Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav technologie potravin

Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav technologie potravin

Nové metody detekce patogenů v potravinách Bakalářská práce

Vedoucí práce: MVDr. Olga Cwiková

Vypracovala: Radka Smetanová Brno 2008

PROHLÁŠENÍ

Prohlašuji, že jsem bakalářskou práci na téma Nové metody detekce patogenů v potravinách vypracovala samostatně a použila jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém seznamu literatury. Bakalářská práce je školním dílem a může být použita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího diplomové práce a děkana AF MZLU v Brně.

dne……………………………………… podpis bakaláře………………………

PODĚKOVÁNÍ Ráda bych poděkovala MVDr. Olze Cwikové za odborné vedení při zpracování této bakalářské práce, za ochotu, cenné informace a rady, které mi po celou dobu poskytovala.

ABSTRAKT Bakalářská práce se zabývá přehledem patogenních mikroorganismů, jejich charakteristikou a metodami jejich detekce v potravinách. V předložené práci jsou charakterizovány zdroje mikrobiální kontaminace potravin, rozdělení onemocnění z potravin podle mechanismů, které je vyvolaly. U patogenních bakterií je popsána jejich biologie, patogeneze, patogenita a epidemiologie. Práce především pojednává o konkrétní metodách detekce patogenních mikroorganismů, zaměřuje se zejména na nejnovější rychlé metody. Jsou to zvláště metody založené na polymerázové řetězové reakci, imunochemické metody a metody využívající živná média. V práci jsou také popsány metody detekující bakteriální toxiny v potravinách.

Klíčová slova: patogenní mikroorganismy, potraviny, detekce, metody.

ABSTRACT Bachelor work deals with summary of pathogenic microorganisms, their characteristic and methods of their detection in food. In submitted work are charactecterized sources of microbial contamination, illneses from food divided according to mechanism that can cause them. There are described the basic information about

biology,

pathogensis,

pathogenity

and

epidemiology

of

pathogenic

microorganisms. The work further deals with particular methods of detection of pathogenic microorganisms, it directs especially on the newest rapid methods. It includes mainly methods misplaced on polymerase chain reaction, imunochemical methods and methods using culture medium. There are also methods of detection of bacterial toxins in food.

Key words: pathogenic microorganisms, food, detection, methods.

OBSAH: 1. ÚVOD........................................................................................................................... 7 2. CÍL PRÁCE .................................................................................................................. 8 3. LITERÁRNÍ PŘEHLED .............................................................................................. 9 3.1 Mikroorganismy...................................................................................................... 9 3.2 Mikrobiální kontaminace potravin.......................................................................... 9 3.3 Zdroje mikrobiální kontaminace potravin ............................................................ 10 3.4 Původci alimentárních onemocnění...................................................................... 11 3.4.1 Patogenní a podmíněně patogenní mikroorganismy...................................... 11 3.4.1.1 Rod Pseudomonas................................................................................. 12 3.4.1.2 Salmonella spp...................................................................................... 12 3.4.1.3 Escherichia coli .................................................................................... 13 3.4.1.4 Yersinia enterocolitica.......................................................................... 14 3.4.1.5 Campylobacter jejuni............................................................................ 15 3.4.1.6 Listeria monocytogenes ........................................................................ 16 3.4.1.7 Clostridium perfringens........................................................................ 17 3.4.1.8 Clostridium botulinum .......................................................................... 18 3.4.1.9 Bacillus cereus ...................................................................................... 19 3.4.1.10 Staphylococcus aureus.......................................................................... 20 3.4.1.11 Shigella spp........................................................................................... 20 3.4.1.12 Vibrio parahemolyticus......................................................................... 21 3.4.1.13 Enterobacter sakazakii ......................................................................... 22 4. METODY DETEKCE PATOGENNÍCH MIKROORGANISMŮ V POTRAVINÁCH..................................................................................................... 22 4.1 Metody detekce mikroorganismů ......................................................................... 24 4.1.1 Klasické kultivační metody ........................................................................... 24 4.2.2 Rychlé metody ............................................................................................... 24 4.2.1.1 Polymerázová řetězová reakce (PCR) .................................................. 25 4.2.1.2 Hybridizace – využití sond.................................................................... 29 4.2.1.3 RFLP (restriction fragment length polymorphism) .............................. 29 4.2.1.4 MLEE (Multi-locus enzyme electrophoresis) ....................................... 30 4.2.1.5 Impedanční (vodivostní) mikrobiologie ................................................ 31 4.2.1.6 Imunologické metody ............................................................................ 31 4.2.1.7 Průtoková cytometrie............................................................................ 35 4.2.1.8 Hygicult................................................................................................. 36 4.2.1.9 Petrifilm ................................................................................................ 37 4.2.1.10 Chromogenní a fluorogenní živné půdy................................................ 37 4.2.1.11 Imunomagnetická separace (IMS) ........................................................ 40 4.2.1.12 Vysokoúčinná kapalinová chromatografie (HPLC – High performance liquid chromatography) ....................................................................... 40 4.2.1.13 Reverzní pasivní latexová aglutinace (RPLA) ...................................... 41 5. ZÁVĚR ....................................................................................................................... 42 6. SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY ........................................................................ 43

1. ÚVOD Schopnost mikroba vyvolat v organismu hostitele patologický stav, tj. určité morfologické nebo fyziologické změny, se nazývá patogenita. Po proniknutí do organismu hostitele se bakterie pomnoží, potlačuje obranné schopnosti hostitele a daným způsobem ho poškodí (Komprda, 2000). Je tedy velmi důležité zamezit výskytu

patogenních

mikroorganismů

v potravinách.

Jestliže

jsou

už

tyto

mikroorganismy v potravinách obsaženy, měli bychom být schopni je detekovat a zabránit tak zkonzumování potraviny a tedy i výskytu alimentárních onemocnění. Výskyt potenciálně patogenních mikroorganismů v prostředí a schopnost některých přežívat v nepříznivých podmínkách představují vážnost potenciálního nebezpečí. Řada patogenních mikroorganismů se vyskytuje v zažívacím traktu zvířat a lidí a jsou nepravidelně vylučovány do prostředí. Přežívají na rostlinách, v prachu a ve výkalech zvířat. Také povrchová voda a voda říční může být kontaminována. Z toho je zřejmé, jak obtížné je zabránit proniknutí patogenních mikroorganismů do potravin. Z potravin jsou nejčastěji příčinou onemocnění drůbež, vejce, maso a masné výrobky a jen ve velmi malém procentu mléko a mléčné výrobky (Lukášová, 2004). Patogenní mikroorganismy mohou být v potravině přítomny ve velmi malých množstvích, a proto může být těžké detekovat je mezi vnitřní mikroflórou často obsaženou v potravinách. Potraviny obsahují různé složky, které mohou interferovat s detekcí mikroorganismů a tím ji znesnadňovat nebo i znemožňovat. Je tedy potřebné stále zdokonalovat staré a vyvíjet nové rychlé techniky k identifikaci mikrobiálních patogenů a jejich množství v potravinách (Hill a Jinneman, 2000). Zatímco původní metody trvaly několik dnů, novými metodami lze získat výsledky během několika hodin.

7

2. CÍL PRÁCE Cílem předložené bakalářské práce bylo prostudovat doporučenou literaturu a zpracovat ji formou literární rešerše a sestavit přehled nových metod využívaných k detekci patogenních mikroorganismů v potravinách.

8

3. LITERÁRNÍ PŘEHLED 3.1 Mikroorganismy Jako mikroorganismy označujeme jednobuněčné nebo vícebuněčné organismy, které nejsou schopny tvořit funkčně diferenciované tkáně nebo pletiva. Společným znakem mikroorganismů jsou velmi malé rozměry jejich těl – od několika desetin µm do několika desetin mm – podle toho byly také nazvány (mikros znamená řecky malý). V systematice organismů jsou mikroorganismy označovány jako Protista; dělí se na Prokaryota, jež nemají diferenciované jádro, a mikrobiální Eukaryota, tj. organismy s pravým jádrem odděleným od cytoplazmy jaderným obalem. Prokaryota se dělí na cyanobakterie (dříve zvané sinice), které se pro fototrofní charakter nazývají také „modrozelené řasy“, a na bakterie. Vyšší Eukaryota zahrnují všechny rostliny i živočichy. Mezi mikrobiální Eukaryota patří řasy (Algae), které zkoumá algologie, houby (Fungi) a protozoa (Šilhánková, 2002).

3.2 Mikrobiální kontaminace potravin Mikroorganismy asociované s potravinami je možno v prvním přiblížení zjednodušeně rozdělit do dvou skupin: -

mikroorganismy způsobující kažení potravin;

-

mikroorganismy vyvolávající alimentární onemocnění (Komprda, 2000).

Podle

charakteru

mikroorganismu

vyvolávajícího

onemocnění,

podle

mechanismu jeho choroboplodného účinku a podle jím způsobeného onemocnění můžeme rozdělit, avšak ne celkem jednoznačně, onemocnění mikrobiálního původu na: -

otravy potravinami (alimentární toxikoinfekce a alimentární intoxikace nebo enterotoxikózy),

-

nákazy způsobené potravinami (alimentární infekce),

-

ostatní onemocnění, jejichž původci jsou přenášeni potravinami a pitnou vodou.

Rozdělení otrav mikrobiálního původu způsobených potravinami na alimentární toxikoinfekce a alimentární intoxikace nebo enterotoxikózy je založené na skutečnosti,

9

zda příslušný choroboplodný mikroorganismus pro vyvolání nemoci svými toxiny musí nebo nemusí vniknout do organismu člověka. Při toxikoinfekci musí toxinogenní mikrob vniknout do organismu, v našem případě s potravinou a v trávicím a zažívacím traktu se z něho po rozpadu buněk uvolní už při rozmnožování v potravině vytvořené endotoxiny. Pojem intoxikace znamená otravu organismu bez rozdílu původu toxické látky. V našem případě myslíme na otravu způsobenou mikrobiálními exotoxiny vytvořenými už v potravině, přičemž přítomnost příslušného choroboplodného mikroba v organismu člověka není podmínkou (Görner, Valík, 2004).

3.3 Zdroje mikrobiální kontaminace potravin Potraviny

mohou

být

kontaminovány

mikroorganismy

primárně

nebo

sekundárně. Primární kontaminace potravin saprofytickými a choroboplodnými mikroorganismy se uskutečňuje v době před jejich dodáním do potravinářského nebo kulinářského závodu. U mléka je to při jeho dojení, případně ve vemeni, přítomnými choroboplodnými bakteriemi a z nádob, potrubí a ploch, se kterými přichází do styku při jeho prvním ošetření v zemědělském závodě. U masa už před porážkou nemocných zvířat intravitálně nebo u zdravých zvířat po jejich porážce. Rostlinné potraviny jsou primárně kontaminované už před sklizením úrody a také během ní mikroorganismy z půdy a z prachu nebo zaléváním kontaminovanou vodou (říční nebo odpadní). Půda je především

zdrojem

kontaminace

potravin

saprofytickými,

choroboplodnými

a toxinogenními bakteriemi rodu Bacillus, Clostridium a plísněmi (mykotoxiny). Kontaminované vody jsou zdrojem zejména choroboplodných bakterií (salmonely a jiné). Sekundární kontaminace potravin zejména saprofytickými mikroorganismy se většinou uskutečňuje při jejich opracování, zpracování a finalizací stykem s nedostatečně čištěným a dekontaminovaným nářadím a zařízením. Významnou úlohu mají přitom i nemocní lidé a bacilonosiči, jestliže jsou i přes zdravotní předpisy zaměstnání v potravinářských a kulinářských závodech. Ti mohou kontaminovat potraviny přímo nebo nepřímo mikroorganismy z fekálií, vlasů, hnisavých ran, sliznic atd. K sekundární kontaminaci řadíme i množení kontaminujících saprofytických nebo choroboplodných mikroorganismů v polotovarech a v hotových produktech při jejich nevhodném skladování (pro mikroorganismy vhodná teplota, nepřiměřeně dlouhý čas);

10

zejména tepelně upravené potraviny jsou většinou velmi dobrou živnou půdou pro saprofytické, ale i pro některé choroboplodné mikroorganismy (Görner, Valík, 2004).

