Snelle en gevoelige analyse van mastitis pathogenen met qPCR; ervaringen uit de praktijk Auteurs: Marielle Melchior1, Marco Verhoef2, Mathijs Bakker3,
wetenschap
Tineke Henselmans4, Jan Vernooij2, Ruud Graat2
Inleiding
QPCR techniek
Sinds 2010 gebruikt Diergeneeskundig Centrum Midden Salland (DGC MS) de qPCR techniek voor de diagnostiek van mastitis. Naast het uitvoeren van diagnostiek op klinische monsters is er onderzoek gedaan naar mogelijkheden voor verdere toepassing van de qPCR techniek voor mastitis diagnostiek op bedrijfsniveau. In dit kader is gekeken naar bedrijfsscreening betreffende de prevalentie van subklinische mastitis en naar de mogelijkheden voor diagnostiek van mastitis voor het droogzetten. Om inzicht te krijgen in de mogelijkheden en de onmogelijkheden van de qPCR wordt eerst de qPCR techniek uitgelegd. Hoe ontstaat de sensitiviteit en hoe ontstaat de specificiteit van deze techniek? Daarna wordt ingegaan op de praktijkervaringen met deze techniek voor de diagnostiek van klinische en subklininsche mastitis, en bij de screening van bedrijven. Voor dit laatste is, in samenwerking met MSD Animal Health, een praktijkonderzoek opgezet op vier melkveebedrijven.
De letters qPCR staan voor: “Quantitative Polymerase Chain Reaction”, oftewel kwantitatieve polymerase ketting reactie. De techniek is schematisch weergegeven in figuur 1. Het belangrijkste kenmerk van de PCR techniek is de vermenigvuldiging van een specifiek stuk DNA, door middel van een cyclische reactie. Hiervoor worden het enzym Taq polymerase en primers gebruikt. Taq polymerase is het enzym dat DNA kan repliceren bij hogere temperaturen. Door middel van het 40x herhalen van een temperatuurcyclus wordt hetzelfde stuk DNA steeds opnieuw vermenigvuldigd.
* MBM Veterinary Consultancy, Heeten, Email:
[email protected] 2 DGC Midden Salland, Raalte 3 Animal Health Lab, Raalte 4 MSD Animal Health, Boxmeer 5 MSD Animal Health, Boxmeer * Reacties op dit artikel kunnen worden gericht aan Marielle Melchior
Specificiteit De primers zorgen voor de specificiteit van de reactie. De primers moeten zodanig ontwikkeld worden dat ze, op korte afstand van elkaar, precies complementair zijn aan het doel- DNA. De primers mogen niet binden met enig ander DNA, dat zich ook in het monster kan bevinden. Naast de primers ondersteunt ook de f luorescente probe (zie volgende paragraaf) in de qPCR reacties de specificiteit van de test.
1
28 Tijdschrift voor Diergeneeskunde | nr 6 | juni 2013
Semi-kwantitatief Het kwantitatief waarnemen van het DNA in de kettingreactie van de qPCR vindt plaats met de f luorescente probes. Deze probes binden specifiek aan het doel-DNA en dragen daardoor bij aan de specificiteit van de qPCR reactie. De pro-
Voor de praktijk bes geven een f luorescentie signaal af, wanneer ze na binding aan het doel-DNA, dat tussen de primers is gevormd, worden afgebroken door het replicerende Taq polymerase (zie figuur 2). Dit proces zorgt voor een alsmaar toenemende f luorescentie tijdens de replicatie. Hoe meer DNA zich bevindt in het oorspronkelijke monster, des te sneller de f luorescentie uitstijgt boven de grens- of achtergrondwaarde. De snelheid van waarnemen van f luorescentie is een semi-kwantitatieve maat voor de hoeveelheid DNA in het uitgangsmateriaal. Deze snelheid wordt weergegeven aan de hand van het nummer van de temperatuurcyclus waarin het signaal boven de grenswaarde uitkomt. Hoe lager het aantal cycli voordat een f luorescent signaal wordt waargenomen, des te meer doel -DNA er aanwezig was in het uitgangsmateriaal. De cyclus waarin het signaal boven de grenswaarde uitkomt wordt aangegeven met de Ct-waarde. De fluorescentie probe heeft aan beide kanten een fluorescent eiwit. Daarbij onderdrukt de Quencher het fluorescentie signaal van de Reporter in zijn nabijheid aan de andere kant van de probe. Als de probe na hechting aan het DNA wordt afgebroken door het Taq polymerase raakt de Quencher verwijderd van de Reporter en wordt dit signaal niet langer onderdrukt. Het signaal van de Reporter wordt waargenomen nadat een specifiek stuk DNA is gerepliceerd.
