbij worden ook geen metabolieten gedetecteerd in de blanco controle afkomstig van methyltrienolone. MT

Abundance (%)

IS

Figuur 48: Chromatogram blanco controle, methyltrienolone (MT) met IS op LC-MS2.

61


3.4.3.2

HLM methyltrienolone

De gevormde metabolieten worden gedetecteerd door de aanwezigheid van pieksignalen in het chromatogram van HLM methyltrienolone (Figuur 49) te vergelijken met de afwezigheid van deze signalen in de blanco en negatieve controle. Figuur 50 illustreert de massaspectra van de metabolieten A1 en A2 van methyltrienolone in HLM bekomen na LC-MS2 analyse, daar in Figuur 20 en 23 de massaspectra weergegeven werden van respectievelijk de IS en methyltrienolone. De RT van de verschillende pieksignalen met bijhorend ion worden weergegeven in Tabel 11. MT A2

IS

Abundance (%)

A1

Abundance (%)

Figuur 49: Chromatogram HLM methyltrienolone (MT) en A1, A2 als metabolieten, met IS op LC-MS2.

Figuur 50: Massaspectrum van metaboliet A1, daar het massaspectrum van metaboliet A2 gelijkaardig is. Tabel 11: Overzicht RT en ionen uit het chromatogram en massaspectra HLM methyltrienolone.

Steroïde Methandiënon (IS) Methyltrienolone (MT) Metaboliet A1 Metaboliet A2

Retentietijd (min) 11,83 11,43 7,87 8,71

Moleculair ion (m/z) 301 285 301 301

Als metabolisatiereactie treden hydroxylaties op van methyltrienolone, waardoor een moleculair ion m/z 301 van A1 en A2 wordt verkregen op LC-MS2.

62


3.5

Analyse van excretie-urines

Bij de analyse van de excretie-urines van niet-chimere en chimere muizen wordt er geen correctie uitgevoerd op de hoeveelheid geproduceerde urine, aangezien ongeveer eenzelfde hoeveelheid muizenurine werd bekomen. Het toevoegen van een IS maakt het mogelijk om te corrigeren voor variaties in de staalvoorbereiding en om de RRT te berekenen (zie 3.6). Niet-chimere muizen worden bij de analyse gebruikt ter controle voor het uitvoeren van excretie-experimenten om het muismetabolisme van de toegediende steroïden na te gaan en zo het aandeel van de humane hepatocyten in de chimere muizen te bepalen. 3.5.1

Excretie-urines methyldienolone op GC-MS

3.5.1.1

Toedieningsoplossing

De toedieningsoplossing wordt meegenomen in de analyse om na te gaan of de hoofdcomponent effectief aanwezig is en dus werd toegediend aan de muizen. Hierbij kan ook de respons van de parent worden afgeleid en indien andere componenten aanwezig zijn die als eventuele metabolieten gezien kunnen worden. Dit is alsook van toepassing op LC-MS2. In de toedieningsoplossing (met een dosis van 200µg/muis) wordt de hoofdcomponent methyldienolone gedetecteerd op een RT van 8,221 min en de IS op een RT van 8,082 min. De RT van methyldienolone is opgeschoven door de grote oppervlakte ten gevolg van de hoge abundantie van dit pieksignaal. 3.5.1.2

Controles

Bij de te analyseren stalen wordt telkens een systeem blank en een negatief urinestaal van de niet-chimere of chimere muis meegenomen om de resultaten achteraf op een correcte manier te kunnen evalueren. Deze worden weergegeven in het overlaid chromatogram excretie-urines, waar bij deze controles enkel de IS zichtbaar is (Figuur 51). Aan de hand van de systeem blank, bestaande uit water, kan eventuele interferentie van de gebruikte solventen en reagentia gedetecteerd worden. De pre-administratie urines, met een afwezigheid van het steroïde (methyldienolone of methyltrienolone) geeft het matrix-effect weer van de muizenurine. Bovendien is de endogene productie van de muizen niet detecteerbaar met de gebruikte methodes, waardoor de pre-administratie urines van de 63


muizen als negatieve urine kunnen beschouwd worden. Bijgevolg zullen geen metabolieten worden waargenomen in het chromatogram, daar de urine voor de toediening van het steroïde werd gecollecteerd. Dit alles is ook van toepassing op LC-MS2. 3.5.1.3

Excretie-urines

Figuur 51 geeft het overlaid chromatogram van de excretie-urines van de niet-chimere en de chimere muis weer, waarbij de gevormde metabolieten gedetecteerd worden door de aanwezigheid van een pieksignaal in het chromatogram van de excretie-urine methyldienolone en de afwezigheid van dit signaal in de negatieve urine en systeem blank. Het derivatisatieprobleem is zoals eerder besproken ook van toepassing bij de excretieurines. In Figuur 37 werd het massaspectrum reeds geïllustreerd van de metaboliet M1 van methyldienolone, daar in Figuur 16 en 17 de massaspectra weergegeven werden van respectievelijk de IS en methyldienolone. De RT van de verschillende pieksignalen met bijhorende ionen worden weergegeven in Tabel 12.

