Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav technologie potravin
Využití FT NIR spektroskopie v mlékárenském průmyslu Disertační práce
Vedoucí práce: doc. Ing. Květoslava Šustová,Ph.D.
Brno 2012
Vypracovala: Ing. Monika Kozelková
PROHLÁŠENÍ Prohlašuji, že jsem disertační práci téma „Využití FT NIR spektroskopie v mlékárenském průmyslu“ vypracovala samostatně a použila jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém seznamu literatury. Disertační práce je školním dílem a může být použita komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího disertační práce a děka Agronomické fakulty Mendelovy univerzity v Brně. V Brně dne …………………… Podpis doktoranda ………………
Zpracovaná disertační práce byla finančně podpoře z prostředků specifického vysokoškolského výzkumu prostřednictvím projektu IGA AF č. TP 10/2010 a č. IP 12/2011.
MÉ PODĚKOVÁNÍ PATŘÍ školitelce paní doc. Ing. Květoslavě Šustové, Ph.D. za odborné vedení mého doktorandského
studia,
cenné
rady
a připomínky,
při zpracování
výsledků
a při tvorbě této disertační práce. Také si cením její vstřícnosti a podpory v nesnázích, které mne v průběhu doktorského studia potkaly. Ing.
Táně
Lužové,
Ph.D.
vděčím
za
předání
zkušeností
s prací
spektrofotometru FT NIR Antaris a obdivuji její schopnost pomoci člověku v každé situaci. Panu Prof. Kuchtíkovi z Ústavu chovu hospodářských zvířat, MENDELU v Brně, firmě A.W.spol. s.r.o. v Lošticích a firmě ELIGO a.s. Brno, za poskytnutí vzorků k analýzám. Paní Laďce Pospíškové za výpomoc při nekonečných analýzách, Ing. Anetě Bubeníčkové, Ph.D., Ing. Haně Konečné a Ing. Daniele Strnadové, Ing. Mirku Jůzlovi, Ph.D. a ostatním spolupracovníkům Ústavu technologie potravin, kteří mě podporovali během studia. V neposlední řadě děkuji také svým rodičům a bratrovi, bez jejichž pomoci, bych nemohla studovat, příteli Bc. Ondrejovi Škultétymu za jeho všestrannou pomoc a trpělivost, Bc. Haně Burkoňové, Bc. Kláře Bařicové a Bc. Vendule Smékalové, Dis a ostatním přátelům, za povzbuzení a ohledy během celého mého doktorského studia.
ABSTRAKT Cílem doktorské práce bylo ověřit a zhodnotit možnosti použití NIR spektroskopie v mlékárenském průmyslu. Kvantitativný kalibrace byly vytvořeny pro stanovení koncentrace, anebo fyzikálních parametrů ovčího a kozího mléka, mražených krémů, Olomouckých tvarůžků, sušené sladké syrovátky, syřidel a vytvořených sýřenin. Referenčními metodami byly stanoveny základní složky, jako sušina, tuk, bílkoviny, laktosa, atd., ale i minoritní složky, jako např. mastné kyseliny, a také fyzikální vlastnosti jako pH, ° SH. Některé referenční hodnoty byly vypočteny základě hodnot z referenčních analýz, jako např. procento vody, síla a dávka syřidla, anebo teoretická výtěžnost sýřeniny. Všechny vzorky byly proměřeny spektrofotometru FT NIR Antaris ve spektrálním rozlišení 10 000 – 4 000 cm-1
s možností
měření
vzorků
v režimu
reflektance,
transmitance
a interaktance. Pro tvorbu kalibrací byl použit algoritmus metody částečných nejmenších čtverců (PLS) a pro ověření kvality predikce kalibrací byla použita křížová validace. Ve většině případů byly vyvinuty velmi dobré kalibrace, jejichž korelační koeficienty byly v rozmezí od 0,858 – 0,999. Některé kalibrace byly méně přesné, ale přesto použitelné, alespoň pro orientační stanovení hodnot. Výsledky práce potvrzují vhodnost NIR spektroskopie pro využití v mlékárenském průmyslu. Kvalitativním hodnocení výrobků pomocí Diskriminační analýzy jsme ověřovali schopnost FT NIR spektrofotometru přiřadit analyzovaná spektra do předem definovaných tříd a tím stanovit rozdíly mezi skupinami vzorků. U Olomouckých tvarůžků byly stanovovány rozdíly mezi různými fázemi výroby, rozdílným formováním (tyčinky a kolečka) a také rozdíly mezi tvarůžky vyrobenými z jarního a letního mléka. Dále jsme stanovovali rozdíl mezi jednotlivými syřidly a určovali, zda je FT NIR spektrofotometr schopen rozeznat i druh syřidla (pepsinové a chymosinové; přírodní a mikrobiální). U sýřenin jsme se snažili stanovit jejich rozdíl v závislosti použití syřidla pro zasýření mléka. Opět bylo potvrzeno, že NIRS metoda lze použít i pro hodnocení kvalitativních vlastností potravin Klíčová slova: NIRS, kvantitativní a kvalitativní analýza, mléčné výrobky, syřidlo
ABSTRACT The aim of this thesis was to verify and evaluate the possibilities of FT NIR spectroscopy usage in dairy industry. The quantitative calibrations were developed to determinate concentration or physical parameter of sheep and goat milk, ice cream, Olomouc curd-cheese, dry sweet whey, rennet and made curds. Moisture content or dryness (for the nature of the product), fat, protein, lactose etc. as well as some other minority components such as fatty acid or physical properties (pH and titrable acidity) were established as the reference methods of the major components. Some reference values were calculated based on the values of the reference analysis e.g. percentage of water, strength and dose of rennet or theoretical yield of curd. All samples were measured by the spectrophotometer FT NIR Antaris in a spectral resolution 10 000 – 4 000 cm-1 and in the reflectance, transmittance and interactance mode. The calibration models for each component were created by using Partial least squares (PLS) algorithm and as well as cross-validation was used for verification of quality prediction of calibrations. Very good results were obtained for almost all the calibrations where all the correlation coefficients were between 0.858 to 0.999. Some calibrations were less accurate but still usable at least for the approximate determination of values. The results of this thesis confirm the suitability of FT NIR spectroscopy for dairy industry usage. By using discriminant analysis in order to obtain qualitative evaluation of products we were verifying the ability of FT NIR spectrophotometer to classify analyzed spectrum in to pre-defined classes and thus to determine differences between groups of samples. For the Olomouc curd-cheese we found differences between the various stages of production, different formation (stick and wheels) as well as differences between cheese made from spring and summer milk. Furthermore, we were looking at differences within the rennet and discovered whether we are or we are not able to discern different types of rennet. We also tried to find the differences for curds depending on usage of rennet. It was confirmed again that the NIRS method can be also used for evaluation of qualitative properties of food. Key words: NIRS, qualitative and quantitative analysis, dairy products, rennet
OBSAH 1 ÚVOD ....................................................................................................................... 8 2 CÍL PRÁCE........................................................................................................... 10 3 LITERÁRNÍ PŘEHLED ..................................................................................... 11 3.1 Infračervená spektroskopie ........................................................................... 11 3.1.1 Historie infračervené spektroskopie ........................................................... 11 3.1.2 Teorie a principy infračervené spektroskopie ............................................ 13 3.1.2.1 Vibrace ........................................................................................ 14 3.1.2.2 Infračervené spektrum ................................................................ 17 3.2 Blízká infračervená spektroskopie ................................................................ 18 3.2.1 NIR spektra potravin .................................................................................. 19 3.2.2 Spektrofotometry........................................................................................ 20 3.2.2.1 Disperzní infračervené spektrofotometry .................................... 21 3.2.2.2 Spektrofotometry s Fourierovou transformací............................ 21 3.2.2.3 FT NIR Antaris ............................................................................ 26 3.2.3 Techniky měření NIR spekter .................................................................... 26 3.2.4 Výhody a nevýhody NIR spektroskopie .................................................... 28 3.3 Aplikace NIR spektroskopie..................................................................... 29 3.3.1. Historie NIR spektroskopie v potrav. průmyslu a zemědělství .............. 29 3.3.2 Aplikace základě kvantitativní analýzy ................................................. 31 3.3.2.1 Kvantitativní analýzy v mlékárenském průmyslu ........................ 33 3.3.3 Aplikace základě kvalitativní analýzy ...................................................... 48 3.3.3.1 Kvalitativní analýzy v mlékárenském průmyslu .......................... 51 3.4 Chemometrie ................................................................................................... 61 3.4.1 Tvorba kalibrace......................................................................................... 62 3.4.2 Úprava NIR spektra.................................................................................... 64 3.4.2.1 Redukce velikost částic .............................................................. 65 3.4.2.2 Derivace spekter ......................................................................... 66 3.4.3 Kvantitativní analýza ................................................................................. 66 3.4.3.1 Metoda částečných nejmenších čtverců ...................................... 67 3.4.4 Kvalitativní analýza ................................................................................... 69 3.4.4.1 Diskriminační analýza ................................................................ 70 3.4.5 Kritéria pro hodnocení spolehlivosti kalibračního modelu ........................ 71 3.4.5.1 Korelační koeficient .................................................................... 72 3.4.5.2 Směrodatná odchylka kalibrace ................................................. 72 3.4.5.3 Křížová validace ......................................................................... 72 3.4.5.4 Směrodatná odchylka predikce ................................................... 73 3.4.5.5 Kalibrační a predikční variační koeficient ................................. 74 3.4.5.6 PRESS (predicted residual sum of squares) ............................... 74 3.4.6 Identifikace odlehlých standardů ............................................................... 75 3.4.7 Dvouvýběrový párový T-test střední hodnotu .......................................... 76
4 MATERIÁL A METODIKA ............................................................................... 78 4.1 Materiál ........................................................................................................... 78 4.1.1 Ovčí mléko ................................................................................................. 78 4.1.2 Kozí mléko ................................................................................................. 79 4.1.3 Mražené krémy........................................................................................... 80 4.1.4 Olomoucké tvarůžky .................................................................................. 81 4.1.5 Sušená sladká syrovátka ............................................................................. 82 4.1.6 Syřidla a sýřeniny....................................................................................... 83 4.1.6.1 Syřidla ......................................................................................... 83 4.1.6.2 Sýřeniny....................................................................................... 85 4.2 Metodika .......................................................................................................... 86 4.2.1 Referenční analytické metody .................................................................... 86 4.2.1.1 Ovčí mléko .................................................................................. 86 4.2.1.2 Kozí mléko ................................................................................... 86 4.2.1.3 Mražené krémy ............................................................................ 87 4.2.1.4 Olomoucké tvarůžky .................................................................... 87 4.2.1.5 Sušená sladká syrovátka ............................................................. 88 4.2.1.6 Syřidla a sýřeniny ....................................................................... 88 4.2.2 Měření NIR spekter .................................................................................... 90 4.2.2.1 Ovčí mléko .................................................................................. 90 4.2.2.2 Kozí mléko ................................................................................... 91 4.2.2.3 Mražené krémy ............................................................................ 91 4.2.2.4 Olomoucké tvarůžky .................................................................... 92 4.2.2.5 Sušená sladká syrovátka ............................................................. 92 4.2.2.6 Syřidla a sýřeniny ....................................................................... 92 4.2.3 Statistické vyhodnocení výsledků .............................................................. 93 5 VÝSLEDKY A DISKUSE .................................................................................... 94 5.1 Ovčí mléko ....................................................................................................... 94 5.2 Kozí mléko ..................................................................................................... 103 5.3 Mražené krémy ............................................................................................. 111 5.4 Olomoucké tvarůžky .................................................................................... 120 5.4.1 Kvantitativní analýzy Olomouckých tvarůžků......................................... 122 5.4.2 Kvalitativní analýzy Olomouckých tvarůžků........................................... 127 5.5 Sušená sladká syrovátka .............................................................................. 131 5.6 Syřidla a sýřeniny ......................................................................................... 139 5.6.1 Syřidla ...................................................................................................... 139 5.6.1.1 Kvantitativní analýzy syřidel..................................................... 143 5.6.1.2 Kvalitativní analýzy syřidel....................................................... 154 5.6.2 Sýřeniny ................................................................................................... 157 5.6.2.1 Kvantitativní analýzy sýřenin .................................................... 157 5.6.2.2 Kvalitativní analýzy sýřenin ...................................................... 161 6 ZÁVĚR ................................................................................................................ 163 7 PŘEHLED POUŽITÉ LITERATURY ............................................................ 167 8 SEZNAM POUŽITÝCH TABULEK................................................................ 191 9 SEZNAM POUŽITÝCH OBRÁZKŮ ............................................................... 193 10 SEZNAM POUŽITÝCH ZKRATEK ............................................................. 197 PŘÍLOHY ............................................................................................................... 201
ÚVOD
1 ÚVOD V poslední době se stala široce diskutovaným tématem kvalita potravin, ale i surovin a meziproduktů, což je nepochybně dobře. Není ale vždy jednoduché zajistit rychlé a efektivní analýzy pro kontrolu požadovaných parametrů kvality. Klasické metody jsou přesné a reprodukovatelné, ale mnohdy velmi zdlouhavé a jejich výsledky jsou známy, až když je analyzovaný produkt vyroben, takže jen velmi těžko zabráníme jeho výrobě, pokud by nějakým způsoben nesplňoval požadavky jakost. Proto se v poslední době stále více prosazuje použití metod, které jsou dostatečně vhodné pro rutinní analýzy, avšak časově nenáročné, a proto je lze použít přímo při výrobě potravin on - line v potravinářských provozech. Mezi tyto metody můžeme řadit i infračervenou spektroskopii, která je jednoduchá a přesná, s jejíž pomocí můžeme stanovit široké spektrum organických složek potravin, krmiv, produktů a souvisejících materiálů. Praktické použití NIR spektroskopie v mlékárenském průmyslu je zaměřeno hlavně stanovení majoritních složek (sušiny, tuku, bílkovin, laktosy), ale v poslední době jsou velmi často publikovány aplikace, pro stanovení také minoritních složek. Užití NIRS je široké také v medicíně a v mnoha průmyslových odvětvích, včetně farmaceutického, petrochemického, kosmetického a chemického průmyslu. Spektrometrie v blízké infračervené oblasti je instrumentální metoda, která využívá vlnových délek 800 – 2 500 nm, tj. 12 500 – 4 000 cm-1 a fyzikálně je založe absorpci (pohlcení), nebo reflexi (odrazu) elektromagnetického záření, kde materiál v závislosti složení, pohlcuje nebo odráží specifické vlnové délky. V NIR spektrech potravin dominují absorpční pásy skupin, které obsahují především chemické vazby: C – H (tuky, oleje, sacharidy), O – H (voda, alkoholy) a N – H (bílkoviny). Prostřednictvím vhodného softwaru poskytuje FT NIR spektrofotometr velmi dobré výsledky, jak v oblasti kvantitativních, tak i kvalitativních analýz. Její nespornou výhodou je rychlost, nedestruktivnost a schopnost analýzy více parametrů najednou. Má také své nevýhody, které jsou vztaženy zejmé vhodnosti a přesnosti referenční metody, která byla použita pro vývoj kalibrací NIR spektrofotometru. Disertační práce byla zaměře využití blízké infračervené spektroskopie při hodnocení kvalitativních a kvantitativních parametrů mléka, mléčných výrobků,
8
ÚVOD
ale i pomocných látek potřebných v mlékárenství z technologických důvodů. Práce by
měla
přispět
k ověření
a rozšíření
možnosti
využití
NIRS
metody
v mlékárenském průmyslu, jak pro kvantitativní, tak i kvalitativní hodnocení produktů.
9
CÍL PRÁCE
2 CÍL PRÁCE Cílem disertační práce bylo rozšířit možnosti využití FT NIR spektroskopie v mlékárenském průmyslu při kontrole kvalitativních a kvantitativních parametrů mléka, mléčných výrobků, ale i pomocných látek potřebných v mlékárenství z technologických důvodů. Byly stanoveny následující dílčí cíle: Prostudovat dostupnou odbornou literaturu zabývající se studiem NIR spektroskopie. Stanovit s vysokou přesností referenční hodnoty vybraných vzorků ovčího a kozího mléka, mražených krémů, Olomouckých tvarůžků, sladké syrovátky a syřidel a sýřenin v chemické laboratoři a následně tyto vzorky analyzovat NIR spektrofotometru. Na základě porovnání referenčních hodnot a spektrálních charakteristik vzorků vytvořit kalibrační modely a jejich funkčnost ověřit křížovou validací. Statisticky vyhodnotit výsledky. Pomocí metody Diskriminační analýzy vyzkoušet citlivost FT NIR spektrofotometru k hodnocení a rozeznání předem definovaných skupin vzorků Olomouckých tvarůžků, sýřenin a syřidel a pomocí grafů vyhodnotit vytvořené kalibrační modely kvalitativní analýzy. Zhodnotit vhodnost využití metod v praxi.
10
LITERÁRNÍ PŘEHLED
3 LITERÁRNÍ PŘEHLED 3.1 Infračervená spektroskopie 3.1.1 Historie infračervené spektroskopie Roku 1648 JAN MAREK MARCI z Lanškrou popisuje ve svém díle Thaumantias seu liber de arcu coelestipolis dosti podrobně rozklad světla. Uvádí, jak se světlo po průchodu trojbokým hranolem rozloží barvy a popisuje sled barev jako analogii s duhou obloze. Ukazuje, že rozklad světla vzniká jeho lomem ve skle hranolu a zachovává se pořadí barev. Je tedy naprosto zřejmé, že priorita tohoto objevu náleží Markovi 24 let před NEWTONEM (1672) (VALNÍČEK, 2006). Před rokem 1800 nikdo dokonce ani netušil, že existují neviditelné formy světla za hranicí viditelného spektra. Objev byl nečekaným výsledkem pokusu, který v roce 1800 provedl britský astronom a skladatel německého původu WILLIAM FREDERIK HERSHEL, známý svým objevem planety Uran (HART – DAVIS, 2011). Při zkoumání, která z barev UV záření přináší teplo ze slunce, použil k rozkladu světla optický hranol, zčernalou žárovku a teploměr, kterým měřil teplotu každé z rozložených barev. Pozoroval lehké zvýšení teploty skrz spektrum, ale zdaleka nedosáhl teploty, kterou dodával přímý slunečný svit. Avšak když nechal omylem termometr při odchodu oběd kousek vedle červené části UV spektra, tak po návratu nalezl výrazné zvýšení teploty. Herschel tuto oblast označil jako "tepelné paprsky", později však byla přejmenová oblast
„infračervenou“
(PASQUINI,
2003).
Herschelova
práce
s názvem „Experiments on the Refrangibility of the Invisible Rays of the Sun“ byla sice publiková 24. břez 1800 v Royal Society, ale poté byla v podstatě zapomenuta, protože ať bylo toto záření jakkoliv zajímavé, nový pohled povahu světla nebyl přijat, protože tehdejší fyzika nepřijala existenci záření neviditelného lidským okem (PASQUINI, 2003; HARD – DAVIS, 2009). Roku 1881 změřili ABNEY a FESTING fotograficky NIR spektrum v rozmezí 700 – 1 200 nm. Spektroskopie, založená rozkladu světla se stala v průběhu 19. století po objevech FRAUNHOFERA, KIRCHHOFFA a BUNSENA jednou ze základních analytických metod (VALNÍČEK, 2006). Od roku 1912 vzrůstá zájem o výzkumy zabývající se molekulární strukturou organických sloučenin pomocí infračervené
11
LITERÁRNÍ PŘEHLED spektroskopie. COBLENTZ provedl několik studií, jejichž výsledky vedly k přesnému měření infračervených spekter pro stovky anorganických a organických sloučenin a ověřil užitečnost absorpce pro identifikaci funkčních skupin organických látek. Následující desetiletí přineslo plodnou sérii několika publikací, které shrnovali studie o přímém stanovení a možnosti měření vlastností neporušeného biologického materiálu pomocí infračervené spektroskopie. Jedná se zejmé o publikace KAYE, který shrnul využití NIR spektroskopie od konce 1920 do dub 1954, GODDU shrnul využití NIR spektroskopie před rokem 1960, WHETSEL před rokem 1968 a STARK společně s dalšími autory shrnul využití blízké infračervené analýzy (NIRA) před rokem 1986 (uvedené autory cituje WORKMAN, 2005). Větši infračervených spektroskopů používaných do roku 1970 používala jako monochromátor hranol nebo mřížku. Zásadní průlom v IR technologii bylo zavedení infračervených spektroskopů s Fourierovou transformací (FT IR). Roku 1800 ALBERT MICHELSON zkonstruoval interferometr studiu rychlosti světla. O dva roky později RAYLEIGH zjistil, že výstup z interferometru může být převeden spektrum
matematickým
postupem
vyvinutým
francouzským
matematikem
JEANEM BAPTISTEM JOSEPHEM FOURIEREM, který přišel
výpočetní
algoritmus tzv. Fourierovu transformaci. Kvůli složitosti matematické operace Fourierovy transformace se tento postup nevyužíval až do roku 1949. Teprve roku 1952 francouzský fyzik FELLGETT zkonstruoval infračervený spektrometr s Fourierovou transformací, jehož součástí byl interferometr Michelsonova typu. Fellgett také objevil multiplexní výhodu FT IR spektroskopie, což znamená, že všechny vlnové délky ze zdroje jsou v interferometru měřeny současně a je možno zjistit
informace
o celém
spektrálním
rozsahu,
zatím
co
v disperzním
spektrofotometru se měřili postupně. O několik
let
později
francouzský
vědec
JACQUINOT
poukázal
energetickou výhodu interferometrie. V disperzním spektrometru dopadá detektor jen malá část záření, kdežto v FT IR přístrojích toto omezení odpadá a optická průchodnost systému je limitová hlavně velikostí zrcadel. V roce 1964 JAMES COOLEY a JOHN TUKEY objevili rychlý algoritmus Fourierovy transformace, čímž zkrátili čas pro počítačový výpočet IČ spektra z hodiny několik málo sekund. Ale i tak to byl stále dosti časově náročný proces, protože zaznamenaný
12
LITERÁRNÍ PŘEHLED interferogram papírové pásce nebo děrované kartě se musel odnést do výpočetního střediska a tam se čekalo výpočet a vykreslení spektra. Další významná změ přišla roku 1969, když byl sestaven první komerční FT IR spektrofotometr se speciálním minipočítačem, prodávaný jako Digilab. Tehdy poprvé bylo vidět v infračervené spektroskopii vykreslené spektrum krátce té, co byl změřen interferogram. Od té doby díky dalšímu rozvoji výpočetní techniky společně se snížením cen došlo k velkému rozšíření komerčních FT IR spektrometrů trhu pro široké použití FT IR spektroskopie ve všech oborech vědy a techniky (uvedené autory cituje DERRICK et al., 1999). V průběhu 2. poloviny 19. století a v prvé polovině 20. století byla infračervená spektroskopie natolik propracována, že se stala nepostradatelnou v chemické a fyzikální laboratoři a v řadě oborů technologických (VALNÍČEK, 2006). Na Obr. 1 v příloze, jsou názorně znázorněny významné historické události, které vedly k vzestupu infračervené spektroskopie. Analýza potravin je jedním z oborů kde se FT IR spektroskopie využívá jak kvantitativnímu, tak i kvalitativnímu hodnocení potravin. VAN DE VOORT roku 1992 sepsal komplexní přehled různých aplikací FT IR spektroskopie v analýze potravin. 3.1.2 Teorie a principy infračervené spektroskopie Infračervená spektrometrie je spektrální metoda založená schopnosti látky pohlcovat záření o vlnových délkách (λ) 800 nm až cca 1 mm. Jedná se o absorpci elektromagnetického vlnění, jež označujeme jako záření infračervené (IČ), a které je vymezeno hodnotami vlnočtů (ν = 1/λ) 12 500 – 10 cm-1 (MATĚJKA et DENDISOVÁ, 2010). Infračervená oblast se dále dělí tři podoblasti, které uvádí Tabulka 1. Tab. 1 Rozdělní infračervené oblasti (OSBORN, FEAM, 1986). Oblast
Vlnová délka (nm)
Vlnočet (cm-1)
Blízká infračervená (NIR)
730 – 2 500
14 300 – 4 000
Střední infračervená (MIR)
2 500 – 5.104
4 000 – 200
Daleká infračervená (FIR)
5.104 – 106
200 – 10
Energie fotonů infračerveného záření (1 – 60 kJ/mol) nepostačuje pro excitaci elektronů v molekulových orbitalech, ale je dostatečná změně vibračního stavu
13
LITERÁRNÍ PŘEHLED (z klasického pohledu zvětšení amplitudy vibrace molekuly) či rotačního stavu molekuly (ke zrychlení rotace molekuly). Uvědomíme-li si, že molekuly jsou tvořeny atomy, které nejsou spojeny rigidními vazbami, ale tyto vazby vykazují určitou pružnost, máme před sebou systém atomů, které mohou různými způsoby vibrovat (KANIA, 2007). Infračervená spektra sledují závislost transmitance nebo absorbance vlnočtu absorbovaného záření. Spektrum je pásové a pásy odpovídají různým typům vibračních přechodů. Rotační přechody mají malý význam a lze je měřit pouze v plynech. V kapalinách a tuhých látkách splývají v kontinuum v důsledku interakcí molekul. Ve spektrech tedy převažují vibrační přechody. 3.1.2.1 Vibrace molekul Vibrační pohyb se u dvouatomové molekuly popisuje modelem harmonického oscilátoru (2 kuličky spojené pružinou viz. Obr. 1).
Obr. 1 Znázornění modelu harmonického oscilátoru (MILDE, 2008). Předpokládá se, že oba atomy sebe působí ve směru vazby silou, která je úměrná odchylce délky vazby (x0) od rovnovážné polohy. Konstanta této úměrnosti k se nazývá silová konstanta (N/m). Tato soustava vykonává vibrační pohyb (mění se délka vazby) s jedinou frekvencí ν:
=
1 2
. = m A mB
k
m A + mB
kde µ je redukovaná hmotnost a k silová konstanta (MILDE, 2008). Frekvence vibrace dvouatomové molekuly tedy závisí síle poutající atomy, tj. typu chemické vazby, a druhu (hmotnosti) vibrujících atomů. Při vibraci dochází k vychýlení atomů z rovnovážné polohy. Potenciální energie v případě harmonického
14
LITERÁRNÍ PŘEHLED oscilátoru je kvadratickou funkcí této výchylky. Grafickým znázorněním této vzdálenosti je parabola s minimem v rovnovážném stavu systému. Na obrázku 2 lze vidět průběh křivky potenciální energie harmonického a anharmonického oscilátoru.
Obr.
2
Znázornění
křivky
průběhu
potenciální
energie
harmonického
a anharmonického oscilátoru (KLOUDA, 2003). Při kvantově-mechanickém popisu v aproximaci harmonického oscilátoru je jeho energie kvantová a nabývá hodnot: 1 E v = h v n 2
kde h je Planckova konstanta (6,626*1031 J/s), ν je frekvence oscilátoru a n je vibrační kvantové číslo (n = 0, 1, 2,…). Pro rozdíl energetických harmonického oscilátoru platí:
E v = h v
U harmonického oscilátoru jsou možné pouze vibrační přechody, při nichž se vibrační kvantové číslo n mění o jedničku (Δn = 1), což jsou přechody mezi sousedními vibračními hladinami. Frekvence absorbovaného záření se tedy musí rovnat frekvenci vibrace molekuly. Absorpcí energie se zvýší amplituda vibrací, frekvence však zůstává nezměněna. Tyto frekvence, které odpovídají přechodům mezi
základním
a prvním
excitovaným
stavem,
se nazývají
základní
(fundamentální). Harmonický oscilátor je jen hrubým přiblížením pohybu reálné dvouatomové molekuly, která se ve skutečnosti chová jako anharmonický oscilátor. V důsledku anharmonicity se ve spektru objevují také tzv. svrchní tóny (overtony), což jsou přechody, kde se n mění o více než 1 (Δn = 2, 3,…). Tyto frekvence jsou přibližně násobkem fundamentální frekvence (NOVOTNÁ, 1998; TRCHOVÁ, 2006; MILDE, 2008).
15
LITERÁRNÍ PŘEHLED Pomocí mechanického modelu molekuly lze víceatomovou molekulu popsat jako soustavu hmotných bodů (atomů), vázaných silami chemických vazeb. Vibrace víceatomové molekuly je složitá forma kmitavého pohybu, kterou můžeme popsat jako součet jednoduchých harmonických pohybů, tzv. normálních vibrací. Každá normální vibrace molekuly je charakterizová určitou frekvencí a dále směrem a velikostí výchylky jednotlivých atomů, přičemž těžiště soustavy atomů nevibruje. Počet normálních vibrací pro danou molekulu je dán počtem jejích vibračních stupňů volnosti. Protože molekula s N atomy pohybující se v prostoru má 3N stupňů volnosti a může konat pohyb translační a rotační, každý se třemi stupni volnosti, má tedy 3N – 6 vibračních stupňů volnosti, tj. 3N – 6 normálních vibrací. Výjimkou jsou lineární molekuly, které mají jen dva rotační stupně volnosti (při rotaci kolem osy procházející spojnicí atomů nedochází k přemisťování molekuly v prostoru), takže vibrační pohyb zbývá 3N – 5 stupňů volnosti (BOKOBZA, 2002). Mění-li se při vibraci především délka vazby, hovoříme o vibraci valenční, která se dále ještě klasifikuje jako symetrická a antisymetrická. Při změně úhlů se jedná o vibraci deformační, které dále dělíme rovinné a mimorovinné (pokud atom vibruje mimo rovinu ostatních atomů). Rozeznáváme tedy rovinné deformační vibrace – nůžkové a kyvadlové a mimorovinné deformační vibrace – vějířové a kroutivé (VOLKA, 1997; KANIA, 2007)
Obr. 3 Různé druhy vibrací skupiny – CH2 – (MILDE, 2008) Vibrační energie vazby, případně celé molekuly, se podle zákonů elektrodynamiky a kvantové mechaniky může zvýšit absorpcí elektromagnetického záření jen tehdy, mění-li se při vibraci její dipólový moment (vektor, jehož velikost závisí distribuci kladných a záporných nábojů v molekule). Tyto vibrace se označují
16
LITERÁRNÍ PŘEHLED jako
aktivní
v infračerveném
spektru.
Nedochází-li
k jeho
změně
(např.
u homonukleárních biatomických molekul, jako je O2, N2, Cl2, které dipólový moment nemají a ani se v důsledku symetrie molekuly při vibraci nemění), molekula neabsorbuje infračervené záření. Celkový dipólový moment molekuly a jeho změny při vibraci souvisí se symetrií molekuly. Např. lineární molekula CO2 nemá celkový dipólový moment, protože lokální dipólové momenty obou vazeb C = O jsou navzájem kompenzované. Při symetrické vibraci dochází k současnému prodlužování obou vazeb v opačném směru, takže výsledný dipólový moment je opět nulový, symetrická valenční vibrace je tedy v absorpčním infračerveném spektru neaktivní. Při antisymetrické vibraci se současně jed vazba zkracuje a druhá prodlužuje, takže dipólové momenty vazeb se již nekompenzují, ale sčítají. Během vibrace tedy dochází změně celkového momentu, antisymetrická vibrace je ve spektru aktivní. Obecně lze říci, že infračervené spektrum nese informaci zejmé o polárních vazbách v molekule, tj. o funkčních skupinách s heteroatomy. Vibrace vazeb nepolárních nebo jen slabě polárních (C – C, C – H apod.) neposkytují ve spektru žádné nebo jen slabé absorpční pásy. Tento důsledek aktivity vibrací má zásadní význam pro využití infračervené spektroskopie v kvalitativní analýze (TRCHOVÁ, 2006). 3.1.2.2 Infračervené spektrum V infračervených spektrech sledujeme závislost transmitance nebo absorbance vlnočtu absorbovaného záření. Spektrum je pásové a pásy odpovídají různým typům vibračních přechodů. Rotační přechody mají malý význam a lze je měřit pouze v plynech. V kapalinách a tuhých látkách splývají v kontinuum v důsledku interakcí molekul. Ve spektrech převažují vibrační přechody. IR spektrum se dělí 2 oblasti: Oblast charakteristických (skupinových) vibrací: 4 000 – 1 000 cm-1. Tato oblast se využívá pro identifikaci funkčních skupin v molekule. Oblast otisku palce: 1 000 – 400 cm-1. Zde se nachází deformační vibrace ovlivněné strukturou molekuly a umožňují identifikovat konkrétní organickou látku (MILDE, 2008). Názorná ukázka dělení infračerveného spektra je znázorně Obr. 2 v příloze. MIR
spektrometrie
je určená
především
k identifikaci
a strukturní
charakterizaci organických sloučenin a anorganických látek. V kvantitativní analýze
17
LITERÁRNÍ PŘEHLED je hojně používaná blízká oblast (Near Infrared Spectrometry – NIR Spectrometry) pro stanovení převážně organických látek. Výhodou IR je možnost měření vzorků jak v plynném (plynová kyveta), kapalném (kyvety, tenký film), tak pevném stavu (technika KBr tablety, tenkého filmu nebo reflektanční techniky) (PRESER, 2012).
3.2 Blízká infračervená spektroskopie Blízkou infračervenou spektroskopii (NIRS) můžeme definovat jako rychlou nedestruktivní analytickou metodu, u níž se využívá interakce mezi dopadajícím elektromagnetickým zářením a tenkou vrstvou materiálu vzorku (BURNS et CIURTZAK,
2007).
Fyzikálně
je tato
metoda
založe absorpci
či
reflexi
elektromagnetického záření (obvykle 800 – 2 500 nm, tj. 12 500 – 4 000 cm-1), kde materiál v závislosti
složení pohlcuje (transmitance) či odráží (reflektance)
specifické vlnové délky (OSBORNE, 2001).
Obr. 4 Elektromagnetické spektrum (dle PENNER, 1994). Získané spektrum je molekulový otisk materiálu, z něhož je vzorek složený, díky čemuž známe jeho přesnou identifikaci a kvantifikaci. Nejvýznamnější absorpční pásma vyskytující se v NIR oblasti se týkají svrchních tónů (overtonů) (700 – 1 800 nm) a kombinačních přechodů (1 800 – 2 700 nm) získaných vibrací vazeb molekul, které obsahují zejmé – CH, – NH, – OH (a – SH) funkční skupiny. Proto je NIR metoda první při volbě analýzy všech hlavních parametrů potravin jako
18
LITERÁRNÍ PŘEHLED je stanovení vlhkosti, tuku, bílkovin, škrobu, anebo aminokyselin (NIEMÖLLER et BEHMER, 2008). Spektra potravin v NIR oblasti jsou široké pásy, které vznikají překrytím mnoha slabších absorpčních pasů, rozdíly mezi nimi jsou nepatrné a lidským okem nepostřehnutelné. Proto skutečná hodnota NIR spektroskopie, jakožto
analytická
metoda,
je založe statistické
a matematické
manipulaci
se spektrálními daty, díky čemuž jsme tyto spektra schopni vyhodnocovat a získat tak chemické i fyzikální informace o složení a vlastnostech potravin (MANLEY et al., 2008). 3.2.1 NIR spektra potravin NIR spektra potravin jsou tvořeny zejmé absorpčními pásy skupin, které obsahují především chemické vazby: C – H (tuky, oleje, sacharidy), O – H (voda, alkoholy) a N – H (bílkoviny). Tyto hlavní skupiny jsou zvláště důležité a užitečné pro kvantitativní analýzu (BERGLES, 2008). Stanovení obsahu vody byla první úspěšná aplikace NIR v analýze zemědělských produktů a potravinářských surovin. NIR absorpční spektrum čisté vody má pět absorpčních pasů (s maximy při 1 940, 1 450, 1 190, 970 a 760 nm při 20 °C). V závislosti teplotě a vazbě vody (rozpouštědlo, voda v matrici) dochází k posunu pasů. U NIR spekter vzorků obsahujících vysoké množství vody ( ˃ 80 %) je přítomen silně dominantní absorpční pás vodíkové vazby mezi 1 440 a 1 930 nm, což může způsobovat komplikace při jejich analýzách. V potravinách jako je mléko, maso, brambory nebo ovoce, se obsah vody pohybuje v rozmezí 70 – 90 %. U těchto potravin se absorpční pásy vody objeví při vlnových délkách mezi 1 400 – 1 410 nm, což je pozorováno i u vzorků čisté vody (BENITO et al., 2008). Stanovení bílkovin v pšenici se stala historicky nejvýznamnější aplikace NIR. Dokonce nekvalifikovaný (zaučený) pracovník dokázal pomoci NIR predikovat obsah bílkovin přesněji, než byla schop stanovit zručná laborantka klasickou Kjeldahlovou metodou (MÍKA et al., 2008). Vzorky s vysokým obsahem bílkovin (mající různý počet N – H vazeb) absorbují více v absorpčních regionech typických N – H skupiny, než vzorky s nízkým množstvím bílkovin. Absorpční pásy typické pro N – H skupiny v bílkovinách mohou být pozorovány například při vlnových délkách 2 060 a 2 180 nm ve spektru vajec; OSBORNE et al. (1982) se zaměřili tři
19
LITERÁRNÍ PŘEHLED vlnové délky 2 180, 2 100, a 1 680 nm, při stanovování bílkovin v mouce, přičemž vlnová délka 2 180 nm odpovídá absorpci lepku a leží rameni širokého absorpčního pásu pro škrob s absorpčním maximem při 2 100 nm. Poměrně ostré absorpční pásy vzniklé z C – H skupin vyskytujících se v lipidech
můžeme
pozorovat
při vlnových
délkách
2 310
a 2 350
nm
a při 1 730 nm. Vlnová délka 1 730 nm se překrývá s absorpčním pásem bílkovin (WEHLING, 2010). Hlavní absorpční pasy NIR v olejích a tucích, jsou podmaněny povahou mastných kyselin s dlouhým řetězcem, poskytující informaci o CH2 skupině při 1 200, 1 734, 1 765 a 2 345 nm. Pásy při 2 140 a 2 190 nm bývají ve spektru olejů, nikoli u parafinů. Jsou vyvolány cis – nenasycenými jednotkami mastných kyselin a mohou byt použity k hodnocení stupně nasycenosti tuků a olejů ve vzorku. Sacharidy jsou početnou skupinou, která se v potravinách vyskytuje velice hojně, a to v nejrůznějších kombinacích. Protože všechny obsahují C – H a O – H vazby, jejich spektra jsou si velice podobná. Přesto určité rozdíly lze nalézt zvláště v oblasti C – H kombinaci. Takové rozdíly byly využity například stanovení celulózy v mouce jakožto indexu mlynářské kvality. U přírodních ovocných šťáv se nejčastěji jednalo o stanovení jednotlivých sacharidů. Sacharóza byla mnohokrát stanovovaná ve víně, čokoládě, v pekařském zboží a laktóza v sušeném mléce. Celkový obsah sacharidů v ovocných šťávách může být měřen způsobem transmitance při 2 200 nm. V poslední době se NIR používá také k měření tzv. DF (dietární vlákniny) s ohledem zdravou lidskou výživu. Využívá se absorpční pas celulózy (2 336 nm) a dále 1 544 nm. Dále jsou pomoci NIR predikovány organické kyseliny (ve víně, chmelu, aminokyseliny v potravinářské pšenici), etanol ve víně, pivu i během jeho výroby (MÍKA et al., 2008). 3.2.2 Spektrofotometry Pro NIR spektrometrii se používají jak disperzní spektrometry, které obvykle zároveň pokrývají oblasti viditelnou, případně i ultrafialovou, tak spektrometry s Fourierovou transformací (FT), které mnohdy umožňují měřit také ve střední (MIR), případně i vzdálené (FIR) infračervené oblasti. Jak disperzní, tak FT spektrometry jsou dnes běžně jedno-paprskové, takže pro získání absorpčních
20
LITERÁRNÍ PŘEHLED charakteristik samotného vzorku je třeba získat referenční spektrum (spektrum pozadí – „background“) (MATĚJKA, 2006). Vzhledem k tomu, že práce byla měře spektrofotometru FT IR Antaris firmy ThermoNicolet,
bude
blíže
popsán
princip
měření
a jednotlivé
součásti
spektrofotometru s Fourierovou transformací. 3.2.2.1 Disperzní infračervené spektrofotometry Jedná se o konstrukčně starší a v současnosti méně používaný typ infračervených spektrometrů. Konstruovali se jako jedno-paprskové (využívali pouze jeden vlnočet), nebo dvou-paprskové. Zdrojem polychromatického záření je rozžhavená tyčinka, např. Nernstova tyčinka, a k rozkladu IČ záření dochází odrazových mřížkách, které jsou vyrobeny z kovových materiálů. Dříve byla detekce záření zajiště pomocí termočlánků, vyrobených nejčastěji z Sb + Bi nebo Pb + Ag. V dnešní době se požívají spíše pyroelektrické detektory, nejznámější TGS (triglycinsulfát) a DTGS (deuterovaný triglycinsulfát), nebo polovodičové detektory např. PbS a také MTC (Mercury – Cadmium – Telluride), který vyniká vysokou citlivostí a rychlou odezvou. Při použití disperzních infračervených spektrometrů bývají spektra zaznamenává obvykle jako závislost transmitance vlnočtu (NĚMCOVÁ et al., 2004).