Sensitiviteit De techniek vereist dat eerst DNA wordt geïsoleerd uit het monster, in dit geval het melkmonster. Hoewel melk niet steriel afgenomen kan worden is netheid bij de monstername zeer belangrijk. Juist omdat de techniek erg gevoelig is worden enkele bacteriën al gedetecteerd. Het semi-kwantitatieve karakter van de test kan de aanwezigheid van zeer kleine aantallen bacteriën aantonen , wat juist bij melkmonsters van subklinisch geïnfecteerde kwartieren van belang is. Deze sensitiviteit kan bij onhygiënisch bemonsteren tot verkeerde conclusies leiden. Voor alle targets uit de qPCR test is gekozen voor een afkapwaarde van Ct 37. De gevoeligheid van de test voor het betalactamase gen is wat lager dan die van de identificatie van de bacteriën, doordat het gen voor betalactamseproduktie in het algemeen als enkelvoudige kopie aanwezig is. Snelheid Een belangrijk voordeel van de qPCR test is dat de uitslag dezelfde dag gegeven kan worden. Na de start van de test is na 4 uur een uitslag beschikbaar. Deze snelheid is met de huidige bacteriologische kweektechnieken niet te behalen.
dubbel strengs DNA
T≈95°C enkel strengs DNA
T≈55°C primers hechten
T≈72°C kopiëren door Taq polymerase
etc.
Figuur 1. Schematische weergave van de vermenigvuldiging van het doel DNA met primers en een temperatuur cyclus. reporter fluorescentie onderdrukt door Quencher
hν enkel strengs DNA
primer
probe
hechten van primers en probe
reporter fluorescentie onderdrukt door Quencher
hν
hν
fluorescentie wordt waargenomen
kopiëren DNA en lysis probe door Taq Polymerase Taq
Figuur 2. Schematische weergave van de werking van primers en Taqman probes, met het ontstaan van fluorescentie tijdens de cycli.
Pathoproof qPCR voor mastitis Deze test was in eerste instantie op de markt als een test voor 12 “targets” of doelen van DNA binding: S. aureus, Staphylococcus spp. (inclusief CNS), S. agalactiae, S. dysgalactiae, S. uberis, E. coli, Enterococcus spp. Klebsiella, Serratia marcescens, Corynebacterium bovis, Arcanobacterium pyogenes/ Peptococcus indolicus (= wrangbacteriën) en het Staphylococcus betalactamase gen (voor penicilline resistentie). Sinds kort is er een 16-target test op de markt die ook Mycoplasma bovis, Mycoplasma spp., gisten en prototheca kan detecteren. De meeste uitslagen van klinische en subklinische monsters zijn positief voor de “major” mastitis pathogenen: stafylokokken, streptokokken, E. coli en soms Klebsiella. Daarnaast worden ook regelmatig C. bovis, wrangbacteriën, enterokokken en het betalactamase gen waargenomen. Het belang van geringe aantallen C. bovis en enterokokken in melkmonsters is nog onduidelijk, het is tot nu toe geen reden geweest om een therapie in te stellen. Mycoplasmata zijn nog niet
Tijdschrift voor Diergeneeskunde | nr 6 | juni 2013
29
Tabel 1. Overzicht van de data verzameling van subklinische monsters vanuit de MPR melkstroom op 4 melkvee bedrijven. Bedrijf A Type melkstal
Bedrijf B
Bedrijf C
Bedrijf D
Melkput
Melkput
Robot
Robot
Gem. aantal koeien
72
80
88
60
Aantal koeien in studie
87
111
117
68
MPR uitslagen
574
1272
438
166
Aantal 4-6 wks MPR’s
8
16
4
3
SCC > 150 vaarzen
46
30
34
8
SCC > 200 koeien
147
266
70
15
Aantal qPCR testen
123
242
38
18
Aantal koeien qPCR getest
53
73
32
16
Tabel 2. Overzicht van uitkomsten van de qPCR diagnostiek van de klinische monsters op 4 melkveebedrijven. Diagnose
Bedrijf A
Bedrijf B
Bedrijf C
Bedrijf D
25
43
1
Aantal testen
28 n
%
n
%
n
%
Stafylokokken
11
39%
6
24%
33
77%
Betalactamase positief
1
4%
-
-
13
30%
S. aureus
-
-
-
-
1
2%
Corynebact. bovis
8
29%
-
-
1
2% 2%
Klebsiella
-
-
-
-
1
E. coli
3
11%
7
28%
2
5%
S. uberis
6
21%
9
36%
4
9%
S. dysgalactiae
15
54%
5
20%
-
-
S. agalactiae
2
7%
-
-
-
-
Pept. indol/ Pyogenes
4
14%
1
4%
1
2%
Enterokokken
4
14%
-
-
1
Gem. diagnose. / test*
1.9
1.1
n
%
1
100%
2% 2.3*
1.0
wetenschap
* Het gemiddelde aantal diagnoses per test zonder de uitslagen betalactamase positief en S. aureus positief, omdat deze dubbeltellingen geven met de diagnose CNS. Vermelden in de tekst
gevonden in de melkmonsters en niet alle gisten blijken te leiden tot een positieve uitslag. Opmerkelijk zijn wel enkele negatieve qPCR uitkomsten van monsters waaruit bij bacteriologisch onderzoek streptokokken werden gekweekt.
