UNIVERSITEIT GENT FACULTEIT DIERGENEESKUNDE. Academiejaar

UNIVERSITEIT GENT FACULTEIT DIERGENEESKUNDE Academiejaar 2012-2013

CASUS: GESLACHTSBEPALING BIJ MONOMORFE VOGELSOORTEN

door

Robin Van Buel

Promotor: Prof. Dr. A. Martel Medepromotor: Gunther Antonissen

Casus in het kader van de Masterproef

De auteur en de promotor(en) geven de toelating deze studie als geheel voor consultatie beschikbaar te stellen voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting de bron uitdrukkelijk te vermelden bij het aanhalen van gegevens uit deze studie. Het auteursrecht betreffende de gegevens vermeld in deze studie berust bij de promotor(en). Het auteursrecht beperkt zich tot de wijze waarop de auteur de problematiek van het onderwerp heeft benaderd en neergeschreven. De auteur respecteert daarbij het oorspronkelijke auteursrecht van de individueel geciteerde studies en eventueel bijhorende documentatie, zoals tabellen en figuren. De auteur en de promotor(en) zijn niet verantwoordelijk voor de behandelingen en eventuele doseringen die in deze studie geciteerd en beschreven zijn.

VOORWOORD

Vogels, gaande van gezelschapsvogels tot pluimvee, vormen reeds van kindsbeen af een rode draad doorheen mijn leven. Het is dan ook niet verwonderlijk dat ik de studie diergeneeskunde heb aangevat met de bedoeling mij te verdiepen in de vogelgeneeskunde, en de relatie tussen mens en vogel in zowel de hobby- als industriesector. Na zes jaar zware studie is mijn interesseveld uiteraard ook enorm vergroot naar andere dieren toe. Dit wil echter niet zeggen dat ik minder gepassioneerd ben geworden ten aanzien van alles wat pluimen heeft. Deze literatuurstudie is dan ook een kleine ode aan de dagen van weleer en een mogelijks gevederde toekomst. Bij deze wil ik mijn promotor, Prof. A. Martel, hartelijk bedanken voor de tijd die zij heeft uitgetrokken en de geleverde inspanningen om deze casus tot een goed eind te brengen. Tenslotte wil ik mijn ouders, Eric Van Buel en Marie-Kristine Smet, bedanken voor de continue steun en de kansen die ze me geven om mijn dromen te helpen realiseren.

~ ‘Common magpies’ door John James Audubon (1785 – 1851) ~

INHOUDSOPGAVE

SAMENVATTING................................................................................................................................................ 1 1. INLEIDING ....................................................................................................................................................... 2 2. LITERATUURSTUDIE .................................................................................................................................... 3 2.1. KUNNEN VOGELS HET GESLACHT VAN HUN NAGESLACHT BEPALEN? ............................................................ 3 2.2. TECHNIEKEN OM HET GESLACHT VAN MONOMORFE VOGELSOORTEN TE BEPALEN ........................................ 5 2.2.1. Vocalisatie .......................................................................................................................................... 5 2.2.2. Aanwezigheid van een broedvlek of promontorium cloacale .............................................................. 5 2.2.3. Moleculaire geslachtsbepaling: DNA-typering .................................................................................. 6 2.2.4. Cloacale geslachtsbepaling (Vent sexing) ........................................................................................ 13 2.2.5. Flowcytometrie ................................................................................................................................. 14 2.2.6. Karyotypering ................................................................................................................................... 15 2.2.7. Chirurgische geslachtsbepaling: laparoscopie/endoscopie.............................................................. 16 2.2.8. Ultrasonografie................................................................................................................................. 18 2.2.9. Geslachtsbepaling via steroïden ....................................................................................................... 19 2.2.10. Morfometrische geslachtsbepaling via discriminant function analysis (DFA) ................................. 19 3. BESPREKING ................................................................................................................................................. 21 4. REFERENTIELIJST ...................................................................................................................................... 23

SAMENVATTING

Sinds geruime tijd is er interesse in het differentiëren van geslachten bij vogels omdat meer dan de helft van alle vogelsoorten seksueel monomorf is. Bij deze vogelsoorten, en in het bijzonder bij jonge vogels en kuikens, is het geen evidentie om het geslacht te bepalen op basis van uitwendige morfologie. Nochtans is geslachtsbepaling van vogels een sleutelgegeven in de avicultuur, soortenbehoud en evolutionaire studies. Dankzij de kennis die we hebben over geslachtsspecifieke genen, is het mogelijk fokprogramma’s bij pluimvee succesvol toe te passen. Cloacale geslachtsbepaling, endoscopie, geslachtsbepaling op basis van steroïden, karyotypering, en andere methoden zijn dikwijls praktisch moeilijk uitvoerbaar omwille van de tijdsduur, betrouwbaarheid, stressinductie van de vogel of financiële kostprijs. Na het grondig, retrospectief bestuderen van deze verscheidene technieken op basis van literatuur, kunnen we stellen dat geslachtsbepaling via genen die chromosoomgebonden zijn het meeste voordelen biedt. Vrouwelijke vogels beschikken over één Z en één W-chromosoom, mannelijke vogels dragen twee Z-chromosomen. Hoewel er vele DNAgebaseerde technieken bestaan, blijkt de PCR-amplificatietechniek via RAPD of AFLP van geslachtsspecifieke CDH1 (chromo-helicase-DNA-binding)-genen met P2-P8 primerparen het goedkoopst, effectiefst en betrouwbaarst te zijn. Ook flowcytometrie, een techniek gebaseerd op de kwantitatieve beoordeling van de DNA-inhoud in een groot aantal celkernen, biedt een gedegen alternatief.

Trefwoorden: geslachtsbepaling, endoscopie, DNA, monomorfisme, PCR, morfometrie

1. INLEIDING

Identificatie van het geslacht bij vogels is niet altijd even gemakkelijk. De voortplantingsorganen bevinden zich namelijk inwendig. Toch kan men van sommige vogelsoorten het geslacht bepalen op basis van uitwendige kenmerken, bijvoorbeeld de kleur van het verenkleed (dichromatisme) of een verschil in grootte en vorm (dimorfisme). Morfologische geslachtsbepaling is echter verre van mogelijk wanneer beide geslachten nagenoeg op elkaar gelijken (monochromatisme/monomorfisme).

Ruw

geschat zijn meer dan 50% van de gekende vogelsoorten uiterlijk monomorfisch (Griffiths et al., 1998). Bij deze soorten – en vooral bij jonge en juveniele vogels in het algemeen – is het moeilijk tot zelfs onmogelijk om het geslacht te bepalen op basis van de uitwendige morfologie. Ook indien men een vogel vangt en de uitwendig bereikbare geslachtsorganen (cloaca) macroscopisch onderzoekt, kan er wat betreft geslachtdifferentiatie, met uitzondering van eenden en zwanen, veelal geen sluitend antwoord worden gegeven. Zowel bij mannelijke als vrouwelijke vogels is er een cloaca aanwezig. In deze lichaamsholte komen de intestinale, urinaire en voortplantingstractus samen. Differentiëren van geslachten is nog moeilijker bij jonge en juveniele vogels. In het juveniele stadium zijn de uitwendige geslachtsspecifieke merkers nog niet aanwezig. In geval van nestjongen valt er geen uiterlijk geslachtsonderscheid te maken in bijna alle 10000 vogelspecies die de wereld kent. Er zijn twee grote types van vogeljongen: nestvlieders enerzijds, die robuuster ontwikkeld zijn en bedekt met dons, en nestblijvers anderzijds, die naakt, hulpeloos, en volledig afhankelijk zijn van hun ouders. Dit is vooral van belang in geval van dierentuinen of in het kader van instandhouding van soorten, waar het met de hand opkweken van de jongen cruciaal is, en bijzondere aandacht belangrijk is voor mannetjes of wijfjes die kleinere overlevingskansen hebben door bijvoorbeeld ziekte of uithongering. Op latere leeftijd, wanneer de vogels uitgewisseld worden om commerciële of doelbewuste fokredenen, is geslachtsbepaling essentieel voor paarvorming (Griffiths, 2000a). Geslachtdifferentiatie is eveneens belangrijk in wetenschappelijke studies over vogels. We weten dat beide geslachten fysiologisch en ethologisch van elkaar verschillen en elk onderhevig zijn aan een specifieke seksuele competitie om te kunnen voortplanten. Het is dan ook geen verrassing dat onderzoeksresultaten hierdoor beïnvloed worden. Dit moet in rekenschap worden gehouden. Hiernaast bestaan er hypotheses aangaande selectie van de jongen op basis van hun geslacht door de ouders, die niet onderzocht kunnen worden indien het geslacht van de nestjongen niet bepaald kan worden. In sommige langdurige studies gaat een groot deel aan potentiële informatie verloren omwille van dit differentiatieprobleem (Dhondt, 1970). Of het nu over fokkerij, soortenbehoud of wetenschappelijk onderzoek gaat, geslachtsbepaling bij vogels kan een significant en groot probleem vormen (Griffiths, 2000a). Het is de bedoeling om in deze casus de meest courante technieken te bespreken ten einde het geslacht van vogels te bepalen. Differentiatie op basis van geslachtsspecifiek gedrag en differentiatie bij industrieel pluimvee, worden niet beschouwd.

2

2. LITERATUURSTUDIE

2.1. KUNNEN VOGELS HET GESLACHT VAN HUN NAGESLACHT BEPALEN? Het eerste voorbeeld is afkomstig van een wetenschappelijk experiment. Deze studie toonde aan dat vogels de mogelijkheid hebben om het geslacht van hun nakomelingen te controleren, wat op zich een markant talent is. Twee studies gingen hieraan vooraf. De eerste werd uitgevoerd door Trivers en Willard in 1973 en was van toepassing op jonge vogels die nog afhankelijk waren van hun ouders. Ze suggereerden dat dieren de geslachtsverhouding van hun nageslacht zouden kunnen aanpassen afhankelijk van de omstandigheden waarin ze leven. Dit betekent bijvoorbeeld dat indien één geslacht beter zou opgewassen zijn tegen predatoren, dat er bijgevolg van dit geslacht meer nakomelingen zouden geproduceerd worden indien de concentratie aan predatoren hoger is. Dit lijkt een vrij evident principe, maar het is moeilijk voor een dier om deze respons tot uiting te brengen aangezien dit strikte genetische en evolutionaire principes zou beïnvloeden en ombuigen. Het mechanisme dat bijvoorbeeld van toepassing is bij gameetproductie zorgt dat er een 1:1 verhouding bestaat. Daarbij komt dat het nageslacht zelf, mannetjes en wijfjes, op een evenwaardige manier in onderlinge competitie zijn om te overleven. Ondanks dit, deden Trivers en Willard een correlatiestudie bij edelherten (Cervus elaphus) om hun theorie te ondersteunen. Deze was gebaseerd op het concept dat als een moeder een vrouwelijk dier ter wereld bracht, dit bijna altijd zou voortplanten. Daarentegen, als ze een mannelijk dier produceerde, zou dit groot en sterk genoeg moeten worden om een harem te verdedigen indien het zou willen voortplanten. Zodoende toonden ze aan dat een goed doorvoede hinde die de mogelijkheid had om sterke, gezonde nakomelingen te produceren, geneigd was een mannelijk dier op de wereld te zetten, terwijl een minder goed doorvoede hinde meer geneigd was vrouwelijke dieren te baren. Beide hinden hanteren de voor hen beste strategie om een maximum aantal nakomelingen te verkrijgen, maar dit heeft wel een impact op de geslachtsverhoudingen die geproduceerd worden (Trivers en Willard, 1973). Ondanks de opwinding die dit gegeven met zich meebracht, leek het nog steeds onmogelijk om geslachtsselectie bij vogels te testen aangezien het geslacht van jonge vogels toen nog niet bepaald kon worden (Gowaty, 1991; Oddie, 1998). Bijgevolg faalden alle pogingen om dit aan te tonen in studies. De tweede wetenschappelijke bijdrage kwam van wetenschappers van de universiteit van Glasgow die onderzoek deden op de kleine mantelmeeuw (Larus fuscus). Deze studie begon op Skomer Island in Wales en belichtte de geslachtsverhoudingen van meeuwenjongen. Ze toonden aan dat in tijden van voedselschaarste gedurende de opfokperiode, vrouwelijke vogels veel beter overleefden dan mannelijke vogels (Griffiths, 1992). Deze bevinding bewees rechtstreeks het geslachtsgebonden verschil in overlevingskansen van de jongen dat Trivers en Willard voorspelden.

3

De theorie en de praktijkbevindingen bij de mantelmeeuwen werden samengebracht door geslachtsbepaling via chromo-helicase-DNA-binding (CHD)-proteïnen. Het experiment gebruikte twee groepen van opnieuw kleine mantelmeeuwen. Deze vogelsoort produceert normalerwijze een legsel van drie eieren. Na de leg, werden de eieren verwijderd in beide groepen wat voedselstress induceert. Dit brengt de wijfjesmeeuwen namelijk in een stresstoestand omdat ze dan genoeg voedsel moeten zoeken om opnieuw dooier te kunnen genereren voor een nieuw legsel. Voor de vogel creëert dit een gevoel van voedselschaarste. In één groep werd niet ingegrepen, in de tweede groep werd op artificiële wijze extra voedsel verschaft om met het verwijderen van de eieren te kunnen omgaan. Deze laatste groep vormde de controlegroep en hun behandeling gaf de zekerheid dat de geobserveerde respons niet aan menselijke verstoring lag. Het manipulatie-effect werd geregistreerd door het gewicht van de eieren te meten, waarvan geweten is dat dit sterk gerelateerd is aan de toestand waarin de vogels zich bevinden (Bolton et al., 1993). Het normale gewicht van de eerste drie, manueel verwijderde meeuweneieren bedroeg 78-81g. Wanneer deze werden weggenomen, nam het gewicht van de eieren in het daaropvolgende legsel af tot 7374g. Dit gaf aan dat er inderdaad voedselstress was. Het gewicht van de eieren van de bijgevoederde mantelmeeuwen bedroeg 78-79g, wat normaal is en amper verschilt van een eerste legsel. Dit betekende dat de voedselstress binnen de controlegroep weinig effect had. Vervolgens werd het geslacht bepaald van de eieren die de meeuwen als tweede legsel produceerden, en de bevindingen waren zoals Trivers en Willard voorspelden. Bij de bijgevoederde mantelmeeuwen bleef de geslachtsverhouding 1:1 gedurende de legperiode. In de groep van de meeuwen met voedselstress werd een significant groter aantal vrouwelijke nakomelingen geproduceerd tot een verhouding van 3:1 (Nager et al, 1999). Hierbij dient vermeld te worden dat deze geslachtsverhouding aanwezig was bij eieren kort nadat ze gelegd werden. Dit bewijst dat deze vogelsoort niet alleen de overlevingskansen van hun jongen bepaalt, maar ook het geslacht produceert dat nodig is. Ze leggen eieren van het juiste geslacht. Echter, de getrokken conclusies van voorgaande studie dienen we toch te kaderen. De laatste jaren zijn er heel wat studies geweest die concludeerden dat vogels de mogelijkheid hebben om het rigide chromosomale geslachtsdeterminatieproces te manipuleren. Hoewel veel van deze studies daar geen twijfel over doen bestaan, blijft het nog maar zeer de vraag welke precieze mechanismen dit fenomeen veroorzaken. Deze aan het licht brengen is niet gemakkelijk aangezien een hele verscheidenheid aan invloeden (milieu, sociaal, kwaliteit van de ouders) aangehaald wordt wat betreft geslachtsmanipulatie, en er geen specifieke reden is om aan te nemen dat deze mechanismen standvastig zijn tussen alle vogelsoorten die hiertoe in staat zijn. De reproductieve biologie heeft recentelijk aangetoond dat er verschillende manieren bestaan waarop gonadotropines en steroïdhormonen een effect zouden hebben op de geslachtsratio. Deze hormonen staan echter onder invloed van talrijke factoren. Desalniettemin worden er een aantal intrigerende hypothesen naar voor geschoven.

Bij

vogels

is

het

wijfje

heterogameet

en

niet-Mendeliaanse

scheiding

van

geslachtschromosomen zou onder maternale controle kunnen staan. Een andere suggestie is dat follikels die uiteindelijk mannetjes en wijfjes teweegbrengen op een verschillend tempo groeien. 4

Vrouwelijke vogels zouden embryo’s selectief kunnen aborteren of eieren van een bepaald geslacht dumpen, bepaalde ova een kans tot fertilisatie, ovulatie of zygotevorming kunnen ontzeggen, of selectief bepaalde eieren als proviand aanwenden zodat er een geslachtsspecifieke embryonale mortaliteit bestaat. Deze hypothesen zouden zowel experimenteel (ethologisch en fysiologisch) als theoretisch moeten getoetst worden. Tot dan is er geen sluitend bewijs dat geslachtsvariaties het gevolg zijn van fysiologische remming of van adaptaties (Sheldon, 1998). 2.2. TECHNIEKEN OM HET GESLACHT VAN MONOMORFE VOGELSOORTEN TE BEPALEN 2.2.1.Vocalisatie Het produceren van zang is een zeer betrouwbare manier om vogels te identificeren en het geslacht te bepalen. Bij de meeste soorten zingt enkel het mannetje, maar in enkele (bv. rode kardinaal (Cardinalis cardinalis) en Oostelijke bospiewie (Contopus virens)) soorten zullen ook wijfjes occasioneel zingen. Een vogel die zingt is bijgevolg niet noodzakelijk mannelijk. Leeftijdsbepaling op basis van zang is niet betrouwbaar, hoewel sommige juveniele vogels incompleet of ongewoon zingen. Naast zingen, kunnen beide geslachten bij de meeste soorten, tal van andere geluiden voortbrengen, die vaak typerend zijn en een grote hulp kunnen bieden wanneer andere technieken onmogelijk uit te voeren zijn. Zo kan men sterk op elkaar gelijkende soorten differentiëren, bijvoorbeeld de Amerikaanse kraai (Corvus brachyrhynchos) en viskraai (Corvus ossifragus), de geelkaakweidespreeuw (Sturnella neglecta) en witkaakweidespreeuw (Sturnella Magna), de wilgenfeetiran (Empidonax traillii) en elzenfeetiran (Empidonax alnorum), enz. De zang van veel soorten varieert afhankelijk van de geografische verspreiding. Deze ‘dialecten’ worden vaak geassocieerd met ondersoorten, en vormen soms een betrouwbaar kenmerk om sommige soorten te identificeren (bv. kruisbek). Vocalisaties vormen voor onderzoekers een eerste middel – en zeker indien het visueel aspect geen info verschaft – om geslachten te identificeren. Op dit moment wordt aangenomen dat cognitieve en ethologische geslachtsverschillen, zoals akoestische communicatie, niet het resultaat zijn van rechtstreekse genoominwerking, maar ontwikkelen als gevolg van een vroege blootstelling aan een verschillend, geslachtstypisch endocrien milieu. De mechanismen van hormooninwerking op de zang en het zanggedrag, zijn nog onduidelijk. Wat wel duidelijk is, is dat er nieuwe benaderingen noodzakelijk zijn om geslachtsgebonden differentiatie van de telencefale vocalisatieregio beter te begrijpen (Balthazart en Ball, 1995). 2.2.2.Aanwezigheid van een broedvlek of promontorium cloacale Promontorium cloacale In het broedseizoen vormt bij mannelijke zangvogels (Passeriformes) het distale uiteinde van de ductus deferens een ronde massa, de seminale glomus, die beiderzijds uitpuilt in de cloaca en vorm geeft aan het cloacale promontorium. Het promontorium cloacale dient om sperma in op te slaan en als hulp bij copulatie. Een typisch promontorium cloacale vormt een rechte hoek met het abdomen en is ietwat groter aan het distale einde dan aan het proximale einde. Sommige wijfjes hebben een

5

gezwollen cloaca maar deze is minder groot als het promontorium cloacale van het mannetje. Aan de hand van deze verdikkingen kan men bij passeriformen dan ook het geslacht bepalen. De glomera zijn de voornaamste spermareservoirs bij deze vogelsoorten en bewaren het sperma tot 4°C beneden de lichaamstemperatuur, wat de levensvatbaarheid van de spermatozoa positief beïnvloedt (Crosta et al., 2003; Pollock en Orosz, 2002). Bij alle andere vogelspecies vormt de ductus deferens het voornaamste spermareservoir. Buiten het broedseizoen is deze methode van geslachtsbepaling onbetrouwbaar en nog niet bewezen. Men zoekt bij voorkeur naar aanvullende technieken (Pollock en Orosz, 2002). Broedvlek Een broedvlek is een vederloze, kale huidvlek die enkel zichtbaar is aan de ventrale, thoracale en abdominale regio van vogels gedurende de broedperiode. Deze vlek is sterk gevasculariseerd aan de oppervlakte zodat warmtetransport plaatsvindt naar de geïncubeerde eieren. De bloedvaten nemen toe in aantal en grootte, de huid wordt dikker en oedemateus. Bij de meeste vogelsoorten lossen de veren spontaan maar ganzen en eenden plukken de veren en verwerken ze in het nest. De veren in deze regio groeien terug vlak nadat de eieren uitkippen bij nestvlieders, in geval van nestblijvers kan het teruggroeien uitgesteld worden tot de herfstrui. De positie van de broedvlek kan variëren. De meeste soorten hebben één enkele vlek centraal op het abdomen, terwijl sommige kustvogels een vlek hebben aan elke kant van het abdomen. Meeuwen en hoenders kunnen drie broedvlekken hebben. Pelikanen, pinguins en genten ontwikkelen geen broedvlekken, maar incuberen de eieren op hun poten. Broedparasieten zoals koekoeken ontwikkelen geen broedvlek. Bij zangvogels ontwikkelt enkel het wijfje een broedvlek. Bij soorten waar beide ouders broeden, kan er bij beide geslachten een broedvlek voorkomen (Fischert et al., 2006). 2.2.3.Moleculaire geslachtsbepaling: DNA-typering DNA-typering werd een veelbelovende geslachtsbepalingsmethode na ontwikkelingen in de DNAtechnologie. De meeste DNA-technieken zijn gebaseerd op polymerase chain reaction (PCR). In de jaren 70’ en 80’ waren DNA-onderzoek en technieken moeilijk, duur en traag. Echter, met de ontwikkeling van nieuwe technieken, werd DNA-onderzoek veel gemakkelijker, goedkoper en sneller. De uitvinding van PCR door Kary Mullis midden jaren 80’, betekende een ware revolutie in de genetica. PCR is ontegensprekelijk één van de meest belangrijke instrumenten geworden voor moleculaire biologen (Alberts et al., 2002; Russel, 2002; Klug en Cummings, 2000). Bloed, met daarin erythrocyten als bron voor DNA, en veren, liefst groeiende of dons, kunnen als staal gebruikt worden om met PCR te onderzoeken (Figuur 1). Omdat de erythrocyten van vogels gekernd zijn en bijgevolg het bloed ongewoon rijk is aan nucleair DNA, is slechts een geringe hoeveelheid nodig: ongeveer 10µl tot 80µl bloed, wat ongeveer overeenkomt met één tot twee bloeddruppels. Het bloed wordt, afhankelijk van de soort en leeftijd, meestal gecollecteerd door punctie van vleugel- of pootvenen. DNA-extractie van veren is moeilijker dan van weefsels omdat enkel het basale uiteinde van de calamus, of een bloedklonter in de schacht, DNA bevat. Bij volgroeide veren vindt men aan de 6

buitenzijde huidcellen terug, terwijl de binnenzijde oude bloedcellen bevat van toen de veer nog groeide (Honkatukia et al., 2003). In vergelijking met bloedname, zijn er meer voordelen aan het verzamelen van veren verbonden: de onderzoekers in het veld hebben minder opleiding nodig, de vogels dienen minder gemanipuleerd te worden, er wordt minder gevaarlijk afval gegenereerd en de opslagprocedures zijn eenvoudiger. Nadelig is vooral de relatief lagere DNA-hoeveelheid aanwezig in veren. Ook de kwaliteit is lager indien het DNA afkomstig is van afgestorven cellen van toen de veer nog in de groeifase was, zoals pulpcellen binnenin de rachis. Algemeen kan men stellen dat de juiste hoeveelheid weefselcellen die nodig is voor staalanalyse, effectief kan verkregen worden van 3 tot 5 versgeplukte borstveren. Echter, dit aantal varieert afhankelijk van de vogelsoort en de grootte van de veren. Veren kunnen bevroren worden tot het moment van analyse (Malagó et al., 2002). DNAextractie uit veren reduceert stress bij de vogel en excessief bloedverlies wordt vermeden (Cerit en Avanus, 2007). Van dode volwassen vogels, nestjongen en embryo’s neemt men stalen van de lever en hersenen.