Obr. 5 Schéma jedno paprskového disperzního infračerveného spektrometru (1. Zdroj záření, 2. Chopper (rotující zrcadlové segmenty), 3. Kyveta se vzorkem, 4. Srovnávací prostředí, 5. Monochromátor, 6. Detektor, 7. Vyhodnocovací zařízení (KLOUDA, 2003). 3.2.2.2 Spektrofotometry s Fourierovou transformací První infračervený spektrofotometr s Fourierovou transformací byl navržen francouzským fyzikem P. FELLGETTEM v roce 1952. Základní součástí přístroje je interferometr nejčastěji Michelsonova typu. Výsledkem měření není spektrum, ale interferogram, což je závislost odezvy detektoru čase. Z interferogramu získáme
21
LITERÁRNÍ PŘEHLED spektrum teprve provedením tzv. Fourierovy transformace. Z hlediska měření se tudíž nejedná o spektrometrii, ale o interferometrii (VOLKA et al., 1996). Princip měření Michelsonův interferometr se skládá ze tří aktivních komponent: dvou sebe kolmých zrcadel – pohyblivého a fixního, a beamsplitteru (polopropustný dělič svazku paprsků) umístěného mezi těmito zrcadly linii 45° (HONNER, 2008). Do
interferometru
vstupuje
paprsek
z infračerveného
zdroje.
Na polopropustném zrcadle je paprsek rozdělen dvě složky, z nichž se jed odráží od zrcadla fixního a druhá od zrcadla pohyblivého. Geometrií interferometru je dáno, že zrcadlo pohybující se dráze x udělí procházejícímu paprsku dráhový rozdíl δ:
2x.
Uvnitř
interferometru
oba
paprsky
interferují.
Pro
intenzitu
S monochromatického záření vzniklého interferencí dvou taktéž monochromatických paprsků o intenzitách S1 a S2 a vlnové délce platí vztah:
2 S = S1 S 2 2 S1 S 2 cos Vložíme-li do dráhy paprsku kyvetu s absorbujícím vzorkem, dochází k zeslabení záření charakteristických vlnových délek. Za komorou se vzorkem je umístěn detektor vhodný pro daný spektrální obor záření. V detektoru je umístěn fotočlánek, který mění dopadající světlo elektrický signál. Detektor neobdrží žádný signál, bude-li dráhový rozdíl / 2, signál bude naopak maximální v případě
n (kde n je celé číslo). V praxi se spíše než s vlnovou délkou setkáváme s jednotkou vlnočet (v cm-1) danou vztahem 1/ Intenzitu signálu z detektoru I DET v závislosti dráhovém rozdílu popíšeme rovnicí: I DET = ( ) SV (v) cos(2v )
kde Sn (n) je intenzita monochromatického záření a n je vlnočet tohoto záření.
22
LITERÁRNÍ PŘEHLED
Obr. 6 Schematické znázornění interference dvou monochromatických vlnění Michalsonově interferometru a jeho převedení spektrum (dle KLOUDA, 2003). Počítač zaznamenává intenzitu signálu z detektoru v závislosti poloze zrcadla (resp.
optickém
dráhovém
rozdílu).
Jestliže
interferometrem
prochází
polychromatické záření, bude interferogram výsledkem všech konstruktivních a destruktivních interferencí celého rozsahu vlnových délek záření. Klasické spektrum se získá matematickou operací nazvanou Fourierova transformace. Fourierova transformace Fourierova transformace je převodem funkční závislosti intenzity signálu (snímaného detektorem) posunu zrcadla do funkční závislosti intenzity signálu (transmitance, absorbance) vlnočtu.
I ( ´)
S (v) exp(i 2v )d (v)
kde ve I () je intenzita signálu detektoru vzhledem k optickému dráhovému rozdílu
, S () je intenzita záření v závislosti vlnočtu , i je imaginární jednotka (i2= -1). Výpočet spektra S () se provede dle vztahu:
S (v )
I ( ) exp(i2v )d ( )
Zpětná Fourierova transformace vyjadřuje spektrum jako rozdíl sinu a cosinu, neboť
23
LITERÁRNÍ PŘEHLED exp( i ) cos( ) i sin
kde nahrazuje výraz 2. Pokud zanedbáme imaginární část i sin, získáme vzorec:
S (v )
I ( ) cos(2v )d ( )
V praxi
není
samozřejmě
možné
zaznamenávat
interferogram
až do nekonečného dráhového rozdílu. Zrcadlo se pohybuje podle konstrukce spektrofotometru a určuje dráhový rozdíl až do hodnoty δmax. Rovněž interferogram je snímán jen z jedné strany, tedy od optického dráhového rozdílu δ=0. Předchozí rovnici lze tedy upravit do tvaru:
S (v )
mac
I ( ) cos(2v )d ( ) 0
Detektor neregistruje signál z detektoru analogovým způsobem, ale snímá diskrétní soubor N hodnot intenzit signálu v daném časovém intervalu. Výsledný interferogram je složen z N bodů a Frourierovu transformaci interferogramu lze provést podle rovnice: m
S (v) I ( i ) cos(2v j i ) i i 1
kde S (vj) je intenzita záření j-té pořadnici vlnočtu j a I (i)je intenzita signálu z detektoru i-té pořadnici dráhovém rozdílui. Výpočet vlastního spektra zahrnuje změření interferogramu bez vzorku (prázdná kyveta), čímž získáme referenční spektrum pozadí SB (ν). Po té je měřeno spektrum vzorku SV (ν). Výsledné spektrum látky Sspec (ν) je definováno vztahem:
S SPEC (v)
S V (v ) S B (v )
Během Fourierovy transformace interferogramu spektrum často dochází vzniku řady spektrálních artefaktů. Abychom obdrželi spektrum co nejlepší kvality, je nutné dodržovat přesně vymezená pravidla nastavení podmínek měření a výsledné spektrum dále upravit. Ke zhoršení kvality spektra dochází jednak vlivem
24
LITERÁRNÍ PŘEHLED instrumentace a jednak zvoleným výpočetním postupem (GRONHOLZ et HERRES, 2001; FERUS, 2006). Spektrofotometry s Fourierovou transformací mají několik výhod oproti klasickým disperzním nástrojům. Jejich hlavní předností je způsob získávání spektra, s čímž je spoje tzv. Fellgettova multiplexní výhoda. Na detektor dopadá v každém okamžiku simultánně záření v celém spektrálním rozsahu. Uvažujeme-li vysokou rychlost záznamu, získáme informaci o široké části spektra ve velmi krátké době. Connesova výhoda je spoje s přesností měření, která je závislá hlavně kalibraci He - Ne laseru. Vysoká rozlišovací schopnost je urče technickou dosažitelností velkého dráhového rozdílu. Poslední a neméně důležitá je Jacquinotova výhoda: V disperzním spektrometru dopadá detektor jen malá část záření. V FT IR přístrojích toto omezení odpadá a optická průchodnost systému je limitová hlavně velikostí zrcadel (VOLKA et al., 1996; Mc CARTHY et KEMENY, 2007). Přístrojové vybavení Zdrojem záření v interferometrických spektrometrech je keramická tyčinka např. z karbidu křemíku, anebo žárovka s wolframovým vláknem či halogenová žárovka, které při zahřátí emitují spojité záření v infračervené oblasti (LEVITIN, 1979; KANIA, 2007). Hlavní součástí spektrometru je interferometr Michelsonova typu, jehož hlavními součástmi jsou dělič paprsků, pohyblivé a pevné zrcadlo. Dělič paprsků, kterým prochází záření, musí mít vysokou propustnost i reflexi. Nejčastěji se používají tenké filtry materiálu s vysokým indexem lomu např. oxid železitý nanesené vhodný nosič např. fluorid vápenatý. Správná funkce interferometru závisí velmi přesně řízeném pohybu pohyblivého zrcátka. Už při nepatrném výkyvu zrcátka mohou svazky interferovat, a proto jsou umístě vzduchovém loži a jejich poloha je říze helium-neonovým laserem, který zajišťuje rychlé a přesné kmity. K detekci záření se používají takové detektory, které jsou schopny zaznamenat změnu tepelné energie. V NIR oblasti se používají nejčastěji fotovodivostní detektory PbS, PbSe, InSb, anebo InGaAs, které mají velmi rychlou odezvu (NOVOTNÁ, 1998; KLOUDA, 2003).
25
LITERÁRNÍ PŘEHLED 3.2.2.3 FT NIR Antaris Spektrometr Antaris je FT NIR analyzátor (Obr. 5 v příloze) navržený speciálně pro použití v provozním prostředí potravinářského, chemického a farmaceutického průmyslu. Jeho unikátní konstrukce umožňuje nasazení jak v provozních, tak laboratorních
podmínkách
pro kontrolu
složení
a uniformity
produktů
a meziproduktů, identifikaci vstupních surovin a verifikaci výrobků (NICOLET.CZ, 2012). He/Ne laser je vybaven filtrem pro redukci síly a reflexe. FT NIR Antaris využívá InGaAs detektoru, který poskytuje informace v rozsahu 12 000 – 3 800 cm-1, což odpovídá 833 – 2 630 nm. Zeslabovací kolo v přístroji slouží jako dva greeny pro limitování
energie
vysílané
vzorek.
Počítač,
který
je propojený
se spektrofotometrem je vybaven softwarem pro zpracování naměřených spekter. Pro měření infračervených spekter je přistroj FT NIR Antaris vybaven třemi různými režimy měření: 1. Režim reflektanční - integrační sféře s využitím kovového zkrátka s různou výškou reflexní plochy (h = 0,2 a 0,3 mm) anebo s použitím tzv. Sample Cup Spinner,
což
je rotující
kompresní
kyveta
urče pro analýzu
zejmé nehomogenních vzorků (Obr.6a v příloze). 2. Režim
transmitanční
–
s využitím
kyvet
s různou optickou
drahou
(př.: 1 mm) v kyvetovém prostoru spektrofotometru (Obr.6b v příloze). 3. Režim interaktanční – který využívá měření pomocí vláknové optiky v podobě optické sondy (Obr.7 v příloze). 3.2.3 Techniky měření NIR spekter Techniky měření NIR spekter lze rozdělit techniky měřící absorpci záření průchodu vzorkem, které využívají tzv. TRANSMITANCE a techniky měřící absorpci záření odrazu paprsku od povrchu vzorku využívající tzv. REFLEKTANCI (WILSON, 1994). Na obr. 7 jsou zobrazeny jednotlivé techniky měření.
26
LITERÁRNÍ PŘEHLED
Obr. 7 Metody získávání NIR spekter (dle KAWANO, 2002). Při transmitančním měření (obr. 7a) prochází záření vzorkem a část je jím absorbována, čímž dochází k zeslabení zářivého toku a zbylé záření je zaznamenáno detektorem (viz obr. 3 v příloze). Tento typ měření slouží nejen pro získání spekter čirých kapalin, ale při využití difúzní transmitance lze touto metodou měřit i vzorky, které způsobují mírný rozptyl záření jako je např. mléko, v němž jsou za rozptyl záření zodpovědné tukové kapénky (NIEMÖLLER et BEHMER, 2008). Kapalné vzorky je možné měřit v kyvetách ze speciálního skla (Infrasil, Suprasil), které vykazuje vysokou propustnost v celé NIR oblasti. Tloušťka optické vrstvy u těchto kyvet je obvykle od 1 mm do cca 10 mm a jejich volba se optimalizuje v závislosti koncentraci analytu v roztoku a optických vlastnostech rozpouštědla. V rámci reflexních technik se nejčastěji uplatňuje princip difúzní reflektance, kdy se dopadající záření odráží od povrchu jednotlivých malých částic vzorku (obr. 7b) (MATĚJKA, 2006). NIR přístroje využívají tzv. integrační koule nebo více než jeden detektor k zaznamenání co největší části odraženého záření. Ve většině případů dopadá záření kolmo vzorek a zaznamenává se záření odražené pod úhlem 45 ° od povrchu (viz obr. 4 v příloze), takže spektra neobsahují žádnou nebo téměř žádnou část odraženého záření. Tato metoda je vhodná pro měření tuhých a sypkých vzorků (WILSON, 1994). Při kombinaci režimu reflektance a transmitance získáme režim transflektance (obr. 7c), který může být použity k analýze čirých, ale i zakalených kapalin. Dopadající záření je přenášeno přes vzorek, difúzně je odraženo od reflexní vrstvy a zpět prochází vzorkem do detektoru. Tato metoda není vhodná pro měření vzorků s vysokou optickou hustotou (NIEMÖLLER et BEHMER, 2008). Vedle uvedených postupů, kdy je vzorek umístěn v držáku přístroje, se často NIR spektra měří s využitím vláknové optiky s různými typy sond, které mohou být umístěny například přímo v chemickém či biotechnologickém výrobním reaktoru (MATĚJKA, 2006). Vláknová optika využívá tzv. režim
27
LITERÁRNÍ PŘEHLED interaktance (obr. 7d), při němž je zaznamenáváno pouze záření procházející vzorkem. Spektra tedy neobsahují ani spekulární ani difúzně odražené záření. Touto technikou lze měřit povrchové charakteristiky vzorků o větší tloušťce (WILSON, 1994). 3.2.4 Výhody a nevýhody NIR spektroskopie Výhody NIR spektrometrie je velmi populární z mnoha důvodů. Mezi její nesporné výhody patří, že se jedná o metodu nedestruktivní. Vzorek se neničí, není třeba jej upravovat přídavkem chemikálie. Po proměření ho lze bez problémů zkonzumovat, jedná-li se o potravinu, či jinak dále používat. Dalšími výhodami jsou rychlost, protože spektrum lze naměřit během několika málo minut či desetin sekund; mnohonásobná analýza s použitím jednoho spektra (při jednom měření lze zjistit současně několik parametrů najednou); snadná obsluha přístroje (BLANCO et VILLARROYA, 2002; Mc CLURE et TSUCHIKAWA, 2007). Na rozdíl od infračervené spektroskopie ve střední oblasti lze měřit přes skleněné materiály, a tudíž můžeme tuto metodu zařadit do on-line kontroly kvality surovin, meziproduktů i finálních výrobků. Dále se ideálně hodí k analýze vzorků s vysokým obsahem vody, ale také pro látky pevné a sypké. NIR poskytuje velmi podobné výsledky, co se týče přesnosti, jako u referenčních metod, podle kterých je NIR přístroj kalibrován (MÍKA et al., 2008). Nevýhody Je nutno zmínit, že i tato metoda má některé nevýhody. NIR spektroskopie se nehodí pro stanovení minoritních látek ve směsích. Spektra získaná změřením NIR spektrometru jsou obtížněji interpretovatelná. Je nutno tedy spektra zpracovávat příslušným
softwarem.
A také
přesnost
vytvořených
metod
může
být
ovlivně použitou referenční (rozhodčí) metodou. Dále vyžaduje vyšší náklady vytvoření kalibračního modelu, neboť pro získávání kalibrační závislosti je potřeba použít velké množství vzorků. A jako poslední velká nevýhoda, kterou je nutno uvést, je velmi vysoká pořizovací ce přístroje (CENTNER, 1999; BLANCO et VILLARROYA, 2002).
28
LITERÁRNÍ PŘEHLED
3.3
Aplikace NIR spektroskopie
Blízká infračervená spektroskopie je používá v mnoha průmyslových odvětvích, včetně farmaceutického, petrochemického, kosmetického a chemického průmyslu. V potravinářství a zemědělství se jako v jediných oborech uplatňuje již od 60. let. Při analýze potravin má téměř všestranné použití, protože se potraviny z více jak 99 % skládají z bílkovin, sacharidů, tuků a vody a NIR spektroskopií jsme tyto složky schopni stanovit téměř ve všech případech. Aplikace NIR spektroskopie je však mnohem širší a zahrnuje i stanovení senzorických a fyzikálně-chemických parametrů jako hustota, pH, ° SH, velikost částic, atd. V současné době se NIR spektroskopie
uplatňuje
zejmé pro hodnocení
kvality
a autenticity
surovin,
meziproduktů i potravin. NIR spektroskopii ovšem nelze považovat za zcela univerzální metodu, protože není například vhodná pro stanovení minoritních složek a má mnohem nižší citlivost než IR spektroskopie (RODRIGUEZ – OTERO et al., 1997b; OSBORNE, 2001; ČURDA, 2002). Vzhledem k tématu práce, bude literární rešerše zaměře více využití NIR spektroskopie v mlékárenském průmyslu. 3.3.1. Historie NIR spektroskopie v potravinářském průmyslu a zemědělství Ačkoli HERSCHEL objevil infračervené záření již v roce 1800, tato spektroskopie byla první polovinu minulého století ignorová z přesvědčení, že postrádá analytický zájem a kvůli nedokonalému technickému vybavení a špatným znalostem spektrální analýzy byla větši výzkumů zastave anebo omeze jen na laboratorní podmínky (BLANCO et VILLARROYA, 2002). Jako první v historii použil NIR spektroskopii pro analýzu potravin a zemědělských produktů KARL NORRIS. Jeho první práce byla provede v roce 1949, kdy využil UV a NIR spektroskopii třídění vajec. Nepublikované spektrum přijaté roku 1952 ukazovalo owerton OH okolo 750 nm, ale nebyl nalezen použitelný pík pro předpověď kvality vajec. Roku 1962 NORRIS, HART, a GOLUMBIC poprvé publikovali použití NIR spektroskopie stanovení vlhkosti semen pšenice. První fáze vývoje použití NIR spektroskopie pro analýzy v potravinářství a zemědělství se zaměřovaly stanovení vlhkosti a složek (B, T, S). K velkému skoku došlo při použití difusní reflektance, která dopomohla NIR spektroskopii k jejímu širšímu využití jak v zemědělství, tak i v dalším odvětví.
29
LITERÁRNÍ PŘEHLED Tento posun vyžadoval nutné úpravy přístrojů a rozvoj chemometrických metod k čemuž dopomohla Norrisova laboratoř. Tato měření byla důležitá, protože ekonomická hodnota produktů jako pšenice byla založe na obsahu sušiny a bílkovin. Klasické metody mokré chemie byly nákladné a časově náročné a nebyly vhodné k jejich použití prodejních místech (uvedené autory citují WORKMAN et WEYER, 2008). Roku 1973 PHIL WILLAIMS koupil první komerční NIR analyzátor pro analýzu zrn a obilí a dosáhl mimořádného úspěchu tím, že nahradil Kjeldahlovu metodu pro stanovení bílkovin u obilí NIR spektroskopii. Tím došlo k zahájení programu zlepšení měření vlhkosti a bílkovin v pšenici v celé Kanadě. Podobnou snahu měli i další země jako Austrálie a Rusko. A to byl začátek éry blízké infračervené spektroskopie. WILLAIMS a NORRIS chtěli společně sepsat souhrnnou práci o využití NIR spektroskopie pro hodnocení biologického materiálu, ale dříve se objevila publikace vydaná OSBORNEM a FEARNEM o možnostech užití NIR spektroskopie v potravinářském průmyslu. Analýza krmiv byla další velkou komoditou pro využití NIR analyzátorů, o čemž pojednává i souhrnná publikace SHENKA, WESTERHAUSE, BARTONA, MARTEN, MARTIN, atd. (WORKMAN, 2005). Literatura odráží změny v potenciálu a zhodnocení NIR spektroskopie. Během roku 1970, vzrostl počet publikací o použití NIR spektroskopie v zemědělství a potravinářském odvětví, a od tohoto data, se stále více a více využívá pro rutinní měření (SUN, 2008). Názornou ukázkou vývoje nárůstu počtu publikací uvádí i RODRIGUEZ – OTERO et al., 1997b (viz. Tab. 2). Tab. 2 Vývoj nárůstu počtu publikací o aplikaci NIR spektroskopie (RODRIGUEZ – OTERO et al., 1997b; PASQUINI, 2003; KARLBERG, 2006). Počet publikací 3 4 23 23 152 > 300 > 4500 > 15 000
Rok 1930 – 1940 1940 – 1950 1950 –1960 1960 – 1970 1970 – 1980 1980 – 1990 1990 – 2000 2000 <
30
LITERÁRNÍ PŘEHLED Takováto produktivita publikací vedla v roce 1993 k založení časopisu Journal of Near Infrared spektroskopie, což byl první časopis věnující se výhradně této problematice (PASQUINI, 2003). O aplikaci NIR spektroskopie k analýze potravin bylo sepsáno několik významných knih, které pojednávají o různých aspektech této technologie, jako například „Near-Infrared Reflectance Analysis Food Industry Applications” sepsá WILLIAMSEM a STEVENSONEM v roce 1990, dále „Near-Infrared Spectroscopy in Food Science and Technology“ od YUKIHIRO OZAKI, která byla vydá v roce
2006,
sepsá OSBORNEM
“Near-Infrared v roce
2001,
Spectroscopy “Recent
in
Food
Technological
Analysis,”
Advances
the
Determination of Food Authenticity” sepsá REIDEM a spoluautory v roce 2006, která obsahuje část věnující se využití NIR spektroskopie stanovení autenticity a falšování potravin, “Theory and Application of Near Infrared Reflectance Spectroscopy in Determination of Food Quality,” kterou sepsal CEN a HE v roce 2008. HOYER sepsal v roce 1997 základní soupis použití NIR spektroskopie v krmivářském průmyslu a SAHNI a spolupracovníci sepsali v roce 2004 knihu o využití in-line NIR spektroskopie pomocí optické sondy pro monitorování v potravinářském průmyslu (uvedené autory cituje BENITO et al., 2008). 3.3.2 Aplikace základě kvantitativní analýzy Větši kvantitativních aplikací NIR spektroskopie je zaměře stanovení hlavních složek ve vzorku. Obecně platí, že detekční limit je okolo 0,1 % (m/m), i když pro některé specifické aplikace a při příznivé matrici vzorku a analytů může NIR dosáhnout nižších detekčních hodnot (PASQUINI, 2003). WEHLING (2010) popsal rovnici, která může být použita pro predikci množství složky přítomné v potravině, z jeho spektrálních dat následovně: složka (%) = z + a log (1/Rλ1) + b log (1/Rλ2) + c log (1/Rλ3) +… kde každá hodnota log (1/R) představuje spektrální data při jiné vlnové délce vynásobené odpovídajícím koeficientem. Přičemž každý koeficient a úsek osy vymezený průsečíkem (z) jsou určeny multivariační regresní analýzou.
31
LITERÁRNÍ PŘEHLED V mnoha případech je možné stanovit více složek vedle sebe, aniž je nutné dělit složité směsi, a to přímo ve výrobním procesu. NIR spektrometrie se proto zařazuje mezi tzv. procesní analytické metody, kdy se klade důraz rychlost samotné analýzy včetně možnosti kontinuální on-line analýzy ve výrobním procesu ( výrobní její přesnost (MATĚJKA, 2006). K nejlépe predikovatelným
lince) nikoli
parametrům patří takové, které jsou podloženy referenční hodnotou stanovované složky (např. obsah N podle Kjeldahla), zatímco predikce obsahu složek základě vlastností v několika stupních laboratorní práce (např. vlákniny) bývá méně reprodukovatelná a při regresní analýze s cílem odvodit dobrou robustní kalibraci činí
určité
problémy.
Blízká
infračervená
spektroskopie
byla
původně
omeze kvantitativní analýzu zrna, ale dnes je široce využívá v mnoha oblastech. Tab. 3 uvádí přehled nejčastějších aplikací NIR spektroskopie v potravinářském průmyslu z hlediska kvantitativního použití. Tab. 3 Oblasti použití NIR kvantitativních aplikací v potravinářském průmyslu (citace uvádí MANLEY et al., 2008). Autoři Osborne, 1991; Wilson et al., 1991; Windham et al., 1993; Cereálie a cereální Wesley et al., 1999; Cozzolino et al., 2000; Bao et al., výrobky 2001; Manley et al., 2001a; Van Zyl et Manley, 2001; Manley et al., 2002, Jirsa et al., 2008 Káva Pizarro et al., 2004 Cukrárenské výrobky Tarkošová et Čopíková, 2000 Rodriguez – Otero et al., 1997; Wust et Rudzik, 2003; Mlékárenské výrobky Blazquez et al., 2004, Andersen et al., 2010 Lihovarnický průmysl Gomez – Cordoves et Bartolome, 1993; Manley et al., 2003 Tuky a oleje Schulz et al., 1998; Moh et al., 1999 Kawano et al., 1992; Schulz et al., 1998; Goula et Ovoce a zelenina Adamopoulos, 2003; Xing et al., 2003; Walsh et al., 2004; Guoquan et al., 2006, Manley et al., 2007 Hrozny Cope, 2000; Esler et al., 2002 Schulz et al., 2002; Laasonen, 2003; Schulz et al., 2003b; Bylinné přípravky Manley et al., 2004; 2006; Joubert et al., 2005; 2006 Med Garcia – Alvarez et al., 2000 Downey, 1996b; Wold et Isaksson, 1997; Pink et al., 1999; Maso a ryby Cozzolino et Murray, 2004; Realini et al., 2004; Sinelli et al., 2010 Vejce Seregély et al., 2006; Giunchia et al., 2008 Aplikace
32
LITERÁRNÍ PŘEHLED Pomazánky a koření Čaj Tabák Víno a hrozny
Iizuka a Aishima, 1999 Grant et al., 1988; Hall et al., 1988; Osborne et Fearn, 1988; Schulz et al., 1999; Luypaert et al., 2003; Schulz, 2004; Zhang et al., 2004 Ha et al., 1997 Baumgarten, 1987; Chauchard et al., 2004; Cozzolino et al., 2004
3.3.2.1 Kvantitativní analýzy v mlékárenském průmyslu V dnešní době lze blízkou infračervenou spektroskopii použít v různých oblastech mlékárenského průmyslu, kde ji můžeme aplikovat třemi způsoby: 1. Při analýze obsahových složek (T, B, S) z hlediska zpeněžování mléka při jeho příjmu, anebo při standardizaci obsah tuku, bílkovin či jiných složek sušiny při výrobě mléka a mléčných výrobků. 2. Při analýze sušených mléčných výrobků z hlediska stanovení tuku, vlhkosti, bílkovin, za účelem získání správného složení směsi, což je například důležité při výrobě speciálních výrobků (kojenecká strava), nebo při analýze mléka pro výrobu smetany, sýrů, kaseinu a syrovátky. 3. Při analýze hotových výrobků za účelem kontroly z hlediska platných právních
předpisů
nebo
požadavků
zákazníků
či
producentů
(FRANKHUIZEN, 2007). Řada autorů již publikovala několik studií shrnujících možnosti využití NIR spektroskopie v mlékárenském průmyslu jako například: BRENNE (1987); WILLIAMS et STEVENSON (1990); RODRIGUEZ – OTERO et al. (1997b); TSENKOVA (1999); RU et GLATZ (2000); OSBORNE (2001); ČURDA et al. (2002); WANG et al. (2010). Mléko První pokusy využívající NIR spektroskopie k hodnocení mléka a mléčných výrobků oznámil GOULDEN roku 1957, kdy se mu podařilo stanovit bílkoviny, tuk a laktózu v mléce. Obdobnými pokusy se později zabývali i další autoři, jako např.: BEN – GERA et NORRIS (1968); CASADO et al. (1978); VERBIESE (1981); WEAVER (1984);
VAN
REUSEL et OGER (1987);
VAN REUSEL
et
KLIJN (1987);
GRAPPIN et al. (1991). KAMISHIKIRYO – YAMASHITA et al. roku 1991
33
LITERÁRNÍ PŘEHLED publikovali, že vlnová délka 2 170 nm je nejvhodnější pro stanovení proteinů v různých potravinách. Na tuto práci navázali prací, ve které pomocí přístroje NIRSystem 6 250 stanovovali obsah bílkovin v mléce a dospěli k velice dobrým výsledkům směrodatné odchylky kalibrace (SEC – standard error of calibration) 0,0897 % a směrodatné odchylky predikce (SEP – standard error of predictiontion) 0,1776 %. HALL et
CHAN roku 1993 analyzovali proteiny, tuk a laktózu
v nehomogenizovaném syrovém kravském mléce v režimu transmitance v 0,5 mm křemenné kyvetě přístroji NIRSystém 6500 v rozsahu 400 – 2 500 nm. Dosáhli těchto výsledků: u tuků byl korelační koeficient (R) = 0, 99; SEC 0,04 %; SEP = 0,04 %; u bílkovin R = 0,95; SEC = 0,08 %; SEP = 0,08 % a u laktózy R = 0,82; SEC = 0,04 %; SEP = 0,05 %. Roku 1990 se CARL zabýval stanovením tuku v homogenizovaném mléce. Pro své analýzy využil přístroj Nicolet Systém 740 v rozsahu 4 400 – 4 250 cm-1. Bylo dosazeno vysoké směrodatné odchylky opakovatelnosti s hodnotou 0,027 %. TSENKOVA et al. (1999) analyzovali 258 vzorků syrového mléka přístroji NIRSystém 6500 v rozsahu 400 – 2 500 nm ve dvou vlnových délkách: 700 – 1100 nm (použili tři různé tloušťky kyvet: 1, 4 a 10 mm) a 1 100 – 2 400 nm (tloušťka kyvety 1 mm). Nejlepších výsledků bylo dosaženo v regionu 1 100 – 2 400 nm v 1 mm kyvetě úpravě spekter 1. derivací. Přesnost výsledků byla srovnatelná s prací HALL a CHAN (1993). V dalších letech publikovali podobné práce i CHEN et al. (1994, 1999); ŠAŠIČ et OZAKI (2001). Porovnávání přesnosti měření složení syrového kravského mléka pomocí přístrojů měřících ve střední (Milko-Scanu 605) a blízké (FT IR spektrometru 740) infračervené oblasti provedli roku 1996 LEFIER et al. Směrodatné odchylky kalibrace pro tuk, hrubé bílkoviny, čisté bílkoviny a laktózu byly: 0,050; 0,048; 0,035 a 0,076 g/100g pro Milko-Scan a 0,047; 0,046; 0,042 a 0,065 g/100g pro FT NIR. Z výsledků a z dalších studií dospěli k závěru, že FT NIR spektrometr je významně lepší než běžný filtrový přístroj, neboť poskytuje více spektrálních informací pro jednotlivé vzorky mléka. LAPORTE et PAQUIN (1999) stanovovali obsah tuku, hrubých bílkovin, čistých bílkovin a kaseinu tak, že rozdělili vzorky kravského mléka do dvou souborů, kdy jeden soubor obsahoval 76 nehomogenizovaných vzorků a druhý přidání
34
LITERÁRNÍ PŘEHLED 20 homogenizovaných vzorků obsahoval celkem 96 vzorků. Všechny statistické parametry kromě tuku byly lepší pro celkovou kalibraci, která obsahovala i homogenizované vzorky. Tím zjistili, že homogenizace má velký vliv stanovení tuku NIR metodou. PURNOMOADI et al. (1999) zkoumali vliv rozdílnosti složení krmné dávky pro dojnice přesnost NIR spektroskopie při stanovení tuku a bílkovin v mléce. Dojnice byly krmeny: směsí bez obohacení, směsí s přidáním kukuřice, rybího extraktu a do čtvrté směsi byl přidán sojový extrakt. Vzorky byly odebírány z ranního a večerního dojení. Nejlepší kalibrace byla získá pro směs s přídavkem rybího extraktu, kde R = 0,980 a SEP = 0,19 % pro tuk a pro bílkoviny R = 0,902 a SEP = 0,09 %. Autoři se shodují, že tato metoda je vhodná pro stanovení tuku v mléce při krmení rozdílnými krmnými dávkami, ale již méně vhodná pro stanovení bílkovin, protože vliv jednotlivých komponent ve směsi má významný vliv jejich stanovení. KUKAČKOVÁ et al. (2000) se ve své studii zaměřili možnosti stanovení základních složek mléka přístroji NIRSystem 6500 s použitím vláknové optiky. Korelační koeficient pro tuk, sušinu a bílkoviny byl vyšší než 0,96 % pro všechny kalibrační modely. K podobným závěrům dospěly i JANKOVSKÁ et ŠUSTOVÁ (2003), jejichž měření probíhalo přístroji FT NIR Antaris ve spektrálním rozsahu 4 000 – 10 000 cm-1 v režimu reflektance integrační sféře. Vliv rozdílných teplot syrového mléka přesnost měření NIR spektroskopu posuzovala ŠUSTOVÁ (2007). Pro analýzy použila 90 vzorků mléka měřeného při teplotách 20 °C, 21 °C, 23 °C, a 25 °C. Největší rozdíl naměřených hodnot zaznamenala mezi teplotou 20 °C a 25 °C, z čehož vyplývá, že je dodržování teploty vzorků při měřením důležité a je třeba dodržovat teplotu shodnou s teplotou, niž je kalibrován model NIR spektroskopu pro danou složku. WOO et al. (2002) vyvinuli novou „měřící jednotku“ MilkSpec-1 pro zjišťování obsahu tuku, laktózy a bílkovin v syrovém mléce transmitanční NIR spektroskopií. Tato metoda využívá měření vzorků syrového
nehomogenizovaného
mléka
ve
skleněných
12 mm
testovacích
zkumavkách o objemu 10 ml při vlnových délkách 700 – 1100 nm. Kalibrační modely byly vytvořeny metodou PLS (Partial least Square), přičemž bylo dosaženo velmi nízkých chyb predikce: 0,06 %; 0,10 % a 0,10 % pro tuk, laktózu a bílkoviny. Stanovením základních složek mléka, ale i některých fyzikálních vlastností (titrační
35
LITERÁRNÍ PŘEHLED kyselost, pH, koagulační vlastnosti mléka) se zabývali i další autoři jako např.: USTUNOL et al. (1991); LU et al. (2004); JANKOVSKÁ (2004); RŮŽIČKOVÁ et ŠUSTOVÁ (2006a); DRAČKOVÁ et al. (2006); JANŠTOVÁ et al. (2009); DE MARCHI et al. (2009); COPPA et al. (2010); BRANDÃO et al. (2010). Vlivem
zánětu
mléčné
žlázy
analýzu
složení
mléka
se zabývali
TSENKOVÁ et al. (1995; 1999 a 2001). Zjistili, že pomocí NIR techniky je možné rozeznat mléko od dojnice se zánětem vemene základě změn ve spektru a složení mléka a dále, že kalibrační modely jsou tím přesnější, čím mléko obsahuje méně somatických buněk. K podobným výsledkům došli i PRAVDOVA et al. (2001), jejichž práce přispěla k možnosti použít NIR spektroskopii kontrole kvality mléka on-line. KUKAČKOVÁ (2001) ve své práci shrnula souhrn publikací, které se zabývají využitím on-line NIR analýz při zpracování mléka. SPITZER et al. (2005) porovnávali měření obsahu tuku, bílkovin, laktózy a obsah somatických buněk přístrojích NIR a VIS spektrometrech v režimu transmitance. Spektra byla snímá při dvou vlnových délkách 380 – 1 100 nm a 900 – 1 700 nm. Lepších výsledků se dosáhlo použitím NIR spektrometru pro model tuku, laktózy a somatických buněk, kdežto model bílkovin prokázal lepší parametry s použitím VIS spektrometru. HANSEN (1998) se snažil ve své práci využít NIR spektroskopii stanovení močoviny a acetonu v syrovém mléce. Jednalo se ale o minoritní složky mléka a nepodařilo se mu dosáhnout dostatečné přesnosti. Pro další měření proto využil střední spektrální oblast. Podobnými pokusy se roku 2006 zabývali také ŠUSTOVÁ et al. (2006), kteří však při stanovení močoviny v syrovém ovčím mléce dosáhli velmi dobrých výsledků R = 0,973. Z práce SIVAKESAVA et IRUDAYARAJE (2002) vyplývá, že kromě základních složek můžeme v mléce stanovit i rezidua antibiotik. Ke stanovení koncentrace tetracyklinu v mléce použili FT MIR a FT NIR spektroskopii. Z poměrně vysokých korelačních koeficientů kalibrace FT MIR spektroskopie lze říci, že tato metoda je vhodnější k rychlému stanovení reziduí v mléce než FT NIR. K obdobným výsledkům dospěli i DRAČKOVÁ et al. (2009b), kdy publikovali práci zaměřenou detekci reziduí penicilinu G a kloxacilinu v syrovém mléce. Zjistili, že NIRS aplikací lze detekovat stanovený maximální limit reziduí kloxacilinu.
36
LITERÁRNÍ PŘEHLED Vytvořené kalibrace pro stanovení penicilinu G vykazovali vysoké hodnoty predikčních odchylek, proto tato metoda není vhodná pro jejich stanovení. Roku 2008 AL – QADIRI et al. použili viditelnou a blízkou infračervenou spektrometrii (600 – 1 100 nm) s využitím difúzní reflektance k detekci a sledování kažení pasterovaného odtučněného mléka dobu 3 až 30 hod při 3 skladovacích teplotách (6; 21 a 37 ° C). Byly sledovány celkové počty aerobních mikroorganismů (KTJ) a pH mléka. Pro predikci stupně kažení mléka byla použita multivariační metoda PLS, díky níž bylo dosaženo velmi příznivých korelačních koeficientů a směrodatných odchylek predikce pro stanovení počtu bakterii a pH: R = 0,99l; 0,99 a SEP = 0,34 log10 KTJ/mL a 0,031. Z dosažených výsledků vyplývá, že NIR spektroskopii lze použít k odhalení rychlých procesů kažení mléka. KAWASAKI et al. (2008) vytvořili kalibraci pro stanovení majoritních složek (T, B, L), ale i minoritních složek (močovinný dusík, PSB) kravského mléka pro experimentální systém analýzy mléka přímo během dojícího procesu pomocí robotického systému. Získali velmi dobré kalibrační výsledky pro všechny sledované parametry, z čehož vyplývá, že tuto metodu lze použít pro real – time analýzu přímo farmách pro kontrolu kvality mléka. Ovčí a kozí mléko Stanovením základních složek kozího mléka NIR spektroskopií se nejvíce zabývali DIAZ – CARRILLO.
Uskutečnili
první
kalibrace pro stanovení
koncentrace
základních složek v kozím mléce, později také identifikovali vlnové délky, kde dochází k největší absorpci pro složky kozího mléka (DIAZ – CARRILLO et al., 1995). Na sledování obsahu kaseinu a jeho jednotlivých frakcí byla zaměře práce DIAZ – CARRILLO et al (1993), kdy sledovali obsah bílkovin, celkového kaseinu, αs-, β- a κ- kaseinu, tuku a laktózy NIR spektrometrem Pacific Scientific 6250. Práce potvrdila úspěšnost stanovení kaseinových frakcí, i když se v mléce vyskytují poměrně v nízkých koncentracích. Jejich výsledky významně zlepšili PEREZ – MARIN et al. (2002) díky použití MPLS modifikované metody částečných nejmenších čtverců a použitím aplikace pro korekci rozptylu záření (SNV). ALBANELL et al. (2003) stanovovali obsah tuku, bílkovin, kaseinu, sušiny a somatických buněk v homogenizovaném a nehomogenizovaném kozím mléce.
37
LITERÁRNÍ PŘEHLED Výsledky potvrdily, že není významný rozdíl mezi stanovenými hodnotami u vzorků upravovaných homogenizací a nehomogenizovanými. Podobné práce publikovalo několik dalších autorů jako např: ŠUSTOVÁ et KUCHTÍK (2007); DRAČKOVÁ et al. (2008). Opět dosáhli velmi přesných kalibrací. FONTECHA et al. (1993) použili Fourierovu transformaci pro stanovení sekundární struktury kaseinů v sýrech z ovčího mléka. Pro analýzu byly vzorky kaseinů stlačeny do KBr tabletek a spektra byla proměře FT IR spektrometru 1725 X Perkin – Elmer. Vzorky lyofilizovaných kaseinů byly získány z ovčího mléka, z kontrolních odběrů sýrů, z rozmražených a vyzrálých sýrů. Z výsledků vyplynulo, že β struktury kaseinu vzrůstají během zrání sýrů a 90 dnech zrání se zmrzlé sýry a kontrolní sýry liší rozmanitostí kaseinových frakcí, kde u zmrzlých a následně rozmražených sýrů byl poměr β struktur nižší. PASCUAL et MOLI (1994) stanovovali pomocí reflektanční spektroskopie hrubé bílkoviny a čisté bílkoviny v ovčím mléce. Pro vyhodnocení výsledků použili metodu multilineární regrese a dosáhli velmi dobrých výsledků. ALBANELL al. (1999) se také zabývali stanovením obsahu tuku, bílkovin a sušiny ovčího mléka. Vzorky nehomogenizovaných mlék byly získány od ovcí různém stupni laktace. Pro bílkoviny bylo dosaženo korelačního koeficientu kalibrace a validace 0,92 a 0,92; pro tuk 0,99 a 0,97 a pro sušinu 0,97 a 0,92. Práce ukazuje, že NIR technika je použitelná pro stanovení základního složení nehomogenizovaného ovčího mléka. NUÑEZ – SANCHEZ et al. (2002) srovnávali přesnost stanovení složení, čerstvého ovčího mléka v režimu transmitance a sušeného ovčího mléka v režimu reflektance. Obě metody dosahovaly vysokých koeficientů kalibrace (vyšších než 0,9) pro všechny stanovované složky. Roku 2006 ŠUSTOVÁ et al. využili FT NIR spektroskopii stanovení základních ale i minoritních složek ovčího mléka. 79 vzorků bylo proměřeno integrační sféře, kde byl odraz paprsku zajištěn kovovým zrcátkem. S využitím metody PLS bylo dosaženo těchto kalibračních výsledku R: 0,983 (sušina); 0,989 (tuk); 0,997 (čisté bílkoviny); 0,997 (kasein); 0,980 (laktosa) a 0,973 (močovina). O rok později se ŠUSTOVÁ et al. (2007) zabývali stanovením čistých bílkovin a kaseinu v kravském, kozím, ovčím mléce a v kravském mlezivu. Získané korelační koeficienty kalibrací byly v rozmezí 0,89 – 0,99 z čehož vyplývá, že
38
LITERÁRNÍ PŘEHLED FT NIR technika je vhodná pro rychlé stanovení čistých bílkovin a kaseinu u všech druhů mlék. Důležité je ovšem při sestavování kalibračních rovnic vybrat vzorky s širokým rozsahem stanovovaných bílkovin a v průběhu celé laktační periody. Roku 2009 MOUAZEN et al. použili NIR spektrofotometr (Lab-Spec@Pro Near Infrared Analyser, USA) pro stanovení tuku, bílkovin, laktózy, tukuprosté sušiny, popelu, hustoty, bod mrznutí a pH ovčího mléka. Vzorky byly získány od 50 ovcí chovaných různým systémem krmení a různého genotypu a proměřeny v rozsahu vlnových délek od 350 – 2 500 nm. Pro kalibraci a validaci bylo použito 40 a 10 vzorků. Pomocí merody PLS (partial least squares) byl vyvinut model, který byl charakterizován dobrou předpovídající schopností pro stanovení téměř všech parametrů (R2 0,84 – 0,90 a RPD (residual prediction deviation) 2,34 – 3,34). Kalibrační model pro tuk a pH měl velmi špatné hodnoty R2 0,14 – 0,73 a RPD 1,11 – 1,64). O stanovení základních složek ovčího mléka pojednává také práce PROCHÁZKOVÉ et al. (2010), jejíž výsledky potvrzují vhodnost NIR spektroskopie jakožto rychlou metodu pro analýzu složení ovčího mléka, což potvrzují i práce ostatních autorů. Sušené mléko a syrovátka První větší experimenty se stanovením základních složek sušeného mléka začaly v roce 1983, kdy DE VILDER et BOSSUYT stanovovali obsah vody, bílkovin a tuku v odstředěném a plnotučném mléce, získaným nízkou, střední a vysokou teplotou sprejového sušení. U plnotučného mléka bylo dosaženo hodnoty směrodatných odchylek kalibrace a validace 0,19 % a 0,29 %, kdežto u odstředěného mléka pouze SEC 0,07 % a SEP 0,09 %. Z dosažených výsledků autoři usuzují, že různé způsoby sušení mléka nemají vliv přesnost stanovení obsahu tuku. Podobné experimenty provedli i FRANKHUIZEN et VAN DER VEEN (1985) a DOWNEY et al. (1989). VUATAZ (1990) stanovoval obsah vody a laktózy v průběhu skladování (12 měsíců) u dietního sušeného mléka přístroji InfraAlyzer 500. U vody dosáhl SEC 0,03 % a SEP 0,05 %. Obsah laktózy porovnával v amorfních a 100 % zkrystalizovaných vzorcích. V prvním případě dosáhl SEP 2,0 %, ve druhém případě SEP 3,6 %.