prevalentie van mastitis verwekkers bij subklinische infecties in vergelijking met klinische infecties binnen een bedrijf en tussen deze bedrijven. Als afkapwaarde voor deze data is de 37e cyclus van de PCR genomen. Dit betekent dat hogere Ct-waarden als negatief beoordeeld zijn.
Praktijkonderzoek
Resultaten praktijkonderzoek
Bij het praktijkonderzoek werden van vier melkveebedrijven zowel melkmonsters van klinische mastitis, als monsters van subklinische mastitis, onderzocht met de qPCR. Van deze bedrijven melken twee bedrijven in een melkput en twee met een robot. Klinische mastitis monsters werden op initiatief van de melkveehouders ingezonden voor onderzoek. De monsters voor onderzoek op subklinische mastitis werden verzameld door van elk dier een monster te nemen van de MPR (melk productie registratie) melkstroom. Dit monster werd ingevroren en bewaard voor onderzoek. Aan de hand van de MPR uitslagen werden de ingevroren monsters van koeien met een SSC > 200 en vaarzen met een SCC > 150 later onderzocht met de qPCR test. In dit onderzoek is vooral gekeken naar de uitkomsten van de klinische monsters en de MPR monsters, binnen de bedrijven en tussen de bedrijven. Hiermee wordt een inzicht gekregen van de
In tabel 1. Is een overzicht gegeven van de monsteraantallen per bedrijf.
30 Tijdschrift voor Diergeneeskunde | nr 6 | juni 2013
Klinische monsters De resultaten van de klinische mastitis monsters van de 4 bedrijven laten een heel verschillend beeld zien van de prevalentie van de verschillende bacteriële infecties (zie Tabel 2). Allereerst is het duidelijk dat in veel klinische monsters meerdere kiemen worden aangetroffen. Op bedrijf C worden gemiddeld 2,3 verwekkers per melkmonster aangetoond. Bij de klinische monsters is er vaak wel een dominante veroorzaker, wat afgelezen kan worden uit de Ct-waarden, maar dit is niet altijd het geval. Op bedrijf A komt in meer dan de helft van de monsters een S. dysgalactiae naar voren, daarnaast worden bijna alle mogelijke diagnoses aangetroffen, behalve S. aureus en Klebsiella. Op bedrijf B worden voornamelijk S. uberis, E. coli,
Voor de praktijk stafylokokken en S. dysgalactiae aangetroffen. Ook hier geen S. aureus, C. bovis en geen betalactamase positieve stafylokokken. Op bedrijf C worden vooral stafylokokken aangetroffen in de klinische monsters die vaak, met name in vergelijking met de andere bedrijven, betalactamase positief zijn. Opmerkelijk genoeg worden hier weinig streptokokken en al helemaal geen S. dysgalactiae in de klinische mastitismonsters aangetoond. Bedrijf D heeft, in de periode van ongeveer 1 jaar, slechts één keer een klinisch monster ingezonden, waarin E. coli werd aangetoond.