Negatieve urine Systeem blank Excretie-urine methyldienolone

M1”

M1 MD IS

Systeem blank

M1”

Excretie-urine methyldienolone Negatieve urine MD

M1

IS

Figuur 51: Overlaid chromatogram excretie-urine niet-chimere muis (bovenaan) en chimere muis (onderaan) ter detectie van de metaboliet (M1) en derivatisatieprobleem (M1”) van methyldienolone (MD) met IS op GC-MS.

64

Resultaten en discussie Tabel 12: Overzicht RT en ionen uit het chromatogram en full scan spectra excretie-urine niet-chimere en chimere muis.

Steroïde Methandiënon (IS) Methyldienolone (MD) Metaboliet M1

Retentietijd (min) 8,085 8,185 8,953

Moleculair ion (m/z) 444 430 518

Fragmentionen (m/z) 429- 354- 339 415- 340- 325 503- 428- 413

Als metabolisatiereactie treedt een hydroxylatie op van methyldienolone in de niet-chimere en chimere muis, waardoor een moleculair ion m/z 518 van M1 wordt verkregen op GCMS. In de toedieningsoplossing is dit pieksignaal in mindere mate aanwezig, waar na toediening van het steroïde aan de muizen de piek meer wordt gevormd en dus beschouwd wordt als een metaboliet. Hierbij is de metaboliet van methyldienolone in de excretie-urine van de niet-chimere muis dezelfde als van de chimere muis, doordat eenzelfde RT wordt verkregen. Deze stemt overeen met de RRT van de metaboliet (M1) bekomen in het chromatogram van HLM methyldienolone (Figuur 36). Aangezien dezelfde metabolisatie heeft plaatsgevonden als bij de HLM studie met methyldienolone op GC-MS, wordt eenzelfde benaming en massaspectrum van de metaboliet M1 bekomen (Figuur 37). 3.5.2

Excretie-urines methyldienolone op LC-MS2

3.5.2.1

Toedieningsoplossing methyldienolone

In de toedieningsoplossing is methyldienolone (met een dosis van 200µg/muis) als hoofdcomponent aanwezig op een RT van 11,67 min en de IS op een RT van 11,96 min. Door de hoge abundantie en grote oppervlakte van het pieksignaal van methyldienolone is de IS moeilijk detecteerbaar, waarbij deze onder de piek van methyldienolone valt. 3.5.2.2

Systeem blank

Figuur 52 illustreert het chromatogram van de systeem blank, waarbij eventuele interferenties en de IS worden weergegeven. Methandiënon (IS) is aanwezig op een RT van 11,88 min met als [M+H]+ m/z 301 (Figuur 20). De systeem blank voor de excretie studie met methyltrienolone op LC-MS2 is dezelfde zoals hier beschreven.

65


Abundance (%)

IS

Figuur 52: Chromatogram systeem blank met IS op LC-MS2.

3.5.2.3

Negatieve urine methyldienolone

Figuur 53 illustreert de chromatogrammen van de negatieve urine methyldienolone van respectievelijk de niet-chimere en chimere muis, waarbij de achtergrond en de IS worden weergegeven. De RT van de IS benadert de RT in het chromatogram van de excretie-urine methyldienolone, waardoor verwezen wordt naar Tabel 13 voor de RT van de verschillende pieksignalen met bijhorend ion. Zoals verwacht worden geen metabolieten gedetecteerd in de geanalyseerde negatieve urine, daar dit ook geldt bij de excretie studie met methyltrienolone op LC-MS2.

Abundance (%)

IS

Abundance (%)

IS

Figuur 53: Chromatogram negatieve urine methyldienolone niet-chimere muis (bovenaan) en chimere muis (onderaan) met IS op LC-MS2.