3.4 Původci alimentárních onemocnění Původce alimentárních onemocnění lze zařadit do 3 skupin:




První skupina představuje mikroorganismy se stoupajícím významem co do závažnosti onemocnění nebo frekvence výskytu.

Salmonella spp. (zvláště S. enteritidis a S. typhimurium) Campylobacter jejuni Campylobacter coli Clostridium botulinum Listeria monocytogenes Verotoxické Escherichia coli




Do druhé skupiny jsou zařazeny mikroorganismy, které nepředstavují závažné riziko pro konzumenta.

Bacillus spp. Clostridium perfringens Staphylococcus aureus Escherichia coli jiná než VTEC




Třetí skupinu tvoří mikroorganismy, způsobující nevýznamné nebo vzácně se vyskytující infekce.

Aeromonas spp. Vibrio parahemolyticus Yersinia enterocolitica (Cempírková aj., 1997).

3.4.1 Patogenní a podmíněně patogenní mikroorganismy S potravinami jsou nejčastěji asociovány tyto mikroorganismy:

11

3.4.1.1 Rod Pseudomonas Bakterie rodu Pseudomonas jsou gramnegativní tyčinky. Rostou při teplotách 5 – 42 °C a pH 7,0 – 8,5, většinou jsou aerobní (Burdychová, Sládková, 2007). Rod Pseudomonas obsahuje více než 200 druhů, většinou saprofytických, přítomných v půdě, vodě a ve vlhkém prostředí. Některé druhy jsou patogenní pro rostliny, hmyz a zvířata. Pseudomonas aeruginosa je patogenní pro člověka. V některých oblastech světa způsobují infekce člověka také Pseudomonas mallei a Pseudomonas pseudomalei. Určité pseudomonády jsou podmíněně patogenní (Greenwood aj., 1999). Některé druhy pseudomonád způsobují kažení potravin, protože produkují proteázy a lipázy, které rozkládají bílkoviny a tuky. Z velkého množství pseudomonád je nejzávažnějším druhem Pseudomonas aeruginosa (Burdychová, Sládková, 2007). P. aeruginosa se vyskytuje v odpadních vodách, v půdě, ve stolici domácích zvířat i lidí. V čisté vodě se nemnoží (Bednář aj. 1999). Je velmi rezistentní vůči nepříznivým vlivům prostředí a může se rozmnožovat i při nízké teplotě a při minimálním obsahu živin, ale v prostředí s dostatečnou vlhkostí (Görner, Valík, 2004). P. aeruginosa může vyvolat akutní gastroenteritidu nebo enterokolitidu zejména u kojenců a u osob oslabených jiným vyčerpávajícím onemocněním. Enteropatogenní kmeny produkují termolabilní enterotoxin proteinové povahy (Görner, Valík, 2004). Průběh onemocnění je u dospělých osob mírný, hlavními příznaky jsou nevolnost, bolesti břicha, průjmy a zvracení. U dětí je průběh infekce těžší, základním projevem jsou zde profůzní průjmy s následnou dehydratací organismu, což může vést až k šoku a oběhovému selhání. Onemocnění trvá 1 – 7 dnů (Komprda, 2007).

3.4.1.2 Salmonella spp. Salmonely jsou gramnegativní, pohyblivé nesporotvorné tyčinky. V současné době je známo přibližně 2200 serovarů na základě 670 antigenních skupin a známých H-antigenů. Z epidemiologického hlediska mohou být salmonely zařazeny do tří skupin: První skupina zahrnuje S. typhi a S. paratyphi A a C, které infikují jen člověka a jsou šířeny přímým kontaktem, méně často potravinami. Druhá skupina zahrnuje serovary, které jsou adaptovány na zvláštní druhy obratlovců (S. gallinarum-pullorum na drůbež, S. choleraesuis atd.). Z nich některé jsou patogenní i pro člověka.

12

Třetí skupina zahrnuje většinu ostatních serovarů u kterých se neprojevuje zvláštní preference k hostiteli a jsou infekční jak pro člověka tak i pro zvířata. V posledních letech dominují jako původci onemocnění člověka S. enteritidis a S. typhimurium (Cempírková aj., 1997). Salmonely jsou termolabilní bakterie, ale ve vnějším prostředí přežívají dlouho. Na rostlinách, v hnoji, čistírenských kalech a v potravinách přežívají někdy měsíce až rok, přičemž si zachovávají svoji virulenci. Jsou ale citlivé vůči chladírenským a mrazírenským teplotám (Görner, Valík, 2004). Rostou v rozmezí teplot + 5 až 47 °C a při pH 4,0 až 9,0. Teploty nad 70 °C salmonely rychle devitalizují. Snížená aktivita vody pod 0,95 zabraňuje jejich množení (Burdychová, Sládková, 2007). Minimální infekční dávka toxinogenních salmonel je obyčejně vysoká, 105 až 106 KTJ. Proto k akutním enteritidám dochází až tehdy, když se salmonely v inkriminované potravině dostatečně rozmnožily, k čemuž je potřebný čas asi 24 hodin, dostatečná vlhkost (> 15 % vody, aw > 0,95) a teplota mezi 10 až 40 °C. Lidé se sníženou odolností, kojenci a senioři, reagují onemocněním i při nižší infekční dávce (Görner, Valík, 2004). Akutní gastroenteritida se projeví po poměrně krátké inkubační době trvající jen několik hodin, maximálně dva dny a probíhá s typickým obrazem toxikoinfekce. Ve střevech se v důsledku lyze bakterií do nich vniknutých uvolní lipopolysacharid, který působí na sliznici střev jako endotoxin a způsobuje časté vodnaté, obyčejně nekrvavé průjmy. Salmonely se mohou v tenkém střevě i množit a způsobit zánětlivé reakce, přičemž může vznikat i další salmonelový toxin. Příznaky odeznívají zpravidla za několik dní (Görner, Valík, 2004).

3.4.1.3 Escherichia coli Escherichia coli jsou morfologicky a biochemicky gramnegativní fakultativně anaerobní tyčinky fermentující laktózu za tvorby organických kyselin (mléčná, octová) a plynů (CO2 a H2). Jsou trvalými obyvateli lidského i zvířecího střevního traktu a jsou rozšířené v přírodě i tam, kde není možné předpokládat přímé fekální znečištění, například v pasterizovaném mléku, v sýrech apod. Běžné saprofytické kmeny těchto bakterií jsou za normálních okolností pro zdravého dospělého člověka neškodné (Görner, Valík, 2004). Ze stovek známých serovarů pouze některé způsobují onemocnění (Cempírková aj., 1997).

13

Mají velmi široké rozmezí teplotního růstu (10 až 45 °C), kromě verotoxinogenní E. coli 0157:H7, která roste špatně při teplotách nad 43 °C, nefermentuje sorbitol a nefermentuje β-glukuronidázu. Bakterie snáší kyselé i zásadité pH (4,4 – 9,0) (Burdychová, Sládková, 2007). Rychle se množí při koncentraci NaCl 2,5 %, stále ještě rostou při koncentraci 6,5 %, inhibuje je až koncentrace NaCl 8,5 %. V chladírenských podmínkách přežívají až několik týdnů při pouze malé redukci počtu buněk (Komprda, 2007). Nerostou při vodní aktivitě pod 0,95 (Burdychová, Sládková, 2007).

Patogenita Escherichia coli vyvolává 2 onemocnění: a) extraintestinální (zejména močových cest, septická onemocnění, infekce ran, hnisavé procesy) b) v intestinálním traktu infekce provázené průjmy (určité kmeny). Extraintestinální formy jsou vyvolány převážně komensálními sérotypy a infekce je často endogenní. Mohou se uplatnit ty kmeny, které vzdorují baktericidiím séra a fagocytóze, tj. mají polysacharidový kapsulární antigen, v močovém traktu ty, které mají tzv. P fibrie jimiž adherují na sliznici močových cest (uropatogenní E. coli). V zažívacím traktu se určité kmeny E. coli uplatňují jako patogeny různými mechanismy, podle kterých se skupiny těchto tzv. enteropatogenních kmenů E. coli označují jako: 1. enteropatogenní v užším slova smyslu (EPEC) 2. enterotoxigenní (ETEC) 3. enteroinvazivní (EIEC) 4. enterohemoragické (EHEC) (Bednář aj., 1999) Infekční dávka je vysoká, 105 – 106 buněk/g u dětí a 109 u dospělých. Inkubační doba trvá 1-3 dny i déle. Při onemocnění se objevuje průjem, někdy s příměsí krve nebo hlenu. Intenzita symptomů závisí na citlivosti organismu a serovaru. Po několika dnech onemocnění odeznívá, pouze u těžších případů (zvláště u dětí) může dojít k dehydrataci organismu (Cempírková aj., 1997).

3.4.1.4 Yersinia enterocolitica Yersinia enterocolitica je gramnegativní, pohyblivá, fakultativně anaerobní tyčinka. 14

Růstové optimum Y. enterocolitica je při 28 °C, při 37 °C roste už velmi pomalu (Görner, Valík, 2004). Množí se při hodnotách pH 4,6 až 9,0 a hodnotách aktivity vody nad 0,95 (Burdychová, Sládková, 2007). Tento mikroorganismus je psychrotrofní, proto roste, i když pomalu, při chladírenských teplotách a způsobuje riziko pomnožení v chlazených potravinách. Zdrojem nákazy pro člověka jsou hlavně prasata a od nich nakažení potkani, psi a kočky. V přenosu nákazy hrají hlavní roli potraviny z vepřového masa nebo kontaminované výkaly jiných zvířat (Görner, Valík, 2004). Y. enterocolitica může být izolována také ze syrového mléka, syrového masa a zeleniny (Cempírková aj., 1997). Y. enterocolitica vyvolává onemocnění u dětí nejmladší věkové skupiny a u oslabených dospělých nebo starých lidí. U malých dětí nebyl prokázán přenos potravinami. Při onemocnění se objevují bolesti břicha, které připomínají zánět slepého střeva, horečka, průjem. Vzácně se přidává nevolnost a vrhnutí. Onemocnění trvá několik dní (Cempírková aj., 1997).

3.4.1.5 Campylobacter jejuni C. jejuni tvoří gramnegativní, zahnuté tyčinkovité buňky s průměrem 0,2 až 0,4 µm a délkou 1,5 až 3,5 µm. Jsou mikroaerofilní, rostou dobře v atmosféře s 10 % O2 a 3 až 10 % CO2, buňka má několik bičíků, což jí umožňuje dobrou pohyblivost (Görner, Valík, 2004). Kampylobaktery obecně vyvolávají střevní infekce u lidí, aborty u domácích zvířat a uplatňují se jako podmíněné patogeny u lidí se sníženou imunitou (Bednář aj., 1999). C. jejuni je citlivý vůči vysokým teplotám, pasterační teploty nepřežívá. Nerozmnožuje se při teplotách nižších než 30 °C. Mražení při - 25 °C přežívá až 4 týdny. Optimální teplota růstu 42 - 45 °C. Optimální pH růstu je 6,5 – 7,5. Roste v rozmezí 5,5 – 8. Důležitá je závislost pH a teploty. Při pH 3 – 5 je inaktivován nejrychleji při 42 °C, méně při 25 °C a nejméně při 4 °C. C. jejuni je citlivý na nedostatek vody. Nejnižší aw při které byl pozorován růst je 0,96. Sušení je ničí (Cempírková aj., 1997). Zdrojem nákazy jsou domácí zvířata, zejména drůbež (i zdravá), prasata, skot, kozy, ovce, ale i psi a kočky (hlavně mláďata). Zřídka se jako zdroj nákazy uplatňuje nemocný člověk. Kontaminace potravin, jako masa a mléka se může uskutečnit už 15

intravitálně a při porážce. C. jejuni přežívá při chladírenských teplotách (4 °C) i několik týdnů v mléku, ve vodě ale i výkalech. Infekční agens se v důsledku této skutečnosti může přenášet na lidi i fekálně kontaminovanou pitnou vodou, ovocem a zeleninou a též mlékem. Zárodky kampylobakter se však v potravinách nerozmnožují a řádně provedenou pasterizaci mléka nepřežívají. (Görner, Valík, 2004). Onemocnění je provázeno bolestmi břicha, výrazným průjmem, někdy až krvavým. Trvá 5 – 7 dní a může ustoupit i bez terapie (Bednář aj., 1999). Infekční dávka je relativně nízká, 102 buněk/gram potraviny, přičemž kontaminovaná svalovina kuřecích brojlerů běžně obsahuje 102 – 103 KTJ/gram, ve střevním obsahu se však nachází v průměru 107 KTJ/gram. Inkubační doba je několik dní (2 – 7) (Komprda, 2007).