Figuur 1: De drie fasen bij de standaard PCR-techniek: 1) denaturatie, 2) hybridisatie en 3) exponentiële vermenigvuldiging (Balzer en Hirsch, 2007). DNA-stalen dienen bewaard te worden onder omstandigheden die DNA-degradatie voorkomen. Meestal worden ze bewaard in 96% ethanol, EDTA-buffer of Queens lysis buffer (bestaande uit Tris, NaCl, EDTA, n-lauroylsarcosine en ultrapuur water) (Seutin et al., 1991). DNA in ethanol is stabiel bij kamertemperatuur en kan zo verschillende jaren bewaard worden. De stabiliteit van DNA kan nog verlengd worden door de stalen in te vriezen aan -20 tot -80°C. Bloedstalen in EDTA bewaart men bij 4°C - indien ze snel geanalyseerd dienen te worden na staalname – of in een diepvriezer. Stalen in

7

een Queen lysis buffer houdt men op kamertemperatuur. Een alternatieve methode is de FTA® kaart. Deze bestaat uit een filterpapier dat geïmpregneerd is met een mengeling van chemicaliën die de bacteriële groei remmen en het DNA in het staal beschermen. Deze kaarten verzekeren een lange houdbaarheid en bewaring bij kamertemperatuur. Ze worden vooral aangewend bij humaan forensisch onderzoek (Anna en Magdalena, 2006). De wijzen van staalname zijn divers en verschillen in effectiviteit, prijs en arbeidsintensiviteit. Deze zaken, samen met de gekozen geslachtsbepalingstechniek, bepalen welke extractiemethode het meest wenselijk is. Een grote variëteit aan commerciële kits is voor handen. Deze zijn echter niet goedkoop, wat de totaalkost - om op grootschalige wijze geslachtsbepaling uit te voeren - sterk doet toenemen. Goedkopere alternatieven zijn: fenol-chloroform, guanidiumthiocyanaat en Chelexextractie. De eerste twee methoden zijn zeer intensief, tijdrovend en maken gebruik van risicovolle substanties. Daarentegen wordt wel hoogwaardig DNA verkregen, zowel kwantitatief als kwalitatief. Chelex-extracties zijn snel en geven DNA van goede kwaliteit, wat belangrijk is indien zeer snel geslachtsresultaten nodig zijn (Anna en Magdalena, 2006). 2.2.3.1. Geslachtsbepalingstechnieken gebaseerd op Polymerase Chain Reaction (PCR) Random amplification of polymorphic DNA (RAPD) RAPD is een type van PCR waarbij genoomsegmenten at random vermenigvuldigd worden. Er is dus geen voorgaande kennis van de DNA-sequentie van het doelfragment nodig, aangezien de primers at random zullen binden. Onder primer verstaan we een klein stukje DNA dat gebruikt wordt als startpunt voor de PCR. Er zijn steeds twee primers nodig: één voor de 5'-streng en één voor de 3'-streng. De beste primer is een kort fragment, waarvan de sequentie alleen overeenkomt met het stuk DNA dat men wil vermenigvuldigen. Is dit niet het geval, dan zal de primer op meerdere plaatsen binden aan het DNA en dus stukken gaan dupliceren die niet gewenst zijn. De onderzoeker die RAPD uitvoert, maakt gebruik van enkelvoudige en willekeurig gekozen primers van 10 nucleotiden lengte (kleiner of langer kan ook). Omdat een grote hoeveelheid intact DNA-genoom hierbij vereist is, zullen gedegradeerde DNA-stalen niet voldoen. De resolving power, of kwantitatieve meting van de resolutie bij electroforese, is lager bij RAPD dan bij doelbewuste, soortspecifieke methoden om DNA te vergelijken, zoals tandemherhalingen.

De temperatuur waarbij primers en enkelvoudige DNA-

strengen aan elkaar hechten is laag (tussen 35-40°C), wat typerend is voor deze techniek. Eén van de gevolgen van deze lage hechttemperatuur, is dat één of beide primers gaan hechten aan andere sequenties dan de doelsequentie. Dit kunnen aanhechtingsfouten zijn van één base, of slechts gedeeltelijke hechting van de primers aan de doelsequentie. Hierdoor wordt de specificiteit en de herhaalbaarheid van de resultaten van de reactie gereduceerd, aangezien er ook niet-specifieke vermenigvuldiging is. Wanneer de hechttemperatuur te hoog is, bestaat het risico dat de primerhechting aan de doelsequenties daalt. Een lage hechttemperatuur zorgt er voor dat een grote variëteit aan genoomfragmenten geamplificeerd kan worden (Williams et al., 1990; Williams et al., 1993). Wanneer één van de banden op de gel specifiek is voor wijfjes, vertegenwoordigd deze heel

8

waarschijnlijk een sequentie die gebonden is aan het W-chromosoom (Griffiths en Tiwari, 1993). Een PCR-reactie met één enkele primer vermenigvuldigt normaliter 10 tot 20 DNA-fragmenten. Om die reden starten RAPD-analyses met het testen van enkele tientallen primers, ten einde enkel en alleen de primers te detecteren die producten specifiek voor vrouwelijke vogels vermenigvuldigen. Ondanks de grote hoeveelheid geteste primers, kan het zijn dat er geen wijfjesspecifiek product gevonden wordt. Zo konden Lessells en Mateman (1998) geen geschikte primers identificeren bij 3 van de 10 door hen bestudeerde soorten, na het screenen van wel 69 verschillende primers per soort. Een polymorfie is een veranderde nucleotidencode voor een bepaald gen die bij een groot percentage van de populatie voorkomt, zodat niet meer van een mutatie kan worden gesproken. Volgens de definitie komen polymorfieën bij meer dan 1% van de populatie voor. In geval van meer zeldzame genveranderingen (<1%) wordt van mutaties gesproken. Polymorfieën kunnen vaak heel kleine varianten zijn van bijvoorbeeld één nucleotide lang, maar ze kunnen ook veel groter zijn, zoals microsatellieten, grote deleties of duplicaties. Aangezien RAPD ontwikkeld werd om genetisch polymorfisme te onderzoeken, is het goed mogelijk dat de verschillen tussen de twee geslachten enkel veroorzaakt worden door autosomaal of Z-chromosomaal gelegen genen (Williams et al., 1990). Om geslachten te differentiëren maakt men gebruik van merkers. Dit zijn delen van DNA-sequenties die voor beide geslachten hetzelfde zijn, en voor beide geslachten verschillen. De stukken die gelijk zijn maken het mogelijk het onderdeel te herkennen tussen de rest van het DNA. De individuele stukken zijn van verschillende lengte, afhankelijk van het geslacht. Deze stukken maken het identificeren van geslachten mogelijk. Merkers worden aangeduid met letters en cijfers. Een andere RAPD-gebaseerde methode is bulked segregant analysis (BSA). Om de merker te lokaliseren die hoogst waarschijnlijk gebonden is aan het W-chromosoom, gaat men DNA-stalen verenigen van individuen van éénzelfde geslacht (=pooled DNA). Dit gegroepeerd staal bevat DNA van individuen waarvan geweten is dat ze één bepaald kenmerk gemeen hebben. Dit wordt dan vergeleken met een gegroepeerd staal van individuen waarvan geweten is dat ze dit kenmerk niet hebben. Op deze wijze wordt het merendeel van de normaal voorkomende polymorfismen in een populatie geamplificeerd binnen elke pool, wat toelaat de producten te identificeren die enkel teruggevonden worden in de vrouwelijke pool (Michelmore et al., 1991). Normaalgezien worden de PCR-producten van een verenigd staal van 3 tot 5 mannetjes vergeleken met de PCR-producten van een verenigd staal van 3 tot 5 wijfjes. De DNA-fragmenten zijn opgelost op een agarose of polyacrylamide-gel en fragmenten geselecteerd als geslachtsspecifieke merker zouden in de 4 meest intensieve banden op de gel moeten gelegen zijn (Griffiths, 2000b). Enkele voor- en nadelen zijn eigen aan de RAPD-techniek. Zo kan de betrouwbaarheid van RAPDmerkers in vraag worden gesteld. Hun lage reproduceerbaarheid, gevoeligheid voor reactieve omstandigheden

en/of

competitie

met

andere

DNA-fragmenten,

veroorzaakt

een

zwakker

bandenpatroon dat onzichtbaar wordt in de aanwezigheid van heldere polymorfische banden. Vele wetenschappelijke tijdschriften accepteren geen experimenten meer die zuiver en alleen op RAPD gebaseerd zijn. Het feit dat deze techniek vrij simpel en goedkoop uit te voeren is, maakt het gebruik van RAPD-merkers echter aantrekkelijk (Lessells and Mateman, 1998). Omdat de primerlengte de 9

lengte van het doelfragment bepaalt, kunnen kortere primers veel meer doelfragmenten tegenkomen en hierdoor de kans op het amplificeren van een geslachtsspecifieke locus verhogen (Griffiths and Tiwari, 1993). Volgens Griffiths en Tiwari (1993) zou deze methode soortspecifiek zijn. Amplification fragment length polymorphism (AFLP) De AFLP-techniek is een identificatietechniek om het genoom van verschillende organismen van elkaar te kunnen onderscheiden en genotyperen. Zuiver DNA met een hoog moleculair gewicht is vereist. De techniek combineert PCR met willekeurig gekozen primers, met het knippen van DNA door restrictie-enzymen (Vos et al., 1995). Eén enkele reactie resulteert in ongeveer 100 DNA-fragmenten. De eerste stap van de AFLP-techniek bestaat uit DNA knippen met 2 verschillende endonucleasen: één die 4 basen knipt en één die er 6 knipt. De volgende stap is ligatie, waarbij stukjes kunstmatig gesynthetiseerd DNA (oligonucleotide-adapters van 20-30bp) hechten aan de coherente uiteinden geproduceerd

door

de

endonucleasen.

Voor

de

daaropvolgende

PCR-reactie

worden primers toegevoegd die de adaptersequentie herkennen. De DNA-fragmenten worden samen met

de

adapters

vermenigvuldigd

in

de

PCR-reactie.

Mochten

alle

restrictiefragmenten

vermenigvuldigd worden, zou op de gel een zeer complex, nutteloos patroon worden verkregen. Daarom zal men het aantal geamplificeerde restrictiefragmenten regelen door aan de primers één of meerdere extra nucleotiden toe te voegen (sticky ends). Dit differentieert de fragmentenpoel van het originele mengsel. Tot slot kunnen de geamplificeerde fragmenten gedetecteerd worden via capillairelectroforese. Hierbij worden de fragmenten gescheiden tijdens migratie door een polymeer in een capillair. De eigenlijke detectie gebeurt met een laserstraal die de fluorescentie van de fluorescerende primers meet. Aan elk AFLP-product wordt een interne standaard toegevoegd zodat de lengte van de fragmenten berekend kan worden. Een andere methode van scheiden van fragmenten maakt gebruik van een gelmatrix waar de (radioactief) gelabelde monsters door middel van elektrische stroom doorheen worden getrokken. Detectie gebeurt dan door de hele gel te belichten tegen een fotografische plaat of een scanner die gevoelig is voor de radioactieve of fluorescerende signalen. Net zoals bij de RAPD is de identificatie van geslachtsgebonden merkers moeilijk omwille van het grote polymorfisme van DNA-sequenties. Het is echter niet aangeraden, in tegenstelling tot RAPD, om DNA-stalen te groeperen om wijfjesgebonden fragmenten te detecteren (pooled-DNA). Dit omdat de PCR-producten niet altijd alle individuele stalen vertegenwoordigen in het verenigde DNA omwille van de selectieve primers (Griffiths, 2000). Bij zowel RAPD als AFLP wordt geadviseerd om een positieve controle te selecteren: een minder intense band op de gel, verkregen door amplificatie van een DNAfragment dat groter en lager is van intensiteit dan geslachtsspecifieke fragmenten (Griffiths, 2000). De positieve controle is noodzakelijk om foute geslachtsbepaling uit te kunnen sluiten. Deze situatie kan men bekomen wanneer een niet-optimale PCR-reactie resulteert in een niet-zichtbare W-gebonden merker, waardoor wijfjes foutief voor mannelijke vogels worden aanzien (Sabo et al., 1994). Een mannelijk DNA-profiel kan enkel en alleen vastgesteld worden wanneer er een positieve controle aanwezig is, en een wijfjesspecifieke sequentie afwezig is op de gel. W-gebonden sequenties gelokaliseerd bij RAPD en AFLP, kunnen ook aangewend worden om primers te ontwikkelen die vervolgens gebruikt worden in een standaard PCR (sequence characterised amplified region of 10

SCAR). Door toepassing van zulke primers zou de geslachtsbepalingsprocedure via PCR aanzienlijk vergemakkelijken én goedkoper worden, wanneer men vergelijkt met de AFLP-techniek. PCR zou in dit geval resulteren in één band bij vrouwelijke vogels en geen banden bij mannelijke vogels, bijgevolg is een positieve controle vereist. Dit wordt bereikt door de primers te selecteren die een DNA-fragment amplificeren in zowel vrouwelijke als mannelijke vogels, wat succesvol samen toegepast kan worden met het primerpaar gericht op een W-gebonden sequentie in een multiplex-PCR. De primers die ontwikkeld werden op basis van de W-gebonden sequentie en gedetecteerd door AFLP, worden met succes ingezet om vrouwelijke en mannelijke struisvogels (Struthio camelus) te onderscheiden. Bij deze soort, alsook andere loopvogels (ratites), kunnen de geslachten niet gedifferentieerd worden op basis van CHD-gebaseerde PCR omdat de geslachtschromosomen niet te differentiëren zijn (Griffiths en Orr, 1999). 2.2.3.2. CHD-genen CHD-gen coderend voor chromo-helicase DNA binding protein 1, was het eerste gen dat ontdekt werd op het W-chromosoom van vrouwelijke vogels (CHD-W) (Griffiths en Tiwari, 1995). CHD-Z, gelokaliseerd op het Z-chromosoom (Griffiths en Korn 1997), is aanwezig bij beide geslachten (mannnelijk ZZ; vrouwelijk WZ). CDH-Z en CDH-W genen ontwikkelen onafhankelijk van elkaar. Het is geweten dat CDH1-Z en CHD1W proteïnestructuren sterk op elkaar gelijken wat betreft aminozurensequenties. Er zijn heel weinig verschillen tussen CHD1-Z en CHD1-W proteïnes (Fridolfsson en Ellegren 1998). Het helicasedomein van het CDH-gen ligt erg vast. Moleculaire evoluties van CDH-Z en CDH-W genen worden op verschillende manieren beïnvloed door hun lokatie op het genoom (Fridolfsson en Ellegren, 1999). Garcia-Moreno en Mindell (2000) toonden aan dat fylogenetische analyse heel bruikbaar is om gerelateerde genen te bepalen in tegengestelde chromosomen. Bij de meeste vogelsoorten is het CHD-gen langer in het W-chromosoom dan in het Z-chromosoom omwille van additionele DNA-bases in de intronregio. Dit gaat niet op voor sternen, purperkoeten en de meeste uilen en valken, waarbij de intronregio in het CHD-W en CHD-Z gen van gelijke grootte zijn (Griffiths et al., 1998; Kahn et al., 1998). CHD leent zich uitermate goed voor DNA-geslachtsbepaling. Aangezien CHD-Z en CHD-W dimorfische geslachtsgenen zijn bij de meeste vogelsoorten, werden deze genen vaak vermeerderd via PCR (Griffiths et al., 1998; Kahn et al., 1998; Fridolfsson and Ellegren, 1999). Er werden talloze primers gemaakt om het verschil in introngrootte in deze CHD-genen te screenen. De meest gebruikte primerparen voor geslachtsbepaling waren P2-P8 (Griffiths et al., 1998) en 1237L - 1237H (Kahn et al., 1998). Birkhead et al. (2001) rapporteerden dat P2 en P8-primerparen met succes aangewend werden

om

het

geslacht

te

bepalen

van

zeekoeten

(Uria

aalge).

Ook

waren

er

geslachtsbepalingsprojecten met oog op soortenbehoud (flamingo’s, trompetkraanvogels, toekans, parkieten, ara’s, gieren van de Oude Wereld, hokko’s, etc.) (Jensen et al., 2003). Jensen et al. (2003) vonden eveneens dat de lengte van de CHDW en CHDZ-introns verschilt tussen soorten. W-introns zijn groter dan Z-introns bij de meeste vogelsoorten die getest werden via P2-P8 en 1237L-1237H

11

primerparen. Bij de kleine lepelaar (Platalea minor) - één van de 50 zeldzaamste vogelsoorten in de wereld - bleken deze primerparen evenwel niet geschikt te zijn (Cheng et al., 2006). Bij loopvogels, zoals de emoe (Dromaius novaehollandia) en de struisvogel (Struthio camelus), hebben zowel mannelijke als vrouwelijke vogels identieke CHDW en CHDZ-genen, waardoor ze beiden zichtbaar zijn als enkelvoudige band bij gebruik van 1237L-1237H (Kahn et al., 1998) en P2–P8 (Griffiths et al., 1998) primerparen. Echter, bij loopvogels vermeerderden de CHD-genen niet door gebruik van P2-P8 primers. SS en OSM5-primers lieten daarentegen wel geslachtsdifferentiatie toe bij struisvogels (Malagó et al., 2002). Cerit and Avanus (2007) identificeerden het geslacht van valkparkieten (Nymphicus hollandicus) door toepassing van P2-P8 primerparen. Vrouwelijke vogels hebben heterogene geslachtschromosomen en beschikken over twee allelen (ZW); mannelijke vogels hebben homogene geslachtschromosomen en beschikken over twee kopie’s van hetzelfde allel (ZZ). Hierdoor zullen dubbele en enkelvoudige banden – zichtbaar op een 5% agarosegel elektroforese - respectievelijk behoren tot vrouwelijke en mannelijke individuen (figuur 2).

