Harm Janssens
Moleculaire analyses in voedingsmiddelen (DNA,RNA en Peptide) 1 oktober 2013
www.tlr.nl
Moleculaire analyses
2
www.tlr.nl
Moleculaire analyses
3
www.tlr.nl
Voeding en diervoeding Onderzoeksterrein Nutriënten; Mineralen; Zware metalen; Microscopisch onderzoek; Industriële contaminanten; Bestrijdingsmiddelen; Biotoxins; Phyto-toxins; Moleculaire analyses (DNA, RNA en eiwit)
Moleculaire analyses
4
www.tlr.nl
Moleculaire analyse in voedingsmiddelen Detectie van macromoleculaire stoffen als: Eiwitten Toxinen DNA RNA
Waarvoor doen we onderzoek? - zuiverheid grondstoffen/kwaliteit - fraude - voedselveiligheid Moleculaire analyses
5
www.tlr.nl
Moleculaire analyse in voedingsmiddelen Voorbeelden: Bepaling van Bepaling van Bepaling van Bepaling van Bepaling van
allergenen GMO’s dierspecies (paardenvlees) plantspecies bacteriën.
Salmonella, Clostridium botulinum.
Bepaling van virussen Norovirus en Hepatitis A
Moleculaire analyses
6
www.tlr.nl
Moleculaire analyse in voedingsmiddelen Detectietechnieken ELISA (Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay). LC-MS/MS DNA-electroforese, Sequentie analyse, PCR (Polymerase Chain Reaction), Incombinatie met Microroostertechniek (micro-array chip), ELISA
RT-PCR. Moleculaire analyses
7
www.tlr.nl
LC-MS/MS Eiwit onderzoek Molecuul wordt verkleind en specifieke fragmenten worden gemeten. Hiermee kan de eiwitcompositie worden bepaald in een complexe matrix
DNA onderzoek DNA-moleculen wordt geknipt en fragmenten worden geïdentificeerd en gemeten.
Moleculaire analyses
8
www.tlr.nl
PCR (polymerase chain reaction)
Moleculaire analyses
9
www.tlr.nl
Pathogene micro-organismes - Allemaal grensreacties (1 bacterie/25g of 1 bacterie/250 g) - Levende bacteriën in voorophoping.
Enrichment
Moleculaire analyses
Extraction
DNA Identification & Amplification
Detection
10
www.tlr.nl
Salmonella (struggle) Doelstelling 10-15% soyaschroot en raapzaadschroot besmet met salmonella. Vaar tijd lichters (binnenvaartschip) 24-36 uur. Ligdag 400-1000 euro.
2006 -
Salmonella chip voor 30 analyse tegelijk (2-3 dots per analyse) Methode niet gevoelig genoeg (50-65%)
2007 -
Salmonella CHIP aan- of afwezigheid
Salmonella CHIP voor typering
Salmonella chip voor 3 analyse (31 dots per analyse). Analyse vanuit rein kolonie Detectie van meer dan 140 species 24 uurs methode na rein kolonie
Moleculaire analyses
11
www.tlr.nl
Detectie met micro array;chip
Moleculaire analyses
12
www.tlr.nl
PCR en micro array;chip Salmonella-array Bacillus array (100 sporen/gram) B. subtilis, B. cereus, Geobacillus, enz.
ESBL bacteriën array
Moleculaire analyses
13
www.tlr.nl
Analyse met RT-PCR Enrichment
Extraction
DNA Identification & Amplification
|
Moleculaire analyses
RT-PCR
Detection
|
14
www.tlr.nl
Real-Time PCR
Moleculaire analyses
15
www.tlr.nl
Real-Time PCR
Moleculaire analyses
16
www.tlr.nl
Ophoping (enrichment) Selectieve ophoping Voldoende DNA voor PCR-analyse Selectiviteit
Afhankelijk van bacterie en matrix Analyse Salmonella EHEC Clostridium Bot.