3.4.1.6 Listeria monocytogenes Listerie jsou krátké, poměrně uniformní grampozitivní tyčinky se zaoblenými konci. Délka obvykle nepřesahuje 0,5 – 2 µm (Bednář aj., 1999). Rostou za fakultativně anaerobních podmínek, netvoří spóry a jsou pohyblivé (peritrichní bičíky). L. monocytogenes je psychrotrofní bakterie a roste už při teplotě 2,5 °C. Její maximální teplota je při 44 °C a optimální v intervalu 30 až 37 °C. Roste v poměrně širokém intervalu hodnot pH 5,0 až 9,0. V kyselejším prostředí (pH < 3,5) je devitalizována. Všechny kmeny L. monocytogenes rostou při hodnotách aw ≥ 0,93 (≤ 10 % NaCl) a některé kmeny i při aw = 0,83 (asi 20 % NaCl) (Görner, Valík, 2004). Tento mikrob má vedle svých psychrotrofních vlastností významný mezofilní potenciál, který umožňuje přežívat teploty mezi 70 – 71 °C. Za bezpečnou hranici se považuje teplota 71,8 °C. Přežívá sušení a mražení (Cempírková aj., 1997). Nejdůležitější patogenní vlastností L. monocytogenes je beta-hemolyzin, zvaný listeriolyzin. Ztráta tohoto hemolyzinu souvisí se ztrátou virulence. Z dalších bílkovinných struktur jsou to ještě: internalin, fosfolipáza a metaloproteáza (Cempírková aj., 1997). Jiné druhy jako L. ivanovii, L. innocua a L. seeligeri se považují za nepatogenní. Z epidemiologického hlediska je pro člověka významná jen L. monocytogenes (Komprda, 2007). Listerie jsou primárně půdní bakterie. Dokázány jsou i v bahně, na rostlinách, stolici zdravých i nemocných zvířat a v menším množství i ve stolici zdravých lidí. Při porážce zvířat může docházet ke kontaktu fekálií s poraženým tělem zvířat jako i s vlastním masem (Görner, Valík, 2004). 16

Dodatečná kontaminace hotových výrobků je způsobena nedostatečnou hygienou manipulace s potravinami, nedostatečnou osobní hygienou pracovníků a nedostatečným čištění a desinfekcí. Infekční dávka není dosud přesně známa. Je udávána v rozsahu 102 – 105 buněk/g. Inkubační doba kolísá od několika dní až po několik týdnů. Klinické příznaky onemocnění jsou různorodé. Bolesti břicha, zvracení a bolesti hlavy se často nevyskytují. Objevují se příznaky podobné chřipce, syndrom infekční mononukleózy, kožní léze, konjunktivitidy, u novorozenců může dojít k sepsi a meningitidě. Onemocnění postihuje osoby s oslabeným imunitním systémem, alkoholiky, těhotné ženy, novorozence a starší osoby. U ostatních lidí probíhá onemocnění jen v mírné formě (Cempírková aj., 1997).

3.4.1.7 Clostridium perfringens Clostridium perfringens je nepohyblivá grampozitivní tyčinkovitá buňka s průměrem asi 0,9 až 1,3 µm a délkou 3 až 9 µm. Zařazuje se mezi anaerobní klostridie, ale pro její růst je postačující jen snížená přítomnost kyslíku. Jeho původním místem výskytu je tlusté střevo lidí a zvířat, ale pravidelně ho lze prokázat i v půdě (Görner, Valík, 2004). Podle přítomnosti exotoxinu se rozeznává 5 typů Cl. perfringens: typy A, C a D jsou lidskými patogeny, typy B, C, D, E patogeny zvířecími (Komprda, 2007). Typ A může způsobit infekci ran a otravy potravinami, typ C nekrotizující enteritidu (Görner, Valík, 2004). Cl. perfringens má schopnost se rozmnožovat v širokém teplotním rozmezí (15 – 50 °C) a optimálně roste při 43 – 45 °C (Cempírková aj., 1997). K nejrizikovějším potravinám patří maso, masné výrobky a šťáva z masa. Rizikovým

faktorem

je především

nesprávný teplotní

režim

při

zacházení

s potravinami: ponechání tepelně opracovaných potravin delší dobu při pokojové teplotě. Cl. perfingens patří k patogenům působící až při vysoké infekční dávce: kolem 107 buněk/gram potraviny. Inkubační doba je poměrně krátká, 8 – 12 hodin (Komprda, 2007). Mezi klinické příznaky patří bolesti břicha, průjem až vodnatý. Onemocnění probíhá bouřlivě, brzy však odezní (Cempírková aj., 1997). 17

3.4.1.8 Clostridium botulinum C. botulinum je tyčinkovitá pohyblivá mírně zahnutá buňka s průměrem 0,5 až 1,0 µm a délkou 2 až 10 µm. Roste jen za aerobních podmínek (Görner, Valík, 2004). Tvoří toxiny A – G. Označení odpovídá typu kmenů (Cempírková aj., 1997). Botulotoxiny typů A, B, E a F způsobují intoxikace u lidí. Toxiny typů C a D byly doteď zjištěny pouze u zvířat, které měly botulismus. V Evropě se na botulotoxických onemocněních podílí nejčastěji Clostridium botulinum typu A, B a E a ojediněle typu F. Botulotoxiny se řadí mezi nejjedovatější toxiny. Letální dávka toxinu A při orálním příjmu člověkem se odhaduje mezi 0,1 až 1,0 µg. Botulotoxiny jsou neurotoxiny, to znamená, že působí na periferní nervový systém (Görner, Valík, 2004). Botulotoxiny jsou ničeny teplem, světlem, zářením a vysoce alkalickým prostředím. Nicméně přesto, že jsou polypeptidy, je jejich rezistence k RTG záření i teplu relativně vysoká. Např. je ničí 10-ti minutový var. V kyselém prostředí (pod pH asi 5,5) se produkce toxinu zastavuje (Bednář aj., 1999). Spory Clostridium botulinum se nacházejí ve fyziologické flóře střeva různých živočichů, v půdě, bahně, prachu, na nízkých porostech, na kořenové zelenině, bramborech aj. Dále mohou být nalézány v sedimentech pobřežních mořských vod zvláště u velkých měst (Cempírková aj., 1997). Botulizmus je obecně asociován s konzervovanými potravinami o nízké kyselosti. Konkrétně se nejčastěji jedná o zeleninu, ryby a masné výrobky (Komprda, 2007). Cl. botulinum se může rozmnožovat jen v těch potravinách, kde je zaručeno anaerobní prostředí. Vegetativní formy jsou citlivé k pasteračním teplotám, spory odolávají varu 2 hodiny. Sterilizační proces je spolehlivě ničí. Nejsou-li dodržovány správné teplotní režimy, dochází ke klíčení spor, vytvoření vegetativních buněk a produkci botulotoxinu. Cl. botulinum roste v teplotním rozmezí 3,3 – 50 °C. Kmeny typu A a B se nemnoží při teplotách pod 10 °C, kmeny typu E mohou růst a produkovat toxin už při teplotě 3,3 °C. Cl. botulinum se dobře množí v mírně kyselém prostředí (Cempírková aj., 1997). Inkubační doba závisí na množství přijatého toxinu a pohybuje se v rozmezí asi 5 hodin – 5 dnů od požití kontaminované potraviny. Nejprve se dostavují příznaky všeobecné: malátnost, bolesti břicha, zvracení. Následují příznaky nervové: dvojité vidění, mydriasis (rozšíření očních zornic), sucho v ústech, poruchy polykání, zástava

18

střevní peristaltiky, poruchy dýchání. Neléčené onemocnění může skončit smrtí v průběhu 3 – 6 dnů. Mortalita je asi 10 % (Komprda, 2007).

3.4.1.9 Bacillus cereus Bacillus cereus je aerobní a fakultativně anaerobní grampozitivní tyčinka. Její průměr je 1,0 až 1,2 µm a délka 3,0 až 5,0 µm. B. cereus roste mezi 10 a 48 °C a s optimem mezi 28 až 35 °C. Některé kmeny tohoto mikroba tvoří velmi odolné spory snášející vysoké teploty a dávky ionizujícího záření. Původním stanovištěm B. cereus je půda, prach a jimi kontaminované potraviny rostlinného a živočišného původu (Görner, Valík, 2004). V surovinách je B. cereus přítomen ve formě spor, které mohou přežít díky své vysoké termorezistenci tepelné opracování. B. cereus je schopen růst při teplotách 7 až 49 °C a v rozmezí pH 4,3 až 4,9. Vodní aktivita nutná pro množení vegetativních buněk je 0,95. Vegetativní formy B. cereus se v potravinách pomnožují jen omezeně, protože jejich růstu brání ostatní mikroflóra. Spory však velmi dobře snášejí suché prostředí i působení varu nebo pasteračních teplot. Po tepelném opracování, kdy je ostatní mikroflóra zničena, dochází při teplotách nad 10 °C k vyklíčení spor a produkci toxinu. K vyvolání onemocnění je třeba velké množství buněk, zpravidla více než 106 v 1g potraviny. B. cereus produkuje nebezpečné enterotoxiny, které vyvolávají alimentární intoxikace (Burdychová, Sládková, 2007). Akutní enteritidu s inkubační dobou 8 až 10 hodin projevující se průjmem způsobuje citlivý průjmový toxin (diarrhoea toxin) bílkovinného charakteru. Vedle masivního průjmu způsobuje i nekrotické poškození sliznice střev a jiných tkání. Je velmi termolabilní a inaktivuje se už záhřevem na 60 °C. Druhý z hlediska enterotoxikózy významný toxin je tvořený buňkami B. cereus je emetický toxin („emetic toxin“). Při jeho působení organismus reaguje po 1 - 5 hodinové inkubační době zvracením, nevolností, zřídka i žaludečními křečemi a průjmem. Snáší i sterilační teplotu 120 °C (Görner, Valík, 2004). V potravinách se vyskytuje běžně, ovšem v množství < 102 KTJ/gram, což je považováno za hodnotu přijatelnou z hlediska zdravotní nezávadnosti. Naopak v případě chybné manipulace s potravinou, především pokud se jedná o nedodržení správného teplotního režimu, může dojít k pomnožení patogena na hodnoty > 105 KTJ/gram, což již stačí k intoxikaci (Komprda, 2007).

19

3.4.1.10 Staphylococcus aureus Staphylococcus

aureus

je

grampozitivní

kokovitá

buňka

s průměrem

0,8 až 1,2 µm. Netvoří spory, je nepohyblivá, fakultativně anaerobní, roste v intervalu 6,5 až 46 °C, s optimální teplotou 35 až 37 °C. Stafylokoky jsou značně odolné vůči dekontaminačním látkám, snášejí záhřev na 60 °C po dobu 30 min a dobře se rozmnožují v potravinách s vysokým obsahem solí a cukru do hodnoty aw = 0,86 (Görner, Valík, 2004). Pasterační teplota 85°C je ničí, avšak některé odolné kmeny mohou přežívat nižší pasterační záhřevy (šetrná pasterace). V mražených výrobcích se uchovává životaschopný až 8 měsíců (Cempírková aj., 1997). V přírodě se stafylokoky vyskytují v prachu, ve vodě, jsou součástí mikroflóry kůže a srsti nebo dutiny ústní či nosní. Ubikvitární rozšíření stafylokoků dává předpoklady k jejich výskytu v mase a potravinách s vysokým obsahem bílkovin (mléko, sýry, apod.) (Burdychová, Sládková, 2007). S. aureus produkuje enterotoxiny A, B, C1, C2, C3, D, E a F. Enterotoxin F nese název „Toxic Shock Syndrome Toxin One – TSST1“. Enterotoxiny jsou termostabilní a zachovávají si aktivitu i po zahřátí na teplotu 100 °C po dobu 20 minut (Cempírková aj., 1997). S. aureus je patogenní pro člověka a prakticky pro všechny teplokrevné živočichy. Lidský organismus je vůči stafylokokové infekci poměrně značně odolný. K onemocnění dochází zpravidla při oslabení organismu nebo při infekci velkou dávkou virulentního kmene (Bednář aj., 1999). Stafylokoková enterotoxikóza je akutní onemocnění. Zpravidla se objevuje za 1 až 6 hodin po požití inkriminované potraviny. Charakteristický je její prudký a dramatický průběh. Stafylokokové enterotoxikózy působí na sliznici střeva, což vede k prudkému zvracení spojeného s průjmem bez zvýšení tělesné teploty, v těžkých případech až s kolapsovým stavem (děti). Chorobné příznaky vymizí obyčejně za jeden až dva dny. K vyvolání stafylokokové enterotoxikózy stačí 0,5 až 5 µg enterotoxinu A (Görner, Valík, 2004).