Figuur 2: Vermeerderd door gebruik te maken van P2-P8 primers, vertonen de PCR-producten een bandenpatroon van vrouwelijke en mannelijke valkparkieten (Nymphicus hollandicus). Van links naar rechts: een pUC19 merker, een man, drie wijfjes en twee mannen (Cerit and Avanus, 2007). Additioneel aan de studies over CHD, werden USP1 en USP3-primers gebruikt om een specifiek vrouwelijk DNA-fragment te vermeerderen bij alle vogelsoorten die een carina op het sternum hebben (Carinatae) (Ogawa et al., 1997). Deze USP-primers faalden om het geslacht te bepalen bij nietgalliformen zoals de zwartsnavelooievaar (Ciconia boyciana) en gieren van de Oude Wereld (monniksgier (Aegypius monachus), Vale gier (Gyps fulvus) en oorgier (Torgos tracheliotus)). Griffiths en Tiwari (1995) schreven dat de veren van de Spix’ ara (Cyanopsitta spixii) gebruikt kunnen worden voor geslachtsbepaling wanneer de PCR-techniek gecombineerd wordt met restrictie-enzymen. 12

2.2.3.3. Geslachtsbepalingstechnieken gebaseerd op DNA-hybridisatie Het W-chromosoom heeft een grote proportie aan repetitieve sequenties, die onderzocht kunnen worden voor W-gebonden merkers. Deze repetitieve sequenties omvatten ook tandemherhalingen: micro- en minisattelieten. Microsattelieten vormen clusters van gewoonlijk minder dan 150 basenparen (bp), met herhalende eenheden tot 13bp, terwijl minisattelieten langer zijn, met clusters tot 20kb en herhalende eenheden tot 25bp (Brown, 2002). Om micro- en minisattelieten te detecteren die geslachtsgebonden zijn, wordt DNA geknipt met restrictie-enzymen, die het DNA op specifieke plaatsen gaan knippen afhankelijk van de nucleotidensequentie. De verkregen DNA-fragmenten worden op basis van grootte gescheiden via electroforese op een agarosegel, en overgebracht naar een nylonmembraan (Southern blotting) dat vervolgens geïncubeerd wordt in een oplossing met probes (=gelabelde DNA-fragmenten). De probes hybridiseren met het DNA afkomstig van het genoom en zetten zich vast op de complementaire sequenties. De hybridisatie wordt gedetecteerd afhankelijk van de wijze waarop de probe gelabeld is: radioactief, fluorescerend of enzymatisch (gewoonlijk radioactief met 32P of met biotine). Als resultaat bekomt men een specifiek profiel van DNA-fragmenten. Om te visualiseren of de probe wijfjesspecifieke fragmenten produceert, dienen referentieprofielen van mannelijke en vrouwelijke vogels te worden vergeleken (Anna en Magdalena, 2006). Bij duiven en kippen werd bijvoorbeeld een trinucleotide-herhaling (TCC)n aangetoond als zijnde geslachtsgebonden (Epplen et al., 1991). Longmire et al. (1993) testten 4 probes: 3 dinucleotideherhalingen (CT)n, (GT)n, (CG)n en 1 trinucleotide-herhaling (TCC)n in combinatie met telkens 1 van de 3 restrictie-enzymen (Haelll, Hinfl, Pstl) in 9 vogelsoorten afkomstig uit 6 ordes. De beste probe (CT)n detecteerde wijfjesgebonden sequenties in 6 soorten, terwijl de dinucleotide-herhaling (CG)n geen enkel geslachtsgebonden fragment produceerde, bij geen enkele soort. De meest gebruikte minisattelietmerkers bevatten probe 33.15 (Jeffreys et al., 1985). Miyaki et al. (1997), die deze probe aanwendden bij 36 Zuid-Amerikaanse parkietensoorten van 13 geslachten, konden wijfjesgebonden fragmenten identificeren bij 28 soorten. Elk van deze soorten toonde een set wijfjesgebonden fragmenten

(tussen

2

en

4),

specifiek

voor

de

desbetreffende

soort.

Nucleaire

microsattelietamplificatie van DNA geëxtraheerd uit museumveren, werd gerapporteerd door Ellegren (1991). Mills et al. (2000) toonden echter aan dat er verschillende fouten kunnen veroorzaakt worden wanneer microsattelietgenotypering wordt gebruikt bij sterk gefragmenteerd DNA en template-DNA in lage concentratie. 2.2.4.Cloacale geslachtsbepaling (Vent sexing) Cloacale geslachtsbepaling is een techniek die zich baseert op macroscopische determinatie van subtiele cloacale geslachtsverschillen. De techniek werd rond 1930 heel populair bij pluimvee dankzij de Japanese professor Kiyoshi Masui. De uitvoerders, wanneer ze goed opgeleid waren in speciaal daarvoor opgerichte scholen, konden gemakkelijk het geslacht identificeren met 95% accuraatheid. De methode bestaat uit het ondersteboven houden van een ééndagskuiken met één hand, terwijl men de cloaca onderzoekt op zoek naar de aan- of afwezigheid van een rudimentair mannelijk 13

geslachtsorgaan. Niet-specialisten die de basistechnieken van deze methode aangeleerd krijgen, leveren een goede prestatie indien ze het juiste geslacht bij 60-70% van de ééndagskuikens kunnen bepalen. Zelfs specialisten kunnen fouten maken bij het identificeren (Bramwell, 2003). Toen men de techniek op wilde vogelsoorten wou toepassen, doken er problemen op. De cloacale karakteristieke kenmerken verschillen namelijk tussen vogelsoorten, wat een invloed heeft op de betrouwbaarheid en het gemak om het geslacht te differentiëren. Veel van deze kenmerken zijn eveneens moeilijk - zoniet onmogelijk - terug te vinden onder slechte veldomstandigheden. Vroeg in het broedseizoen dilateren de vrouwelijke cloacae om de passage van het disproportioneel grote ei mogelijk te maken. Op basis hiervan beschreef Serventy (1956) een eenvoudige methode om geslachten te onderscheiden via een vergelijkend onderzoek van de externe cloacae. De accuraatheid en betrouwbaarheid werden echter niet gekwantificeerd en de algemene toepasbaarheid werd buiten beschouwing gelaten. Door deze gebreken bleek de vooropgestelde, vergelijkende methode enkel toepasbaar op wijfjes die recentelijk eieren hadden gelegd, en hun bijhorende partners (Boersma en Davies, 1987). 2.2.5.Flowcytometrie Flow cytometrie (FCM) is een niet-invasieve, biochemische meettechniek waarbij de nucleaire DNAinhoud kwantitatief zal beoordeeld worden in plaats van kwalitatief (karyotypering). Het meten van de nucleaire DNA-inhoud werd reeds toegepast in een grote verscheidenheid aan organismen. Hierbij werd FCM ook aangewend om DNA-verschillen te bepalen tussen het DNA van mannen en vrouwen bij de mens, en andere zoogdieren. Nakamura et al. (1990) ontwikkelden een snelle en goedkope procedure om het geslacht van levende vogels te identificeren aan de hand van kleine maar consistente verschillen in de nucleair DNA-inhoud van mannetjes en wijfjes. Nucleaire DNA-inhoud blijkt een seksueel dimorf kenmerk te zijn bij vogels omdat in die soorten met heteromorfe sexchromosomen, het W-chromosoom steeds kleiner is dan het Z-chromosoom, en mannelijke vogels homogameet (ZZ) zijn en vrouwelijke heterogameet (ZW). Men stelde vast dat in de meerderheid van de soorten de mannetjes (ZZ) aldus meer DNA-inhoud hadden dan de wijfjes (ZW) (Tiersch et al, 1989; Nakamura et al., 1990). Bloed (het nucleaire DNA binnen de erythrocyten) en vederpulp (mitotisch actieve cellen van vasculair weefsel in de kern van elke veer) kunnen als staal gebruikt worden (Redelman et al, 1997). Enkele microliter bloed zijn reeds voldoende en onder de juiste omstandigheden zijn er al resultaten beschikbaar één uur na staalname. Stalen kunnen bewaard worden op 4 tot 20 °C zonder af te doen aan de mogelijkheid om geslachten te differentiëren via DNA-inhoud. De flowcytometer meet de fluorescentie, de grootte, en het granulair aspect van de cellen. De meeste toepassingen ervan bevinden zich in de geneeskunde. Voor geslachtsdifferentiatie bij vogels zal de DNA-inhoud van een grote hoeveelheid celkernen, gemerkt met propidium iodide, gemeten worden via een argon ion laser (Figuur 3).

14

Figuur 3: Een suspensie met gemerkte cellen wordt in één rij doorheen een intense lichtbron (laser) gestuurd waarbij de celeigenschappen gemeten worden. Bij instrumenten die de mogelijkheid hebben om te sorteren, kunnen de gemerkte cellen elektrostatisch gescheiden worden van de initiële populatie (Wulff, 2006). De techniek werd met succes toegepast op 29 soorten van 7 ordes met een foutratio van minder dan 1%, en met metingen die sterk herhaalbaar waren (lage variatiecoëfficiënt) (Nakamura et al., 1990). Er dient wel opgemerkt te worden dat de techniek soms inaccuraat bleek bij bepaalde hoeveelheden celdebris, en wanneer er variatie was in de distributie van fluorescentie. Hoewel Redelman et al. (1997) argumenteerden dat FCM duidelijk minder intensief en tijdrovend is dan PCR-procedures, is dit veelal afhankelijk van het aantal geteste soorten, het aantal en de verscheidenheid van de weefselstalen, en de beschikbaarheid van instrumentarium en expertise, die allen samen eerder de voorkeur geven om PCR-gebaseerde methodieken aan te wenden. 2.2.6.Karyotypering De chromosomen kunnen bij beide geslachten microscopisch onderzocht worden. Bij vogels zijn wijfjes heterogameet (Z en W-chromosomen) en mannetjes homogameet (twee Z-chromosomen) (Ellegren, 2001). Het staal, nodig om chromosoomisolatie en karyotypering te doen, kan verkregen worden uit gecultiveerde cellen die afkomstig zijn van een ontwikkelende veer of bloedcellen. Bij zeer 15

jonge vogels kan men bloed aftappen door een deel van de teennagel af te knippen bij het uitkippen of door een bloedstaal te nemen uit bloedvaten binnen het ei (Harcourt-Brown N. en Chitty J., 2005). Aangezien het merendeel van de chromosomen van vogelsoorten microchromosomen zijn, is het moeilijk ze accuraat te tellen. Vrouwelijke vogels zijn heterogameet en beschikken over een Wgeslachtschromosoom dat van vergelijkbare grootteorde is als de microchromosomen. Omdat het grote

Z-chromosoom

gedifferentieerd

kan

worden

van

het

kleinere

W-chromosoom,

is

geslachtsbepaling via geslachtschromosomen zeer goed mogelijk (Figuur 4) (Archawaranon, 2004).

Figuur 4: Karyotypering bij een vrouwelijke (links) en mannelijke (rechts) grote beo (Gracula religiosa). Wanneer men karyotyperingen van meerdere vogelsoorten naast elkaar legt, kan op basis van patronen een fylogenetische evolutie in beeld gebracht worden (Archawaranon, 2004). Een ervaren cytogeneticus kan precieze resultaten afleveren binnen wetenschappelijk gedefinieerde grenzen. Het grootste nadeel aan chromosoomanalyse is de moeilijkheid om geschikte cellen uit de celcultuur te isoleren en de grote hoeveelheid tijd die de procedure in beslag neemt (Christidis, 1985). De methodiek is niet toepasbaar bij struisvogels omwille van de lage divergentie van Z en Wchromosomen (Malagó Jr et al., 2002). 2.2.7.Chirurgische geslachtsbepaling: laparoscopie/endoscopie De unieke anatomie en fysiologie van vogels maakt van hen de perfecte kandidaten voor endoscopische procedures. Vogels hebben geen diafragma en ze hebben naast longen ook luchtzakken. Bij zoogdieren daarentegen dient er CO2-gas ingebracht te worden om de organen endoscopisch beter te kunnen identificeren. Dit is geen noodzaak bij vogels omwille van de natuurlijke inflatie van de luchtzakken. Vogels hebben geen peritoneale holte die wel teruggevonden wordt bij zoogdieren. Er zijn 16 aparte, duidelijk afgelijnde ruimten binnenin het lichaam van een vogel: 8 luchtzakholten en 8 coeloomruimten. Vogelembryo’s hebben 6 paar luchtzakken. Bij het merendeel van de vogelsoorten zijn bij of vlak na het uitkippen 2 paar luchtzakken versmolten, die de claviculaire mediane luchtzak vormen. Gedomesticeerd pluimvee en sommige andere soorten hebben nog een 16

extra versmelting van twee luchtzakken waardoor de cervicale luchtzak wordt gevormd. De meeste vogelsoorten hebben 8 luchtzakken in totaal: 1 claviculaire, 1 cervicale, 2 craniaal-thoracale, 2 caudaal-thoracale en 2 abdominale luchtzakken. Het is uitermate belangrijk om een grondige kennis te hebben van de anatomie van het respiratoir stelsel, aangezien de chirurg de verschillende luchtzakken en coeloomruimten zal binnendringen afhankelijk van het doel van de procedure. Wanneer geslachtsidentificatie een noodzaak is, zijn er twee chirurgische technieken die gangbaar zijn in de praktijk: laparotomie en endoscopie. Beide hebben als doel de gonaden rechtstreeks te onderzoeken. De vogel wordt lokaal verdoofd, gefixeerd en er wordt een incisie gemaakt in het abdomen tussen de laatste twee ribben (figuur 5). Voor endoscopie is deze opening groot genoeg om de een metalen probe in te brengen die gebruikt wordt om de spijsverteringstractus te verplaatsen en de gonaden te onderzoeken. Deze grenzen aan de wervelkolom en liggen net onder de ribbenkast. Het mannetje heeft een paar testis, het wijfje daarentegen gewoonlijk één enkel ovarium. Omdat het ovarium aan de linkerzijde van het lichaam gelokaliseerd is, wordt de incisie ook in deze zijde gemaakt om het onderzoek te vergemakkelijken. Bij endoscopie wordt de procedure nog meer verfijnd door een optische vezelkabel in te brengen om de gonaden te inspecteren. Een kleine abdominale punctie is hierbij nog steeds noodzakelijk. Uitgevoerd door ervaren clinici, kunnen zowel laparotomie als endoscopie uitgevoerd worden in enkele minuten (Griffiths, 2000).

Figuur 5: Benodigd materiaal om endoscopie uit te voeren: LED-lichtbron (1), lichtkabel bestaande uit optische vezels (2), Hopkins arthroscoop in de schede (3), scherpe obturator (4). Uitwendig zicht op de onderzoeksplaats met de musculus sartorius rechts en de twee laatste ribben met de arthroscoop ingebracht, net onder de processus uncinatus van de voorlaatste rib (5) (Richner, 1989).

17

Endoscopische geslachtsbepaling is uitermate geschikt omdat het de fysische karakteristieken van het geslachtsstelsel evalueert en rechtstreeks resultaten verschaft. Weefsel van de gonaden van een volwassen vogel kan gemakkelijk gevisualiseerd worden in vergelijking met dat een juveniele vogel. Een expert kan echter ook het geslacht bij juveniele vogels identificeren. Tijdens het inspecteren van jonge, mannelijke vogels kunnen testikels waargenomen worden als kleine, avasculaire structuren. Bij volwassen mannetjes is hun oppervlakte gevasculariseerd, groter, en variërend in grootte afhankelijk van het seizoen. Bij vrouwelijke vogels worden de ovaria vaak niet teruggevonden. Halfwassen wijfjes hebben een ovarium met een granulair aspect. Wanneer de vrouwelijke vogel volwassen wordt, verschijnen druiventrosachtige follikels (Swengel, 1996). Aan deze techniek zijn verschillende nadelen verbonden. Bij niet-broedende vogels verkleinen de gonaden om gewicht te besparen en zijn ze bijgevolg moeilijk terug te vinden. Heel kleine vogels, die slechts enkele grammen kunnen wegen, vereisen een veel moeilijkere en preciezere chirurgie. Dit is vooral het geval bij jonge vogels die klein en delicaat zijn. De grootste nadelen van endoscopie en laparotomie zijn echter de noodzaak om de vogel onder anesthesie te brengen en de accidentele letsels aan vitale organen die worden veroorzaakt door chirurgie. Een vaak voorkomend letsel is bijvoorbeeld een grote zwelling op de plaats van incisie doordat de luchtzak wordt aangesneden. Andere complicaties zijn bloedingen, hartstilstand, aanprikken van de proventriculus, aanprikken van de gonaden, infectie van de abdominale ruimte, ontsteking van de chirurgische site, subcutaan emfyseem en tijdelijke left leg lameness omwille van trauma aan spieren en zenuwen veroorzaakt door chirurgische benadering via de linkerzijde. Hoewel het onderzoek letaal kan aflopen, lijkt er geen significante stijging te zijn van de mortaliteitscijfers wanneer ervaren handen deze techniek uitvoeren (Richner, 1989; Swengel, 1996). Ondanks het succes, blijft geslachtsbepaling door middel van chirurgie een risico dat vaak te groot wordt geacht. Om bijvoorbeeld enkel de juiste roepnaam aan een vogel als huisdier te geven, zal men dikwijls niet het risico willen nemen op verwonding of een mogelijks letale afloop. Aan de andere kant is het ook risicovol om een zeldzame of dure vogel deze procedure te laten ondergaan. Daarbij komt dat deze methode de vogel agiteert en een einde maakt aan mogelijke broedpogingen in de nabije toekomst: een spijtige zaak als men de methode aanwendde om net het broeden te faciliteren (Griffiths, 2000). 2.2.8.Ultrasonografie Ultrasonografie is een snelle, accurate en niet-invasieve (stressloze) techniek, die gebruikt kan worden om gonadale en intragenitale structuren te detecteren vanuit verschillende topografische posities. Deze techniek wordt al enige tijd gebruikt om het foetale geslacht te bepalen bij mensen en andere zoogdieren. De urogentiale organen van vogels zijn daarentegen minder goed bereikbaar via ultrasound omdat de caudale luchtzakken en intestinale lussen het beeld van de gonaden en nieren belemmeren. Laterale, cranioventrale en caudoventrale abdominale benaderingen worden in de literatuur beschreven. Uitwaaieren van de transducer en extra druk zetten op de abdominale wand, kan tot een bepaald niveau het beeld verbeteren. Veelal wordt bij vogels de linkse oviduct in beeld gebracht. Anesthesie is hierbij niet nodig (Hildebrandt et al., 1995)

18

2.2.9.Geslachtsbepaling via steroïden 2.2.9.1. Geslachtsbepaling via fecale steroïden Deze methode is gebaseerd op oestrogeen- en testosteronniveaus (resp. E/T-niveaus) in de feces van vogels. De fecale excreta van vrouwelijke vogels hebben een hogere E/T-ratio dan mannelijke vogels. Voor deze test zijn verse fecesstalen nodig. Omwille van seizoens- en leeftijdsgebonden variaties, kunnen occasioneel overlappingen vastgesteld worden in de hormoonratio’s, en dan vooral buiten het broedseizoen. De beste resultaten worden behaald bij volwassen vogels tijdens het broedseizoen (Swengel, 1996). 2.2.9.2. Analyse van steroïden in eieren Vogeleieren bevatten verschillende maternale hormonen in aanzienlijke hoeveelheden. De wijze van staalname is van belang omdat hormonen niet homogeen verspreid zijn binnen het ei en gedurende de embryonale ontwikkeling. Hormoonniveaus kunnen dalen en stijgen door veranderingen in de eistructuur en de secretie of opname van hormonen door het embryo. Extractie van hormonen uit de dooier en chromatografische isolatie van verschillende hormonen voor immunoassays, kan de resultaten sterk beïnvloeden omdat zulke methoden interfererende substanties verwijderen zoals eiwitten, vetten en andere hormonen en hun metabolieten, die kunnen reageren met het gebruikte antiserum. Deze methode heeft meer validatie nodig, en dan vooral met de nodige aandacht voor de accuraatheid en specificiteit van de hormoonmetingen (Von Engelhardt and Groothuis, 2005). Petrie et al. (2001) vonden dat hormoonconcentraties in de dooiers van mannelijke en vrouwelijke eieren significant verschilden. 2.2.10. Morfometrische geslachtsbepaling via discriminant function analysis (DFA) Discriminant function analysis (DFA) gebaseerd op morfologische metingen is een snelle, goedkope en efficiënte methode om het geslacht van monomorfe vogelsoorten te bepalen in veldstudies. Tussen vrouwelijke en mannelijke vogels bestaan bij biometrische metingen vaak significante, kleine verschillen. Staartlengte, tarsuslengte, snavellengte, gewicht, wing chord en vleugelformule (beschouwd slagpenaspecten: de lengte en relatieve positie van de toppen van de slagpennen en de aanwezigheid en lengte van inkepingen en emarginaties in de slagpennen) vormen de belangrijkste meetparameters en laten toe een onderscheid te maken tussen de geslachten (figuur 6). Met dit als doel, werden reeds verschillende analysemethoden gebruikt: lineaire modellen of multivariate methoden, zoals principal component analysis en discriminant function analysis (DFA). DFA is hierbij de meest populaire methode en het gebruik ervan is de voorbije decennia gestaag toegenomen. Het principe van DFA is het verschaffen van vergelijkingen, gebaseerd op morfologische metingen, om het geslacht van vogels te voorspellen. Deze vergelijking is in hoofdzaak geijkt op individuen van gekend geslacht. Elke discriminant-vergelijking heeft een geschatte proportie van individuen die correct gedifferentieerd zijn op basis van hun geslacht. Drie validatiemethoden worden bij DFA courant gebruikt, ten einde de proportie correct gedifferentieerde vogels te schatten bij geslachtsbepaling: resubstitution, jackknife en sample splitting. Bij de eerste methode wordt het geslacht van elk individu 19

geschat op basis van de discriminantfunctie, berekend uit de complete dataset. In geval van de jackknife-methode wordt het geslacht bepaald via de discriminantvergelijking, berekend nadat het individu uit de dataset is verwijderd. Deze procedure wordt herhaald tot van elk individu het geslacht bepaald is. Bij sample splitting wordt de dataset willekeurig verdeeld in twee subgroepen, en de training set (tweederde van de individuen) wordt aangewend om de discriminantfunctie te berekenen en vervolgens de accuraatheid van de discriminantfunctie te bepalen door het resterende derde te classificeren (Dechaume-Moncharmont et al., 2011).

Figuur 6: Meetparameters bij DFA: a) wing chord (afstand van de handwortel tot de top van de langste slagpen), b) staartlengte (afstand van de top van de centrale rectrix tot de insertie van de twee centrale rectrices), c) snavellengte (afstand van de neusvleugels tot de snaveltip), d) tarsuslengte (afstand van het intertarsaalgewricht tot de laatste pootschub voor de teen begint) (Dechaume-Moncharmont et al., 2011). Biologen besteden veel aandacht aan de proportie vogels die foutief gedifferentieerd is, omdat een discriminant-vergelijking niet beschouwd mag worden als een doel op zichzelf, maar wel als een instrument om betrouwbaar en snel aan geslachtsbepaling te doen in latere veldstudies. Verscheidene methoden kunnen aangewend worden om de proportie correct gedifferentieerde vrouwelijke en mannelijke vogels te schatten in geval van DFA. Toch is de gekozen methode zelden gerechtvaardigd in de vogelliteratuur. Daarbij komt dat de geschatte ratio aan correct gedifferentieerde vogels afhankelijk is van de grootte van de steekproef. Tussen individuen onderling of binnen éénzelfde individu,

kan

er

ook

een

variantie

in

de

metingen

bestaan

die

de

mogelijkheid

tot

geslachtsdifferentiatie beïnvloedt. Deze variantie kent twee componenten: de werkelijke variantie tussen individuen en de meetfout die voortkomt uit toevallige of systematische fouten. Grote meetfouten geven aanleiding tot een Type 2-fout. Francis en Mattlin (1986) toonden aan dat de power van de discriminant kan terugvallen van 89% tot <50%, wanneer er een kleine hoeveelheid bias is binnen de morfologische metingen. De noodzaak om de meetfout te bepalen wordt onderstreept (Arnqvist en Martensson 1998), maar slechts enkele studies die gebruik maken van DFA rapporteerden de meetfout en het effect ervan op de discriminatieratio.