66


3.5.2.4

Excretie-urine methyldienolone

Figuur 54 geeft het chromatogram van de metabolieten in de excretie-urines van de nietchimere en de chimere muis weer, waarbij de gevormde metabolieten gedetecteerd worden door de aanwezigheid van pieksignalen in het chromatogram van de excretie-urine methyldienolone te vergelijken met de afwezigheid van deze signalen in de systeem blank en negatieve urine. Metaboliet M0’ vertoont een gelijkaardig spectrum aan dat van M2’, waardoor Figuur 46 de massaspectra illustreert van de metabolieten M0’ en M2’ van methyldienolone in excretie-urines bekomen na LC-MS2 analyse. In Figuur 20 en 21 werden de massaspectra respectievelijk weergegeven van de IS en methyldienolone. De RT van de verschillende pieksignalen met bijhorend ion worden weergegeven in Tabel 13. Door het detecteren van de hoofdcomponent in de excretie-urines worden de ionen opgevraagd van de metabolieten bekomen bij de HLM studie met methyldienolone op LCMS2, doordat andere eventuele metabolieten moeilijk detecteerbaar zijn door hun lage signalen. Hierbij worden de metabolieten met een m/z 303 weergegeven, daar m/z 275 niet wordt gedetecteerd in het chromatogram van de excretie-urines. M2’

Abundance (%)

M0’

Figuur 54: Chromatogram excretie-urines metabolieten methyldienolone op LC-MS2 met selectie van [M+H]+ met een m/z 303. Tabel 13: Overzicht RT en ionen uit het chromatogram en massaspectra excretie-urine methyldienolone.

Steroïde Methandiënon (IS) Methyldienolone (MD) Metaboliet M0’ Metaboliet M2’



Als metabolisatiereactie treden hydroxylaties op van methyldienolone in de niet-chimere en chimere muis, waardoor een moleculair ion m/z 303 van M0’ en M2’ wordt verkregen 67


op LC-MS2. In de toedieningsoplossing zijn deze pieksignalen in mindere mate aanwezig, waar na toediening van het steroïde aan de muizen de pieken meer worden gevormd en dus beschouwd worden als metabolieten. Hierbij komt het signaal op een RT van 8,72 min in dezelfde piekverhouding voor als in de toedieningsoplossing, waardoor dit pieksignaal niet beschouwd wordt als een metaboliet (Figuur 54). Er worden opnieuw meerdere metabolieten gedetecteerd op LC-MS2 bij de excretie-studie met methyldienolone dan bij de detectie via GC-MS, waardoor zoals eerder vermeld dit te wijten is aan de gevoeligheid van de methodes of aan de derivatisatie. Fracties werden opgevangen van de metabolieten op LC-MS2 om deze op GC-MS te kunnen detecteren, waarbij enkel metaboliet M2’ gedetecteerd werd en overeenkomstig is met metaboliet M1 van bij de excretie studie met methyldienolone op GC-MS (zie 3.5.1.3). Hierbij zijn de metabolieten van methyldienolone in de excretie-urine van de niet-chimere muis dezelfde als van de chimere muis, doordat eenzelfde RT wordt verkregen. Metaboliet M2' stemt overeen met de RRT van de metaboliet (M2’) bekomen in het chromatogram van HLM methyldienolone (Figuur 45). Aangezien dezelfde metabolisatie heeft plaatsgevonden als bij de HLM studie met methyldienolone op LC-MS2, wordt eenzelfde benaming en massaspectrum van de metaboliet M2’ bekomen (Figuur 46). Metaboliet M0’ wordt enkel bij excretie-urines gevormd, daar deze niet zichtbaar is bij humane lever microsomen. 3.5.3

Excretie-urines methyltrienolone op LC-MS2

De systeem blank werd reeds besproken in 3.5.2, waardoor deze niet opnieuw vermeld wordt. 3.5.3.1

Toedieningsoplossing methyltrienolone

In de toedieningsoplossing is methyltrienolone (met een dosis van 160µg/muis) als hoofdcomponent aanwezig op een RT van 11,46 min en de IS op een RT van 11,91 min. Door de hoge abundantie en grote oppervlakte van het pieksignaal van methyltrienolone is de IS moeilijk detecteerbaar, waarbij deze onder de piek van methyltrienolone valt.

68


3.5.3.2

Negatieve urine methyltrienolone

Figuur 55 illustreert de chromatogrammen van de negatieve urine methyltrienolone van respectievelijk de niet-chimere en chimere muis, waarbij de achtergrond en de IS worden weergegeven. De RT van de IS benadert de RT in het chromatogram van de excretie-urine methyltrienolone, waardoor verwezen wordt naar Tabel 14 voor de RT van de verschillende pieksignalen met bijhorend ion. Aangezien andere muizen gebruikt werden dan bij de methyldienolone studie worden deze resultaten hier geïllustreerd.

Abundance (%)

IS

Abundance (%)

IS

Figuur 55: Chromatogram negatieve urine methyltrienolone niet-chimere muis (bovenaan) en chimere muis (onderaan) met IS op LC-MS2.