Moleculaire analyses
Ophoping BPW en BHI BPW TPGY
Matrices Food/Feed Food Food/Feed
17
www.tlr.nl
Salmonella (struggle) 2009
Systeem testen door rondzendmonsters
Geaddeerde monsters werden teruggevonden Analyt-bevattende soyaschroten zeer matig
2010
Salmonella direct uit BPW
PALGENE Systems: BIOCONTROL: BIOTECON:
Moleculaire analyses
Gene disk Salmonella (36 uur/food & feed) , Assurance GDS (36 uur/food & feed), Shortprep2+Foodproof R 300 27 (36 uur/food & feed),
18
www.tlr.nl
Salmonella (struggle) RT-PCR’s direct uit BPW? De Gene disk Salmonella (AFNOR GEN 25/05-11/08) gaf goede resultaten met levensmiddelen, maar kon slechts ca 50% van de Salmonella positieve monsters terugvinden in diervoeders (sojaschroot en raapzaad) t.o.v. de ISO 6579 en de OXOID Rapid test. - Meetmethode ongeschikt voor diervoeders - AFNOR werkt met geaddeerde monsters (petfood is geen diervoeder) -
Geen simulatie van de praktijk
- Aantal Labs hebben een erkenning van deze methode in diervoeder. Moleculaire analyses
19
www.tlr.nl
Salmonella (struggle) RT-PCR’s direct uit BPW? TLR heeft BIOTECON PCR gebruikt om rechtstreeks uit BPW, maar het lukte alleen om voldoende cellen te krijgen m.b.v. toevoegen BHI (concentratie Salmonella). - Door tweede ophoping een bewerkelijk, - Geen AFNOR; Dure en intensieve validatie, - Tijdswinst beperkt.
Moleculaire analyses
20
www.tlr.nl
Salmonella BIOCONTROL: Assurance GDS met IMS en BHI ophoping (IMS = Immuno Magnetische Seperatie) Buffered Peptone Water (18 - 24 hrs) PickPen IMS sample to BHI (2-4 hrs) extra groei Salmonella Amplification & Detection (75 minutes) -
Methode is vergelijkbaar met NEN-EN-ISO 6579 -
Ook bij natuurlijke besmette soyaschroot en raapschroot
- AFNOR- certificaat
Moleculaire analyses
21
www.tlr.nl
DNA-voedingsmiddelen Sample preparation
Extraction
DNA Identification & Amplification
| Moleculaire analyses
Detection
RT-PCR)
| 22
www.tlr.nl
Belangrijke aandachtpunten Selectiviteit en specificiteit 1% paardenvlees in lasagne met 2% vlees. 5 mg/kg allergeen in voedingsmiddel
Weet wat je meet. Dierlijke DNA hoofdzakelijk in vleesdeel en niet in vetdeel. Wat is aftelpunt
Monsterpreparatie en monstername Cruciaal belang, wat wil je weten. Moleculaire analyses
23
www.tlr.nl
GMO-analyse Detectiegrens (<0,1%) 1 op 1000 zaadjes moet worden aangetoond.
Biologische producten screening. GMO uitdrukken in % van DNA % GMO-soya in soya
Mogelijke bijmenging Voorgaande lading Overslag Moleculaire analyses
24
www.tlr.nl
Detectie van GMO’s Screening DNA sequentie welke veelvuldig bij GMO’s worden toegepast. Gevonden sequentie en CP’s geeft indicatie van welke events er inzitten. Als screening niet kan worden verklaard Niet toegelaten events (LL601,BT63,--) Bijmenging (voorgaande lading???) Event-analyse Specifiek DNA analyse van welk gen erin gezet. Meerdere events mogelijke (stack events)
Moleculaire analyses
25
www.tlr.nl
GMO-analyse Screening (wel of geen manipulatie)
Inserted DNA = construct
Inserted DNA = construct plant DNA
Screening
promotor
GEN
terminator
promotor
GEN
terminator
plant DNA
Analyse van gemeenschappelijke stukjes DNA (promotor, terminators. ..)
Moleculaire analyses
26
www.tlr.nl
GMO-analyse Event analyse (welk gen zit erin?)