20

3. BESPREKING

Voor het management en het behoud van vogelsoorten, voor de studie van dierlijke ecologie, gedrag, populatiestructuren en levensgeschiedenis, is geslachtsdifferentiatie een must. Het identificeren van geslachten in vogelsoorten kan uitgevoerd worden via diverse technieken, zoals cloacale geslachtsbepaling, endoscopie, geslachtsbepaling via steroïden, DNA-gebaseerde methoden, morfometrie, ultrasonografie, gedragsbepaling, karyotypering en flowcytometrie. De voorkeur voor een bepaalde techniek is afhankelijk van de beschikbare apparatuur en de ervaring van de vorser. Endoscopie vereist dat de vogel onder anesthesie wordt gebracht door een dierenarts en dat er postoperatieve zorgen dienen verleend te worden. Deze methode kan levensbedreigend zijn voor vogels. Cloacale geslachtsbepaling vereist een doorgedreven expertise. Zelfs experten kunnen hierbij fouten maken. Geslachtsbepaling via steroïden is tijdrovend. Echter, aangezien de steroïdenniveaus kunnen verschillen, bij volwassen vogels afhankelijk van de reproductieve fase waarin ze zich bevinden en bij embryo’s afhankelijk van de ontwikkelingsfase, kan het geslacht niet accuraat gedifferentieerd worden op deze wijze. Karyotypering heeft het nadeel dat de responstijd laag is. Alleen een ervaren celgeneticus kan betrouwbare resultaten leveren. Idealiter gebruikt men vers weefsel of bloed omdat levende cellen en DNA-genoom van hoge kwaliteit vereist zijn. Veren zijn minder geschikt omdat het aantal geschikte, levende cellen en DNA aanwezig, kleiner is dan in bloed. Normaliter kunnen geschikte cellen in metafase niet geïsoleerd worden zonder herhaaldelijke pogingen te ondernemen. Deze extractieproblematiek maakt de methode zeer onpraktisch. Hoewel het manipuleren en fixeren van vogels een zeer stressvolle handeling is, dienen ze tweemaal gemanipuleerd te worden bij karyotypering: één maal om veren te plukken zodat er nieuwe kunnen groeien, en een tweede maal om deze groeiende vederpulp te verzamelen. Om deze redenen is ook karyotypering niet meteen geschikt voor geslachtsbepaling. DNA-gebaseerde technieken zijn meer betrouwbaar dan andere. Het grote voordeel hierbij is dat de technieken niet-invasief zijn en er geen anesthesie vereist is. Decennia geleden diende men volumineuze bloedstalen te verzamelen en duurde de procedure enkele weken. Tegenwoordig zijn stalen uit één enkele veer voldoende en kan er binnen de 24 uur resultaat gegeven worden, zonder de betrouwbaarheid van de test te beïnvloeden. Om erfelijkheid en genetische parameters van enkele kwantitatieve kenmerken te onderzoeken zoals uitkippingspercentage, uitkipratio van vrouwelijke en mannelijke kuikens, overlevingspercentage, groeipercentage, voederconversie, eiproductie en eigewicht, zijn testen op de nakomelingen nodig. Een goed onderzoeksprogramma aangaande de nakomelingen vereist dat de geslachten van de kuikens geweten zijn vanaf het uitkippen. Commercieel waardevolle vogels of bedreigde vogels in een conservatieprogramma mogen geen leed worden aangedaan bij geslachtsbepaling. Aangezien het nemen van bloedstalen manipulatiestress veroorzaakt bij de kuikens, kan men beter veren verzamelen als DNA-bron. Veren zijn gemakkelijk te verzamelen, en kunnen al even gemakkelijk bewaard en getransporteerd worden. Ze vormen een goede bron van DNA. DNA-extractie uit veren reduceert de manipulatiestress, voorkomt onnodig bloeden en minimaliseert de kans op infectie zonder effect te hebben op de accuraatheid en betrouwbaarheid van de resultaten. Amplificatie van seksueel dimorfe genen bij de meeste vogelsoorten, vormt het grootste 21

voordeel van de CDH-sequentie. Bijgevolg kan het geslacht van de meeste vogelsoorten gedifferentieerd worden met P2-P8 primerparen, bij veranderende hechttemperatuur en MgCl2concentratie. Een concentratieverschil in de DNA-stalen beïnvloedt de test niet en één enkele primer reduceert zonder problemen de kans op gecontamineerde banden. Het biedt een gemakkelijke, goedkope en accurate geslachtsbepaling. De test kan worden uitgevoerd in een eenvoudig laboratorium.

22

4. REFERENTIELIJST

Alberts B., Johnson A., Lewis J., Raff M., Roberts K. en Walter P. (2002). Manipulating proteins, DNA, and RNA. Molecular Biology of the Cell, Garland Science, New York, 4th Edition, 508-509. Anna D. en Magdalena Z.-N. (2006). Molecular techniques for sex identification in birds. Biological Letters 43(1), 3-12. Archawaranon M. (2004). Rapid sexing hill mynah (Gracula religiosa) by sex chromosomes. Biotechnology 3, 160-164. Arnqvist G. en Martensson T. (1998). Measurement error in geometric morphometrics: Empirical strategies to assess and reduce its impact on measures of shape. Acta Zoologica Academiae Scientiarum Hungaricae 44, 73–96. Balthazart J. en Ball G.F. (1995). Sexual differentiation of brain and behavior in birds. Trends in Endocrinology and Metabolism 6(1), 21-29. Balzer J. en Hirsch M. (2007). Diagnostic update: PCR, wat is het en wat kunt u er mee in de praktijk? Vet Med Lab, a Division of IDEXX Laboratories BV. Birkhead T.R., Hatchwell B.J. en Lindner R. (2001). Extra-pair paternity in the common murre. The Cooper Ornithological Society 103, 158-162. Boersma P.D. en Davies E.M. (1987). Sexing monomorphic birds by vent measurements. Institute for Environmental Studies and Department of Zoology, University of Washington, Seattle, Washington, USA 98195. Short Communications. Bolton M., Monaghan P., Houston D. (1993). Proximate determination of clutch size in lesser blackbacked gulls: the roles of food supply and body condition. Canadian Journal of Zoology 71, 273-279. Bramwell R.K. (2003). Sexing chicks in the backyard flock. Avian Advice 5, 4-5. Brown

T.A.

(2002).

Genomes.

2nd

ed.

Oxford,

BIOS

Scientific

Publishers,

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK21128/ Cerit H. en Avanus K. (2007). Sex identification of parrots from feather DNA using CHDW and CHDZ genes of avian sex chromosomes. Turkish Journal of Veterinary and Animal Sciences 31(6), 371-374. Cheng Y.H., Kuo T.F., Lee D.N. en Weng C.F. (2006). Sex identification of the black-faced spoonbill (Platalea minor). Zoological Studies 45, 104-113. Christidis L. (1985). A rapid procedure for obtaining chromosome preparations from birds. Auk 102, 892-893.

23

Crosta L., Gerlach H., Bürkle M., Timossi L. (2003). Physiology, diagnosis and diseases of the avian reproductive tract. The veterinary clinics of North America. Exotic animal practice 6, 57-83. Dhondt A.A. (1970). The sex ratio of nestling great tits. Bird Study 17(3), 282-286. Dechaume-Moncharmont F.-X., Monceau K. en Cezilly F. (2011). Sexing birds using discriminant function analysis: a critical appraisal. The Auk 128(1), 78−86. Ellegren H. (1991). DNA typing of museum birds. Nature 354, 113. Ellegren H. (2001). Hens, cocks and avian sex identification. A quest for genes on Z or W? EMBO Reports 2, 192-196. Epplen J.T., Ammer I.I., Epplen C., Kammerbauer C., Mitreiter R., Roewer L., Schwaiger W., Steimle V., Zischler I.I., Albert E., Andreas G., Beyermann B., Meyer W., Buitkamp J., Nanda I., Schmid M., Nurnberg P., Pena S.D.J., Poche H., Sprecher W., Schartl M., Weising K., Yassouridis A. (1991). Oligonucleotide fingerprinting using simple repeat motifs: A convenient, ubiquitously applicable method to detect hypervariability for multiple purposes. In: DNA fingerprinting: Approaches and applications. Birkhauser Press, Basel, Switzerland, 50-69. Francis R.I.C.C. en Mattlin R.H. (1986). A possible pitfall in the morphometric application of discriminant analysis: Measurement bias. Marine Biology 93, 311–313. Fischert S.A., Bortolotti G.R., Fernie K.J., Bird D.M., Smits J.E. (2006). Brood patches of American kestrels altered by experimental exposure to PCB’s. Journal of Toxicology and Environmental Health, Part A, 69,1603–1612. Fridolfsson A.K. en Ellegren H. (1999). Molecular evolution of the avian CHD1 genes on the Z and W sex chromosomes. Genetics 155, 1903-1912. Garcia-Moreno J. en Mindell D.P. (2000). Rooting a phylogeny with homologous genes on opposite sex chromosomes (gametologs): A case study using avian CHD. Molecular Biology Evolution 17, 1826-1832. Griffiths R. (1992). Sex biased mortality in the Lesser Black-backed Gull Larus fuscus during the nestling stage. Ibis 134, 237-244. Griffiths R. en Tiwari B. (1993). The isolation of molecular genetic markers for the identification of sex. Proceedings of the National Academy of Sciences 90, 8324-8326. Griffiths R. en Tiwari B. (1995). Sex of the last wild Spix’s macaw. Nature 375, 454. Griffiths R. en Korn R.M. (1997). A CHD1 gene is Z chromosome linked in the chicken Gallus domesticus. Gene 197, 225-229.

24

Griffiths R., Double M.C., Orr K. en Dawson R.J.G. (1998). A DNA test to sex most birds. Molecular Ecology 7, 1071-1075. Griffiths R. en Orr K. (1999). The use of amplified fragment length polymorphism (AFLP) in the isolation of sex-specific markers. Molecular Ecology 8, 671-674. Griffiths R. (2000a). Sex identification in birds. Seminars in Avian and Exotic Pet Medicine. Molecular Laboratory, DEEB, Graham Kerr Building, Glasgow University, Glasgow G122 8QQ. 9,14. Griffiths R. (2000b). Sex identification using DNA markers. Blackwell Science, London. In: Molecular methods in ecology, 295-321. Gowaty P.A. (1991). Facultative manipulation of sex ratio in birds. Current Ornithology 8, 141-171. Harcourt-Brown N. en Chitty J. (2005). BSAVA Manual of Psittacine Birds. Woodrow House, 1 Telford Way, Waterwells Business Park, Quedgeley, Gloucester GL2 2AB. Replika Press Pvt. Ltd., India. Hoofdstuk 18, 222-223. Hildebrandt T., Pitra C., Sömmer P. en Pinkowski M. (1995). Sex identification in birds of prey by ultrasonography. Journal of Zoo and Wildlife Medicine 26(3), 367-376. Honkatukia, M., Kulamala J. en Söderback P. (2003). Isolation of genomic DNA from chicken feathers using QuickPickTM gDNA kit. Technical Note TN51000-009, Bio-Nobile Oy, 1-2. Jeffreys A.J., Brookfield J.F.Y., Semeonoff R. (1985). Positive identification of an immigration testcase using human DNA fingerprintings. Nature 317, 818-819. Jensen T., Pernasetti F.M. en Durrant B. (2003). Conditions for rapid sex determination in 47 avian species by PCR of genomic DNA from blood, shell-membrane blood vessels and feathers. Zoo Biology 22, 561-567. Kahn N.W., John J. en Quinn T. (1998). Chromosome-specific intron size differences in the Avian CHD gene provide an efficient method for sex identification in birds. The Auk 115, 1074 -1078. Klug W.S. en Cummings M.R. (2000). Construction and analyses of DNA clones. Concepts of genetics, Prentice Hall Inc., New Jersey, 515-517. Lessells C. en Mateman, A. (1998). Sexing birds using random amplified polymorphic DNA (RAPD) markers. Molecular Ecology 7, 187 -195. Longmire J.L., Maltbie M., Pavelka R.W., Smith L.M., Witte S. M., Ryder O.A., Ellsworth D.L., Baker R.J. (1993). Gender identification in birds using microsatellite DNA fingerprint analysis. Auk 110, 378381. Malagó Jr. W., Heitor M.F., Matheucci Jr. E., Medaglia A. en Henrique-Silva F. (2002). Large scale sex typing of ostriches using DNA extracted from feathers. BMC biotechnology 2, 19. 25

Michelmore R.W., Paran I., Kesseli R.V. (1991). Identification of markers linked to disease resistance genes by bulked segregant analysis: a rapid method to detect markers in specific genomic regions by using segregating populations. Proceedings National Academy of Science 88, 9828-9832. Mills L.S., Citta J.J., Lair K.P., Schwartz M.K. en Tallmon D.A. (2000). Estimating animal abundance using noninvasive DNA sampling: Promise and pittfalls. Ecological Applications 10, 283 -294. Miyaki C.Y., Duarte M.B., Caparroz R., Nunes A.V. en Wajntal A. (1997). Sex identification of South American Parrots (Psittacidae, Aves) using the human minisatellite probe 33.15. The Auk 114, 516520. Nager R., Monaghan P., Griffiths R. (1999). Experimental demonstration that offspring sex ratio varies with maternal condition. Proceedings of the National Academy of Sciences (USA) 96, 570-573. Nakamura D., Tiersch T.R., Douglass M. en Chandler R.W. (1990). Rapid identification of sex in birds by flow cytometry. Cytogenetics and Cell Genetics 53, 201-205. Oddie K. (1998). Sex discrimination before birth. Trends in Ecology and Evolution 13, 130-131. Ogawa A., Solovei I., Hutchison N., Saitoh Y., Ikeda J.E., Macgregor H. en Mizuno S. (1997). Molecular characterization and cytological mapping of a non-repetitive DNA sequence region from the W chromosome of chicken and its use as a universal probe for sexing Carinitae birds. Chromosome Research 5, 93-101. Petrie M., Schwabl H., Brande-Lavridsen N. en Burke T. (2001). Sex differences in avian yolk hormone levels. Nature 412, 498. Pollock C.G., Orosz S.E. (2002). Avian reproductive anatomy, physiology and endocrinology. The veterinary clinics of North America. Exotic animal practice 5, 441-474. Redelman D., Fleury S.A. en Garner D.L. (1997). Flow cytometry for sexing birds. Trends in Ecology and Evolution 12, 489. Richner H. (1989). Avian laparoscopy as a field technique for sexing birds and an assessment of its effects on wild birds. Journal of Field Ornithology 60, 137-142. Sabo T.J., Kesseli R., Halverson J.L., Nisbet I.C.T., Hatch J.J. (1994). PCR-based method for sexing roseate terns (Sterna dougallii). Auk 111, 1023-1027. Serventy D.L . (1956). A method of sexing petrels in field observations. Emu 56, 213-215. Seutin G., White B.N. en Boag P.T. (1991). Preservation of avian blood and tissue samples for DNA analyses. Canadian Journal of Zoology 69, 82-90. Sheldon B.C. (1998). Recent studies of avian sex ratios. Heredity 80, 397-402.

26

Swengel S.R. (1996). Special techniques, C: Sex determination In: Cranes: Their Biology, Husbandry, and Conservation. National Biological Service/International Crane Foundation: United States of America, 223-231. Tiersch T.R., Chandler R.W., Wachtel S.S. en Elias S. (1989). Reference standards for flow cytometry and application in comparative studies of nucleair DNA content. Cytometry 10, 706-710. Trivers R. L. en Willard D.E. (1973). Natural selection of parental ability to vary the sex ratio of offspring. Science 179, 90-91. Von Engelhardt N. en Groothuis T.G.G. (2005). Measuring steroid hormones in avian eggs. Annals of the New York Academy of Sciences 1046, 181-192. Vos P., Hogers R., Bleaker M., Reijmans M., Van De Lee T., Hornes M., Fritjers A., Pot J., Peleman J., Kuiper M., Zabeau M. (1995). AFLP: a new technique for DNA fingerprinting. Nucleic Acids Research 23, 4407-4414. Williams J.G.K., Kubelik A.R., Livak K.J., Rafalski J.A., Tingey S.V. (1990). DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers. Nucleic Acids Research 18, 6531-6535. Williams J.G.K., Hanafey M.K., Rafalski J.A., Tingey S.V. (1993). Genetic analysis using random amplified polymorphic DNA markers. Academic Press, San Diego. Methods in Enzymology 218, 704740. Wulff S. (2006). Educational Guide to Flow Cytometry. Dako, Carpinteria, California, USA, 2nd Edition, 10-11.

27

UNIVERSITEIT GENT FACULTEIT DIERGENEESKUNDE Academiejaar 2012-2013

CASUS: IN OVO VACCINATIE BIJ VLEESKUIKENS

door

Robin Van Buel

Promotor: Prof. Dr. A. Martel Medepromotor: Marc Verlinden

Casus in het kader van de Masterproef

De auteur en de promotor(en) geven de toelating deze studie als geheel voor consultatie beschikbaar te stellen voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting de bron uitdrukkelijk te vermelden bij het aanhalen van gegevens uit deze studie. Het auteursrecht betreffende de gegevens vermeld in deze studie berust bij de promotor(en). Het auteursrecht beperkt zich tot de wijze waarop de auteur de problematiek van het onderwerp heeft benaderd en neergeschreven. De auteur respecteert daarbij het oorspronkelijke auteursrecht van de individueel geciteerde studies en eventueel bijhorende documentatie, zoals tabellen en figuren. De auteur en de promotor(en) zijn niet verantwoordelijk voor de behandelingen en eventuele doseringen die in deze studie geciteerd en beschreven zijn.

VOORWOORD

Vogels, gaande van gezelschapsvogels tot pluimvee, vormen reeds van kindsbeen af een rode draad doorheen mijn leven. Het is dan ook niet verwonderlijk dat ik de studie diergeneeskunde heb aangevat met de bedoeling mij te verdiepen in de vogelgeneeskunde, en de relatie tussen mens en vogel in zowel de hobby- als industriesector. Na zes jaar zware studie is mijn interesseveld uiteraard ook enorm vergroot naar andere dieren toe. Dit wil echter niet zeggen dat ik minder gepassioneerd ben geworden ten aanzien van alles wat pluimen heeft. Deze literatuurstudie is dan ook een kleine ode aan de dagen van weleer en een mogelijks gevederde toekomst. Bij deze wil ik mijn promotor, Prof. A. Martel, hartelijk bedanken voor de tijd die zij heeft uitgetrokken en de geleverde inspanningen om deze casus tot een goed eind te brengen. Tenslotte wil ik mijn ouders, Eric Van Buel en Marie-Kristine Smet, bedanken voor de continue steun en de kansen die ze me geven om mijn dromen te helpen realiseren.