3.5.3.3

Excretie-urine methyltrienolone

Figuur 56 geeft het chromatogram van de metabolieten in de excretie-urine van de chimere muis weer, waarbij de gevormde metabolieten gedetecteerd worden door de aanwezigheid van pieksignalen in het chromatogram van de excretie-urine methyltrienolone te vergelijken met de afwezigheid van deze signalen in de systeem blank en negatieve urine. Metaboliet A0 vertoont een gelijkaardig spectrum aan dat van A2, waardoor Figuur 50 de massaspectra illustreert van de metabolieten A0 en A2 van methyltrienolone in excretieurines bekomen na LC-MS2 analyse. In Figuur 20 en 23 werden de massaspectra 69


respectievelijk weergegeven van de IS en methyltrienolone. De RT van de verschillende pieksignalen met bijhorend ion worden weergegeven in Tabel 14. Door het detecteren van de hoofdcomponent in de excretie-urines worden de ionen opgevraagd van de metabolieten bekomen bij de HLM studie met methyltrienolone op LCMS2, doordat andere eventuele metabolieten moeilijk detecteerbaar zijn door hun lage signalen. Hierbij worden de metabolieten met een m/z 301 weergegeven, waarbij deze niet worden gedetecteerd in de excretie-urine van de niet-chimere muis.

A2

Abundance (%)

A0

Figuur 56: Chromatogram excretie-urine metabolieten methyltrienolone op LC-MS2 met selectie van [M+H]+ met een m/z 301. Tabel 14: Overzicht RT en ionen uit het chromatogram en massaspectra excretie-urine methyltrienolone chimere muis.

Steroïde Methandiënon (IS) Methyltrienolone (MT) Metaboliet A0 Metaboliet A2



Als metabolisatiereactie treden hydroxylaties op van methyltrienolone in de chimere muis, waardoor een moleculair ion m/z 301 van A0 en A2 wordt verkregen op LC-MS2. In de toedieningsoplossing zijn deze pieksignalen niet aanwezig en kunnen dus beschouwd worden als een metabolieten. Metaboliet A2 stemt overeen met de RRT van de metaboliet (A2) bekomen in het chromatogram van HLM methyltrienolone (Figuur 49). Aangezien dezelfde metabolisatie heeft plaatsgevonden bij de HLM studie met methyltrienolone op LC-MS2, wordt eenzelfde benaming en massaspectrum van de metaboliet A2 bekomen (Figuur 50). Metaboliet A0 wordt enkel bij excretie-urines gevormd, daar deze niet zichtbaar is bij humane lever microsomen en dus enkel in het muismetabolisme voorkomt.

70


Op basis van de bekomen resultaten bestaat de mogelijkheid dat een humane metaboliet van methyltrienolone (A2) aanwezig is in de excretie-urines bij de chimere muis, daar deze niet wordt waargenomen bij de niet-chimere muis en wel in HLM via detectie op LC-MS2. Hierbij wordt niet uitgesloten dat de gedetecteerde metabolieten alsook kunnen verkregen worden bij het muismetabolisme. Dit kan niet met zekerheid besloten worden, aangezien bij een tweede analyse de hoofdcomponent bij de niet-chimere muis niet gedetecteerd werd en bijgevolg dus ook geen metabolieten kunnen gedetecteerd worden door een te lage concentratie, ten gevolge van een weinig volume aan muizenurine. 3.6

Overzicht

Op basis van de RRT worden pieksignalen in de verschillende analyses van de componenten in de humane lever microsomen en excretie-urines gekoppeld aan elkaar door het verkrijgen van dezelfde RRT voor eenzelfde piek (Tabel 15-17). Bij de HLM studie van methyldienolone en metabolieten gedetecteerd via LC-MS2 bestaat er tussen de twee reeksen een maximale opschuiving van RRT 0,02, waardoor deze als dezelfde componenten beschouwd kunnen worden. De RRT wordt bekomen door de RT van de component te delen door de RT van de IS. Tabel 15: Relatieve retentietijden van methyldienolone en metabolieten gedetecteerd via GC-MS.

Methyldienolone Metaboliet M1 Methyldienolone Metaboliet M1 Methyldienolone Metaboliet M1

RRT Reeks 1 HLM 1,01 1,11 Niet-chimere muis 1,01 1,11 Chimere muis 1,01 1,11

RRT Reeks 2 HLM 1,01 1,11 Niet-chimere muis 1,01 1,11 Chimere muis 1,01 1,11

71

Resultaten en discussie Tabel 16: Relatieve retentietijden van methyldienolone en metabolieten gedetecteerd via LC-MS2.