3.4.1.11 Shigella spp. Bakterie z rodu Shigella jsou nepohyblivé gramnegativní tyčinky nefermentující laktózu. Jsou původci tzv. bakteriální dysenterie, shigelózy nebo úplavice. Rod Shigella má čtyři druhy: Shigella sonnei, S. flexneri, S. boydii a S. dysenterie. V Evropě převládají druhy S. sonnei a S. flexneri, měně často S. boydii. S. dysenteriae, původce 20

nejtěžší formy dysenterie se vyskytuje jen v mimoevropských krajích. Shigelly jsou patogenní jen pro lidi (Görner, Valík, 2004). Shigelly se nacházejí ve střevě člověka a v zevním prostředí s fekální kontaminací např. ve vodních zdrojích znečištěných odpadními vodami, prosakem, dále v potravinách fekálně kontaminovaných. Shigella sp. je na rozdíl od salmonel vzácně izolována ze zvířat. Ve srovnání se salmonelami jsou málo odolné vůči vlivům zevního prostředí. V potravinách se nerozmnožují, pasterační teploty je spolehlivě devitalizují. Nejdéle se udrží v potravinách při teplotě 25 °C. Chladírenské teploty prodlužují dobu přežívání. Většina onemocnění souvisí s pitím kontaminované vody. Důležitý je také přenos z osoby na osobu. Onemocnění může probíhat od asymptomatických infekcí až po těžké průjmové stavy. Závažnost onemocnění závisí na původci. Je-li původcem Sh. dysenterie objevují se bolesti břicha, nevolnost, průjem až krvavý, horečka, někdy bolesti hlavy a celková vyčerpanost. Je-li původcem např. Sh. sonney, objevuje se jen mírný průjem bez horečky. Příznaky odezní většinou za 1 – 2 dny. Avšak u dětí, starých nebo oslabených lidí může dojít při těžký průjmech k dehydrataci organismu, což může mít fatální následky (Cempírková aj., 1997). Infekční dávka je nízká, 100 bakterií i méně může vyvolat onemocnění. Inkubační doba je 1 – 7 dní, většinou méně jak 4 dny (Cempírková aj., 1997).

3.4.1.12 Vibrio parahemolyticus Vibrio parahemolyticus je gramnegativní, fakultativně anaerobní, nesporulující tyčinka, oxidáza pozitivní, halofilní. Roste dobře v prostředí s 6 % NaCl (Cempírková aj., 1997). Poměrně rychle se množí i při teplotách kolem 40 °C, k vyšším teplotám je však vysoce citlivý (Komprda, 2007). Vyskytuje se ve vodách na mořských pobřežích, v sedimentu, v planktonu, ale není ve vodě v otevřeném moři. Vyvolává 2 typy onemocnění, jednak průjmová onemocnění jako otravy z potravin, méně často také onemocnění extraintestinální (infekce ran) (Bednář aj., 1999). Infekce tímto patogenem je zjišťována především po konzumaci syrových, nedostatečně tepelně opracovaných nebo rekontaminovaných ryb a mořských živočichů. Infekční dávka je poměrně vysoká, více než 106 buněk. Inkubační doba je 4 – 96 hodin s průměrem asi 15 hodin (Komprda, 2007).

21

Mezi klinické příznaky onemocnění patří profuzní průjem, bolesti břicha a nevolnost, někdy doprovázené horečkou a zvracením. Onemocnění trvá většinou 2 – 5 dní a odezní bez následků. Onemocnění je sezónní a vyskytuje se především v letních měsících (Cempírková aj., 1997).

3.4.1.13 Enterobacter sakazakii Enterobacter sakazakii je oportunistický patogen, který způsobuje vzácnou formu novorozenecké meningitidy a nekrotizující enterokolitidy. Tato gram-negativní nesporulující fakultativně anaerobní tyčinka byla poprvé spojena s novorozeneckou meningitidou roku 1961, tehdy ještě pod svým původním nesprávným názvem Enterobacter cloaca (Anonym, 2006). Riziko u bakterie Enterobacter sakazakii vyplývá z jeho všudypřítomného výskytu, schopnostech růstu v rozmezí teplot 5 – 47 °C (optimum je 37 °C), dlouhodobém přežívání v produktech s nízkou vodní aktivitou a poměrně krátké generační době (při pokojové teplotě 1,7 hod.). Jeho nebezpečnost je zvláště vysoká u kojenecké a dětské mléčné výživy, protože prostředí sprejových sušáren je pro tento mikrob výhodné (Demnerová aj, 2007). Onemocnění způsobené Enterobacter sakazakii se vyznačuje neobvykle vysokou mortalitou, která může dosahovat až 80 procent, a ačkoli se většina dokumentovaných případů týká novorozenců nebo dětí do 3 let, byly zaznamenány i případy onemocnění dospělých. Nákaza vzniká u novorozenců zpravidla požitím kontaminované sušené kojenecké stravy a její léčba spočívá zejména v podávání antibiotik (Anonym, 2006).

4. METODY DETEKCE PATOGENNÍCH MIKROORGANISMŮ V POTRAVINÁCH

Mikrobiologické metody průkazu patogenních mikrobů v poživatinách jsou pouze jedna z komponent systému preventivních opatření, avšak klíčová, protože jedině jejich pomocí lze přítomnost patogenních mikrobů v potravině nebo prostředí zjistit, proto verifikují účinnost všech ostatních opatření (Jičínská, Havlová, 1996).

22

Interpretace výsledků získaných mikrobiologickým rozborem dané potraviny je mnohem obtížnější, než se obvykle usuzuje a to především z následujících důvodů: -

MO se nacházejí v dynamicky se měnícím prostředí: výsledky stanovení platí vlastně pouze pro okamžik odběru;

-

negativní výsledek kultivace může být zavádějící: ve vzorku může být přítomen již pouze bakteriální toxin;

-

výsledky platné pro daný vzorek nemusí být nezbytně reprezentativní pro celou šarži;

-

počty kolonií jsou relevantní vždy pouze v určitém rozsahu konfidenčního intervalu (např. zjištěná hodnota KJT = 320 ve skutečnosti znamená, že počty daného MO se s 95%ní pravděpodobností pohybují v rozmezí 285 – 355) (Komprda, 2003).

Jediný způsob, jak získat absolutní jistotu, že potravina neobsahuje patogenní mikroorganismy, by byl zkoušet všechny produkty bezprostředně před konzumací. To ovšem není možné, vyšetření je třeba omezit na reálnou část produktu. Proto byly vypracovány přejímací plány, které umožňují statisticky odhadnout reprezentativnost počtu odebraných vzorků pro pravděpodobnost záchytu patogenů ve vzorku. Vychází se z předpokladu rovnoměrného rozdělení zjišťovaných mikrobů ve výrobku, avšak i v tomto případě závisí pravděpodobnost záchytu patogenů mj. od poměru objemu analyzovaných vzorků k objemu kontrolované dávky. Existuje určité riziko falešně negativních výsledků, které se zvyšuje i nerovnoměrným rozložením mikrobů ve výrobku, které je pro mnohé potravinářské suroviny i výrobky charakteristické. Vyšetřovaná potravina pak obsahuje patogenní mikroby, ačkoliv výsledky rozboru byly negativní. Jiný koncept kontroly patogenů v potravinách spočívá v zavedení systému HACCP, který slouží k vytváření podmínek pro dobrou výrobní praxi pomocí kritických kontrolních bodů (CCP). Znalost kritických bodů jednak umožňuje zavést opatření k odstranění rizika kontaminace, dále je možno ještě zabránit kontaminaci finálního výrobku, pokud došlo ke kontaminaci už během výrobního procesu (Jičínská, Havlová, 1996).

23

4.1 Metody detekce mikroorganismů Metody detekce MO je možno rozdělit na klasické (konvenční) a moderní, tzv. rychlé metody (Komprda, 2003).

4.1.1 Klasické kultivační metody Používají se ke kontrolním (úředním) rozborům, jejichž účelem je rozhodnout o přípustnosti poživatiny pro lidskou nebo živočišnou konzumaci, k vystavování garančních

osvědčení

jakosti

v tuzemských

i

mezinárodních

dodavatelsko-

odběratelských vztazích, k rozborům potraviny, u kterých je podezření, že způsobily alimentární onemocnění, k mikrobiologické kontrole výrobního zařízení a prostředí. Některé

klasické

kultivační

metody

k průkazu

epidemiologicky

důležitých

mikroorganismů, ve formě čs. i mezinárodních norem (také označované jako Standardní metody), jsou úředně platné metodiky mikrobiologických potravinářských rozborů předepsané k prováděná shora uvedených typů rozborů (Jičínská, Havlová, 1996).

Klasické metody se dělí na kvalitativní a kvantitativní. -

kvantitativní - metody poskytují počty buněk určitého druhu nebo rodu nebo určité skupiny mikroorganismů (Šilhánková, 1987)

-

kvalitativní – jsou to metody průkazu přítomnosti či nepřítomnosti zjišťovaného mikroba v určitém, metodou předepsaném množství vzorku (Jičínská, Havlová, 1996)

4.2.2 Rychlé metody Klasické

kultivační

metody

k průkazu

patogenních

mikroorganismů

v potravinách vyžadují dobu 7 až 10 dní. Výhodou rychlých metod je především rychlé získání negativních výsledků, tj. zjištění nepřítomnosti příslušného patogenního mikroorganismu ve vzorku. Pozitivní výsledky vyžadují obvykle další vyšetření vzorku klasickou metodou (Jičínská, Havlová, 1996).

