UNIVERSITEIT GENT
FACULTEIT DIERGENEESKUNDE Academiejaar 2012 – 2013
HET VARKEN ALS ORGAANDONOR VOOR DE MENS: DE ROL VAN PROCIENE VIRUSSEN
door
Lore VAN BETSBRUGGE
Promotoren: Prof. dr. Karen van der Meulen Prof. dr. Kristien Van Reeth
Literatuurstudie in het kader van de Masterproef © 2013 Lore Van Betsbrugge
Universiteit Gent, haar werknemers of studenten bieden geen enkele garantie met betrekking tot de juistheid of volledigheid van de gegevens vervat in deze masterproef, noch dat de inhoud van deze masterproef geen inbreuk uitmaakt op of aanleiding kan geven tot inbreuken op de rechten van derden. Universiteit
Gent,
haar
werknemers
of
studenten
aanvaarden
geen
aansprakelijkheid
of
verantwoordelijkheid voor enig gebruik dat door iemand anders wordt gesteld in een advies of informatie vervat in de masterproef.
UNIVERSITEIT GENT
FACULTEIT DIERGENEESKUNDE Academiejaar 2012 – 2013
HET VARKEN ALS ORGAANDONOR VOOR DE MENS: DE ROL VAN PROCIENE VIRUSSEN
door
Lore VAN BETSBRUGGE
Promotoren: Prof. dr. Karen van der Meulen Prof. dr. Kristien Van Reeth
Literatuurstudie in het kader van de Masterproef © 2013 Lore Van Betsbrugge
VOORWOORD
Ik wil iedereen bedanken die mij geholpen heeft om deze masterproef tot een goed einde te brengen. In het bijzonder wil ik mijn promotor Karen van der Meulen bedanken voor de zeer goede begeleiding. Tijdens het jaar maakte ze veel tijd voor mij vrij en kreeg ik feedback met opbouwende commentaren. Ze gaf me interessante tips en richtlijnen en ik kon steeds op haar rekenen als ik vragen had. Ook wil ik mijn mama bedanken voor de steun en voor het nalezen van mijn masterproef.
INHOUDSOPGAVE
VOORBLAD TITELBLAD VOORWOORD INHOUDSOPGAVE SAMENVATTING………………………………………………………………………………………………p.1 INLEIDING……………………………………………………………………………………………………...p.2 LITERATUURSTUDIE…………………………………………………………………………………………p.3 1. XENOTRANSPLANTATIE………………………………………………………………………………....p.3 2. ROL VAN ZIEKTEVERWEKKERS BIJ ORGAANTRANSPLANTATIE TUSSEN VARKEN EN MENS……………………………………………………………………………...p.5 2.1 INLEIDING…………………………………………………………………………………………………p.5 2.2 PORCIEN ENDOGEEN RETROVIRUS…………………………………………………………….…..p.6 2.3 PORCIEN HERPESVIRUS…………………………………………………………………………..…p.12 2.3.1 Porciene cytomegalovirus…………………………………………………………………...………..p.12 2.3.2 Porciene gamma-lymfotroop herpesvirus………………………………………………………...…p.14 2.4 PORCIEN HEPATITIS E VIRUS……………………………………………………………………….p.15 2.5 PORCIEN CIRCOVIRUS TYPE 1 EN TYPE 2……………………………………………………….p.17 2.6 PORCIEN ENCEPHALOMYOCARDITIS VIRUS……………………………………………………p.19 2.7 OVERIGE VIRUSSEN……………………………………………………………………………..……p.21 BESPREKING…………………………………………………………………….……………………..……p.22 REFERENTIELIJST……………………………………………………………………………………...…..p.24
SAMENVATTING
Xenotransplantatie tussen varken en mens is een veelbelovende techniek voornamelijk omwille van de uitputting van de humane organen. Xenotransplantatie geeft virussen echter de kans om de normale immunologische afweermechanismen van de ontvanger te omzeilen. Ook het gebruik van immunosuppressiva werkt dit in de hand. Het doel van deze studie was om het risico van de porciene virussen in te schatten bij xenotransplantatie. De verschillende virussen worden besproken met betrekking tot hun structuur, eigenschappen, epidemiologie, risico’s, detectiemethoden en preventie. Na uitgebreid onderzoek van literatuurgegevens over deze verschillende virussen werd het duidelijk dat bepaalde virussen van groter belang zijn dan andere. Het porciene endogeen retrovirus is het meest beschreven. Dit virus is uniek door de incorporatie in het genoom van de gastheer en door de moeilijke detectie. Bij het pathogeen-vrij kweken van varkens kan dit virus niet geëlimineerd worden. Het porciene hepatitis E virus (PERV) veroorzaakt geen klinische symptomen bij het varken maar blijkt een zoönotisch virus te zijn die mensen infecteert en hepatitis veroorzaakt. Ook porciene circovirussen 1 en 2 evenals porciene herpesvirussen hebben mogelijk belang bij xenotransplantatie. Meer onderzoek is nodig om de rol van de virussen correct te kunnen inschatten en om maatregelen te kunnen nemen die risico op overdracht na transplantatie uit sluiten.
Sleutelwoorden: xenotransplantatie - varken - porciene virussen
1
INLEIDING
Door de grote vraag naar transplantatie van organen, weefsels of cellen tussen mensen is er een tekort aan organen ontstaan. Dit heeft geleid tot de ontwikkeling van xenotransplantatie, de transplantatie van organen, weefsels of cellen tussen verschillende diersoorten. Het varken werd verkozen tot het best geschikte dier voor xenotransplantatie gebaseerd op fysiologische, ethische en economische redenen. Patiënten met leverfalen door leverkanker of levercirrose kunnen misschien in de toekomst behandeld worden met een leverimplantaat afkomstig van het varken. Diabetes wordt nu reeds behandeld met insuline afkomstig van het varken. Hopelijk zal men ooit pancreascellen van het varken in de mens kunnen transplanteren. Maar xenotransplantatie vormt nog steeds een groot op infectieus vlak voor de mens. Door de transplantatie van varkensorganen in de mens geeft men microorganismen en in het bijzonder varkensvirussen de kans om de normale verdedigingsmechanismen van het lichaam te overbruggen. De immunosuppressiva die gebruikt worden bij transplantatie zullen bovendien de immuniteit van de ontvanger inhiberen en zo wordt de transmissie van virussen vergemakkelijkt. De bedoeling van dit eindwerk is om een overzicht te geven van het risico van varkensvirussen bij xenotransplantatie. Achtereenvolgens zullen porcien endogeen retrovirus, porciene
herpesvirussen,
porcien
hepatitis
E
virus,
porciene
circovirussen
1
en
2
en
encephalomyocarditis virus besproken worden.
2
LITERATUURSTUDIE: HET VARKEN ALS ORGAANDONOR VOOR DE MENS: DE ROL VAN PORCIENE VIRUSSEN
1. XENOTRANSPLANTATIE
Allotransplantatie is de verplaatsing van organen, weefsels of cellen van een menselijke donor naar een menselijke ontvanger. Door het grote succes heeft dit geleid tot een tekort aan organen. Er zijn hele lange wachtlijsten voor patiënten die een orgaandonor nodig hebben. Hierdoor is men op het idee gekomen om organen van dieren te gebruiken. Xenotransplantatie is de overdracht van cellen, weefsels of organen tussen verschillende diersoorten. De historiek van xenotransplantatie begon in 1964 wanneer Reemtsma (1969) een poging deed om een nier van een chimpansee in een mens met nierfalen te transplanteren. De patiënt overleefde 9 maanden. Primaten werden echter niet geschikt verklaard als donor omwille van ethische redenen en de hoge kans op infectieoverdracht (Tabel 1). Daarentegen werd het varken wel als een goede donor naar voren gedragen. Eerst en vooral vanwege de fysiologische compatibiliteit met de mens. Zo vonden Li et al. (2013) dat de biomechanische eigenschappen van de galgangen van varkens met de leeftijd van 7 tot 10 maanden oud gelijkaardig zijn met deze van de volwassen mens. Ook de voortplantingskenmerken en ethische overwegingen maken het varken geschikt als donor. Tabel 1 De voor –en nadelen van specifieke diersoorten voor het gebruik in xenotrasplantatie (overgenomen uit Denner et al., 2012) Beschrijving of waarde Parameter
Beschrijving of waarde voor niet-humane
voor varken (in
Het voordeel voor
vergelijking met de
gebruik van varken
mens) Fysiologie Transplant afstoting Galactosyl-alfa-1,3galactosyl epitopen
Gelijk Zeer sterk
Ja
Onduidelijk Neen, enkel na genetisch modificeren Neen, maar irrelevant na genetisch modificeren
primaten (in vergelijking met de mens) Mensapen
Apen
Bijna identiek
Gelijk
Niet zeer sterk
Sterk
Neen
Neen
Bedreigde diersoort
Neen
Ja
Ja
Ja
Orgaanafmeting
Gelijk
Onduidelijk
Gelijk
Klein
Ligging
Horizontaal
Onduidelijk
Rechtop
Rechtop
100
Ja
251-289
170-193
Worpgrootte
6-10
Ja
1, soms 2
1, soms 2
Beschikbaarheid
Niet-gelimiteerd
Ja
Geen
Laag
Kosten
Laag
Ja
Zeer hoog
Hoog
Mogelijk
Ja
Mogelijk in de toekomst
Mogelijk in de toekomst
aan hoge kostprijs
aan hoge kostprijs
Beschikbaar
Ja
Geen
Geen
Mogelijk
Ja
Zwangerschapsduur (dagen)
SPF (specific pathogen free) of DPF ( designated pathogen free) Transgenetisch ter preventie afstoting Klonen
Mogelijk in de verre toekomst
Mogelijk in de toekomst
3
Mensen met levercirrose of leverkanker zouden kunnen behandeld worden met de lever van een varken, diabetici zouden kunnen geholpen worden met porciene pancreaseilandjes en mensen die lijden aan de ziekte van Parkinson of Huntington zouden grotendeels kunnen genezen door implantatie van neurogeen weefsel afkomstig van varkens. Maar dit is helaas nog toekomstmuziek, tot op heden is er slechts één klinische studie van xenotransplantatie vanuit het varken beschreven. Hierbij werden de eilandjes van Langerhans van het varken overgebracht in diabetici in Nieuw Zeeland. Dit is de eerste studie die officieel goedgekeurd is door de regering in 2009 en één van eerste stappen op weg naar de klinische toepassing van xenotransplantatie (Denner et al., 2012). Er liggen nog verschillende obstakels in de weg van geslaagde xenotransplantatie zoals immunologische afstoting, fysiologische incompatibiliteit en de transmissie van micro-organismen. Als men xenotransplantatie wil doen slagen, dan moet men ervoor zorgen dat het lichaam het vreemde materiaal dat getransplanteerd werd niet afstoot. Afstoting van de porciene cellen, weefsels of organen kan gebeuren op verschillende niveaus: hyperacute afstoting, acute vasculaire afstoting, cellulaire afstoting en chronische afstoting. Hyperacute en acute vasculaire afstoting zijn voornamelijk het gevolg van humane antistoffen gevormd tegen het terminaal oligosacharide determinant galactose-alfa-1,3-galactose (Gal) op vasculair endotheel van het varken na transplantatie. Deze reactie kan voorkomen worden door transgene biggen te gebruiken die humane complement regulatorische eiwitten bevatten die op hun beurt in staat zijn om de antistof-gemedieerde complement activatie op het gevasculariseerd varkensorgaan te inhiberen. Een andere benadering is om biggen te kweken met een zogenaamd ‘knocked out’ galactose-alfa-1,3-galactosyltransferase genen locus. Door het gen te coderen of door gal-alfa-1,3-galactosyltransferase uit te schakelen kan men de expressie van de gal-alfa-1,3-gal residuen tegen gaan. Daarnaast kan men immunosuppressiva aan de ontvangende gastheer geven. Er is op verschillende wijzen vooruitgang gemaakt in de ontwikkeling van nieuwe immunosuppressieve medicatie en door verdere pogingen om genetisch gemodificeerde biggen te ontwikkelen (Denner et al., 2012). Door genetische modificatie van het varken en verfijning van de immunosuppressieve middelen is men er reeds in geslaagd om de overleving van een heterotroop xenograft van het hart te verlengen van 2 minuten naar 8 maanden (Byrne et McGregor, 2012).