39
LITERÁRNÍ PŘEHLED MARTEL et PAQUIN (1991) stanovovali vodu v mléce v průběhu odpařování s cílem usnadnit kontrolu sušícího procesu a zastavení sušení požadované sušině při výrobě sušeného mléka. K měření využili spektrofotometr Bomem DA3 s režimem transmitance v rozsahu 8 500 – 5 000 cm-1. Byl dosažen velmi vysoký R = 0,999, což značí, že touto metodou lze kontrolovat průběh sušícího procesu. BARABÁSSY et KAFFKA (1993) zjišťovali kvantitativní vztah mezi obsahem vody, bílkovin a vícesložkovým sušeným mlékem. Pro měření vzorků sušeného mléka, proteinového koncentrátu, laktózy a syrovátkového prášku byl použit PMC Spectralyzer 1025. Ve všech případech bylo dosaženo velmi nízkých hodnot SEC (0,098 %). Další obdobná práce autorů porovnávala měření dvou různých přístrojích (NIRSystem 6500 a PMC spetralyzer 1025). Přístrojem NIRSystems 6500 bylo dosaženo R od 0,929 (laktóza) do 0,990 (popeloviny), SEC od 0,125 % (tuk) do 6,79 % (laktóza). PMC spectralyzer 1025 vykázal menší rozsah R od 0,986 (tuk) do 0,998 (vlhkost) sušeného mléka, SEC byla nejmenší pro stanovení vlhkosti 0,098 % a nejvyšší pro bílkoviny 1,89 % (BARABÁSSY et KAFFKA, 1995). BARABÁSSY et TURZA (1996) také použili NIR techniku stanovení originálních a lyofilizovaných směsí sušeného mléka. Hodnoty R tuku, bílkovin, laktózy a vody byly u obou variant sušeného mléka vyšší jak 0,93, avšak celkově lepších výsledků bylo dosaženo u mléka před lyofilizací. KUKAČKOVÁ (2001) ve své práci použila NIR spektroskopii pro stanovení sušiny, tuku, bílkovin, laktosy, volného tuku, kaseinu, čistých bílkovin, dispersibility, smáčivosti, indexu dusíku syrovátkových bílkovin a popelovin v sušeném mléce a kojenecké dětské výživě. Pomocí spektrofotometru NIRSystem 6500 s vláknovou optikou bylo proměřeno 74 vzorků ve spektrálním rozsahu 400 – 2 500 nm. Metodou PLS byly vyvinuty kalibrační modely s korelačními koeficienty kalibrace v rozmezí 0,945 – 0,999 a validace 0,916 – 0,988. Stanovením základních složek v sušeném mléce se zabývalo mnoho dalších autorů
např.
PASTIEROVÁ
(1991);
RATCHEV
et
PETROVA
(1991);
TAKAMURA et al. (1998); WU et al. (2007; 2008) atd. Potenciál NIR spektroskopie pro stanovení změn syrovátky v průběhu zpravování hodnotili POULIOT et al. (1997). Pomocí spektrofotometru NIRS 6500 s optickou sondou stanovovali denaturaci syrovátkových bílkovin vlivem tepla;
40
LITERÁRNÍ PŘEHLED složení
syrovátkového
koncentrátu
v průběhu
výroby
a stupeň
hydrolýzy
syrovátkových bílkovin působením trypsinu. Spektra vzorků byla proměře ve spektrálním rozsahu 1 100 – 2 500 nm a pomocí metody PLS byly vytvořeny kalibrační modely. Autorům se podařilo vytvořit dostatečně silné NIR kalibrace pro předpověď úspěšného stanovení denaturovaných syrovátkových bílkovin; pro monitoring výroby koncentrátu a pro enzymatickou hydrolýzu syrovátkových bílkovin. Nicméně vzorky pro kalibrace musí být pečlivě vybírány tak, aby v celém rozsahu překryly výkyvy ve složení. Kalibrace velice dobře předpovídaly vzorky, které byly velmi odlišného složení a kvality od vzorků, které byly použity k vývoji kalibrací. Jejich výsledky ukázaly, že NIR spektroskopie společně s optickou sondou může být použita pro kontrolu při zpracování syrovátky. Fermentované mléčné výrobky Stanovením obsahu tuku, bílkovin a sušiny ve fermentovaných mléčných výrobcích se zabývali RODRÍGUEZ – OTERO et HERMIDA (1996). Na přístroji NIRSystems bylo v režimu reflektance proměřeno 107 kalibračních vzorků (4 skupiny vzorků: fermentované plnotučné mléko, fermentované odstředěné mléko, fermentované mléko bez příchutě a fermentované mléko s příchutí). Pro vytvoření kalibračního modelu byly použity všechny referenční hodnoty společně bez ohledu skupinu. Došlo tak k rozšíření koncentračního rozpětí složek a tím bylo usnadněno jejich stanovení. Avšak lepších výsledků bylo dosaženo stejnými autory, při použití režimu transflektance (RODRÍGUEZ – OTERO et al., 1997a). Firma NICODOM se roku 1997a zabývala aplikací NIR spektroskopie pro stanovení bílkovin, sušiny a tuku v jahodových jogurtech. Vzorky s ovocem byly pomocí mixéru rozmixovány a spektra byla proměře přístroji Nicolet Protégé 460. Bylo dosaženo velmi dobrých R pro bílkoviny 0,944; sušinu R = 0,993 a tuk R = 0,991. Další aplikací firmy Nicodom (1997b) byla mezioperační kontrola směsi jogurty. RŮŽIČKOVÁ et ŠUSTOVÁ (2006a) použili FT NIR spektroskopii stanovení vybraných parametrů kvality následujících mléčných výrobků: sušinu, tuk a pH stanovovali u jogurtů, mléčné krupice a rýže. Vzorky byly proměřeny integrační sféře v režimu reflektance ve spektrálním rozsahu 10 000 – 4 000 cm-1. Pomocí
41
LITERÁRNÍ PŘEHLED metody PLS bylo dosaženo nejvyššího korelačního koeficientu u jogurtu: 0,998 (sušina); 0,989 (tuk); 0,875 (pH) a 0,989 (titrační kyselost). Ostatní korelační koeficienty u parametrů mléčné krupice a rýže charakterizovali také spolehlivé kalibrační modely. R pro mléčnou krupici 0,967 (sušina); 0,983 (tuk) a 0,992 (pH); R pro mléčnou rýži: 0,987 (sušina); 0,990 (tuk) a 0,852 (pH). Výsledky studie vypovídají o vhodnosti použití NIR spektroskopie pro rychlé a nedestruktivní analýzy mléčných výrobků. AFFANE et al. (2011) použili NIR spektroskopii stanovení pH a titrační kyselosti kefíru. Pro tvorbu kalibrace pro pH použili spektra bez jakékoliv úpravy, avšak pro titrační kyselost byly spektra podrobe vyhlazení Savitzky – Golay derivace. Z dosažených kalibrací autoři vyvodili závěry, že tuto metodu lze použít pro screeningové měření pH a titrační kyselosti kefírů. Sýry Roku 1982 FRANK et BIRTH použili NIR techniku stanovení obsahu vody, bílkovin a tuku u různých druhů sýrů (čedar, Colby, Parmezán, Romano, Gruyere). O tři roky později FRANKHUIZEN et VAN DER VEEN (1985) stanovovali totéž u různých holandských sýrů (tavené sýry, Gouda, Edam). Obdrželi tyto výsledky: u obsahu vody SEC = 0,15 %; 0,21 %; 0,25 % (tavené sýry, Gouda a Eidam), nedosáhli však dobrých výsledků SEP. Při stanovení obsahu bílkovin (50 vzorků tavených sýrů) dosáhli SEC = 0,31 % a SEP 0,35 %. Stanovovali také tuk u stejných vzorků jako při stanovení vody a dosáhli SEC = 0,15 %; 0,21 %; 0,25 % a SEP = 0,23 %; 0,24 %; 0,22 % (tavené sýry, Gouda a Eidam). Získané kalibrační koeficienty pro kalibraci všech sýrů byly vyšší než pro jednotlivé druhy sýru, ale naopak SEC a SEP byly nižší u kalibrací pro jednotlivé sýry. WEHLING et PIERCE roku 1988 stanovovali obsah vody v čedarských sýrech zralých 3 – 6 měsíců, použitím 3 vlnových délek 1 818; 1 445 a 1 734 nm. O pár let později stanovovali u čedarů i sušinu a tuk tak, že vzorky sýrů nastrouhali
a
proměřili
v režimu
transmitance
v transportní
cele
ve spektrálním rozsahu 800 – 1 070 nm a v režimu reflektance v rozsahu 1 100 – 2 500 nm pomocí optické sondy, kdy použili celý vzorek. Pro vytvoření kalibračních a validačních modelů byly použity dvě metody PLS a MLR (multiple linear
42
LITERÁRNÍ PŘEHLED regression). PLS kalibrace vytvořené z nastrouhaných vzorků sýrů poskytly nejnižší standardní chybou predikce pro vlhkost 0,335 % a pro tuk 0,330 %. Přijatelné výsledky pro stanovení vlhkosti sýrů byly také získány z kalibrace metodou MLR při měření vzorku v transportní cele, avšak kalibrace pro tuk vykazovala vysoké hodnoty SEP. Kalibrace vytvořené ze spekter získaných optickou sondou poskytly méně spolehlivé výsledky, než byly získány kalibracemi nastrouhaných vzorků sýrů (PIERCE et WEHLING, 1994). Stanovením tuku, bílkovin a laktózy u čedarového typu sýrů se zabývali také KAISER et al. (1991). CHEN et al. roku 1998 analyzovali polotučné a plnotučné sýry čedarového typu v průběhu jejich zrání. Spektra byla ovlivně vlhkostí vzorků, ale tento vliv může být potlačen ustanovením rovnováhy ve vzorku nejméně 10 minut před jejich měřením. Výrazně oddělené píky charakterizující tuk ve zmrazených vzorcích byly při 1 744; 1 450; 1 240; 1 170 a 1 115 cm-1. Píky pozorované v oblasti mezi 1 650 a 1 540 cm–1 byly přiřazeny bílkovinám. Výšky těchto píků (absorbance) odpovídaly množství bílkovin. Porovnáním reflektanční spektroskopie a referenčních metod při stanovení tuku, bílkovin a sušiny popisuje RODRIGUEZ – OTERO et al. roku 1995. Proměřili celkem 92 kravských sýrů vyrobených Galícia, přičemž validační sada obsahovala 25 vzorků. Analýza proběhla přístroji NIRSystems 6500. Bylo dosaženo velmi vysokých korelačních koeficientů. Stejné druhy sýrů byly sledovány i přístroji s optickými filtry, který je rutinně používán pro analýzu masa a masných výrobků MEATSPEC ve vlnovém rozsahu 800 – 1100 nm. Referenčně byl určen obsah tuku, bílkovin a sušiny (RODRIGUEZ – OTERO et al., 1996). Roku 2005 FILHO et VOLEY stanovovali sušinu u 5 druhů čerstvých sýrů s nízkým, středním a vysokým obsahem sušiny. Při svých analýzách dosáhli velice dobrých výsledků. Stanovením základních složek čerstvých sýrů se zabývali také BLAQUEZ et al. (2004). Analýzou složení sýrů Danbo se zabývalo několik autorů jako např.: SØRENSEN et JEPSEN, 1998a a SØRENSEN et SNOR, 1998. Velmi dobrých výsledků u těchto sýrů dosáhli WITTRUP et NORGAARD (1998), jejichž kalibrace byly popsány následujícícmi výsledky: R = 0,99; SEC = 0,52 % pro tuk; R = 0,98; SEC = 0,06 % pro celkový dusík a R = 0,98; SEC = 0,58 % sušinu.
43
LITERÁRNÍ PŘEHLED Porovnáním optothermální blízké infračervené spektroskopie a střední infračervené spektroskopie s Fourierovou transformací a celkovou reflexí se zabývali MC QUEEN et al. (1995). U 24 vzorků sýrů (6 čerstvých, 9 měkkých, 9 tvrdých) stanovovali obsah vody, tuku a bílkovin
přístroji Spectra – Tech. Dosáhli
korelačního koeficientu predikce v rozmezí 0,93 – 0,96 s chybou predikce mezi 2 – 5 % při použití NIR metody, zatím co korelační koeficient predikce s odchylkou predikce při stanovení pomocí metody MIR byl 0,81 – 0,92 ± 4 – 9 %. MAZEROLLES et al. (2000) měřili transmitanční spektra u polotvrdých a tvrdých sýrů těsně odpuštění syrovátky. Při této mezioperační kontrole sledovali obsah tuku a vlhkost. Aby vytvořili spolehlivou metodu, použili pro tvorbu kalibrací experimentálně vyrobné sýry s širokým rozsahem koncentrací tuku a vlhkosti. Do kalibrace byly také přidány sýry získané z různých mlékáren. Vytvořené kalibrace byly popsány těmito výsledky: SEC = 0,45 g/100 g a SEP= 0,39 g/100 g pro sušinu a SEC = 0,49 g/100 g a SEP=0,49 g/100 g pro tuk. ADAMOPOULOS et al. (2001) zkoumali možnost využití NIR spektroskopie při on – line kontrole kvality výroby tradičního řeckého sýru Feta přístroji Instalab 600 Dicky – John, kdy byla stanovová vlhkost, tuk a bílkoviny. Vzorky byly odebírány z dobře definovaných kritických bodů výroby. Veškeré údaje byly zpracovány pomocí vhodného počítačového programu tak, aby mohly být kalibrační konstanty přesně vypočteny a uloženy do přístroje. Jejich správnost
byla
ověřová nezávislou skupinou vzorků. Z této studie lze vyvodit závěr, že NIR technika může být úspěšně použita pro on-line kontrolu kvality výroby sýru Feta. Roku 1997 se HOYER zabýval stanovením vlhkosti, tuku a bílkovin u tavených sýrů a sýrů Cottage. Bylo proměřeno 35 vzorků tavených sýrů (taveniny) při teplotě 77,8 – 85,8 °C a 49 vzorků cottage sýrů o teplotě 59,2 – 65,4 °C. Opět bylo dosaženo velice dobrých kalibračních výsledků (R = 0,988 – 0,999; SEC 0,06 – 0,38 %). Práce, která byla zaměře použití NIR techniky pro stanovení sušiny, tuku, hrubých bílkovin, pH a reologických vlastností (penetrace) u tavených sýrů, byla publiková ČURDOU et KUKAČKOVOU (2004). Vzorky byly proměřeny přístroji FT NIR použitím vláknové optiky a kalibrační model byl ověřen křížovou validací. Bylo dosaženo opět velmi dobrých korelačních koeficientů a směrodatných odchylek validace. Roku 2009 PI et al. publikovali možnost užití difúzní reflektanční
44
LITERÁRNÍ PŘEHLED NIR
spektroskopie
stanovení
složení
plátků
tavených
sýrů
zabalených
v polyethylenovém (PE) obale. Pomocí PLS algoritmu a úpravy spekter druhou derivací byla navrže metoda, v níž byla eliminová přítomnost PE obalu v NIR spektrech
a vrcholy
separovaných
píků
byly
přímoúměrné
koncentraci
stanovovaných analytů. Z těchto výsledků vyplývá, že NIR spektroskopii lze použít pro stanovení základních složek tavených sýrů. Roku 2011a GONZÁLEZ – MARTÍN et al. použili NIR techniku pro rozlišení minerálního složení (Ca, K, Mg, Na, P) ovčího sýru pocházejícího z různého
systému
výroby
(ekologické
a konvenční
zemědělství).
Do diskriminačního modelu bylo použito 80 spekter různých sýrů. Použitím algoritmu PLS bylo správně klasifikovaných vzorků 97 % při vnitřní validaci a 85 % u externí validace. Roku 2010 ANDERSEN et al. studovali smetanové sýry typu Žervé s obsahem tuku (0 %; 3 %; 6 %; 9 %) vyrobené při různém pH (4,4; 4,7; 5,0) s obsahem
soli
(0,4 %;
0,65 %;
0,9 %).
Sýry
byly
proměřeny
různými
spektroskopickými metodami (fluorescenční, NIR, FT IR, LF NMR). Spektra naměřená danými metodami obsahovala hlavně informace o tučnosti sýrů, ale další informace týkající se koncentrace složek byly velmi složité pro stanovení. SAPUTRA et al., 1992 studovali změny koncentrace glykomakropeptidu během enzymatické fáze koagulace kravského mléka pro určení jednotlivých vlnových délek využitím metody výběru hlavních komponent. Výběr byl založen možnosti určení hlavních komponent, možnost monitorování phenylalaninu a methioninu a fyzikálním významu změn v reflektanci během koagulace. Spektra byla proměře přístroji InfraAnalyzer 500 v režimu difúzní reflektance pomocí vláknové optiky. Bylo vybráno 6 vlnových délek, které velmi dobře korelovaly (R = 0,90 – 0,92) se změnami koncentrace makropeptidu při koagulaci. Výsledky ukazují, že NIR spektroskopie je schopná objektivně monitorovat i koagulaci mléka. V průběhu zrání sýrů dochází zejmé změně v množství peptidů a volných aminokyselin. Posouzením zralosti sýrů z hlediska množství celkových dusíkatých látek, rozpustného dusíku, rozpustných aminokyselin tyrosinu a tryptofanu a aminokyselin glutaminu, prolinu, leucinu a lysinu měřením v režimech reflektance a optickou sondou se zabývala JANKOVSKÁ (2004).
45
LITERÁRNÍ PŘEHLED Stanovením polyaminů pomocí NIRS v Olomouckých tvarůžcích se zabývali DRAČKOVÁ et al. roku 2009a. Vzorky pocházející přímo od výrobce byly skladovány při 5 °C (n = 96) a při 20 °C (n = 179) sedm týdnů. Spektra byla proměře pomocí spektrofotometru FT NIR Antaris v rozsahu 10 000 – 4 000 cm-1 při 100 sc. Metodou PLS získaly následující korelační koeficienty kalibrace (R2KAL) se směrodatnými odchylkami validace (SECV) pro putrescin, spermidin a spermin (mg.kg-1): 0,660 (SECV = 142); 0,755 (SECV = 2,29); 0,627 (SECV =7,07) pro vzorky skladované při 20 ° C; 0,822 (SECV = 46,4); 0,833 (SECV = 1,31) a 0,679 (SECV = 2,48) pro vzorky skladované při 5 °C. Autoři poukazují skutečnost komplikace stanovení minoritních látek pomocí FT NIR spektroskopie, protože IR spektra se od sebe liší v závislosti jejich fyzikálně-chemickém složení. Stanovením volných aminokyselin (Asp, Ser, Met, Thr, Glu, Val, Gly, His, Orn a Cit) a celkovou sumou volných AMK během zrání u norských sýrů Norvegia a Pråst se věnoval SKEIE et al. (2006). Jejich výsledky ukázaly dobrou schopnost NIR techniky předpovídat obsah volných aminokyselin během zrání. MLČEK et al. (2011) se věnovali odhadem tyrosinu, tryptofanu a celkového rozpustného dusíku u 288 vzorků eidamů. Vzorky byly proměřeny v režimu reflektance integrační sféře a pomocí optické sondy. Kalibrační modely byly vyvinuty pomocí algoritmu PLS a ověřeny cross validací. Pro metodu integrační sféře bylo dosaženo těchto korelačních koeficientů: R = 0,911; R = 0,929 a R = 0,959 pro celkový rozpustný dusík, tryptofan a tyrosin a pro metodu s využitím optické sondy: R = 0,807; R = 0,945; R = 0,928. Výsledky studie ukazují, že NIR spektroskopie je vhodná pro rychlé a přibližné stanovení úrovně prozrání sýrů. Koagulační vlastnosti mléka Jedním z nejčasnějších použití spektrofotometru pro monitorování optických změn vlastností mléka v průběhu zasyřování bylo v roce 1984 Mc MAHONEM et al. Pro své pokusy použili Beckman DU-8B UV/Vis spektrofotometr a sledovali změnu absorbance. Výsledky měření byly získány v přímém důsledku rozptylu světla vlivem velikostí agregovaných kaseinových micel. Tyto metody našly jen malé použití do doby, než došlo k rozvoji optických vláken. Záření v oblasti NIR může být přenášeno prostřednictvím optické sondy a monitorováno difúzní reflektancí nebo
46
LITERÁRNÍ PŘEHLED transmitancí, jelikož u sýřeniny bude reflektance vyšší, zatímco transmitance se bude snižovat (WOODCOCK et al., 2008). PAYNE et al. (1993) měřili pomocí optické sondy změny v difúzní odrazivosti během koagulace mléka. Jako zdroj použili fotodiodu, která vyzařovala záření vlnové délky při 950 nm. Dosáhl velmi dobrých výsledků kalibrace pro čas zasýření s chybou predikce 1,5 – 2,4 min. Nicméně tato studie monitorovala koagulaci pouze při jedné vlnové délce. LAPORTE et al. (1998) použil NIR reflektanční spektroskopii s využitím optické sondy pro monitorování koagulace mléka syřidly při výrobě sýru Čedar. Mléko pocházelo od 52 individuálních dojnic. Pro stanovení referenčního času koagulace byl použit koagulometr INRA. Spektra koagulujícího mléka byla získá ponořením optické sondy do sýrařské vany každé dvě minuty dobu 50 min ve spektrálním rozsahu 1 100 až 2 500 nm s rozlišením 2 nm pomocí skenovacího spektrofotometru NIRSystems (Perstorp Analytical, Silver Springs, MD). Celkem bylo získáno 1 300 spekter, která byla uprave druhou derivací. Metodou PLS byly vyvinuty kalibrační modely k predikci procenta koagulace mléka. Korelační koeficient kalibrace se směrodatnou odchylkou predikce byl 0,94 ± 0,20 % a validace 0,87 ± 0,36 %. Studie ukázala, že NIR reflektanční spektroskopie je vhodná metoda k monitorování koagulace mléka. Kromě toho autoři dosáhli lepších výsledků NIR spektroskopií pro odhad koagulace mléka, než při použití koagulometru. CASTILLO et al. (2000) použili optickou sondu v režimu difúzní reflektance při vlnové délce 880 nm pro monitorování parametrů koagulace kozího mléka (čas koagulace a čas krájení sýřeniny). Koagulace mléka byla měře 3x, vždy při jiném pH, teplotě a koncentraci syřidla (pH - 5,5; 6,0 a 6,5; teplota 28; 32 a 36 °C; koncentrace syřidla 0,020; 0,035 a 0,050 ml/kg mléka). Opět bylo dosaženo velmi dobrých výsledků predikce pro čas koagulace mléka syřidlem R2 = 0,9913 ± 0,895 s a čas krájení sýřeniny R = 0,978 ± 84,5 s. Roku 2009 použili CECCHINATO et al. také střední infračervenou spektroskopii, pro stanovení koagulačních vlastností mléka. Ve studii se zaměřili vliv genotypu plemene ve vztahu koagulačním vlastnostem mléka. Mléko bylo získáno od 1 200 hnědých švýcarských krav. Referenční hodnoty pro čas koagulace
47
LITERÁRNÍ PŘEHLED mléka syřidlem (min) a pevnost sýřeniny byly stanoveny pomocí počítačového renneting metru. MIR data byly zaznamená v rozsahu 4 000 – 900 cm−1. Kalibrační modely byly vyvinuty metodou PLS a ověřeny vnější křížovou validací. Byly získány vysoké koeficienty determinace v závislosti genotypu, které se pohybovaly v rozmezí pro: čas koagulace 0,91 – 0,96 a pevnost sýřeniny 0,71 – 0,87. LYNDGAARD et al. (2012) využili NIR reflektanční spektroskopii stanovení koagulačních vlastností mléka v reálném čase. NIR spektra byla zaznamenává v průběhu koagulace v rozsahu 1 000 – 2 500 nm a zpracová pomocí analýzy hlavních komponent. Hlavními komponentami jako funkce času byly vyvinuty modely: pro koagulaci mléka, a pak pro popis tří procesů koagulace mléka: proteolýzu kaseinu, agregaci kaseinových micel a tvorbu trojrozměrného gelu. Model pro koagulaci mléka a model vytvořený spojením tři koagulačních procesů byly vytvořeny a testovány ve 12 sýrařských vanách. Oba modely byly vytvořeny velmi kvalitně, protože jejich hodnoty koeficientů determinace byly R2 > 0,99. Algoritmus postupu byl vyvinut tak, že je schopen poskytnout v reálném čase odhad parametrů pro semi-empirický model popisující kinetiku procesů koagulace mléka a dále stanovit časy, kdy dochází k přechodu mezi třemi koagulačními procesy. 3.3.3 Aplikace základě kvalitativní analýzy NIR spektroskopie může být velmi dobrým nástrojem při určování původu, stáří či zkoušky pravosti potravin, kde je cílem spíše klasifikovat, než provádět kvantitativní stanovení (JIRSA et al, 2008). Otázka autenticity potravin, pokud jde o falšování a nesprávné označování výrobku existuje již od dob, kdy bylo jídlo poprvé nabízeno k prodeji. V nedávné minulosti se však falšování potravin stalo sofistikovanější (KAROUI et De BAERDEMAEKER, 2007). Potraviny nebo složky potravin, které mají
vysokou
cenu
a podstupují
řadu
zpracovatelských
kroků,
jsou
nejpravděpodobnějším cílem falšování vzhledem k možnosti náhrady kvalitní ingredience za levnější náhražku (KAROUI et al., 2005a). Základní myšlenka aplikace NIR spektroskopie při řešení pravosti potravin se spoléhá generování spektroskopického otisku potraviny, přičemž každý materiál (surovina, potravina) se od sebe liší v závislosti odrůdě, ročním období, roku nebo místu výroby (MANLEY et al., 2008). Aplikace NIR spektroskopie pro testování autenticity kávy,
48
LITERÁRNÍ PŘEHLED ovocné dřeně, sušeného mléka, pomerančového džusu, těl jatečně opravovaných prasat, rýže, masných výrobků, rostlinných olejů, pšenice a pšeničné mouky jsou shrnuty v práci, kterou publikoval DOWNEY roku 1996. Tyto aplikace mohou být založeny například principech Diskriminační analýzy (viz. Kap. 3.4.4.1), kdy je problém řešen srovnáním spektra testovaného vzorku se spektrem vzorku v příslušné knihovně, kdy by knihov měla obsahovat příklady známých autentických a falšovaných vzorků. V nejjednodušším případě je naší otázkou, zda vzorek patří do jedné ze dvou skupin, zda se tedy podobá vzorkům v knihovně, či ne. Vše je posuzováno základě vypočítání spektrální vzdálenosti. Jestliže je tato vzdálenost blízko k nule jsou obě látky identické, pokud je však vzdálenost větší nejedná se o shodné vzorky. Často je však nutné použít klasifikaci více různých tříd, identifikovat druh falšování (přídavek invertního řepného cukru do medu, přídavek látek zvýšení bílkovin v mléce), anebo kvantifikovat úpravu výrobku (přídavek rostlinného tuku do mléčného výrobku) (OSBORNE et al., 2001). K těmto složitějším analýzám lze využít například metodu hlavních komponent (PCA – Principal Component Analysis), která transformuje vícerozměrná data a vytváří z nich společné komponenty, přičemž může být podle charakteru analýzy použita jak pro kvantitativní tak i pro kvalitativní stanovení. Dále lineární diskriminační analýza (LDA), kterou lze charakterizovat anebo oddělit dva či více různých druhů od sebe, anebo lze využít i metodu částečných nejmenších čtverců (PLS), která vytváří základní vztahy mezi dvěma maticemi (GODULA, 2010). Některé podniky využívají kvalitativní analýzu pro ověření příchozí suroviny, anebo pro kontrolu výrobního procesu. V poslední době se NIR spektroskopie využívá zejmé k testování kvality a autenticity ovocných dření a šťáv, džusů, mléka a mléčných výrobků, dále se sleduje kvalita ví základě jeho odrůd, anebo zda nedochází k falšování olivového oleje levnějšími náhražkami. V tabulce 4 je shrnut přehled nejčastějších aplikací NIR spektroskopie v potravinářském průmyslu, které byly použity hodnocení potravin.
49
kvalitativnímu
LITERÁRNÍ PŘEHLED Tab. 4 Oblasti použití NIR kvalitativních aplikací v potravinářském průmyslu (citace uvádí REID, et al. 2006; MANLEY et al., 2008). Autoři Contal et al., 2002; Rodriguez – Saona, et al., 2001 Reid, et al., 2005; Scotter et al., 1992; Shilton et al., 1998; Twomey et al., 2005 Downey et al., 1994, 1997; Downey a Spengler, 1996; Pizarro et al., 2007 Osborne a Fearn, 1988
Aplikace Stanovení kvality a autenticity ovocných šťáv Stanovení kvality džusů Rozlišení kávy Arabica a Robusta Hodnocení kvality černého čaje Rozpoznáváním geografického původu zeleného čaje Camellia sinensis L.
Chen et al., 2009 Osborne a Fearn,1988; Budínová et al., 1998
Klasifikace komerčních čajů Rozpoznáváním geografického původu odrůd vína Falšování extra panenského oleje slunečnicovým olejem Rozpoznáváním geografického původu olivového panenského oleje Rostlinné oleje Falšování medu Falšování javorového sirupu
Cozzolino et al., 2003 Downey et al., 2002 Downey a Flynn, 2002 Sato, 1994 Downey et al., 2003 Paradkar et al., 2002 Sato, et al., 1990; Ulbert, 1994; Sato 1994 Downey et al., 1990; Maraboli et al., 2002
Falšování mléčného tuku cizím tukem Klasifikace sušeného mléka Hodnocení kvality rýže Basmati a dalších dlouhozrnných druhů rýže Hodnocení pekařské kvality různých druhů mouky Klasifikace rybího masa Rozlišení zmraženého a rozmraženého hovězího masa Rozlišení druhu masa (hovězí, vepřové, jehněčí a kuřecí) Senzorická kvalita masových klobás Senzorika espresa z pražené kávy Senzorické hodnocení textury vařených brambor Stanovení kvality čokolády měřením kakaových bobů
50
Osborne et al., 1997 Downey et al., 1986; Devaux et al., 1987 Murray et al., 2001 Downey et Beauchêne, 1997a, 1997b Cozzolino et Murray 2004 Ellekjaer et al., 1994 Estebán - Díez et al., 2004 Van Dijk et al., 2002 Davies et al., 1991
LITERÁRNÍ PŘEHLED 3.3.3.1 Kvalitativní analýzy v mlékárenském průmyslu Falšování mléka a mléčných výrobků Falšování mléka a mléčných výrobků můžeme rozdělit několik způsobů: Výrobky nejsou v souladu s požadavky právních předpisů (např. chybné označení), jsou do nich přidávány nesprávné přísady či složky, jiného než mléčného původu, anebo nesplňují požadavky technologický proces (ULBERT, 2003). Přídavek vody je jedním z nejstarších praktik, kterým může být mléko porušené či falšované (ARVANITOYANNIS et TZOUROS, 2005). Zvyšování kvality syrového mléka přispívá obecně k lepší konkurenceschopnosti mlékárenských výrobků trhu (HANUŠ et al., 2008). Kvalita mléka je spoje s množstvím obsahových složek v něm přítomných, zejmé s obsahu tuku a bílkovin. Častým způsobem falšování mléka, s cílem zvýšit množství těchto složek, je jejich náhrada za cizí, jako například přídavek rostlinného oleje pro zvýšení tuku či přídavek např. syrovátkové či rostlinné bílkoviny do mléčných výrobků pro zvýšení obsahu proteinů. Tím se bohužel mění jejich senzorické a funkční vlastnosti, což je pro spotřebitele nežádoucí. NIR spektroskopii při odhalování cizího tuku v mléčném tuku jako první použili SATO et al. v roce 1990. Pro vyhodnocení byly vybrány vlnové délky od 2 110 – 2 160 nm a 2 124 a 2 144 nm. Autoři vytvořili metodu pro kvantifikaci cizího tuku v mléčném tuku s detekčním limitem ve výši 3 %. Pokud by se vybraly pro detekci cizího tuku pouze dvě poslední vlnové délky, tak je nutné prohlédnout rozdíly v absorpčních hodnotách při těchto délkách, protože mohou být ovlivněny způsobem krmení, sezónou a fází laktace. Podobnému pokusu se o rok později věnoval
i CARL
(1991),
který
pro své
pokusy
použil
spektrofotometr
Nicolet Systém 740. Pro vyhodnocení vybral rozsah vlnových délek 2 273 – 2 353 nm, a pomocí algoritmu PLS dosáhl při stanovení cizího tuku v mléčném tuku relativní standardní odchylky 2 %. LUŽOVÁ (2011) se zabývala využitím NIR spektrometrie při kontrole falšování sýrů rostlinnými tuky. Ve své práci analyzovala tzv. analogy sýrů, určené k zapékání a smažení, které srovnávala s eidamskými sýry a dále analogy tavených
51
LITERÁRNÍ PŘEHLED sýrů, které byly srovnávány s tavenými sýry bez použití rostlinného tuku. Měření probíhalo v režimu reflektance při 80 scanech, s rozlišením 4 cm-1. Pro vyhodnocení výsledků byla použita diskriminační analýza. U všech porovnávaných skupin sýrů a analogů byl NIR přístroj schopen rozpoznat rozdíl mezi sýrem a jeho analogem. Výsledky prokázaly, že spektrometrie může být využita v rozpoznávání sýrů od jejich imitací a přispět tak k úspěšnému odhalení případných padělatelů sýrů. GIANGIACOMO et al. (1992) zkoumali možnost detekce sušené syrovátky přidané do sušeného mléka. 105 vzorků bylo analyzováno v rozsahu 1 100 – 2 500 nm Kalibrační modely byly sestaveny pomocí metody MLR (multiple linear regression) a diskriminační analýzy. Pro ověření kalibrace MLR byly připraveny dvě sady validačních vzorků mícháním sušených mlék získaných různými sušícími procesy a sušenou syrovátkou. První sada poskytla SEP 0,84 %, druhá sada 1,49 %, což bylo hodnoceno jako nepřijatelné. Výsledky diskriminační analýzy, až na jeden vzorek chybně zařazený, byly pozitivní. Autoři uvádí, že predikční výsledky má vliv různá technologie sušení a také různý typ mléka, a proto detekce těchto směsí může vést k nesprávné identifikaci. Obdobnou prací se zabýval také MLČEK (2008), kdy se snažil detekovat sušenou syrovátku přidávanou do sušeného odstředěného mléka. Při své analýze získal velice spolehlivé kalibrační modely jak při metodě PLS tak i při diskriminační analýze, kdy byl schopen odhalit již 4 % přídavku syrovátky. Vhodnou metodu pro detekci rostlinných bílkovin v sušeném mléce navrhnuli MARABOLI et al. v roce 2002. Pomocí spektrofotometru InfraAnalyzer 500 analyzovali 155 vzorků čistého a falšovaného sušeného mléka (přimíchám obsah sojového, hrachového a pšeničného proteinu) při vlnových délkách 1 100 – 2 500 nm. Kalibrační modely byly vytvořeny ze vzorků, které obsahovali 0 – 5 % rostlinné bílkoviny. Pomocí aplikace MLR a první derivace vyvinuli kalibraci pro detekci a kvantifikaci přesného množství přídavku cizích bílkoviny v sušeném mléce. KASEMSUMRAN et al. (2007) ověřovali schopnost NIR spektroskopie detekovat a kvantifikovat přídavek vody a syrovátky jako příměs v syrovém mléce, a druhé
straně
se snažili
demonstrovat
potenciál
chemometrických
metod
v kombinaci s NIR technikou klasifikaci falšování mléka a stanovení obsahu příměsí
52
LITERÁRNÍ PŘEHLED ve vzorcích. Bylo namícháno 90 vzorků mléka s různým přídavkem vody a syrovátky (50 s přídavkem vody a 40 s přídavkem syrovátky). Vzorky byly reflektančně proměřeny v rozmezí 1 100 – 2 500 nm pomocí spektrofotometru InfraAlyzer 500. Pro vyhodnocení byly použity dvě metody. První diskriminační analýza s metodou částečných nejmenších čtverců (DA-PLS) a metoda Soft independent modeling of class analogy (SIMCA), což je statistická metoda pro řízenou klasifikaci dat (vzorků), kdy je nutno předem definovat třídy, které se skládají ze vzorků, které mají charakteristické vlastnosti a definují dané třídy. Termín "Soft" značí, že tříděním lze identifikovat vzorky, které by mohly patřit do více tříd. Výsledky této studie prokázaly, že NIR spektroskopií je možno stanovit jak příměsi v mléce, tak i určit jejich obsah ve vzorcích. Vytvořené kalibrace pomocí algoritmu PLS dosahovaly korelačních koeficientů pro stanovení množství vody a syrovátky 0,997 a 0,999 a směrodatné odchylky kalibrace SEC ± 2,311 % (v/v) a ± 0,264 % (v/v). JHA et MATSUOKA (2004) použili NIR spektroskopii v rozsahu 700 – 1 124,8 nm k detekci různých příměsí v syrovém mléce, jako je močovina, NaOH, olej a různé čistící přípravky. Získané výsledky vykazovaly velmi nízké odchylky. Autoři uvádějí tuto techniku jako rychlou možnost stanovení cizích látek v mléce. V obdobné práci BORIN et al. (2006) zkoumali možnost využití NIR difúzní reflektance pro detekci a stanovení příměsí v sušeném mléce. Vzorky byly připraveny smícháním sušeného mléka se syrovátkou, škrobem, a sacharózou v různém poměru v rozmezí od 1 – 50 % a proměřeny ve spektrálním rozsahu 1 027,5 – 2 400,0 nm pomocí spektrofotometru CARY 5G UV/VIS/NIR. Na základě metody hlavních komponent (PCA) s 98,3 % pravděpodobností identifikovali, o jakou příměs v sušeném mléce se jedná a s využitím algoritmů LS – SVM (Lest squares – support vector machina) a PLS vyvinuli kalibrační modely pro kvantifikaci příměsí, které vykazovaly velmi nízké chyby predikce. Výsledky studie prokázaly, že lze vytvořit robustní modely stanovení některých běžných příměsi v sušeném mléce. Další variantou falšování mléka je přídavek mléka obnoveného. Touto problematikou se zabývali HAN et al. (2007), kdy použili NIR spektroskopii pro identifikaci přídavku obnoveného mléka do mléka syrového. Pro rozlišení mléka falšovaného od nefalšovaného použili metodu nezávislého modelování tříd analogů
53
LITERÁRNÍ PŘEHLED SIMCA (Soft independent modeling of class analogy). Výsledky ukázaly, že lze se 100 % přesností stanovit množství přídavku obnoveného mléka do syrového, ale jen v případě, že je jeho koncentrace vyšší než 20 %. Zajímco pokud je obsah nižší než 10 %, tak lze toto porušení kvantifikovat jen s přesností 96,7 %. Dále použili metodu PLS, při níž bylo dosaženo těchto výsledků: R = 0,971, RMSECV = 7,76 %, RPD = 5,13. Na tuto studii navázali v roce 2008 LI et al., kdy k vyhodnocení použili diskriminační analýzu s využitím Mahalanobisovy vzdálenosti. Dosažené výsledky Diskriminační analýzy ukázaly, že přesnost detekce je 87,5 % což svědčí o dobrém potenciálu pro rozpoznání falšovaného mléka. Autoři se shodli to, že NIRS je vhodná pro detekci falšování syrového mléka mlékem obnoveným. Různé mléčné výrobky lze falšovat i tím, že se dražší mléko např. ovčí nebo kozí nahradí mlékem kravským. Roku 2007 se GONZÁLEZ – MARTÍN et al. snažili pomocí NIR spektrometrie identifikovat a kvantifikovat původ mléka (kravské, ovčího a kozího), určeného pro výrobu sýra. K proměření 224 vzorků použili optickou sondu. Použitá metoda byla uprave pomocí algoritmu MPLS (modified partial least squares) a bylo dosaženo těchto výsledků: korelační koeficient a směrodatná
odchylka
kalibrace
pro kravské,
kozí
a ovčí
mléko
byla
0,834 ± 11,6 %; 0,871 ± 9,8 % a 0,880 ± 10,6 %. Ze získaných výsledků lze říci, že touto metodou lze stanovit původ použitého mléka při výrobě sýrů. Obdobnou prací se zabývali také YANG et al. (2012), kdy zkoumali rozdíly ve spektrech mezi 3 druhy mléka. Pro analýzy použili 27 vzorků kravského mléka, 21 vzorků buvolího a 30 vzorků jačího mléka. Vzorky byly uloženy při -70 °C a rozmrazení ve vodě při 37 °C byly proměřeny pomocí spektrofotometru DA 7200 ve spektrálním rozsahu 950 – 1 650 nm se 100 sc. Na základě získaných výsledků se autoři shodli tom, že lze mezi sebou rozlišit spektra 3 druhů mlék, protože buvolí mléko má své charakteristické absorpční vrcholy při 1 404 nm, zatím co jačí při 1 382 nm a kravské při 1 518 nm. Velice závažný způsob falšování mléka melaninem, za účelem maskování nízkého obsahu bílkovin, byl velkým problémem některých čínských mlékáren v roce 2008. Melamin je průmyslová látka, která se používá zejmé při výrobě plastických hmot. Poprvé byla identifiková v sušeném kojeneckém mléce, později i v běžném mléce a dalších mléčných výrobcích. Dlouhodobé podávání vysokých
54
LITERÁRNÍ PŘEHLED koncentrací melaminu může vyvolat selhání ledvin až smrt a to především u kojenců a dětí. Maximální výše příjmu melaminu je oficiálně stanove např. v Číně, USA a EU 2,5 ppm ve stravě pro dospělé a 1 ppm ve výživě pro kojence (HOUDKOVÁ, 2012). Kvůli tomuto problému vznikla řada publikací věnujících se detekci melaminu v mléce a mléčných výrobcích. LU et al. (2009) se ve své studii zabývali schopností detekce melaminu v sušeném mléce. Využili NIR spektroskopie v kombinaci s LS-SVM (Lest squares – support vector machina) v režimu reflektance v rozsahu 4 000 – 12 000cm-1. Vytvořená metoda měla detekční limit nižší než 1ppm. Podobných výsledků u sušeného mléka dosáhli i MAUER et al. (2009) a BALABIN et SIMIRNOV (2011), kteří využili NIR spektrometrii k odhalení melaminu v čerstvém mléce, sušeném mléce a mléce pro kojeneckou výživu. Určování geografického původu sýrů Kvalita mléka hraje důležitou roli při výrobě všech druhů sýrů, protože ovlivňuje jak výtěžnost, tak i vlastnosti sýrů. Krmení zvířat je jedním z prvků, který výrobci sýrů považují za velmi důležitý. Vztah mezi původem sýru a typem luk, kterých se krávy pasou, byly intenzivně zkoumány řadou autorů pomocí známých analytických metod. FERNANDEZ et al. (2003) zjistili, že mléko pocházející z oblastí s vyšší nadmořskou výškou obsahuje více seskviterpenů, než mléko z nižších nadmořských výšek, BUGAUD et al. (2001) zjistili, že podíl C18:1 a z celkového podílu C18:2 + C18:3 byl vyšší v horských oblastech než v údolí (uvedené autory citují KAROUI et BAERDEMAEKER, 2007). V poslední době se stále více zvyšuje potenciál použití FT NIR spektroskopie v kombinaci
s chemometrií
k rozlišení
sýrů
různého zeměpisného původu.