Methyldienolone Metaboliet M1' Metaboliet M2' Metaboliet M3' Metaboliet M4' Metaboliet M5' Metaboliet M6' Methyldienolone Metaboliet M0’ Metaboliet M2’ Methyldienolone Metaboliet M0’ Metaboliet M2’

RRT Reeks 1 HLM 0,97 0,55 0,57 0,65 0,71 0,80 0,87 Niet-chimere muis 0,98 0,48 0,59 Chimere muis 0,98 0,49 0,59

RRT Reeks 2 HLM 0,98 0,57 0,59 0,67 0,73 0,82 0,89 Niet-chimere muis 0,98 0,49 0,59 Chimere muis 0,98 0,49 0,59

Tabel 17: Relatieve retentietijden van methyltrienolone en metabolieten gedetecteerd via LC-MS2.

Methyltrienolone Metaboliet A1 Metaboliet A2 Methyltrienolone Metaboliet A0 Metaboliet A1 Metaboliet A2 Methyltrienolone Metaboliet A0 Metaboliet A2

RRT Reeks 1 HLM 0,96 0,67 0,73 Niet-chimere muis 0,96 Chimere muis 0,97 0,61 0,74

RRT Reeks 2 HLM 0,97 0,67 0,74 Niet-chimere muis Chimere muis 0,96 0,62 0,74

In Tabel 18 wordt een overzicht van de metabolieten van methyldienolone gegeven gedetecteerd via GC-MS en LC-MS2 in HLM en excretie-urines, waar in Tabel 19 een overzicht van de metabolieten van methyltrienolone wordt gegeven gedetecteerd via LCMS2 in HLM en excretie-urines. Zoals eerder vermeld werden fracties opgevangen van de metabolieten op LC-MS2 om deze op GC-MS te detecteren, waarbij metaboliet M2’ overeenkomstig is met metaboliet M1 op GC-MS aangeduid in Tabel 18.

72

Resultaten en discussie Tabel 18: Overzicht metabolieten methyldienolone in HLM en excretie-urines via detectie op GC-MS (bovenaan) en LCMS2 (onderaan).

GC-MS

LC-MS2

HLM x

Metaboliet M1 Metaboliet M0’ Metaboliet M1' Metaboliet M2' Metaboliet M3' Metaboliet M4' Metaboliet M5' Metaboliet M6’

Excretie-urines x x

x x x x x x

x

Tabel 19: Overzicht metabolieten methyltrienolone in HLM en excretie-urines via detectie op LC-MS2.

HLM Metaboliet A0 Metaboliet A1 Metaboliet A2

x x

Excretie-urines x x

73

Besluit

4 Besluit In dit onderzoek werd de metabolisatie nagegaan van de anabole androgene steroïden methyldienolone en methyltrienolone aan de hand van in vivo en in vitro technieken, doordat het niet toegestaan is om onderzoek uit te voeren op gezonde menselijke vrijwilligers omwille van ethische redenen. De kennis van het metabolisme van dopinggerelateerde producten is noodzakelijk voor de detectie ervan in de urine, doordat de metabolieten van het steroïde een langere detectie van het misbruik toelaten. Er werd op zoek gegaan naar humane metabolieten door het analyseren van excretie-urines van nietchimere en chimere muizen en via incubaties met behulp van microsomen (HLM). Bij de gedetecteerde metabolieten van methyldienolone en methyltrienolone in HLM en excretieurines treden hydroxylaties op als metabolisatiereactie. Eerst en vooral werd de referentiestandaard van methyldienolone en methyltrienolone geanalyseerd op GC-MS en LC-MS2. Hierbij kon methyltrienolone niet worden gedetecteerd via GC-MS doordat het steroïde een sterk geconjugeerd systeem bevat, maar wel via detectie op LC-MS2. Beide referentiestandaarden werden dus zuiver bevonden, desondanks het optredende derivatisatieprobleem bij de detectie van methyldienolone via GC-MS. Door analyse van de referentiestandaarden werd het massaspectrum en de retentietijd van beide componenten bepaald, waardoor de steroïden in verdere analyses gedetecteerd en geïdentificeerd konden worden. Bij de analyse van de HLM experimenten werd eerst de optimale incubatietijd van de steroïden in de microsomen bepaald via GC-MS en LC-MS2. Hierbij werd de mate van vorming van de metabolieten geobserveerd na verschillende incubatieperiodes en op basis van de bekomen resultaten werd geopteerd voor een 4u incubatie. Via analyse op GC-MS van methyldienolone werd er een gehydroxyleerde metaboliet (m/z 518) vastgesteld, daar bij de analyse via LC-MS2 zes metabolieten (m/z 303 en 275) van methyldienolone in HLM werden gedetecteerd. Hiervan vertonen twee metabolieten (m/z 275) een ongekende metabolisatiereactie. Het verschil in detectie van het aantal metabolieten is te wijten aan de gevoeligheid van de methodes of aan de derivatisatie en is alsook geldig bij de analyse van excretie-urines. Via de LC-MS2 analyse van methyltrienolone werden er twee gehydroxyleerde metabolieten (m/z 301) gedetecteerd. 74