Inserted DNA = construct
plant DNA
promotor
GENE
terminator
Inserted DNA = construct promot or
GENE
terminator
plant DNA
Event analys e Analyse van stukje gen meestal 80-120 basenparen Stacke d event Meerdere contructs in DNA
Moleculaire analyses
27
www.tlr.nl
Screening GMO’s - 35S-promotor (cauliflower mosaic virus promotor) - NOS-terminator (Nopalin Synthase Terminator (NOS) van Agrobacterium tumefaciens) - FMV promotor ( Figwort mosaic virus promoter) - BAR (gen van Streptomyces hygroscopicus) - CTP2:CTP4 EPSPS (gen van Arabidopsis thaliana en Agrobacterium spp) - PAT-gen (geïsoleerd uit grondbacteriën) CaMV (bepaling van cauliflower mosaic virus)
Moleculaire analyses
28
www.tlr.nl
Event
Unique Identifier (first event mentioned)
Plant
Authorisa tion EU
P35S
356043
DP-356Ø43-5
soybean
x2
+
ACS-GMØØ5-3 soybean
x1
+
-
A2704-21, A5547-35 ACS-GMØØ5-3 soybean A5547-127 (LibertyLink) ACS-GMØØ6-4 soybean
-
+
x2
soybean
G94-1, G94-19, G168 DD-Ø26ØØ5-3 soybean GTS 40-3-2 (Roundup Ready) MON-Ø4Ø32-6 soybean
CTP2CP4EPSP S
FMV
bar
PAT
-
-
-
-
-
-
+
-
-
-
+
+
-
-
-
+
-
-
+
-
-
-
-
+
+
-
-
-
x1
+
+
-
-
-
GU262 (LibertyLink) ACS-GMØØ3-1 soybean
-
+
-
-
-
+
MON87705 MON-877Ø5-6 soybean MON89788 (Roundup Ready 2 Yield) MON-89788-1 soybean W62, W98 (Liberty Link) ACS-GMØØ1-8 soybean
x2
-
-
+
-
-
x1
-
-
+
-
-
-
+
+
-
+
-
A2704-12
FG72
Moleculaire analyses
MST-FGØ72-2
T-nos
-
-
+
29
www.tlr.nl
Screening GMO’s De verhouding tussen CPs (crossing points) geeft een indicatie of er meerdere events aanwezig. De CP (crossing point) geeft een indicatie van concentratie.
Moleculaire analyses
30
www.tlr.nl
Events-Analyse Specifieke analyse van een event ofwel verandering van DNA ter plaatse Concentratie in % van totaal DNA van product (soja, mais, enz) LOQ <0,1% (detectiegrens) Stack-events worden alle events aangetoond Events van stack GMO hebben ongeveer hetzelfde percentage. Totaal GMO kan boven 100% uitkomen.
Moleculaire analyses
31
www.tlr.nl
Monster en preparatie Monstername Hot spots/inhomogene verdeling Bijmenging
Monstergrootte <0,1% minimaal 3.000 zaden <0,01% minimaal 30.000 zaden
Bijmenging 0,1% soja 100% GMO
Moleculaire analyses
32
www.tlr.nl
Recente ontwikkelingen GMO Methoden omgezet naar 5-nuclease Uniforme detectie, 4 signalen tegelijk te meten, Meerdere methode in één sequence.
DNA-extractie gerobotiseerd Snellere analyse en grotere doorzet Reproduceerbaardere analyses
Moleculaire analyses
33
www.tlr.nl
Ontwikkelingen in GMO-analyse Komen steeds meer toelatingen - Uitbreiding van screening, - Uitbreiding van events. Tijd voor een andere aanpak???.
Moleculaire analyses
34
www.tlr.nl
Bedankt voor de aandacht U kunt meer van ons zien op: 6 oktober 12:30 uur en 12 oktober 14:00 uur op RTL 7 “ Puur en innovatief “
Moleculaire analyses
35
www.tlr.nl