INHOUDSOPGAVE

SAMENVATTING................................................................................................................................................ 3 1. INLEIDING ....................................................................................................................................................... 2 2. LITERATUURSTUDIE .................................................................................................................................... 3 2.1. IMMUNITEIT BIJ PLUIMVEE ............................................................................................................................ 3 2.1.1. Anatomie van het immuunsysteem ...................................................................................................... 3 2.1.2. Aangeboren en adaptieve immuniteit .................................................................................................. 3 2.1.3. Maternale antistoffentransfer ............................................................................................................. 4 2.2. OORZAKEN VAN VACCINATIEFALEN ................................................................................................. 6 2.2.1. Vaccinatieprogramma ........................................................................................................................ 6 2.2.2. Hanteren van een vaccin..................................................................................................................... 6 2.2.3. Tekortkomingen bij het toedienen ....................................................................................................... 7 2.2.4. Maternale antistoffen .......................................................................................................................... 7 2.2.5. Stress ................................................................................................................................................... 7 2.2.6. Timing ................................................................................................................................................. 7 2.2.7. Onderdrukking van het immuunsysteem ............................................................................................. 7 2.2.8. Bedrijfsmanagement ........................................................................................................................... 8 2.2.9. Vaccinkwaliteit ................................................................................................................................... 8 2.2.10. Vaccinmodificaties .............................................................................................................................. 8 2.2.11. Vaccinstam en –serotype .................................................................................................................... 8 2.3. IN OVO VACCINATIE ...................................................................................................................................... 9 2.3.1. Vaccineren op broeierijniveau ............................................................................................................ 9 2.3.2. Voordelen van in ovo vaccinatie ....................................................................................................... 10 2.3.3. Vaccinvoorbereiding ......................................................................................................................... 10 2.3.4. Toedieningslocatie ............................................................................................................................ 11 2.3.5. Eilokalisatie, eischaalpenetratie en injectiesite (Williams, 2005b) .................................................. 13 2.3.6. Invloed op het embryo....................................................................................................................... 15 2.3.7. In ovo instrumentariumhygiëne en antibioticagebruik ..................................................................... 17 2.4. ENKELE TOEPASSINGEN VAN IN OVO VACCINATIE TEGEN PLUIMVEEZIEKTEN ............................................. 18 2.4.1. Ziekte van Marek (Marek’s Disease of MD) ..................................................................................... 19 2.4.2. Gumboro (Infectious Bursal Disease of IBD) ................................................................................... 21 2.4.3. Coccidiose......................................................................................................................................... 21 2.4.4. Paramyxovirus (Newcastle Disease Virus of NCD).......................................................................... 22 2.4.5. Aviaire influenza ............................................................................................................................... 23 3. BESPREKING ................................................................................................................................................. 25 4. REFERENTIELIJST ...................................................................................................................................... 26

SAMENVATTING

Op maandag 12 november 2012 werd broeierij Belgabroed bezocht door de laatstejaarsstudenten van Optie varken, pluimvee en konijn, onder begeleiding van Marc Verlinden. De ééndagskuikens werden na het uitkippen via spray gevaccineerd tegen pseudovogelpest (paramyxovirus). De tekortkomingen van dit sprayen, zoals het feit dat niet alle kuikens even goed geïmmuniseerd worden en het opwekken van een adequate bescherming enige tijd vergt, zetten me aan het nadenken. Bij het uitdiepen van deze problematiek, stelde ik vast dat in ovo vaccinatie een antwoord biedt op nagenoeg al deze knelpunten. Zo ook het manueel intramusculair injecteren tegen de Ziekte van Marek bij leghennen in broeierij Belgabroed. Het in ovo vaccineren wordt de laatste decennia internationaal meer en meer de procedure bij uitstek voor broeierijvaccinatie tegen de Ziekte van Marek (Marek’s Disease of MD-virus), Gumboro (Infectious Bursal Disease of IBD-virus) en tal van andere ziekten die in de eerste levensweken van een kuiken kunnen aanslaan. Bij in ovo vaccinatie beschikken de kuikens namelijk al vanaf dag 1 over hoge, beschermende, ziektespecifieke antistof titers, hetgeen ervoor ondenkbaar was. Deze supertechnologie vond haar oorsprong in de Verenigde Staten (VS) en kent een zeer snelle wereldlijke verspreiding, dankzij de initiële goedkeuring van het United States Department of Agriculture (USDA) in 2003 om in ovo vaccins tegen avipoxvirus (Fowl Pox), en het besmettelijke en fatale paramyxovirus (Newcastle Disease) in te voeren. Hierdoor werd de deur naar de Aziatische en Latijns-Amerikaanse markten opengezet. Het laboratoriumconcept om ‘in ovo’ te vaccineren heeft zich aldus globaal verspreid en is verder ontwikkeld tot een commercieel en praktisch toepasbare technologie (Embrex Inovoject® systeem, Intelliject®, ECAT-systeem®, e.d.) waarbij antigenen in eieren worden ingebracht, tegen 50.000 tot 70.000 eieren per uur. In de VS wordt meer dan 85% van de vleeskippenindustrie in ovo gevaccineerd, en globaal worden er jaarlijks meer dan 15 miljard eieren met vaccin in ovo geïnjecteerd, in meer dan 34 verschillende landen. Aldus bestaan er bepaalde toedieningsprincipes bij in ovo vaccinatie die cruciaal zijn, omwille van het feit dat ze gebaseerd zijn op de fysiologie van de immuunrespons en de tolerantie van het embryo tegenover deze relatief invasieve technologie. Het begrijpen van de factoren die het in ovo toedienen beïnvloeden, is van belang wanneer we ze willen linken met de kuikenkwaliteit. Deze casus heeft de bedoeling om de link tussen in ovo vaccinatie en kuikenkwaliteit te belichten, met inbegrip van de beïnvloedende factoren zoals embryonale leeftijd op moment van injectie, uitkippercentage, vaccintoediening in de verschillende eicompartimenten en immuunrespons. Verder worden de fysische uitdagingen van injectietechnieken, broeierijhygiëne en sanitaire maatregelen aangaande in ovo apparatuur, verder uitgediept.

Trefwoorden: vaccinatie, vleeskuiken, Paramyxovirus, in ovo, immuniteit

5. INLEIDING Het eerste onderzoek naar het in ovo toedienen van vaccins werd uitgevoerd door Sharma en Witter (1983). Studies die hierop verder bouwden, toonden aan dat het in ovo toedienen van de levend verzwakte vaccins HVT, SB-1, en CVI988 tegen de ziekte van Marek (Marek’s Disease of MD-virus) bij kippenembryo’s in een late ontwikkelingsfase – veilig was en een vroegere immuniteit induceerde dan toediening van het vaccin na het uitkippen (Sharma et al., 1984; Zhang and Sharma, 2001). Omwille van deze opmerkelijke resultaten, werd in ovo vaccinatie gecommercialiseerd (Gildersleeve et al., 1993; Sarma et al., 1995). Ook tegen Gumboro (Infectious Bursal Disease of IBD-virus) en avipoxvirus (Fowl Pox) kan er commercieel gevaccineerd worden, met uitzondering van paramyxovirus (Newcastle Disease of NCD) waar de licentie nog in aanvraag is. Vandaag de dag is in ovo vaccinatie een wijdverspreide praktijk die wereldwijd in vele commerciële vleeskippenbroeierijen toegepast wordt, voornamelijk in Amerika, Japan, Australië en sommige delen van Europa. In ovo vaccinatie wordt uitgevoerd wanneer de broedeieren overgeplaatst worden van de voorbroedmachine (incubator of setter) naar de uitkipmachine (hatcher) (Williams, 2002). Het proces en de techniek die gebruikt worden bij toediening van deze levende vaccins is hierbij cruciaal. Vaccin toedienen op een foute plaats binnen het ei, leidt tot ineffectieve vaccinatie, waardoor de voordelen van de techniek – indien correct uitgevoerd - teniet worden gedaan (Avakian et al., 2002). De complexiteit van het in ovo toedienen wordt vaak onderschat, wat deels te wijten is aan de 5 embryonale compartimenten die gedurende het in ovo proces via de naald te bereiken zijn. Verder kan het embryonaal lichaam subcutaan, intramusculair, intracraniaal, intraorbitaal of intra-abdominaal geïnjecteerd worden, waarbij de laatste drie genoemde injectiewijzen excessief, embryonaal trauma veroorzaken. De efficiëntie van het vaccin en de veiligheid van het embryo kunnen beïnvloed worden door het embryonaal compartiment waar het vaccin wordt ingebracht. Optimale resultaten worden verkregen wanneer het vaccin geïnoculeerd wordt tussen dag 18 en 19 van de broedperiode. Indien er aan bepaalde criteria voldaan is, zoals het tijdstip en de plaats van vaccinatie, de vaccinmengeling, de

machinehygiëne

en

de

managementspecificaties

van

de

broeierij,

bewijst

in

ovo

vaccinatietechnologie een zeer effectieve en efficiënte methode te zijn om tot wel 50.000 eieren per uur te vaccineren (Williams en Hopkins, 2011). Hoewel de dierengezondheidssector een grote variëteit aan preventieve behandelingen tegen pluimveeziekten heeft ontwikkeld, worden deze behandelingen niet altijd toegepast op een manier die effectieve en consistente resultaten oplevert. Conventionele toepassingen zijn enkel toepasbaar na het uitkippen: via voeder en drinkwater, via sprays die bij de vogels inwerken op de mucosale membranen en via manuele vaccinatie. Deze behandelingen vereisen meestal meerdere vaccinaties en herhalingsvaccinaties (field boosts), waarbij soms kostelijk giswerk komt kijken. Het resultaat is een minder efficiënte en minder consistente vaccintoediening. In ovo vaccinatie laat stroomafwaarts eveneens procesverbeteringen toe wat de efficiëntie ten goede komt, en biedt tal van voordelen ten opzichte van andere behandelingsmethoden (Williams, 2002). 2

6. LITERATUURSTUDIE 6.1. IMMUNITEIT BIJ PLUIMVEE Door de continue toename van het economisch belang van vleeskippen, is een beter begrip van de ontwikkeling en functie van het immuunsysteem bij kippen noodzakelijk. Deze kennis kent een rechtstreekse toepassing in selectieprogramma’s voor moederdieren, waarbij selectie voor vroege immunocompetentie en hoge ziekteweerstand belangrijk zijn om aan de vraag van de moderne, intensieve productiesystemen bij vleeskippen te voldoen (Erf, 1997). 6.1.1.Anatomie van het immuunsysteem De immuniteitscellen verblijven in primair lymfoïede organen (PLO) of secundair lymfoïede organen (SLO). De thymus en de bursa van Fabricius zijn de PLO waar, respectievelijk, de T en Bcelprecursoren differentiëren en maturatie ondergaan. T-lymfocyten staan in voor celgemedieerde afweer, terwijl de B-lymfocyten instaan voor humorale afweer. De thymus is een verlengde, multilobulaire structuur gelokaliseerd over de lengte van de nek, aan beide zijden van de trachea, en waarvan enkele lobben tot vooraan in de thoraxholte lopen. Lobben van de thymus zijn onderverdeeld in lobules, waarvan elke lobule een perifere cortexzone heeft met een hoge densiteit aan lymfocyten. De thymus is functioneel vanaf het uitkippen en functioneert met toenemende leeftijd meer en meer als SLO. De bursa van Fabricius is een zakvormige, lymfoepitheliale uitgroei van het proctodeum en is gelokaliseerd boven de cloaca. De bursa is onderverdeeld in follikels, waarvan elke follikel gevuld is met lymfocyten. Net zoals in de thymus, bevinden de lymfocyten zich in een perifere cortexzone en een centrale medulla. De bursa is actief vanaf het uitkippen tot ongeveer 4 tot 10 weken, waarna er gradueel regressie optreedt (Saif et al., 2008). Functionele immuniteitscellen verlaten de PLO en bevolken SLO, de belangrijkste sites voor antigeengeïnduceerde immuunrespons. SLO, gekarakteriseerd door aggregaten van lymfocyten en antigeenpresenterende cellen, zijn verspreid in het lichaam. Voorbeelden zijn de milt, het beenmerg, de Harderse klier (gelokaliseerd ventromediaal ten opzichte van de oogbol), conjunctivaalgeassocieerd (CALT), bronchiaal-geassocieerd (BALT) en intestinaal-geassocieerd lymfoïed weefsel (GALT). De bursa kan ook fungeren als SLO. Kippen missen de zoogdierequivalent van lymfeknopen, maar hebben lymfoïede nodules op het verloop van de lymfevaten (Saif et al., 2008). 6.1.2.Aangeboren en adaptieve immuniteit Vertebraten, inclusief kippen, hebben ruwweg twee types van verdedigingssystemen tegen infectieuze agentia. Dit zijn de aangeboren immuniteit en de adaptieve immuniteit. Aangeboren immuniteit bestaat uit een breed gamma aan defensiemechanismen: fysische en biochemische barrières die de invasie voorkomen van infectieuze en niet-infectieuze agentia (antigenen), en oplosbare en cellulaire componenten die de mogelijkheid hebben om met succes vreemde substanties (antigenen) te elimineren die in de lichaamsweefsels binnendringen. De cellulaire componenten van de aangeboren 3

immuniteit zijn monocyten/macrofagen, heterofielen (neutrofielen genaamd bij zoogdieren), basofielen, eosinofielen, natural killer cells (NK-cellen) en complementfactoren. Meestal is de aangeboren immuniteit zeer effectief in het elimineren van antigenen. Wanneer deze echter faalt, wordt het een noodzaak om met een meer specifieke focus een immuunreactie te verkrijgen tegenover het antigeen. In dat geval wordt de adaptieve immuniteit geactiveerd (Erf, 1997). Adaptieve immuniteit belichaamt twee aspecten van het immuunsysteem. Deze zijn de humorale immuniteit, die verzorgd wordt door antistoffen, en de celgemedieerde immuniteit, die vooral uit de activiteit van de T-cellen bestaat (Erf, 2004). Lymfocyten zijn de cellulaire componenten van de adaptieve immuniteit. Er zijn verscheidene subpopulaties van lymfocyten die morfologisch niet van elkaar te scheiden zijn, maar verschillen in hun ontwikkelingslocatie, weefsellocatie, fenotypische expressie van moleculen aan het celoppervlak, en functionele mogelijkheden. Lymfocyten van kippen bestaan uit B-cellen uit de bursa van Fabricius, en T-cellen uit de thymus, zoals hiervoor reeds vermeld werd. Elke B- en T-cel beschikt over een homogene set antigeenreceptoren, specifiek voor een bepaald antigeen. Samen beschikken de B- en T-cel populaties over elk een repertoire van bijna 9

10 verschillende antigeenherkenningsplaatsen (Funk en Palmer, 2003). Bij een eerste interactie met een antigeen, bijvoorbeeld pathogeen ‘A’, zijn er relatief weinig T- en Bcellen met receptoren specifiek voor dit antigeen. Vooraleer pathogeen ‘A’ geëlimineerd kan worden door specifieke immuniteitscomponenten, dienen T- en B-cellen met ‘A’-specifieke receptoren te vermenigvuldigen en differentiëren in effectorcellen (antistofproducerende plasmacellen). Deze proliferatie en differentiatie zijn echter tijdrovend, wat pathogeen ‘A’ veelal de opportuniteit geeft om ziekte te veroorzaken. In plaats van de omvorming tot effectorcellen, kunnen cellen die pathogeen ‘A’ herkennen, zich differentiëren tot lang levende, snel reagerende memorycellen. Zodoende gebeurt er bij een T- en B-celrespons op pathogeen ‘A’, een toename bij de ‘A’-specifieke cellen, met name ‘A’specifieke effectorcellen en memorycellen. De effectorcellen zullen instaan voor de eliminatie van pathogeen ‘A’, terwijl de vormende memorycellen zich afzijdig zullen houden, en effectief zullen reageren bij een daaropvolgende interactie met pathogeen ‘A’, zodat de ziekte niet kan aanslaan. Echter, pathogeen ‘A’-specifieke memorycellen zullen het individu niet kunnen beschermen tegen een ander pathogeen. Op dit concept, namelijk het uitbreiden van de populaties van antigeenspecifieke cellen en het produceren van antigeenspecifieke memorycellen, wordt rechtsreeks beroep gedaan bij vaccinatieschema’s, waarbij een niet-pathogene vorm van een pathogeen geïntroduceerd wordt aan het immuunsysteem van een individu. Het immuunsysteem zal een respons vormen tegen specifieke componenten van de pathogeen, zoals hierboven beschreven. Bij een daaropvolgend contact zal het immuunsysteem geprimed zijn, en zal de pathogeen vernietigd worden voor die ziekte kan veroorzaken (Erf, 1997; Erf, 2004). 6.1.3.Maternale antistoffentransfer Maternaal verkregen antilichamen, ook gekend als passieve immuniteit, zijn immunoglobulines (Ig) die op natuurlijke wijze van één individu naar een ander individu worden doorgegeven. Ze beschermen 4

net uitgekipte kuikens tegen ziekten waar ze in hun eerste levensweken (1 tot 2 weken) vatbaar voor zijn, aangezien hun immuunsysteem nog niet geheel ontwikkeld is. Bij vogels, en in dit geval kippen, worden deze antilichamen doorgegeven van hypergeïmmuniseerde of natuurlijke geïnfecteerde moederdieren, naar het nageslacht via het ei. Dit wil zeggen dat hoe beter geïmmuniseerd de hen is, hoe beter beschermd de kuikens zullen zijn. Het is daarom van belang om niet enkel goede vaccinatieschema’s op te stellen voor de kuikens, maar ook voor de moederdieren zelf (Gharaibeh et al., 2008). Daarbij komt dat het niveau van deze overgeërfde antilichamen van groot belang is wanneer serologie overwogen wordt om ziekte te diagnosticeren bij kuikens (Sharma, 2003). De antilichamentransfer gebeurt in twee stappen: eerst worden de antistoffen afgezet in de dooier en het albumine (eiwit), nadien worden ze door het embryo opgenomen. Maternale antistoffen bestaan uit verschillende types immunoglobulines (IgG, IgA en IgM), maar de twee voornaamste klassen zijn IgG (bij vogels soms ook aangeduid als IgY) en IgA. IgG is het meest effectief, aangezien het voor het ovuleren in verschillende stadia afgezet wordt door de ovaria in de dooier, doorheen het folliculair epitheel dat morfologische veranderingen is ondergaan. IgG wordt vanuit de dooier getransfereerd in de embryonale circulatie vanaf dag 7, tot 3-4 dagen voor het uitkippen (Rose et al., 1974). Na 18 tot 19 dagen incuberen, zal reeds een groot deel van deze maternale antistoffen geabsorbeerd zijn door het embryo. Een volledige maternale bescherming ontwikkelt zich pas een paar dagen na het uitkippen. Indien een levend vaccin aan het embryo wordt toegediend in deze gelimiteerde tijdsperiode, kan het virus repliceren zonder al teveel interferentie van de maternale antistoffen, en een goede immuunrespons teweegbrengen (Villalobos, 2012). In een studie uitgevoerd door Hamal et al. (2006), werd er aangetoond dat 27 tot 30% van het IgG van de hen, naar het nageslacht wordt doorgegeven. IgA en IgM worden daarentegen afgezet in het eiwit tijdens de passage doorheen de oviduct, en voornamelijk ter hoogte van het magnum. Ze worden ingeslikt door het kuiken tijdens de ontwikkeling. IgA en IgM bieden mucosale bescherming ter hoogte van het ademhalings- en spijsverteringsstelsel. Hoewel IgG een meer algemene, systemische werking heeft, blijken IgA en IgM een zeer belangrijke, lokale rol te spelen bij de bescherming tegen Infectieuze Bronchitis (IB) en de ziekte van Newcastle (NCD), of als additionele proteïnebron. De hoeveelheid IgA en IgM die van de hen naar het kuiken getransfereerd wordt, is minder dan 1% van de concentratie immunoglobulines in het plasma van de hen. Verder is IgM het eerste immunoglobuline-isotype dat gesynthetiseerd wordt door het kuiken zelf, gevolgd door IgA en IgG (Hamal et al., 2006). Kuikens met een goede antistoffenbescherming hebben hoge, uniforme antistof titers, wat enkel mogelijk is als de moederdieren ook hoge, uniforme antistof titers hebben. Spijtig genoeg zal er in een koppel met hoge, uniforme titers, steeds ongeveer tien procent kuikens zijn met weinig tot geen titers. Daarbij komt dat wanneer de koppel geen uitgesproken hoge titers heeft, het aantal kuikens zonder antistoffen drastisch toeneemt. Op een koppel van 25.000 dieren, betekent dit ongeveer 2.500 dieren zonder enige vorm van bescherming tegen ziekten. Dit is te vermijden wanneer een vaccinatieprogramma wordt toegepast dat vroeg en effectief is. Titers variëren echter enorm en worden door tal van factoren beïnvloedt zoals bijvoorbeeld locatie en voorgeschiedenis (Hamal et al., 5

2006). Hoge en uniforme titers in de koppel kunnen bekomen worden door aan priming te doen met kwalitatieve levende vaccins. Levende vaccins geven kuikens een brede bescherming aangezien ze aan alle stadia van het virus worden blootgesteld. Het stimuleert het immuunsysteem zodat dit efficiënt reageert met een hoge antistoffenproductie wanneer dode vaccins als booster toegediend worden. Dode vaccins verbeteren de immuunrespons door de stabiliteit van het vaccin te verhogen, en het immuunsysteem langer te stimuleren (Jacob et al., 1998). 6.2. OORZAKEN VAN VACCINATIEFALEN Het falen van vaccinatie treedt op wanneer, volgend op vaccintoediening, de kippen geen adequate antistoffentiters ontwikkelen en/of vatbaar zijn bij uitbraak van een veldstam. Wanneer vaccinatie faalt, heeft men de neiging om met een beschuldigende vinger naar het vaccin te wijzen. Hoewel dit een belangrijke factor is om in rekenschap te nemen, zijn er vele andere factoren die geëvalueerd dienen te worden om de oorzaak aan het licht te brengen. Volgende factoren komen veelvuldig voor bij het falen van vaccinaties bij commercieel pluimvee (Butcher en Miles, 1994; Butcher en Yegani, 2008): 6.2.1.Vaccinatieprogramma Elke regio heeft haar eigen specifieke ziekten, waardoor men geen standaard of internationaal vaccinatieprogramma kan ontwikkelen. In gebieden met een hoge concentratie aan industriële pluimveebedrijven, gebieden waar kleine koppels dicht bij grote, commerciële koppels worden gehuisvest, of bij bedrijven met een lage bioveiligheid, zijn meer intensieve vaccinatieprogramma’s noodzakelijk. Zo kan men beroep doen op mesogene levende vaccins (2 lentogene levende vaccins (1

ste

de

keuze) in plaats van de

keuze). Deze zogenaamde hot strain vaccins geven meer entreacties,

maar ondervinden minder interferentie van de maternale immuniteit waardoor ze sneller ingezet kunnen worden. In sommige gebieden doet men geen beroep op vaccins, en levert men opvallende topprestaties. Vaccinreacties hebben een duidelijke impact, waardoor men kan concluderen dat overmatig vaccineren geen houdbare situatie is. Vaccinatieschema’s moeten bijgevolg goed bestudeerd worden, zodat het resultaat niet meer schaadt dan dat het goed doet. Wanneer men een levend vaccin introduceert in een bepaalde regio, dient dat noodzakelijk te zijn. Nieuwe stammen of vaccins kunnen namelijk ziekte introduceren en verspreiden in het gebied. 6.2.2.Hanteren van een vaccin Een goed ontwikkeld vaccinatieprogramma zal niet effectief zijn wanneer het vaccin beschadigd raakt door foutief gebruik en opslag. Levende vaccins kunnen geïnactiveerd worden wanneer ze blootgesteld worden aan schadelijke omstandigheden. Vaccins dienen gehanteerd te worden zoals aangegeven wordt door de fabrikant. Eens een vaccin gefabriceerd is, tikt de klok om het te gebruiken. Zo kan IB-vaccin 50% van zijn potentie verliezen één uur na fabricatie, door het in een te warm milieu te brengen.