Door de fysiologische incompatibiliteit tussen varken en mens op cellulair en moleculair niveau en de immunologische respons zou er kunnen trombose optreden. De thrombocyten zijn van groot belang in de hemostase. Doordat de thrombocyten tussen het varken en de mens zeer verschillend zijn kan dit leiden tot afstoting van het xenograft. Porciene plasma, leukocyten, rode bloedcellen en thrombocyten kunnen een erge trombose na transplantatie veroorzaken door het samenklonteren van humane thrombocyten (Zhang et al.,2008).
In een getransplanteerd orgaan kunnen virussen, schimmels en/of bacteriën aanwezig zijn die mee getransplanteerd kunnen worden en zo ziekte kunnen veroorzaken in de patiënt. Welke en hoeveel micro-organismen bij xenotransplantatie van varken naar mens een rol spelen is nog grotendeels onduidelijk. Bovendien moet men rekening houden met het feit dat transplantatie patiënten
4
immunosuppressiva toegediend krijgen waardoor hun afweersysteem vaak zeer zwak is en de pathogenese van de micro-organismen anders verloopt dan in de gezonde gastheer. Ook de overbrugging van de natuurlijke barrières en het lange contact tussen het pathogeen en de ontvangende gastheer spelen een belangrijke rol. Om dit probleem tegen te gaan worden kiemvrije varkens gekweekt. Deze varkens worden gekweekt in hermetisch afgesloten boerderijen, het voeder wordt bestraald en is vrij van elk zoogdier proteïne, de hokken worden gesteriliseerd, de lucht wordt gefiltreerd en het binnenkomende materiaal wordt geautoclaveerd. Het personeel moet speciale kledij dragen en zich douchen bij het inkomen en het weggaan van het bedrijf, de geboorte van de biggen gebeurt aan de hand van een keizersnede en er is een geregelde controle van weefsels en bloed. Maar men blijft vrezen voor transmissie van micro-organismen en dan voornamelijk virussen, omdat deze niet kunnen bestreden worden met antibiotica.
2. ROL VAN ZIEKTEVERWEKKERS BIJ ORGAANTRANSPLANTATIE TUSSEN VARKEN EN MENS
2.1. INLEIDING
Verschillende virussen van het varken vormen een mogelijk risico bij xenotransplantatie als ze de species barrière overbruggen. Eerst en vooral zijn er de virussen die bij het varken klinische symptomen veroorzaken. Daarnaast bestaan er porciene virussen die geen ziektesymptomen vertonen bij het varken. Zo heeft men latent aanwezige virussen, dit zijn virussen die in het genoom van de gastheer integreren. Ze kunnen ongemerkt getransplanteerd worden doordat de donor op het moment van de xenotransplantatie geen ziektesymptomen vertoont. Porciene endogeen retrovirus is geïntegreerd in de gastheerchromosomen en porciene cytomegalovirus veroorzaakt een latente infectie. Recent zijn er 2 nieuwe porciene herpesvirussen geïdentificeerd bij het varken (porciene lymfotrope herpesvirussen). Deze virussen persisteren in de kern van de cellen en kunnen eventueel na xenotransplantatie gereactiveerd worden in de mens. Sommige virussen vertonen geen klinische tekenen in het varken maar kunnen wel bij de mens ziektesymptomen veroorzaken. Zo kan Porciene hepatitis virus E hepatitis veroorzaken bij de mens. Ook virussen met kankerverwekkende eigenschappen zouden een grote impact kunnen hebben bij de mens. Dergelijke oncogene virussen blijven onopgemerkt bij het varken omdat de levensduur van deze dieren heel beperkt is. Virussen die overgedragen worden door middel van verticale transmissie moeten ook grondig onderzocht worden. Tabel 2 geeft een overzicht van de belangrijkste virussen voor xenotransplantatie. In de daarna volgende hoofdstukken worden de virussen en hun risico in meer detail beschreven.
5
Tabel 2 Infectiviteit van porciene virussen bij de mens (overgenomen uit Yoo et al., 2000) Eigenschap
PERV
HEV
PCV1
PCV2
PCMV
PLHV ½
Gekende ziekte (bij biggen)
-
-
-
+
+/-
-
Transformering (bij biggen)
-
-
-
-
-
-
Infectie (bij humane cellen)
+
-*
-
-
?
?***
Infectie ( bij niet-humane primate cellen)
-
-*
-
-
?
?***
Infectie (humaan)
-
+
?**
?**
-
?***
Infectie (niet-humane primaten)
?
+
-
-
?
?***
Gekende ziekte (humaan)
-
+
-
-
-
-
Gekende ziekte (niet-humane primaten)
?
+
?
?
?
?***
Latentie
+
-
-
-
+
+
HEV= Porciene Hepatitis E virus; PCMV=Porciene cytomegalovirus; PCV1= Porciene circovirus type 1; PCV2= Porciene circovirus type 2; PERV= Porciene endogeen retrovirus; PLHV1/2= Porciene lymfotroop herpesvirus types 1 en 2. * HEV is niet cultiveerbaar in virtro in gelijk welke cellen. ** Enkel specifieke antistoffen werden gedetecteerd en er werden geen virale sequenties in mensen geïdentificeerd. *** PLHV werd nog niet geïsoleerd, enkel kleine stukken van het genoom werden geïdentificeerd
2.2. PORCIEN ENDOGEEN RETROVIRUS
Eigenschappen en structuur Het porciene endogeen retrovirus (PERV) is het meest bestudeerde en belangrijkste virus wat betreft xenotransplantatie. PERV behoort tot de familie van de gammaretrovirussen. Deze virussen bevatten een enkelvoudige, positieve streng van RNA en zijn omringd door een envelop. De virale partikels hebben een diameter van ongeveer 100 nanometer. Bij infectie van de gastheercel zal dit virus door middel van het enzyme reverse transcriptase zijn viraal RNA omzetten tot proviraal DNA en vervolgens inbouwen in het DNA van de gastheercel (Figuur 1).
6
Figuur 1 Replicatiecyclus van PERV (overgenomen uit Denner et al. (2012)) De replicatiecyclus: -
PERV hecht zich vast via een specifieke celreceptor.
-
Vervolgens is er fusie van de virale envelop met het plasma membraan.
-
Het nucleokapsied wordt vrijgelaten uit het virus.
-
Het virale RNA wordt omgezet via reverse transcriptase tot een enkelstrengige DNA kopij. Er wordt een RNA-DNA hybride en vervolgens een dubbelstrengig DNA gevormd.
-
Dit dubbelstrengig DNA migreert naar de kern en wordt vervolgens in het genoom van de gastheercel geïntergreerd als provirus.
-
Vanuit dit provirus wordt nieuw viraal RNA (2 identieke strengen van enkelstrengig RNA) en messenger RNA voor structurele, enzymatische en envelop proteïnen gevormd. De rijping van de nieuwe virusdeeltjes gebeurt in het cytoplasma van de cel.
-
Tot slot zullen de nieuw gevormde virussen de cel verlaten door opname van een stukje celmembraan, dit proces wordt “budding” genoemd. Het nucleokapsied is omringd door een stuk membraan (de envelop) afkomstig van de geïnfecteerde cel.
De meeste endogene retrovirussen zijn niet in staat om te repliceren. Er is slechts een kleine minderheid die infectieuze viruspartikels kunnen produceren en cellen van dezelfde (ecotrope) of van andere diersoorten (polytrope, xenotrope) kunnen infecteren. Bij varkens bestaan drie verschillende stammen, PERV-A, PERV-B en PERV-C die allen tot de gammaretrovirussen behoren. PERV-A en PERV-B worden bij alle varkens aangetroffen en kunnen humane cellen in vitro infecteren. Vooral virus opgegroeid in PK15 -of in geïnfecteerde HEK293 cellen vertoonde transmissie naar verschillende humane cellijnen. In sommige humane cellijnen werd een productieve PERV infectie opgemerkt (HEK 293 en HeLa), in andere bleek deze overdracht niet productief (Tabel 3). Vele humane cellen vertoonden receptoren specifiek voor PERV-A en PERV-B, terwijl weinig humane cellen PERV-C specifieke receptoren bezaten. PERV-C is een ecotroop virus en is enkel in staat om zich bij het varken te vermenigvuldigen.
