Snelle en betrouwbare analyse van de microbiologische zwemwaterkwaliteit met qpcr

Snelle en betrouwbare analyse van de microbiologische zwemwaterkwaliteit met qPCR Bart Wullings, Leo Heijnen en Edwin Kardinaal KWR Watercycle Research Institute, Nieuwegein

Inhoud

Microbiologische zwemwaterkwaliteit qPCR voor snelle en betrouwbare analyses • E. coli en enterococcen • Source tracking: o.a. Bacteroides • Cyanobacteriën (vervolg presentatie Miguel Dionisio Pires)

Conclusies

© kwr 2012 - Genomics in het waterbeheer - 12 juni 2012

2

Europese richtlijn microbiologische zwemwaterkwaliteit


3

Monitoring zwemwaterkwaliteit

Reguliere monitoring fecale verontreiniging • • • •

Gestandaardiseerde ISO kweekmethoden Monstername, analyse en rapportage duurt 2/3 dagen Bij overschrijding opnieuw 2/3 dagen Bij calamiteiten is sneller resultaat gewenst!

Monitoring Cyanobacteriën • Fluoroproob en microscopische telling • Metingen minder betrouwbaar, temperatuurgevoelig (fluoroproob) en subjectief en duur (telling)

qPCR

Foto Waterproef

• Snel (<24 uur), betrouwbaar, objectief, reproduceerbaar en goedkoop(er) © kwr 2012 - Genomics in het waterbeheer - 12 juni 2012

4

qPCR

• Eerste NEN norm voor qPCR Legionella pneumophila © kwr 2012 - Genomics in het waterbeheer - 12 juni 2012

5

qPCR voor monitoring fecale besmetting

Onderzoek in opdracht van RWS Waterdienst In 2011 qPCR methoden voor E. coli en enterococcen operationeel gemaakt in laboratorium Eerste veldstudieresultaten zien er goed uit!


6

qPCR voor monitoring fecale besmetting Andijk 2010, ente rococce n

C o n ce n tra tie s(K V E+D N Ak o p ië n /1 0 0m l)

qPCR

kweek

grenswaarde 'uitstekend'

1,0E+06 1,0E+05

1,0E+04

1,0E+03

1,0E+02

1,0E+01

1,0E+00 11-6-2010

1-7-2010

21-7-2010

10-8-2010

30-8-2010

19-9-2010

Datum

Kleine Ze e tje 2010, E. coli

C o n c e n tra tie s(K V E+D N Ak o p ië n /1 0 0m l)

qPCR

kweek

grenswaarde 'uitstekend'

1,0E+06

1,0E+05

1,0E+04

1,0E+03

1,0E+02

1,0E+01

1,0E+00 11-6-2010

21-7-2010 - 12 juni 10-8-2010 © kwr 2012 - 1-7-2010 Genomics in het waterbeheer 2012 Datum

30-8-2010

19-9-2010

7

Bronopsporing fecale verontreiniging

Vraag:

Welke bronnen van fecale vervuiling?

Methode:

Aantonen van dier-specifieke darmbacteriën (o.a. Bacteroides): onderzoek 2011/2012 © kwr 2012 - Genomics in het waterbeheer - 12 juni 2012

8

Monitoring van potentieel toxische cyanobacteriën met qPCR

Opdrachtgever: RWS Waterdienst KWR (fycocyaninegen) • • • •

Bart Wullings Daniëlle van de Linde Lonneke Hensen Edwin Kardinaal

Deltares (toxinegenen) • • • •

Miguel Dionisio Pires Bas van der Zaan Merel Collenteur Jan Gerritse © kwr 2012 - Genomics in het waterbeheer - 12 juni 2012

9

qPCR voor 4 potentieel toxische geslachten van Cyanobacteriën Microcystis

Aphanizomenon

Planktothrix

Anabaena


10

Ontwikkeling van specifieke primers en probes

Onderzoek gestart in 2009 Doelgen is het fycocyanine operon (cpcBA) • Uniek voor cyanobacteriën en grote collectie van “referentie” sequenties beschikbaar in databases (totaal 1000 cpcBA sequenties)

• Microcystis en Planktothrix genus specifiek primers en probe ontworpen Geslachten Anabaena en Aphanizomenon zijn niet monofylogenetisch maar vermengd • Discrepantie tussen morfologische en fylogenetische classificatie • Sequenties kunnen worden geclusterd in 9 (Rajaniemi et al 2005) of 4 grotere clusters (dit onderzoek) • Primers en probes ontworpen deze 4 clusters (A,B,C,D) 11 © kwr 2012 - Genomics in het waterbeheertegen - 12 juni 2012

Correctiefactor qPCR naar celdichtheid Genoomcopieen verklaring voor verschil telling versus qPCR

In literatuur is beschreven dat in cel van Cyanobacteriën wel 57 kopieën van genoom aanwezig kunnen zijn. qPCR resultaten in literatuur in combinatie met celtelling


12

Veldstudie 2011

35 locaties Ongeveer 7 bemonsteringen Totaal 232 monsters


13

Resultaten veldstudie qPCR (correctie) en celtelling

Camping De Watermolen Anabaena C

Aphanizomenon D

Microcystis

Planktotrix

Anabaena sp.

Aphanizomenon

Microcystis sp.

Planktothrix sp.

cellen / DNA ko p ie aan tallen p er m l

1000000 100000 10000 1000 100 10 1 25

27

29

31

33

© kwr 2012 - Genomics in het waterbeheerWeeknummers - 12 juni 2012

35

37

39 14

Resultaten veldstudie qPCR (correctie) en celtelling

Bovenwater strand zeilplas Anabaena C

Aphanizomenon D

Microcystis

Planktotrix

Anabaena sp.

Aphanizomenon

Microcystis sp.

Planktothrix sp.

cellen / DNA kopie aantallen per ml

1000000 100000 10000 1000 100 10 1 25

27

29

31

33

Weeknummer

35


37

39

15

Discussie en conclusies

Q-PCR methoden beschikbaar voor het snel screenen van potentieel toxische cyanobacteriën; • Betere en snellere beoordeling van zwemwater op risico cyanobacteriën met qPCR; • Betrouwbaardere detectie van afzonderlijke vier genera; • Grotere gevoeligheid waardoor proliferatie in vroeger stadium kan worden aangetoond; • Prijs per monster is lager dan voor microscopische telling

• Methoden klaar voor zwemseizoen 2012 • Implementatie van methoden in laboratoria gestart, nu het vervolg; • Mogelijk uitbreiden van de methoden voor andere genera zoals Woronichinia / Phormidium. 16 © kwr 2012 - Genomics in het waterbeheer - 12 juni 2012

Veldstudie 2011


17

Stelling

1. qPCR methoden hebben de toekomst en moeten zo snel mogelijk worden ingevoerd in het waterbeheer


18

Snelle en betrouwbare analyse van de microbiologische zwemwaterkwaliteit met qpcr

Recommend Documents