Mezi nejnovější rychlé metody patří:


Systém Petrifilm




Imunologické metody




Průtoková cytometrie

24




Impedanční metody




Využití selektivních diagnostických chromatografií




Miniaturizace biochemických testů




Luminiscenční stanovení




Hybridizace – využití sond




PCR

Rychlý rozvoj nových metod a přístupů k detekci patogenních mikroorganismů nastal v 90. letech (Anonym, 2007). 4.2.1.1 Polymerázová řetězová reakce (PCR) Použití DNA (RNA) sond (primerů) specifických pro daný cílový MO, v kombinaci s metodou PCR, kterou lze namnožit vybranou specifickou sekvenci DNA a tuto po následné separaci gelovou elektroforézou a obarvení detekovat, je v potravinářské mikrobiologii používána ve stále rostoucí míře. Výhodou je skutečnost, že alimentární patogeny mohou být detekovány bez obvyklého značného důrazu na selektivní růstové médium, nevýhodou, že přítomnost specifické sekvence nukleové kyseliny sama o sobě nezaručuje přítomnost živých, množení schopných MO. Metoda se často využívá k tzv. typizaci, tedy rozlišení jednotlivých subtypů v rámci daného druhu patogenní bakterie, které se mohou podstatně lišit virulencí a dalšími, z hlediska šíření daného onemocnění podstatnými, vlastnostmi (Komprda, 2003). Polymerasovou řetězovou reakcí docílíme zmnožení molekul DNA a zvýšení její koncentrace na požadovanou úroveň. Snadnost a rychlost metody vedla od jejího prvního předvedení v roce 1986 k jejímu rychlému rozšíření, vývoji nových variant PCR a k velkému rozvoji zejména diagnostických aplikací. V PCR využíváme schopnosti DNA-polymerasy stavět k jednomu vláknu DNA vlákno komplementární. Jak známo, DNA polymerasa není schopna stavět DNA od počátku, musí navazovat na hotový oligonukleotidový úsek vlákna zvaný primer (očko), který obsahuje zpravidla alespoň 18 nukleotidů. Pokud přidáme dva primery, které nasednou ke komplementárním úsekům obou vláken v blízkosti 3´-konců, dojde k dostavění vláken DNA-polymerasou do podoby dvouvláknové DNA. Zdrojem nukleotidů pro syntézu jsou deoxynukleosidtrifosfáty. DNA-polymerasa je napojuje k 3´-koncům primerů a sleduje templáty DNA ve směru 3´-5´. Nutnost přidat primery je velkou výhodou. Nedojde totiž k dostavění druhých vláken jakékoliv DNA, ale jen té,

25

k níž jsou primery komplementární. Tak můžeme zmnožit jen určitou z mnoha různých DNA ve vzorku a primery současně omezují úsek DNA (např. gen), který je množen. Postup zahrnuje tři základní kroky, které tvoří jeden cyklus. Cyklus se může podle potřeby mnohokrát opakovat (např. 30 – 40x). Proces PCR je automatizován a provádí se v cyklerech. Tři kroky jednoho cyklu jsou následující: -

Denaturace DNA. V pufrovaném roztoku se všemi reagenciemi se DNA několik sekund při 95 °C taví. Vznikají jednovláknové molekuly DNA, které budou sloužit jako templáty.

-

Nasednutí primerů k templátu (annealing). Roztok se ochladí na 40 – 70 °C. Během několika

sekund

dojde

k nasednutí

oligonukleotidových

primerů

ke komplementárním vláknům templátů. -

Elongace. DNA-polymerasa při teplotě 72 °C dostaví DNA k primerům. Podle vzdálenosti primerů se nechá probíhat sekundy (jsou-li blízko) až 2 minuty (jsou-li daleko). V posledním cyklu se ponechá elongační krok dobíhat déle, aby došlo k dostavění případně nedokončených vláken (Klouda, 2005).

Obr. 1 Schéma PCR (Anonym, 2008).

26

Namnožení DNA pomocí PCR: Na základě znalosti sekvence DNA, kterou chceme amplifikovat, jsou nesyntetizovány dva oligonukleotidy, přičemž každý je komplementární k sekvenci jednoho řetězce dvoušroubovice na opačných koncích úseku, který má být amplifikován. Tyto oligonukleotidy slouží jako primery pro syntézu DNA in vitro pomocí DNA-polymerázy a navíc ohraničují amplifikovaný segment. PCR začíná s dvouřetězcovou DNA, a proto na začátku každého cyklu je třeba od sebe oddělit oba řetězce krátkým zvýšením teploty. Po denaturaci je reakční roztok chlazen v přítomnosti velkého nadbytku obou primerů, které nasedají na obě komplementární sekvence DNA. Z obou primerů jsou syntetizovány nové řetězce DNA v přítomnosti DNA-polymerázy a všech čtyř deoxyribonukleosidtrifosfátů. Další cyklus je pak znovu zahájen denaturací zvýšenou teplotou, kdy dojde k oddělení nasyntetizovaných řetězců DNA (Alberts et al., 1998). Původně bylo třeba přidávat novou DNA-polymerázu po každém cyklu, protože standardní enzymy nevydrží tak vysoké teploty (nad 90 °C), které jsou potřeba k izolaci vláken DNA před každou replikací. Ale v současné době máme speciální termostabilní polymerázy, které snáší teplo. Nejznámější z nich (Taq polymerase) pochází z Termus aquaticus, bakterie, která žije v horkých pramenech a tudíž má termostabilní enzymy (Weaver, Hedrick, 1997). V dalších cyklech reakce slouží i nově nasyntetizované molekuly DNA jako templáty a během několika málo cyklů začnou v roztoku převažovat amplifikované molekuly ohraničené z obou stran primery. Obvykle se pro amplifikace používá 20 – 30-ti cyklů, přičemž se v každém cyklu množství molekul oproti předcházejícímu cyklu zdvojnásobí. Jelikož jeden cyklus trvá přibližně pět minut a protože byla celá technika zautomatizována, je nyní možno naklonovat fragment DNA bez použití buněk během několika hodin na rozdíl od několikadenního standardního postupu. Z celé molekuly DNA, která je pro reakci použita, je amplifikován pouze úsek mezi primery, protože DNA-polymeráze pro iniciaci replikace na jiném místě chybí primer. Produktem tří cyklů je 16 řetězců DNA, z nichž 8 má požadovanou délku a odpovídá jednomu nebo druhému řetězci původní DNA; ostatní řetězce jsou delší a obsahují i sekvence, které se nacházejí za místem, na kterém nasedá primer pro syntézu opačného řetězce DNA – tyto řetězce vznikají jen tehdy, pokud je templátem původní řetězec. Po dalších třech cyklech má 240 z 256 řetězců požadovanou délku a po několika dalších cyklech začnou řetězce ohraničené primery zcela převažovat (Alberts et al., 1998). 27

Obr. 2 Schéma PCR – namnožení DNA (Anonym B, 2008).

Základní technikou dělení, identifikace a čištění nukleových kyselin je elektroforéza na gelu. Nukleové kyseliny se v mírně zásaditém prostředí (pH ≈8,5) chovají jako polyanionty a v elektrickém poli mohou být proto rozděleny podle své velikosti. Podle délky dělených fragmentů nukleových kyselin lze zvolit ze dvou druhů gelů. Pro delší fragmenty (500 bp – 25 kbp) se používají agarosové gely, pro kratší fragmenty gely polyakrylamidové (Anonym, 2008). Největším problémem diagnostické aplikace PCR technik (a jiných klonovacích technik nukleových kyselin) je jejich "falešná" pozitivita zapříčiněná vlastní úžasnou citlivostí těchto technik. Stačí jedna jediná molekula DNA, která znečistí zkumavku, ve které je umístěn zkoumaný vzorek nebo v němž se provádí analýza, a PCR ji zaregistruje jako falešně pozitivní signál (Anonym B, 2008).

Hlavní využití PCR: -

získávání dostatečného množství DNA pro sekvenci,

-

získávání DNA pro syntézu genů,

-

diagnostika patogenních mikroorganismů,

-

detekce genetických poruch,

-

identifikace osob v kriminalistice (porovnání DNA z jediného vlasu nebo spermie – fingerprint),

-

studium genetických informací fosilíí v geologii (Klouda, 2005).

28

4.2.1.2 Hybridizace – využití sond Jako sondu označujeme v molekulární genetice molekulu nukleové kyseliny, kterou použijeme k vyhledání určité sekvence ve vzorku testované DNA nebo RNA. Využíváme při tom schopnost jednovláknových molekul nukleových kyselin tvořit hybridní molekuly (hybridizovat), pokud obsahují komplementární sekvence. Z této schopnosti vyplývá i využití sond - tyto molekuly za určitých podmínek hybridizují s vyšetřovanou nukleovou kyselinou pouze v případě, že obsahuje komplementární sekvenci. Sondu si přitom můžeme uměle připravit tak, aby měla námi zvolenou sekvenci. Pro hybridizaci se používají buď dvojvláknové DNA-sondy, nebo jednovláknové RNA-sondy. Vyšetřovaná nukleová kyselina může být také buď dvojvláknová DNA nebo jednovláknová RNA. Pokud jsou některé z molekul dvojvláknové, musíme je před hybridizací nejdříve vystavit podmínkám, které povedou k jejich denaturaci – obvykle se používá chemický roztok, obsahující denaturační činidlo (např. močovina nebo formamid). Při vlastní hybridizaci nejprve smísíme sondu s vyšetřovanou nukleovou kyselinou a zajistíme vhodné podmínky pro hybridizaci. Poté je potřeba odmýt sondu, která se nenavázala na vyšetřovanou nukleovou kyselinu, abychom při detekci "zviditelnili" jenom sondu navázanou na vyšetřovanou DNA. Proces hybridizace probíhá mezi molekulami nukleových kyselin, takže ho nemůžeme přímo sledovat. Abychom mohli zjistit zda hybridizace proběhla, musíme mít nějak označeny molekuly použité sondy. Prakticky se to provádí tak, že jsou už při přípravě (syntéze) sondy použity značené nukleotidy. Tradičně se jako značka používá radioaktivní fosfor, který je v nukleotidu v podobě fosfátu. Další způsob spočívá v připojení molekuly, která může působit jako antigen a být rozpoznávána protilátkami. Hybridizací lze zjišťovat i přítomnost konkrétních sekvencí přímo v buňce, tedy v místě jejich normálního výskytu, tzv. in situ. Protože průběh hybridizace můžeme posuzovat pouze pod mikroskopem, používají se pro tento způsob detekce výhradně sondy značené fluorescenčním barvivem, jejichž přítomnost můžeme pozorovat fluorescenčním mikroskopem. Hovoříme o tzv. fluorescenční in situ hybridizaci (FISH). (Raclavský, 2003).

4.2.1.3 RFLP (restriction fragment length polymorphism) RFLP je jednou z nejjednodušších metod využívaných ke studiu polymorfismu i k mapování genů. Dnes je RFLP využívána především ve spojení s PCR. Tato PCR-

29

RFLP je někdy nazývána CAPS (cleaved amplified polymorfic semence – štěpění amplifikovaných polymorfních sekvencí) (Southern, 1979). Restrikční analýza DNA je metodou charakterizace DNA pomocí jejího štěpení restrikčními endonukleasami na fragmenty. Identifikace a analýza produktů štěpení se provádí elektroforetickým dělením. Je známo velké množství bakteriálních restrikčních endonukleas (asi 1500), které se liší od sebe tím, že rozpoznávají různé krátké sekvence nukleotidů - 4, 6, 8 a že štěpí DNA na různě dlouhé fragmenty podle individuálního pořadí

bazí

a

podle

rozpoznané

sekvence.

Za

daných

podmínek

vzniká

reprodukovatelný počet restrikčních fragmentů o určité opět reprodukovatelné délce (rovná se počtu bazí). Počet i délka fragmentů je pro daného jedince specifická. Některé restrikční endonukleasy jsou citlivé na methylaci DNA. V některých případech methylace adeninu a methylace cytosinu inhibují štěpení, v jiných je methylace pro štěpení nezbytná. Odlišení různých DNA se provádí na základě polymorfismu délky štěpných úseků. Tento polymorfismus vzniká na základě přítomnosti nebo nepřítomnosti rozpoznávacích a štěpných míst. Obecně restrikční endonukleasy, které rozpoznávají kratší sekvenci, štěpí DNA častěji na menší úseky, zatímco restrikční endonukleasy rozpoznávající delší sekvenci štěpí méně často a na delší fragmenty. Při neúplném (parciálním) štěpení DNA vlivem nevhodných reakčních podmínek vznikají delší úseky (například velký obsah bílkovin, nevhodná teplota, nedostatečná doba). Hvězdičkové štěpení (tzv. „star“ aktivita enzymu) je způsobeno nespecifickým štěpením mimo rozpoznávací místa. Vzniká tak mnoho krátkých úseků. Tento analyticky nepříznivý stav může být způsoben například nadbytkem glycerolu v reakci. Proto nelze zvyšovat koncentraci restrikčního enzymu v reakci zvyšováním použitého objemu, ale použitím stejného objemu enzymu ze zásoby o vyšší koncentraci (Anonym, 1998).