7
Tabel 3 Porcien endogeen retrovirus tropisme voor humane cellen ( gebaseerd op Blusch et al. (2002)) Infectiestudies met pseudotype virus
Infectiestudies
met
replicatie
competent
virus
Celtype
PERV-A
PERV-B
PERV-C
PERVNIH-2
Provirus (PCR)
PERVRNA
Reverse Transcriptaseactiviteit
GEIMMORTALISEERDE CELLIJNEN HEK293; niercellijn,
+
+
-
+
-
HeLa; cervicale kanker
+
-
-
HUVEC
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
Vasculaire fibroblasten
+
+
+
+
-
PBMC
+
+
+
+/-
+/-
epitehliaal
PRIMAIRE CELLEN Endotheliale cellen (umbicale vene) Endotheliale cellen (saphena vene) MRC-5, foetale long
-
+
fibroblasten
Deze tabel bevat experimentele data betreffende een reeks humane cellijnen en primaire celtypes relevant voor transplantatie met een grote waarschijnlijkheid op productieve PERV infectie.
PERV transmissie naar en, in sommige gevallen, vermenigvuldiging in werd ook gedemonstreerd in primaire endotheliale cellen, fibroblasten en mesangiale cellen. Voornamelijk endotheliale cellen zijn belangrijk in verband met xenotransplantatie aangezien ze vaak in contact komen met porciene cellen en daardoor mogelijks met PERV. Studies omtrent de potentiële infectie van perifere bloed mononucleaire cellen (PBMC) leverden tegengestelde resultaten op. Daar waar sommige onderzoekers de productieve infectie van humane PBMCs konden aantonen, was het voor anderen onmogelijk om replicatie te detecteren. De reden van deze grote verschillen kan gelegen zijn aan de methoden gebruikt om de replicatie aan te tonen (Blusch et al., 2002).
De hoeveelheid virus die na replicatie bij het varken vrijkomt en zou kunnen overgedragen worden is afhankelijk van de varkenssoort en van het weefsel of orgaan. Miniatuurvarkens hebben een heel hoge virusuitscheiding in tegenstelling tot het Duitse landras die een heel laag uitscheidingsprofiel heeft. In het hart werd er maar zeer weinig PERV expressie waargenomen. In melanoma’s van miniatuurvarkens vond men een hogere hoeveelheid van PERV messenger RNA (mRNA) dan in de gewone huid. De expressie in de milt van deze dieren was dan weer veel hoger dan in de melanoma’s (Dieckhoff et al., 2007). In de porciene cellen van de eilandjes van Langerhans van het Duitse landras werd er slechts een lage expressie van PERV mRNA en een afwezigheid van partikeluitscheiding gevonden (Irgang et al., 2008). Deze resultaten zijn zeer belangrijk omdat de cellen van de eilandjes
8
van Langerhans, hart en nieren de eerste potentiële xenotransplantatie producten zijn die voor de mens gebruikt zouden kunnen worden. Risico’s bij xenotransplantatie De vrees bestaat dat door xenotransplantatie met PERV geïnfecteerde weefsels een nieuwe epidemische ziekte zou kunnen ontstaan. Het humaan immunodeficiëntie virus (HIV) en de acquired immuno-deficiency syndrome (AIDS) pandemie zijn het resultaat van een dergelijke transspecies transmissie van een retrovirus, namelijk het simian immunodeficiency virus (SIV), naar de mens. PERV, dat nochtans niet zo homoloog is met het HIV maar wel een retrovirus is, zou hetzelfde lot kunnen ondergaan. Indien PERV zich zou kunnen aanpassen aan de mens, dan kunnen ze tumoren en/of immuundeficiënties veroorzaken. Ze vormen hierdoor een groot risico bij xenotransplantatie (Denner et al., 2012). Onderstaand worden enkele mogelijke manieren besproken die kunnen leiden tot aanpassing bij de mens.
Kaulitz et al. (2013) beschrijven specifiek het risico van een nieuwe variant van het PERV-C die van groot belang zou kunnen zijn bij xenotransplantatie. Meer in het bijzonder vermelden ze de recombinatie tussen PERV-A en PERV-C, wat zou kunnen resulteren in een gemengd PERV-A/C die, in tegenstelling tot PERV-C wel in staat zou kunnen zijn om humane cellen te infecteren ( Figuur 2).
Figuur 2 De structuur van proviraal PERV en de recombinatie tussen PERV-A en PERV-C (overgenomen uit Denner et al., 2012) Cap= transcriptie start plaats, PBS= bindingsplaats van de primer, SD= splice donor, SA= splice acceptor, SU/TM= oppervlakte/transmembraan envelop proteïnen delingsplaats in Env, PPT= polypurine tract, poly(A)= addition site, LTR= long terminal repeat, gag= group-specific antigen gene, ppro/pol= portease/polymerase gene, env= evelop protein gene
Bij bepaalde humane cellen geïnfecteerd met PERV-A en recombinant PERV-A/C zag men dat de productie van viruspartikels veel hoger was na adaptatie aan humane cellen (Wilson et al. 1998; Denner et al., 2003; Harrison et al, 2004). Zo werd een grote stijging in virusconcentratie gevonden wanneer men een recombinant PERV-A/C afkomstig van PBMC’s van varkens op niet-geïnfecteerde 293 niercellen van mensen in vitro passeerde. De hoge virusconcentratie was het gevolg van een
9
toename van de lengte van de LTR (Figuur 2) en een multimerisatie van de nucleaire factor Y (NF-Y) transcriptiefactor-bindingsplaatsen. Deze bevindingen laten vermoeden dat PERV de mogelijkheid heeft om zich aan te passen aan humane cellen en daarom efficiënter kan repliceren. Een laatste risico van PERV is de mogelijkheid dat mutaties in het proline rijke domein van de envelop (Env) eiwitten van PERV-C zouden kunnen ontstaan die het tropisme van het virus veranderen. Mutaties in het C-terminale einde van de oppervlakte envelop eiwitten van PERV-C werden reeds beschreven en resulteerden in binding aan en infectie van humane cellen ( Denner et al., 2012). De gammaretrovirussen hebben de mogelijkheid om cellen te infecteren zonder specifieke receptor wanneer een ander retrovirus aanwezig is. Is bijvoorbeeld het humane endogeen retrovirus (HERV) met zijn envelop eiwitten en zijn receptor aanwezig in een cel, dan kan PERV-C deze humane cellen infecteren ook al hebben deze cellen geen PERV-C specifieke receptor.
Detectie Verschillende methoden om een PERV infectie aan te tonen zijn Southern blotting hybridisatie waarbij PERV-specifieke probes gebruikt worden, evenals fluorescent in situ hybridisatie (FISH) om de chromosomale lokalisatie van provirussen en de expressie van viraal RNA te detecteren in de gastheercellen. Ook werd expressie van virale eiwitten bestudeerd aan de hand van specifieke antisera in immunoperoxidase en immunofluorescentie technieken en met Western blotting. Ma et al. (2010) stelden een SYBR Green I-based real-time kwantitatieve polymerase chain reaction (PCR) test op om kopienummers van PERV geïntegreerd in de gastheer vast te kunnen stellen. Deze test is 100 keer gevoeliger vergeleken met de conventionele PCR en zou dus een duidelijke meerwaarde kunnen hebben om donor varkens te screenen en om humane patiënten behandeld met porciene xenotransplantatie producten te onderzoeken op transmissie van PERV. Antistoffen kunnen worden opgespoord aan de hand van ELISA en Western Blotting.
Er zijn nog geen humane PERV infecties ontdekt tot de dag vandaag, zodat de specificiteit en detectie-limieten van bovenvermelde testen nog niet kunnen geëvalueerd worden (Denner et al., 2012). Hier dient ook opgemerkt te worden dat de meeste humane recipiënten tot op heden voor een korte periode aan het weefsel van varkens blootgesteld werden, aangezien xenotransplantatie nog een relatief recente techniek is (Denner, 2008). Volgens een onderzoek in de USA (Schuurman J., 2009) moet om de beoordeling mogelijk te maken van het risico van tot nu toe ongekende pathogenen na xenotransplantatie, donormateriaal voor ten minste 50 jaar worden gearchiveerd.
Omdat niet de aanwezigheid van het PERV provirus, maar voornamelijk de expressie belangrijk is om het risico te evalueren, moeten er in de toekomst vooral RNA studies met een goede sequencering opgestart worden.
10
Preventie van PERV bij xenotransplantatie Infecties door xenozoönotische retrovirussen worden normaal voorkomen door het humane immuunstelsel.
Daar
mensen
en
primaten
(oude
wereld)
geen
functioneel
alfa-1,3-
galactosyltransferase bezitten, worden er hoge gehaltes anti-gal antistoffen vrijgesteld in hun circulatie door continu contact met gal alfa-1,3-gal-dragende micro-organismen. Deze natuurlijke antistoffen neutraliseren eveneens effectief alfa-gal-dragende gammaretrovirussen waaronder PERV. Aldus zijn de virussen gevoelig aan serum-gemedieerde virolyse via het klassieke complement-gemedieerde systeem in vitro en zeer waarschijnlijk ook in vivo. Als de PERV eiwitten op xenograften tot expressie komen, dan zal de immunologische strijd tegen gal alfa-1,3-gal leiden tot een vernietiging van het xenotransplant. Onderzoek toonde de expressie van mRNA in zowel specifieke pathogeen-vrije biggen als in conventionele dieren aan. PERV-A, -B en -C werden in alle weefsels teruggevonden met de hoogste expressie in de nier, gevolgd door lever, long en hart. In de pancreas werd maar een laag gehalte gevonden. De expressie van PERV-C was veel lager dan de expressie van PERV-A en PERV-B. Daar expressie werd teruggevonden in zowel conventionele als speciefiek pathogeen-vrije dieren wordt duidelijk dat het gebruik van pathogeen vrije biggen het risico op PERV transmissie naar humane recipiënten of xenotransplantaten niet kan reduceren zoals verwacht. De productie van PERV vrije dieren lijkt op dit moment dan ook niet haalbaar door het grote aantal aan provirussen, maar nieuwe technieken zoals applicatie van zinc finger nucleasen voor het tot stand komen van genetisch gemodificeerde dieren zouden varkens zonder expressie van functioneel PERV kunnen produceren (Denner et al., 2012). Denner et al. (2012) heeft recent een onderzoek uitgevoerd naar de effecten van multipele PERV-specifieke short hairpin RNAs op de expressie van PERV. Deze methode kan zorgen voor veiligere donors, minder expressie van PERV RNA en eiwitten en een mindere kans op vrij zetting van infectieuze virus partikels. In India werd een studie uitgevoerd rond proviraal porciene endogeen retrovirus in verse en gedecellulariseerde porciene weefsels (Prabha et al.,2008). Gedecellulariseerde hartkleppen werden reeds ingeplant in mensen. Decellularisatie heeft als doel de cellulaire immunogeniciteit af te zwakken en de interactie tussen de natuurlijk voorkomende alfa- gal epitopen van het varken en de humane alfa- gal antistoffen te minimaliseren. Het hart werd aan de hand van PCR en RT-PCR getest op de aanwezigheid van PERV specifieke GAG sequenties. Alle weefsels van zowel de gedecellulariseerde als de verse delen van het hart zoals de aortaklep, pulmonalisklep en de hartspier toonden de aanwezigheid van PERV DNA aan. RT PCR voor PERV was positief voor alle verse weefsels en was negatief voor de gedecellulariseerde weefsels. Gedecellulariseerd weefsel kan dus een risico vormen bij xenotransplantatie.