6

6.2.3.Tekortkomingen bij het toedienen Toedieningsfouten zijn de grootste reden van het falen van vaccinatie. Een goed getrainde ploeg is een must. Water- of voedervaccintie bereikt mogelijks niet alle dieren. Rekenen op de horizontale spreiding van het vaccin na replicatie, is riskant. Vaak resulteert dit in lange entreacties en een onderdrukte immuniteit van de koppel. Wanneer kippen gemist worden bij vaccinatie met geïnactiveerde vaccins, zijn er niet-gevaccineerde dieren, aangezien dit type vaccin geen horizontale spreiding

kent.

Levende

vaccins

in

drinkwater

kunnen

geïnactiveerd

worden

door

ontsmettingsmiddelen. Subcutane of intramusculaire vaccinatie faalt wanneer het vaccin niet op de correcte locatie wordt toegediend. Bij vergissingen, zoals pokkenvaccin dat verkeerdelijk voor ILTvaccin wordt aanzien en via de oogdruppelmethode wordt toegediend, kunnen er lesies en verliezen optreden. 6.2.4.Maternale antistoffen Hoewel vaccinatie belangrijk is, is een goede timing primordiaal. Bij kuikens die gevaccineerd worden terwijl ze nog hoge titers aan maternale antistoffen hebben, zal het vaccin falen omwille van neutralisatie. Een groot deel van het vaccin zal vernietigd worden, waardoor het immuunsysteem minder gestimuleerd wordt. Ook te laat vaccineren is afgeraden omdat de kuikens dan voor een korte periode kwetsbaar zijn (Butcher en Richard, 1994). 6.2.5.Stress Vaccinatie geeft stress. Een kip die geïnoculeerd wordt met een levend vaccin, wordt eigenlijk geïnfecteerd met een milde vorm van de ziekte. Stress, veroorzaakt door bijvoorbeeld extreme temperaturen, extreme vochtigheid, nutritionele fouten, parasitisme en andere ziekten, kan de weerstand onderdrukken. Een basisregel voor vaccinatie is altijd de vaccinatie uit te stellen tot de vogels gezond zijn. Het is beter een vaccin over te slaan in een zieke koppel, dan te vaccineren wanneer er ziekte is. 6.2.6.Timing Kippen kunnen reeds geïnfecteerd zijn op het moment van vaccinatie. Ondanks correcte vaccinatie, worden de dieren toch ziek omdat het even duurt vooraleer de antistoffenproductie beschermende titers haalt. Bij blootstelling aan levend vaccin wordt ongeveer 4 tot 5 dagen na blootstelling IgG eerst gedetecteerd, maar de beschermende titers volgen pas dagen later. 6.2.7.Onderdrukking van het immuunsysteem De immuniteitsstatus van de koppel moet ook in rekenschap gebracht worden bij vaccinatie. Immunosuppressie kan optreden bij infectie met de Ziekte van Marek, Gumboro of Chicken Infectious Anemia (CIA), of door

het consumeren van voeder met een hoog mycotoxinegehalte. 7

Immunosuppressie verwijst naar de omstandigheden waarin de niet-cellulaire (antistoffen) en cellulaire component van het immuunysteem niet naar behoren functioneren. Dit geeft een beperkte immuunrespons en mogelijks erge entreacties. 6.2.8.Bedrijfsmanagement Slechte bedrijfsvoering kan aanleiding geven tot het falen van vaccinatie. Indien infectieuze agentia vrij kunnen verspreiden en vermenigvuldigen zonder voorafgaande ontsmetting in opeenvolgende ronden, is het mogelijk dat de hoeveelheid infectieus agens te groot is om een normaal, effectief vaccinatieschema te doen slagen. Op lange termijn kunnen vaccins een goede bedrijfsvoering niet vervangen. 6.2.9.Vaccinkwaliteit Vaccinkwaliteit komt in een slecht daglicht te staan wanneer de antistoffentiters onvoldoende hoog zijn, of wanneer er toch ziekte uitbreekt in de koppel. Desondanks kan men meestal aantonen dat de vaccins van excellente kwaliteit zijn, en niet verantwoordelijk zijn voor het falen van de vaccinatie. Men dient om zeker te zijn producten aan te kopen van gerenommeerde farmaceutische bedrijven, die vaccins fabriceren onder strikte kwaliteitscontrolesystemen. 6.2.10. Vaccinmodificaties Commerciële pluimveebedrijven kunnen – om de kosten te reduceren – partiële vaccindoses toedienen. Wanneer partiële doses worden toegediend, zal het immuunsysteem van de kippen onvoldoende gestimuleerd worden. Het resultaat is een verlaagde weerstand tegen ziekten. Men dient te vaccineren zoals aangegeven door de fabrikant. Het gebruik van vaccins die excessief geattenueerd zijn, kan leiden tot een gebrek aan immunogeniteit en een verhoogde kans op het aanslaan van ziekten. Daarentegen kunnen vaccins die niet genoeg verzwakt zijn, verlengde entreacties en een verhoogde vatbaarheid voor secundair bacteriële infecties teweegbrengen, zoals E. coli. In sommige gevallen zijn de verliezen hierdoor vergelijkbaar met een uitbraak van de veldziekte. 6.2.11. Vaccinstam en –serotype Vele ziekten worden veroorzaakt door agentia met tal van verschillende stammen en serotypes. Soms kan het vaccin niet de correcte stam - of het juiste serotype - bevatten om beschermende titers te ontwikkelen tegen de veldziekte. Hoewel het vaccin correct werd toegediend, en er adequate titers ontstaan tegen de vaccinstam of -serotype, zullen de kippen ziek worden. Problemen met zulke varianten worden gezien bij vogelpokken, IB-virus, IBD-virus en de Ziekte van Marek. In sommige gevallen is de veldstam van het organisme hoogvirulent en de vaccinstam sterk geattenueerd. In deze situatie mag de koppel dan nog zo goed gevaccineerd zijn, de verkregen immuniteit is ontoereikend om 100% bescherming te geven tegen de ziekte. 8

6.3. IN OVO VACCINATIE 6.3.1.Vaccineren op broeierijniveau Bij het vaccineren op broeierijniveau stuit men op drie problemen (Warin, 2005): 

Interferentie met verkregen maternale antistoffen: De moederdieren geven een variëteit (zie hiervoor) aan antilichamen mee aan hun nageslacht, die de kuikens beschermen gedurende de eerste levensweken. Deze antilichamen zullen weerstand bieden tegen wildvirussen, maar kunnen ook virussen neutraliseren afkomstig van levende vaccins, waardoor deze niet kunnen repliceren en, daardoor, het immuunsysteem niet of te weinig stimuleren. Verkregen antilichamen zullen aanwezig zijn in de algemene circulatie, maar minder op lokaal niveau, inclusief in het oculaire, nasale en tracheobronchiale mucosale membranen. Het is mogelijk gebruik te maken van deze situatie, door levende vaccins te sprayen (IB en NCD): ze zullen vrij kunnen repliceren in de mucosa, waarbij lokale immuniteit wordt opgewekt. Aangezien deze mucosamembranen de belangrijkste ingangspoort zijn voor wildvirussen, zal deze lokale immuniteit de eerste verdedigingslinie vormen voor het kuiken (Ogra et al., 1980). Hoe dan ook, lokale immuniteit op zich is slechts weinig effectief tegen virussen waarvan de belangrijkste ingangspoort het spijsverteringsstelsel is (bijv. IBD).



Broeierijvaccinatie is een initiële vaccinatie, de stammen die gebruikt worden zijn een compromis tussen doeltreffendheid en veiligheid: ze dienen genoeg immunogeen te zijn om een goede immuniteit op te wekken, maar zonder ongewenste effecten te veroorzaken bij de vogels. De keuze van de vaccinstam en het attenuatieniveau hangt af van de sanitaire status van de kuikens, en de omstandigheden waaronder ze grootgebracht worden: sterk geattenueerde vaccins worden gekozen voor vogels die bijvoorbeeld mycoplasmaproblemen hebben, of naar bedrijven getransporteerd worden met minder goede afmestomstandigheden, om het risico op complicaties te vermijden.



Wanneer verschillende vaccins tegelijkertijd worden toegediend, dient men rekening te houden met het feit dat er geen interacties mogen zijn, ofwel moet er zoveel mogelijk inspanning geleverd worden om dit te minimaliseren. Bijvoorbeeld, omwille van intrinsieke biologische verschillen, zal het IB-virus sneller repliceren dan het NCD-virus: 24-48 uur per cyslus tegen 4-5 dagen per cyclus, respectievelijk. Ook zal een NCD-vaccin meer tegen een NCD-infectie beschermen, dan wanneer een gecombineerd NCD/IB-vaccin wordt toegediend. De eigenlijke oorzaak hiervan is nog niet bekend, maar om dit probleem te omzeilen, kan men stammen toedienen die elk op een andere locatie repliceren (bijv. trachea en darmen). Wanneer de infectiedruk hoog is, is het aangeraden dat beide vaccins met één week tussentijd worden toegediend, en liefst eerst tegen het virus vaccineren dat het meeste risico geeft (meestal NCD-virus) (Ali et al., 2004; Rauw et al., 2009).

9

6.3.2.Voordelen van in ovo vaccinatie In ovo inoculatie van vaccins geeft de mogelijkheid om heel effectief een universele, zeer hoge gezondheidsstatus bij pluimvee te bekomen (van den Wijngaard, 2002; Williams en Hopkins, 2011): - Vroege immuniteit: Een snellere blootstelling aan verscheidende vaccins verbetert de gezondheid van de vogels en de ziekteresistentie wanneer ze op het afmestbedrijf komen. Er is slechts een minimale interferentie met maternaal doorgegeven antistoffen. - Uniforme toediening: In ovo vaccinatie laat een geautomatiseerd en uniform proces toe om consistente vaccinhoeveelheden en –concentraties aan elke vogel toe te dienen. Dit is een hele verbetering wanneer men dit vergelijkt met de voorheen gebruikte subcutane injectiemethode op de dag van uitkippen, die gevoeliger is aan menselijke fouten. - Snellere afzet: De tijd tussen de uitkipmachine en de afzet naar boerderijen toe wordt gereduceerd omdat er geen vaccinaties meer hoeven te gebeuren. De kuikens komen op deze manier met minder stress, sneller in hun opgroeiomgeving. - Stressreductie: De vogels zijn, in tegenstelling tot vaccinatie via injectie onmiddellijk na het uitkippen, minder gestresseerd na in ovo vaccinatie. - Reductie van de arbeidskosten: Een reductie van de arbeid, die direct geassocieerd is met de subcutane vaccinatie op de dag van uitkippen, wordt gerealiseerd. - Naaldhygiëne: Door het individueel reinigen van elke naald na elke injectie, in tegenstelling tot manuele injectie na het uitkippen, wordt het risico op ziekteverspreiding minimaal. - Toekomstige producten: Steeds meer komen er producten en vaccins op de markt om dierziekten te controleren via in ovo toepassing. - Jaarlijkse miljoenenbesparingen voor de pluimvee-industrie omwille van bovenstaande voordelen, waardoor de sector eventueel: goedkoper kippenvlees kan aanbieden aan de consument, nieuwe broeierijen kan ontwerpen met verhoogde sanitaire normen, en zich meer kan focussen op een meer welzijnsgerichte pluimvee-industrie. 6.3.3.Vaccinvoorbereiding Veldobservaties tonen aan dat microbiële contaminatie van het vaccin een klein tot zeer groot verlies in uitkippercentage kan betekenen, met een toename van vroegtijdige sterfte als direct gevolg. Het spreekt voor zich dat vaccincontaminatie de kwaliteit van de kuikens negatief beïnvloedt, aangezien pathogene bacteriële organismen of onjuiste vaccinvirussen in ovo geïntroduceerd worden. Vaccins voor in ovo gebruik dienen steriel te zijn, en worden meestal bewaard en bereid op een andere locatie dan vaccins die gebruikt worden voor sprayvaccinatie op de dag van uitkippen (Ziekte van Newcastle, Infectieuze Bronchitis). Foutieve toepassing van een vaccin dat niet bestemd is voor in ovo toediening 10

kan de gezondheid en het uitkippen van kuikens ernstig schaden. Om zulke kostelijke fouten te vermijden is het van belang een gescheiden opslag- en voorbereidingsruimte te voorzien voor in ovo vaccins en vaccins die op de uitkipdag worden toegediend (Cereno, 2004). In geval van bacteriële contaminatie tijdens het mengproces, kan het causale bacteriële organisme normaalgezien geïsoleerd worden uit de nog niet uitgekipte embryo’s of onbevruchte eieren die geïnjecteerd werden, evenals de omgeving van de voorbereidingskamer. In de meeste gevallen is de contaminatiebron het dooiwater van het Marek-vaccin. De standaardprocedure voor het mengen van vaccins vereist het gebruik van gedestilleerd water (geen drinkwater) in het dooibad. Een bacteriële contaminatie van het dooibad kan het gevolg zijn van: een bacteriële introductie via de schoepen van de mixer, een gecontamineerde dooibadcontainer of het gebruik van gecontamineerd drinkwater. Waterdruppeltjes aan de buitenzijde van het ampul kunnen gemengd raken met het vaccin wanneer er contact is tussen het gecontamineerde water en het openen van het ampul tijdens het mengproces. Geen enkel proces is meer cruciaal om te controleren bij in ovo vaccinatie, dan het correct aseptisch voorbereiden van het vaccin (Williams, 2005a). 6.3.4.Toedieningslocatie Er bestaan 5 verschillende compartimenten binnen het ei die tijdens de late incubatiefase bereikbaar zijn voor in ovo vaccinatie. Om de immuunrespons te maximaliseren, en aldus de kuikenkwaliteit, dient men bij in ovo vaccinatie het juiste compartiment met vaccin te injecteren. De compartimenten van een broedei in late fase zijn: de luchtcel, de allantoïszak (excreta), het amionvocht, het embryonaal lichaam en de dooierzak (Figuur 1). Elk compartiment wordt bij vaccintoediening via een andere route benaderd, wat zich vertaalt in afzonderlijke, antigenische presentatieroutes aan het immuunsysteem. Daarnaast treden er drastische veranderingen op in deze compartimenten, aangezien ze door het ontwikkelende embryo gebruikt worden gedurende de ideale injectieperiode, dag 17,5 tot dag 19 van het broedproces. Bijkomstige studies naar injectieplaatsen toonden aan dat nagenoeg 100% van de gevaccineerde embryo’s vaccin ontvangen in het amnionvocht of de rechterborst. Zoals reeds vermeld, beïnvloedt de ontwikkelingsfase van het embryo hierbij de injectieplaats. De meeste embryo’s die commercieel gevaccineerd worden tussen dag 18 en dag 18 met 10-12 uren incubatie, krijgen het vaccin in het amnionvocht toegediend, waardoor het voor het uitkippen door het embryo wordt opgenomen, ingeademd of beide. Bij de meer ontwikkelde embryo’s in de populatie, die later gevaccineerd worden (vroeg dag 19), bestaat er een grotere kans dat het vaccin in het embryonaal weefsel wordt toegediend. Rechtstreekse toediening in het embryonaal lichaam is dus gebruikelijk, niettegenstaande dat een te diepe penetratie in het ei – op elk moment van ontwikkeling – excessief trauma kan veroorzaken aan het embryo (Avakian et al., 2002; Williams, 2005a).

11

Figuur 1: Overlangse doorsnede van een kippenei op dag 1 (links) en op dag 15 (rechts). Bij in ovo vaccinatie op het moment van transfer, zal het ei zo georiënteerd zijn dat de luchtcel zich bovenaan bevindt (www.infovisual.info). In een serie van goed doordachte studies, tekende Phelps (1995) de effecten van in ovo injectieplaatsen uit aangaande antibiotica-injectie en de daaropvolgende absorptie binnen het embryo, gemeten via bloedplasmawaarden (Figuur 2). De resultaten van antibioticatoediening in de verschillende compartimenten binnenin het ei op dag 18 in de incubatieperiode, gaven een interessant contrast weer wanneer we ze vergelijken met de toediening van Marek-vaccin. Luchtceltoediening van Marek-vaccin resulteert in geen efficaciteit, terwijl antibioticatoediening in de luchtcel wel een snelle absorptie kent, met verhoogde bloedniveaus voor 24 uur. Injectie van Marek-vaccin of antibiotica in het allantoïsvocht geeft lage antibioticaniveaus in het bloed, en een gereduceerde efficaciteit tegen de Ziekte van Marek.

Figuur 2: Gentamicineniveaus in het plasma (µg/ml) na in ovo toediening van 1mg gentamicine in de compartimenten van een 18 dagen geïncubeerd broiler ei (Phelps, 1995). 12

De verschillende compartimenten binnen het ei staan in voor verschillende steunfuncties tijdens de embryonale ontwikkeling, en de vloeistofdynamica en samenstelling van de compartimenten verschilt. Scheiding van nutriënten en afval is hierbij uiterst belangrijk voor de overleving van het embryo tijdens de broedperiode. Inoculatie van antigenische en therapeutische stoffen in de individuele ruimten binnenin het ei, kan hun opname door het embryo bijgevolg doen toenemen of limiteren. Ook de specifieke opnameroute en het type of de grootte (moleculair gewicht) van de stof zelf, kan het effect op het embryo beïnvloeden (Avakian et al., 2002; Williams, 2005a). De belangrijkste steunfunctie van de allantoïsblaas voor het embryo is wateropslag en de reabsorptie van elektrolyten. De passage van stoffen en antigenen van de allantoïsblaas naar het embryo wordt echter gelimiteerd door de allantochoriale bloedcirculatie en het membraan zelf. Daarentegen wordt het amnion opgenomen door het embryo vlak voor het uitkippen. Het inbrengen van antibiotica of Marek-vaccin in het amnion resulteert in dit geval in orale opname, en inwendige absorptie via de mucosa van het ademhalingsen spijsverteringsstelsel van het embryo (Avakian et al., 2002). 6.3.5.Eilokalisatie, eischaalpenetratie en injectiesite (Williams, 2005b) 6.3.5.1. Eilokalisatie Eilokalisatie is simpelweg de mogelijkheid om het ei te lokaliseren en het injectieapparaat op het eischaaloppervlak te plaatsen. De locatie van het ei dient correct te zijn ,zowel horizontaal als verticaal. Eens de eieren in de eilade geplaatst worden, kan hun oriëntatie veranderen omwille van de eigrootte en het periodiek keren bij incubatie, zodat ze van hun initiële, centrale as gaan afwijken en gaan leunen. Wanneer een ei leunt, zal het embryo zich oriënteren volgens de zwaartekracht, waarbij de kop de omgekeerde richting uitwijst van de kantelrichting. Door de injector te voorzien van een translationele of zijwaartse beweging om de eischaal te vinden, bewerkstelligt men twee zaken: de Figuur 3: Zijdelingse en translationele beweging (Williams, 2005b).

injector loodrecht in het verlengde brengen van de centrale ei-as (ook al leunt het ei), en de vaccinatienaald en punch (naald rondom de vaccinatienaald) naar het inwendige centrum van het ei richten (Figuur 3).

6.3.5.2. Eischaalpenetratie We kunnen het embryo niet succesvol bereiken voor vaccinatie, zonder penetratie van de eischaal. Dit klinkt logisch, maar het is noodzakelijk om dit proces in twee stappen te delen omwille van de steriele en de fysiologische vereisten van embryovaccinatie. De eerste stap is de perforatie zelf, en de tweede stap is toegang krijgen tot het embryo als dusdanig. Om deze reden werd het ‘naald in een naald’concept ontwikkeld met een uitwendige naald of punch, en een inwendige naald of vaccinator (Figuur 4). De punch werd ontwikkeld voor eischaalpenetratie en werd getest voor gebruik op lange termijn. Ze gaat ongeveer een jaar mee, waarin ze meer dan één miljoen eieren doorboort. Het ontwerp van 13

de punch bevat twee externe openingen in de canule zelf, die sanitaire behandeling toelaten. De naaldpunt is echter van groter belang, aangezien de hoek ervan toelaat de eischaal herhaaldelijk te doorboren zonder af te breken, en er een minimum aan eischaalresten wordt achtergelaten aan de binnenzijde van het ei, of op het oppervlak van het luchtcelmembraan.