Ve většině aplikací nalezených v literatuře, které uvádějí rozlišení sýrů základě zeměpisného
původu,
byly použity klasifikační
techniky jako
je lineární
diskriminační analýza (LDA) a diskriminační analýza s využitím částečných nejmenších čtverců (DA– PLS). Tyto metody nejsou tím nejlepším postupem pro ověřování zeměpisného původu potravin, protože obvykle existuje pouze jediná vyhovující třída pro zařazení neznámého vzorku (OLIVERI et al., 2011).
55
LITERÁRNÍ PŘEHLED První studie zahrnující ověření autenticity sýru pomocí NIR spektroskopie publikovali PILLONEL et al. (2000). Vzorky pocházely z Francie, Německa, Rakouska, Finska a Švýcarska. 20 nastrouhaných vzorků o hmotnosti 150 g bylo pomocí difúzní reflektance proměřeno Petriho misce v rozsahu 1 000 – 2 500 nm, pomocí 64 scanů, při spektrálním rozlišené 2 cm-1. K prozkoumání a využití informací obsažených ve spektru použili PCA analýzu a lineární diskriminační analýzu (LDA). Zpočátku se zaměřili diskriminaci vzorků ze Švýcarska a těch, které pocházejí z jiných zemí, a poté mezi vzorky ze všech regionů dohromady. Pomocí LDA analýzy byly všechny vzorky se 100 % přesností klasifikovány a rozřazeny do 6 evropských regionů. Studie dospěla k závěru, že NIR technika má slibný potenciál, avšak protože bylo použito pro diskriminaci pouze 20 vzorků, nedá se vytvořený model označit za příliš robustní. Na práci PILLONELA et al. (2000) navázali KAROUI et al. (2005b) studií zahrnující analýzu většího počtu vzorků. Pro měření použili jak NIR, tak i MIR oblast. Pro analýzu použili 91 Ementálů pocházejících z Rakouska, Finska, Německa, Francie a Švýcarsko. Analyzované vzorky měly stáří od 12 – 16 týdnů. Pro vyhodnocení byla použita faktorová diskriminační analýza (FDA) a analýza společných komponent s analýzkou specifické měrné hmotnosti (Common component and specific weights analysis - CCSWA. Cílem FDA bylo předpovědět, do které předem definované skupiny neznámý vzorek patří a pomocí CCSWA, která se zabývá
vektorovým
rozdílem
analyzovaných
dat,
popsat
několik
spektroskopických dat, které byly získány při analýze vzorků. Při použití všech diskriminačních faktorů v FDA analýze bylo klasifikováno správně: 100 % sýrů z Rakouska, 94,7 % ze Švýcarska, 83,3 % z Francie, 76,9 % Německa a 66,7 % z Finska. Autoři dospěli k závěru, že NIR spektroskopie je docela dobrý nástroj k identifikaci zeměpisného původu Ementálů. LUŽOVÁ (2011) se ve své práci zabývala otázkou, zda je FT NIR spektrofotometr natolik citlivý, aby byl schopen rozlišit stejné druhy eidamských sýrů o 45 % TvS, ve stejném stupni zrání, od čtyř rozdílných výrobců. Pro vyhodnocení výsledků použila diskriminační analýzu, kdy zjistila, že lze od sebe rozlišit sýry základě původu výroby.
56
LITERÁRNÍ PŘEHLED Autoři GONZÁLEZ – MARTÍN et al. (2011b) ve své práci shrnují využití NIRS techniky společně s optickou sondou k rozlišení sezónnosti mléka (léto, zima), z něhož byly vyrobeny sýry (kravské, ovčí, kozí) různého stáří (nad 6 měsíců). Jako referenční materiál bylo použito 112 letních a 112 zimních sýrů obsahujících různé procento kravského, ovčího a kozího mléka. V průběhu zrání byla pomocí spektrofotometru NIRSystem 5000 zaznamenává NIR spektra sýrů. Jako klasifikační metoda byla použita DPLS s algoritmem 2 PLS. Se 100 vzorky v každé skupině (léto, zima), bez úpravy spekter a 15 PLS faktory bylo dosaženo multiple korelačního koeficientu 0,814 a směrodatné chyby validace 0,257. Z 200 vzorků použitých v interní validaci bylo správně klasifikováno 96 % vzorků sýrů vyrobených ze zimního mléka a 97 % sýrů vyrobených z mléka letního. Pro externí validaci bylo použito 24 vzorků s predikční hodnotou 92 % v obou případech. To znamená, že model může být použit pro rozeznání sezónnosti mléka použitého zpracování jakéhokoliv druhu mléka při výrobě sýrů ve stáří nad šest měsíců. Stanovení stáří sýrů a jejich senzorických vlastností Kvalita sýrů je dá jejich stupněm zrání či zralostí, s čímž jsou spojeny i senzorické vlastnosti, což je jeden z nejdůležitějších parametrů určující kvalitu pro dnešního spotřebitele. BURNS
et CIURCZAK
(2007)
použili
NIR
spektroskopii
studiu
holandských sýrů (Edam a Gouda) v různém stáří. Jejich cílem bylo zařadit sýry do skupin, které byly charakterizovány různou zralostí (20 dnů, min 2 měsíce, min 4 měsíce a min 7 měsíců). Získané výsledky byly slibné, protože korelační koeficient byl 0,92 a směrodatná odchylka kalibrace byla 28 dnů (pro vzorky o zralosti mezi 25 a 412 dnů). Při snížení rozsahu zrání pouze 160 dní dosáhli ještě lepších výsledků (R = 0,96 a SEC = 11). Stanovením zralosti tradičního španělského ovčího sýru Zamorano (CHOP) pomocí NIR techniky, se zabývali roku 2008 REVILLA et al. Na výrobu sýrů Zamorano bylo použito ovčí mléko získané od tří plemen (Churra, Castella a Assaf) s nízkým ( < 500 000 / 1ml), středním (1 000 000 – 1 500 000 / 1ml) a vysokým obsahem ( > 2 500 000 / 1ml) somatických buněk. Pro získání spekter, použili sýry ve stáří 0; 1; 2; 3; 9 a 12 měsíců. Pro získání výsledků využili lineární diskriminační
57
LITERÁRNÍ PŘEHLED analýzu (LDA), která byla provede základě rozdílů stáří sýrů v jednotlivých měsících a množství somatických buněk v každém měsíci. Správně bylo zařazeno 93,7 % klasifikovaných vzorků základě rozdílného stáří. Při klasifikaci sýrů v prvním měsíci zrání s jednou proměnnou (sýry z mléka od plemene Churra nebo Castellana), bylo rozlišeno správně 81,3 % sýrů pocházejících od plemene Assaf, při použití dvou proměnných, také podle obsahu somatických buněk, bylo správně klasifikováno 87,5 %. Podobných výsledků bylo dosaženo při rozlišení sýrů s CHOP proti sýrům bez CHOP ve třetím měsíci zrání (68,8 %) a sýry s obsahem somatických buněk v devátém měsíci (81,3 % správně klasifikováno). Všechny modely byly testovány externí křížovou validací. CATTANEO et al. (2005) se zabývali stanovením stáří italského čerstvého sýru Crescenza. Vzorky byly měřeny v rozsahu 833 – 2 500 nm při 16 sc a rozlišení 10 nm. Celkem 126 sýrů ze dvou typů výroby bylo skladováno 20 dnů a použito k analýzám. Spektra byla uprave druhou derivací a hodnoce PCA analýzou. Touto metodou byl stanoven jasný rozdíl mezi sýry čerstvými, které byly skladované 0 – 6 dnů, zralými skladované 8 – 10 dnů a starými skladované 20 dnů. Autoři dospěli k závěru, že hlavní výhodou použití spektroskopické techniky byla možnost rychlého vytvoření profilu, který spojoval složení sýrů s jeho kvalitou. Detekci Clostridium tyrobutyricum při zrání polotvrdých sýrů Danbo NIR spektroskopií přibližuje práce SØRENSENA et JEPSENA (1997). Práce ukázala, že prostřednictvím NIR spektroskopie je možné kvalitativně hodnotit zrání sýrů. LEFIER et al. (2000) pomocí infračervené Fourierovy spektroskopie zkoumali rozmanitost mikroflóry během zrání měkkých sýrů (sýry s plísní v těstě). Pozorovali skupinu sýrů, u kterých byly použity dvě startovací kultury. Jed kultura obsahovala 6 typů Lactococcus lactis ssp. lactis a druhá 2 typy Lactococcus Lactis ssp. cremoris. Byla urče referenční spektra pro jednotlivé kmeny a základě diskriminační analýzy byla proměřená spektra vyhodnoce pomocí Mahalanobisovy vzdálenosti. Na základě výsledků autoři uvádějí, že FT IR spektroskopie je rychlá a robustní metoda pro kvalitativní analýzy mikroflóry sýrů a sledování růstu startovací kultury během zrání sýrů. SØRENSEN et JEPSEN (1998b) použili jak reflektanční tak i transmitanční spektroskopii
pro stanovení
senzorických
58
vlastností
u 32
sýrů
Danbo.
LITERÁRNÍ PŘEHLED Pro transmitanci použili region 850 – 1 050 nm a pro reflektanci 1 110 – 2 490 nm. Jako senzorické vlastnosti byly hodnoceny konzistence a chuť, které hodnotil 10 členný panel hodnotitelů. Mezi texturní vlastnosti byly zařazeny: pružnost, lepivost, soudržnost, měkkost a tvrdost. K chuťovým vlastnostem patřily sýrová, kyselá, sladká a nečistá. Přesnost výsledků NIR reflektanční spektroskopie byla lepší než u transmitanční. Korelační koeficient kalibrace obdržený reflektanční technikou se pohyboval v rozmezí 0,86 – 0,94 u texturních vlastností a v rozmezí 0,52 – 0,77 u chuťových vlastností. Protože senzorické vlastnosti sýrů se odvíjejí od jejich chemického složení, z výsledků práce vyplývá, že i senzorické vlastnosti je možné určovat pomocí NIR spektroskopie. Potenciál NIR spektroskopie předpovídat zralost a smyslové atributy 24 sýrů čedarového typu vyrobených za použití 5 různých sýřících enzymů a skladovaných při 4 °C 9 měsíců, byly sledovány pomocí Foss NIRSystems 6500 vědeckým týmem DOWNEY et al. v roce 2005. Autoři ukázali, že NIR spektroskopii lze využít k úspěšnému předpovídání zralosti a několika smyslovým charakteristikám jako je drobivost, elasticita, žvýkatelnost, ulpívání v ústech, mazlavost, tavitelnost a formování hmoty s dostatečnou přesností pro průmyslové použití. Nicméně vzhledem k nízkému počtu zkoumaných sýrů v jejich studii by získané výsledky měly být hodnoceny s rezervou, dokud nebude model rozšířen o větší množství sýrů. BLAQUEZ et al. (2006) využili NIR reflektanční spektroskopii snímání spekter tavených sýrů ve spektrálním rozsahu 750 – 2 498 nm. Sýry byly skladovány 2 až 4 týdny při teplotě 4 °C. U vzorků bylo stanoveno 9 senzorických a 5 instrumentálních vlastností. Autoři uvádějí, že smyslové vlastnosti byly předpovězeny s dostatečnou přesností a doporučují využití NIR reflektanční spektroskopie pro rutinní kvalitativní hodnocení tavených sýrů. ŠUSTOVÁ et al. (2002) využili FT NIR spektroskopii sledování vlivu chlazení reologické vlastnosti tavených sýrů. Pomocí spektrofotometru FT NIR Antaris bylo proměřeno 23 tavených sýrů. Na základě diskriminační analýzy byly prokázány rozdíly mezi spektry tavených sýrů chlazených ihned (při teplotě 60 °C) a tavených sýrů chlazených 24 hodinách (při teplotě pod 60 °C). MLČEK et ŠUSTOVÁ (2006) využili ve své práci NIR reflektanční spektroskopii k hodnocení texturních vlastností eidamských sýrů. Vzorky byly
59
LITERÁRNÍ PŘEHLED odebírány
v měsíčních
intervalech
dobu
6
měsíců
a proměřeny
pomocí
spektrofotometru FT NIR Antaris v kompresní rotační kyvetě ve spektrálním rozsahu 12 500 – 4 000 cm-1. Pro analýzy bylo použito 30 vzorků, u nichž byla stanovová tvrdost mezi prsty a ústy, mazlavost, elasticita palcem a ústy, drobivost a žvýkatelnost. Pomocí metody PLS bylo dosaženo spolehlivých kalibrací pro různé vlastnosti až stanovení mazlavosti a tvrdosti mezi ústy, jejichž výsledky dosahovaly vysokých kalibračních a validačních odchylek. REVILLA
et
al.
(2009)
využili
NIRS
technologii
s použitím
Warner - Bratzlerovy sondy pro analýzu textury tvrdého ovčího sýru ve stáří 0; 1; 2; 3; 9 a 12 měsíců. 96 vzorků bylo proměřeno ve spektrálním rozsahu 1 100 – 2 000 nm při rozlišení 2 nm a 32 scany, přičemž 76 vzorků bylo použito pro kalibraci a 20 vzorků pro validaci. Pro vyhodnocení výsledků byla použita upravená regresní metoda PLS. Získané kalibrace pro stanovení textury byly charakterizovány korelačním koeficientem kalibrace 0,961 a směrodatnou odchylkou kalibrace 2,1 N. Ze získaných výsledků vyplývá, že vzniklý kalibrační model lze použít i pro stanovení textury neznámých vzorků sýra. PILLONEL et al. 2007 použili NIR spektroskopii k předpovědi barvy (hodnot L, a, b) evropských ementálů. Dvacet vzorků bylo proměřeno spektrofotometru Büchi NIR Lab N – 200 s využitím rotační kyvety v rozmezí 1 000 – 2 500 nm. Při použití PCA analýzy bylo dosaženo těchto hodnot pro L: R2 = 0,56; SEC = 0,76; RPD = 1,89 a RER = 7,91, pro hodnoty a: R2 = 0,72; SEC = 0,15; RPD = 1,98 a RER = 7,6 a hodnoty b: R2 = 0,82; RMSECV = 0,52; RPD = 2,56 a RER = 9,42. Z dosažených výsledků vyplývá, že NIR spektroskopie může být použita k předpovědi barvy ementálských sýrů. WOODCOCK et al. (2008) shrnuli ve své práci výsledky publikací zabývajících
se kontrolou
kvality
a autenticity
(složením,
senzorických
a reologických vlastností) sýrů. Z jejich práce vyplývá, že reflektanční spektroskopie je vhodnější pro průmyslové využití než transmitanční. Potenciál využití NIR spektroskopie
pro kontrolu
kvality
a autenticity
K podobným závěrům dospěli i ZOU et al. 2011.
60
je do budouc velmi
vysoký.
LITERÁRNÍ PŘEHLED
3.4 Chemometrie Rozšíření NIR spektroskopie by nebylo možné bez současného rozvoje chemometrických metod a výkonné počítačové techniky, která umožňuje statistické vyhodnocení snímaného spektra v korelaci s analyticko-chemickými a fyzikálními vlastnostmi měřených vzorků (Mc CLURE, 2003). Chemometrie tedy využívá matematických
a statistických
metod
k uspořádání
velkého
množství
experimentálních dat, k určení společných vlastností a k odhalení funkčních vztahů a zákonitostí v nich skrytých (HOLÍK, 2007). Tento termín poprvé použil SVANTE WOLD v roce 1971 (ECKSCHLAGER, 1991; HEISE et WINZEN, 2008). Naměřená NIR data v kombinaci s chemometrickými metodami zvyšují množství informací o spektrech analyzované látky, čímž se zvýší např. i možnost rozlišení velmi podobných materiálů (HEISE et WINZEN, 2008). Při použití těchto metod také dochází k odstranění problému rozptylu záření způsobeného rozdíly ve velikosti částic analyzovaného materiálu (OSBORNE, 1993). Výhodou chemometrického zpracování je, že velmi často usnadní výklad určitého chemického jevu či jeho příčin tím, že umožní získat informace, které nejsou bez takového zpracování patrné (ECKSCHLAGER, 1991). Cílem aplikace chemometrických metod je vytvoření kalibračního modelu a získání propracovaného systému možnosti statistického vyhodnocení získaných výsledků. K tomu se nejčastěji využívají metody založené principu vícenásobné lineární regrese jako např. metoda hlavních komponent (PCR – Principal Component Regression) a metoda částečných nejmenších čtverců (PLS – Partial least squere). Metoda
PLS
byla
použita
pro kvantitativní
vyhodnocení
výsledků
v předkládané disertační práci, a proto se jí budeme více zabývat v kapitole 3.4.3.1. Chemometrické metody používané v kvalitativní analýze NIR spekter jsou nejčastěji shluková analýza (cluster analysis), analýza hlavních komponent (PCA – principal component analysis) a diskriminační analýza (DA – discriminant analysis). Shluková analýza slouží k třídění vzorků do skupin (shluků) tak, aby si vzorky náležící do stejné skupiny byly podobnější než vzorky ze skupin různých. Cílem shlukové analýzy je tedy nalézt v datech podmnožiny podobných objektů. Diskriminační analýza určuje třídu (nebo třídy), které jsou nejpodobnější neznámému materiálu
61
LITERÁRNÍ PŘEHLED (HEISE et WINZEN, 2008). Tato metoda je blížeji popsá v kapitole 3.4.4.1, protože byla použita kvalitativnímu vyhodnocení výsledků disertační práce. 3.4.1 Tvorba kalibrace Pod pojmem tvorba kalibrace v NIR spektroskopii si můžeme představit veškeré kroky, které jsou potřebné pro odhad matematického vztahu mezi optickými vlastnostmi vzorku a jeho chemickým složením (DOHNAL, 1999; HURBURGH et IGNE, 2010). Nejčastěji se zde můžeme setkat s tzv. vícerozměrnou inverzní kalibrací, jejímž cílem je popis závislosti mezi skupinou naměřených dat, např. spektrem X, a veličinami kalibračního modelu, např. koncentracemi C látek ve směsi. Tato aplikace umožňuje stanovení hodnot koncentrací jednotlivých složek v neznámém vzorku (c*) z jeho naměřeného spektra (x*). Inverzní kalibrace vyžaduje nutnou znalost koncentrace sledované látky v kalibračních vzorcích. Pro vzorky jsou zaznamená spektra absorbance X a sestrojen kalibrační model, popisující vztah mezi koncentrací sledované látky c a absorbancí X rovnicí: c = X . β + ec (n,1) (n,m) (m,l) (n,l)
c1 c2 cn
x11 x1m x 21 x 2 m x nl x nm
1 2
m
e1 e2 en
kde ci je koncentrace sledované látky v kalibračním vzorku i, xij je absorbance tohoto vzorku při j-té vlnové délce, βj je regresní koeficient čili molární absorpční koeficient pro vlnovou délku j a ei je koncentrační reziduum vzorku i, čili rozdíl mezi koncentrací stanovenou referenční metodou a koncentrací vypočtenou proložením kalibračních dat modelem. Odhad parametrů modelu metodou nejmenších čtverců (PLS) je dán vztahem: β= (XT . X )-1 . XT . c (m,l) (m,n) (n,m) (m,n) (n,l) Řešení existuje pouze v případě, když počet kalibračních vzorků n je větší než počet vlnových délek m spektra, m>n. Jinak nelze invertovat součin XTX a tím ani odhadnout parametry β. Moderní analytické přístroje umožňují naměřit spektrum
62
LITERÁRNÍ PŘEHLED při stovkách vlnových délek a zmíněný předpoklad je pak zásadním omezením použitelnosti metody. Byly proto navrženy dvě strategie jak postupovat, pokud uvedená podmínka není splněna: 1. Z původního spektra vhodnou metodou vybrat omezený počet vlnových délek tak, aby podmínka byla splněna. 2. Zkomprimovat původní spektra získaná při stovkách vlnových délek do formy latentních proměnných, a ty pak použít
kalibraci namísto
původních absorbančních proměnných (MELOUN et MILITKÝ, 2002).
Obr. 8 Kvantitativní NIRS kalibrace (převzato z HURBURGH et IGNE, 2010). Pro vytvoření přesného kvantitativního, ale i kvalitativního kalibračního modelu je obecně základním požadavkem dostatečný počet analyzovaných vzorků ( ˃ 30) (ČURDA, 2002; ČIŽMÁR, 2010). Vzorky kalibraci by měly byt odebrány z podobných souborů, které by se měly měřit v budoucnosti. Rovněž i příprava (sušení, mletí, skladování atd.) by měla být podobná přípravě vzorků, které se budou sériově měřit. Je třeba získat co nejširší škálu vzorků s různým chemickým složením (MÍKA et al., 2008). Funkčnost kalibračního modelu je, mimo přesnosti vlastního měření, obecně závislá dvou faktorech. Jedním z nich je fyzikální podstata vzniku spekter, tj. citlivost odezvy spektrometru
jednotkovou změnu koncentrace
stanovovaného analytu. Druhou je přesnost vstupních dat, získaných referenčními postupy, protože kalibrací infračervených spekter nelze dosáhnout lepší přesnosti stanovení, než je přesnost metody, kterou byla vstupní data získána. Přesnost stanovení lze však zvýšit rozšířením kalibračních modelů o další standardy (TENKL et al., 2009).
63
LITERÁRNÍ PŘEHLED Princip kvalitativní kalibrace je daný postupy, pomocí kterých se jeden objekt řadí do jedné existující třídy (diskriminační analýza), nebo pomocí nichž lze nespořádanou skupinu objektů uspořádat do několika vnitřně sourodých tříd či shluků (analýza shluku CLU), kdy je daný postup klasifikace založen určitých předpokladech o vlastnostech klasifikovaných objektů. Proto je velmi důležité pečlivě se zaměřit výběr standardů, které budou popisovat definovanou třídu, protože jejich variabilita bude vymezovat oblast pro posouzení neznámého vzorku v kalibračním modelu za vyhovující. Při této kalibraci rozhoduje, zda je neznámý vzorek dostatečně shodný se standardy a je-li správně zařazen do charakterově nejbližší třídy (CENTNER, 2002). Abychom mohli požadované kalibrace vytvořit, je nutné mít k dispozici příslušný počítačový software, který je vhodný k měření vzorků
a získání
jejich
spekter
(Result
integration)
a software
potřebný
pro chemometrické zpracování dat (TQ Analyst). Výsledky analýz pro každou stanovovanou látku mohou být vyjádřeny několika způsoby např.: koncentrací, maximální výškou píku, integrálem, absorbancí, počtem částic, jménem třídy, atd. (GELADI, 2003). 3.4.2 Úprava NIR spektra NIR absorpční pásy (spektrum) vznikají tehdy, když NIR záření o specifické frekvenci vibruje stejné frekvenci jako molekulové vazby ve vzorku. Naměřená spektra vzorků obsahují informace o charakteristických absorpcích, které jsou spojeny se svrchními tóny (Δν ˃ 1) a kombinačními přechody valenčních a deformačních vibrací. K identifikaci látek tak nedochází základě přiřazení pásů jednotlivým funkčním skupinám, ale využívá se tzv. celospektrálních metod (WORKMAN et WEYER, 2008; ŠIŠKANOVÁ, 2010). I přesto NIR spektra obsahují charakteristické informace, které jsou dány funkčními skupinami – CH, – NH, – OH, které jsou odpovědné za vibrační stavy molekul. Typická NIR spektra mají lineárně rostoucí trend od kratších k delším vlnovým délkám, což je způsobeno rozptylem záření, který závisí velikosti částic vzorku a vlnové délce dopadajících záření (ESBENSEN, 1998). Z hlediska kvantitativního hodnocení je to jeden z nejdůležitějších faktorů v NIR spektru, protože Log (1/R) se zvyšuje s velikostí částic vzorku, což je dáno prodlužující se délkou optické dráhy. Tento efekt
64
LITERÁRNÍ PŘEHLED je multiplikativní, protože např. pro potraviny a zemědělské produkty je odrazivost paprsku náhodná, což je způsobeno právě vlivem různé velikosti částic vzorku (MANLEY et al., 1994). Na obrázku 9 je znázorněno NIR spektrum bez jakékoliv úpravy. Avšak před kalibrací je obvykle vhodná a někdy i přímo nutná úprava spektrálních dat (ČURDA et al., 2002). V následujících kapitolách budou blíže popsány
aplikace,
které
byly
použity
pro úpravu
spekter
při zpracování
výsledků disertační práce.
Obr. 9 NIR spektrum sušené syrovátky bez jakých koliv úprav. 3.4.2.1 Redukce velikost částic (Standard Normal Variate – SNV) Významnou úpravou spekter před tvorbou kalibrace je aplikace redukce velikosti částic (SNV – Standard Normal Variate). Pomocí SNV dochází k úpravě spektrálních dat s cílem kompenzace rozdílů v optických drahách vzorků. SNV redukuje vliv velikosti částic tak, že každé spektrum upraví tak, aby v souboru byla směrodatná odchylka proměnných v každém bodě rov 1 (ČURDA, 2002). Tato úprava je vhodná v případech, kdy existují multiplikativní příspěvky (způsobené rozptylem záření), které významně korelují s optickou vrstvou. S optickou drahou je pak nakládáno pouze jako s jedním z příspěvků k výslednému spektrálnímu signálu. Pro každý standard software počítá průměr a standardní odchylku regionu základní linie. Potom pro každý bod nebo body ve spektrálním regionu odečítá tento průměr a dělí ho směrodatnou odchylkou. Toto normalizuje všechny standardy a postaví
je „stejnou
startovní
čáru“.
SNV
korekce
je pak
automaticky
apliková i neznámé vzorky. Tento algoritmus je vhodné použít v případech, kdy
65
LITERÁRNÍ PŘEHLED je třeba kompenzovat rozdíly v optické tloušťce, způsobené různým rozložením tuhých částic ve vzorku, anebo pokud mají spektra neznámých vzorků odlišné charakteristiky rozptylu než spektra látek použita kalibraci (BURNS et CIURCZAK, 2007; NICOLET.CZ, 2007a). 3.4.2.2 Derivace spekter Derivační metody se používají v NIR spektroskopii již dlouho jako předběžné metody pro potlačení neustálého působení signálu pozadí a zvýšení schopnosti rozlišení. Derivované spektrum první derivace je vyjádřeno jako d (log1/R)/dλ. Tato derivace poskytuje křivku s píky, které korespondují s body inflexe každé straně log (1/R) píku. Je potřeba si uvědomit, že má první derivace tedy v místě maxima signálu píku nulu a to může znesnadnit odečtení jeho polohy. Na obrázku 10a je znázorně ukázka spektra při jeho první derivaci. Jak lze vidět rostoucí lineární trend byl odstraněn.
Obr. 10 První a) a druhá b) derivace NIR spektra sušené syrovátky. Velmi časté je také použití druhé derivace spekter, která si zachovává intensitu a polohu pasů a zlepšuje jejich rozlišitelnost, protože v místě signálu se vytváří ostrý pík. Musí se ale dát pozor intenzitu šumu v signálu, protože by se mohl negativně projevit v derivovaném spektru vzorku. Druhá derivace lze vyjádřiv vztahem d2 (log1/R)/dλ2 (BEEBE et al., 1998; Mc CLURE, 2007; OZAKI, 2007). Na Obr. 10b je opět znázorně ukázka spektra při jeho druhé derivaci. 3.4.3 Kvantitativní analýza Nejjednodušší spektrální kvantitativní analýza předpokládá platnost Lambertova – Beerova zákona, tj. lineární závislost mezi absorbancí a koncentrací měřených
66
LITERÁRNÍ PŘEHLED analytů (za jinak konstantních experimentálních podmínek). To vyžaduje, aby vybrané vibrační pásy nebyly ovlivněny intermolekulární interakcí, a aby se v infračerveném spektru nepřekrývaly. Vzhledem k tomu, že pásy v NIR oblasti jsou obvykle široké i pro čisté látky, a nelze vyloučit jejich překryv, není princip Lambertova – Beerova záko obvykle splněn. Proto se pro kvantitativní kalibraci v NIR spektrometrii musí vyvíjet kalibrační modely s využitím pokročilých chemometrických algoritmů (MATĚJKA, 2006; OZAKI et al., 2007; TENKL et al., 2009). V našem případě jsme pro zpracování výsledků použili algoritmus částečných nejmenších čtverců (PLS – Partial least square). Tato metoda je vhodná k analýze materiálu, který nemá přesně definovanou matrici, a také pokud chceme stanovit více analytů z jednoho spektra. Nevýhodou je poměrně široký matematický aparát a rovněž potřeba značného množství standardů nutných k vytvoření spolehlivého kalibračního modelu (NICOLET.CZ, 2007b). 3.4.3.1 Metoda částečných nejmenších čtverců (Partial Least Squares – PLS) Tato metoda byla vyvinuta v 70. letech HERMANEM WOLDEM a své využití měla zejmé v sociálních vědách. Poměrně záhy se začala využívat i v chemických či spektrálních aplikacích. Velmi často se však tato metoda objevuje ve spojitosti právě s infračervenou spektroskopií, neboť nám umožňuje komprimovat často velmi obsáhlou matici spektrálních dat (TENKL et al., 2009). Při použití algoritmu PLS se v rámci kalibračního modelu využívají nikoli hodnoty absorbance v maximech vybraných pásů, ale většinou se vyhodnocují širší spektrální úseky či dokonce celá NIR spektra, přičemž se využívá oblasti spekter, které jsou statisticky proměnlivé jako funkce koncentrace dané komponenty. PLS regrese tedy vyhledává soubor faktorů (hlavní komponenty), které upravují současné rozložení spektrálních dat a analytické koncentrace s tím, že tyto faktory vysvětlují v maximální možné míře kovariance spektrální informace a koncentrace analyzované látky. Tím dochází k odstranění problému, který je způsobený vzájemnou korelací mezi různými vlnovými délkami. Během kalibrace metody PLS jsou všechny důležité koncentrační a spektrální informace analyzované oblasti nebo oblastí kalibračních standardů kondenzovány do souborů nových proměnných, tzv. hlavních komponent (Principal components – PC). Každá komponenta reprezentuje nezávislý zdroj proměnlivosti
67
LITERÁRNÍ PŘEHLED v kalibračních datech a popisuje odchylky v NIR spektrech, které odpovídají odlišnostem v chemickém složení analyzovaných látek. Tyto komponenty jsou seřazeny podle množství variability, kterou reprezentují a jsou vyvíjeny společně s kalibračním modelem, který zajistí nejlepší korelaci mezi informací poskytnutou koncentrací analytu a jeho spektrální informací (BEEBE et KOWLASKI, 1987; HAALAND et THOMAS, 1988a,b; MELOUN et MILITKÝ, 2002). Tato metoda využívá vztah složité matematické operace statistické a faktorové analýzy. Při tvorbě kalibračního modelu dochází k redukci matice dat dimenze (n, N), kde n je počet bodů spektra a N počet kalibračních směsí matici dimenze (nf, N), kde nf udává počet „faktorů“. Faktorem rozumíme kombinace spektrálních charakteristik. S touto redukcí je spoje i redukce matice z rozměru (n, ns) rozměr (nf, ns), kde ns je počet nezávisle absorbujících složek. Maticový popis: PŘED REDUKCÍ:
A(n, N) = k (n, ns) . c (ns, N) + e (n,N)
PO REDUKCI:
A(nf, N) = k (nf, ns) . c (ns, N) + e (nf,N)
A…matice dat (N spekter o n bodech) k…matice koeficientů (n koeficientů pro ns složek) c…matice koncentrací složek (ns složek v N směsích) e…matice odchylek (pro n bodů v N spektrech) (NICOLET.CZ, 2007b). Na obr. 11 lze vidět grafické znázornění metody nejmenších čtverců.
Obr. 11 Grafické znázornění metody nejmenších čtverců.
68
LITERÁRNÍ PŘEHLED yi - i – tá pozorovaná hodnota při hodnotě faktora xi ypi – i – tá predikovaná hodnota ei - i – té reziduum
y pi b0 b1 xi
ei yi y pi
dMi – odchylka i – té predikované hodnoty od průměru pozorovaných hodnot
d Mi y pi y dTi – ochylka i – té pozorované hodnoty od průměru pozorovaných hodnot
dTi yi y Hodnota ypi = b0 + b1xi se nazývá predikovaná hodnota a odchylka pozorované hodnoty od predikované reziduum e (ANONYM, 2012). Výstupem u metody PLS je lineární regrese mezi vloženými kvantitativními hodnotami
a hodnotami
vypočtenými
kalibračním
modelem.
Při
vhodně
vypracovaném kalibračním modelu by tato regrese měla mít jednotkovou směrnici se statisticky nevýznamným absolutním členem (NICOLET.CZ, 2007b). PLS regresní algoritmus se stal jedním z dominantních postupů vícerozměrné kalibrace díky kvalitě získaného kalibračního modelu (VENKATESAN et al., 2011). VÝHODY PLS METODIKY: Umožňuje kalibrace za použití pásů nebo regionů, které se silně překrývají. Řeší interference neznámých komponent (nečistot). K výpočtům jsou použity všechny datové body v analyzovaném regionu. Uživatel nepotřebuje specifikovat zvláštní oblast pro každou komponentu. NEVÝHODY: Vyžaduje velké množství standardů. Pochopení jejích matematického principu je obtížné (NICOLET.CZ, 2007b). 3.4.4 Kvalitativní analýza Na rozdíl od stanovení koncentrace ve vzorku při kvantitativní analýze, jsou kvalitativní vlastnosti výrobků (vzorků) spojeny s jejich spektrální odlišností a nemohou být vyjádřeny jako spojité funkce, ale místo toho mají diskrétní hodnoty, které například mohou představovat shodnost či totožnost výrobků, anebo reprezentovat jejich dobrou kvalitu (HEISE et WINZEN, 2008). Výsledkem takového hodnocení je potvrzení nebo zpochybnění identity vzorku nebo zařazení
69
LITERÁRNÍ PŘEHLED analyzovaného
vzorku
do různých
tříd
–
klasifikace
(MUSELÍK,
2012).
Chemometrické metody používané pro tvorbu skupin (tříd) anebo pro klasifikaci spekter vzorků, látek nebo materiálu jsou rozděleny základě použitého algoritmu. Rozsáhlá srovnání různých možností klasifikačních metod kvalitativní analýzy jsou shrnuty ve studii WALCZAK et MASSART (1998). Větši kvalitativních metod funguje při výběru celého spektra, ale jsou i metody, které se spoléhají výběr určitých vlnových délek (HEISE et WINZEN, 2008). 3.4.4.1 Diskriminační analýza (Diskriminant analysis) Diskriminační analýza byla poprvé popsá RONALDEM FISHEREM v roce 1936. Jedná se o klasifikační techniku, určující, do které třídy známých materiálů v kalibračním modelu neznámý vzorek patří. Výsledkem analýzy je jméno třídy nebo tříd, které jsou hodnocenému spektru nejpodobnější.
Obr. 12 Znázornění aplikace diskriminační analýzy. Klasifikace pomocí diskriminační analýzy vyžaduje sestrojení kalibračního modelu, ve kterém jsou specifikovány jednotlivé třídy, přičemž každá třída je popsá libovolným počtem standardů (obvykle 5 a více). Klasifikační pravidla (matematický algoritmus), která jsou používá k vytvoření kalibračního modelu, interpretují NIR spektrum jako bod v dimensionálně redukovaném faktorovém prostoru. Součástí výsledku může být i tzv. Mahalanobisova vzdálenost, která určuje vzdálenost hodnoceného spektra od těžiště každé třídy. Mahalanobisova vzdálenost Jde o obecné měřítko vzdálenosti beroucí v úvahu korelaci mezi parametry a je nezávislá rozsahu hodnot parametrů. Počítá vzdálenost mezi objekty v systému souřadnic, jehož osy nemusí být sebe kolmé. V praxi se používá pro zjištění vzdálenosti mezi skupinami objektů.
70
LITERÁRNÍ PŘEHLED Jsou dány dvě skupiny objektů w1 a w2 o n1 a n2 počtu objektů a popsané p parametry:
D52 (w1 , w2 ) d12V 1 d´12 kde d12 je vektor o délce p rozdílů mezi průměry p parametrů v obou skupinách. V je vážená disperzní matice (matice kovariancí parametrů) uvnitř skupin objektů.