Vaccinatie van humane orgaandonoren kan ook een methode zijn om PERV transmissie tegen te houden. Er bestaan al effectieve vaccins tegen gammaretrovirussen, zoals murine leucose virus en felien leukemie virus. Zo werden transmembrane envelopeiwitten en de oppervlakte envelopeiwitten van felien leukemie virus gebruikt om ratten en geiten te immuniseren. Dit resulteerde in bindende en
11
neutraliserende antistoffen en 100% bescherming tegen felien leukemie virus (Denner et al., 2012). Volgens Bush et al. (2006) is het gebruik van actieve vaccinaties echter minder geschikt voor het gebruik
in
xenotransplantaties.
De
orgaandonoren
zullen
immers
een
B-cel
specifieke
immunosuppressie ondergaan. Als er al anti-PERV-antistoffen zouden worden geïnduceerd, dan zal de titer waarschijnlijk te laag zijn om bescherming te induceren.
2.3. PORCIEN HERPESVIRUS
Er bestaan drie subfamilies in de herpesvirussen: Alpha-, Beta- en Gammaherpesvirinae. Bij het varken komen er 4 herpesviridae voor, pseudorabies virus behoort tot de Alphaherpesvirinae, porcien cytomegalovirus
behoort
tot
de
Betaherpesvirinae
en
2
recentere
virussen,
lymphotrope
herpesvirussen genaamd, behoren tot de Gammaherpesvirinae. Diverse Europese landen, Canada en Nieuw-Zeeland zijn al enkele jaren vrij van pseudorabies virus. Ook de Verenigde Staten van Amerika is pseudorabies vrij, althans de gedomesticeerde varkens. Sinds pseudorabies bij varkens niet meer voorkomt, is het xenogenetisch risico tot een minimum herleid en van minder belang in xenotransplantatie (Yoo et Giulivi, 2000). Daarom zullen hieronder enkel de Beta- en Gammaherpesvirussen besproken worden.
2.3.1.Porcien cytomegalovirus
Eigenschappen en structuur Herpesvirussen zijn groot en sferisch van vorm met een diameter van 150-200 nm en bevatten een envelop. Het genoom bestaat uit een lineair, dubbelstrengig DNA met een lengte van 150-230 kb. Na de poxvirussen hebben ze het grootste genoom van de virussen. De herpesvirussen vermeerderen in de kern van de gastheercel. Het virale DNA wordt via cellulaire transcriptasen omgezet tot mRNA. Typisch voor deze virussen is dat de transcriptie van de virale genen in een vaste volgorde gebeurt. De ‘vroege’ genen ondergaan vóór de DNA replicatie transcriptie en translatie, deze genen coderen voor de niet-structurele eiwitten. Deze eiwitten zijn nodig voor de vermeerdering van het DNA en de transcriptie van de andere virale genen. De ‘late’ genen worden tijdens én na de DNA replicatie tot structurele eiwitten gevormd en zullen meestal samen met de vorming van de nieuwe viruspartikels in de cel gecreëerd worden. Een typisch kenmerk van het herpesvirus is dat het na primaire infectie latent in de geïnfecteerde gastheer aanwezig kan blijven. Porcien cytomegalovirus (PCMV) is latent aanwezig in longmacrofagen, bloedmonocyten en CD8+ T-cellen van het varken. Het virus kan gereactiveerd worden wanneer de immuniteit van de gastheer daalt bijvoorbeeld bij stress, ziekte, zwangerschap, enzovoort met vermeerdering en uitscheiding tot gevolg. Na toediening van corticosteroïden aan gnotobiotische varkens werd excretie van CMV aangetoond. Dit toont de reactivatie van PCMV aan (Edington et al., 1976, Narita et al., 1985). PCMV is endemisch aanwezig over de gehele wereld, maar de prevalentie verschilt van regio tot regio en varieert van minimum 12% in Iowa in de US, 55% in Canada (Hamel et al., 1999, Rupasinghe et al., 1999, Widen et al., 1999) tot maximum 99% in Japan (Tajima et al.,1998, Hamel et al., 1999).
12
PCMV veroorzaakt rhinitis bij biggen jonger dan 10 weken oud. Bij oudere biggen is de infectie subklinisch. De ziekte wordt ook wel “inclusion body rhinitis” genoemd, omdat er grote intracellulaire inclusies gevonden worden in de geïnfecteerde cellen van de muceuze klieren van de neusmucosa. Soms wordt een vergroting van de cellen waargenomen. Net als het humaan CMV, kan PCMV via de placenta de foetussen infecteren (Edington et al.,1988), wat resulteert in congenitale infectie waarbij de foetussen sterven of lijden aan gegeneraliseerde ziekte postpartum (Smith,1997). Het PCMV werd geïsoleerd uit een hele reeks verschillende weefsels en cellen waaronder de testis en epididymis, de primaire pulmonaire macrofagen, epitheelachtige en fibroblastachtige cellen uit porciene eileiders en de longmacrofagen (Shirai et al.,1985). Er is nog weinig geweten rond de pathogenese van PCMV, ook al is dit virus van groot belang bij xenotransplantatie. Risico’s bij xenotransplantatie Porciene CMV zou gastheerspecifiek zijn in vivo en in vitro. Pogingen om andere diersoorten, zoals konijnen, muizen, hamsters en rundvee, te infecteren met PCMV zijn niet succesvol (Edington et al., 1999). Voor xenotransplantatie dient men echter zeker te zijn dat geen transmissie naar mensen optreedt. Daarom werden verschillende studies uitgevoerd naar de gevoeligheid van humane cellen met variabele resultaten. Humane B-cellen en humane embryogene epitheliale cellen van de nier (HEK-293) werden gecocultiveerd met porciene alveolaire macrofagen die geïnfecteerd waren met PCMV. Nadien werden de humane cellen onderzocht met PCR. Men vond geen PCMV DNA terug (Tucker et al.,1999). Of overdracht naar en vermeerdering in andere humane bloedcellen zoals Tlymfocyten of macrofagen kan optreden is nog niet onderzocht. Vooral infectie van longmacrofagen zou een risico betekenen omdat PCMV dan de mogelijkheid zou kunnen hebben om de gastheerbeschermingsmechanismes te beschadigen. Deze immunomodulatie zou het risico op infectie met en door opportunistische infectie kunnen vermeerderen. Dit werd reeds beschreven voor knaagdieren en humane CMV (Smid et al., 1976). Ook in de studie van Tucker et al. (1999) werd er geen transmissie gevonden. Zij deden een vergelijkbaar in vitro onderzoek naar de rol van PCMV als een potentieel xenozoönotisch virus in cellijnen. Zij concludeerden daarentegen dat PCMV waarschijnlijk geen significant zoönotisch agens is voor de xenotransplantatie van het varken naar de mens, daar er geen bewijs gevonden werd van infectie met PCMV in de humane cellijnen. Transmissie werd wel gevonden in twee andere studies. In 2008 werd er een studie uitgevoerd die aantoonde dat PCMV humane fibroblastcellen in vitro kan infecteren (Whitteker et al., 2008). Humane fibroblastcellen werden geïncubeerd met levend PCMV, hitte-gedode PCMV of medium. Er werd nagegaan of er infectie plaatsvond aan de hand van cytopathogeen effect, virale transcriptie via RTPCR en virale eiwitexpressie via Western blotting. Na 7 dagen vond men in de geïncubeerde cellen een cytopathogeen effect. Via RT-PCR vond men PCMV DNA polymerase in de cellen. Ook werden PCMV-specifieke eiwitten waargenomen in de geïnfecteerde humane cellen. De resultaten benadrukken het potentiële risico van PCMV. De verschillen in gebruikte cellen kunnen mogelijks de tegengestelde resultaten verklaren. Tucker et al. (1999) gebruikten PCMV geïsoleerd van persisterend geïnfecteerde porciene alveolaire
13
macrofagen daar waar Whitteker et al. (2008) PCMV van persisterend geïnfecteerde porciene cellen van de nasale conchae gebruikten. Abrahante et al. (2011) voerden tenslotte onderzoek uit naar de mogelijke transmissie van virussen via xenotransplantatie voor de behandeling van diabetes. Er werden eilandjes van Langerhans geïsoleerd van volwassen, gezonde varkens en vervolgens in cultuur gebracht voor de implantatie plaatsvond. Men onderzocht of een eilandje negatief zou zijn ook al was het dier zelf positief voor PCMV en andere pathogenen. Dit deed men aan de hand van kwantitatieve real-time PCR. De eilandjes werden onmiddellijk na isolatie en op 7 dagen na cultivatie getest. De eilandjes testten echter positief voor PCMV in 3 van de 12 onderzochte dieren voor cultivatie en in 2 van de 12 na cultivatie. Ook de milt was positief. De studies van Whitteker en Abrahante tonen duidelijk het potentieel risico van PCMV bij xenotransplantatie aan.