Besluit

Bij de excretie studie werd een dosisbepaling uitgevoerd waarbij de dosis steeds werd opgevoerd tot een detecteerbaar niveau van het steroïde of de metabolieten. Deze toegediende dosis van methyldienolone (200µg/muis) en methyltrienolone (160µg/muis) is bijgevolg de laagste dosis waarbij componenten werden gedetecteerd. Via analyse op GC-MS van methyldienolone werd er opnieuw een metaboliet (m/z 518) vastgesteld in zowel de niet-chimere als chimere muis. Door het verkrijgen van dezelfde metaboliet van bij de in vitro HLM wordt het humaan metabolisme bevestigd in het in vivo uPA+/+-SCID chimeer muismodel. Bij de analyse via LC-MS2 werden twee metabolieten (m/z 303) van methyldienolone in zowel de excretie-urines van de niet-chimere als van de chimere muis gedetecteerd. Hierbij komt slechts een van de twee metabolieten van methyldienolone zowel in de HLM als in het chimeer muismodel voor. Deze metaboliet is overeenkomstig met de metaboliet die via GC-MS gedetecteerd werd. Via de LC-MS2 analyse van methyltrienolone werden er twee metabolieten (m/z 301) gedetecteerd bij de chimere muis, die niet werden vastgesteld in de excretie-urines van de niet-chimere muis. Hierbij wordt slechts een van de twee metabolieten gedetecteerd in zowel HLM als in het chimeer muismodel, waardoor deze metaboliet door het humaan metabolisme wordt gevormd. Hoewel hier wel een verschil werd opgemerkt met de nietchimere muizen wordt niet uitgesloten dat de verkregen metabolieten alsook door het muismetabolisme gevormd worden. Binnen dit onderzoek werden metabolieten gedetecteerd van methyldienolone en methyltrienolone, maar daarnaast is het ook van belang om hun structuur te achterhalen om deze steroïden specifieker te kunnen identificeren. Een hogere dosis kan alsook worden toegediend aan het muismodel om eventuele metabolieten met een laag signaal te kunnen detecteren. De robuustheid kon aan de hand van de relatieve abundantie niet bepaald worden door een beperkt aantal metingen. Hierdoor zou men in een later onderzoek meerdere metingen moeten uitvoeren om de herhaalbaarheid en reproduceerbaarheid na te gaan. Het einddoel van dit onderzoek is om de steroïden methyldienolone en methyltrienolone op te nemen in de routinescreening ter detectie.

75


Literatuurlijst [1] VAN EENOO, P. (2005). Doping Control Laboratory [on line]. Universiteit Gent. http://www.docolab.ugent.be [datum van opzoeking: 09/03/2014]. [2] World Anti-Doping Agency (WADA) (2014). Accredited Laboratories For Doping Control Analysis [on line]. http://www.wada-ama.org/Documents/Science_Medicine/AntiDoping_Laboratories/WADA_Accredited_Laboratories_EN.pdf [datum van opzoeking: 09/03/2014]. [3] MORENTE-SÁNCHEZ, J., ZABALA, M. (2013). Doping in Sport: A Review of Elite Athletes’ Attitudes, Beliefs, and Knowledge. Sports Medicine, 43(6), 395-411. [4] World Anti-Doping Agency (WADA) (2012). Anti-Doping Testing Figures Report [on line]. http://www.wada-ama.org/Documents/Resources/Testing-Figures/WADA-2012-AntiDoping-Testing-Figures-Report-EN.pdf [datum van opzoeking: 16/03/2014]. [5] World Anti-Doping Agency (WADA) (2009). World Anti-Doping Code [on line]. http://www.wada-ama.org/Documents/World_Anti-Doping_Program/WADP-TheCode/WADA_Anti-Doping_CODE_2009_EN.pdf [datum van opzoeking: 02/04/2014]. [6] World Anti-Doping Agency (WADA) (2009). WADA History [on line]. http://www.wada-ama.org/en/About-WADA/History/WADA-History/ [datum van opzoeking: 16/03/2014]. [7] DUNTAS, L.H., POPOVIC, V. (2013). Hormones as doping in sports. Endocrine, 43(2), 303-13. [8] World Anti-Doping Agency (WADA) (2014). The 2014 Prohibited List International Standard [on line]. http://www.wada-ama.org/Documents/World_Anti-Doping_Program/WADPProhibited-list/2014/WADA-prohibited-list-2014-EN.pdf [datum van opzoeking: 16/03/2014]. [9] KICMAN, A.T. (2008). Pharmacology of anabolic steroids. British Journal of Pharmacology, 154, 502-521. [10] SCHÄNZER, W. (1996). Metabolism of anabolic androgenic steroids. Clinical Chemistry, 42:7, 1001-1020. 76