4.2.1.4 MLEE (Multi-locus enzyme electrophoresis) MLEE je poměrně jednoduchá a levná metoda molekulárního typování. Buňky se šetrně lyzují a směs proteinů v lyzátu se podrobí elektroforéze v polyakrylamidovém gelu. Klony téhož sérovaru se geneticky liší mj. tím, že jeden a tentýž enzym je v různých klonech kódován různými alelami svého strukturního genu. V tomto případě různé klony obsahují odlišné varianty téhož enzymu „isoenzymy“ (také isozymy). Isozymy téhož enzymu se poněkud liší některými svými fyzikálně chemickými 30

vlastnostmi, včetně pohyblivosti při elektroforéze v gelech. Toho se využívá v metodice MLEE k molekulárnímu typování klonů (Jičínská, Havlová, 1996). V MLEE je bakterie lyzována bez denaturace a cytoplasmatické enzymy jsou odděleny elektroforézou na škrobových gelech. Každý enzym je poté zviditelněn vyvíjením gelu s vhodným enzymovým substrátem a indikátorovým barvivem. Vzdálenosti migrace každého enzymu jsou určeny a jsou jim přiřazena číselná ustanovení odpovídající každé alele. Předpokládá se, že všechny enzymy, které urazí stejnou vzdálenost, jsou produkty totožných genů (Fratamico, 2005). Enzymy zkoumané pomocí MLEE se obvykle účastní základního metabolismu buňky a méně podléhají selektivnímu tlaku prostředí a konvergenci. Data získaná metodou MLEE se proto považují za reprezentativní vzorky celého genomu organismu a jsou dobrým základem pro studium populační genetiky bakterií, hub a prvoků (Boerlin, 1997).

4.2.1.5 Impedanční (vodivostní) mikrobiologie Impedance a vodivost jsou dvě vzájemně reciproké veličiny. Metoda přímé impedance je založena na tvorbě iontových metabolitů (organické kyseliny, amonné ionty) vlivem růstu a metabolické činnosti MO v růstovém médiu. Přítomnost iontů vede ke změně vodivosti (impedance) daného média. Vodivost (impedance) je měřena v pravidelných intervalech (obvykle 6 minut) a doba, kdy dojde ke změně vodivosti, je označována jako doba detekce. Čím vyšší je počet MO, tím kratší je doba detekce. Na základě předem zkonstruované kalibrační křivky pro různé počty MO je příslušné zařízení schopno automaticky stanovit počet mikroorganismů ve vzorku (Komprda, 2003). Slouží k detekci salmonel, listerií a koliformních bakterií (Raugel, 1999). Nepřímá impedanční technika spočívá v monitorování mikrobiálních metabolitů skrze produkci CO2. Používá se jestliže specifické okolnosti dostanou testovaný mikroorganismus nebo médium mimo obvyklý rozsah působení přímé impedance (například vysoká koncentrace soli v selektivním médiu) (Raugel, 1999). Tato nepřímá technika je využitelná k detekci širokého spektra mikroorganismů, včetně St. aurerus, L. monocytogenes, E. coli, P. aeruginosa a serovarů salmonel (Forsythe, 2000).

4.2.1.6 Imunologické metody Imunochemické metody jsou založeny na použití protilátek jako specifických vazebných činidel. Pomocí imunochemických metod lze stanovit v původním 31

biologickém materiálu celou řadu cizorodých látek (farmaka, toxické látky), látky tělu vlastní, látky infekčního původu nebo specifické protilátky vzniklé na nějaký imunologický podnět. Antigeny jsou makromolekulární látky přirozeného nebo umělého původu, které imunitní systém rozpozná jako cizí. Po vpravení do vhodného organismu, antigeny stimulují tvorbu protilátek, lymfokinů, regulačních a výkonných T-lymfocytů, čímž navodí imunitní odpověď (Zajoncová, 2004). Protilátky jsou specifické bílkoviny (zvané imunoglobuliny), které se u obratlovců tvoří jako obranný mechanizmus proti infekci – tedy vniknutí především virů a bakterií, ale i dalších pro organizmus cizích molekul, tzv. antigenů. Antigen je tedy cokoli, co imunitní systém rozpoznává jako „cizí“. Nejčastěji se jedná o bílkoviny (včetně enzymů), peptidy, nukleoproteiny, polypeptidové bakteriální toxiny. Protilátka je schopna reagovat s daným antigenem a vytvořit s ním pevný komplex – toho lze právě využít i analyticky (Komprda, 2003).

RIA (radioimunoassay) Princip RIA spojuje jednoduchou imunologickou reakci antigenu s radioaktivně značenou protilátkou. Velkou předností RIA metody je její vysoká specifita a senzitivita. Nevýhody jsou dány především používáním radionuklidů, které představují potenciální zdravotní riziko pro laboratorní pracovníky. Vyžaduje zvláštní bezpečnost opatření při práci, dopravě a likvidaci radioaktivního odpadu. V současnosti je většina RIA metod nahrazena metodami enzymové imunoanalýzy (Karpíšková a Pospíšilová, 2005).

Enzymoimunoanalýza (EIA) Je to metoda, která je analogická technice přímé nebo nepřímé fluorescence. Místo fluorescenčního barviva je na protilátku navázán enzym (nejčastěji peroxidáza). Test se hodí k měření jak antigenu, tak protilátky. Má-li se měřit množství protilátky, je antigen navázán na pevnou fázi, inkubován s testovaným sérem a potom se nechá reagovat s antiimunoglobulinem konjugovaným s enzymem. Při stanovení antigenu se naváže na pevnou fázi protilátka, přidá se testovaný roztok obsahující antigen a k tomu enzymem značená protilátka. Výhody této metody jsou v její citlivosti (stanovuje se koncentrace v rozsahu ng/ml) (Bier aj., 1984).

32

Imunochemická metoda, která vyžaduje pro kvantifikaci děje oddělení volného reaktantu od jeho vázané formy, se označuje jako heterogenní. Naproti tomu metody, které tento krok nevyžadují, se nazývají homogenní.

Heterogenní enzymoimunoanalýza - ELISA ELISA byla poprvé představena v 60. letech 20. století a byla k dispozici jen zřídka. Nicméně dostupnost více citlivých barviv a substrátů v posledních letech zvýšila možnost jejího využití. ELISA se od PCR odlišuje v tom, že detekuje fenotypové vlastnosti patogenních mikroorganismů (Schmidt, Rodrick, 2003). K detekci antigenu nebo haptenu se často požívá technika ELISA využívající kompetitivní vazebnou reakci na pevné fázi. U tohoto typu stanovení soutěží o vazbu na omezený počet vazebných míst na pevném povrchu imobilizovaných protilátek neznačený ligand s ligandem značeným enzymem. Po krátké inkubaci je separován volný komplex od komplexu vázaného. Po promytí je přidán substrát a enzym přítomný ve vázané frakci jej přemění na barevný produkt. Množství vzniklého produktu je nepřímo úměrné koncentraci neznačeného ligandu v testovaném vzorku. Absorbance standardů, kontrolních a testovacích vzorků je měřena na ELISA readru při příslušné vlnové délce. Referenční jamky, které obsahují jen konjugát ligandu s enzymem vykazují nejintezivnější zbarvení. Úbytky zabarvení v jamkách jsou úměrné množství nekonjugovaného antigenu. Nekompetitivní ELISA, známá pod názvem sendvičová technika je nejvíce používanou metodou ELISA pro stanovení antigenů, které mají nejméně dvě různé antigenní

determinanty.

Základem

stanovení

jsou

polystyrenové

kuličky

s adsorbovaným nadbytkem specifické protilátky (většinou monoklonální) proti antigenu. Tyto kuličky jsou specifické pro jednu antigenní determinantu na sledovaném antigenu. Vzorek je inkubován s kuličkami povlečenými protilátkou tak, až se všechen antigen ze vzorku naváže na imobilizované protilátky na kuličkách. Po odstranění nenavázaného materiálu se stanoví množství navázaného antigenu pomocí další enzymem značené protilátky, která je namířena proti druhé antigenní determinantě na stejném antigenu. Po druhé inkubaci a separaci nadbytečného nenavázaného konjugátu, je stanovena aktivita enzymu, který je navázán na sendviči, přidáním vhodného substrátu. Množství vzniklého produktu je přímo úměrné množství antigenu ve vzorcích. Změna zabarvení je přímo úměrná množství antigenu ve vzorku. Vhodným enzymem pro značení bývá alkalická fosfatasa (Zajoncová, 2004). 33

ELISA je v praxi využívána pro detekci patogenů a jejich toxinů v potravinách – hlavně průjmového enterotoxinu B. cereus a stafylokokových enterotoxinů (Anonym A, 2006).

Obr. 3 ELISA (Kodíček, 2007).

Homogenní enzymoimunoanalýza Antigen se kovalentně naváže na enzym v blízkosti jeho aktivního centra. Protilátka při své interakci s antigenem „zakryje“ nejen molekulu antigenu, ale i vazebné místo enzymu, takže enzym je potom inaktivní. Je-li však v systému přítomen antigen ze vzorku, potom se naváže na protilátku a část konjugátu antigen-enzym zůstane volná a enzym tudíž aktivní. Aktivita enzymu je tedy úměrná množství antigenu ve vzorku (Králová, Rauch, 1995).

Předpoklady správného provedení Pro správné provedení techniky ELISA je třeba splnit řadu předpokladů. Antigen nebo protilátka musí být navázán na povrch nerozpustného nosiče bez ztráty imunoreaktivity. Použité enzymy musí mít vysokou specifickou aktivitu, tj. přeměňují velká množství substrátu na detekovaný produkt. Stabilita enzymů a také imunologická reaktivita konjugátu musí být stabilní jak během reakce, tak i během jeho skladování. Aktivita enzymů, které jsou použity při značkování se nemůže přirozeně vyskytovat v analyzovaných biologických tekutinách (Zajoncová, 2004).

34

ELFA (enzyme linked fluorescent essay) Reakce je koncipována podobně jako ELISA, rozdíl je v použitém substrátu, který je enzymem štěpen na fluorescenční produkt. Vzniklé chemické změny jsou detekovány pomocí fotodiodového fluorimetru (McMeekin, 2003). ELFA se prakticky využívá např. v systému VIDAS (Soejima et al., 2003). Tato technika sysému VIDAS kombinuje: -

sendvičovou

techniku

k zachycení

antigenu

nebo

toxinu

patogenních

mikroorganismů mezi potaženými protilátkami a protilátkami konjugovanými s enzymem, který slouží jako indikátor; -

měření intenzity fluorescence plynoucí z katalýzy substrátu konjugovanými enzymy Metodou ELFA lze stanovit Listerie spp., L. monocytogenes, salmonely, E. coli

O175 a C. jejuni. (Raugel, 1999).

Systém VIDAS Testy jsou založeny na specifické reakci antigen-protilátka. Do přístroje VIDAS se vkládá reagenční strip a komůrka s pevnou fází (SRP). Reagenční strip obsahuje deset jamek. První z nich je prázdná, do ní se pipetuje vzorek. Dalších 8 jamek obsahuje reagenční nebo promývací roztoky a poslední jamka je optickou kyvetou, ve které je změřena reakce substrátu, a to na základě jeho fluorescenčního měření. SPR je plastové zařízení ve tvaru pipety, jehož vnitřek je potažen antigenem, který zachytí cílový analyt. Cílový analyt se označí antigenem konjugovaným s enzymem. Vznikne imobilizovaný enzym, který katalyzuje rozštěpení substrátu na fluorescenční konečný produkt. Chemické změny jsou detekovány pomocí fotodiodového fluorimetru (Anonym, 2006). Využívá se k detekci listerií, salmonel, Escherichie coli O157, rodu Campylobacter a stafylokokového enterotoxinu v potravinách (Raugel, 1999).

4.2.1.7 Průtoková cytometrie Průtoková cytometrie (anglicky flow cytometry) je perspektivní analytická a preparativní technika umožňující rychlá a multiparametrická měření optických vlastností mikroskopických částic, zejména buněk a jejich komponent. Konstrukce moderních cytometrů byla podmíněna pokroky v oblasti optiky, elektroniky a fluidiky. Vedle rychlosti analýz, která může dosahovat i několik desítek tisíc částic za sekundu, je významnou předností cytometrie schopnost třídit mikroskopické částice podle jejich 35

vlastností a v reálném čase (Doležel aj., 2007). Parametrem průtokové cytometrie může být fyzikální nebo chemická vlastnost buňky (granularita, obsah DNA, životnost, pH atd.) a vše co můžeme označit monoklonální protilátkou (povrchové molekuly diferenciačních antigenů, intracelulární molekuly včetně cytokinů atd.) (Anonym A, 2008). Metoda je založena na zachycení rozptylu světla bakteriálními buňkami s navázanými

protilátkami

značenými

fluorescenčními

barvivy:

fluoresceinisothiokyanát, rhodaminisothiokyanát apod. K dispozici jsou značené protilátky

proti

těmto

patogenům:

různým

serovarům

salmonel,

Listeria

monocytogenes, Campylobacter jejuni, Bacillus cereus (Komprda, 2003).