Detectie Doordat PCMV subklinische infectie veroorzaakt in volwassen varkens is het belangrijk dat er goede detectiemethoden bestaan. Yang et al. (2012) ontwikkelden daarvoor een “loop-mediated isothermal amplification” (LAMP) methode. Dit zou een gevoelige, snelle en goedkope manier zijn om PCMV te screenen. Het resultaat kon afgelezen worden 30 minuten na de reactie. Via toevoeging van SYBR Green kon men bovendien macroscopisch de positieve reacties waarnemen. De sensitiviteit en specificiteit van LAMP bleek homoloog te zijn aan deze van PCR. Liu et al. (2012) ontwikkelden een ELISA gebaseerd op glycoproteïne gB. Het gB epitoop werd gebruikt als antigen in een indirecte ELISA test voor de detectie van PCMV antistoffen. Deze indirecte ELISA test had een specificiteit en sensitiviteit van respectievelijk 98% en 97,8%. Er werden geen kruisreacties aangetoond met antistoffen tegen andere virussen. Deze indirecte ELISA test is een goede methode voor het onderzoeken van anti-PCMV gB antistoffen.
Preventie van PCMV bij xenotransplantatie Naar preventie toe is er over PCMV nog niet veel beschreven in vergelijking met PERV. Dit komt door de viruseigenschappen. Herpesvirussen worden niet in het genoom van de gastheercel geïntegreerd en zijn bijgevolg gemakkelijker te detecteren in vergelijking met PERV. Het gevaar bij herpesvirussen ligt voornamelijk bij de latentie. Volgens Clark et al. (2003) en Mueller et al. (2004) kunnen echter PCMV vrije varkensgroepen bekomen worden door vroeg spenen of door middel van keizersnede en het apart groot brengen. Maar volgens een onderzoek van Tucker et al. (2002) is er in varkens van een specifieke pathogeen-vrije transgenetische groep die op de wereld werd gebracht via keizersnede toch PCMV DNA gedetecteerd.
2.3.2.Porciene gamma-lymfotroop herpesvirus type 1 en 2
Voor de algemene structuur van herpesvirussen wordt verwezen naar hoofstuk 2.3.1. Porciene gammaherpesvirussen vertonen een structurele gelijkenis met het humaan Epstein-Barr virus (EBV) en het humaan herpesvirus 8 (HHV-8). Ze lijken fylogenetisch zeer sterk op de lymfotrope
14
herpesvirussen bij het schaap en het rund die een lymfoproliferatieve ziekte veroorzaken bij hun gastheer (Ulrich et al.,1999). Bij het varken werden deze virussen voor het eerst ontdekt in Duitsland en Spanje (Ehlers et al., 1999). Men vond twee specifieke sequenties in de milt en perifere bloed mononucleaire cellen die een homologie van 68% bezaten met gammaherpesvirussen, maar slechts 41% met de reeds gekende porciene herpesvirussen. Gebaseerd op de weinige informatie over de sequenties, werden deze nieuwe types voorzichtig benoemd tot porciene lymfotrope herpesvirussen (Ulrich et al., 1999) en bij de subfamilie van de Gammaherpesvirinae ingedeeld. Studies rond de prevalentie van deze virussen in de Duitse gedomesticeerde varkenspopulatie tonen een prevalentie van 90% aan. De virussen werden ook gevonden bij wilde varkens in Duitsland aan de hand van PCR. Alle virussen onderverdeeld in de gammaherpesvirussen repliceren in vitro in lymfoblastoïde T- en Bcellen. In vivo repliceren deze virussen slechts in de familie waartoe de natuurlijke gastheer behoort. Ook al werden deze 2 types geïdentificeerd aan de hand van de specifieke sequenties, een echte virusisolatie is nog niet gerapporteerd. Bijgevolg zijn hun tropismen voor andere dieren of mensen, weefsels of lymfocyten nog ongekend. Er werden wel al verschillende onderzoeken gedaan om de potentiële rol van PLHV in xenotransplantatie duidelijker te maken (Yoo et Giulivi, 2000). Zo bestaat het risico dat de transactivators van HHV-8 en EBV het PLHV-1 kunnen activeren (Scobie et al., 2009). Er werd aangetoond dat PLHV niet wordt gereactiveerd na transplantatie van hart, nier, bijnier en thymuskwab tussen baviaan en varken (Mueller et al.,2004). Volgens Tucker et al. (2004) kan PLHV verticaal overgedragen worden. Ook dit zou van groot belang kunnen zijn in relatie tot xenotransplantatie. Meer onderzoek is noodzakelijk naar de potentiële risico’s van deze virussen.
2.4. PORCIEN HEPATITIS E VIRUS
Eigenschappen en structuur In de Verenigde Staten werd een nieuw virus ontdekt in het jaar 1997, het porciene hepatitis E virus (PHEV) (Meng et al., 1997). Dit virus is klein en heeft geen enveloppe. Het genoom bestaat uit een positieve RNA streng van 7.2 kb. Normaal behoort dit virus tot de Caliciviridae, maar door de unieke genoomstructuur is er een nieuwe, niet-geclassificeerde groep gevormd de hepatitis E-like virussen. Het genoom bevat slechts 3 open reading frames (ORF’s). ORF1 codeert voor een niet-structureel RNA polymerase, ORF2 codeert voor een geglycosyleerd kapsel proteïne en ORF3 codeert voor een cytoskelet-geassocieerd fosfoproteïne (Zafrullah et al., 1997, Pringle,1998, Reyes et al., 1990). De nucleotide sequenties van ORF2 en ORF3 van het PHEV zijn ongeveer 80-84% homoloog met die van het humane virus, al zijn er recent ook humane stammen geïsoleerd die een veel hogere gelijkenis vertonen (Figuur 3). Eén geval van acute hepatitis E werd in de Verenigde Staten gerapporteerd (Schlauder et al., 1998, Erker et al., 1999, Meng et al., 1999). Het geïsoleerde HEV US1 virus had een aminozuurgelijkenis van 94% en 98% met respectievelijk ORF1 en ORF3 van PHEV.
15
Bij een tweede geval, een HEV genaamd US-2, was er een gelijkenis van 99% met de recent ontdekte US-1 stam. Ook deze nieuwe stam vertoonde sterke gelijkenis met de PHEV.
Figuur 3 Relatie tussen de verschillende stammen binnen hepatitis E virus (gebaseerd op Yoo et al., 2000)
Hepatitis E komt vaak voor in varkenspopulaties, ook in niet-endemische landen voor humaan HEV. De prevalentie is hoger bij zeugen en infectie gebeurt bij biggen aan een leeftijd van 2-3 maanden. Risico’s bij xenotransplantatie Meng et al. (1998) hebben bewezen dat het PHEV instaat is om primaten te infecteren. Ze infecteerden Rhesus apen en chimpansees intraveneus met PHEV. Na infectie werd er een seroconversie gezien en het virus werd teruggevonden in de feces van de apen. Viremie bleef tot 5 weken na de infectie aanwezig bij Rhesus apen en milde, focale, necrotiserende en inflammatoire pathologische bevindingen werden gevonden in de lever. Bij de chimpansees werden geen viremie of pathologische veranderingen van de lever gevonden. Ook serologische studies wijzen er op dat PHEV mensen kan infecteren. Zo werd in Taiwan onderzoek gedaan naar de prevalentie van HEV antistoffen bij varkenshandelaars en varkensvleesverdelers. Zij hadden een hogere seroprevalentie dan de controlegroep die niet of minder met varkens in contact kwam (Yoo et al., 2000). Bij varkens is de HEV infectie dosis-afhankelijk. Slechts vanaf een bepaalde drempel krijgt het varken enzymverhoging, leverpathologie of fecale virusuitscheiding. Mogelijks is de PHEV infectie en ziekte bij de mens ook dosis-afhankelijk. Ondanks de detectie van antistoffen is het nog niet zeker of dit virus pathologisch kan zijn bij de mens. PHEV zou na transplantatie ook een mogelijkheid hebben tot verticale transmissie wat een bijkomend risico inhoudt (Yoo et Giulivi, 2000).
Detectie Het HEV kan via de RT-LAMP methode op snelle manier gedetecteerd worden. Deze techniek werkt via een specifieke primer die op het ORF3 gen bindt. De sensitiviteit van deze test is 10 keer hoger dan van RT-nPCR (Reverse Transcription- Nested Polymerase Chain Reaction). Zo werden 41 galstalen met RT-LAMP en RT-nPCR getest, met als resultaat respectievelijk 36 en 18 positieve stalen. De specificiteit van deze test werd bewezen door het uitblijven van vermeerdering van DNA of
16
RNA van andere virussen. De RT-LAMP techniek kan gebruikt worden voor de diagnose van PHEV in laboratoria maar ook op het veld (Zhang et al.,2012). Om antistoffen tegen HEV te detecteren, worden er steeds snellere en geautomatiseerde methodes ontwikkeld. In een studie van Wutz et al. (2013) werd het serum van geslachte varkens getest aan de hand van een microarray analyse platform MCR 3. Hierbij werd gebruik gemaakt van geïmmobiliseerde recombinante antigenen van HEV genotype 1 en 3 op een flow-through chemiluminescence immunochip. De analytische test werd vergeleken met ELISA en LIA (Line Immunoassay) gebaseerd op een recomLine HEV (microgen). De immunochip had de hoogste sensitiviteit en was in 9 minuten automatisch geanalyseerd.
Preventie van HEV bij xenotransplantatie Volgens Tanaka et al. (2004) kan door consistent gebruik van barrièrevoorzieningen en een adequate desinfectie, gecombineerd met regelmatige controles van de varkensgroep gekweekt voor xenotransplantatie
de
HEV
infectie
geëlimineerd
worden.
Deze
varkens
gebruikt
voor
xenotransplantatie zouden kunnen vrij zijn van HEV infectie, zelfs als het PHEV een hoge prevalentie kent bij de varkens van dat land. Scobie et al. (2009) daarentegen vonden wel PHEV terug in specifieke pathogeen-vrije inrichtingen en benadrukken het potentiële risico van PHEV bij xenotransplantatie.