[11] HARTGENS, F., KUIPERS, F. (Eds.) (2000). Verboden middelen in de sport. Bohn Stafleu Van Loghum, Houten/Diegem, 266p. (ISBN 90-313-2778-6) [12] FRAGKAKI, A.G., ANGELIS, Y.S., KOUPPARIS, M., TSANTILI-KAKOULIDOU, A., KOKOTOS, G., GEORGAKOPOULOS, C. (2009). Structural characteristics of anabolic androgenic steroids contributing to binding to the androgen receptor and to their anabolic and androgenic activities. Applied modifications in the steroidal structure. Steroids, 74, 172-197. [13] SCHÄNZER, W., DONIKE, M. (1993). Metabolism of anabolic steroids in man: synthesis and use of reference substances for identification of anabolic steroid metabolites. Analytica Chimica Acta, 275, 23-48. [14] LOOTENS, L., MEULEMAN, P., POZO, O.J., VAN EENOO, P., LEROUX-ROELS, G., DELBEKE, F.T. (2009). uPA+/+-SCID Mouse with Humanized Liver as a Model for In Vivo Metabolism of Exogenous Steroids: Methandienone as a Case Study. Clinical Chemistry, 55:10, 1783-1793. [15] DE GROOT, A., KOERT, W. (2007). Prohormonen [on line]. Ergogenics. http://www.ergogenics.org/anabolenboek/index15.html [datum van opzoeking: 02/04/2014]. [16] MOSS, G.P. (1989). Nomenclature Of Steroids. Pure and Applied Chemistry, 61:10, 1783-1822. [17] DE GROOT, A., KOERT, W. (2006). De Structuurformule van Testosteron [on line]. Ergogenics. http://www.ergogenics.org/anabolenboek/index4.html [datum van opzoeking: 07/04/2014]. [18] Pharmacology Education Partnership (PEP) (2003). Steroids and athletes: Genes work overtime [on line]. http://www.thepepproject.net/Load/teacher/PEP_M6.pdf [datum van opzoeking: 08/04/2014]. [19] DEMEYERE, M. (2012). De genexpressie. De Hogeschool West-Vlaanderen, Brugge, 188p. [20] BRANDON, E.F.A., RAAP, C.D., MEIJERMAN, I., BEIJNEN, J.H., SCHELLENS, J.H.M. (2003). An update on in vitro test methods in human hepatic drug

77


biotransformation research: pros and cons. Toxicology and Applied Pharmacology, 189, 233-246. [21] LEE, J., XIAODONG, L. (2007). The Conduct of Drug Metabolism Studies Considered Good Practice (II): In Vitro Experiments. Current Drug Metabolism, 8(8), 822-829. [22] FASINU, P., BOUIC, P.J., ROSENKRANZ, B. (2012). Liver-Based In Vitro Technologies for Drug Biotransformation Studies. Current Drug Metabolism, 13, 000000. [23] EMOTO, C., IWASAKI, K., MURAYAMA, N., YAMAZAKI, H. (2011). Drug Metabolism and Toxicity in Chimeric Mice with Humanized Liver. Journal of Health Science, 57(1), 22-27. [24] KATOH, M., TATENO, C., YOSHIZATO, K., YOKOI, T. (2008). Chimeric mice with humanized liver. Toxicology, 246, 9-17. [25] JANCOVA, P., ANZENBACHER, P., ANZENBACHEROVA, E. (2010). Phase II Drug Metabolizing Enzymes. Biomedical Papers of the Medical Faculty of the University Palacky Olomouc Czech Republic, 154(2), 103-116. [26] Mind and Muscle (2011). Prohormones: Methyldienolone [on line]. http://www.mindandmuscle.net/articles/prohormones-methyldienolone/ [datum van opzoeking: 21/04/2014]. [27] Mind and Muscle (2011). Anabolic Steroids: Methyltrienolone [on line]. http://www.mindandmuscle.net/articles/anabolic-steroids-methyltrienolone/ [datum van opzoeking: 21/04/2014]. [28] KICKMAN, A.T. GOWER, D.B. (2003). Anabolic steroids in sport: biochemical, clinical and analytical perspectives. Annals of clinical biochemistry, 40, 321-356. [29] THEVIS, M., SCHÄNZER, W. (2007). Mass Spectrometry In Sports Drug Testing: Structure Characterization And Analytical Assays. Mass Spectrometry Reviews, 26, 79-107. [30] POZO, O.J., LOOTENS, L., VAN EENOO, P., DEVENTER, K., MEULEMAN, P., LEROUX-ROELS, G., PARR, M.K., SCHÄNZER, W., DELBEKE, F.T. (2009). Combination of liquid-chromatography tandem mass spectrometry in different scan modes with human and chimeric mouse urine for the study of steroid metabolism. Drug Testing and Analysis, 1, 554-567. 78