MPR monsters; subklinische mastitis Op alle bedrijven worden in 60- 80% van de monsters van hoog celgetal koeien en vaarzen stafylokokken aangetroffen (zie Tabel 3). Ook hier wordt meestal meer dan één verwekker aangetroffen. Bedrijf A heeft in de subklinische monsters 2 - 3 keer zoveel S. dysgalactiae diagnoses ten opzichte van de andere bedrijven, echter het laagste percentage betalactamase positieve stafylokokken. Bedrijf B heeft een hoger percentage betalactamase positieve stafylokokken, het hoogste percentage Peptococcus indolicus / pyogenes infecties, echter hier worden geen S. aureus infecties aangetroffen. Daarnaast heeft bedrijf B ook het hoogste percentage van de ‘minor pathogen’ C. bovis. Bij bedrijf C worden vooral stafylokokken gevonden, die in 11% van de gevallen betalactamase positief zijn. Er worden
Tabel 3. Overzicht van de qPCR resultaten weergegeven als % diagnoses per 100 qPCR testen op MPR monsters op vier melkveebedrijven . Diagnose*
Bedrijf A (n=…)
Bedrijf B (n=…)
Bedrijf C (n=…..)
Bedrijf D (n=…)
Stafylokokken
61%*
79%
74%
78%
Betalactamase pos.
4%
8%
11%
6%
S. aureus
9%
-
5%
-
Corynebact. bovis
19%
27%
-
-
Klebsiella
1%
-
-
-
E. coli
3%
1%
-
6%
1%
9%
-
11%
42%
9%
5%
17%
S. uberis S. dysgalactiae S. agalactiae
-
-
-
-
Pept. indol / Pyogenes
8%
12%
11%
6%
Enterokokken
15%
3%
5%
67%
1.7
1.5
1.1
1.9
Gem. Diagnoses / test
*diagnoses per 100 qPCR testen
echter opvallend weinig streptokokken aangetroffen; slechts 5% S. dysgalactiae en geen S. uberis. Bij bedrijf D worden in 67% van de monsters enterokokken aangetroffen. Omdat deze diagnose nooit werd vastgesteld in de klinische monsters, gaat het vermoedelijk1 om een contaminatie vanuit de machine die de monsters voor de MPR verzamelt vanuit de robot.
Klinische - versus subklinische infecties binnen een bedrijf Bij het vergelijken van de prevalenties van bacteriële uierpathogenen binnen een bedrijf, tussen de klinische monsters en de MPR monsters, valt bij bedrijf A op dat de prevalenties van de verwekkers sterk overeen komen tussen de beide monsterstromen (zie Figuur 1). Het meest in het oog springende verschil wordt gevonden in het percentage stafylokokken, dat lager is bij de klinische monsters. Het, in vergelijking met de andere bedrijven, hoge percentage S. dysgalactiae en S. uberis wordt zowel in de klinische als subklinische monsters gevonden. Bij bedrijf B is de situatie anders dan bedrijf A; hier is de prevalentie van E. coli, S. uberis en S. dysgalactiae hoger bij de klinische dan bij de subklinische monsters. De prevalentie stafylokokkeninfecties is ook hier lager bij de klinische monsters. C. bovis infecties zijn hier niet aangetroffen bij de klinische monsters. Bij bedrijf C is te zien dat de klinische en MPR monsters weer opmerkelijk goed overeen komen. Op dit bedrijf is de prevalentie van het betalactamase gen bij de klinische monsters hoger dan bij de MPR monsters. De vergelijking laat zien dat het aantal streptokokken infecties op dit bedrijf, in het algemeen, zeer laag is. Tenslotte de uitzonderlijke uitslag van bedrijf D, waarvoor slechts één klinisch monster werd ingezonden. Omdat het hier om een bedrijf gaat met een uitmuntende uiergezondheid (tankcelgetal tussen de 50 en 100) en het aantal gebruikte injectoren bekend is, is betrouwbaar aan te geven dat hier verder geen klinische mastitis gevallen zijn geweest. Het is interessant om waar te nemen dat er wel enkele subklinische infecties zijn, zowel van betalactamase nega-
Dit vermoeden leek te worden bevestigd nadat de wijze van bemonstering enigszins was gewijzigd. Na het verwijderen van een slang uit het monstername apparaat werden bijna geen enterokokken meer gevonden.