2.5. PORCIEN CIRCOVIRUS TYPE 1 EN TYPE 2
Eigenschappen en structuur Het porciene circovirus (PCV) behoort tot de familie Circoviridae. Het zijn kleine virussen met een diameter van ongeveer 15 tot 22 nm. Het genoom is zeer klein in vergelijking met andere virussen en bestaat uit enkelstrengig circulair DNA met negatieve polariteit (slechts 1759 nucleotiden). Circovirussen hebben geen envelop (Hamel et al., 1998). Het DNA repliceert in de kern van geïnfecteerde cellen en codeert voor ten minste 4 virale proteïnes. Er bestaan 2 types van circovirussen bij het varken. Het PCV type I heeft een hoge prevalentie. Serologische studies in Duitse slachtvarkens tonen een prevalentie van ongeveer 60% (Tischer et al., 1995). Ook andere studies toonden aan dat varkens uit Duitsland, Noord-Ierland en Canada positief waren voor PCV type I (Tischer et al., 1986, Edwards, 1994, Dulac et Afshar, 1989, Larochelle et al., 1999). Er is nog geen ziekte geassocieerd met PCV1. PCV2 komt over de hele wereld voor. Infecties zijn beschreven in onder andere Spanje, Duitsland, Frankrijk, Canada, Japan en Korea (Choi et Chae, 1999, Onuki et al., 1999, Mankertz et al., 2000, Cottrell et al., 2000). Het PCV2 veroorzaakt in tegenstelling tot PCV1 wel klinische symptomen, namelijk het post-weaning multi-systemic wasting syndrom (PMWS) bij varkens van vijf tot twaalf weken oud. Het werd voor het eerst ontdekt in Canada in 1991 (Harding et Clark, 1997). De ziekte typeert zich met progressief gewichtsverlies, tachypnee, dyspnee en geelzucht. PCV2 werd ook geassocieerd met myocarditis bij biggen die dood geboren werden (O’Conner et al., 2001).
17
Het PCV1 kan primaire porciene cellen transformeren (Tischer et al., 1995). Geïnfecteerde cellen vertoonden eigenschappen homoloog aan cellen getransformeerd door het primate virus 40 large tumor (SV40 large T) antigeen. Deze transformatie uitte zich door cellen die hun contactinhibitie verloren en cel kolonies vormden. Het is niet gekend of PCV DNA geïntegreerd zit in het chromosoom of dat PCV humane cellen zou kunnen infecteren en deze transformeringseigenschap kan behouden. Er moeten nog verdere studies gedaan worden om de virus-cel interactie en pathogenese van PCV te verklaren.
Risico bij xenotransplantatie Er zijn namelijk onenigheden voor wat betreft de zoönotische capaciteit van PCV. Er werden bij de mens, de muis en vee antistoffen gevonden die reageren tegen PCV1. Zo werden bij een onderzoek in Duitsland en Canada PCV1 specifieke antistoffen gevonden bij 20-30% van de testpersonen met behulp van ELISA en het recombinant PCV antigeen. Het blijft echter discutabel of de antistofresponsen die werden gevonden in de mens of andere zoogdieren veroorzaakt zijn door een actieve virusinfectie, omdat men er nog niet in geslaagd is om PCV-specifieke nucleotiden sequenties te detecteren bij mensen of dieren waar het antistof aanwezig is (Tischer et al.,1995; Dongwan Yoo et al., 2000). Mogelijks zijn de antistoffen die men vond bij de mens en andere diersoorten zelfs niet specifiek voor PCV (Garkavenko et al., 2004). Hatterman et al. (2002) hebben echter wel bewezen dat PCV2 humane cellen kan infecteren onder experimentele omstandigheden in vitro. Of PCV kan overgedragen worden naar mensen via xenotransplantatie blijft onduidelijk. Wegens mogelijkheid om te vermeerderen in humane cellen is het risico van overdracht bij xenotransplantatie echter niet uitgesloten. Ook bij een onderzoek in Duitsland werden PCV1 specifieke antistoffen gevonden in mensen. Ongeveer 20% van de gezonde testpersonen waren positief voor PCV gelijkend antigen en het percentage steeg tot 30% in de sera van gehospitaliseerde patiënten. Gelijkaardige resultaten werden gevonden in Canada (Tischer et al., 1995). Vierentwintig procent van random geselecteerde gehospitaliseerde patiënten in West- Canada werden positief bevonden voor PCV antigen. Dit onderzoek werd gedaan met behulp van ELISA en het recombinant PCV antigeen. De antistof responsen die werden gevonden in de mens of andere zoogdieren waren waarschijnlijk niet veroorzaakt door een actieve virus infectie omdat men er nog niet in geslaagd is om PCV-specifieke nucleotiden sequenties te detecteren van dieren waar het antistof aanwezig is. (Dongwan Yoo et al., 2000).
Preventie van PCV bij xenotransplantatie Wegens het potentiële risico moeten varkenspopulaties gescreend worden voor het virus en de positieve populaties zouden niet mogen aangewend worden voor xenotransplantatie. Het is zeer moeilijk om negatieve varkens te vinden in het veld, dus varkens voor xenotransplantatie moeten specifiek pathogeen-vrij gekweekt worden.
18
2.6. PORCIEN ENCEPHALOMYOCARDITIS VIRUS
Encephalomyocarditis virus (EMCV) behoort tot het genus Cardiovirus in de familie Picornaviridae. Het is een enkelvoudig gestrengd, positief RNA virus met een genoom van ongeveer 7,8 kb. Het viraal RNA bindt direct aan de ribosomen van de cel en wordt volledig of gedeeltelijk vertaald. Het nieuwgevormde virus verlaat de geïnfecteerde cel via cytolyse. Er werden reeds een paar gevallen van EMCV infectie bij de mens geconstateerd, die zich uitten met koorts, nekpijn, lethargie, hoofdpijn en overgeven (Murnane, 1981). Ratten en muizen zijn de natuurlijke gastheer en verspreiden het virus via orale-fecale overdracht. Het virus is wereldwijd verspreid en is reeds geïsoleerd uit meer dan 30 diersoorten waaronder zoogdieren, vogels en insecten. Varkens blijken zeer gevoelig te zijn voor EMCV. Het virus is dan ook endemisch aanwezig in de varkenspopulatie. Er zijn tot nu toe twee types van EMCV bekend bij het varken. Type A veroorzaakt voortplantingsproblemen en type B uit zich in hartfalen. Het sterftecijfer is afhankelijk van de leeftijd. Het is zeer hoog voor speenvarkens, waar het acute myocarditis en plotse dood veroorzaakt, maar op latere leeftijd is de infectie subklinisch. Transplacentaire infectie veroorzaakt mummificatie van foetussen, abortus, doodgeboorte en neonatale sterfte. (Brewer et al., 2001). Het virus vermeerdert meest uitgebreid in het hart, de lever en de nieren. Hier worden dan ook de hoogste virustiters teruggevonden (Craighead et al.,1963).
PEMCV kan humane cellen infecteren en vormt bijgevolg een mogelijk risico bij xenotransplantatie. Dit werd aangetoond door humane cardiomyocyten, renale epitheel cellen, beenmerg progenitor cellen, endotheliale cellen van de aorta, PBMCs en hepatocyten te inoculeren met EMCV-30. De cellen werden geoogst na 7 en 16 uren en werden via immunohistochemie en in situ hybridisatie op virale antigenen en RNA onderzocht. Figuur 4 toont controle (A) en geïnfecteerde (B) humane cardiomyocyten waarbij de hoge immunoreativiteit met anti-EMCV polymerase antistoffen in de geïnfecteerde cellen opvalt. Vijfennegentig procent van de EMCV geïnoculeerde cardiomyocyten werden positief bevonden voor virale polymerase. Hepatocyten, renale cellen, endotheliale cellen van de aorta, beenmerg progenitor cellen, PBMCs en neuroblastoma cellen waren negatief voor EMCV polymerase antigenen (Brewer et al., 2001). Ook Brewer et al. toonden aan dat humane cardiomyocyten productief kunnen geïnfecteerd worden door PEMCV. Humane cardiomyocyten werden geïnfecteerd waarna op verschillende tijdstippen de virustiter werd bepaald. De aldus verkregen groeicurve toonde aan dat humane cardiomyocyten heel gemakkelijk en productief kunnen geïnfecteerd worden door PEMCV.
19
Figuur 4 EMCV antigenen en RNA in primaire humane myocard cellen (overgenomen uit Brewer et al., 2001)
Naast de bovenstaande studies waarin vermeerdering in humane weefsels werd aangetoond zijn er bijkomende bewijzen dat EMCV gemakkelijk de speciesbarrières kan doorbreken. Zo kan EMCV overgedragen worden van de rat naar het varken, het virus is wijdverspreid bij vertebraten. EMCV werd geïsoleerd uit verschillende diersoorten, en de verschillende virusstrengen vertoonden antigene gelijkenissen. Wanneer pancreas- en myocardweefsel van varkens geïnfecteerd met EMCV werden getransplanteerd in muizen, dan resulteerde dit tot overdracht van het virus en een acute, fatale ziekte bij de muizen (Denis et al.,2006, Brewer et al. (2003).
Belangrijk in het zicht van xenotransplantatie is ook dat het EMCV kan persisteren voor een lange periode na de acute ziekte. Vooral hartweefsel van het varken houdt een risico in bij transplantatie. Een persisterende EMCV infectie kan in varkenshartweefsel aanwezig zijn. De chronische infectie resulteerde in inflammatie en beschadigingen van het hartweefsel. Dit laatste heeft grote consequenties voor de kwaliteit en levensduur van het donorweefsel (Brewer et al.,2001).
Brewer et al. (2001) vonden EMCV RNA in 2 van de 100 varkensharten verkregen van commerciële varkens op het tijdstip van de slachting. Deze resultaten toonden aan dat er nood is aan de ontwikkeling van een snelle RT-PCR test voor de screening van varkensweefsels dat men wil gebruiken voor xenotransplantatie. Voorbeelden van routineonderzoeken om de persisterende infectie van EMCV in varkensweefsel te onderzoeken zijn in situ hybridisatie, RT-PCR en immunohistochemie.
Over de preventie van EMCV is nog weinig geweten, maar uit bovenstaande gegevens kan afgeleid worden dat EMCV een potentieel belangrijk virus is voor xenotransplantatie. Het risico moet verder onderzocht worden.
20
2.7. OVERIGE VIRUSSEN
Er zijn nog verschillende andere virussen die mogelijks een risico inhouden bij xenotransplantatie maar waar er nog niet veel over beschreven staat (Tabel 4). Hierbij kan men denken aan paramyxovirussen zoals Hendra virus, Nipah virus, Menangle virus en Tioman virus, porciene calicivirussen, inclusief sapovirussen die gastroenteritis bij de mens veroorzaken, porcien torque virus en het Reston ebolavirus. Het potentieel risico van deze virussen moeten nauwkeurig in kaart gebracht worden. Ze dienen op een lijst van micro-organismen komen die moeten worden getest in donor varkens en gepaste preventiemaatregelen dienen onderzocht te worden (Yoo et Giulivi (2000), Denner et al. (2012)).