[31] LIPSCHITZ, C., BAARS, B., VAN DEN BERG, J., JANSSEN, H.G., MAASKANT, J., SCHOENMAKERS, P., TIJSSEN, R., VONK, N. (Eds.) (1996). Chromatografie in de praktijk. Gaschromatografie. Ten Hagen & Stam b.v., Den Haag, losbladig. (ISBN 90-71694-34-8) [32] SALLIAU, S. (2012). Instrumentele technieken. Chromatografie. De Hogeschool West-Vlaanderen, Brugge, 104p. [33] LIPSCHITZ, C., BAARS, B., VAN DEN BERG, J., JANSSEN, H.G., SCHOENMAKERS, P., TIJSSEN, R., VONK, N. (Eds.) (1997). Chromatografie in de praktijk. Gaschromatografie. Ten Hagen & Stam b.v., Den Haag, losbladig. (ISBN 9071694-35-6) [34] LIPSCHITZ, C., BAARS, B., VAN DEN BERG, J., JANSSEN, H.G., SCHOENMAKERS, P., TIJSSEN, R., VONK, N. (Eds.) (1995). Chromatografie in de praktijk. Vloeistofchromatografie. Ten Hagen & Stam b.v., Den Haag, losbladig. (ISBN 90-71694-35-6) [35] LIPSCHITZ, C., BAARS, B., VAN DEN BERG, J., JANSSEN, H.G., SCHOENMAKERS, P., TIJSSEN, R., VONK, N. (Eds.) (2001). Chromatografie in de praktijk. Vloeistofchromatografie. Ten Hagen & Stam b.v., Den Haag, losbladig. (ISBN 90-71694-35-6) [36] GATES, P. (2009). Quadruple & Triple Quadrupole (QQQ) Mass Analysis [on line]. University of Bristol. http://www.chm.bris.ac.uk/ms/theory/quad-massspec.html [datum van opzoeking: 24/04/2014]. [37] POZO, O.J., DEVENTER, K., VAN EENOO, P., DELBEKE, F.T. (2008). Efficient Approach for the Comprehensive Detection of Unknown Anabolic Steroids and Metabolites in Human Urine by Liquid Chromatography-Electrospray-Tandem Mass Spectrometry. Analytical chemistry, 80(5), 1709-1720. [38] GATES, P. (2004). Tandem Mass Spectrometry (MS/MS) [on line]. University of Bristol. http://www.chm.bris.ac.uk/ms/theory/tandem-ms.html [datum van opzoeking: 24/04/2014]. [39] LOOTENS, L., VAN EENOO, P., MEULEMAN, P., LEROUX-ROELS, G., DELBEKE, F.T. (2009). The uPA (+/+)-SCID Mouse with Humanized Liver as a 79


Model for in Vivo Metabolism of 4-Androstene-3,17-dione. Drug Metabolism and Disposition, 37(12), 2367-2374. [40] MEULEMAN, P., LEROUX-ROELS, G. (2008). The human liver-uPA-SCID mouse: A model for the evaluation of antiviral compounds against HBV and HCV. Antiviral research, 80(3), 231-238. [41] MEULEMAN, P., LIBBRECHT, L., DE VOS, R., DE HEMPTINNE, B., GEVAERT, K., VANDEKERCKHOVE, J., ROSKAMS, T., LEROUX-ROELS, G. (2005). Morphological and Biochemical Characterization of a Human Liver in a uPA‐SCID Mouse Chimera. Hepatology, 41(4), 847-856. [42] BD Biosciences (2012). NADPH Regenerating System Solution A & B. BD Gentest, Woburn, 2p. [43] COTTYN, A., VAN OOSTVELDT, K. (2013). In vivo en in vitro technieken. Proefdierkunde en weefselkweek. De Hogeschool West-Vlaanderen, Brugge, 86p. [44] FRAGKAKI, A.G., ANGELIS, Y.S., TSANTILI-KAKOULIDOU, A., KOUPPARIS, M., GEORGAKOPOULOS, C. (2009). Statistical analysis of fragmentation patterns of electron ionization mass spectra of enolized-trimethylsilylated anabolic androgenic steroids. International Journal of Mass Spectrometry, 285(1), 58-69. [45] GEYER, H., PARR, M.K., KOEHLER, K., MARECK, U., SCHÄNZER, W., THEVIS, M. (2008). Nutritional supplements cross‐contaminated and faked with doping substances. Journal of mass spectrometry, 43(7), 892-902.

80

Voor akkoord verklaring

Recommend Documents