4.2.1.8 Hygicult Rychlá terénní metoda mikrobiologické kontroly hygieny potravin. Test obsahuje destičku oboustranně pokrytou kultivačním médiem, která je zakotvena ve víčku sterilní nádobky. Odběr vzorku a inokulace se provádějí buď přitlačením destičky na testovaný povrch, ponořením do testovaných tekutin nebo smočením povrchu kultivačního média tekoucí vodou. Jedna zkumavka umožňuje odběr a kultivaci dvou vzorků. Výsledky jsou k dispozici po 24 hodinách inkubace (kvasinky a plísně – 3-5 dnů) – bez další manipulace se vzorky. Po inkubaci se výsledky snadno vyhodnotí porovnáním výsledku s modelovou tabulkou (Anonym A, 2007). Kromě snadné použitelnosti patří k přednostem testu jeho hospodárnost, protože odstraňuje problémy s transportem vzorku, pracnou přípravu kultivačních médií, nákladnou sterilizaci a problémy s počítáním kolonií při vyhodnocování výsledků. Hygicult se uchovává při pokojové teplotě a nevyžaduje speciální přípravu. Pro zjištění celkového počtu mikroorganismů je určen Hygicult TPC. Velká výhoda tohoto Hygicultu je, že použitý agar obsahuje látky eliminující vliv biocidních látek nebo čistících prostředků, které při testování právě vyčištěné plochy mohou ulpět na agaru. Inkubace probíhá v termostatu 24 – 48 hodin při teplotě 35 – 37 °C. Hygicult E/β-GUR má testovací destičku z jedné strany pokrytou agarem k průkazu bakterií čeledi Enterobacteriaceae, z druhé strany je destička pokryta bezbarvým agarem k průkazu bakterií produkujících β-glukuronidázu. Inkubace se provádí v termostatu 24 - 48 hodin při teplotě 35 – 37 °C.

36

Pro stanovení samotné čeledi Enterobacteriaceae se používá Hygicult E. Inkubace se provádí v termostatu 24 – 48 hodin při teplotě 35 – 37 °C (Demnerová, 2008).

4.2.1.9 Petrifilm Destičky pro přesnou kontrolu mikrobiologické kvality potravin nebo prostředí potravinářských provozů. Jedná se o médium přímo připravené k inokulaci vzorků. Destičky se skládají ze dvou vrstev filmů, které obsahují živná média, gel rozpustný ve studené vodě a speciální indikátor, který zvýrazní narostlé kolonie mikroorganismů na destičce. Natištěná mřížka usnadní počítání kolonií.

K detekci kontaminace potravin patogenními mikroorganismy se využívá:


Petrifilm Coliform Count Plate (PFCC) – k určení počtu koliformních bakterií,




Petrifilm Enterobacteriaceae Count Plate (PFE) – k určení celkového počtu bakterií Enterobacteriaceae,




Petrifilm E. coli Count Plate (PFEC) – k určení celkového počtu koliformních bakterií a bakterií E. coli,




Petrifilm Selective E. coli Count Plate (PFSEC) – k selektivnímu určení bakterií E. coli,




Petrifilm High Sensitivity Coliform Count Plate (PFHSCC) – k určení počtu koliformních bakterií – destička s vyšší citlivostí,




Petrifilm P2000 Coliforms (P2000 CC) – k velmi rychlému stanovení počtu koliformních bakterií (Anonym A, 2007).

4.2.1.10 Chromogenní a fluorogenní živné půdy Schopnost zjistit přítomnost specifického enzymu použitím vhodných substrátů, zvláště fluorogenních a chromogenních enzymových substrátů, vedlo k rozvoji velkého množství metod k identifikaci mikroorganismů ještě v primárních izolačních médiích. Začlenění takových substrátů do selektivního média může eliminovat potřebu subkultury

a

napomoci

biochemickým

testům

prokázat

totožnost

některých

mikroorganismů. Fluorogenní enzymové substráty se obvykle skládají ze specifického substrátu pro určitý enzym, jako je cukr nebo aminokyselina a fluorescenčního barviva (4-methylumbelliferon), které je schopno přeměnit UV záření ve viditelné světlo. 37

Methylumbelliferyl-substráty jsou rozpustné ve vodě, vysoce citlivé a velmi specifické. Kvůli jejich závislosti na pH, silné difuzi v pevných médiích a potřebě UV-záření, je použití těchto substrátů omezeno. Chromogenní enzymové substráty jsou směsi, které slouží jako substráty pro určité enzymy a mění barvu následkem působení enzymu. V závislosti na jejich chemické reakci jsou rozeznávány čtyři skupiny chromogenních směsí. Deriváty indolylu jsou rozpustné ve vodě a termostabilní, nejvíce používané deriváty jako je 5bromo-4-chloro-3-indolyl,

5-bromo-6-chloro-3-indolyl

nebo

6-chloro-3-indolyl

nevykazují žádnou difuzi na agarovém médiu (Manafi, 2000).

Příklady některých testů: •

Stanovení koliformních bakterií a E.coli

Pro stanovení počtu E.coli jako indikátorového mikroorganismu se k redukci doprovodné mikroflóry využívá obvykle inhibičního účinku zvýšené kultivační teploty 44°C a inhibičního účinku buď žlučových solí nebo terigolu. Další krok je založen buď na průkazu indolu nebo na průkazu β-D-glukuronidázy. Existují 2 způsoby detekce enzymu β-D-glukuronidázy: -

na základě fluorescence methylumbelliferonu (v UV světle - 366 nm) jakožto štěpného produktu fluorogenního substrátu 4-methylumbelliferyl-β-D-glukuronidu (zkratka MUG) - princip systému Fluorocult.

-

na základě barevné reakce štěpného produktu kondenzátu kyseliny glukuronové s 5-bromo-4-chloro-3-indolem (výsledkem štěpení je modře zbarvený halogenový derivát indiga) - princip systému Chromocult.

Fluorocult LMX Současné stanovení koliformních bakterií a E.coli ve vodách a potravinách v jedné zkumavce je možno provádět pomocí tekutého kultivačního média Fluorocult LMX bujónu. Za pozitivní výsledek se považuje modrozelené zbarvení média. V případě, že se jedná o běžné koliformní bakterie, nevykazuje médium typickou fluorescenci - ta se objeví v případě přítomnosti E. coli.

38

Chromocult Koliformní agar Živné médium pro současné stanovení koliformních bakterií a E.coli, ve kterém jsou kombinovány dva chromogenní substráty - X-glukuronid a Salmon-GAL. Specifický enzym pro E.coli (β-D-glukuronidáza) štěpí oba substráty, takže produkty této hydrolýzy zbarvují kolonie tmavě modře až fialově. Enzym, který produkují ostatní koliformní bakterie (β-D-galaktosidáza) (Enterobacter, Citrobacter, Klebsiella), štěpí pouze substrát Salmon-GAL a kolonie se zbarvují červeně. Dále je možno identifikovat některé kmeny z rodu Salmonella, Shigella, Yersinia, které mají schopnost štěpit substrát X-glukuronid a jejíž kolonie mají světle modrou až tyrkysově modrou barvu.

Chromocult TBX agar Chromogenní

selektivní

médium

pro

stanovení

počtu

β-D-

glukuronidázopozitivních E.coli. Vedle tryptonu a žlučových solí je v půdě obsažen substrát X-glukuronid, jehož štěpný produkt způsobuje modrozelené zabarvení kolonií E.coli. Inkubace probíhá při zvýšené teplotě 44°C a výsledky je možno odečítat po 18 24 hodinách (Donát, 2001).

API Listeria test14 Tento test rozlišuje všechny druhy listerií běžnými biochemickými testy. Součástí komerčně dodávané sady je 10 mikrozkumavek. Každá obsahuje dehydratovaný chromogenní substrát pro testování enzymových reakcí nebo fermentace sacharidů, které jsou charakteristické pro jednotlivé druhy listerií. Jednotlivé testy sledují buď přítomnost enzymů (arylamidasy, mannosidasy, glukosidasy), nebo fermentaci následujících sacharidů: D-arabitolu, D-xylosy, rhamnosy, α-methyl-Dglukosidu, ribosy, glukosa-1-fosfátu, D-tagatosy.

RAPID L. mono test Princip detekce na médiu Rapid L. mono (Sanofi Diagnostics Pasteur) je založený na specifickém průkazu aktivity enzymu fosfolipasy (projevující se modrým zbarvením kolonií) a na schopnosti využívat xylosu, což se pozná tak, že se okolo bakteriálních kolonií vytvoří patrná žlutá zóna. Složení selektivního média inhibuje růst většiny interferující mikroflóry (G+, G. bakterie, kvasinky i plísně). L. monocytogenes vykazuje fosfolipasovou aktivitu a není schopná využívat xylosu, její kolonie mají proto čistě modrou barvu bez doprovodné „halo“ zony. Díky fosfolipasové aktivitě 39

a schopnosti využívat xylosu tvoří buňky L. ivanovii modrozelené kolonie se žlutou „halo“ zónou. Kolonie jiných druhů rodu Listeria mají barvu bílou; L. seeligeri a L. welshimeri s „halo“ zónou, L. innocua a L. grayi „halo“ zónu netvoří.

ALOA a COMPASS L. mono Agar ALOA (AES Laboratoire) a COMPASS L. mono Agar (Solanka) jsou diagnostická chromogenní média pro izolaci Listeria spp. a identifikaci Listeria monocytogenes. Jsou založena na průkazu β-glukosidasy, obsažené v buňkách všech druhů rodu Listeria a způsobující modré až modrozelené zabarvení kolonií. Listeria monocytogenes a Listeria ivanovii navíc tvoří působením fosfolipasy C specifické pro fosfatidylinositol (PI-PLC) kolem kolonií žlutou „halo“ zónu (Blažková aj., 2005). •

Stanovení Enterokoků

Jednoduchá detekce přítomnosti enterokoků je možná pomocí Chromocult Enterokokového bujónu. V bujónu obsažený substrát X-GLU (5-bromo-4-chloro-3indolyl-β-D-glukopyranosid)

je

štěpen

enzymem

β-D-glukosidázou,

který

je

charakteristický pro enterokoky. Výsledným efektem této reakce je změna barvy bujónu ze žluté na modrozelenou. Změna barvy bujónu tudíž potvrzuje přítomnost enterokoků a D-streptokoků ve vzorku. Doba detekce je poloviční ve srovnání s jinými běžně používanými metodami (Donát, 2001). 4.2.1.11 Imunomagnetická separace (IMS) Tato metoda je založená na principu vazby bakteriálních nebo jiných buněk na magnetické částice s imobilizovaným specifickými protilátkami. Vzniklý komplex je možné separovat ze suspenze pomocí vnějšího magnetického pole. Tato specifická separační technika umožňuje významné selektivní zkoncentrování cílových buněk. Díky tomu lze imunomagnetické separace úspěšně využít jako náhradu kroku selektivního pomnožení při kultivačním stanovení významných patogenních mikroorganismů, např. salmonel, Listeria monocytogenes nebo E. coli O157 (Anonym A, 2006).