Tabel 4 Virussen die een risico vormen bij xenotransplantatie (overgenomen uit Denner et Tönjes, 2012) Virusgroep
Virusnaam
Ziekte bij biggen
Transmissie
naar
de
mens Herpesvirussen PLHV-1
Porciene lymfotroop herpesvirus 1
PLHV-2-3
Porciene lymfotroop herpesvirus 2-3
PCMV
Lymfoproliferatieve ziekte
Ongekend
Ongekend
Ongekend
Porciene cytomegalovirus
Ongekend
Circovirussen PCV-1
Porciene circovirus 1
PCV-2
Porciene circovirus 2
Geen Postweaning multisystemic wasting syndrome
Ongekend Ongekend
Andere virussen
A/H1N1
en
HXNX PHEV Paramyxovirussen
andere
Influenzavirus
Griep
+
Porciene hepatitis E virus
Asymptomatisch
+
Nipah virus Menagle virus
Respiratoir en neurologisch
Encefalitis en
syndroom
respiratoire ziekte
Reproductie ziekte Encefalitis en respiratoire
Hendra virus
Calicivirussen Filovirussen
ziekte
Tioman virus
?
?
Sapovirussen
?
Gastroenteritis
Reston ebolavirus
?
Ongekend
21
BESPREKING
Vele obstakels staan nog in de weg vooraleer xenotransplantatie van varken naar mens effectief toegepast kan worden. We denken hierbij bijvoorbeeld aan het grote aantal bekende, maar vooral ook onbekende virussen die bij het varken voorkomen en die kunnen overgedragen worden naar de mens, de risico’s van orgaan-incompatibiliteit tussen varken en mens, afstotingsreacties tegen het vreemde weefsel, de ethische vragen bij het gebruik van varkensweefsels en de problemen die het kweken van SPF of genetisch gemodificeerde varkens met zich mee brengt. Hieronder worden een aantal van deze zaken en de toekomstverwachtingen kort bediscussieerd.
Zoals uit het literatuuroverzicht blijkt zijn er heel wat virussen die een mogelijk risico vormen bij xenotransplantatie. Naast uitgebreid onderzoek naar hun interactie met varken en mens en hun mogelijkheden om de species-barrière te doorbreken, is het cruciaal dat ze kunnen worden opgespoord. Dit laatste is zeker van belang voor virussen die asymptomatisch voorkomen en voor virussen die zich in een persistente of latente toestand kunnen terugtrekken. De sensitiviteit en specificiteit van de diagnostische testen moeten daarvoor nog veel verbeteren in de toekomst. De screening van donorvarkens zou indien mogelijk moeten gebeuren aan de hand van DNA/RNA testen en serologische testen. Ontwikkeling en optimalisatie van nieuwe diagnostische testen zal ook helpen om tot nog toe onbekende pathogenen bij varkens aan het licht te brengen.
Varkensorganen en weefsels werken in verschillende opzichten anders dan die van de mens. Insuline-producerende cellen van de pancreas werken relatief eenvoudig en zouden in principe geen groot probleem mogen vormen voor transplantatie. Transplantatie van de lever daarentegen is veel gecompliceerder. Dit orgaan is zeer verschillend tussen varken en mens en ook de functionaliteit van de varkenslever is verschillend van de menselijke lever. Deze verschillen maken dat succesvolle xenotransplantatie van de lever een zeer grote uitdaging is. Bovendien zijn er naast de functionele verschillen ook verschillen die leiden tot afstotingsreacties, zoals aangehaald in Hoofdstuk 1. De vele afstotingsreacties van de ontvanger tegenover het vreemde weefsel vormen een groot probleem dat nog lang niet opgelost is. Ontwikkeling van betere immunosuppressieve medicatie is dus een belangrijk onderzoeksdomein voor de toekomst. Afstotingsreacties kunnen ook deels worden voorkomen door gebruik te maken van genetisch gemodificeerde varkens. Dergelijke genetisch gemodificeerde varkens werden reeds ontwikkeld, zoals de galactose-alfa-1,3-galactosyltransferase ‘knocked out’ varkens (zie Hoofdstuk 1), met langere overlevingstijden van varkensweefsels na xenotransplantatie tot gevolg. Er schuilt echter een gevaar in de ontwikkeling van deze transgene ‘humanized’ dieren. Door de incorporatie van humane genen in de cellen van het varken, bestaat immers de mogelijkheid dat varkensvirussen zich gemakkelijker kunnen aanpassen aan de mens wanneer ze vermeerderen in de transgene varkens. Dit potentiële risico moet zeer goed onderzocht worden, waarbij vooral de replicatie van de varkensvirussen in humane weefsels een belangrijke parameter is.
22
Bovenstaande maakt duidelijk dat er nog veel onderzoek moet gebeuren om tot veilige en succesvolle xenotransplantatie te komen. Echter, de weg van het onderzoek zelf kent ook vele hindernissen. Zo dienen er veel dieren gebruikt te worden. Vele mensen protesteren tegen het gebruik van proefdieren voor de wetenschap omwille van de levensomstandigheden van de dieren, het mogelijk lijden dat ze moeten ondergaan en de genetische modificering. Xenotransplantatie en het voorafgaande onderzoek zal bovendien wegens geloofsovertuigingen, cultuur en sociale omgeving niet altijd aanvaard worden. Dit alles maakt dat ondanks de veelbelovende verwachtingen, xenotransplantatie van varken naar mens de komende jaren nog geen concrete oplossing is voor het tekort aan donororganen.
23
REFERENTIELIJST
Albrahante J.A. et al., 2011, Microbiological safety of porciene islets: comparison with source pig, 8:88-93
Beckwith J et al. 2010, A health-economic analysis of porciene islet xenotransplantation. Xenotransplantation 17: 233-242.
Blusch JH et al. (2002). Pig endogenous retroviruses and xenotransplantation, 9:242-251
Brewer C. et al. (2003). Transmission of porciene encephalomyocarditis virus (EMCV) to mice by transplanting EMCV-infected pig tissues. Xenotransplantation. 10: 569-576.
Brewer L.A. et al., 2001, Porciene Encephalomyocarditis virus persists in pig myocardium an infects human myocardial cells, 75:11631-11629
Brewer L.A. et al., 2004, Transplanting encephalomyocarditis virus-infected porciene islet cells reverses diabetes in recipient mice but also transmits the virus, 11:160-170
Byrne et McGregor (2012), Cardiac xenotransplantation: progress and challenges, 17:148-54
Choi C, Chae C.(1999). In situ hybridization for the detection of porciene circovirus in pigs with post-weaning multisystemic wasting syndrome. J Comp Pathol. 121, 265-270.
Clark D. et al, 2003, Porciene cytomegalovirus in pigs being bred for xenograft organs: Progress towards control. Xenotransplantation;10:142.
Clayson ET, Innis BL, Myint KSA, et al. (1995). Detection of hepatitis E virus infections, among domestic swine in the Kathmandu Valley of Nepal. Am J Trop Med Hyg. 53, 228-232.
Cottrell TS, Friendship RM, Dewey CE, et al.(2000). A study investigating maternal antibody to porciene circovirus type II and the occurrence of viremia on two Ontario farms. Proc Am Assoc
Craighead et al., 1963, Oral infection of sine with encephalomyocarditis virus. J. Infect. Dis. 112:205-212
Denis P. et al.,2006, Genetic variability of encephalomyocarditis virus isolates, Veterinary microbiology 113: 1-12
Denner et al. (2003) Genetic alterations of the long terminal repeat of an ecotropic porciene endogenous retrovirus during passage in human cells. Virology 314: 125-133
Denner J et al. (2012). Infection barriers to successful xenotransplantation focusing on porciene endogenous retroviruses, Clin Microbiol Rev. 25:318-43.
Denner J. (2008), Xenotransplantation: state of the art of biosafety, p 7-79. In Jansen ES, Simon JW (ed), Xenotransplantation ethic, econimic, social,cultural and scientific backgroud, Volume 1, VDM-verlag, Saarbrücken, Germany.
Dieckhoff B et al. 2007. Expression of porciene endogenous retroviruses in melanomas of Munich miniature swine Troll. Vet. Microbiol. 123: 53-68.
Dulac GC, Afshar A.(1989). Porciene circovirus antigens in PK-15 cell line (ATCC CCL-33) and evidence of antibodies to circovirus Canadian pigs. Can J Vet Res. 53, 431-433.
Edington N, Broad S, Wrathall AE, Done JT. (1988). Superinfection with porciene cytomegalovirus initiating transplacental infection. Vet Microbiol. 16, 189-193.
24
Edington N, Watt RG, Plowright W. (1976). Cytomegalovirus excretion in gnotobiotic pigs. J Hyg (Lond). 77, 283-290.
Edington N. Cytomegalovirus. In: Straw BE, D'Allair S, Mengeling WL, Taylor D, eds. Diseases of Swine. 8th ed. Ames: Iowa State University Press, 1999:125-131.
Edwards S, Sands JJ. (1994). Evidence of circovirus infection in British pigs. Vet Rec. 134, 680681.
Ehlers B, Ulrich S, Goltz M.(1999). Detection of two novel porciene herpesviruses with high similarity to gammaherpesviruses. J Gen Virol. 80, 971-978.
Ellis J, Krakowka S, Lairmore M, et al. (1999). Reproduction of lesions of postweaning multisystemic wasting syndrome in gnotobiotic piglets. J Vet Diagn Invest. 11, 3-14.
Erker JC, Desai SM, Schlauder GG, Dawson GJ, Mushahwar IK. (1999). A hepatitis E virus variant from the United States: molecular characterization and transmission in cynomolgus macaques. J Gen Virol. 80, 681-690.
Garkavenko O et al. (2008) Porciene endogenous retrovirus transmission characteristics from a designated pathogen-free herd, 40:590-3
Garkavenko O. et al., 2004, Monitoring for potentially xenozoonotic viruses in New Zealand pigs. 72: 338-344
Hamel AL, Lin L, Sachvie C, Grudeski E, Nayar GP. (1999). PCR assay for detecting porciene cytomegalovirus. J Clin Microbiol. 37, 3767-3778.