1
Tijdschrift voor Diergeneeskunde | nr 6 | juni 2013
31
1 0,8 0,6 0,4 0,2 0
Bedrijf A Klinische monsters Bedrijf A MPR monsters
Bedrijf B Klinische monsters Bedrijf B MPR monsters
en os us vis p kk lla li re ko ase e bo sie . co eris o au e l ia s . y m ia C. leb E f n S ct a ub a ne ct t a t . l K ke c S la la S a ge a g o ok a g s y k t a y ro d l/p Be S. te S. do En .t in p Pe
en os us is i p a kk ol re ov ell is e ko ase e o ia au C. b bsi E. c ber l ia . es y n ct m f e S u l ct a a la . en ke t a t K l a S c S la a g og ok g s y k a o ta dy l/p S. er Be S. do Ent n i . pt Pe
Figuur 3. Grafische weergave van de vergelijking van de uitkomsten van de qPCR testen van klinische en MPR melkmonsters binnen Bedrijf A.
Figuur 4. Grafische weergave van de vergelijking van de uitkomsten van de qPCR testen van klinische en MPR melkmonsters binnen bedrijf B.
tieve stafylokokken als van S. uberis en S. dysgalactiae. De hoge aantallen enterokokken moeten waarschijnlijk als een artefact in de monstername gezien worden (zie eerdere voetnoot6)
wetenschap
1 0,8 0,6 0,4 0,2 0
Beperkingen QPCR Onder de huidige omstandigheden is het belangrijk dat de antibioticumgevoeligheid van een infectieus agens bekend is alvorens een behandeling wordt ingezet. Daarom wordt de Pathoproof mastitis qPCR ingezet naast Bacteriologische Onderzoek (BO). De qPCR test geeft immers alleen informatie over de penicilline gevoeligheid van stafylokokken op basis van de aan- of afwezigheid van het betalactamase gen. Op basis van deze informatie kan, in het algemeen, geen adequate therapiekeuze gemaakt worden. Met name bij Coagulase Negatieve Stafylokokken (CNS) (stafylokokken met uitzondering van S. aureus) blijkt regelmatig dat de betalactamase positieve CNS in het antibiogram (ABG) ook resistent zijn voor oxacilline. Deze CNS-en, die soms tevens voor andere antibiotica resistent blijken, zijn vaak erg moeilijk te genezen. Dit leidt in de praktijk vaak tot het advies van droogzetten of afvoeren, afhankelijk van het celgetalverloop en het aantal aangetaste kwartieren. Voor en tegens van de qPCR. Een belangrijk voordeel van de qPCR is de mogelijkheid om tijdens en na een therapie te onderzoeken wat het agens is, waar veehouders dankbaar gebruik van maken. De qPCR zorgt er voor dat het BO onderzoek sneller en efficiënter uitgevoerd kan worden omdat uitgebreide biochemische testen niet nodig zijn om de identiteit van een bacterie te bepalen, de qPCR geeft reeds het antwoord.
32 Tijdschrift voor Diergeneeskunde | nr 6 | juni 2013
Daarnaast maakt de qPCR het BO onderzoek ook sensitiever, een tweede of derde pathogeen in de qPCR uitslag maakt dat deze ook eerder gevonden wordt in het BO onderzoek. Dit is nuttig omdat ook hiervan een ABG gemaakt moet worden om een therapie succesvol te laten verlopen. Anderzijds is het BO sensitiever om bijvoorbeeld een infectie met verschillende CNS in één kwartier vast te stellen. De qPCR kan immers geen bacteriën aantonen, waarvoor het geen primers en probes bevat, dit in tegenstelling tot het BO, dat in principe alles laat zien wat er groeit. De specificiteit van de qPCR heeft dan ook een keerzijde; soms is de PCR negatief terwijl er streptokokken bij BO worden aangetoond. Dit zijn dan geen S. uberis, S. dysgalactiae of S. agalactiae, maar deze aangetoonde streptokokken zorgden in de praktijk toch voor vervelende infecties, die behandeld moesten worden. Aan de hand van een ABG kan dit adequaat plaatsvinden. Zo kunnen ook met enige regelmaat enterobacteriaceae, anders dan E. coli of Klebsiella, met BO worden aangetoond. Vervolgens kan een ABG worden ingezet, zodat een passend advies gegeven kan worden voor behandeling en eventuele opvolging van de infectie. In alle gevallen, dus ook als de qPCR negatief is, is er ook BO ingezet. Ook na behandeling wordt behalve qPCR meestal ook een BO ingezet. Dit levert leerzame ervaringen op zoals bijvoorbeeld in het geval van behandelde Gram-negatieve infecties die volop groeien bij BO, en in het ABG een ‘intermediate gevoelig’ resultaat opleveren voor het bij de therapie gebruikte antibioticum. Het inzetten van zowel qPCR als BO en ABG lijkt overbodig, maar in dit onderzoek versterkten en verbeterden de analyses elkaar. De combinatie van de gevoeligheid en snelheid van de qPCR, de robuustheid en betrouwbaarheid van BO en de
Voor de praktijk
Bedrijf C Klinische monsters 1 Bedrijf C MPR monsters 0,8 0,6 0,4 0,2 0
1 0,8 0,6 0,4 0,2 0
Bedrijf D Klinische monsters Bedrijf D MPR monsters
en os us vis p kk lla li re ko ase e bo sie . co eris o au e l ia s . y m ia C. leb E f n S ct a ub a ne ct t a t . l K ke c S la la S a ge a g o ok a g s y k t a y ro d l/p Be S. te S. do En .t in p Pe
en os a us is p kk re ov iell coli ris ko ase e e o au C. b bs l s tia . ia be y E. m le S ne en ct af ac .u ta l K t a l S c a ge kk S la a g o g s y ko a a y t p o r d l/ S. Be te S. do En . in t p Pe
Figuur 5. Grafische weergave van de vergelijking van de uitkomsten van qPCR testen van klinische en MPR melkmonsters binnen bedrijf C.