V
1 (n1 1)S1 (n 2)S 2 n1 n2 2
kde S1 a S2 jsou disperzní matice jednotlivých skupin. Vektor d12 měří rozdíl mezi p-rozměrnými průměry skupin a V vkládá do rovnice kovarianci mezi parametry. Při konstrukci kalibračního modelu jsou, podobně jako při kvantitativní analýze PLS, kondenzovány všechny spektrální informace ve spektru do souborů proměnných tzv. hlavních komponent (Principal Components – PC). Každá komponenta reprezentuje nezávislý zdroj proměnlivosti v kalibračních datech. Komponenty jsou seřazeny podle množství variability, kterou reprezentují. První komponenta popisuje nejvíce variabilitu kalibračního spektra. Při definici třídy materiálu pomocí více kalibračních standardů vzniká v kalibračním modelu shluk bodů – tzv. klastr. Analýza neznámého vzorku promítá posuzované spektrum do prostoru a přiřazuje ho k nejbližší definované třídě, přičemž lze mimo jmé třídy získat i vzdálenost analyzovaného spektra od těžiště klastru této třídy (BEEBE et al., 1998; NICOLET.CZ, 2007c; BOWER, 2009; JARKOVSKÝ et LITTNEROVÁ, 2011; MUSELÍK, 2012). 3.4.5 Kritéria pro hodnocení spolehlivosti kalibračního modelu Při tvorbě kalibračních modelů je cílem vytvořit kalibraci, s co nejlepší predikční schopností správného určení parametrů nového vzorku s podobnými vlastnostmi jako má kalibrační soubor vzorků. Parametry charakterizující kvalitu vytvořeného kalibračního modelu jsou: korelační koeficient zmiňované lineární regrese, směrodatná odchylka kalibrace (Standard Error of Calibration – SEC), křížová validace (cross – validation), směrodatná odchylka predikce (Standard Error of Prediction – SEP), kalibrační variační koeficient (Calibration Coefficient of Variation – CCV), predikční variační koeficient (Prediction Coefficient of Variation
71
LITERÁRNÍ PŘEHLED – PCV). Dále určení optimálního počtu PLS faktorů (PRESS) a identifikace odlehlých standardů pomocí funkcí: Spectrum Outlier, Principal component Score (PC Score) a Leverage. Pro ověření správné predikce kalibračního modelu lze využít metodu Dvoupárového T-testu střední hodnotu, kdy dochází hladině významnosti 0,05 k posouzení, zda li se hodnoty (referenční a predikované) průkazně neliší. 3.4.5.1 Korelační koeficient (R) Korelační koeficient R udává míru lineární závislosti mezi naměřenými spektry a referenčními hodnotami. Může se pohybovat v intervalu od -1 (dokonalá negativní závislost) do +1 (dokonalá pozitivní závislost). Pro výpočet korelačního koeficientu závislosti mezi referenčními a předpověděnými hodnotami z NIR spekter platí vztah: N
R
[( x x i
i 1 N
(x x i 1
i
)( yi , NIR y NIR , prum)]
prum
,
N
)
prum
2
( y i 1
i , NIR
y NIR , prum)
2
yNIR udává hodnotu předpověděnou z NIR spektra, xi je referenční hodnota i-tého kalibračního vzorku, yNIR,prum je průměrná hodnota yNIR, xprum je průměrná hodnota xi a N je počet kalibračních vzorků. Někdy není uváděn korelační koeficient, ale jeho druhá mocni tzv. koeficient determinace (R2). 3.4.5.2 Směrodatná odchylka kalibrace (Standard Error of Calibration – SEC) Kvalitu vytvořeného kalibračního modelu můžeme také posoudit podle tzv. směrodatné odchylky kalibrace SEC (Standard Error of Calibration), která je dá vztahem:
SEC
1 N ( yNIR xi )2 , N 1 i 1
kde yNIR je hodnota předpověděná z NIR spektra, xi referenční laboratorní hodnota i-tého kalibračního vzorku, N je počet kalibračních vzorků (ESBENSEN,1998). 3.4.5.3 Křížová validace (cross – validation) Přesnost předikovaných hodnot analýz často závisí tom, jak funkční byla použitá kalibrace. K ověření dostatečné přesnosti kalibračního modelu se používá tzv. cross – validace (angl. Cross – validation) kalibrace. Postup výpočtu začíná vynecháním
72
LITERÁRNÍ PŘEHLED jednoho páru proměnných a výpočtu parametrů b0 a b1 kalibrační rovnice metodou nejmenších čtverců ze zbylých hodnot yexp a xexp. yexp = b0 + b1xexp +
yvypoč = b0 + b1xvynech
Pomocí parametrů b0 a b1 a vynechané nezávisle proměnné xvynech se vypočítá očekávaná hodnota závisle proměnné yvypoč a použije se spolu s vynechanou hodnotou yvynech pro vyjádření tzv. čtverce reziduálu (SR – Squere residual) SR = ( yvypoč - yvynech)2 Postup, tj. vynechání páru proměnných a další výpočet, se opakuje pro všechny páry x a y. Nakonec se ze všech získaných SR hodnot vypočítá směrodatná odchylka predikce (SEP – Standard Error of Prediction) celé kalibrační funkce (HAALAND et THOMAS, 1988). Jestliže metoda funguje dobře, tj. vypočítaná hodnota stanovované složky se shoduje s hodnotou, která je standardu přiřaze jako referenční, datové body zobrazené rozmístěny
úhlopříčce
zobrazovací
pole.
vygenerovaném grafu jsou
Informace
vygenerovaná
touto
diagnostikou může být použita také k vyhledání odlehlých standard (NICOLET.CZ, 2007a). 3.4.5.4 Směrodatná odchylka predikce (Standard Error of Prediction – SEP) Vytvořený kalibrační model je testován nezávislým souborem vzorků o známém složení. Predikce (předpověď) je určení koncentrace složky ze spektra základě vytvořené
kalibrační
rovnice.
SEP
(standard
error
of
prediction)
je definová vztahem:
SEP
1 M ( yNIR xi bias )2 , M 1 i 1
kde yNIR je hodnota předpovězená z NIR spektra, xi je referenční laboratorní hodnota i-tého validačního vzorku, M je počet validačních vzorků. Hodnota bias (průměrná diference mezi předpověděnými hodnotami z NIR spekter yNIR s referenčními hodnotami xi pro vzorky validačního souboru) je vypočítá ze vztahu: bias
1 M
M
( y i 1
NIR
xi ) .
Je kladen důraz minimální SEP, protože se jedná o odchylku (chybu), která je očekává v budoucích předpovědích. SEP spolehlivé kalibrace není obvykle
73
LITERÁRNÍ PŘEHLED o mnoho větší než SEC, oproti směrodatné odchylce při laboratorním stanovení bývá SEP úspěšné NIR kalibrace přibližně dvojnásobně větší (ESBENSEN, 1998). 3.4.5.5 Kalibrační a predikční variační koeficient (Calibration and Prediction Coefficient of Variation – CCV a PCV) Spolehlivost vytvořené kalibrace pro různé složky lze také ověřit výpočtem tzv. kalibračního variačního koeficientu CCV (calibration coefficient of variation) a predikčního variačního koeficientu PCV (Prediction coefficient of variation) v procentech: CCV
SEC .100 , X prum
PCV
SEP .100 , X prum
kde SEC je směrodatná odchylka kalibrace a SEP je směrodatná odchylka predikce a Xprum je průměr laboratorních hodnot složky. Výhodou CCV ve srovnání s SEC je nezávislost použitých jednotkách. Dobrá kalibrace má CCV do 5 % (PCV do 10 %), do 10 % CCV je model ještě použitelný (ESBENSEN,1998; ČURDA et al., 2002; MÍKA et al., 2008). 3.4.5.6 PRESS (predicted residual sum of squares) Při vývoji kalibračního modelu pomocí regresní metody PLS (Partial least square) (viz. kap. 3.3.1) je třeba věnovat pozornost především diagnostickému nástroji, označovanému zkratkou PRESS („predicted residual sum of squares“) (MATĚJKA, 2006). Funkce PRESS zobrazuje, jak se hodnota sumy čtverců predikované zbytkové chyby mění s číslem hlavních komponent (Principal components – PC) použitých kalibraci každé složky stanovované aktivní metodou.
Dle HAALANDA
et THOMASE (1988b) je dá vztahem: m
PRESS (cˆi ci ) 2 i 1
kde m je celkový počet kalibrovaných vzorků, ĉi udává odhadovanou hodnotu koncentrace a ci referenční hodnotu koncentrace i – tého vzorku vynechaného z kalibrace při křížové validaci. Optimální počet PC komponent odpovídá oblasti okolo minima zmíněné PRESS křivce. V rámci této oblasti je však vhodné volit raději nižší počet PC - komponent, protože příliš vysoký počet použitých PC - komponent snižuje
74
LITERÁRNÍ PŘEHLED kvalitu predikce pro jiná než kalibrační měření. Kalibrační model pak totiž zahrnuje stále větší podíl šumové složky analyzovaných kalibračních dat; popisuje tak stále „dokonaleji“ kalibrační data včetně všech chyb a nahodilých jevů v nich obsažených. Nevhodný je pochopitelně i model s malým počtem PC - komponent, kdy dostatečně nevyužíváme veškeré relevantní informace. Počet použitelných PC - komponent je ovlivněn i počtem kalibračních měření. Čím větší je počet kalibračních vzorků i spekter, tím vyšší počet PC - komponent můžeme principiálně využít. V uvedené laboratorní
úloze
je tak
možnost
použití
většího
počtu
PC - komponent
limitová právě omezeným počtem připravených vzorků (MATĚJKA, 2006; BURNS et CIURCZAK, 2007; NICOLET.CZa, 2007; PROCHÁZKOVÁ et al., 2010). 3.4.6 Identifikace odlehlých standardů Pro každý typ analýz jsou k dispozici diagnostické algoritmy, které umožňují hodnotit zadávaná data podle různých statistických kritérií. Pro identifikaci odlehlých standardů se používají zejmé tyto tři diagnostické nástroje: Spectrum Outlier, Principal Component Scores (PC Scores), Leverage, které základě spektrální nebo koncentrační odlišnosti vyloučí kalibrační standardy ze souboru. Spectrum Outlier Tato diagnostika počítá Mahalanobisovu vzdálenost spektra každého kalibračního standardu aktivní metody od spektra průměrného, a následně hledá spektra, která jsou nejvíce odlišná od ostatních standardů. Je zde využit Dixonův nebo Chauvenetův test k posouzení, zda je odlišnost signifikantní. K výpočtu hodnoty Mahalanobisovy vzdálenosti jsou využity koncentrační a spektrální informace pro každý standard a stanovovanou složku. Tato diagnostika je založe spektrální informaci všech standardů (NICOLET.CZ, 2007a). Principal Component Scores (PC Scores) Diagnostika PC Scores zobrazuje graficky, jak jsou jednotlivé standardy použité v metodách PLS (Partial least square), PCR (Principal component regression) či v Diskriminační analýze reprezentovány jednotlivými hlavními komponentami (PLS faktory) použitými kalibraci. Každá PC Scores reprezentuje nezávislý zdroj spektrální proměnlivosti v kalibračních datech. PC jsou seřazeny podle množství
75
LITERÁRNÍ PŘEHLED variability, kterou reprezentují. První PC popisuje nejvíce variability kalibračních spekter. Každá další PC popisuje většinu ze zbývající variability. Tato diagnostika nám určí, zda PC, které byly vypočítány pro kalibrační metodu, správně reprezentují spektrální data každého standardu. Datové body izolované od ostatních indikují, že korespondující standard je rozdílný od ostatních standardů v metodě (BOYSWORTH et BOOKSH, 2007, NICOLET.CZ, 2007a). Leverage Tato diagnostika poskytuje informace o kalibračních standardech pouze PLS (Partial least square) metody: Jaký vliv má každý ze standardů kalibrační model. Jak přesně kalibrační model popisuje každý standard. Datové body by měly být distribuovány souměrně celém rozsahu generovaného grafu. Izolovaný bod indikuje rozdílnost korespondujícího standardu od ostatních v metodě. Jestliže má standard vysokou reziduální hodnotu, oblast nebo oblasti analyzovaného spektra obsahují vlastnosti, které nejsou modelovány kalibrovanou metodou. Jestliže je vysoká hodnota „Leverage“ (tj. vzdálenost bodu od těžiště modelu), standard má významný vliv kalibrační model pro vybranou komponentu. Standard s vysokou hodnotou „Leverage“ má obvykle nízkou hodnotu reziduální, protože větši spektrální informace je zahrnuta do kalibračního modelu (HEISE et WINZEN, 2008; BOYSWORTH et BOOKSH, 2007; NICOLET.CZ, 2007a). 3.4.7 Dvouvýběrový párový T-test střední hodnotu Dvouvýběrový párový t-test střední hodnotu je založen Studentově rozdělení pravděpodobnosti. Tento test se používá, jestliže každé z n vybraných statistických jednotek naměříme dva statistické znaky, přičemž měření jsou nezávislá. Neověřujeme tedy shodu spárovaných hodnot, ale spíše jejich rozdíl (zajímá nás, zda jsou referenční a predikované hodnoty rozdílné či ne). To je v souladu s volbou hladiny významnosti (většinou 0,05), což má za následek velkou pravděpodobnost při potvrzení odlišnosti (95%). Jestliže mám dva soubory hodnot (referenční, predikované z NIR spektrofotometru), které chci srovnat tak použiji předpoklady: H0: střední hodnoty obou výběrů se neliší (μ1 = μ2)
76
LITERÁRNÍ PŘEHLED HA: střední hodnoty obou výběrů se liší (referenční a predikované hodnoty jsou rozdílné). Testované hypotézy zapíšeme ve tvaru H0: Ed = 0 s alternativní hypotézou H1: Ed ≠ 0, přičemž D = X - Y. Kritická hodnota se bere pro n - 1 stupňů volnosti, kde n je počet dvojic. Funkce je definová vztahem:
T
Dk n 1 SD
kde D je rozdíl hodnot dvou souborů, SD je výběrové variační rozpětí dvojic a D je aritmetický průměr rozdílů. Pokud je vypočítaná t krit(2) < |t stat| tzn., že výsledek t testu spadá do oblasti kritických hodnot. Hypotézu H0 zamítáme. A porovnávané hodnoty se statisticky průkazně liší hladině významnosti 0,05. Pokud je vypočítaná t krit (1) a t krit (2) > |t stat|, tak potvrzujeme hypotézu H0 (KUBANOVÁ et LINDA, 2007).
77
MATERIÁL A METODIKA
4 MATERIÁL A METODIKA 4.1 Materiál Disertační práce je zaměře využití blízké infračervené spektroskopie (NIRS) při hodnocení a produktů
kvalitativních mlékárenského
a kvantitativních průmyslu.
parametrů
Charakteristika
vybraných
surovin
základního
složení
hodnocených vzorků, jejich úprava před vlastními analýzami a přehled provedených referenčních analýz jsou shrnuty v následující části práce. Část disertační práce zabývající se analýzou Olomouckých tvarůžků a jakostních parametrů syřidel byla sepsá díky získaným projektům od Interní Grantové Agentury AF Mendelovy univerzity v Brně pod číslem TP 10/2010 (Technologické a mikrobiologické parametry vstupní suroviny a jejich vliv průběh zrání a výslednou jakost tvarůžků) a IP 12/2011 (Využití blízké infračervené reflektanční spektrometrie (FT NIR) k hodnocení jakosti syřidel). 4.1.1 Ovčí mléko Syrové nehomogenizované ovčí mléko bylo získáno soukromé ovčí farmě Ondruch ve Valašské Bystřici. Celkem bylo provedeno 5 odběrů 19 vzorcích v průběhu celého laktačního období. Po odběru bylo mléko zchlazeno teplotu 4 - 6 °C, zakonzervováno pomocí
BROAD SPECTRUM MICROTABS
II, uloženo
do chladících přepravek a převezeno Ústav technologie potravin, AF MENDELU v Brně, kde bylo proměřeno přístroji FT NIR Antaris. Před vlastním měřením byly vzorky vytemperovány 40 °C, promíchány a zchlazeny 20 °C, aby se lépe rozptýlil tuk v celém objemu vzorku a nedošlo změně spektrální informace vlivem vyvstátého tuku povrchu vzorku. Referenční analýzy pro stanovení volných mastných kyselin (MK): C10:0 – kaprinové, C12:0 – laurové, C14:0 – myristové, C16:0 – palmitové, C18:0 – stearové a C18:1n9c – olejové byly provedeny Ústavu chemie a biochemie, AF MENDELU v Brně plynovém chromatografu HP4890 s kapilární kolonou DB23. Referenční hodnoty pro kalibraci spektrofotometru stanovení mastných kyselin v mléčném tuku jsou uvedeny v Tab. 5. U vzorků byly také laboratorně stanoveny i další mastné kyseliny jako např. C4:0, C6:0, C8:0, atd., ale jejich koncentrace byla velmi nízká a FT NIR spektroskopie není vhodná pro stanovení minoritních složek
78
MATERIÁL A METODIKA ve vzorku, protože spektrální signál stanovované složky (MK) je velmi slabý a může např.: zaniknout ve spektrálním šumu, a proto v tomto případě nelze vytvořit kalibrační modely pro jejich stanovení. Tab. 5 Referenční hodnoty pro kalibrace mastných kyselin (MK) obsažených v mléčném tuku ovčího mléka v %. Parametr C10:0 C12:0 C14:0 C16:0 C18:0 C18:1n9c
N
min
max
xp
xs
95,00 95,00 95,00 95,00 95,00 95,00
1,34 1,21 6,57 25,04 8,55 18,56
6,68 3,68 13,11 37,31 20,36 32,72
3,70 2,35 9,37 29,43 14,95 25,27
1,23 0,57 1,47 2,93 2,66 3,36
N – počet vzorků, min a max – minimální a maximální hodnota, xp – průměr, xs – směrodatná odchylka, C10:0 – kys. kaprinová, C12:0 – kys. laurová, C14:0 – kys. myristová, C16:0 – kys. palmitová, C18:0 – kys. stearová a C18:1n9c – kys. olejová
4.1.2 Kozí mléko Individuální vzorky syrového nehomogenizovaného kozího mléka byly odebírány soukromé kozí farmě Kozí Dvorek Olešenka, která hospodaří v ekorežimu. Odběry probíhaly dobu šesti měsíců v průběhu celé laktace. Po odběru bylo mléko zchlazeno požadovanou teplotu, zakonzervováno pomocí BROAD SPECTRUM MICROTABS II, uloženo do chladicích boxů a převezeno Ústav technologie potravin, AF MENDELU v Brně, kde bylo proměřeno přístroji FT NIR Antaris a do soukromé laboratoře pro rozbor mléka v Brně v Tuřanech, kde byl stanoven obsah bílkovin, tuku, laktosy a tukuprosté sušiny (TPS). Celkem bylo odebráno 86 vzorků a použito pro tvorbu kalibrace TPS a pro rekalibrace již vytvořených kalibrací pro bílkoviny, tuk a laktosy v roce 2004 Ing. Renatou Jankovskou, Ph.D., která získané výsledky kalibrací uvádí ve svojí doktorské práci. Aby byly vytvořené kalibrace stále funkční a robustní je potřeba provádět jejich rekalibraci alespoň 1x ročně. Jankovská použila pro kalibraci spektrofotometru referenční hodnoty získané z přístroje Pro-Milk pro stanovení bílkovin a klasické laboratorní metody dle příslušných ČSN pro stanovení tuku a laktosy. V naší práci jsme použili pro rozšíření těchto
kalibrací
hodnoty
získané
nepřímou
79
referenční
metodou
pomocí
MATERIÁL A METODIKA infračerveného absorpčního analyzátoru BENTLEY 2000. Dle DRAČKOVÉ et al. (2008) může vedlejší referencí metoda ovlivnit následné výsledky kalibračních modelů. V naší práci jsem se pokusili zjistit, do jaké míry bude mít použití vedlejší referenční metody vliv kvalitu vytvořených rekalibrací. Před vlastním měřením NIR spektrofotometru byly vzorky vytemperovány 40 °C, promíchány a zchlazeny 20 °C. Stanovené referenční hodnoty kozího mléka jsou uvedeny v Tab. 6. Tab. 6 Referenční hodnoty pro rekalibraci a kalibraci složek kozího mléka v %. Parametr Bílkoviny Tuk Laktosa TPS
N kalibrace 121,00 (86 + 35) 121,00 (86 + 35)
min
max
xp
xs
1,87 1,49
3,31 5,54
2,68 3,26
0,30 0,74
121,00 (86 + 35) 86,00
3,44 6,94
5,05 9,04
4,43 8,00
0,31 0,37
N – počet vzorků (86 nových + 35 původních vzorků), min a max – minimální a maximální hodnota, xp – průměr, xs – směrodatná odchylka, TPS – tukuprostá sušina
4.1.3 Mražené krémy Pro vytvoření kvantitativních modelů kalibrací pro tuk, sušinu a bílkoviny bylo použito 40 vzorků mražených krémů zakoupených v tržní síti. Vzorky zahrnovaly smetanové a tvarohové krémy a také „zmrzliny“ s příměsí rostlinného tuku. Na Ústavu technologie potravin v mlékařské laboratoři byly vzorky homogenizovány rozmícháním při pokojové teplotě a následně provedeny referenční analýzy pro obsah
sušiny,
tuku
a bílkovin.
Následně
byly
vzorky
proměřeny
spektrofotometru FT NIR Antaris v režimu reflektance integrační sféře, dvěmi různými metodami, a to v kádince s výškou hladiny 5 cm a Petriho misce, kde byl odraz záření zajištěn kovovým zrcátkem s výškou reflexní plochy 0,3 mm.
80
MATERIÁL A METODIKA Tab. 7 Referenční hodnoty mražených krémů v %. Parametr Suši Tuk Bílkoviny
Metoda
N
min
max
xp
xs
K Z K Z K
40,00 40,00 40,00 40,00 40,00
30,55 30,55 3,77 3,77 1,38
48,36 48,36 19,27 19,27 5,95
37,28 37,28 9,87 9,87 2,80
3,56 3,56 3,53 3,53 1,05
Z
40,00
1,38
5,95
2,80
1,05
K – kádinka, Z – zrcátko, N – počet vzorků, min a max – minimální a maximální hodnota, xp – průměr, xs – směrodatná odchylka
4.1.4 Olomoucké tvarůžky Pro referenční a spektrofotometrické analýzy byly vzorky Olomouckých tvarůžků odebírány přímo v potravinářském podniku A.W. spol. s.r.o. v Lošticích. Bylo provedeno vždy sedm různých odběrů vzorků, které zahrnovaly různou fázi výroby, ale i hotové výrobky, ve dvou sériích (jarní a letní období) podle následujícího schématu: 1. vzorky směsi tvarohů nasolení (1), přídavku kultur (2) a formování do tvaru tyčinek nebo koleček (3), 2. vzorky tvarůžků sušení a odvětrávání (4), 3. vzorky tvarůžků konci výrobního procesu (5), připravené k balení a expedici. Dle CWIKOVÉ a NEDOMOVÉ (2007) se tvarůžky balí prozrálé do 1/3 řezu. 4. hotový výrobek zabalený uchovávaný při 5 °C konci doby trvanlivosti ( 30 dnech) (6), 5. hotový výrobek zabalený uchovávaný při 20 °C konci doby trvanlivosti ( 30 dnech) (7). Jako hotové výrobky byly odebírány tvarůžky formované jako kolečka a tyčinky. Pro kvantitativní analýzy bylo použito 72 vzorků Olomouckých tvarůžků, které byly před vlastním měřením postrouhány jemném struhadle. Referenční analýzy pro stanovení sušiny, chloridu sodného (NaCl), pH a titrační kyselosti byly provedeny Ústavu technologie potravin a zároveň proměřeny spektrofotometru FT NIR Antaris. Byly vytvořeny kalibrační modely pro sušinu, pH, SH a obsah NaCl jak pro tvarůžky skladované při 5 °C tak i při 20 °C. Pro tvorbu kvantitativních kalibrací
81
MATERIÁL A METODIKA nebyly použity Olomoucké tvarůžky v první fázi výroby, kdy se jednalo pouze o nasolený a zformovaný tvaroh s přídavkem mlékařské kultury, protože díky nástrojúm programu TQ Analyst – Spectrum Outlier, Leverage a PC Score, které slouží k určení odlehlých standardů, by došlo k odstranění těchto vzorků z kalibrace. Získané referenční hodnoty pro kalibrace jsou uvedeny v Tab. 8. Pro tvorbu kvalitativních kalibrací pomocí Diskriminační analýzy byly použity tvarůžky v různé fázi výroby a rozdílného tvaru (kolečka, tyčinky), s cílem určení schopnosti přístroje rozeznat jednotlivé fáze výroby Olomouckých tvarůžků a dále stanovení, zda existuje spektrální rozdíl mezi Olomouckými tvarůžky různého tvaru, z čehož by se dalo usuzovat, že dochází k rozdílnému prozrávání a složení tvarůžků vlivem jejich tvaru. Poslední diskriminační analýza byla provede pro tvarůžky vyrobené v jarním a letním období, kdy jsme se snažili stanovit, zda bylo k výrobě použito jarní či letní mléko. Tab. 8 Referenční hodnoty složek a fyzikálních vlastností Olomouckých tvarůžků. Parametr Suši (%) NaCl (%) pH °SH
Teplota skladování 5 °C 20 °C 5 °C 20 °C 5 °C 20 °C 5 °C 20 °C
N
min
max
xp
xs
72,00 72,00 72,00 72,00 72,00 72,00 72,00 72,00
34,54 35,82 4,93 4,90 5,45 5,45 16,54 36,20
38,97 38,97 6,56 7,02 7,70 8,01 95,54 95,54
37,04 37,32 5,57 5,86 6,14 6,36 60,90 64,46
0,93 0,78 0,40 0,54 0,57 0,76 18,66 14,98
N – počet vzorků, min a max – minimální a maximální hodnota, xp – průměr, xs – směrodatná odchylka, °SH – titrační kyselost
4.1.5 Sušená sladká syrovátka Ke spektrofotometrickým analýzám pomocí přístroje FT NIR Antaris bylo použito 48 vzorků sladké sušené syrovátky, získané ve spolupráci s firmou Eligo a.s. zabývající se výrobou a prodejem sušených mléčných výrobků. V mlékařské laboratoři Ústavu technologie potravin AF MENDELU v Brně byly provedeny referenční analýzy pro stanovení sušiny, vody, pH a titrační kyselosti. Referenční analýzy pro stanovení bílkovin byly provedeny
Státním veterinárním ústavu
v Olomouci. Získané referenční hodnoty pro kalibrace jsou uvedeny v Tab. 9.
82
MATERIÁL A METODIKA Tab. 9 Referenční hodnoty složek a fyzikálních vlastností sladké sušené syrovátky. Parametr Suši (%) Voda (%) Bílkoviny (%) pH °SH
N
min
max
xp
xs
48,00 48,00 48,00 48,00 48,00
94,62 2,06 9,68 6,14 3,96
97,94 4,96 20,80 6,67 6,74
96,44 3,42 11,35 6,41 5,33
0,87 0,83 2,10 0,11 0,55
N – počet vzorků, min a max – minimální a maximální hodnota, xp – průměr, xs – směrodatná odchylka, °SH – titrační kyselost
4.1.6 Syřidla a sýřeniny 4.1.6.1 Syřidla Pro analýzy a vytvoření kalibračních modelů bylo použito 6 různých tekutých syřidel běžně dostupných v tržní síti (viz. obr.12 příloha). Rozborová byla syřidla:
pepsinové přírodního původu o deklarované síle 1:10 000,
tři syřidla chymosinová přírodního původu o deklarované síle: 1:5 000, 150 IMCU/ml a 145 IMCU/ml
a dvě syřidla chymosinová mikrobiálního původu o deklarované síle: 950 IMCU/ml a 1 000 IMCU/ml. Vzorky syřidel byly skladovány v lednici při teplotě 5 ± 1 °C dobu
6 měsíců. Analýzy vzorků byly provedeny: ihned po prvním otevření, a dále 3 a 6 měsících skladování v lednici (4 – 6 ºC). Tento časový postup byl zvolen vzhledem k jakostním parametrům tekutých syřidel, které by měly zůstat stejné minimálně dobu 3 měsíců skladování za požadovaných podmínek (TEPLÝ et al., 1976). Pro zasyřování bylo použito obnovené plnotučné, polotučné a odtučněné sušené mléko stejné šarže, abychom zajistili surovinu o stále stejných vlastnostech celý průběh pokusu. Je známo, že pro zachování jakostních vlastností syřidel co nejdelší čas, je nutno syřidla skladovat při teplotě do 10 °C, což uvádí i TEPLÝ et al. (1976), a také řada výrobců obale syřidla. Ale i tak se může stát malých farmách či mlékárnách, že při manipulaci se syřidlem zůstane syřidlo vystaveno delší dobu při pokojové teplotě. A proto byla další část zaměře stanovení jakostních parametrů
83
MATERIÁL A METODIKA syřidel při pokojové teplotě. Část syřidel byla otevření odlita do neprůhledných čistých lahviček a skladová za nestandardních podmínek (při pokojové teplotě okolo 20 °C). Tato syřidla byla analyzová a proměřová každý měsíc dobu půl roku. Pro zasyřování bylo použito obnovené plnotučné sušené mléko. U všech vzorků syřidel za různého skladování byly provedeny Ústavu technologie potravin, AF MENDELU v Brně referenční analýzy pro stanovení pH syřidla, času koagulace mléka syřidlem, síly syřidla a dávky syřidla. Referenční hodnoty pro pH syřidel (lednice, pokojová teplota) byly sloučeny a použity pro tvorbu kalibračního modelu pro pH, díky čemuž bylo dosaženo rozšíření kalibračního rozpětí pro stanovovaný jakostní parametr. Celkem tedy bylo použito pro kalibraci pH 29 spekter syřidel. Další kalibrace již byly tvořeny zvlášť pro syřidla skladovaná v lednici a při pokojové teplotě. Pro tvorbu kalibrací pro čas koagulace mléka syřidlem, síly a dávky syřidla bylo použito 54 spekter syřidel skladovaných v lednici, a pro kalibrace syřidel skladovaných při pokojové teplotě pouze 36 spekter. Referenční hodnoty pro jednotlivé kalibrace jsou uvedeny v Tab. 10, Tab. 11 a Tab. 12. Tab. 10 Referenční hodnoty pH syřidel. Parametr pH
N
min
max
xp
xs
29,00
3,98
6,00
5,32
0,63
N – počet vzorků, min a max – minimální a maximální hodnota, xp – průměr, xs – směrodatná odchylka
Tab. 11 Referenční hodnoty kalibrovaných parametrů syřidel skladovaných v lednici. Parametr
N
min
max
xp
xs
Čas koagulace (s) Síla syřidla (1:x) Dávka syřidla (ml)
54,00 54,00 54,00
9,00 2124,00 0,38
116,00 26667,00 4,38
40,61 9 139,60 1,69
24,67 6838,84 0,97
N – počet vzorků, min a max – minimální a maximální hodnota, xp – průměr, xs – směrodatná odchylka
84
MATERIÁL A METODIKA Tab. 12 Referenční hodnoty kalibrovaných parametrů syřidel skladovaných při pokojové teplotě. Parametr
N
min
max
xp
xs
Čas koagulace (s) Síla syřidla (1:x) Dávka syřidla (ml)
36,00 36,00 36,00
11,00 1333,00 0,42
176,00 24000,00 7,33
58,29 7 532,65 2,49
39,11 6202,14 1,73
N – počet vzorků, min a max – minimální a maximální hodnota, xp – průměr, xs – směrodatná odchylka
Měření bylo také zaměřeno tvorbu kvalitativních kalibračních modelů s použitím diskriminační analýzy s cílem prokázat, zda je FT NIR spektrofotometr natolik citlivý a je schopen rozlišit od sebe jednotlivé druhy syřidel, a také určit zda se jedná o syřidlo pepsinové, chymosinové, nebo přírodního či mikrobiálního původu. A dále pro tvorbu kalibrací pro rozlišení syřidel různého stáří a skladování za rozdílných teplotních podmínek (lednice, pokojová teplota). 4.1.6.2 Sýřeniny V mlékařské laboratoři Ústavu technologie potravin, AF MENDELU v Brně byly vyrobeny a analyzovány sýřeniny vzniklé zasýřením obnoveného plnotučného, polotučného a odtučněného mléka šesti různými tekutými syřidly (viz. kap. 5.1.6.1.). Analýzy byly prováděny ve třech časových intervalech: začátku pokusu, kdy byla sýřeni vyrobe za použití čerstvého syřidla, a dále sýřeniny vzniklé zasýřením syřidlem
skladovaným
3
a6
měsíců
v lednici.
U těchto
sýřenin
byla
stanove referenčně suši a vypočte výtěžnost sýřeniny dle vzorce v kap. 5.2.1.6. Pro kalibraci sušiny a výtěžnosti sýřeniny by teoreticky mělo být použito 54 spekter vzorků, ale 11 vzorků sýřenin se vysráželo v podobě velmi jemných vloček, které protekly přes síto při 2-minutovém okapu sýřenin, který byl nutný stanovit pro výpočet jejich výtěžnosti. Tyto velmi jemné sýřeniny vznikaly nejčastěji při sýření chymosinovým mikriálním syřidlem o síle 1 000 IMCU/ml. Pro kalibraci bylo tedy použito 43 spekter vzorků, jejichž rozpětí referenčních hodnot pro jednotlivé parametry je vyjádřeno v Tab. 13.
85
MATERIÁL A METODIKA Tab. 13 Referenční hodnoty kalibrovaných parametrů sýřenin. Parametr Suši (%) Výtěžnost (g)
N
min
max
xp
xs
43,00 43,00
10,32 17,03
17,02 50,27
13,20 39,04
1,66 7,20
N – počet vzorků, min a max – minimální a maximální hodnota, xp – průměr, xs – směrodatná odchylka
4.2 Metodika 4.2.1 Referenční analytické metody 4.2.1.1 Ovčí mléko Obsah tuku (%) pro stanovení MK ovčího mléka byl stanoven acidobutyrometrickou metodou dle Gerbera. Analýzy mastných kyselin v tuku ovčího mléka byly provedeny
Ústavu
chemie
a biochemie,
MENDELU
v Brně
plynovém
chromatografu HP4890 s kapilární kolonou DB-23 (60 m x 0,25 mm x 0,25 µm). Pro měření byl zvolen teplotní program od 100 °C * 3 min * 10 °C/min * 170 °C * 0 min * 4 °C/min * 230 °C * 8 min * 5 °C/min * 250 °C * 15 min, teplota injektoru 270 °C, teplota detektoru 280 °C. Nástřik 2 µl. Nosným plynem byl dusík. K výstupu z kolony byl připojen plameno-ionizační detektor. Finální chromatogramy byly zpracovány programem CSWstation (verze 1.7, Data Apex). Standard směsi mastných kyselin: SUPELCO 37 compoment FAME mix, kat. č. 47885-U + Linoleic acid conjugated methyl ester, kat. č. O5632. 4.2.1.2 Kozí mléko U všech vzorků kozího mléka byl v soukromé laboratoři pro rozbor mléka v Brně v Tuřanech infračerveném absorpčním analyzátoru BENTLEY 2000 (Bentley Instruments Inc., USA) stanoven obsah bílkovin, tuku, laktosy a tukuprosté sušiny (TPS). IR analyzátor je pravidelně kalibrován hodnoty stanovené podle příslušné referenční metody dle normy ČSN 57 0536:1999. Tukuprostá suši byla stanove výpočtem z obsahu celkové sušiny a z obsahu tuku.
86
MATERIÁL A METODIKA 4.2.1.3 Mražené krémy Na Ústavu technologie potravin, MENDELU v Brně byly u 40 vzorků mražených krémů stanovené jednotlivé složky následujícími referenčními metodami:
Suši – vážkovou metodou při 102 ± 2 °C, kdy se 3 g vzorku přidalo 3 až 5 ml destilované vody pro snadnější promíchání a odpaření (ČSN 57 0107:1965).
Tuk – pomocí acidobutyrometrické metody dle ČSN 57 0107:1965. Jednalo se o metodu dle Gerbera, kdy navážka vzorku byla 3 až 5 g.
Bílkoviny – pomocí Kjeldahlovy metody s přepočítávacím faktorem 6,38 přístroji
KjeltecTM
88100/200
(FOSS
Analytical
AB,
Sweden)
(ČSN 57 0107:1965). 4.2.1.4 Olomoucké tvarůžky Na Ústavu technologie potravin byly u 72 vzorků Olomouckých tvarůžků stanoveny chemické a fyzikální vlastnosti následujícími metodami:
Suši – vážkovou metodou při 102 ± 2 °C, kdy se 5 g postrouhaných Olomouckých tvarůžků sušilo do konstantní hmotnosti (ČSN 57 0107-3: 1982).
Obsah chloridu sodného (NaCl) – přímou titrací roztokem dusičnanu stříbrného dle normy ČSN 57 0107-12:1982.
pH – potenciometricky pH metru WTW pH 95 (Ger) dle ČSN 57 0107:1965.
Titrační kyselost (°SH) – se stanovila titračně dle ČSN 57 0107 titrací 10 g vzorku, 0,25 mol roztokem hydroxidu sodného do růžového zbarvení (ČSN 57 0107:1965).
87
indikátor fenolftalein
MATERIÁL A METODIKA 4.2.1.5 Sušená sladká syrovátka Na Ústavu technologie potravin byly u 48 vzorků sušené sladké syrovátky stanoveny chemické a fyzikální parametry následujícími metodami:
Suši – vážkovou metodou, kdy se 3 g vzorku suší při 87 ± 2 °C dobu 6 hodin a pak do konstantní hmotnosti (ČSN 57 0105-3:2003)
Voda – podle ČSN 57 0105-13:2003 dle vzorce:
voda (%)
a 100 n
kde a je úbytek váze sušením v g a n je navážka vzorku v g.
pH – potenciometricky pH metru WTW pH 95 (Ger) dle ČSN 57 0803:1981.
Titrační kyselost (° SH) – titračně dle ČSN 57 0105-8:1981 titrací 25 g tekutého vzorku, do kterého se přidá 75 ml vody a 2 ml fenolftaleinu. Titruje se 0,25 mol roztokem hydroxidu sodného do růžového zbarvení.
A dále Státním veterinárním ústavu v Olomouci byly stanoveny celkové bílkoviny Kjeldahlovou metodou dle 57 0105-5:1985. 4.2.1.6 Syřidla a sýřeniny Syřidla U vzorků syřidel byly v chemické laboratoři Ústavu technologie potravin, AF MENDELU v Brně stanoveny následující jakostní parametry: pH syřidla, síla a dávka syřidla.
pH syřidla pomocí WTW pH 95 (Ger) podle ČSN 57 0107-12:1982,
Síla syřidla podle Soxhleta, která se vypočítala ze vztahu:
Síla ( S )
objem mléka (ml) 2400 (Gajdůšek, 1997) čas koagulace mléka ( s)
Pro stanovení času koagulace u syřidel skladovaných v lednici a získání sýřenin bylo použito plnotučné, polotučné a odtučněné sušené mléko stejné šarže
88
MATERIÁL A METODIKA obnovené podle ČSN 57 0105:2003. Protože se jednalo o mléko tepelně ošetřené, musel být před sýřením přidáván CaCl2. Aby bylo dosaženo podobného času koagulace sušeného mléka jako mléka syrového, byl odzkoušen přídavek 36% CaCl2 (Milcom a.s., Tábor) v intervalu 20 – 120 μl. Optimálního času koagulace mléka bylo dosaženo až při přídavku 100 μl CaCl2. U syřidel skladovaných při pokojové teplotě bylo k zasyřování použito pouze obnovené plnotučné sušené mléko s přídavkem 100 μl CaCl2. Měření času koagulace bylo provedeno 3x a pro následující výpočty byl použit aritmetický průměr hodnot.
Dávka syřidla potřebná pro zasýření se vypočítala ze vztahu: D
M 35 40 S t T
(Gajdůšek, 1997)
kde D je dávka syřidla v ml, M je množství sýřeného mléka v ml (teoreticky 10 000 ml), S je síla syřidla podle Soxhleta, t je teplota sýření ve ºC (v našem případě 35 ºC), T je čas srážení v minutách (teoreticky 40 minut) Sýřeniny
Suši – vážkovou metodou při 102 ± 2 °C, kdy se 3 g vzorku sýřeniny suší do konstantní hmotnosti (ČSN 57 0107-3:1982).