Figuur 4: Overlangse doorsnede van het 'naald in naald'-concept (Williams, 2005b). 6.3.5.3. Injectiesite De injectiesite wordt beïnvloedt door de naaldpunt en – grootte. De naald die gebruikt wordt om het vaccin in te brengen via het Inovoject®-systeem (vaccinator), is een 20 gauge naald met een naaldtop die een vrij stompe hoek heeft van 45 graden. De naaldopening is minder dan 1mm. Een doorsnee,

wegwerpbare

spuit

daarentegen, heeft een hypodermische naald van 20 gauge met een naaldtop van Figuur 5: Injectiesite is afhankelijk van naaldgrootte

28 graden die ongeveer 3mm lang is. Als

en -punt (Williams, 2005b).

beide naalden tegelijkertijd geïnjecteerd worden op een diepte van 25mm, kan de

injectiesite sterk differentiëren (Figuur 5). Zoals hiervoor al werd bediscussieerd, beïnvloedt de embryonale leeftijd de injectiesite. De incubatieleeftijd is niet de enige beïnvloedende factor, ook het incubatortype, het kippenras, en zelfs verlengde opslag van de eieren voor het incuberen (>7 dagen). De relatieve grootte van het embryo en de aan- of afwezigheid van eicompartimenten buiten het embryo, beïnvloedt de mogelijkheid om bij in ovo vaccinatie met de vaccinator in de correcte eicompartimenten terecht te komen. 14

6.3.6.Invloed op het embryo 6.3.6.1. Embryoleeftijd en uitkippercentage Het begrijpen van de embryonale ontwikkelingsfase en zodoende het injectietijdstip, legt enkele specifieke zaken bloot aangaande het broedproces. Deze kunnen geëvalueerd worden aan de hand van het uitkippercentage, om zo de kuikenkwaliteit te maximaliseren bij in ovo toepassingen. Injecteren op het correcte tijdstip zal niet enkel het uitkippercentage verhogen, maar ook de prestaties en de immuniteitsstatus van de vogels tijdens de opfokfase. Om te mikken op bepaalde, geprefereerde locaties, moet men de verschillende fysiologische karakteristieken begrijpen die geassocieerd zijn met de embryonale ontwikkeling in de late fase van het broedproces. Een te vroege ei-injectie zal het uitkippercentage reduceren door het toenemen van sterfte bij embryo’s in de late ontwikkelingsfase, alsook het toenemen van de incidentie van gemiste vaccinaties. Een te late vaccinatie zorgt voor een toegenomen aantal gebroken eieren en problemen wat betreft vacuümtransfer. Over het algemeen is de meest geschikte tijdsperiode gelegen tussen dag 17, en 1214 uur incubatie, tot dag 19, en 2-4 uur incubatie, waarbij het tijdstip ‘nul’ het normale inlegmoment is. Bij ei-injectie op dag 17 is aangetoond dat het uitkippercentage 1 tot 2% daalt in vergelijking met injectie op dag 18. Het moet gezegd dat ook niet-geïnjecteerde eieren (controlegroep) een dalend uitkippercentage hebben, wanneer de overdracht van de voorbroedmachine naar de uitkipmachine op dag 17 doorgaat in plaats van op dag 18 (Williams, 2005a; Moreira de Souza, 2008). Verschillen in uitkippercentage zijn te wijten aan de verschillende omgevingsomstandigheden tussen voorbroedmachine en uitkommachine. Er bestaan markante verschillen in ventilatiekarakteristieken tussen de eieren onderling. In de voorbroedmachine zijn de eieren met het smalle uiteinde naar beneden georiënteerd, waardoor de laminaire luchtstroom ter hoogte van de stompe kant van het ei passeert. In de uitkommachine liggen de eieren op hun zijde. De omgevingsverschillen tussen deze twee milieus kunnen geëvalueerd worden naargelang waterverlies, vochtigheidsgraad, warmte, CO 2gehalte en beschikbare zuurstof. Toename van warmte, CO 2-gehalte en vochtigheidsgraad kan in de uitkommachine – in tegenstelling tot de voorbroedmachine - op dag 18 teruggevonden worden ter hoogte van het embryo. Gelijklopend zal men een daling in waterverlies en zuurstofbeschikbaarheid kunnen vaststellen in de uitkommachine. Een positief effect op het uitkippercentage wordt bekomen wanneer het embryo langer in het klimaat van de voorbroedmachine verblijft. Het uitkippercentage van geëmbryoneerde eieren wordt negatief beïnvloedt door ze op een te vroeg tijdstip in de uitkommachine te plaatsen, losstaand van het feit of ze geïnjecteerd zijn of niet (Williams, 2005a). Verschillen tussen in ovo geïnjecteerde en niet-geïnjecteerde eieren kunnen te wijten zijn aan de injectie-opening in de eischaal. Een opening in de eischaal afkomstig van een naald van 16 gauge, veroorzaakt een bijkomende toename van 25 tot 30% in het relatieve poriënvolume van het ei. De opening doet het waterverlies niet drastisch toenemen in de periode voor uitkomen (<0,5%). Andere fysiologische parameters daarentegen kunnen wel beïnvloed worden. Er kan zelfs een fysiologisch 15

voordeel ontstaan voor het embryo wat betreft respiratie en gasuitwisseling gedurende de late ontwikkelingsfase, en dan vooral in eieren afkomstig van oudere moederdieren (Williams, 2005a). 6.3.6.2. Embryonale schade Er kan echter ook een nadeel zijn wanneer te vroeg geïnjecteerd wordt (voor dag 17,5), omdat het schade kan berokkenen aan het embryo of de ondersteunende weefsels binnenin het ei (te invasief), of een massale microbiële contaminatie kan teweegbrengen gedurende het uitkippen. Verschillende types broedmachines vertonen een verschil in waterverlies en temperatuurprofiel, wat resulteert in variërende fasen van embryonale ontwikkeling op eenzelfde chronologische leeftijd. Het optimale moment voor ei-injectie is meer afhankelijk van de fysiologische karakteristieken van het embryo, dan van de eigenlijke broedtijd. De optimale tijd om te injecteren - gebaseerd op de fysiologische ontwikkeling – is de periode tussen het naar boven migreren van de steel van de dooierzak in het abdomen en het onder de vleugel wegsteken van de kop, tot het uitkippen geïnitieerd wordt (Williams, 2005a; Williams en Zedek, 2008). Bij single-stage incubatie bevinden alle eieren in de incubator zich in dezelfde ontwikkelingsfase. Multi-stage incubatie kent een continue aanvoer van broedeieren, waarbij eieren één of meerdere keren per week ingelegd worden. Er wordt gebruik gemaakt van de gegenereerde warmte van de eieren aan het einde van het broedproces, om de eieren aan het begin van het proces te verwarmen. Over het algemeen zullen multi-stage tunnelincubators een groter verlies aan water en relatieve warmte genereren gedurende het broedproces, dan multi-stage inwandelincubators. Dit houdt in dat embryo’s beter geschikt zijn voor ei-injectie op een vroeger tijdstip wanneer commerciële multi-stage tunneltypes worden gebruikt, in vergelijking met multi-stage inwandeltypes. Kleine aanpassingen aan het injectietijdstip kunnen worden gemaakt om commerciële broeierijschema’s op punt te zetten (Williams en Zedek, 2008). Wanneer men laboratoriumexperimenten uitvoert waarbij de eieren manueel geïnjecteerd worden, is het belangrijk om een representatief aandeel van de eieren te evalueren vooraleer ze geïnjecteerd worden, om zo de fysiologische leeftijd van het embryo vast te stellen. Incubatie in laboratoria en kleinere incubatiesystemen geeft vaak een uitgestelde embryonale ontwikkeling. Gelijkaardige chronologische en ontwikkelingsproblemen zijn aanwezig bij eieren waarbij de embryo’s doorheen de schaal gebroken zijn. Hoewel de injectie zelf gecontroleerd verloopt, is er een grotere kans op breken van de eieren wanneer ze verplaatst worden als er meerdere gaten aanwezig zijn in de eischaal. Breuken boven het luchtcelmembraan gedurende de late fase (dag 19), geven niet noodzakelijk een mindere kans op uitkippen bij verplaatsing of injectie. Daarentegen zullen eieren met breuken die zich situeren onder het luchtcelmembraan, aan het smalle uiteinde of de zijkanten van het ei, het embryo gewoonlijk gevangen nemen binnen de eischaal, en de kans op uitkippen doen dalen. Eieren die geïnjecteerd worden gedurende de late incubatiefase (dag 19) zouden minder dan 1% eieren moeten bevatten waarvan het embryo reeds uitkipt (Williams en Zedek, 2008).

16

6.3.7.In ovo instrumentariumhygiëne en antibioticagebruik Het ei-injectieproces moet ondersteund worden door een grondig reinigings- en desinfectieprogramma in de broeierij, maar net zo belangrijk is de reiniging van het vaccinatiemateriaal zelf. De kuikenkwaliteit kan ernstig gecompromitteerd worden door direct contact met gecontamineerd vaccinatiemateriaal, aangezien bij in ovo vaccinatie de eischaal doorboord wordt. Dagelijkse reiniging en ontsmetting van gebruikt materiaal is bijgevolg van cruciaal belang, alsook de bewaring van materiaal tijdens perioden van onbruik, waarbij organische of microbiële bevuiling minimaal dient te zijn. Vooraleer men de injector installeert, wordt een grondige omgevingsanalyse uitgevoerd om het contaminatieniveau na te gaan. Er worden stalen genomen op verschillende locaties in de broeierij, die geanalyseerd worden op de aanwezigheid van bacteriën en schimmels, maar vooral op de aanwezigheid van Aspergillus (Williams, 2005a). Verder dient het injectiemateriaal ontworpen te zijn zodat het gemakkelijk te reinigen is. De injectoren zelf, en ook de naalden en transfercomponenten, moeten routinematig gereinigd en ontsmet worden (Figuur 6) (Villalobos en Williams, 2011). Automatische ontsmetting en sterilisatie van de toedieningscomponenten van het vaccin, zijn een noodzaak om op lange termijn het proces optimaal te laten verlopen. Horizontale pathogene besmetting van ei tot ei door naalden, moet vermeden worden door gecontroleerde sanitaire maatregelen te implementeren, voor elke component die het ei raakt tussen elke injectie. De kuikenkwaliteit kan in het gedrang komen bij terugval van elkeen van deze sanitaire vereisten, zodat gebruiksgemak een cruciaal gegeven wordt bij het systeemontwerp (Villalobos, 2012).

Figuur 6: Via openingen in punch of uitwendige naald, kan de vaccinator of inwendige naald in 'naald in naald'-concept, gemakkelijk gereinigd worden tussen elke injectie (Villalobos en Williams, 2011). Op chloor gebaseerde reinigingsmiddelen worden gebruikt tijdens de ei-injectie. Ze worden getolereerd door het embryo, laten geen chemische residuen na op de eischaal, en zorgen voor een snelle eliminatie van bacteriën en virussen. De chloorconcentratie van het reinigingsmiddel 17

(gebufferde chlooroplossing) gedurende injectie, heeft een vereiste standaard van 5000ppm actieve chloor (0,5%) tijdens het mengen, en mag nooit onder de 3500ppm zakken tijdens het proces. Het is belangrijk dat het broeierijpersoneel de correcte menginstructies volgt, maar ook dat het management deze procedure benadrukt en de correcte producten voorziet. Ook de installatie zelf wordt gereinigd met op chloor gebaseerde reinigingsproducten en detergenten, en behandeld met isopropyl-alcohol tijdens opslagperioden (Villalobos en Williams, 2011). Antibiotica zijn geen vereiste bij in ovo vaccinatie, hoewel ze vroeger wel frequenter gebruikt werden bij in ovo vaccinatie tegen de Ziekte van Marek, om de steriliteit van het vaccin te waarborgen tijdens mengprocessen. Heden ten dage verwijderen meer en meer producenten antibiotica uit hun vaccinatieprogramma voor vleeskippen. Omwille hiervan werd de nood aan een striktere aseptische techniek en critical control points hoger bij het mengproces van het Marek-vaccin. Het water van het dooibad is altijd bacterieel gecontamineerd, tenzij men een strikt aseptisch werkt, steeds de handen grondig wast en bioveilig (gedestilleerd) water voorziet. Een mild desinfectans – en meer specifiek chloor – wordt aan het water van het dooibad toegevoegd om bacteriële contaminatie van het Marekvaccin te voorkomen. Embrex, een Amerikaans bedrijf gespecialiseerd in ovo vaccinatietechnologie en eigendom van Pfizer, heeft verschillende studies laten uitvoeren om te bepalen in welke mate chloorwater de vaccintiters beïnvloedt. Marek-vaccin werd ontdooid, geopend, en voor minstens 30 seconden in direct contact gebracht met dooiwater met 200ppm chloor en 500ppm chloor, bij volumes van 10, 25, 50 en 100µl. Het Marek-vaccin werd vervolgens bij een verdunningsvloeistof gevoegd, en het aantal plaque forming units (PFU) werd bepaald. De bekomen data wees uit dat water met 200ppm chloor geen bedreiging vormt voor Marek-vaccintiters, het water met 500ppm chloor of hoger gaf echter een significante reductie van de vaccintiters (Villalobos en Williams, 2011). 6.4. ENKELE TOEPASSINGEN VAN IN OVO VACCINATIE TEGEN PLUIMVEEZIEKTEN In ovo vaccinatie is een relatief nieuwe technologie waarbij er tot op de dag van vandaag verwoed gezocht wordt naar nieuwe methoden om via levende vaccins, antigenen van economisch belangrijke ziekten in eieren te inoculeren, waardoor er reeds verhoogde titers aanwezig zijn op de dag van uitkippen. Levend verzwakte vaccins, vectorvaccins (een virus wordt hierbij als vector gebruikt voor de genen van het pathogeen agens tegen dewelke men wenst te vaccineren), recombinante vaccins (een virus of een bacterie wordt genetisch gemodificeerd door deletie of insertie van een gen. Een voorbeeld hiervan is het ‘inlassen’ van een merkergen) of DNA-plasmide vaccins worden hiervoor aangewend. DNA-vaccins vormen een aparte groep. Het vaccin bevat DNA met het gen en zijn expressiecassette.

Nadat

dit

DNA-vaccin

parenteraal

in

het

embryo

wordt

ingespoten,

vermenigvuldigd het in de cellen van de gastheer. Daar komt het gen tot expressie en wordt het antigen geproduceerd. Het antigen wordt zowel aan de humorale als aan de cellulaire afweer blootgesteld. Deze manier van immunisatie belooft heel wat toepassingen voor de toekomst (Davidson et al., 2008). Onderstaande tabel (Tabel 1) geeft een idee welke vaccins er reeds commercieel kunnen worden aangewend voor in ovo gebruik, en welke vaccins er zich nog in een experimentele fase bevinden: 18

Tabel 1: Commerciële en experimentele in ovo vaccins (Davidson et al., 2008).

6.4.1.Ziekte van Marek (Marek’s Disease of MD) De Ziekte van Marek is een veel voorkomende lymfoproliferatieve ziekte bij kippen, gewoonlijk gekarakteriseerd door mononucleaire, cellulaire infiltraten in perifere zenuwen en verscheidene andere organen en weefels, inclusief iris en huid. De ziekte wordt veroorzaakt door een herpesvirus, is besmettelijk, en kan etiologisch onderscheiden worden van andere lymfoïede neoplasmen bij vogels (Saïf et al., 2008). De Ziekte van Marek wordt opgedeeld in een acute (symptoomloze sterfte, depressie, paralyse) en een klassieke vorm (paralyse van de nervus ischiadicus en nervus brachialis die respectievelijk poot- en vleugelverlamming geven). Postmortem vindt men bij klassieke Marek vergroting van voorgenoemde zenuwen, en bij acute Marek vergroting van nieren, gonaden, hart, proventriculus, en een vergrote lever en milt met white spots op beiden. Verspreiding gebeurt via cellen afkomstig van vederfollikels en de lucht. Eens geïnfecteerd zal de drager persisterend virus uitscheiden het hele leven lang (Vegad, 2007). CVI988, een serotype 1 van de Ziekte van Marek werd in een studie van Zhang en Sharma (2001) aangewend als in ovo vaccin in specific pathogen free (SPF) kippen, om te bepalen of dit virus een vroege bescherming biedt tegen de Ziekte van Marek na uitkippen. MD-virus CVI988 werd geïnjecteerd bij 17 dagen geïncubeerde eieren (groep 1) en vlak na uitkippen (groep 2). Een derde 19

groep (groep 3) werd niet gevaccineerd. Op een leeftijd van 1, 2, 3, 4, 5 en 7 dagen, werden bij kippen van elke groep stalen genomen en als volgt onderzocht: a) single-cell suspensies van de milt werden geïnoculeerd op fibroblast monolayers van kippenembryo’s, met als doel het virus te isoleren; b) secties van het bursaweefsel werden aangekleurd met anti-pp38 monoklonale antilichamen en via indirecte immunofluorescentie beoordeeld om virale antigeenexpressie na te gaan; c) kippen werden intra-abdominaal blootgesteld aan MD-virus RB1B, een virulent serotype 1 MD-virus. De resultaten toonden aan dat er bij kippen, geïnjecteerd met MD-virus CVI988 op dag 17 van de incubatie, geen detectie was van virus en virusproteïnes tot 3 en 2 dagen na uitkippen respectievelijk. Gedurende de eerste 4 dagen na uitkippen was er ook een significant bewijs dat de kippen die MD-virus CVI988 kregen op dag 17 van de incubatie, een betere bescherming hadden tegen virulent MD-virus, dan degenen die MD-virus CVI988 kregen op de dag van uitkippen. Deze resultaten geven aan dan MDvirus CVI988 proteïnes adequaat tot expressie kwamen binnen het embryo, zodanig dat een immunologische respons kon opgestart worden voor het uitkippen. Wakenell et al. (2002) toonden aan dat de doeltreffendheid tegen het Marek-virus afhankelijk was van de plaats waar het vaccin in ovo werd toegediend (Figuur 6). Het vaccin was niet effectief wanneer het toegediend werd in de luchtcel of de allantoïszak, wat bijgevolg een lage beschermingsindex (protective index) gaf. De beschermingsindex of protective index is hierbij een vergelijking tussen de hoeveelheid therapeutisch agentia om een bepaald effect te bekomen en de hoeveelheid van het agentia dat toxiciteit veroorzaakt. Kwantitatief is dit de ratio die gegeven wordt door de toxische dosis te delen door de therapeutische dosis. De hoogste effectiviteit vond men in het amnionvocht, met een beschermingsindex van 94,4%, en in het embryonaal lichaam, met een beschermingsindex van 93,9%. De mate van bescherming die kuikens hadden wanneer het vaccin in de allantoïszak of de luchtcel ingebracht werd, bleek minder dan 50%. Men concludeerde hieruit dat het vaccin diep genoeg in het ei moet worden ingebracht, namelijk in het amnion, die het embryonaal lichaam en het amnionvocht bevat. De dooierzak werd in deze studies niet geëvalueerd.

Figuur 6: Beschermingsindexen (Protective indices) van verschillende eicompartimenten na in ovo vaccinatie met Marek-vaccin HVT/SB-1 (Wakenell et al., 2002). 20

Vele individuele studies werden uitgevoerd aangaande het Inovoject®-systeem en de Ziekte van Marek. Het systeem werd gevalideerd tussen verschillende rassen, alsook eieren van verschillende leeftijden van moederdieren (eigrootte) (Avakian et al., 2002; Williams, 2005a). 6.4.2.Gumboro (Infectious Bursal Disease of IBD) Gumboro, veroorzaakt door een dubbelstrengig RNA virus van de familie Birnaviridae, treedt acuut op en is een hoog besmettelijk voor jonge kippen. Naast Newcastle Disease is het economisch de belangrijkste ziekte bij pluimvee aangezien de mortaliteit hoog is. Er bestaan 2 serotypes waarvan enkel serotype 1 ziekte voortbrengt, en verschillende stammen die variëren van laag virulent tot hoog virulent, met respectievelijk lichte (groeivertraging) en zware (beven, depressie, witte en waterige diarree, gedaalde eetlust, en finaal sterfte) klinische symptomen. Het veroorzaakt een verlengde immunosuppressie van het immuunsysteem aangezien het lymfotroop is en de cellen van de Bursa van Fabricius aanvalt, wat kan leiden tot vaccinfalen, E. coli infecties, en gangreneuze dermatitis. Secundaire ziekten die doorbreken doen veelal meer schade dan het virus zelf. Het virus is zeer stabiel en kan maanden in de omgeving overleven (Shandana, 2007). In 2004 voerden Riaz et al. een studie uit bij vleeskuikens om de in ovo vaccinatietechniek te evalueren bij IBD-virus. In totaal werden er 160 geëmbryoneerde kippeneieren in vier groepen gedeeld na 18 dagen broeden: A, B, C en D (positieve controlegroep), met elk 40 eieren per groep. Drie verschillende IBD-vaccins werden in het amnion geïnoculeerd in groepen A, B en C respectievelijk: intermediate strain (D-78), hot strain (Bursin) en een lokaal geprepareerd eivaccin (na 24 passages). De eieren kipten uit en de experimentele kuikens werden afzonderlijk grootgebracht. Het uitkippercentage was 93, 83, 90 en 97% respectievelijk in groep A, B, C, en D. De geometric mean titer (GMT) van de antilichamen was het hoogst in groep B (146,96), gevolgd door groep A en C (127,94), 14 dagen na uitkippen. 21 dagen na uitkippen waren de titers van A, B en C respectievelijk 56, 64, en 56. De GMT van IBDV was het hoogst in groep B - 64 in de bursa en 32 in de milt - 0 dagen na uitkippen, gevolgd door groep A en C respectievelijk. De virustiter nam gradueel af tot 15 dagen na uitkippen. De bescherming na introductie met een virulent IBD-virus was 100, 100, 90 en 17% in groep A, B, C, en D respectievelijk. Het eindresultaat bewees dat in ovo vaccinatie veilig en effectief is om de kuikens in hun jonge leven tegen IBD te beschermen. 6.4.3.Coccidiose Coccidiose is een ziekte van universeel belang in de pluimveeproductiesector. De protozoa van het geslacht Eimeria vermenigvuldigen in de darmen en veroorzaken weefselschade, resulterend in storingen in de voedsel- en nutriëntenopname, dehydratatie, bloedverlies, verlies van huidpigmentatie en verhoogde vatbaarheid voor andere ziektekiemen. Het betreft E. tenella, E. acervulina, E. maxima, E. brunetti, E. necatrix, E. mitis, E. praecox en E. mivati (Saif et al., 2008). De gesporuleerde oöcyst is het infectieuze stadium in de levenscyclus. Eens geïnfecteerd zullen de kippen drager zijn en oöcysten uitscheiden. Deze kunnen door mechanische vectoren – of soms zelf stof in de lucht – 21

verspreid worden. De kippen hebben een onverzorgd verenkleed, zijn depressief en hebben diarree. Kippen die geïnfecteerd zijn met E. tenella vertonen een bleke kam en lellen, en hebben bloed in de cecale feces (Vegad, 2007). In 2004 onderzochten Weber et al. de immunisatie van vleeskuikens wanneer ze in ovo geïnjecteerd werden met infectieuze stadia van 5 Eimeria-soorten. Bevruchte eieren werden geïnjecteerd op dag 18 van het broedproces met oöcysten van E. acervulina, E. maxima, E. mitis, E. praecox en E. 2