Figuur 6. Grafische weergave van de vergelijking van de uitkomsten van de qPCR testen van klinische en MPR melkmonster binnen bedrijf D.
onmisbare informatie van het ABG zorgen voor een goed onderbouwde therapiekeuze. Al deze diagnostiek werpt natuurlijk ook de vraag op ‘wanneer is het genoeg?’ om een goed historisch beeld te hebben van een bedrijf. We hopen deze vraag in de toekomst te kunnen beantwoorden. Wellicht kan dit gekoppeld worden aan een monitoring van de resultaten van de ingezette therapieën, zodat er een indruk is van de effectiviteit en afwijkingen tijdig gesignaleerd kunnen worden.
QPCR koppeldiagnostiek en droogzetbehandeling Het praktijkonderzoek heeft aangetoond dat het screenen zowel voor de behandelend dierenarts, als voor de veehouder, relevante informatie oplevert. De prevalenties van subklinische infecties blijken zeer verschillend per bedrijf en er lijkt een relatie te zijn met de klinische infecties. Omdat in dit onderzoek koeien meer dan eens onderzocht zijn (zie Tabel 1) is aangetoond dat koeien gedurende de lactatie vaak langdurig met dezelfde soorten bacteriën besmet zijn. Daarom kan een qPCR onderzoek in het laatste maanden van de lactatie, ook belangrijke informatie leveren voor de infectiestatus van de betreffende koe bij droogzetten.
Conclusie De qPCR vormt een waardevolle diagnostische techniek die op een snelle en betrouwbare wijze kan vaststellen of,- en welke infectie zich in de uier van een koe bevindt. Met de qPCR worden vaak meerdere pathogenen in een monster aangetoond, vaker dan bij bacteriekweek het geval is. De qPCR is waardevol om snel en doeltreffend uit te zoeken welke uierpathogenen op het
bedrijf voorkomen, waardoor preventieve en therapeutische maatregelen daar op kunnen worden afgestemd. Daarnaast kan deze techniek op efficiënte wijze vaststellen welke pathogenen een rol spelen voorafgaand aan de droogstandsbehandeling van de individuele koe.
Literatuur suggesties voor verdere verdieping 1. Field comparison of real-time polymerase chain reaction and bacterial culture for identification of bovine mastitis bacteria. Koskinen, M.T., et al., J Dairy Sci., 2010 Dec; 93 (12):5707-15 2. Quality of bulk tank milk samples from Danish dairy herds based on real-time polymerase chain reaction identification of mastitis pathogens. Katholm, J., et all, J. Dairy Sci., 2012 Oct; 95(10):5702-8 3. Mastitis diagnosis in dairy cows using Pathoproof real-time polymerase chain reaction assay in comparison with conventional bacterial culture in a Northern German field study. Spittel, S., et all., Berl Munch Tierarztl Wochenschr. 2012 Nov-Dec; 125 (11-12):494-502 4. Principles and technical aspects of PCR amplification. Pelt-Verkuil, E., Springer Book, ISBN 978-1-4020-6240-7 5. A-Z of Quantitative PCR. Stephen A. Bustin, IUL Biotechnology Series Book, ISBN 978-09636817-8-2
Tijdschrift voor Diergeneeskunde | nr 6 | juni 2013
33