Teoretická výtěžnost sýřeniny
Po inkubaci sýřeniny v termostatu při 35 ºC dobu 1 hod byla ponechá 2 minuty při okapu řídkém sítě a následně zvážena, tak byla získá hmotnost sýřeniny i se zadrženou syrovátkou. Aby byla stanove čistá hmotnost sýřeniny (výtěžnost) vzorec a), musela se od ní odečíst zadržená syrovátka, která byla vypočte dle vzorce b): a) Výtěžnost (g) = Hmotnost sýřeniny okapu (g) – zadržená syrovátka Hmotnost sýřeniny okapu (g) . Suši sýřeniny (%) b) Zadržená syrovátka (g) = 100
89
MATERIÁL A METODIKA 4.2.2 Měření NIR spekter Veškeré spektroskopické analýzy probíhaly spektrofotometru FT NIR Antaris (ThermoNicolet, USA), který jako zdroj emitujícího záření využívá halogenovou žárovku a k dělení paprsku záření dochází přesně zbroušeném okénku vyrobeném z fluoridu vápenatého. Výsledný signál záření je zaznamenán detektoru z InGaAs. Analyzované vzorky byly snímány ve spektrálním rozsahu 12 500 – 4 000 cm-1, čemuž odpovídá 1 000 – 2 500 nm, s časem snímání jednoho spektra ~1,5 min. Přístrojově lze nastavit jak počet snímání spekter, tak i spektrální rozlišení. Čím vyšší je nastaveno spektrální rozlišení, tím přesnější a konkrétnější je spektrální informace o daném vzorku. Přístroj FT NIR Antaris umožňuje analýzu vzorků ve třech různých režimech měření viz kap. 3.2.2.3. Prostředí komunikace mezi počítačem a spektrofotometrem je zajištěno prostřednictvím programu Result Integration. Pro tvorbu kalibračních modelů pro kvantitativní a kvalitativní analýzy byl použit program TQ Analyst. Z hlediska kvantitativní analýzy lze prostřednictvím tohoto programu metodou částečných nejmenších čtverců PLS (Partial least squares viz kap. 3.4.3.1) k naměřeným spektrům přiřazovat jejich referenčně stanovené hodnoty, upravovat spektrální rozsah či vybírat charakteristické části spektra, kde dochází k největší odezvě signálu stanovované složky či eliminovat spektra vzorků, která byla prostřednictvím PC Score, Spectrum Outlier a Levrage označe jako nevyhovující danému souboru. Vzniklé kalibrace byly validovány pomocí křížové validace, abychom určili jakou má vytvořený model schopnost přesné předpovědi stanovovaného parametru. Z hlediska kvalitativního hodnocení je možno využít metodu Diskriminační analýzy (kap. 3.4.4.1), která má schopnost z naměřených spekter vzorků vytvořit třídy o definovaných vlastnostech a posléze neznáme spektrum vzorku přiřadit do charakterově nejbližší předem definované třídy. V dalších kapitolách jsou blíže popsány jednotlivé metodiky měření. 4.2.2.1 Ovčí mléko I když byly vzorky ovčího mléka zakonzervovány pomocí BROAD SPECTRUM MICROTABS II, nemá to dle JANKOVSKÉ (2004) vliv spektrální informaci analyzovaného vzorku. Před spektroskopickou analýzou bylo ovčí mléko
90
MATERIÁL A METODIKA vytemperováno 40 °C, promícháno a následně zchlazeno 20 °C. Tento postup byl zvolen dle doporučení, které uvádí CHEN et al. (1999), neboť je nutné převést tuk do kapalné formy a rovnoměrně jej rozptýlit v celém objemu vzorku. Vzorky byly proměřeny v Petriho misce o průměru 6 cm v režimu reflektance integrační sféře přístroje. Odraz paprsku byl zajištěn kovovým zrcátkem s výškou reflexní plochy 0,3 mm (viz. Obr. 8 v příloze). Počet snímání jednoho spektra byl 100 scanů se spektrálním rozlišením 8 cm-1. Obdobné nastavení zvolili ve své práci také ŠUSTOVÁ et al. (2006) a PROCHÁZKOVÁ et al. (2010). Ke tvorbě kalibračních modelů byla použita průměrná spektra a algoritmus PLS. Vytvořené kalibrace byly ověřeny křížovou validací. 4.2.2.2 Kozí mléko Metodika spektrofotometrické analýzy kozího mléka byla zvole obdobně, jako v práci JANKOVSKÉ (2004), aby mohlo dojít k rozšíření a úpravě již vzniklých kalibrací. Vzorky kozího mléka byly vytemperovány 40 °C, promíchány, zchlazeny 20 °C a proměřeny v Petriho misce (Ø 6cm) integrační sféře se zrcátkem 0,3 mm. Počet snímání jednoho spektra byl 150 scanů se spektrálním rozlišením 16 cm-1. Každý vzorek byl snímán 2x a pro tvorbu kalibrací bylo použito průměrné spektrum. K jejich vytvoření byla použita metoda PLS s křížovou validací. 4.2.2.3 Mražené krémy Vzorky mražených krémů byly homogenizovány rozmícháním při pokojové teplotě a proměřeny dvěma způsoby integrační sféře spektrofotometru. V prvním případě byl vzorek proměřen ve skleněné kádince o průměru 3 cm s výškou hladiny vzorku 5 cm (viz obr. 9a) v příloze) a v druhém případě v Petriho misce o průměru 6 cm s kovovým zrcátkem s výškou reflexní plochy 0,3 mm (viz obr. 9b) v příloze). V obou případech byl nastaven počet snímání jednoho spektra 100 scanů se spektrálním rozlišením 8 cm-1. Vzorky byly proměřeny 2x a pro tvorbu kalibrací bylo použito jejich průměrné spektrum. Ke tvorbě kalibrací jsme využili program TQ Analyst s algoritmem PLS.
91
MATERIÁL A METODIKA 4.2.2.4 Olomoucké tvarůžky Před vlastní analýzou pomocí spektrofotometru FT NIR Antaris byly vzorky tvarůžků nastrouhány jemném struhadle, abychom zajistili homogenitu vzorku a vloženy do kompresní rotační kyvety (viz Obr.10 v příloze), díky níž jsme byli schopni snímat vzorky komplexněji. Spektra byla měře v režimu reflektance s průměrem 80 scanů a spektrálním rozlišení 4 cm-1. Tato metoda snímání spekter byla ověře MLČKEM et ŠUSTOVOU (2006) a MLČKEM et al. (2011). Kvantitativní kalibrace byly vytvořeny s použitím algoritmu PLS a ověřeny křížovou validací a kvantitativní měření pomocí Diskriminační analýzy. 4.2.2.5 Sušená sladká syrovátka Vzorky sušené sladké syrovátky byly proměřeny v režimu interaktance ve skleněné kádince o průměru 3 cm s použitím vláknové optické sondy (Fiber Optic) (viz Obr. 11 v příloze). Sonda byla při měření uchyce do stojanu a ponoře 2 cm kolmo do vzorku syrovátky. Hloubka ponoření zajistila bezpečný odraz paprsku od vzorku. Počet snímání jednoho spektra byl 100 scanů s rozlišením 8 cm-1. Každý vzorek byl proměřen 2x a pro tvorbu kalibrací bylo použito průměrné spektrum. Kalibrační modely byly vytvořeny za použití programu PLS s ověřením funkčností vytvořených modelů křížovou validací. 4.2.2.6 Syřidla a sýřeniny Syřidla Při analýze syřidel skladovaných v lednici a při pokojové teplotě bylo použito 80 scanů, při spektrálním rozlišení 4 cm-1. Pro měření infračervených spekter byly použity tři různé techniky měření: 1. Režim reflektance integrační sféře, kde byl zajištěn odraz paprsku kovovým zrcátkem s reflexní výškou 0,2 a 0,3 mm (viz Obr. 13 v příloze); 2. Režim transmitance s využitím transflektanční kyvety s optickou drahou 1 mm (viz Obr. 14 v příloze) 3. Režim interaktance s využitím optické sondy (viz Obr. 15 v příloze).
92
MATERIÁL A METODIKA Sýřenina Při analýze sýřenin bylo použito 100 scanů, při spektrálním rozlišení 8 cm-1. Stejné nastavení použili při svých analýzách např. DRAČKOVÁ et al. (2009a). Vzorky byly měřeny v režimu reflektance integrační sféře s nástavcem Sample Cup Spinner
pro rotaci
vzorků.
Sýřeni byla
před
měřením
rozmělně a vlože do kompresní kyvety se skleněným dnem o poloměru 1 cm. Čas snímání jednoho spektra byl ~1,5 min. Každý vzorek byl proměřen dvakrát a pro kalibraci bylo použito průměrné spektrum. Pro tvorbu kalibračních modelů bylo v obou případech využito programů PLS s křížovou validací a Diskriminační analýzy. 4.2.3 Statistické vyhodnocení výsledků Výsledky analýz byly vyhodnocovány pomocí programů Microsoft Excel 2003. U všech referenčních hodnot byly vypočteny souhrnné statistiky: průměr, minimální a maximální hodnota, směrodatná odchylka a lineární regresní křivka (y = bx + a). Při tvorbě kalibračních modelů byly získány korelační koeficienty kalibrace a validace (R) a jejich směrodatné odchylky (SEC) a (SEP), které vypovídají o kvalitě
regresní
závislosti
mezi
laboratorními
hodnotami
a hodnotami
předpověděnými pomocí NIR spektrometrie. Závislost s korelačním koeficientem 0,95 – 0,99 se považuje za velmi silnou, 0,80 – 0,94 za dosti silnou a 0,50 – 0,79 poukazuje středně silnou závislost (TRILČOVÁ et. al., 2005). Pro porovnání spolehlivosti kalibrace NIR přístroje se používá kalibrační variační koeficient (CCV) a pro validaci predikční validační koeficient (PCV). Za dobrou kalibraci jsou považovány hodnoty CCV okolo 10 % (PCV 15 %), za velmi spolehlivou kalibraci hodnoty CCV menší 5 % (PCV 10 %) (ESBENSEN, 1998; ČURDA et al., 2002; MÍKA et al., 2008). Jako doplňkový statistický test byl použit Studentův test (ttest), který se používá pro stanovení rozdílů mezi referenčními a predikovanými hodnotami NIRS. Jedná se o porovnávání shodnosti výsledků středních hodnot mezi prvními a druhými prvky uspořádaných dvojic. Je-li t 1 a t2 ≥ tstat pro celkový počet stanovení a zvolenou hladinou významnosti, je rozdíl mezi naměřenými hodnotami neprůkazný (KUBANOVÁ et LINDA, 2007).
93
VÝSLEDKY A DISKUSE
5 VÝSLEDKY A DISKUSE 5.1 Ovčí mléko Ovčí mléko obsahuje ve srovnání s mlékem kravským více tuku, bílkovin a přirozeně s těmito hodnotami stoupá i obsah sušiny. Dále má ovčí mléko příznivé spektrum mastných kyselin (DRAGOUNOVÁ et al., 2007). Využitím FT NIR spektroskopie pro analýzu ovčího mléka se zabývalo již několik autorů (viz. kap. 3.3.2.1), kteří stanovovali spíše jeho majoritní složky, jako je sušina, tuk, bílkoviny, laktosa atd. V disertační práci jsme se zaměřili ověření možnosti stanovení vybraných volných mastných kyselin (C10:0 – kys. kaprinové, C12:0 – kys. laurové, C14:0 – kys. myristové, C16:0 – kys. palmitové, C18:0 – kys. stearové a C18:1n9c – kys. olejové) zastoupených v tuku syrového nehomogenizovaného ovčího mléka. Problematikou stanovení mastných kyselin pomocí NIR spektroskopie v různých druzích olejnin se zabývali
PANFORD et DE MAN (1990); AULRICH et
MOLKENTIN (2009) studovali vliv konvenčního a ekologického zemědělství zastoupení mastných kyselin a jejich detekci pomocí NIRS v kravském mléce; SUNDARAM et al. (2011) studovali zastoupení mastných kyselin v burských ořeších, anebo CECCHINATO et al. (2012) v hovězím loji pomocí NIRS metody. Na Ústavu chemie a biochemie, AF MENDELU v Brně bylo analyzováno 95 vzorků tuku ovčího mléka a stanoven obsah volných mastných kyselin. Referenční metody jsou popsány v kap. 4.2.1.1. Rozpětí referenčních hodnot stanovovaných mastných kyselin uvádí tabulka 5 kap. 4.1.1. Vzorky ovčího mléka byly proměřeny spektrofotometru FT NIR Antaris v režimu reflektance integrační sféře s využitím kovového zrcátka (h = 0,3 mm) pro zajištění odrazu paprsku ve spektrálním rozsahu 10 000 – 4 000 cm-1, se 100 sc a rozlišením 8 cm-1. Obr. 13 znázorňuje průběh spekter ovčího mléka s maximálním a minimálním obsahem kys. palmitové a kys. olejové. Na obrázku 13 jsou také vyznačeny oblasti a vlnové délky, které jsou charakteristické pro absorpční skupiny tuku. Jak lze vidět, spektra se od sebe v těchto oblastech liší jen velmi nepatrně.
94
VÝSLEDKY A DISKUSE
Obr. 13 Průběh NIR spekter ovčího mléka s maximálním a minimálním obsahem kys. palmitové
a kys.
olejové.
S vyznačením
oblastí
a vlnových
délek
charakteristických pro absorpční skupiny tuku. Pro stanovení obsahu mastných kyselin v tuku ovčího mléka, byla některá spektra podrobe úpravě první nebo druhé derivace a byl vybrán takový rozsah regionu, aby bylo dosaženo co nejlepších kalibračních a validačních výsledků. Tab. 14 uvádí použité úpravy spekter a rozsahy regionů pro jednotlivé mastné kyseliny. Tab. 14 : Úprava spekter a regionů vybraných oblastí vlnočtů pro kalibrace obsahu mastných kyselin obsažených v tuku ovčího mléka. N
Vybraný region pro kalibraci úprava vlnočet (cm-1)
úprava spektra
Parametr C10:0
87
první derivace 1st Derivative in range 10 001,03 – 4 005,98
C12:0
87
první derivace 1st Derivative in range 10 001,03 – 4 005,98
C14:0
87
C16:0
88
C18:0
86
první derivace 1st Derivative in range 10 001,03 – 4 005,98 bez úprav 1st Derivative in range 10 001,03 – 4 170,69 bez úprav Spectrum Range 8 947,93 – 4 005,98
C18:1n9c
89
druhá derivace
Spectrum Range
10 001,03 – 4 005,98
N – počet vzorků, C10:0 – kys. kaprinová, C12:0 – kys. laurová, C14:0 – kys. myristová, C16:0 – kys. palmitová, C18:0 – kys. stearová a C18:1n9c – kys. olejová.
95
VÝSLEDKY A DISKUSE Pomocí diagnostických nástrojů Spectrum Outlier, PC Scores a Leverage (viz. kap. 3.4.6) byly identifikovány odlehlé standardy, které základě spektrálních nebo koncentračních odlišností nezapadaly do kalibračního souboru dat a byly odstraněny. Tyto standardy neobsahovaly klíčové informace pro vytvoření kalibračních modelů. Kalibrace byly vytvořeny pomocí metody částečných nejmenších čtverců (PLS – Partial least square) a pro jejich tvorbu bylo použito 87 vzorků pro stanovení kys. kaprinové, laurové a myristové; 88 vzorků pro kys. palmitovou; 86 vzorků pro kys. stearovou a 89 vzorků pro kys. olejovou. Důležitým diagnostickým nástrojem kalibrace PLS je závislost PRESS (predicted residual sum of squares) viz. kap. 3.4.5.6 počtu PLS faktorů použitých kalibraci, který umožňuje odhadnout jejich optimální počet. Hodnota PRESS je indikátorem chyby kalibrace PLS metody. Při optimálním průběhu PRESS dochází k prudkému poklesu PLS a další pokles je pozvolný. Prudký pokles funkce PRESS tedy vypovídá o robustnosti kalibračního modelu. Vysoký počet PLS faktorů snižuje schopnost predikce, protože PRESS zahrnuje i spektrální šum (HAALAND et THOMAS 1988b; MATĚJKA, 2006; NICOLET.CZ, 2007a). Kalibrační výsledky mastných kyselin a hodnoty PLS faktorů uvádí Tab. 15. Tab. 15 Kalibrační výsledky mastných kyselin obsažených v tuku ovčího mléka. Parametr C10:0 C12:0 C14:0 C16:0 C18:0 C18:1n9c
N
R
87 87 87 88 86 89
0,911 0,993 0,999 0,992 0,858 0,999
SEC (%) 0,505 0,066 0,056 0,367 1,360 0,152
CCV (%) 13,65 2,81 0,60 1,25 9,10 0,60
y = bx ± a
PLS
y = 0,8308x + 0,626 y = 0,9869x + 0,0307 y = 0,9986x + 0,0131 y = 0,9842x + 0,4637 y = 0,7362x + 3,9437 y = 0,998x + 0,0517
5 8 10 10 10 9
N – počet vzorků, y = bx + a = regresní přímka, SEC – směrodatná odchylka kalibrace, CCV – kalibrační variační koeficient, R – korelační koeficient, PLS
–
počet faktorů, C10:0 – kys.
kaprinová, C12:0 – kys. laurová, C14:0 – kys. myristová, C16:0 – kys. palmitová, C18:0 – kys. stearová a C18:1n9c – kys. olejová
Nejnižší počet PLS faktorů (5) byl nalezen pro kys. kaprinovou a naopak nejvyšší počet PLS (10) byl nalezen pro kys. myristovou, palmitovou a stearovou. Vyšší počet PLS pravděpodobně souvisí s užším koncentračním rozpětím daných hodnot a větší směrodatnou odchylkou hodnot. U všech modelů měla funkce PRESS klesající trend,
96
VÝSLEDKY A DISKUSE což vypovídá o robustnosti kalibračních modelů. Pro příklad je uveden průběh funkce PRESS s nejvíce klesajícím trendem viz Obr. 14.
Obr. 14 Funkce PRESS pro stanovení kys. myristové v tuku ovčího mléka s počtem 10 PLS faktorů. Korelační koeficienty kalibrací (R) se pohybovaly v rozmezí od 0,999 pro kys. myristovou a olejovou až do 0,858 pro kys. stearovou se směrodatnými odchylkami kalibrací (SEC) od 0,056 % a 0,152 % až do 1,360 % jak uvádí Tab. 15. Pro ověření spolehlivosti vytvořených kalibračních modelů byla použita křížová validace se stejnou sadou vzorků, která je charakterizová korelačním koeficientem validace (R) a jeho směrodatnou odchylkou (SEP) (Tab. 16). Tab. 16 Validační výsledky mastných kyselin obsažených v tuku ovčího mléka. Parametr C10:0 C12:0 C14:0 C16:0 C18:0 C18:1n9c
N
R
87 87 87 88 86 89
0,618 0,647 0,761 0,739 0,778 0,709
SEP (%) 0,974 0,443 0,951 1,970 1,680 2,370
PCV (%) 26,41 18,88 10,16 6,70 11,25 9,39
y = bx ± a y = 0,4498x + 2,0232 y = 0,4981x + 1,1752 y = 0,6036x + 3,7019 y = 0,5802x + 12,316 y = 0,6623x + 5,0268 y = 0,4970x + 12,684
N – počet vzorků, y = bx + a = regresní přímka, SEP – směrodatná odchylka validace, PCV – predikční variační koeficient, R – korelační koeficient, C10:0 – kys. kaprinová, C12:0 – kys. laurová, C14:0 – kys. myristová, C16:0 – kys. palmitová, C18:0 – kys. stearová a C18:1n9c – kys. olejová
97
VÝSLEDKY A DISKUSE Nejlepší výsledky validace dosáhla metoda pro stanovení kys. stearové, kdy R = 0,778 ± 1,680 %. Naopak nejnižší hodnoty R měl model pro stanovení kys. kaprinové R = 0,618 ± 0,974 %. Směrodatné odchylky validace byly v rozmezí 0,443 % až 1,970 %. Získané korelační koeficienty kalibrace a validace svědčí o tom, že se ve všech případech jedná pouze o středně silné závislosti mezi referenčními a predikovanými hodnotami. Dosažení nízkých korelačních koeficientů validace a vysokých hodnot směrodatných odchylek bylo zapříčiněno tím, že interval koncentrací mastných kyselin měl malý rozsah a pro zlepšení funkčnosti metod je nutno kalibrace rozšířit o více standardů. Díky tomu se zvýší koncentrační rozpětí složek a dosáhne se pravidelnějšího pokrytí slepých míst v kalibraci, čímž se sníží i chyba stanovení. Tuto hypotézu potvrzuje práce autorů z firmy v Thermo Fisher Scientific Inc (2008), která uvádí, že při koncentračním rozpětí 0 – 50 % kys. laurové, myristové, palmitové a stearové, lze dosáhnout velmi vysokých korelačních koeficientů kalibrace i validace s nízkými chybami stanovení. Obr. 15 – 20 znázorňují grafické vyjádření závislostí korelačních koeficientů kalibrací a validací.
Obr. 15 Kalibrační a validační modely pro stanovení zastoupení kys. kaprinové v tuku ovčího mléka.
98
VÝSLEDKY A DISKUSE
Obr. 16 Kalibrační a validační modely pro stanovení zastoupení kys. laurové v tuku ovčího mléka.
Obr. 17 Kalibrační a validační modely pro stanovení zastoupení kys. myristové v tuku ovčího mléka.
Obr. 18 Kalibrační a validační modely pro stanovení zastoupení kys. palmitové v tuku ovčího mléka.
99
VÝSLEDKY A DISKUSE
Obr. 19 Kalibrační a validační modely pro stanovení zastoupení kys. stearové v tuku ovčího mléka.
Obr. 20 Kalibrační a validační modely pro stanovení zatoupení kys. olejové v tuku ovčího mléka. K největšímu překryvu regresních přímek kalibrace a validace dochází v případě stanovení kys. stearové, u níž je nejmenší rozdíl mezi korelačními koeficienty. Jelikož bylo dosaženo vyšších hodnot směrodatných odchylek a variačních koeficientů, má tato kalibrace pouze dobrou spolehlivost správné predikce hodnot. Ostatní regresní přímky se překrývají méně, což svědčí o ještě větší nepřesnosti kalibračních modelů. Jako nejméně robustní a přesné modely se nám dle obr. 15 a 16 jeví kalibrace pro stanovení kys. kaprinové a laurové. Koncentrace těchto mastných kyselin v tuku ovčího mléka se pohybovala v intervalu 1,3 – 6,6 % pro kys. kaprinovou a 1,2 – 3,6 % pro kys. laurovou. Tento interval je velmi úzký, a proto bylo těžké najít silnější závislost mezi spektrálními daty a referenčními
100
VÝSLEDKY A DISKUSE hodnotami. Proto lze konstatovat, že tato medoda není vhodná pro stanovení těchto minoritních MK. Spolehlivost
kalibrací
byla dále posuzová pomocí tzv. kalibračních
a predikčních variačních koeficientů (CCV a PCV) (Tab. 15 a Tab. 16). Za dobrou kalibraci jsou považovány hodnoty CCV okolo 10 % (PCV 15 %), za velmi spolehlivou kalibraci hodnoty CCV menší 5 % (PCV 10 %) (ESBENSEN, 1998; ČURDA et al., 2002; MÍKA et al., 2008). Za kalibrace vhodné pro orientační stanovení hodnot s velmi spolehlivou predikcí lze označit metody pro stanovení kys. myristové, palmitové a olejové, jejichž hodnoty variačních koeficientů se pohybovaly v rozmezí 0,26 – 1,25 % (CCV) a 6,70 – 10,16 % (PCV) (viz. Tab. 15 a 16). Kalibrace pro stanovení kys. stearové má jen dobrou spolehlivost pro správnou predikci výsledků modelem (CCV = 9,10 %; PCV = 11,25 %), i když dosahovala nejmenších rozdílů mezi korelačními koeficienty kalibrace a validace. Kalibrace pro stanovení kys. laurové a kys. kaprinové měly hodnoty CCV a PCV vyšší, čímž se potvrdila naše domněnka, o nevhodnosti modelů pro analytické stanovení MK (viz. Tab. 15 a Tab. 16). Cílem doplňkového statistického dvouvýběrového párového t-testu střední hodnotu bylo určit, zda se stanovené hodnoty z obou metod (referenční, NIR) průkazně neliší. Pokud je t
stat
nižší jak t1 krit
a t2 krit, je kalibrační model funkční
a hodnoty se od sebe průkazně neliší. Z Tab. 17 vyplývá, že se získané hodnoty z obou metod statisticky průkazně neliší (P < 0,05). Tab. 17 Statistické vyhodnocení mastných kyselin obsažených v tuku ovčího mléka. Parametr C10:0 C12:0 C14:0 C16:0 C18:0 C18:1n9c
N 87 87 87 88 86 89
xNIR (%) 3,70 2,35 9,37 29,43 14,95 25,27
xREF (%) 3,70 2,35 9,37 29,43 14,95 25,27
SD
t stat
t1 krit
t2 krit
0,13 0,06 0,16 0,31 0,29 0,02
3,3 E-16 0,00 -0,01 0,00 7,86 E-05 0,00
1,66 0,50 1,66 1,66 1,66 1,66
1,99 1,66 1,99 1,99 1,99 1,99
N – počet vzorků , xNIR – hodnoty predikované, tref – hodnoty referenční, SD – směrodatná odchylka diference, tstat – t-test, t1(krit) – tabulková hodnota při α = 0,05, t2(krit) – tabulková hodnota při α = 0,01, C10:0 – kys. kaprinová, C12:0 – kys. laurová, C14:0 – kys. myristová, C16:0 – kys. palmitová, C18:0 – kys. stearová a C18:1n9c – kys. olejová
101
VÝSLEDKY A DISKUSE Jako nejlépe vytvořený kalibrační model pro orientační stanovení mastných kyselin zatoupených v tuku ovčího mléka se nám jevil model pro kys. myristovou, protože
byl
charakterizován
vysokými
korelačními
koeficienty
s nízkými
směrodatnými odchylkami (0,999 ± 0,056 %; 0,761 ± 0,951 %) a jeho spolehlivost byla potvrze i hodnotami CCV a PCV (0,60 % a 10,16 %). Stejnou
prací
se zabývali
roku
2007
také
ALBANELL
et
al.
Pomocí
spektrofotometru NIRS Foss 5000 stanovovali v rozsahu 1 100 – 2 500 nm obsah tuku, bílkovin, kaseinu, sušiny ve 122 vzorcích a obsah kys. kapronové, kaprilové, kaprinové, myristové, palmitové a olejové v 61 vzorcích tuku nehomogenizovaného ovčího mléka. Spektra byla podrobe první a druhé derivaci a pro tvorbu kalibračních modelů byla použita metoda PLS. Získané korelační koeficienty kalibrací a jejich směrodatné odchylky dosahovaly téměř ve všech případech nižších hodnot než naše výsledky, jak uvádí Tab. 18. Pro tvorbu našich kalibrací bylo použito více vzorků a také byl stanoven širší rozsah spektrálního regionu pro stanovované MK, což nám umožnilo získání vyšších hodnot korelačních koeficientů. Tab. 18 Srovnání kalibračních a validačních výsledků mastných kyselin ovčího mléka získaných ALBANELLEM et al. (2007) a námi. Mastná kyselina C10:0 C14:0 C16:00 C18:1n9c
Kalibrace (R ± SEC) Albanell et al. Naše výsledky (2007) 0,866 ± 0,395 0,911 ± 0,505 0,821 ± 0,628 0,999 ± 0,056 0,857 ± 0,952 0,992 ± 0,364 0,893 ± 0,750 0,999 ± 0,152
Validace (R ± SEP) Albanell et al. Naše výsledky (2007) 0,651 ± 0,660 0,618 ± 0,974 0,682 ± 0,721 0,761 ± 0,951 0,718 ± 1,273 0,739 ± 1,970 0,798 ± 0,995 0,709 ± 2,370
R – korelační koeficient kalibrace a validace, SEC – směrodatná odchylka kalibrace, SEP směrodatná odchylka validace,
–
C10:0 – kys. kaprinová, C14:0 – kys. myristová, C16:0 – kys.
palmitová a C18:1n9c – kys. olejová.
Korelační
koeficienty
kalibrace
ostatních
stanovovaných
složek
se pohybovaly v rozmezí 0,997 - 0,903 s nízkými směrodatnými odchylkami a validace od 0,995 – 0,718. Nejlepších kalibračních hodnot MK dosáhl tým autorů pro stanovení kys. kapronové a kaprilové s korelačními koeficienty kalibrace a validace: 0,903 a 0,750 (kys. kapronová) a 0,914 a 0,718 (kys. kaprilová). ALBANELL et al. označili NIR spektroskopii jako potenciální techniku
102
VÝSLEDKY A DISKUSE pro předpověď koncentrace mastných kyselin v ovčím mléce. Naše práce toto mínění potvrzuje. Stanovením širokého spektra mastných kyselin v syrovém a sušeném kravském mléce se zabývali COPPA et al. (2010). Vzorky syrového mléka byly získány od krav, které byly v různém režimu krmení (pastva, siláž, krmivo obohacené o tukové složky), pro zajištění širokého rozpětí zastoupení mastných kyselin. Analýzy byly provedeny spektrofotometru Foss NIRSystem 6500 v režimu transflektance ve spektrálním rozsahu 400 – 2 498 nm. Pomocí metody PLS a ověřením kalibrace křížovou a externí validací (114 vzorků) bylo dosaženo vysokých
korelačních
koeficientů
pro nasycené
MK
(mastné
kyseliny),
mononenasycené MK, transMK, trans a cis-C18:1, kys. kaprinovou, laurovou, myristovou, palmitovou a olejovou. Při stanovení stejných MK jako v naší práci autoři dosáhli lepších kalibračních výsledků, než se podařilo nám. Při stanovení polynenasycených MK, kys. stearové a vakcenové a konjugované kys. linolové dosáhli pouze přibližné predikce. Pro stanovení kys. linolové, linoleové a celkové n-6 a n-3 MK byla predikce jejich obsahu MK velmi slabá. Ve všech případech bylo dosaženo lepších výsledků MK stanovovaných v sušeném mléce než v syrovém. AULRICH et MOLKENTIN (2009) studovali rozdíl v zastoupení mastných kyselin v kravském mléce, které bylo získáno z konvenčního a ekologického zemědělství. Zaměřili se stanovení MK, které byly nejvíce ovlivněny sezónou a rozdílnou krmnou dávkou. Výsledky jejich práce poukazují možnost stanovení zejmé ω-3 MK (s C18:3 a C 20:5) pomocí NIR spektroskopie.
5.2 Kozí mléko V naší práci jsme se zaměřili stanovení bílkovin, tuku, laktosy a TPS v kozím mléce. Celkem bylo odebráno 86 vzorků a použito pro tvorbu kalibrace pro TPS a pro rekalibrace vytvořených kalibrací pro bílkoviny, tuk a laktosu v roce 2004 Ing. Renatou Jankovskou, Ph.D. Spektrofotometr FT NIR Antaris byl kalibrován základě referenčních hodnot (viz Tab. 6, kap. 4.1.2), které byly získány vedlejšími referenčními metodami uvedenými v kap. 4.2.1.2. Nastavení metody měření (viz kap. 4.2.2.2) bylo shodné s metodou JANKOVSKÉ (2004), abychom
103
VÝSLEDKY A DISKUSE mohli naměřená spektra použít pro rozšíření a upravení již vytvořených kalibrací. Na obr. 21 je vidět průměrné spektrum kozího mléka s různým obsahem bílkovin.
Obr. 21 Průběh NIR spekter kozího mléka s maximálním a minimálním obsahem bílkovin. Pro vytvoření kalibračních modelů pomocí metody PLS byla všech spektra až kalibraci pro tuk podrobe úpravě první derivací, čímž se zvýraznily jejich absorpční pásy. Pro kalibraci tuku byla použita spektra bez úpravy. Dále byly pro každou složku vybrány charakteristické rozsahy regionů, tak aby bylo dosaženo co nejlepších kalibračních výsledků (Tab. 19). Tab. 19 Úprava spekter a regionů pro vybrané oblasti vlnočtů pro kalibraci kozího mléka. Parametr
N
úprava spektra
Bílkoviny
119
první derivace
Tuk
118
bez úprav
Laktosa
119
první derivace
TPS
80
první derivace
Vybraný region pro kalibraci úprava vlnočet (cm-1) Spectrum Range 4 087,00 – 9 977,93 1st Derivative in range 4 011,21 – 5 391,04 Spectrum Range 6 658,20 – 9 997,17 2nd Derivative in range 5 941,63 – 5 325,53 Spectrum Range 4 622,75 – 4 144,52 2nd Derivative in range 6 011,80 – 5 378,37 Spectrum Range 9 997,17 – 4 474,91
N – počet vzorků, TPS – tukuprostá sušina
Pomocí diagnostických nástrojů (Spectrum Outlier, PC Scores a Leverage) byly v každé kalibraci průměrně tři vzorky označeny jako odlehlé standardy, které se lišily od ostatních svojí spektrální informací. Skutečný počet vzorků pro kalibrace
104
VÝSLEDKY A DISKUSE je uveden v Tab. 19. U vytvořených kalibrací byl zkontrolován průběh funkce PRESS a zjištěn počet PLS faktorů. Jak uvádí tab. 20, ve všech kalibračních metodách bylo dosaženo poměrně vysokého počtu PLS faktorů v rozmezí 10 – 15, avšak s prudkým klesajícím trendem. Vysokých hodnot PLS faktorů bylo dosaženo i před doplněním kalibrací o naše vzorky (bílkoviny – PLS (9), tuk – PLS (5), laktosa – PLS (11)), což mělo teoreticky snížit počet PLS faktorů a pokrýt tak slepá místa v kalibraci. Vysoký počet PLS faktorů je pravděpodobně zapříčiněn stále malým koncentračním rozpětím referenčních hodnot stanovovaných složek, ale i tak jsou vytvořené kalibrace charakterizovány vysokými korelačními koeficienty a nízkými odchylkami a lze je použít pro stanovení daných složek kozího mléka. Obr. 22 uvádí nejvíce klesající trend funkce PRESS pro obsah tuku. Tab. 20 Kalibrační výsledky pro složky kozího mléka. Parametr Bílkoviny Tuk Laktosa TPS
N
R
118 119 118 80
0,995 0,950 0,954 0,989
SEC (%) 0,030 0,233 0,092 0,054
CCV (%) 1,120 7,138 2,079 0,675
y = bx ± a
PLS
y = 0,989x + 0,0292 y = 0,903x + 0,3166 y = 0,910x + 0,3981 y = 0,978x + 0,1716
14 10 15 10
N – počet vzorků, y = bx + a = regresní přímka, SEC – směrodatná odchylka kalibrace, CCV – kalibrační variační koeficient, R- korelační koeficient, PLS - počet faktorů, TPS – tukuprostá sušina
Obr. 22 Funkce PRESS pro stanovení tuku v kozím mléce s počtem 10 PLS faktorů.
105
VÝSLEDKY A DISKUSE Vytvořené kalibrace byly charakterizovány korelačními koeficienty (R), jejichž hodnoty se pohybovaly v intervalu 0,984 – 0,995 a směrodatnými odchylkami SEC od 0,030 % do 0,233 %. Nejvyšší závislosti predikovaných a referenčních hodnot bylo dosaženo u kalibrace pro bílkoviny (0,995 ± 0,030 %) a naopak nejnižší u kalibrace pro laktosu (0,984 ± 0,092 %). Pro ostatní stanovované složky jsou kalibrační hodnoty uvedeny v Tab. 20. Pro ověření spolehlivosti vytvořených kalibrací byla použita křížová validace se stejnou skupinou vzorků. Bylo dosaženo korelačních koeficientů validace (R) v rozmezí od 0,640 pro bílkoviny do 0,959 pro laktosu se směrodatnými odchylkami predikce (SEP) 0,084 – 0,303 % opět pro stejné složky, což svědčí o tom, že jako nejspolehlivější kalibrační model můžeme považovat kalibraci pro bílkoviny. Model pro stanovení laktosy je třeba ještě zdokonalit, aby byl použitelný v praxi, protože jeho
korelační
koeficient
TRILČOVÉ et al. (2005) pouze
validace
byl
0,640,
což
poukazuje
dle
středně silnou závislost mezi stanovovanými
a referenčními hodnotami složek. Validační výsledky kalibrací pro tuk a TPS poukazují velmi silnou (tuk) a dosti silnou (TPS) závislost (Tab. 21). Tab. 21 Validační výsledky pro složky kozího mléka. Parametr
N
R
Bílkoviny Tuk Laktosa TPS
118 119 118 80
0,959 0,913 0,640 0,857
SEP (%) PCV (%) 0,084 0,303 0,252 0,190
3,138 9,292 5,680 2,376
y = bx ± a y = 0,9246x + 0,1991 y = 0,865x + 0,437 y = 0,5872x + 1,8377 y = 0,7376x + 2,099
N – počet vzorků, y = bx + a = regresní přímka, SEP – směrodatná odchylka validace, PCV – predikční variační koeficient, R – korelační koeficient, TPS – tukuprostá sušina
Na Obr. 23 – 26 jsou graficky vyjádřeny závislosti korelačních koeficientů kalibrací a validací stanovovaných složek. Obr. 23 a 24 potvrzují velmi silnou závislost mezi kalibrací a validací u bílkovin a tuku, protože se jejich regresní přímky téměř překrývají. Kalibrace pro stanovení laktosy a TPS lze z tohoto hlediska označit za méně přesnější, protože dochází k většímu rozdílu mezi korelačními koeficienty a získané regresní přímky se rozcházejí (Obr. 25 a 26).
106
VÝSLEDKY A DISKUSE
Obr. 23 Kalibrační a validační modely pro stanovení bílkovin v kozím mléce.
Obr. 24 Kalibrační a validační modely pro stanovení tuku v kozím mléce.
Obr. 25 Kalibrační a validační modely pro stanovení laktosy v kozím mléce.
107
VÝSLEDKY A DISKUSE
Obr. 26 Kalibrační a validační modely pro stanovení tukuprosté sušiny v kozím mléce. Hodnoty kalibračních a predikčních variačních koeficientů se pohybovaly v rozmezí CCV 0,675 – 7,138 % a PCV 2,376 – 9,292 %. Nejnižších hodnot bylo dosaženo pro kalibraci TPS a nejvyšších pro tuk. Ostatní hodnoty CCV a PCV jsou uvedeny v Tab. 20 a 21. Kalibrace pro bílkoviny, laktosu a TPS byly vyhodnoceny základě CCV a PCV jako vysoce spolehlivé, protože splňovaly dané limity (CCV < 5 %, PCV <10 %). V případě kalibrace pro tuk hodnota CCV mírně překročila hodnotu 5 %, avšak hodnota PCV byla > 10 %, proto byla vytvořená kalibrace označe za méně spolehlivou oproti ostatním. Z výsledků porovnání predikovaných a referenčních hodnot získaných dvouvýběrovým párovým t-testu střední hodnotu můžeme konstatovat, že se mezi hodnotami (NIR a referenčními) není průkazný rozdíl (P < 0,05). Vypočítané hodnoty jsou shrnuty v tabulce 22. Tab. 22 Statistické vyhodnocení jednotlivých kalibrovaných složek kozího mléka. Parametr
N
Bílkoviny Tuk Laktosa TPS
118 119 118 80
xNIR (%) 2,68 3,26 4,43 8,00
xREF (%) 2,68 3,26 4,43 8,00
SD
t stat
t1 krit
t2 krit
0,03 0,07 0,03 0,04
0,12 0,00 0,02 0,02
1,66 1,66 1,66 1,66
1,98 1,98 1,98 1,99
N – počet vzorků, xNIR – hodnoty predikované, xREF – hodnoty referenční, SD – směrodatná odchylka diference, tstat – t-test, t1(krit) – tabulková hodnota při α = 0,05, t2(krit) – tabulková hodnota při α = 0,01, TPS – tukuprostá sušina.
108
VÝSLEDKY A DISKUSE Nejlépe vytvořený funkční model byl získán pro stanovení bílkovin, protože byl charakterizován nejlepšími kalibračními i validačními výsledky s nejnižšími směrodatnými odchylkami. Jeho spolehlivost byla potvrze také hodnotami SEC 1,120 % a SEP 3,138 %. Kalibrační model pro stanovení laktosy se jeví jako vysoce spolehlivý z hlediska hodnocení CCV a PCV, avšak korelační koeficienty kalibrace a validace a jejich směrodatné odchylky se v této metodě od sebe nejvíce lišily, a proto lze tento model použít pouze pro orientační stanovení hodnot. Při porovnání výsledků naší práce a práce JANKOVSKÉ (2004) bylo dosaženo v naší práci lepších hodnot v přípatě kalibrace tuku a srovnatelných hodnot u kalibrace bílkovin. Pouze u kalibrace pro laktosu se Jankovské podařilo získat lepších výsledků při křížové validaci (Tab. 23). Tab. 23: Srovnání kalibračních, validačních výsledků a PLS faktorů před rekalibrací vytvořených kalibrací složek kozího mléka. Kalibrace (R ± SEC) Jankovská (2004) Naše výsledky
Parametr
Validace (R ± SEP) Jankovská (2004) Naše výsledky
Bílkoviny
0,989 ± 0,060
0,995 ± 0,030
0,972 ± 0,090
0,959 ± 0,084
Tuk
0,907 ± 0,220
0,950 ± 0,233
0,835 ± 0,290
0,913 ± 0,303
Laktosa
0,981 ± 0,060
0,954 ± 0,092
0,930 ± 0,110
0,640 ± 0,252
R – korelační koeficient kalibrace a validace, SEC – směrodatná odchylka kalibrace, SEP – směrodatná odchylka predikce.
Díky získaným výsledkům vytvořených rekalibrací lze konstatovat, že vedlejší referenční metoda nemusí, ale může ovlivnit kvalitu vytvořených kalibrací, což se potvrdilo v případě kalibrace pro laktosu. Ukázalo se, že chyba nepřímé metody se může zanést i do vytvořených kalibrací a výrazně ovlivnit její kvalitu. Pokud není jiná možnost, lze použít vedlejší metodu pro kalibraci spektrofotometru, ale pak je nutno dbát kvalitu referenčních hodnot a snažit se o minimalizaci zanesení chyb do metody. Využitím NIR spektroskopie pro analýzu kozího mléka se nejvíce zabývali DIAZ – CARRILLO et al. (1993; 1995), kteří identifikovali vlnové délky, při nichž dochází k největší absorpci záření při stanovení základních složek kozího mléka.