4.2.1.12 Vysokoúčinná kapalinová chromatografie (HPLC – High performance liquid chromatography) Princip metody spočívá v pohybu látky (vzorku) v systému dvou fází (mobilní a stacionární). Mobilní fází je kapalina a stacionární fází může být pevná látka

40

i kapalina (nesmí být mísitelná s kapalnou látkou mobilní fáze a musí být zakotvena na vhodném pevném nosiči). Stacionární fáze je uložena v koloně, v níž prochází mobilní fáze za stálého tlaku. Na kolonu se nanáší stanovovaná látka, která je během migrace stále rozdělena na dvě fáze tak, že jedna část z této látky se pohybuje s mobilní fází zbytková část látky se sorbuje na stacionární fázi. Takto se vzorek rozdělí na určitý počet zón představující jednotlivé složky. Tyto zóny jsou snímány detektorem a převáděny na zapisovač pomocí píků. Poloha píku znázorňuje v chromatografu kvalitu a plocha množství zkoumané složky (Goldmann, 1999). Kapalinová chromatografie je jednou ze slibně se rozvíjejících metod stanovení stafylokokových enterotoxinů (SEs). Pro jejich stanovení byly zatím testovány metody využívající různé druhy kolon pro umístění stacionární fáze. Např. u afinitní chromatografie je využíván specifický receptor, jenž má schopnost vázat SEB, ke kterému má vysokou afinitu. V současné době byly pomocí chromatografických metod stanoveny zatím jen SEA a SEB (Balaban and Rasooly, 2000). Výhodou této metody je možnost kvalitativního i kvantitativního průkazu široké škály toxinů. Zatím však tato metoda není standardizovaná. Velkou nevýhodou HPLC je časová náročnost a vysoké požadavky na přístrojové vybavení. Navíc před vlastní analýzou vyžaduje příprava vzorků složité extrakční a purifikační postupy (Karpíšková a Pospíšilová, 2005). 4.2.1.13 Reverzní pasivní latexová aglutinace (RPLA) Reverzní pasivní latexová aglutinace se používá k detekci mikrobiálních toxinů, jako jsou shiga toxiny (produkující Sh. dysenterie a EHEC) a termolabilní a termostabilní toxiny E. coli. Částice latexu jsou potaženy králičím antisérem, které je reaktivní vůči cílovému antigenu. Z toho důvodu budou částice v přítomnosti antigenu aglutinovat a vytvářet síťované struktury. Ta se usazuje na dno mikrotitrační jamky tvaru V a má difúzní vzhled. Jestliže není přítomen antigen, objeví se pevná skvrna (Forsythe, 2000).

41

5. ZÁVĚR Cílem

předložené

bakalářské

práce

bylo

charakterizovat

patogenní

mikroorganismy a popsat nejnovější metody jejich detekce v potravinách. V práci

jsou

stručně

charakterizovány

mikroorganismy

a

zařazeny

do systematiky organismů. Další kapitola se zabývá mikrobiální kontaminací potravin. Dále jsou v práci popsány zdroje mikrobiální kontaminace potravin. Tyto zdroje mohou být primární nebo sekundární. K primární kontaminaci potravin dochází před jejich dodáním do potravinářského podniku, na druhé straně sekundárně jsou potraviny kontaminovány až při jejich zpracování a opracování. Patogenní mikroorganismy se dělí do tří skupin podle závažnosti onemocnění, které vyvolávají. U patogenů a podmíněných patogenů nejčastěji asociovaných s potravinami je uvedena jejich stručná charakteristika, možný výskyt, optimální podmínky jejich růstu a onemocnění, které způsobují. Další část práce se zabývá metodami detekce patogenních mikroorganismů v potravinách a jejich významem z hlediska prevence nákaz. Existují metody klasické a moderní (rychlé). Zatímco původní metody trvaly několik dnů, novými lze získat výsledky během několika hodin. Mnohé z těchto nových metod využívají polymerázovou řetězovou reakci (PCR - polymerace chain reaction), která se v této oblasti stala revolučním prostředkem, neboť umožňuje získat potřebná množství DNA i z velmi malých vzorků. Další metody využívají pro tyto účely techniku nazvanou hybridizace DNA. Testy založené na PCR se využívají pro potvrzení přítomnosti nebo absence sledovaných patogenů v potravinách. Výhodou imunologických metod je jejich vysoká specifita, citlivost a relativně snadná proveditelnost. Mezi nevýhody těchto metod patří občasný výskyt falešně pozitivních výsledků získaných např. použitím protilátek s nízkou specifitou. Jsou zde popsány metody, jako impedanční mikrobiologie, vysokoúčinná kapalinová chromatografie a reverzní pasivní latexová aglutinace. Dále průtoková cytometrie jejíž výhodou je vysoká rychlost detekce a schopnost separovat částice na základě zadaných parametrů. Metody využívající živná média, jako je metoda Petrifilm, Hygicult a fluorogenní a chromogenní živná média slouží k rychlému stanovení patogenních mikroorganismů ve vzorku, nevyžadují žádnou speciální přípravu a mohou být okamžitě použity.

42

6. SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY ALBERTS, B., BRAY, D., JOHNSON, A., LEWIS, J, RAFF, M, ROBERTS, K., WALTER, P. Základy buněčné biologie : úvod do molekulární biologie buňky. Ústí nad Labem: Espero Publishing, 1998. 630 s. ISBN 80-902906-0-4. ANONYM: Ústav biochemie a mikrobiologie. VŠCHT Praha, sborník 2006. ANONYM: Ústav lékařské chemie a biochemie. Genotypové rozlišení haptoglobinu, CUNI, 2008. Dostupný z WWW: . ANONYM: Rychlé metody stanovení patogenu. 2007. ANONYM: Multimediální učebnice DNA diagnostiky. 1. vydání, 2. lékařská fakulta UK,

Praha

1998

Dostupný

z WWW:


DNA/newlook/defa.htm>. ANONYM A: Interaktivní atlas potravinářské mikrobiologie. VFU Brno, 2006. Dostupný z WWW: . ANONYM A: Seznam výrobků. NOACK ČR, spol. s r. o., 2007. ANONYM A: FACS – Centrum průtokové cytometrie. 2008. Dostupný z WWW: . ANONYM B: PCR – Polymerázová řetězová reakce. Zdravotní ústav se sídlem v Ostravě, 2008. Dostupný z WWW:< http://www.zuova.cz/index.php>. ANONYM B: Izolace nukleových kyselin. Okologické centrum J.G.Mendela Nový Jíčín - Laboratoř molekulární biologie, 2008. BALABAN, N., RASOOLY, A. Staphylococcal enterotoxins. International journal of Food Mikrobiology, 2000, vol. 61, no. 1. BIER, O., DIAS da SILVA, W., GÖTZE, D., MOTA, I. Základy imunologie. 1. vydání Praha: Avicentrum, zdravotnické nakladatelství, 1984, 424 s. BLAŽKOVÁ, M., KARAMONOVÁ, L., FUKAL, L., RAUCH, P. Listeria monocytogenes: Nebezpečný patogen a jeho detekce v potravinách. Chem. Listy 99, 467 – 473, 2005. BOERLIN, P. Applications of multilocus enzyme electrophoresis in medical mikrobiology. J. mikrobiol meth 28 (3): 221-231, 1997. BURDYCHOVÁ, R., SLÁDKOVÁ, P. Mikrobiologická analýza potravin. 1. vydání Brno: Medelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně, 2007, 130 s., ISBN 978-807375-116-6.

43

CEMPÍRKOVÁ, R., LUKÁŠOVÁ, J., HEJLOVÁ, Š. Mikrobiologie potravin. 1. vydání České Budějovice: Jihočeská univerzita Zemědělská fakulta České Budějovice, 1997, 165 s. ISBN 80-7040-254-7. DEMNEROVÁ aj. Mikrobiologická bezpečnost potravin. Výživa a potraviny, 63, 2007, č. 1. DEMNEROVÁ, K. Hygicult – účinná pomoc při sledování bakteriální kontaminace potravin. Potravinářská revue 2008, č. 1. DOLEŽEL, J., GREILHUBER, J., SUDA, J. Flow Cytometry with Plant Cells: Analysis of Chromosomes, Genes and Genomes. AV ČR, v.v.i., Praha, 2007. DONÁT, J. Využití chromogenních a fluorogenních živných půd při mikrobiologickém vyšetřování vody a potravin. CHEMagazín, číslo 4, Ročník XI, 2001. FORSYTHE, S. J. The Microbiology of Safe Food. 1. vyd. London: Blackwell Science, 2000. 412 s. ISBN 0-632-05487-5. FRATAMICO, P.,M., BHUNIA, A.,K., SMITH, J.,L. Foodborne Pathogens – Mikrobiology and Molecular Biology. Caister Academic Press, 2005, 453 s., ISBN 1904455-99-X. GOLDMANN, I. Diplomová práce, MZLU ZF Lednice, 1999. GÖRNER, F. VALÍK, Ĺ. Aplikovaná mikrobiológia poživatin. Male centrum, 2004, 528 s. ISBN 80-967064-9-7. HILL W. E., JINNEMAN, K.C. Principles and Applications of genetic techniques for detection, identification, and subtyping of food-associated pathogenic microorganisms. In LUND, B. M., BAIRD-PARKER, T. C., GOULD, G. W. Microbiological Safety and Quality of Food, vol. 2, 2000, Springer – Verlag, Berlin. JIČÍNSKÁ,

E.,

HAVLOVÁ,

J.

Metody

detekce

patogenní

mikroorganismů

v potravinách. 1. vydání Praha: Ústav zemědělských a potravinářských informací, 1996. 115 s. ISBN 80-85120-49-6. KARPÍŠKOVÁ, R., POSPÍŠILOVÁ, M. Aktuální pohled na stafylokokové toxiny v potravinách. Souhrnná sdělení. 10. konference monitoringu a konference hygieny životního prostředí pořádaná SZÚ Praha, 2005. KLOUDA, P. Základy biochemie. 2. vydání Ostrava: Nakladatelství Pavel Klouda, Ostrava, 2005, 144 s., ISBN 80-86369-11-0. KODÍČEK, M. Biochemické pojmy – výkladový slovník Verze 2.0, 2007. ISBN 978-807080-669-2. Dostupný z WWW: .

44

KOMPRDA, T. Hygiena potravin – cvičen., 1.vydání Brno: Medelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně, 2005, 50 s., ISBN 80-7157-709-X. KOMPRDA, T. Obecná hygiena. 2. vydání Brno: Medelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně, 2007, 148 s., ISBN 978-80-7157-757-7. KOMPRDA, T. Hygiena potravin. 2. vydání Brno: Medelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně, 2000, 180 s., ISBN 80-7157-276-4. KRÁLOVÁ, B., RAUCH, P. Bioanalytické metody. 2. vydání Praha: VŠCHT Praha, 1995. 280s. ISBN 80-7080-234-0. LUKÁŠOVÁ, J. Význam mikrobiologie pro zajištění zdravotní nezávadnosti a jakosti potravin. Veterinářství 2004; 54. MANAFI, M. New development in chromogenic and fluorogenic culture media. International Journal of Food Microbiology 60, 2000. MCMEEKIN, T.A. Detection Pathogens in Food. 1st printing, Cambridge: Woodhead Publishing Limited, 2003, 384 p., ISBN 0-8493-1756-8. RACLAVSKÝ, V. Metody molekulární genetiky. Učební text, 2003. Dostupný z WWW: . RAUGEL, P. Rapid food analysis and hygiene monitoring : kits, instruments, and systems. Berlin: Springer Verlag, 1999. 921 s. ISBN 3-540-63253-0. SCHMIDT, R., H. and RODRICK, G., E. Food Safety Handbook. Publisher by John Wiley & Sons Publication, Inc., Hobojem, New Jersey, 2003, 850 s., ISBN 0-47121064-1. SOEJIMA, T., NAGANO, E., KUBOTA, T., YAMAGATA, H., KAGI, H. Comparison between ultrafiltration and trichloroacetic acid precipitation method for concentration of Staphylococcus aureus enterotoxin in dairy symplex. International Journal of Food Mikrobiology, 2004, vol. 93, no. 2. SOUTHERN, E. Gel elektrophoresis of restriction fragments. Methods Enzymol., 1979, 68, 152-176. ŠILHÁNKOVÁ, L. Mikrobiologie pro potravináře a biotechnology. 3. vydání Praha: Academia, 2002, 335 s. ISBN 80-200-1024-6. WEAVER, R. F., HEDRICK, P. W. Genetics. 3. vyd. Dubuque: WCB, 1997. 17 s. ISBN 0-697-16000-9. ZAJONCOVÁ, L. Imunochemické metody – doplňky ke skriptům „Praktická cvičení z klinické biochemie pro biochemiky“, 2004, 17 s.

45