Hamel AL, Lin LL, Nayar GP. (1998). Nucleotide sequence of porciene circovirus associated with postweaning multisystemic wasting syndrome in pigs. J Virol. 72, 5262-5267.
Harding JSC, Clark EG. (1997). Recognizing and diagnosing postweaning multisystemic wasting syndrome (PMWS). Swine Health Prod. 5, 201-203.
Harrison et al, (2004) Determinants of high titer in recombinant porciene endogenous retroviruses. J. Virol. 78: 13871-13879
Hatterman K. et al, 2002, Infection studies on human cell-lines with porciene circovirus type 1 and type 2, Paris, World microb 385:132
Herrera JL, Hill S, Shaw J, Fleenor M, Bader T, Wolfe MS.(1993). Hepatitis E among-US travelers. Morb Mortal Wkly. 42,1-4.
Hussaini SH et al.,1997,Severe hepatitis E infection during pregnancy, Viral Hepat , 4, 51-54.
Irgang et al., 2008, No evidence for PERV release by islet cells from German landrace pigs. Ann. Transplant. 13: 59-66
Kennedy S, Moffett D, McNeilly F, et al. (2000) Reproduction of lesions of postweaning multisystemic wasting syndrome by infection of conventional pigs with porciene circovirus type 2 alone or in combination with porciene parvovirus. J Comp Pathol. 122, 9-24.
Larochelle R, Morin M, Antaya M, Magar R. (1999). Identification and incidence of porciene circovirus in routine field cases in Quebec as determined by PCR. Vet Rec. 145,140-142.
Li WC et al. (2013), Comparison of biomechanical properties of bile duct between pigs and humans for liver xenotransplant, 45:741-7
25
Liu et al. (2012), Indirect-blocking ELISA for detecting antibodies against glycoprotein B (gB) of porciene cytomegalovirus (PCMV). J. Virol. Methods. 186:30-5.
Ma Y et al. (2010). Real-time quantitative polymerase chain reaction with SYBR green i detection for estimating copy numbers of porciene endogenous retrovirus from Chinese miniature pigs, 42:1949-52
Mankertz A, Domingo M, Folch JM, et al. (2000). Characterisation of PCV-2 isolates from Spain, Germany and France. Virus Res. 66, 65-77.
Meng XJ, Dea S, Engle RE, et al.(1999). Prevalence of antibodies to the hepatitis E virus in pigs from countries where hepatitis E is common or is rare in the human population. J Med Virol. 58, 297-302.
Meng XJ, Halbur PG, Haynes JS, et al. (1998). Experimental infection of pigs with the newly identified swine hepatitis E virus (swine HEV), but not with human strains of HEV. Arch Virol. 143, 1405-1415.
Meng XJ, Halbur PG, Shapiro MS, et al. (1998). Genetic and experimental evidence for crossspecies infection by the swine hepatitis E virus. J Virol. 72, 9714-9721.
Meng XJ, Purcell RH, Halbur PG, et al.(1997). A novel virus in swine is closely related to the human hepatitis E virus. Proc Natl Acad Sci USA, 94, 9860-9865.
Millard AL et al. (2010). Efficiency of porciene endothelial cell infection with human cytomegalovirus depends on both virus tropism and endothelial cell vascular origin, 17:274-87
Mueller N. et al, 2004, Reduction of consumptive coagulopathy using procine cytomegalovirusfree cardiac porciene grafts in pig-to-primate xenotransplantaion. Transplantation; 78: 1449
Murnane, T.G., 1981, Encephalomyocarditis, In G. W. Beran (ed.), CRC handbook series in zoonoses, section B, vol. 2.Viral zoonoses. CRC Press, Boca Raton, Fla. 137-147
Narita M, Shimizu M, Kawanuru H, Haritari M, Moriwaki M. (1985). Pathologic changes in pigs with prednisolone induced recrudescence of herpesvirus infection. Am J Vet Res. 46, 1506-1510.
O’ Conner B. et al, 2001, Multiple porciene circovirus 2-associated abortions and reproductive failure in a multisite swine production unit. Can Vet J 42: 551-553
of hepatitis E virus is a phosphoprotein that associated with the cytoskeleton. J Virol. 71, 90459053.
Onuki A, Abe K, Togashi K, Kawashima K, Taneichi A, Tsunemitsu H. (1999). Detection of porciene circovirus from lesions of a pig with wasting disease in Japan. J Vet Med Sci. 61, 11191123.
Payne CJ, Ellis TM, Plant SL, Gregory AR, Wilcox GE. (1999). Sequence data suggests big liver and spleen disease virus (BLSV) is genetically related to hepatitis E virus. Vet Microbiol , 68, 119125.
Platt KB, Yoon KJ, Zimmerman JJ.(1998). Susceptibility of swine to hepatitis E virus and its significance to human health. Research Report. Ames: Iowa State University. 125-126.
Prabha S et al. (2008). Existence of proviral porciene endogenous retrovirus in fresh and decellularised porciene tissues, 26:228-32
26
Pringle C. (1998). Minutes of the 27th International' Committee on Taxonomy of Viruses Meeting. Arch Virol. 143:1449-1459.
Reemtsma K. (1969), Renal transplantation from non-human primates to man, Ann N Y Acad SCi. 162:412-8
Reyes GR, Purdy MA, Kim JP, et al. (1990). Isolation of a cDNA from the virus responsible for enterically transmitted non-A, non-B' hepatitis. Science. 247:1335-1339.
Rupasinghe V, Tajima T, Maeda K, Iwatsuki-Horimoto K, Sugii S, Horimoto T. (1999). Analysis of porciene cytomegalovirus DNA polymerase by consensus primer PCR. J Vet Med Sci. 61: 12531255.
Schlauder GG, Dawson GJ, Erker JC, et al.(1998). The sequence and phylogenetic analysis of a novel hepatitis E- virus isolated from a patient with acute hepatitis reported in the United States. J Gen Virol . 79: 447-456.
Schuurman HJ. (2009). The International Xenotransplantation Association consensus statement on conditions for undertaking clinical trials of porciene islet products in type 1 diabetes—chapter 2: Source pigs,16:215-22
Scobie et al.,2009, Porciene endogenous retrovirus and other viruses in xenotransplantation, 2:175-179
Shirai J, Narita M, lijima Y, Kawamura H. A. (1985). Cytomegalovirus isolated from swine testicle cell culture. Nippon Juigaku Zasshi. 47: 697-703.
Smith KC. (1997). Herpesviral abortion in domestic animals. Vet J. 153: 253-268.
Tajima T, Kawamura H. (1998) Serological relationship among porciene cytomegalovirus Japanese isolates and a UK isolate. J Vet Med Sci. 60,:107-109.
Tanaka H. et al,2004, Molecular investigation of hepatitis E virus infection in domestic and miniature pigs uses for medical experiments,11:503-510.
Tien NT, Clayson HT, Khiem HB, et al. (1997). Detection of immunoglobulin G to the hepatitis E virus among several animal species in Vietnam. Am J Trop Med Hyg. 57, 211.
Tischer I, Bode L, Apodaca J, et al. (1995). Presence of antibodies reacting with porciene circovirus in sera of humans, mice, and cattle. Arch Virol. 140, 1427-1439.
Tischer I, Bode L, Peters D, Pociuli S, Germann B.(1995). Distribution of antibodies to porciene circovirus in swine populations of different breeding farms. Arch Virol. 140, 737-743.
Tischer I, Peters D, Pociuli S.(1995). Occurrence and role of an early antigen and evidence for transforming ability of porciene circovirus. Arch Virol. 140, 1799-1816.
Tsarev SA, Shrestha MP, He J, et al. (1998). Naturally acquired hepatitis E virus- (HEV) infection in Nepalese rodents. Am J Trop Med Hyg. 59, 242.
Tucker A. et al., 2002, The production of transgenic pigs for potential use in clinical xenotransplantation: Microbiological evaluation. Xenotransplantation ;9:191
Tucker A. et al.,1999, Evaluation of porciene cytomegalovirus as a potential zoonotic agent in xenotransplantation. Transplant Proc 1999;31:915.
Tucker AW, Galbraith D, McEwan P, Onions D. (1999). Evaluation of porciene cytomegalovirus as a potential zoonotic agent in xenotransplantation. Transplant Proc. 31, 915.
27
Ulrich S, Goltz M, Ehlers B. (1999). Characterization of the DNA polymerase loci of the novel porciene lymphotrophic herpesviruses 1 and 2 in domestic and feral pigs. J Gen Virol. 80, 31993205.
Whitteker J. et al.,2008, Human Fibroblasts are permisssive for procine cytomegalovirus in vitro., 86: 155-162.
Whitteker JL et al. (2008), Human fibroblasts are permissive for porciene cytomegalovirus in vitro, Volume 86, Issue 1, Pages 155-62
Widen BF, Lowings JP, Belak S, Banks M. (1999). Development of a PCR system for porciene cytomegalovirus detection and determination of the putative partial sequence of its DNA polymerase gene. Epidemiol Infect. 123, 177-180.
Wilson CA et al. (1998), Type C retrovirus released from porciene primary peripheral blood mononuclear cells infects human cells. J. Virol. 72: 3082-3087
Wutz K. et al. (2013). New Route for Fast Detection of Antibodies against Zoonotic Pathogens in Sera of Slaughtered Pigs by Means of Flow-through Chemiluminescence Immunochips. Anal. Chem. downloaded from http://pubs.acs.org on May 4.
Yang JL, Zhang SH Liu ZH, Yang R, Huang Y, Wen M. (2012). Development and evaluation of a loop-mediated isothermal amplification assay for the rapid detectrion of procine cytomegalovirus under field conditions. Virol J. 29: 321.
Zafrullah M, Ozdener-MH, Panda SK, Jameel S.(1997). The ORF3 protein
Zhang B, Zhang A, Zhao Y. (2008). Platelet aggregation and thrombosis in xenotransplantation between pigs and humans. Thromb Res. 121:433-41
Zhang LQ et al.(2012). Simple and rapid detection of swine hepatitis E virus by reverse transcription loop-mediated isothermal amplification. Arch. Virol. 157:2383-8
http://www.rajaha.com/elisa-test-what-principle-types/indirect-elisa-test/
28