109
VÝSLEDKY A DISKUSE Podobnými pracemi se zabývali také ALBANELL et al. (2003); ŠUSTOVÁ et KUCHTÍK (2007); a nebo DRAČKOVÁ et al. (2008). HADRA et al. (2006) stanovovali pomocí spektrofotometru NIR Anataris ve spektrálním rozsahu 10 000 – 4 000 cm-1 koncentraci tuku, laktosy, bílkovin, sušiny, TPS a titrační kyselost v pasterovaném kozím mléce. Pomocí metody PLS dosáhli poměrně vysokých korelačních koeficientu kalibrace a validace pro: tuk 0,968 a 0,942; laktosu 0,984 a 0,902; bílkoviny 0,985 a 0,900; sušinu 0,966 a 0,933; TPS 0,897 a 0,643 a pro titrační kyselost 0,989 a 0,951. Získané výsledky pro kalibraci bílkovin a TPS dosahovaly v naší práci vyšších hodnot. Ostatní kalibrace byly lépe vytvořeny HADROU et al. (2006). Autoři uvádí, že NIR spektroskopie je adekvátní technika pro analýzu kozího mléka. Tuto myšlenku potvrzuje i práce ŠUSTOVÉ et KUCHTÍKA (2007), kteří analyzovali kromě bílkovin, tuku, laktosy, kaseinu také množství somatických buněk v kozím mléce. Jejich výsledky bohužel poukazují nevhodnost NIR spektroskopie pro stanovení somatických buněk, protože bylo dosaženo nízkých korelačních koeficientů kalibrace a validace a vysokých chyb predikce. Autoři uvádí, že to bylo způsobeno příliš vysokou variabilitou referenčních hodnot. Stanovení fyzikálně – chemických parametrů kozího mléka uvádí práce DRAČKOVÉ et al. (2008). Celkem 60 vzorků proměřovali pomocí spektrofotometru FT NIR Antaris integrační sféře ve spektrálním rozsahu 10 000 – 4 000 cm-1 se 100 sc. Referenční hodnoty pro kalibraci spektrofotomentu byly získány přístroji Bentley 2 500 (Bentley Instruments, Chaska, USA). Pomocí metody PLS bylo dosaženo těchto kalibračních výsledků korelačních koeficientů kalibrace a validace se směrodatnými odchylkami pro: bílkoviny 0,920 ± 0,094 % a 0,888 ± 0,111 %; tuk 0,951 ± 0,124% a 0,924 ± 0,154 %; laktosu 0,997 ± 0,011% a 0,935 ± 0,050 %; sušinu 0,940 ± 0,260 % a 0,899 ± 0,334 %; TPS 0,940 ± 0,260 % a 0,899 ± 0,191 %; bod mrznutí 0,935 ± 0,003 a 0,833 ± 0,005; titrační kyselost 0,952 ± 0,295 a 0,878 ± 0,469 a pro pH 0,835 ± 0,057 a 0,703 ± 0,076. Při porovnání dosažených výsledků s našimi, dosáhl tým autorů, až kalibraci pro laktosu, která byla posá vyššími korelačními koeficienty, obdobných výsledků pro kalibraci tuku a bílkovin.
110
VÝSLEDKY A DISKUSE Z uvedených výsledků disertační práce a výsledků ostatních autorů vyplývá, že FT NIR spektroskopie představuje vhodnou techniku pro rychlou analýzu základních složek kozího mléka.
5.3 Mražené krémy Následující kapitola je zaměře ověření vhodnosti NIR spektroskopie pro analýzu chemického složení vybraných složek (sušiny, tuku a bílkovin) mražených krémů. Pro analýzy bylo použito 40 vzorků zakoupených v tržní síti, které zahrnovaly jak smetanové a tvarohové krémy, tak i „zmrzliny“ s příměsí rostlinného tuku. Na Ústavu technologie potravin, AF byly provedeny dle příslušných ČSN norem referenční analýzy vzorků (viz. kap. 4.2.1.3), jejichž výsledky jsou uvedeny v Tab. 7 kap. 4.1.3. Homogenizované
vzorky
byly
při pokojové
teplotě
proměřeny
spektrofotometru FT NIR Antaris v režimu reflektance se 100 sc a spektrálním rozlišením 8 cm-1 v rozsahu 10 000 – 4 000cm-1 dvěma metodami. V prvním případě byl vzorek analyzován ve skleněné kádince o průměru 3 cm s výškou hladiny vzorku 5 cm a v druhém případě v Petriho misce o průměru 6 cm s kovovým zrcátkem s výškou reflexní plochy 0,3 mm. Cílem bylo porovnat, která metoda poskytuje lepší a spolehlivější výsledky. Zda měření vzorku v kádince, kdy dochází k odrazu paprsku od vzorku, což by mělo napodobovat měření on-line v praxi, anebo v Petriho misce, kde je zrcátkem zajiště rovnoměrná vrstva vzorku ve všech místech a nedojde tak k tvorbě větších částic, které by způsobily rozptyl záření. Pro tvorbu kalibrací pomocí programu TQ Analyst metodou PLS byla použita průměrná spektra ze dvou měření a jejich funkčnost byla ověře křížovou validací. Na obrázku 27 vidíme ukázku NIR spekter mraženého krému měřeného v kádince a Petriho misce.
111
VÝSLEDKY A DISKUSE
Obr. 27: NIR spektra mraženého krému měřeného v kádince a Petriho misce. Pomocí identifikace odlehlých standardů nástrojem Leverage, Sperctrum Outlier a PC Score jsme při tvorbě všech kalibrací odstranily 1 – 3 vzorky. Skutečný počet vzorků je uveden v Tab. 24. Pro každou složku byly vytvořeny dvě kalibrace dle způsobu měření a vybrány oblasti regionů, v nichž bylo dosaženo nejlepších kalibračních výsledků (Tab. 24). Spektra vzorků pro kalibraci sušiny (Z), bílkovin (Z) a tuku (K) byla podrobe první derivaci, pro ostatní kalibrace byla použita spektra bez úprav derivováním. Další úpravou spekter bylo použití korekce velikost částic (SNV – Standard Normal Variate) a to v případě kalibrace pro sušinu (K), tuk (Z) a v obou metodách pro tvorbu kalibrace bílkovin. Pomocí SNV dochází k úpravě spektrálních dat tak, aby v souboru byla směrodatná odchylka proměnných v každém bodě rov 1, s cílem kompenzace rozdílů v optických drahách vzorků (ČURDA et al., 2002). Optimální počet PLS faktorů získaný při minimální hodnotě PRESS, která měla ve všech případech klesající trend, je uveden v Tab. 25. Nejnižší počet PLS (3) byl dosažen u tuku metodou měření v kádince, naopak nejvyšší (10) u bílkovin měřením v Petriho misce se zrcátkem. Ostatní hodnoty PLS jsou shrnuty společně s kalibračními výsledky v Tab. 25.
112
VÝSLEDKY A DISKUSE Tab. 24 : Úprava spekter a regionů vybraných oblastí vlnočtů pro kalibrace mražených krémů. Parametr
Způsob měření
N
K
39
Z
39
K
37
Z
38
Sušina
Tuk
K
36
Z
37
Bílkoviny
Vybraný region pro kalibraci
Úprava spektra
vlnočet (cm-1)
úprava
bez Spectrum Range úprav první 1st Derivative in range derivace 1st Derivative in range první Spectrum Range derivace bez Spectrum Range úprav 1st Derivative in range bez 1st Derivative in range úprav 1st Derivative in range první Spectrum Range derivace
10 001,03 – 4 005,98 4 906,83 – 4 214,40 7 520,54 – 5 300,15 8 130,42 – 4 004,01 10 001,03 – 4 132,86 4 695,20 – 4 176,71 8 759,10 – 7 371,80 5 960,35 – 5 558,80 10 001,03 – 4 088,46
N – počet vzorků, K – kádinka, Z – zrcátko,
Tab. 25 Kalibrační výsledky kalibrovaných složek mražených krémů. Způsob měření K Sušina Z K Tuk Z K Bílkoviny Z Parametr
N
R
39 39 37 38 36 37
0,957 0,982 0,921 0,909 0,968 0,998
SEC (%) 1,030 0,675 0,137 1,470 0,265 0,069
CCV (%) 2,763 0 1,810 1,388 15,232 9,501 2,469
y = bx ± a
PLS
y = 0,9161x + 3,1272
5 7 3 6 7 10
y = 0,964x + 1,3408 y = 0,8486x + 1,4951 y = 0,8267x + 1,6826 y = 0,8258x + 0,4861 y = 0,9958x + 0,0108
N – počet vzorků, y = bx + a = regresní přímka, SEC – směrodatná odchylka kalibrace, CCV – kalibrační variační koeficient, R – korelační koeficient, PLS – počet faktorů, K – kádinka, Z – zrcátko
Na obrázku 28 je znázorněn nejlepší průběh funkce PRESS pro sušinu stanovovanou v Petriho misce se zrcátkem h = 0,3 mm. Referenční hodnoty koncentračního rozpětí sušiny se pohybovaly v rozmezí 30,5 – 48,3 %, díky čemuž byl optimálně pokryt interval stanovovaných hodnot.
113
VÝSLEDKY A DISKUSE
Obr. 28 Funkce PRESS pro stanovení sušiny v mražených krémech metodou v Petriho misce se zrcátkem h = 0,3 mm s počtem 7 PLS faktorů. V Tabulce
25
a 26
jsou
uvedeny
kalibrační
a validační
výsledky
pro stanovované složky obou metod. Tab. 26 Validační výsledky jednotlivých složek mražených krémů. Způsob měření K Sušina Z K Tuk Z K Bílkoviny Z Parametr
N
R
39 39 37 38 38 37
0,926 0,929 0,899 0,860 0,861 0,932
SEP (%) 1,350 1,320 1,550 1,800 0,544 0,384
PCV (%) 3,620 3,545 15,728 18,651 19,617 13,856
y = bx ± a y = 0,8794x + 4,5033 y = 0,8899x + 4,0586 y = 0,8230x + 1,7292 y = 0,7448x + 2,4173 y = 0,8231x + 0,4774 y = 0,8018x + 0,5297
N – počet vzorků, y = bx + a = regresní přímka, SEP – směrodatná odchylka validace, PCV – predikční variační koeficient, R - korelační koeficient, K – kádinka, Z – zrcátko.
Po vytvoření kalibračních modelů metodou měření v KÁDINCE bylo dosaženo následujících korelačních koeficientů kalibrace a validace a jejich směrodatných odchylek pro: sušinu 0,957 ± 1,350 % a 0,926 ± 1,350 %; tuk 0,921 ± 0,137 % a 0,899 ± 1,55 % a pro bílkoviny 0,968 ± 0,265 % a 0,861 ± 0,544 %. Z dosažených výsledků vyplývá, že u kalibrací pro sušinu a tuk existuje velmi silná závislost mezi referenčními a predikovanými hodnotami NIR spektroskopem. Kalibrace bílkovin se vyznačuje dosti silnou závislostí mezi hodnotami referenčními a predikovanými.
114
VÝSLEDKY A DISKUSE Spolehlivost vytvořených kalibrací byla ověře pomocí kalibračních (CCV) a predikčních (PCV) variačních koeficientů. Dle ČURDA et al. (2002), můžeme kalibraci pro sušinu považovat za vysoce spolehlivou, protože CCV a PCV nabývaly hodnot 2,763 % a 2,620 %. Kalibrace pro tuk a bílkoviny měly spolehlivost také poměrně vysokou, ale pouze pro orientační stanovení, jejichž hodnoty CCV a PCV jsou uvedeny v Tab. 25 a 26. Kalibrační modely vytvořené ze spektrálních dat získaných měřením vzorků v Petriho misce se ZRCÁTKEM, byly popsány korelačními koeficienty kalibrace se směrodatnými odchylkami pro sušinu, tuk a bílkoviny následovně: 0,982 ± 0,675 % (sušina); 0,909 ± 1,470 % (tuk) a 0,998 ± 0,069 % (bílkoviny). Kalibrace byly ověřeny křížovou validací s následujícími korelačními koeficienty validace a příslušnými
odchylkami
pro:
sušinu
0,929
±
1,320 %,
tuk
0,860
±
1,80 % a pro bílkoviny 0,932 ± 0,384 %. Z výsledků vyplývá, že velmi silnou závislost referenčních a predikovaných hodnot vykazuje kalibrace pro sušinu a bílkoviny, kalibrace pro tuk vykazuje pouze dosti silnou závislost. Po ověření spolehlivosti modelů pomocí kalibračních a variačních koeficientů, bylo zjištěno, že nejlépe funkční je opět kalibrace pro sušinu, protože její hodnoty CCV a PCV jsou 2,763 % a 3,620 %. U kalibrací pro tuk a bílkoviny CCV a PCV přesáhly hodnoty 5 % a 10 %, proto je nelze označit za spolehlivé. K jejich zlepšení by došlo rozšířením koncentračního rozpětí hodnot, což potvrzuje aplikační list pro kalibraci mražených krémů firmy BÜCHI (2005). Nicméně určitá závislost zde byla naleze a lze tyto metody použít k orientačnímu stanovení daných složek. Při porovnání referenčních (xREF) a predikovaných (xNIR) hodnot pomocí dvouvýběrového párového t-testu střední hodnotu nebyl nalezen mezi hodnotami statisticky průkazný rozdíl (P < 0,05), jak uvádí Tab. 27.
115
VÝSLEDKY A DISKUSE Tab. 27 Statistické vyhodnocení kalibrovaných složek mražených krémů t-testem Způsob měření K Sušina Z K Tuk Z K Bílkoviny Z Parametr
N 39 39 37 38 36 37
xNIR (%) 37,28 37,28 9,87 9,71 2,79 2,80
xREF (%) 37,28 37,28 9,87 9,71 2,79 2,79
SD
t stat
t1 krit
t2 krit
0,570 0,570 0,580 0,573 0,175 0,170
0,000 0,000 0,001 0,001 -0,004 0,070
1,686 1,686 1,688 1,687 1,690 1,688
2,024 2,024 2,028 2,026 2,030 2,028
N – počet vzorků, xNIR – hodnoty predikované, xREF – hodnoty referenční, SD – směrodatná odchylka diference, tstat – t-test, t1(krit) – tabulková hodnota při α = 0,05, t2(krit) – tabulková hodnota při α = 0,01, TPS – tukuprostá sušina, K – kádinka, Z – zrcátko.
Za celkově nejlepší kalibrace lze označit metody pro stanovení sušiny, protože při obou způsobech měření, bylo dosaženo velmi vysokých hodnot korelačních koeficientů s nízkými odchylkami, jejichž vysoká spolehlivost byla dá nízkými hodnotami CCV a PCV. Naopak jako nejslabší kalibrační model se nám jevil pro stanovení tuku metodou se zrcátkem, kdy se jeho korelační koeficienty kalibrace a validace nejvíce lišili, což lze vidět obr. 32. Jeho nespolehlivost je také dá vyššími hodnotami CCV a PCV. Obr. 29 – 34 znázorňují vztahy mezi referenčními a predikovanými hodnotami spektrometrem.
Obr. 29 Kalibrační a validační výsledky pro stanovení sušiny metodou v kádince.
116
VÝSLEDKY A DISKUSE
Obr. 30 Kalibrační a validační výsledky pro stanovení sušiny metodou Petriho misce se zrcátkem h = 0,3 mm.
Obr. 31 Kalibrační a validační výsledky pro stanovení tuku metodou v kádince.
Obr. 32 Kalibrační a validační výsledky pro stanovení tuku metodou Petriho misce se zrcátkem h = 0,3 mm.
117
VÝSLEDKY A DISKUSE
Obr. 33 Kalibrační a validační výsledky pro stanovení bílkovin metodou v kádince.
Obr. 34 Kalibrační a validační výsledky pro stanovení bílkovin metodou Petriho misce se zrcátkem h = 0,3 mm. Stanovením tuku a sušiny v mražených krémech se zabýval roku 1999 tým vědců
ze
společnosti
PERTEN
INSTRUMENT.
Pomocí
Visible
/
NIR
spektrofotometru s optickou sondou analyzovali 150 vzorků pocházejících ze dvou různých mlékáren (92 + 58). Získaná spektra byla ošetře korekcí velikost částic a podrobe první derivaci. Kalibrační modely byly vyvinuty pomocí metody částečných nejmenších čtverců (PLS) a popsány 7 PLS faktory pro tuk, 10 PLS pro sušinu. Nejlepších výsledků kalibrací bylo dosaženo v regionu od 1 000 – 1 300 nm pro tuk a 950 – 1 300 nm pro sušinu. Získané korelační koeficienty validace se směrodatnými odchylkami pro tuk 0,994 ± 0,33 % a sušinu 0,994 ± 0,44 %, byly v obou případech nepatrně vyšší ve srovnání s výsledky v naší práci. Autoři označují NIR spektroskopii jako rychlou a snadnou metodu pro stanovení složení mražených krémů.
118
VÝSLEDKY A DISKUSE Naše práce se nejvíce přibližuje svým obsahem práci, kterou publikoval v roce 2005 tým autorů ze společnosti BÜCHI. Jejich cílem bylo, vyvinou kalibrační pro stanovení
model
sušiny,
tuku
a
bílkovin
v mražených
krémech
pro spektrofotometr NIRFlex N-500. Pro tvorbu kalibrací použily 300 vzorků a získali následující korelační koeficienty validace se směrodatnými odchylkami pro: sušinu 0,986 ± 0,54 %; tuk 0,995 ± 0,29 % a bílkoviny 0,983 ± 0,068 %. Autoři opět dosáhli ve všech případech lepších výsledků, než uvádí naše práce. Abychom se jejich výsledkům alespoň přiblížili bylo by nutné naše kalibrace rozšířit o více vzorků. Další práce, která ověřila možnost použití NIR spektroskopie k analýze mražených krému publikovali TANG et al. (1999). Autoři se zaměřili stanovení tuku,
tukuprosté
sušiny
(TPS)
a sacharosy
pomocí
spektrofotometru
NIR Systém 6500. Celkem 43 vzorků mražených krémů bylo zakoupeno v obchodní síti a rozděleno 30 vzorků, které se použili tvorbě kalibrací a 13 vzorků k externí validaci. Před analýzou byly všechny vzorky rozmraženy ve vodní lázni při 40 °C, zchlazeny pokojovou teplotu a propasírovány přes síto, aby se odstranily větší kousky ovoce a ořechů. Poté byly proměřeny ve spektrálním rozsahu 400 – 2 500 nm s 32 scany a rozlišením 2 nm v režimu reflektance. Nejlepších kalibrací bylo dosaženo upravením spekter druhou derivací a omezením spektrálního regionu 1 100 – 2 500 nm. Křížová validace ukázala, že hodnoty z referenčních metod pro tuk, TPS a sacharosu v mražených krémech, jsou srovnatelné s hodnotami predikovanými NIR spektroskopem s procentuální odchylkou hodnot pro: tuk 5 %, TPS 5,9 % a sacharosu 7,2 %. Autoři opět uvádí, že NIR spektroskopie může být použita pro rychlé screeningové analýzy chemického složení mražených krémů. SILAGHI et al. (2010) popisuje vhodnost NIR spektroskopie stanovení kvalitativních vlastností mražených krémů jako např: koeficient konzistence a index chování tekuté směsi mraženého krému. Prediktivní modely byly vyvinuty pomocí metody PLS. Byly nalezeny vysoké korelační koeficienty nad 0,95 pro oba stanovované reologické parametry. Jak vyplývá z dosažených výsledků disertační práce a citací, NIR spektroskopie je vhodná metoda pro kvantitativní ale i kvalitativní hodnocení mražených krémů.
119
VÝSLEDKY A DISKUSE Výsledky kalibrací mražených krémů budou také publikovány v diplomové práci Bc. Kateřiny Horníkové.
5.4 Olomoucké tvarůžky Blízká infračervená spektroskopie byla využita pro analýzu základních složek sýrů již v roce 1982 FRANKEM et BIRTHEM. Následující kapitola pojednává o analýze Olomouckých tvarůžků pomocí FT NIRS, jak z hlediska kvantitativního, tak i kvalitativního hodnocení. Při kvantitativním hodnocení jakostních ukazatelů Olomouckých tvarůžku byly analýzy zaměřeny stanovení obsahu sušiny, chloridu sodného (NaCl), pH a titrační kyselosti (° SH). Pro referenční a spektrofotometrické analýzy byly vzorky odebírány přímo v potravinářském podniku A. W. spol. s.r.o. v Lošticích. Odběry vzorků v různých technologických fázích výroby a hotového výrobku byly provedeny ve dvou sériích (jaro, léto) dle schématu uvedeného v kap. 4.1.4. Hotové výrobky byly dále skladovány při teplotě 5 a 20 °C dobu jednoho měsíce Ústavu technologie potravin, kde byly také provedeny veškeré referenční analýzy (viz. kap. 4.2.1.4), jejichž hodnoty jsou shrnuty v Tab. 8 kap. 4.1.4. Celkem 72 vzorků Olomouckých tvarůžků bylo proměřeno
spektrofotometru FT NIR Antaris
integrační sféře v režimu reflektance v jemně nastrouhaném stavu pomocí kompresní rotační kyvety. Metodika spektrofotometrického měření je blížeji popsá v kap. 4.2.2.4. Kalibrační modely byly vyvinuty pomocí metody částečných nejmenších čtverců (PLS), ověřeny křížovou validací a statisticky zhodnoceny dvouvýběrovým párovým t-testem střední hodnotu. Při kvalitativním hodnocení jsme využili metodu Diskriminační analýzy pro rozlišení Olomouckých tvarůžků: v různé fázi výroby, rozdílného tvaru (kolečka, tyčinky), vyrobených z jarního či letního mléka. Na obrázku 35 je možno vidět průměrná NIR spektra Olomouckých tvarůžků v různé fázi výroby a skladovaných při rozdílné teplotě. Charakter průběhu spekter je, až spektrum tvarůžků skladovaných při 20 °C stejný, avšak maximální hodnota Log (1/R) v pících, kde R je podíl energie odraženého záření, je pro každé spektrum Olomouckých tvarůžků rozdílná. Obrázek 36 znázorňuje průměrná spektra Olomouckých tvarůžků rozdílného tvaru (tyčinky a kolečka) a vyrobených z jarního
120
VÝSLEDKY A DISKUSE a letního mléka. Tyto spektra obsahují části regionů, v nichž se od sebe nepatrně liší, základě čehož došlo k rozlišení jarních a letních Olomouckých tvarůžků pomocí DA.
Obr. 35 NIR spektra Olomouckých tvarůžků v různé fázi výroby a skladování za rozdílných teplot.
Obr. 36 NIR spektra Olomouckých tvarůžků ve tvaru tyčinek a koleček, vyrobených z jarního a letního mléka
121
VÝSLEDKY A DISKUSE 5.4.1 Kvantitativní analýzy Olomouckých tvarůžků Pro vytvoření kalibračních modelů pomocí metody PLS byla všech spektra až kalibraci pro NaCl (20 °C) uprave první derivací, spektra pro NaCl (20 °C) byla podrobe druhé derivaci. Opět byly pro každý stanovovaný parametr vybrány charakteristické rozsahy regionů, tak aby bylo dosaženo co nejlepších kalibračních a validačních výsledků (Tab. 28). Tab. 28 Úprava spekter a regionů vybraných oblastí vlnočtů pro kalibrace Olomouckých tvarůžků. Teplota Parametr skladování Suši (%) NaCl (%) pH ° SH
5 °C 20 °C 5 °C 20 °C 5 °C 20 °C 5 °C 20 °C
Vybraný region pro kalibraci
úprava spektra první derivace první derivace první derivace druhá derivace první derivace první derivace první derivace první derivace
úprava
vlnočet (cm-1)
Spectrum Range
4 487,54 – 7 386,03 7 570,14 – 4 005,98 9 999,10 – 4 005,43 9 999,10 – 4 005,98 7 646,25 – 4 018,92 9 003,42 – 4 005,98 4 013,14 – 7 842,85 7 792,11 – 4 170,87
°SH – titrační kyselost, NaCl – kuchyňská sůl,
Referenční vzorky pro kalibrace měly dostatečné rozpětí hodnot díky stanovenému schématu odběrů, čímž jsme zajistili širokou škálu vzorků s rozdílnými vlastnostmi. V případě stanovení titrační kyselosti měl interval hodnot veliký rozsah od 16,54 – 95,54, ale nebyl pravidelně pokryt hodnotami, což zřejmě způsobilo, že vytvořené kalibrace byly méně spolehlivé oproti ostatním. Pomocí Spektrum Outlier, Leverage a PC Score jsme identifikovali odlehlé standardy, které byly z kalibrací vyloučeny. Přesný počet použitých vzorků pro kalibrace je uveden v tabulce 29. Kvalita vytvořených kalibrací byla posuzová podle funkce PRESS, která v sobě nese informace o hodnotě predikované zbytkové chyby sumy čtverců, měnící se s počtem PLS faktorů (ŠUSTOVÁ et KUCHTÍK, 2007). Optimální počet PLS faktorů se pohyboval od 5 – 10 PLS viz Tab. 29. Průběh funkce PRESS s nejvíce klesajícím trendem znázorňuje Obr. 37 pro kalibraci NaCl při 20 °C. Kalibrační
122
VÝSLEDKY A DISKUSE modely s takovýmto průběhem jsou obvykle charakterizovány vysokými korelačními koeficienty a nízkými směrodatnými odchylkami.
Obr. 37 Průběh funkce PRESS kalibrace NaCl při 20 °C s počtem PLS faktorů 8. Tabulka 29 a 30 shrnuje kalibrační a validační výsledky vytvořených kalibrací a výsledky hodnot kalibračních a predikčních variačních koeficientů (CCV a PCV) pro jejich ověření spolehlivosti. Tab. 29 Kalibrační výsledky hodnot Olomouckých tvarůžků. Parametr Suši (%) NaCl (%) pH ° SH
Teplota skladování 5 °C
46
CCV y = bx ± a PLS (%) 0,952 0,285 0,769 y = 0,9063x + 3,4695 5
20 °C
51
0,954 0,235 0,630 y = 0,9103x + 3,3473
5
5 °C 20 °C 5 °C 20 °C 5 °C 20 °C
47 62 62 70 68 65
0,975 0,999 0,905 0,987 0,980 0,976
5 8 2 5 6 10
N
R
SEC
0,090 0,020 0,245 0,123 3,670 3,240
1,615 0,342 3,991 1,967 6,027 5,026
y = 0,9508x + 0,274 y = 0,9989x + 0,0066 y = 0,8183x + 1,1149 y = 0,9741x + 0,165 y = 0,9613x + 2,3556 y = 0,9532x + 3,0169
N – počet vzorků, y = bx + a = regresní přímka, SEC – směrodatná odchylka kalibrace, CCV – kalibrační variační koeficient, R – korelační koeficient, PLS – počet faktorů, ° SH – titrační kyselost, NaCl – kuchyňská sůl
123
VÝSLEDKY A DISKUSE Tab. 30 Validační výsledky Olomouckých tvarůžků. Parametr Suši (%) NaCl (%) pH ° SH
Teplota skladování 5 °C 20 °C 5 °C 20 °C 5 °C 20 °C 5 °C 20 °C
N
R
SEP
PCV
y = bx ± a
46 51 47 62 62 70 68 65
0,801 0,823 0,802 0,755 0,889 0,906 0,916 0,876
0,572 0,467 0,255 0,359 0,263 0,328 7,480 7,240
1,542 1,252 4,562 6,137 4,284 5,257 12,296 11,278
y = 0,539x + 17,119 y = 0,5321x + 17,453 y = 0,4823x + 2,902 y = 0,4819x + 3,0274 y = 0,7917x + 1,2772 y = 0,7962x + 1,2408 y = 0,8611x + 8,394 y = 0,7895x + 13,301
N – počet vzorků, y = bx + a = regresní přímka, SEP – směrodatná odchylka validace, PCV – predikční variační koeficient, R – korelační koeficient, ° SH – titrační kyselost, NaCl – kuchyňská sůl
Korelační koeficienty kalibrací se pohybovaly v rozmezí 0,905 – 0,999 se směrodatnými odchylkami od 0,020 % – 3,670 ° SH. Nejlepší R byl dosažen pro kalibraci NaCl při 20 °C (0,999 ± 0,020 %) a nejmenší pro pH při 5 °C (0,905 ± 0,245). Korelační koeficienty validací byly v intervalu 0,755 – 0,916 s odchylkami od 0,255 – 7,480. Nejvyšší hodnota náležela kalibraci pro ° SH při 5°C (0,916 ± 7,480) a nejnižší kalibraci pro NaCl při 20 °C (0,755 ± 0,359). Grafické vyjádření závislostí korelačních koeficientů kalibrací a validací je uvedeno Obr. 16 - 21 v příloze. Při srovnání výsledků kalibrací a validací, měly modely pro stanovení °SH (5 °C, 20 °C) nejsilnější závislost mezi referenčními a predikovanými hodnotami a jejich korelační koeficienty kalibrace a validace se od sebe lišily minimálně (5°C: 0,980 a 0,916; 20 °C: 0,976 a 0,876). Jejich směrodatné odchylky predikce však dosahovaly příliš vysokých hodnot (7,480 a 7,240), což společně s hodnotami kalibračních a predikčních variačních koeficientů definovalo tyto modely pouze jako s dobrou spolehlivostí vhodnější spíše pro orientační stanovení, protože hodnoty CCV a PCV mírně překročily limity 5 a 10 %, jak uvádí Tab. 29 a 30. Jako nejlépe vytvořené modely s velmi silnou závislostí a vysokou spolehlivostí, byly vybrány kalibrace pro stanovení pH (5 °C, 20 °C), protože opět hodnoty korelačních koeficientů kalibrace a validace byly velmi těsné a jejich CCV a PCV splnily stanovené limity. U modelu pro pH (5 °C), také došlo k největšímu překryvu regresních přímek (Obr. 38). Kalibrace pro NaCl (5 °C) a sušinu (5 °C,
124
VÝSLEDKY A DISKUSE 20 °C) Olomouckých tvarůžků dosáhly hodnot korelačních koeficientů splňující interval limitu pro dosti silnou závislost, s vysokou spolehlivostí správné predikce hodnot, jak uvádí tabulka 29 a 30.
Obr. 38 Grafické vyjádření závislosti kalibračních a validačních výsledků pro stanovení pH při 5 °C. Model pro stanovení NaCl při 20 °C měl nejvíce rozdílné hodnoty korelačních koeficientů (0,999 a 0,755), což je graficky vyjádřeno Obr. 39, ale jejich směrodatné odchylky dosahovaly nízkých hodnot (0,020 a 0,359 %) a tento model byl popsán vysokou spolehlivostí (CCV 0,342 %, PCV 6,137 %).
Obr. 39 Grafické vyjádření závislosti kalibračních a validačních výsledků pro stanovení NaCl při 20 °C. Při
statistickém
hodnocení
referenčních
a predikovaných
hodnot
pomocí
dvouvýběrového párového t-testu střední hodnotu (Tab. 31) bylo prokázáno, že neexistuje rozdíl mezi hodnotami xREF a xNIR hladině významnosti (α = 0,05).
125
VÝSLEDKY A DISKUSE Tab. 31 Statistické vyhodnocení jakostních parametrů Olomouckých tvarůžků. Parametr Suši (%) NaCl (%) pH ° SH
Teplota skladování 5 °C 20 °C 5 °C 20 °C 5 °C 20 °C 5 °C 20 °C
N
xNIR xREF
46 51 47 62 62 70 68 65
37,04 37,32 5,57 5,86 6,14 6,25 60,9 64,46
37,04 37,32 5,57 5,86 6,14 6,25 60,9 64,46
SD
t stat
t1 krit
t2 krit
0,137 0,109 0,059 0,068 0,073 0,091 2,263 1,858
0,000 0,000 0,032 0,000 0,021 -0,056 0,001 0,000
1,679 1,676 1,679 1,670 1,653 1,652 1,652 1,653
2,014 2,009 2,013 2,000 1,973 1,971 1,972 1,972
N – počet vzorků, xNIR – hodnoty predikované, xREF – hodnoty referenční, SD – směrodatná odchylka diference, tstat – t-test, t1(krit) – tabulková hodnota při α = 0,05, t2(krit) – tabulková hodnota při α = 0,01,
Analýze Olomouckých tvarůžků se také věnovali autoři DRAČKOVÁ et al. (2009a), kteří se zaměřili
stanovení polyaminů pomocí NIR reflektanční
spektrometrie s Fourierovou transformací (viz. kap. 3.3.2.1). Naše práce se nejvíce svým obsahem přibližuje práci LUŽOVÉ et al. (2007), kteří se zaměřili stanovení sušiny, NaCl, pH, titrační kyselosti (° SH) a tuku v čerstvých kozích sýrech. Pro měření byla také použita technika reflektance při 100 sc a 8 rozlišení. Pro tvorbu kalibrací použili metodu PLS a získali následující korelační koeficienty kalibrací a validací se směrodatnými odchylkami pro: sušinu 0,810 ± 1,23 % a 0,671 ± 1,60 %; NaCl 0,964 ± 0,070 % a 0,867 ± 0,135 %; pH 0,959 ± 0,023 a 0,659 ± 0,063 a pro ° SH 0,953 ± 0,849 a 0,901 ± 1,120. Při srovnání dosažených výsledků s výsledky naší práce jsme získali lepší parametry pro kalibrace sušiny a pH ale naopak horší pro NaCl a °SH. Kalibrace °SH byla autory hodnoce jako nejspolehlivější. Obdobnou prací se také zabývali DRAČKOVÁ et al. (2007) kdy pomocí NIRS stanovovali sušinu, tuk v sušině, tuk, NaCl, aktivitu vody a titrační kyselost u 100 sýrů s nízkodohřívanou sýřeninou. Pro měření byl použit režim reflektance se 100 sc a 8 rozlišení. Kalibrační modely byly vyvinuty pomocí metody PLS a ověřeny křížovou validací. Korelační koeficienty kalibrací se pohybovaly v rozmezí
od 0,936
pro tuk
v sušině
do 0,991
pro NaCl.
Korelační
koeficienty validací získali od 0,735 pro aktivitu vody do 0,950 pro sušinu. Získané výsledky kalibrací pro sušinu R= 0,965 ± 0,77 % a RV = 0,950 ± 0,92 % a NaCl R =
126
VÝSLEDKY A DISKUSE 0,991 ± 0,04 % a RV = 0,906 ± 0,12 % byly ve srovnání s našemi výsledky vyšší. Kalibrační model pro stanovení °SH byl obdobně jako v našem případě popsán nižším korelačním koeficientem validace a vyššími hodnotami směrodatných odchylek (SEC 2,33 a SEP 3,48). ČURDA et KUKAČKOVÁ (2004) použili NIR techniku pro stanovení sušiny, tuku, bílkovin a pH a reologických vlastností (penetrace) u tavených sýrů pomocí optické sondy. Kalibrační modely byly vytvořeny pomocí metody PLS a bylo dosaženo korelačních koeficientů pro sušinu; tuk; bílkoviny; pH a penetraci: 0,998; 0,995; 0,996; 0,945 a 0,925. Standardní chyba predikce byla pro sušinu, tuk, bílkoviny, pH a penetraci: 0,429; 0,997; 0,303; 0,062 a 1,330. V případě stanovení pH (R= 0,945 ± 0,033; RV = 0,945 ± 0,062) bylo dosaženo ve srovnání s naší prací opět lepších výsledků. V případě kalibrací pro sušinu byly naše korelační koeficienty nižší avšak s lepšími hodnotami SEC a SEP a s nižším počtem PLS faktorů o 7. Jak vyplývá z výsledků naší práce a prací ostatních autorů, je NIR spektroskopie vhodná pro stanovení složení, zejmé majoritních složek široké škály různých druhů sýrů. Metoda se jeví i vhodná sledování kyselosti sýrů jako jeden z ukazatelů kvality v průběhu jejich zrání. Výsledky kalibrací Olomouckých tvarůžků byly v roce 2011 publikovány ve vědeckém časopise Acta technologica agriculturae, 14 (3): 57 – 60, ISSN 13352555. 5.4.2 Kvalitativní analýzy Olomouckých tvarůžků Rozlišení různé fáze výroby (stáří) Olomouckých tvarůžků Cílem bylo zjistit, zda pomocí Diskriminační analýzy je NIR spektroskopie schop zachytit rozdíly tvarůžků v jednotlivých fázích výroby, tedy v jejich rozdílném stáří. Ke zjištění možného rozdílu mezi vzorky byly použity Olomoucké tvarůžky ve fázi formování, osušení a odvětrávání, před balením a ve fázi hotového výrobku skladovaného při 5 a 20 °C dobu 30 dnů, a to jak ve tvaru tyčinek a koleček, tak i vyrobených jaře a v létě. Spektra tvarůžků v různé fázi výroby jsou znázorněny obrázku 35. Pro tvorbu kalibrací metodou Diskriminační analýzy, byla použita průměrná spektra ze dvou měření.
127
VÝSLEDKY A DISKUSE Při porovnávání všech spekter tvarůžků došlo k vytvoření klastrů, což značí, že od sebe lze rozeznat různé fáze výroby Olomouckých tvarůžků. Na obr. 40 jsou znázorněny rozdíly mezi vytvořenými klastry vzorků před balením a konci doby trvanlivosti
tvarůžků
skladovaných
při 5 °C,
jejichž
průkazný
rozdíl
je potvrzen diskriminačním křížem.
Obr. 40 DA pro tvarůžky měřené před balením (□) a konci doby trvanlivosti (∆). Dále také došlo k vytvoření klastrů při porovnávání tvarůžků skladovaných při různé teplotě (5 °C a 20 °C) viz Obr. 41. Diskriminační kříž se nevytvořil pouze u tvarůžků ve fázi formování a osušení, což znamená, že tvarůžky lze od sebe rozeznat s menší spolehlivostí, než v ostatní případech (Obr. 42). Závěrem tedy můžeme říci, že FT NIR spektroskopie je vhodná pro rozlišení stáří Olomouckých tvarůžků.
Obr. 41 Diskriminační analýza spekter tvarůžků skladovaných při 5 °C (□) a 20 °C (∆).
128
VÝSLEDKY A DISKUSE
Obr. 42 Diskriminační analýza spekter tvarůžků skladovaných ve fázi tvarování (□) a osušení (∆). Naše práce se nejvíce podobala práci autorů REVILLA et al. (2008), kteří se zaměřili stanovení zralosti ovčího sýru Zamorano. Pro získání spekter, použili sýry ve stáří 0; 1; 2; 3; 9 a 12 měsíců. Pro získání výsledků využili lineární diskriminační analýzu (LDA), která byla provede základě rozdílů stáří sýrů v jednotlivých měsících a množství somatických buněk v každém měsíci (viz kap. 3.3.2.2). Výsledky disertační práce byly publikovány ve formě ústního sdělení mezinárodní vědecké konferenci: Stretnutie mladých vedeckých pracovníkov v potravinarstve v Bratislavě a ve sborníku: III. Vedecká konferencia: Stretnutie mladých vedeckých pracovníkov v potravinarstve. 1. vyd. Bratislava: STU Bratislava, 2010, s. 40. ISBN 978-80-227-3411-0. Rozlišení rozdílného tvaru Olomouckých tvarůžků Cílem analýzy bylo určit, zda jsme FT NIR spektroskopií schopni stanovit rozdíl mezi Olomouckými tvarůžky rozdílného tvarování (kolečka a tyčinky), což by mohlo poukazovat rozdílné prozrávání sýrů uvnitř hmoty, s čímž jsou spojeny i jejich senzorické vlastnosti. Pro analýzy byly použity Olomoucké tvarůžky v různé fázi, ve tvaru tyčinek a koleček odebraných jaře a v létě. Vzorky byly homogenizovány a proměřeny spektrofotometru FT NIR Antaris. Znázornění průběhu spekter Olomouckých tvarůžků ve tvaru tyčinek a koleček je uvedeno obr. 36. Pro tvorbu kalibrací byla použita rozlišovací metoda Diskriminační analýza. Jak lze vidět obr. 43 vzorky
129
VÝSLEDKY A DISKUSE Olomouckých tvarůžku jsou seskupeny v obou případech do klastrů, které byly předem definovány, a jejich odlišnost je potvrze tvorbou Diskriminačního kříže.
Obr. 43 Diskriminační analýza spekter tvarůžků ve tvaru koleček (∆) a tyčinek (□). NIR spektrofotometr tedy dokázal rozlišit rozdíl mezi Olomouckými tvarůžky
různého
tvarování.
Jejich
spektrální
odlišnost
je pravděpodobně
spoje s rozdílnou zralostí vzorků uvnitř hmoty. Tyto domněnky by bylo vhodné potvrdit i chemickými rozbory např. stanovením jejich aminokyselinového složení. Vliv sezóny výrobu Olomouckých tvarůžků Cílem analýzy bylo pomocí FT NIR spektroskopie zjistit, zda existuje rozdíl mezi Olomouckými tvarůžky vyrobenými z jarního a letního mléka. Jak uvádí řada autorů (PEREA, et al. (2000); GONZÁLES – MARTÍN et al. (2009)) sezonní změny v mléce jsou spojeny zejmé se změnami v jeho složení, což je spojeno i s výtěžností a kvalitou vyrobeného sýru. Jarní sýry jsou většinou více s ovocnými a sladkými podtexty, zatímco letní sýry mají lepší profil MK (ABILLEIRA et al., 2010). Sezónnost má největší vliv skladbu mastných kyselin, kdy v letním mléce je více nenasycených MK s delším řetězcem, více CLA (konjugovaná kys. linolová) a méně nasycených MK s kratším řetězcem než v ostatních obdobích (TALPUR et al., 2008). U letních sýrů byla také identifiková hlubší proteolýza než u sýrů v ostatních měsících (MUNOZ, et al. 2003). Pro analýzy byly použity Olomoucké tvarůžky v různé fázi výroby, ve tvaru tyčinek a koleček odebraných v jarním a letním období. Ukázky spekter jarních
130
VÝSLEDKY A DISKUSE a letních Olomouckých tvarůžků jsou uvedeny Obr. 36. Pro tvorbu kalibrace byla použita opět rozlišovací metoda Diskriminační analýza.
Obr. 44 Diskriminační analýza spekter tvarůžků vyrobených z jarního (∆) a letního (□) mléka. Obr. 44 znázorňuje
vytvoření klastrů, kdy se mezi klastry vytvořil
diskriminační kříž, čímž se nám potvrdilo, že jsme schopni velmi dobře s pomocí NIRS rozlišit Olomoucké tvarůžky vyrobené z jarního a letního mléka. Naše práce se nejvíce přibližuje práci autorů GONZÁLEZ – MARTÍN et al. (2011b), kteří se zaměřili využití NIRS techniky k k rozlišení sezónnosti mléka (léto, zima) (viz Kap. 3.3.2.2). Výsledky byly publikovány ve sborníku příspěvků XXXVII. Semináře o jakosti potravin a potravinových surovin - Ingrovy dny. s. 175 – 177. ISBN 97880-7375-495-2.