6

brunetti. De geïnjecteerde dosis varieerde voor alle soorten van 10 tot 10 gesporuleerde oöcysten per ei. Kuikens die in ovo oöcysten ontvingen, scheidden oöcysten uit na het uitkippen. Na 2 weken werden de kuikens experimenteel geïnfecteerd met homologe Eimeria-soorten. De in het ei geïmmuniseerde kuikens vertoonden een significante reductie in de lesiescores, een betere dagelijkse groei, of verminderde uitscheiding van oöcysten, vergeleken met hun niet-geïmmuniseerde 5

leeftijdsgenoten. In additionele studies werden eieren geïnjecteerd met 10 sporozoieten van E. tenella, E. maxima of E. acervulina per ei. De resultaten toonden aan dat in ovo immunisatie van vleeskuikens tegen verschillende soorten coccidia realiseerbaar is. De infectiviteit van de sporozoieten bij 18 dagen oude embryo’s varieerde afhankelijk van het soort Eimeria, en het medium waarin de sporozoieten opgelost waren voor het injectietijdstip. 6.4.4.Paramyxovirus (Newcastle Disease Virus of NCD) Newcastle Disease, veroorzaakt door paramyxovirus, is wereldwijd een hoog besmettelijke en fatale ziekte bij kippen en verscheidene andere vogelsoorten. De ziekte heeft een substantiële, economische impact in de pluimvee-industrie. NCD-virusisolaten verschillen sterk in virulentie en worden geclassificeerd als hoog virulent (velogeen), middelmatig virulent (mesogeen) en laag virulent (lentogeen), op basis van hun pathogeniteit bij de kip (Shandana, 2007). De symptomen variëren van lichte ademhalingstoornissen bij laag virulente stammen, tot acute sterfte, zenuwsymptomen, diarree en zwakte bij hoog virulente stammen. Indicatieve postmortem bevindingen zijn puntbloedingen op de klieren in de proventriculus, haemorrhagische letsels in de dunne darmen, trachea en tonsillen, en necrose in de milt in de vorm van white spots (Vegad, 2007). Vaccinatie is de belangrijkste preventiemethode om paramyxovirus onder controle te houden. Ondanks de beschikbaarheid van een aanzienlijk aantal conventionele vaccins, die stammen gebruiken zoals B1, F, Clone 30, La Sota, Mukteswar of andere lentogene en mesogene paramyxostammen, zal vaccinatie regelmatig falen omwille van het niet onderhouden van de koudeketen, onderdoseren, aanwezigheid van maternale antistoffen, fouten in het vaccinatieschema en slechte selectie van de vaccinstam. Met dit laatste bedoelt men dat niet alle levende vaccins in ovo toegepast kunnen worden, hoofdzakelijk omdat vaccinvirussen een hoge embryomortaliteit teweegbrengen, het uitkippercentage doen dalen of de net uitgekipte kuikens klinisch ziek doen worden. Selectie van een sterk geattenueerde virusstam, virusmodificatie, en een inoculatiedosis die minimale schade toebrengt aan het embryo of aan neonatale kuikens, zijn essentieel in de ontwikkeling van een levend in ovo vaccin (Chandana, 2007). 22

In 1992 werd de F-stam van NCD door Ahmad et al. bekomen via het Indian Veterinary Research Institute in Calcutta. Er werd een experiment opgezet met 5 experimentele groepen (E1-E5) en 2 controle groepen (C1 en C2), waarbij de geëmbryoneerde eieren van vleeskippen na 18 dagen incuberen - met een hypodermische naald - manueel geïnjecteerd werden met het F-stam NCD-virus in verschillende concentraties. Het vaccin-inoculum (0,1ml/ei) werd aldus over de groepen E1 tot en met E5 verdeeld, terwijl de controlegroepen C1 en C2 geïnjecteerd werden met 0,1ml steriele Phosphate Buffered Saline (PBS of fosfaat gebufferde zoutoplossing). De eieren werden uitgebroed en de kippen gevaccineerd via de oculo-nasale methode op de dag van uitkippen (groep C1), of 7 dagen later (groep C2). Uitgekipte kuikens uit alle groepen – behalve E5 – werden afzonderlijk onder laboratoriumomstandigheden grootgebracht, waarbij voeder en water ad libitum verstrekt werden. Op een leeftijd van 28 dagen kreeg 50% van de kippen in elke groep – behalve E5 – een herhalingsvaccin (La Sota). Er was geen ongevaccineerde controlegroep. De prestaties na in ovo vaccinatie werden nagegaan wat betreft uitkippercentage, overleving, ontwikkeling van de humorale immuniteit en bescherming tegen ziekte, en vervolgens vergeleken met conventionele vaccinatie na uitkippen (Ahmad et al., 1992). Zoals ook in vele andere studies wordt aangetoond, leken uitkippercentage en overleving van uitgekipte kuikens niet significant beïnvloed na in ovo vaccinatie met virusvaccin of PBS. Enkel in groep E1 en groep E2, waar de virusconcentratie hoger was, bleken deze twee parameters lager te scoren. In groep E1 stierven de kuikens binnen de 2 dagen door ademhalingsproblemen. Serologische resultaten toonden aan dat de antistoffenrespons bij de E-groepen sterk toenam, en alle kippen seropositief waren na vaccinatie na uitkippen. Daarentegen was de respons slecht bij de controlegroepen (C1, C2): slechts 42,1% en 88,8% respectievelijk waren seropositief na 3 weken. De experimentele groepen (E-groepen) hadden aldus vanaf dag 1 na het uitkippen, significant hogere titers dan wanneer er conventioneel werd gevaccineerd na uitkippen. In week 6 waren nog steeds 11,11-66,66% van de kippen seropositief in de E-groepen, tegenover 0% in de controlegroepen. Bescherming tegen infectie is het ultieme doel van vaccineren. Na experimentele virusblootstelling bleek 89-100% van de kippen in de controlegroepen, en 37,5-88,9% van de kippen in de in ovo gevaccineerde groepen (die geen herhalingsvaccinatie hadden gekregen) te sterven. Er bestond hierbij een sterke correlatie tussen mortaliteit en lage of geen antistof titers. Na herhalingsvaccinatie stierf slechts 11-20% van de kippen meer in de controlegroepen en E4, terwijl alle kippen overleefden in de andere E-groepen. Gestorven kippen vertoonden de hierboven geschreven symptomen. Over het algemeen kan men dus stellen dat in ovo vaccinatie duidelijk een hoger beschermingsniveau biedt aan kuikens, dan conventionele vaccinatie na uitkippen (Ahmad et al., 1992). 6.4.5.Aviaire influenza Aviaire influenza is een verzamelnaam voor diverse types type A orthomyxovirussen met hemagglutinine en neuraminidase-antigenen aan het virusoppervlak. De ziekte kent een wereldwijde distributie. Influenzavirussen variëren enorm in hun pathogeniteit, gaande van milde, respiratoire 23

problemen tot catastrofale verliezen geassocieerd met viscerotropische of pansystemische infecties. Wilde vogels fungeren als reservoir en zetten de ziekte over naar koppels in commerciële eenheden met een te lage bioveiligheid. Hoog pathogene aviaire influenza karakteriseert zich door subcutane, viscerale en mucosale bloedingen, en oedeem van de kop. Milde vormen van influenza resulteren in tracheïtis, longoedeem en - in de aanwezigheid van een bacteriële infectie - luchtzakontsteking (Saif, 2008; Vegad, 2007). Verschillende strategieën zijn ontwikkeld om levend verzwakt influenza vaccin (LVIV) voor in ovo toepassing te produceren. De eerste strategie betreft een recombinant vaccin. Een dergelijk recombinant LVIV werd recentelijk ontwikkeld tegen hoog pathogene aviaire influenza (HPAI) H5N1 en NCD-virus (Park et al., 2006; Steel et al., 2008). Dit bivalent vaccin gaf na één enkele in ovo dosis na 18 dagen geïncubeerde kippeneieren, 90% en 80% bescherming tot 3 weken na uitkippen, tegen NCD en HPAI H5N1 respectievelijk. Een andere strategie maakte gebruik van een viraal vectorvaccin, die een variant is van de vorige klasse. In dit geval was het vectorvirus een niet-replicerend humaan adenovirus serotype 5 (Ad5), dat de expressie van hemagglutinine (HA) van het laag pathogene aviaire influenzavirus (LPAI) H5N9 toeliet. Het vectorvaccin werd op een gelijkaardige wijze als het recombinantvaccin toegediend. Er volgde een experimentele blootstelling met het hoog pathogene aviaire influenzavirus (HPAI) H5N1 (89% HA-homologie, 68% bescherming) of HPAI H5N2 (94% HAhomologie, 100% bescherming). Desondanks werd in beide studies niet in detail ingegaan op het uitkippercentage (Toro et al., 2007). Bij vaccinstudies tegen andere influenzastammen, werd er in de meeste gevallen een negatieve invloed vastgesteld wat betreft het uitkippercentage, waardoor deze vaccins praktisch onbruikbaar waren (Cai et al., 2011). Cai et al. (2011) modificeerden de H7 en H9 HA-proteïnes van H7 en H9 laag pathogene influenzavirussen, door de aminozuren op hun knipplaats te substitueren met aminozuren die teruggevonden worden bij het H6 HA subtype. Ze vonden dat één enkele in ovo dosis bij 18 dagen geïncubeerde kippeneieren een complete bescherming gaf aan meer dan 70% van de kuikens, wanneer deze 2 tot 6 weken na het uitkippen experimenteel blootgesteld werden aan een homoloog 6

laag pathogeen virus. Daarnaast, na inoculatie van 19 dagen bebroede embryo’s met 10 Egg Infectious Dose 50 (EID 50: de dosis nodig om bij 50% van de geïnoculeerde eieren infectie op te wekken) aan laag pathogene influenzavirussen, bleek het uitkippercentage te stijgen tot meer dan 90% (equivalent aan de ongevaccineerde controlegroep), met een gelijkaardig beschermingsniveau. Deze bevindingen indiceren dat de strategie van het modificeren van de HA-knipplaats, gecombineerd met het aanwenden van levend geattenueerd influenza vaccin, wel degelijk kan toegepast worden voor in ovo vaccinatie tegen aviaire influenza. Met een hoge bescherming in de eerste 2 weken na uitkippen, zijn de kuikens reeds beschermd nog voor ze op het afmestbedrijf toekomen.

24

7. BESPREKING

De populariteit van in ovo vaccinatie injectoren neemt wereldwijd toe. Momenteel worden deze in ovo injectoren in de VS, in 90% van de broeierijen voor vleeskuikens aangewend, met verdere verspreiding naar Latijns Amerika, Azië en Europa. Veelbelovende vooruitzichten voor ziektecontrole en broeierij-automatisatie liggen in het verschiet. In de nabije toekomst is het aannemelijk dat de technologie ook diagnostische mogelijkheden toelaat, zoals geslachtsbepaling van het embryo voor het uitkippen. Andere mogelijkheden zijn het combineren van verschillende vaccins en betere controle van respiratoire aandoeningen. In de toekomst zit in ovo vaccinatie in de lift, aangezien vaccinproducten tal van vaccins aan het ontwikkelen zijn specifiek voor in ovo toepassingen. Deze nieuwe producten vragen mogelijks andere technieken om in ovo te vaccineren, maar dat zal enkel leiden tot nieuwe opportuniteiten wanneer de in ovo technologie geoptimaliseerd wordt. Het objectief van commercieel in ovo vaccineren is om op een veilige en uniforme manier iedere levensvatbare embryo te vaccineren. Om dit te bekomen, dient elke commerciële in ovo injector het vaccin toe te dienen op de locaties die het meest doeltreffende effect teweegbrengen. Onderzoek heeft uitgewezen dat vaccintoediening in het amnionvocht en het embryonaal lichaam – beiden aanwezig in het amnion – de optimale locaties zijn om te vaccineren. Bij in ovo vaccinatie is ook kwaliteitscontrole van uiterst belang, om een maximale kwaliteit van de kuikens te garanderen. De techniek dient steriel en gecontroleerd te verlopen, met een precieze toediening op de juiste locatie binnenin het ei. Incubatiecondities dienen gecoördineerd te worden met het tijdstip van ei-injectie, om zo een maximaal uitkippercentage en vaccindoeltreffendheid te bekomen. Elke broeierij en elk incubatortype vereisen een eigen management om deze maximale resultaten te bereiken. Men dient gedetailleerde evaluaties van de embryo’s te maken wanneer men in ovo toepassingen onderzoekt, om zo een optimale embryoleeftijd en injectieplaats te verzekeren. De kwaliteit van in ovo vaccinatie is niet enkel afhankelijk van de wijze van vaccintoediening, maar ook van het injectietijdstip in relatie met de embryonale ontwikkelingsfase, de steriliteit van het vaccin en de toedieningslocatie in het ontwikkelende ei. Kuikenkwaliteit is daarom slechts een relatief gegeven, en afhankelijk van de optimalisatie van al deze vaccinatieprincipes. De redenen waarom in een broeierij als Belgabroed – en in de Benelux in het algemeen – echter nog niet wordt overgestapt naar in ovo vaccinatie injectoren, zijn de volgende: er zijn Europees weinig in ovo vaccins geregistreerd, er zijn te weinig vaccins die in ovo toegediend kunnen worden en onze broeierijen zijn te klein om deze dure technologie rendabel te maken, met klassieke vaccinaties bekomt men goede resultaten onder de huidige velddruk (Ziekte van Marek + Gumboro op dag 1) en bij vaccinatie tegen Newcastle Disease kent men weinig entreacties.

25

8. REFERENTIELIJST

Ahmad J. en Sharma J. M. (1992). Evaluation of a modified-live virus vaccine administered in ovo to protect chickens against Newcastle disease. American Journal of Veterinary Research 53, 1999-2004. Ali A.S., Abdalla M.O. en Mohammed M.E.H. (2004). Interaction Between Newcastle Disease and Infectious Bursal Disease Vaccines Commonly Used in Sudan. Department of Preventive Medicine and Veterinary Public Health, Faculty of Veterinary Medicine, University of Khartoum, Sudan. International Journal of Poultry Science 3(4): 300-304. Avakian A., Wakenell P.S, Bryan T., Schaeffer J.L., Williams C. J. en Whitfill C.E. (2002). In Ovo Administration of Marek’s disease Vaccine: Importance of Vaccine Deposition Site in the Fertile Egg. Mexico, Puerto Vallarta. Proceedings of the 51st Western Poultry Disease Conference, 119-121. Butcher G.D. en Miles R.D. (1994). Vaccine Failure in Poultry: Factors to Consider. Cooperative Extension Service, Institute of Food and Agricultural Sciences, University of Florida, Gainesville, 1-4. Butcher G.D. en Yegani M. (2008). Investigating Vaccination Failure in Poultry Flocks. VM174 of a series of the Veterinary Medicine-Large Animal Clinical Sciences Department, Florida Cooperative Extension Service, Institute of Food and Agricultural Sciences, University of Florida, p.1-4. Cai Y., Song H., Ye J., Shao H., Padmanabhan R., Sutton T.C. en Perez D.R. (2011). Improved hatchability and efficient protection after in ovo vaccination with live-attenuated H7N2 and H9N2 avian influenza viruses. Virology Journal 8, 31. Chandana M., Manna S.K., Das R., Batabyal K. en Roy R.N. (2007). Development of in ovo vaccine against Newcastle disease of birds. Current Science, Vol. 93(9): 1305-1309. Cereno, Source:

T.

N.

(2004).

Canadian

Mareks Poultry

Disease:

Vaccine

handling.

Consultants

Merial

Ltd,

Canada, artikel

Inc. via

http://www.thepoultrysite.com/articles/181/mareks-disease-vaccine-handling Davidson F., Kaspers B. en Schat K.A. (2008). Avian Immunology. First Edition, Academic Press Elsevier Publishing, Chapter 20, 383-386. Erf G.F. (1997). Immune system function and development in broilers. Center of Excellence for Poultry Science, University of Arkansas, Fayetteville, AR 72701, p.109-111. Erf G.F. (2004). Cell-Mediated Immunity in Poultry. Poultry Science 83, 580–590. Funk P.E. en Palmer J.L. (2003). Dynamic Control of B Lymphocyte Development in the Bursa of Fabricius. Archivum Immunologiae et Therapiae Experimentalis 51, 389–398.

26

Gharaibeh S., Mahmoud K. en Al-Natour M. (2008). Field Evaluation of Maternal Antibody Transfer to a Group of Pathogens in Meat-Type Chickens. Poultry Science 87, 1550–1555. Gildersleeve R.P., Hoyle C.M., Miles A.M., Murray D.L., Ricks C.A., Secrest M.N., Williams C.J. en Womack C.L. (1993). Developmental performance of an egg injection machine for administration of Marek’s disease vaccine. Journal of Applied Poultry Research 2, 337–346. Hamal K.R., Burgess S.C., Pevzner I.Y. en Erf G.F. (2006). Maternal Antibody Transfer from Dams to Their Egg Yolks, Egg Whites, and Chicks in Meat Lines of Chickens. Poultry Science 85, 1364–1372. Jacob J.P., Butcher G.D. en Mather F.B. (1998). Vaccination of Small Poultry Flocks. Cooperative Extension Service, Institute of Food and Agricultural Sciences, University of Florida, Gainesville, 1-4. Moreira de Souza F. (2008). Basic aspects of in ovo injection in commercial hatcheries. Hatchery Expertise

Online,

CEVA

Animal

Health

Asia

Pacific,

No.

20,

internetreferentie:

http://www.thepoultrysite.com/focus/contents/ceva/OnlineBulletins/ob_2008/Article-No20-Sept08.pdf Ogra P.L., Fishaut M. en Gallagher M.R. (1980). Viral vaccination via the mucosal routes. Clinical Infectious Diseases 2(3): 352-369. Park M.S., Steel J., Garcia-Sastre A., Swayne D., Palese P. (2006). Engineered viral vaccine constructs with dual specificity: avian influenza and Newcastle disease. Proceedings of the National Academy of Science, USA, 103, 8203-8208. Phelps P. (1995). The In Ovo Administration of Antibiotics into Broiler Eggs at Transfer, Ph.D. Dissertation, North Carolina State University. Rauw F., Gardin Y., Palva V., van Borm S., Gonze M., Lemaire S., van den Berg T. en Lambrecht B. (2009). Humoral, cell-mediated and mucosal immunity induced by oculo-nasal vaccination of one-dayold SPF and conventional layer chicks with two different live Newcastle disease vaccines. Vaccine 27(27): 3631-3642. Riaz M.N., Hussain I., Akhtar M., Rasool M.H., Mansoor M.K. en Haq S.E.U. (2004). Evaluation of In Ovo Vaccination Against Infectious Bursal Disease Virus in Commercial Broilers in Pakistan. International Journal of Agriculture & Biology 6, 984-986. Rose M.E., Orlans E. en Buttress N. (1974). Immunoglobulin classes in the hen’s egg: Their segregation in yolk and white. European Journal of Immunology 4, 521–523. Saif Y.M., Fadly A.M., Glisson J.R., McDougald L.R., Nolan L.K. en Swayne E.D. (2008). Diseases of Poultry. Blackwell Publishing Professional, 2121 State Avenue, Ames, Iowa 50014, USA, p. 47-58.

27

Sarma G., Greer W., Gildersleeve R.P., Murray D.L. en Miles A.M. (1995). Field safety and efficacy of in ovo administration of HVT + SB-1 bivalent Marek’s disease vaccine in commercial broilers. Avian Diseases 39, 211–217. Sharma J.M., Lee L.F. en Wakenell P.S. (1984). Comparative viral, immunologic, and pathologic responses of chickens inoculated with herpesvirus of turkeys as embryos or at hatch. American Journal of Veterinary Research 45, 1619–1623. Sharma, J.M. (2003). The Avian Immune System. In Diseases of Poultry. 11th ed. Saif Y.M. Saif, Barnes H.J., Glisson J. R., Fadly A.M., McDougald L.R. en Swayne D.E. (2003). Iowa State Press, Ames, p. 5–16. Steel J., Burmakina S.V., Thomas C., Spackman E., Garcia-Sastre A., Swayne D.E., Palese P. (2008). A combination in-ovo vaccine for avian influenza virus and Newcastle disease virus. Vaccine, 26, 522531. Toro H., Tang D.C., Suarez D.L., Sylte M.J., Pfeiffer J., Van Kampen K.R. (2007). Protective avian influenza in ovo vaccination with non-replicating human adenovirus vector. Vaccine, 25, 2886-2891. Van den Wijngaard J.K. (2002). In ovo vaccine applications in chickens surpass the conventional approach. Lohmann Information 26, 1-4. Vegad J.L. (2007). A colour atlas of poultry diseases: an aid to farmers and poultry professionals. International Book Distribibuting Co. p.1-6. Villalobos T. en Williams C.J. (2011). The importance of hatchery vaccination hygiene. Artikel van Poultry International, internetreferentie: http://www.ceva.vn/en/Technical-Informations/Poultry/OtherInformations/The-importance-of-hatchery-vaccination-hygiene Villalobos T. (2012). In ovo technology driving hatchery modernization. Internetreferentie: http://www.worldpoultry.net/Breeders/Incubation/2012/4/In-ovo-technology-driving-hatcherymodernisation-WP010206W/ Wakenell P.S., Bryan T., schaeffer J., Avakian A., Williams C. en Whitfill C. (2002). Effect of in ovo vaccine delivery route on HVT/SB-1 efficacy and viremia. Avian Diseases 46, 274–280. Warin s. (2005). Performing hatchery vaccination. International Hatchery Practice 21(2), 7-11. Weber F.H., Genteman K.C., LeMay M.A., Lewis D.O. en Evans N.A. (2004). Immunization of Broiler Chicks by In Ovo Injection of Infective Stages of Eimeria. Poultry Science 83, 392–399. Williams C. (2002). In ovo vaccination for disease prevention. International Poultry Production 15(8), 7-9.

28

Williams C.J. (2005a). In ovo vaccination and chick quality. International Hatchery Practice 19(2), 713. Williams C.J. (2005b). Critical success factors for in ovo vaccination. International Hatchery Practice 25(2), 7-9. Williams C.J. en Zedek A.S. (2008). Comparative field evaluations of in ovo applied technology. Poultry Science 89: 189–193. Williams C.J. en Hopkins B.A. (2011). Field evaluation of the accuracy of vaccine deposition by two different commercially available in ovo injection systems. Poultry Science 90, 223-226. Zhang Y. en Sharma J.M. (2001). Early posthatch protection against Marek’s disease in chickens vaccinated in ovo with a CVI988 serotype 1 vaccine. Avian Diseases 45(3), 639–645.

29