5.5 Sušená sladká syrovátka Naše práce byla zaměře stanovení
obsahu
sušiny, vody, bílkovin
a fyzikálních parametrů jako je pH a °SH v sušené sladké syrovátce. Vzorky byly získány ve spolupráci s firmou Eligo a.s. zabývající se výrobou a prodejem sušených mléčných výrobků. Na Ústavu technologie potravin a Státním veterinárním ústavu v Olomouci bylo podrobeno chemickým analýzám 48 vzorků kyselé syrovátky (viz. kap. 4.2.1.5) a stanoveny jejich referenční hodnoty, které jsou zaznamenány v Tab. 9 kap. 4.1.5.
131
VÝSLEDKY A DISKUSE Vzorky byly proměřeny v režimu interaktance ve skleněné kádince o průměru 4 cm s použitím vláknové optické sondy (Fiber Optic) se 100 sc a rozlišením 8 cm-1. Ukázka průběhu spektra sušené syrovátky je znázorněno Obr. 45.
Obr. 45 Ukázka spektra sušené syrovátky s různým obsahem bílkovin. Rozptýlení referenčních hodnot pro sušinu, vodu a bílkovin vyjádřené jako směrodatná odchylka průměru (sx) bylo dostatečné (viz Tab. 9 kap. 4.1.5), avšak při stanovení pH a °SH byl zaznamenán menší rozptyl (sx = 0,11 pro pH a 0,55 pro °SH), což způsobilo problémy při tvorbě kalibrací. Spektra pro kalibraci vody, bílkovin a pH byla podrobe první derivaci a spektra pro kalibraci °SH druhé derivaci. Bez úprav zůstala jen spektra pro kalibraci sušiny. Aby bylo dosaženo co nejlepších kalibračních výsledků, byly vybrány pro všechny metody specifické oblasti spekter, které jsou uvedeny v Tab. 32 a pomocí identifikace odlehlých standardů byly vyloučeny z kalibrace pro sušinu 2 vzorky, pro vodu 11, pro bílkoviny 6 a u stanovení pH 3 a °SH 6 vzorků.
132
VÝSLEDKY A DISKUSE Tab. 32 Úprava spekter a regionů pro vybrané oblasti vlnočtů pro kalibraci sušené sladké syrovátky. Parametr Suši (%) Voda (%) Bílkoviny (%) pH ° SH
úprava spektra spectrum první derivace první derivace první derivace druhá derivace
Vybraný region pro kalibraci úprava vlnočet (cm-1) Spectrum Range 5 958,96 – 5 319,18 Spectrum Range 8 579,98 – 4 018,92 Spectrum Range 6 714,92 – 5 669,69 Spectrum Range 5 958,96 – 4 480,18 1St derivative in range 4 967,73 – 4 173,20
°SH – titrační kyselost,
Kalibrační modely pro stanovení jednotlivých složek a fyzikálních vlastností byly vytvořeny algoritmem PLS. Optimální počet PLS faktorů navržených pomocí křížové validace je uveden v Tab. 34. Nejnižšího počtu PLS (5) měla kalibrace pro ° SH, naopak nejvyšší počet PLS (10), zaznamenaly kalibrace pro stanovení obsahu vody a pH. Podle tvaru funkce PRESS a počtu PLS faktorů, které nám stanovují měnící se chybu sumy čtverců, můžeme předpokládat úspěšnost vytvořené kalibrace. V našem případě měly všechny kalibrace klesající charakter funkce PRESS. Na Obr. 46 je znázorně funkce PRESS pro bílkoviny s nejvíce klesajícím trendem.
Obr. 46 Průběh funkce PRESS pro stanovení bílkovin v sušené sladké syrovátce s optimálním počtem PLS faktorů 8. Tabulky 33 a 34 shrnují kalibrační a validační výsledky jednotlivých parametrů sušené sladké syrovátky.
133
VÝSLEDKY A DISKUSE Tab. 33 Kalibrační výsledky stanovovaných parametrů sušené sladké syrovátky. Parametr
N
R
SEC
CCV (%)
y = bx ± a
PLS
Suši (%) Voda (%) Bílkoviny (%) pH ° SH
46 37 42 45 42
0,972 0,999 0,999 0,991 0,970
0,204 0,036 0,072 0,016 0,134
0,212 1,053 0,634 0,249 2,512
y = 0,9466x + 5,155 y = 0,9981x + 0,0064 y = 0,999x + 0,0113 y = 0,9834x + 0,107 y = 0,9414x + 0,3126
9 10 8 10 5
N – počet vzorků, y = bx + a = regresní přímka, SEC – směrodatná odchylka kalibrace, CCV – kalibrační variační koeficient, R – korelační koeficient, PLS – počet faktorů, °SH – titrační kyselost.
Tab. 34 Validační výsledky stanovovaných parametrů sušené sladké syrovátky. Parametr
N
R
SEP
PCV (%)
y = bx ± a
Suši (%) Voda (%) Bílkoviny (%) pH ° SH
46 37 42 45 42
0,921 0,894 0,972 0,625 0,658
0,341 0,371 0,494 0,091 0,425
0,354 10,800 4,362 1,418 7,935
y = 0,8606x + 13,469 y = 0,7836x + 0,7672 y = 0,9177x + 0,9106 y = 0,5005x + 3,2067 y = 0,5306x + 2,5256
N – počet vzorků, y = bx + a = regresní přímka, SEP – směrodatná odchylka validace, PCV – predikční variační koeficient, R – korelační koeficient, ° SH – titrační kyselost.
Vysoké hodnoty korelačních koeficientů kalibrace i validace bylo dosaženo pro sušinu, obsah vody a bílkovin (0,972 – 0,999 a 0,894 – 0,972). Tyto výsledky signalizují vysokou míru těsnosti referenčních a predikovaných hodnot pomocí kalibračních rovnic, což je znázorněno i Obr. 47 – 49. SEC a SEP zmiňovaných parametrů potvrzuje úspěšnost vytvořených modlů (Tab. 33 a 34). Se středně silnou závislostí hodnot (xNIR a xREF) byly vytvořeny kalibrace pro stanovení pH a ° SH. Jejich korelační koeficienty kalibrace (0,991 a 0,970) a validace (0,625 a 0,658) byly od sebe velmi vzdáleny a regresní přímky se nejvíce rozcházely (Obr. 50 a 51), i když hodnoty SEC a SEP dosahovaly relativně nízkých hodnot v případě pH 0,026 a 0,091 a ° SH 0,134 a 0,425.
134
VÝSLEDKY A DISKUSE
Obr. 47 Kalibrační a validační modely pro stanovení sušiny sušené sladké syrovátky.
Obr. 48 Kalibrační a validační modely pro stanovení obsahu vody sušené sladké syrovátky.
Obr. 49 Kalibrační a validační modely pro stanovení obsahu bílkovin sušené sladké syrovátky.
135
VÝSLEDKY A DISKUSE
Obr. 50 Kalibrační a validační modely pro stanovení pH sušené sladké syrovátky.
Obr. 51 Kalibrační a validační modely pro stanovení ° SH sušené sladké syrovátky. Všechny vytvořené kalibrace lze dle hodnot kalibračních a predikčních variačních koeficientů (CCV a PCV) označit za vysoce spolehlivé, protože jejich hodnoty nepřekročily limity 5 a 10 %. Jak uvádí Tab. 34 a 35 hodnoty CCV se pohybovaly v rozmezí od 0,212 % pro sušinu do 2,512 % pro SH a PCV od 0,354 % pro sušinu do 10,800 % pro stanovení obsahu vody. Porovnáním
výsledků
predikovaných
a referenčních
hodnot
pomocí
dvouvýběrového párového t-testu střední hodnotu (Tab. 35) nebyl nalezen průkazný rozdíl mezi hodnotami (NIR a referenčními) hladině významnosti (P < 0,05).
136
VÝSLEDKY A DISKUSE Tab. 35 Statistické vyhodnocení kalibrovaných parametrů sušené sladké syrovátky. Parametr
N
xNIR
xREF
SD
t stat
t1 krit
t2 krit
Suši (%) Voda (%) Bílkoviny (%) pH ° SH
46 37 42 45 42
96,44 3,42 11,35 11,35 11,35
96,44 3,42 11,35 11,35 11,35
0,129 0,136 0,324 0,017 0,085
-0,021 -0,001 0,000 -0,184 -0,011
1,679 1,688 1,683 1,680 1,683
2,014 2,028 2,020 2,015 2,020
N – počet vzorků, xNIR – hodnoty predikované, xREF – hodnoty referenční, SD – směrodatná odchylka diference, tstat – t-test, t1(krit) – tabulková hodnota při α = 0,05, t2(krit) – tabulková hodnota při α = 0,01, ° SH – titrační kyselost.
Nejlépe vytvořený kalibrační model s vysokou spolehlivostí byl získán pro stanovení bílkovin, s nejvyššími korelačními koeficienty (0,999 a 0,972) a nízkými SEC a SEP (0,072 a 0,494). Jeho spolehlivost byla potvrze také hodnotami CCV 0,643 % a PCV 4,362 %. Kalibrační modely pro stanovení pH a ° SH měly korelační koeficienty kalibrace a validace velmi rozdílné, přičemž hodnoty korelačních koeficientů validace byly pouze 0,625 pro pH a 0,658 pro ° SH. Podle hodnot CCV a PCV byly tyto kalibrace označeny za vysoce spolehlivé pro orientační stanovení kyselosti. Pro zlepšení predikční schopnosti modelů je nutno tyto kalibrace obohatit o více standardů, které zesílí závislost mezi referenčními a predikovanými hodnotami anebo rozšíří kalibrační interval hodnot. První analýzy sušené syrovátky pomocí NIR spektroskopie provedli BAER et al. v roce 1983. Při tvorbě kalibračních modelů pro stanovení základních složek použili syrovátku kyselou, sladkou, demineralizovanou a delaktózovanou, a zjistili, že je vhodnější používat pro tvorbu kalibrací vzorky podobného složení a vytvořit tak kalibrace každý typ syrovátky zvlášť. Nejvíce se naše práce přibližuje práci DAŇKOVÉ (2011), která využila FT NIR spektrofotometr stanovení měrné hmotnosti, obsahu vody, hodnot pH a ° SH u sušené syrovátky. Pro analýzu použila 40 vzorků, které byly proměřeny spektrofotometru FT NIR Antaris se 100 sc a spektrálním rozlišením 8 cm-1. Metodou PLS vytvořila kalibrační modely, které byly popsány korelačními koeficienty kalibrace se směrodatnými odchylkami pro: měrnou hmotnost 0,814 ± 0,001; obsah vody 0,995 ± 0,075 %; pH 0,878 ± 0,059 a ° SH 0,876 ± 0,189
137
VÝSLEDKY A DISKUSE a korelačními
koeficienty
validace
se směrodatnými
odchylkami
predikce
pro měrnou hmotnost, obsah vody, pH a ° SH: 0,749 ± 0,011; 0,764 ± 0,518 %; 0,854 ± 0,064 a ° SH 0,819 ± 0,219. Ve srovnání s naší prací získala DAŇKOVÁ horší výsledky pouze u kalibrace pro stanovení obsahu vody. Modely pro stanovení pH a SH byly popsány vyššími hodnotami korelačních koeficientů validace, cehož Daňková dosáhla pomocí nižšího počtu PLS faktorů pro pH (1) a SH (2). Pro stanovení obsahu popelovin, tuku, obsahu vody, laktosy, bílkovin a soli v sušené syrovátce použil tým vědců ze společnosti LECO CORPORATION roku 2005 spektrofotometr Leco NIR Quick Check 20S. Při analýzách dosáhli poměrně vysokých koeficientů determinace. Přesnost vytvořených metod posuzovali základě standardní chyby stanovení, která se vypočítala z rozdílu hodnot predikovaných a referenčních. Dosáhli následujících hodnot R2 a standardních chyb stanovení pro: popeloviny 0,9 a 0,34 %; tuk 0,76 a 0,16 %; obsah vody 0,82 a 0,31 %; laktosu 0,84 a 2,47 %; bílkoviny 0,91 a 0,40 % a sůl 0,79 a 0,24 %. Z dosažených výsledků vyplývá, že NIR spektroskopie je vhodnou metodou pro rychlé stanovení základních složek sušené syrovátky. FT NIR metody pro stanovení složení sušené syrovátky se velice přibližují metodám pro sušené mléko. Analýzami sušeného mléka pomocí NIRS se zabývala řada autorů (viz. Kap. 3.3.2.1). RŮŽIČKOVÁ et ŠUSTOVÁ (2007) zaměřily své analýzy stanovení obsahu vody a titrační kyselosti pomocí FT NIR v sušeném mléce. Spektra 71 vzorků sušeného odstředěného mléka a 40 vzorků sušeného mléka smíchaného v různém poměru se sušenou syrovátkou pro rozšíření referenčních hodnot. V naší práci bylo dosaženo lepšího kalibračního modelu pro stanovení obsahu zbytkové vody v %, avšak kalibrace pro ° SH byla kvalitnější a robustnější v práci Růžičkové a Šustové. Tím se potvrdily naše hypotézy, jak zlepšit kalibrační modely v naší práci, že je nutno, je rozšířit o větší škálu vzorků. Z výsledků předkládané práce a práce ostatních autorů vyplývá, že je NIR technika vhodná k rutinním analýzám složení sušených mléčných výrobků, jakožto sušené syrovátky, ale i sušeného mléka a dalších.
138
VÝSLEDKY A DISKUSE
5.6 Syřidla a sýřeniny Poslední kapitola výsledků doktorské práce je zaměře hodnocení jakostných parametrů syřidel a vyrobených sýřenin. Cílem práce bylo stanovit, zda je možno použít pro tvorbu kalibračních modelů syřidla ředěná anebo jen neředěná a určit, která metodika měření poskytuje lepší výsledky. Kvantitativnými analýzami byla ověřová vhodnost FT NIR spektroskopie pro stanovení pH, času koagulace, síly a dávky syřidel skladovaných v lednici a za nestandardních podmínek (pokojová teplota). Kvalitativní analýzy byly zaměřeny schopnost NIR spektrofotometru rozlišit jednotlivé druhy syřidel, a také určit zda se jedná o syřidlo pepsinové, chymosinové, nebo přírodního či mikrobiálního původu. Dále jsme se pokusily rozlišit stáří a rozdílné skladování syřidel. Kvantitativní analýzy sýřenin pomocí NIRS byly zaměřeny stanovení jakostních parametrů sýřenin, a to sušiny a teoretické výtěžnosti. Kvalitativními metodami jsme se snažili rozlišit sýřeniny vyrobené za použití rozdílných syřidel. 5.6.1 Syřidla K referenčním analýzám a vytvoření kalibračních modelů pomocí spektrofotometru FT NIR Antaris bylo použito 6 různých tekutých syřidel běžně dostupných v tržní síti, jejichž charakteristiky jsou uvedeny v kap. 4.1.6.1. Vzorky syřidel byly skladovány v lednici při teplotě 5 ± 1 °C dobu 6 měsíců. Analýzy syřidel byly prováděny: ihned po prvním otevření, a dále 3 a 6 měsících skladování v lednici (4 – 6 ºC). Pro zasyřování bylo použito obnovené plnotučné, polotučné a odtučněné sušené mléko stejné šarže. Část syřidel byla otevření odlita do neprůhledných čistých
lahviček
a skladovaná
při pokojové
teplotě.
Tyto
syřidla
byla
analyzová každý měsíc dobu půl roku. Pro zasyřování bylo použito obnovené plnotučné sušené mléko. Referenční metody jsou více popsány v kap. 4.2.1.6 spolu s referenčními hodnotami pro pH syřidel (Tab. 10 kap. 4.1.6.1) a pro syřidla skladovaná v lednici (Tab. 11 kap. 4.1.6.1) a při pokojové teplotě (Tab. 12 kap. 4.1.6.1). Vzorky byly proměřeny třemi různými metodami: v režimu reflektance integrační sféře s pomocí zrcátka h = 0,2 a 0,3 mm; v transflektanční kyvetě
139
VÝSLEDKY A DISKUSE s optickou drahou 1mm a pomocí optické sondy s nastavením ve všech případech 80 scanů, při spektrálním rozlišení 4 cm-1. Jakostní parametry zakoupených syřidel byly velmi rozdílné. Pro tvorbu kalibračních modelů byla použita syřidla, u nich se čas koagulace při sýření sušeného mléka pohyboval v intervalu od 50 do 110 s, ale i syřidla s časem koagulace několik sekund. Aby se prodloužila doba zasyřování mléka optimální čas koagulace, je vhodné syřidlo naředit destilovanou vodou optimální koncentraci. Po proměření naředěných syřidel destilovanou vodou bylo zjištěno, že dochází změně spekter (viz. obr. 52) a použitím Diskriminační analýzy byl prokázazán rozdíl mezi spektry ředěných a neředěných syřidel (Obr. 53).
Obr. 52 NIR spektrum syřidla ředěného 5% a neředěného. Měřeno v režimu transmitance v kyvetě.
Obr. 53 Diskriminační analýza syřidla ředěného 5% (∆) a neředěného (□).
140
VÝSLEDKY A DISKUSE Pro tvorbu kalibračních modelů proto byla použita syřidla koncentrovaná, tedy původní od výrobce. Dalším úkolem bylo zjistit, který způsob měření poskytuje přesnější výsledky pro tvorbu kalibračních modelů. Na obr. 54 lze vidět rozdíly mezi spektry získanými měřením rozdílnými technikami. Jak je možno vidět, průběh spektra syřidel měřený optickou sondou je odlišný od ostatních průběhů spekter.
Obr. 54 NIR spektra syřidla získané různými technikami měření: světle modré spektrum – optická sonda (interactance), tmavomodré a fialové spektrum-integrační sféra (reflektance), červené spektrum - kyveta (transmitance); Také diskriminační analýza poukázala rozdíly mezi spektry měřenými rozdílnými technikami (Obr. 55).
Obr. 55 Diskriminační analýza různých technik měření syřidel (□) optická sonda, (o) kyveta a zrcátko s výškou 0,2 a 0,3 mm (∆). Ke zjištění, která z metod je vhodnější pro tvorbu kalibračních modelů, bylo použito všech tří technik měření, k rozlišení syřidel čerstvých a 3 měsíce
141
VÝSLEDKY A DISKUSE skladovaných v lednici. Pro vyhodnocení spekter a vytvoření kalibračních modelů (Obr. 56 a 57) pro jednotlivé techniky měření byly použity pouze některé části regionů (viz. tab. 36). Spektra nebyla dále nijak upravována. Tab. 36 Použité regiony pro vytvoření kalibračních modelů DA při určení stáří syřidel (čerstvá a 3 měsíce skladovaná v lednici) Technika měření
Použitý region (cm-1)
Optická sféra – zrcátko h = 2mm
9 004,01 - 5 401,21
Optická sféra – zrcátko h = 3mm
7 514,57 - 4 500,03
Kyveta
8 838,53 – 5 306,08
Optická sonda
9 348,32 – 7 851,51
Obr. 56 Diskriminační analýza syřidel měřených otevření a třech měsících v lednici v režimu reflektance optické sféře se zrcátkem s výškou A) 2 mm a B) 3 mm.
Obr. 57 Diskriminační analýza syřidel měřených otevření a třech měsících v lednici C) v režimu transmitance s využitím transflektanční kyvety s optickou drahou 1mm, D) v režimu interactance pomocí optické sondy. Na obrázcích 56 a 57 lze vidět, že FT NIR spektrofotometr dokázal všemi technikami měření s vysokou spolehlivostí rozeznat syřidla měře otevření a 3
142
VÝSLEDKY A DISKUSE měsících skladování v lednici. Avšak jako nejvhodnější techniku pro tvorbu kalibračních modelů bylo zvoleno měření syřidel v režimu transmitance v kyvetě, protože vzdálenost klastrů byla od sebe veliká a vzdálenost spekter v klastrech byla nepatrná, a proto se nám jevila tato technika jako nejpřesnější. Výsledky metodiky měření syřidel, byly publikovány formou ústního sdělení semináři VII. Molekulová spektroskopie 2011 v Seči a dále Mezinárodní konferenci postgraduálního doktorského studia MendelNet 2011 formou ústního sdělení a dále ve sborníku MendelNet 2011 - Proceedings of International Ph.D. Students Conference. s. 586 – 592, ISBN 978-80-7375-563-8. 5.6.1.1 Kvantitativní analýzy syřidel Pro tvorbu kalibrace pro stanovení pH, byly spektra syřidel skladovaných v lednici a při pokojové teplotě sloučeny do jednoho souboru (n = 29) a použity k vytvoření modelu pomocí metody PLS. Díky sloučení bylo dosaženo rozšíření kalibračního rozpětí (3,98 – 6,00) pro stanovovaný jakostní parametr. Spektra pro kalibraci nebyla upravena, avšak byla vybrá nejvhodnější oblast vlnočtů 5 340,80 – 4 934,08 cm-1, která poskytla nejlepší korelační koeficienty kalibrace a validace. Použitím metod pro odstranění odlehlých standardů (Spectrum Outlier, Leverage a PC Score) nedošlo k označení žádného chybného standardu. Pomocí funkce PRESS, která měla klesající charakter (Obr. 58) byl vybrán optimální počet PLS faktorů 10.
Obr. 58 Průběh funkce PRESS pro stanovení pH syřidel s optimálním počtem PLS faktorů 10. V tabulce 37 jsou shrnuty kalibrační a validační výsledky vytvořené metody pro stanovení pH syřidel.
143
VÝSLEDKY A DISKUSE Tab. 37 Kalibrační a validační výsledky pro stanovení pH syřidel. pH
N
kalibrace validace
29 29
CCV PCV PLS y = bx ± a (%) (%) – – 0,999 0,016 0,305 y = 0,9984x + 0,0095 10 0,211 3,968 y = 0,7917x + 1,2772 0,945 – – – R
SEC
SEP
N – počet vzorků, y = bx + a = regresní přímka, SEC – směrodatná odchylka kalibrace, SEP – směrodatná odchylka validace, CCV – kalibrační variační koeficient, PCV – predikční variační koeficient, R – korelační koeficient, PLS – počet faktorů
Korelační koeficienty kalibrace se od sebe liší jen minimálně (0,999 a 0,945) a směrodatné odchylky dosahují nízkých hodnot v obou případech, z čehož vyplývá, že je metoda velmi přesná a mezi kalibračními a predikčními hodnotami existuje velmi silná závislost, což potvrzuje i grafické vyjádření, kdy regresní přímky kalibrace a validace leží téměř sobě (Obr. 59).
Obr. 59 Kalibrační a validační modely pro pH syřidla. Vysokou spolehlivost kalibračního modelu potvrdily hodnoty kalibračního a predikčního koeficientu CCV 0,305 % a PCV 3,968 %, které splnily požadované limity 5 a 10 %. Pomocí Studentova t-testu
střední hodnotu byla srovnává rozdílnost
referenčních a predikovaných hodnot NIR spektrofotometrem. Z tabulky 38 vyplývá, že mezi hodnotami není průkazný rozdíl hladině významnosti α = 0,05.
144
VÝSLEDKY A DISKUSE Tab. 38 Statistické vyhodnocení jednotlivých parametrů syřidel. Parametr
N
xNIR
xREF
SD
t stat
t1 krit
t2 krit
pH
29
5,32
5,32
0,12
-0,341
1,703
2,052
N – počet vzorků, xNIR – hodnoty predikované, xREF – hodnoty referenční, SD – směrodatná odchylka diference, tstat – t-test, t1(krit) – tabulková hodnota při α = 0,05, t2(krit) – tabulková hodnota při α = 0,01.
Závěrem tedy lze říci, že se podařilo vytvořit kvalitní kalibrační model pro stanovení pH syřidel, jehož predikční schopnost je vysoká a spolehlivá a proto můžeme tuto metodu použít k rychlému stanovení pH syřidel. Syřidla skladovaná v lednici Pro tvorbu kalibračních modelů pomocí metody PLS bylo použito celkem 54 vzorků syřidel. Spektra pro kalibraci času koagulace byla podrobe druhé derivaci, pro ostatní kalibrace byla použita spektra bez úprav. Pro každý stanovovaný parament syřidla byl vybrán, a případě upraven spektrální region tak, aby bylo dosaženo co nejvyšších hodnot korelačních koeficientů kalibrace a validace (Tab. 39). Tab. 39 Úprava spekter a regionů pro vybrané oblasti vlnočtů pro kalibraci syřidel. Parametr Čas koagulace (s)
N 50
úprava spektra druhá derivace
Síla (1: x)
53
bez úpravy
Dávka (ml)
50
bez úpravy
Vybraný region pro kalibraci úprava vlnočet (cm-1) spectrum range
5 306,00 – 4 893,83
1st Derivative in range spectrum range 1st Derivative in range 1st Derivative in range
5 087,30 – 4 809,28 6 990,91 – 5 294,41 5 087,30 – 4 674,92 9 999,10 – 5 294,40
N – počet vzorků
Použitím metod pro odstranění odlehlých standardů (Spectrum Outlier, Leverage a PC Score) byly odstraněny v kalibraci pro čas koagulace a dávku syřidla 4 vzorky a v kalibraci pro sílu syřidla pouze jeden odlehlý standard. Funkce PRESS nám ukazuje, jak se mění chyba sumy čtverců (PLS) vytvořených kalibrací. Kalibrační výsledky stanovovaných parametrů syřidel a hodnoty PLS faktorů pro kalibrační modely jsou uvedeny v tab. 40. Nejnižší počet PLS faktorů (7), byl nalezen pro kalibraci síly syřidla, ostatní modely kalibrací dosahovali 10 PLS. Nejvíce klesající trend měl PRESS pro stanovení síly syřidla (Obr. 60)
145
VÝSLEDKY A DISKUSE
Obr. 60 Průběh funkce PRESS pro kalibraci síly syřidla s optimálním počtem PLS 10. Tab. 40 Kalibrační výsledky pro jednotlivé parametry syřidel. Parametr
N
R
SEC
CCV (%)
y = bx ± a
PLS
Čas koagulace (s)
50
0,986
4,110
10,120
y = 0,9744x + 0,9823
10
Síla (1: S)
53
0,984 1 220,000
13,349
y = 0,9679x + 293,16
7
Dávka (ml)
50
0,981
11,432
y = 0,9604x + 0,0672
10
0,193
N – počet vzorků, y = bx + a = regresní přímka, SEC – směrodatná odchylka kalibrace, CCV – kalibrační variační koeficient, R – korelační koeficient, PLS – počet faktorů
Tab. 41 Validační výsledky pro jednotlivé parametry syřidel. Parametr Čas koagulace (s) Síla (1 : S)
N
R
SEP
PCV (%)
y = bx ± a
50
0,892
11,300
27,863
y = 0,7669x + 7,651
53
0,966
1 700,000
18,600
y = 0,9397x + 531,12
Dávka (ml)
50
0,943
0,323
19,128
y = 0,9198x + 0,1403
N – počet vzorků, y = bx + a = regresní přímka, SEP – směrodatná odchylka validace, PCV – predikční variační koeficient, R - korelační koeficient,
Z tabulky 40 vyplývá, že korelační koeficienty kalibrace odpovídají velmi silné kalibrační závislosti, protože se pohybují od 0,981 pro dávku syřidla do 0,986 pro čas koagulace mléka syřidlem se směrodatnými odchylkami pro dávku syřidla 0,193 ml a čas koagulace 4,11 s. Směrodatná odchylka kalibračního modelu pro sílu syřidla dosahovala hodnot 1 220, což nás navádí k tomu, že tento kalibrační model
146
VÝSLEDKY A DISKUSE nemá
dobrou
vypovídající
schopnost.
Spolehlivost
všech
modelů
byla
ověře křížovou validací pro stejnou skupinu vzorků (Tab. 41). Bylo dosaženo korelačních koeficientů validace a jejich směrodatných odchylek od 0,892 ± 11,3 s pro čas koagulace do 0,966 ± 1700 pro sílu syřidla. Protože bylo použito pro tvorbu kalibrací pro stanovení času koagulace a síly syřidla veliké koncentrační rozpětí referenčních hodnot (čas koagulace 9 – 116 s; síla syřidla 1: 2 124 – 26 667) a hodnoty nebyly v intervalu rovnoměrně rozptýleny, došlo k tvorbě slepých míst v kalibračním modelu, díky nimž bylo dosaženo vysokých směrodatných odchylek kalibračních a validačních hodnot. Pro zlepšení vypovídající schopnosti kalibrací, je nutné je doplnit o další standardy, a tím by se dle ŠUSTOVÉ et KUCHTÍKA (2007) snížil jak počet PLS faktorů, tak by se zvýšila i předpovídající schopnost metody. Kalibrační a predikční variační koeficienty naše domněnky potvrdily, protože poukazují ve všech případech vysokou variabilitu hodnot stanovovaných parametrů. Podle dosažených hodnot CCV a PCV nelze vytvořené kalibrace označit jako spolehlivé, protože překračují ve všech případech obě hranice pro spolehlivost (CCV < 5 %; PCV <10 %), jak je uvedeno v Tab. 40 a 41. Nejméně spolehlivý model byl vytvořen pro stanovení času koagulace mléka (CCV 10,120 %; PCV 27,863 %). S největší pravděpodobností byla příči nespolehlivosti vytvořených kalibrací buď široké spektrum koncentračního rozpětí referenčních hodnot, anebo použitá referenční metoda dle Soxhleta pro stanovení času koagulace mléka a tedy i síly a dávky syřidla. Jak uvádí řada autorů, je nutno zdůraznit, že stanovení síly syřidla dle Soxhleta je pouze orientační metoda, protože výsledná síla je závislá pH a kvalitě sýřeného mléka a není vztaže k žádnému referenčnímu standardu (TEPLÝ et al., 1976; JACOB et al., 2011, TABAYEHNEJAD et al., 2012). Studentovým
t-testem
byl
opět
testován
rozdíl
mezi
referenčními
a predikovanými hodnotami z kalibračních rovnic. Nebyl nalezen statisticky průkazný rozdíl (P < 0,05) mezi referenčními a predikovanými hodnotami (Tab. 42) Tab. 42 Statistické vyhodnocení jednotlivých parametrů syřidel.
147
VÝSLEDKY A DISKUSE
Parametr
n
xNIR
xREF
SD
t stat
t1 krit
t2 krit
Čas koagulace (s)
56
40,61
40,56
3,36
0,099
1,674
2,006
Síla (S : x)
53
9139,60
9139,66
939,39
0,000
1,675
2,007
Dávka (ml)
50
1,69
1,69
0,14
-0,015
1,677
2,010
N – počet vzorků, xNIR – hodnoty predikované, xREF – hodnoty referenční, SD – směrodatná odchylka diference, tstat – t-test, t1(krit) – tabulková hodnota při α = 0,05, t2(krit) – tabulková hodnota při α = 0,01
Na Obr. 61 – 63 je znázorněno grafické vyjádření vztahu kalibračních a validačních výsledků vytvořených kalibrací. Velmi pevné vztahy jsou mezi hodnotami kalibrace a validace u stanovení síly a dávky syřidel, protože k sobě regresní přímky velmi těsně přiléhají.
Obr. 61 Grafické znázornění kalibračních a validačních výsledků pro stanovení času koagulace mléka syřidlem skladovaným v lednici.
Obr. 62 Grafické znázornění kalibračních a validačních výsledků pro stanovení síly syřidla skladovaného v lednici.
148
VÝSLEDKY A DISKUSE
Obr. 63 Grafické znázornění kalibračních a validačních výsledků pro stanovení dávky syřidla skladovaného v lednici. Protože bylo dosaženo ve všech případech vysokých korelačních koeficientů kalibrace a validace, existuje mezi hodnotami závislost, a tyto modely mohou být použity k orientačnímu stanovení času koagulace, síly a dávky syřidla. Syřidla skladovaná za nestandardních podmínek (pokojová teplota) Cílem bylo pokusit se vytvořit kalibrační modely jakostních parametrů syřidel, která byla analyzová pravidelně 1x měsíčně dobu půl roku. Bylo použito šest různých tekutých syřidel, jejichž charakteristika je uvede v kap. 5.1.6.1. Pro stanovení času koagulace bylo pro zasyřování použito pouze sušené plnotučné mléko s přídavkem 100 µl CaCL2. Pro tvorbu kalibrací bylo použito celkem 36 vzorků syřidel, jejichž rozpětí referenčních hodnot pro jednotlivé parametry je uvedeno v kap. 5.1.6.1 Tab. 12. Pro každý parament syřidla byl vybrán a upraven region spektra tak, aby bylo dosaženo co nejvyšších hodnot korelačních koeficientů kalibrace (tab. 43). V případě stanovení času koagulace mléka muselo být spektrum podrobeno druhé derivaci.
149
VÝSLEDKY A DISKUSE Tab. 43 Úprava spekter a regionů pro vybrané oblasti vlnočtů pro kalibraci syřidel při pokojové teplotě. Parametr
N
Čas koagulace (s)
31
Síla (1:X)
34
Dávka (ml)
28
úprava spektra druhá derivace
Vybraný region pro kalibraci úprava vlnočet (cm-1) 1st Derivative in range 4 833,79 – 5 304,02
2st Derivative in range spectrum range 2st Derivative in range bez úpravy spectrum range bez úpravy
5 197,22 – 4 966,05 7 056,45 – 4 005,98 4 949,04 – 5 774,76 7 354, 52 – 6 266,84
N – počet vzorků
Při tvorbě kalibrací, diagnostiky Spektrum Outlier, Leverage a PC scores určily odlehlá spektra, která byla z kalibrací odstraněna, skutečný počet použitých vzorků kalibracím je uveden v Tab. 43. Tabulka 44 a 45 shrnuje získané kalibrační a validační výsledky, které popisují naše vytvořené kalibrace pro jakostní parametry syřidel. Tab. 44 Kalibrační výsledky pro jednotlivé parametry syřidel při pokojové teplotě. Parametr
N
R
SEC
CCV (%)
y = bx ± a
PLS
Čas koagulace (s)
31
0,986
6,540
11,219
y = 0,9741x + 1,4771
8
Síla (1 : x)
34
0,991
828,000
10,992
y = 0,9822x + 134,36
8
Dávka (ml)
28
0,962
0,470
18,875
y = 0,9256x + 0,1848
5
N – počet vzorků, y = bx + a = regresní přímka, SEC – směrodatná odchylka kalibrace, CCV – kalibrační variační koeficient, R – korelační koeficient, PLS – počet faktorů
Tab. 45 Validační výsledky pro jednotlivé parametry syřidel při pokojové teplotě. Parametr
N
R
SEP
PCV (%)
y = bx ± a
Čas koagulace (s)
31
0,659
29,900
51,290
y = 0,4754x + 32,162
Síla (1 : x)
34
0,699
4490,00 0
59,607
y = 0,5624x + 3068,8
Dávka (ml)
28
0,697
1,240
49,806
y = 0,9198x + 0,1403
N – počet vzorků, y = bx + a = regresní přímka, SEP – směrodatná odchylka validace, PCV – predikční variační koeficient, R – korelační koeficient,
150
VÝSLEDKY A DISKUSE Korelační koeficienty kalibrací mají optimální hodnoty (Tab. 44), které se pohybují v intervalu od 0,962 ± 0,47 ml pro dávku syřidla do 0,991 ± 828 pro sílu syřidla, avšak ověření kalibrace křížovou validací prokázalo, že nepřesnost metody je veliká, i když funkce PRESS měla výraznou klesající tendenci ve všech případech. Počet PLS faktorů se pohyboval v rozmezí od 5 – 8, přičemž nejméně jich měla kalibrace pro stanovení dávky syřidla. Na Obr. 64 je uveden průběh funkce PRESS pro dávku syřidla s nejvíce klesajícím trendem. Korelační koeficienty validací (Tab. 45) byly velmi nízké od 0,699 ± 4 490 pro sílu syřidla do 0,659 ± 29,9 pro čas koagulace mléka. Nelze tedy říci, že byla naleze závislost mezi hodnotami. Směrodatné odchylky kalibrací byly opět velmi vysoké jako u kalibrací syřidel skladovaných v lednici.
Obr. 64 Funkce PRESS dávky syřidla s nejvíce klesajícím trendem s optimálním počtem PLS faktorů 5. Hodnoty kalibračních
a predikčních
variačních
koeficientů
potvrdily
nefunkčnost a vysokou nespolehlivost vytvořených modelů, protože hodnoty PCV se pohybovaly u všech kalibrovaných parametrů v rozmezí od 49,81 % do 59,56 %. Tyto
modely nejsou
funkční,
i když
mírná
závislost
a předikovanými hodnotami byla naleze (Obr. 65 – 67).
151
mezi
referenčními
VÝSLEDKY A DISKUSE
Obr. 65 Grafické znázornění kalibračních a validačních výsledků pro stanovení času koagulace mléka syřidlem skladovaným při pokojové teplotě.
Obr. 66 Grafické znázornění kalibračních a validačních výsledků pro stanovení síly syřidla skladovaného při pokojové teplotě.
Obr. 67 Grafické znázornění kalibračních a validačních výsledků pro stanovení dávky syřidla skladovaného při pokojové teplotě.
152
VÝSLEDKY A DISKUSE V Tab.
46
jsou
zaznamenány
výsledky
statistického
vyhodnocení
predikovaných párovým testem T - test. I v tomto případě nám T- test určil, že rozdíl mezi naměřenými hodnotami v laboratoři a hodnotami získanými z NIRu je statisticky neprůkazný (P ˂ 0,05). Tab. 46 Statistické vyhodnocení parametrů syřidel při pokojové teplotě. Parametr Čas koagulace(s)
N
xNIR
xREF
SD
t stat
t1 krit
t2 krit
31
58,29
58,26
7,02
0,027
1,697
2,042
0,000
1,692
2,035
0,004
1,703
2,052
Síla (1: x)
34
Dávka (ml)
28
7532,65 7532,65 1063,66 2,49
2,49
0,33
N – počet vzorků, xNIR – hodnoty predikované, xREF – hodnoty referenční, SD – směrodatná odchylka diference, tstat – t-test, t1krit – tabulková hodnota při α = 0,05, t2krit – tabulková hodnota při α = 0,01
Stanovení času koagulace mléka, síly a dávky syřidla je velice složité z hlediska odborné a časové náročnosti. Proto naší snahou bylo zjistit, zda je metoda NIR spektroskopie vhodná pro stanovení jakostních parametrů syřidel. Na základě výsledků práce můžeme usuzovat, že lze vytvořit velice kvalitní kalibraci pro stanovení pH syřidla. V případě kalibrací pro čas koagulace, síly a dávky syřidla skladovaného v lednici se podařilo vytvořit pouze kalibrace, které jsou vhodné spíše pro použití k orientačnímu stanovení hodnot. Kalibrace vytvořené za použití syřidel skladovaných při pokojové teplotě byly celkově nefunkční, protože jejich korelační koeficienty kalibrace a validace se výrazně lišily a hodnoty predikčního variačního koeficientu překračovali 50 %. Kvalita kalibrací pro stanovení času koagulace, síly a dávky syřidla byla ovlivně jendak širokým rozpětím referenčních hodnot a také volbou referenční metody, která byla použita kalibraci NIR spektrofotometru. Na základě našich zkušeností bych pro dosažení kvalitnějších kalibrací doporučila zvolit zcela jinou metodiku měření referenčích hodnot. Jako vhodné se jeví metodiky dle ISO157/IDF 2007 pro bovinní syřidla a ISO 176/IDF 2002 pro mikrobiální syřidla, které pro stanovení celkové koagulační aktivity enzymů využívají pro zasyřování standardizovaný substrát (sušené odstředěné mléko s 0,05% CaCl2, pH 6,5, při teplotě 32 °C). Výsledná síla je vyjádře v IMCU (International Milk Clotting Units).
153
VÝSLEDKY A DISKUSE Z časových důvodů jsme tento postup nemohli realizovat, ale je to další námět pro navázání naši práci. V literatuře se podobnými analýzami syřidel nikdo nezabýval. Avšak stanovení koagulačních vlastností mléka řešilo několik autorů (viz. kap. 3.3.2.1). 5.6.1.2 Kvalitativní analýzy syřidel Rozlišení druhů syřidel Zajímalo nás, zda je FT NIR spektrofotometr vhodný k rozlišení jednotlivých druhů syřidel (Obr. 68), a zda lze určit že se jedná o syřidlo pepsinové, chymosinové (Obr. 69), anebo přírodního či mikrobiálního původu (Obr. 70). Pro tvorbu kalibračních modelů pomocí Diskriminační analýzy bylo použito 53 spekter šesti syřidel různého stáří. Spektra nebyla dále nijak upravována. Pro vyhodnocení spekter byla použita pouze část regionu, a to v rozmezí od 8 889,26 do 5 407,55 cm-1. Na obr. 22 v příloze je možné vidět, jak by vypadala Diskriminační analýza syřidel, pokud bychom pro kalibraci použili celý spektrální region. Regiony metod pro stanovení druhů syřidel (chymosinových x pepsinových, přírodních x mikrobiálních) nebyly upravovány.
Obr. 68 Diskriminační analýza jednotlivých syřidel (1 - pepsinové přírodní syřidlo o deklarované síle 1:10 000, 2 – chymosinové přírodní syřidlo o deklarované síle 1:5 000, 3 – chym. přír. syřidlo o deklarované síle 150 IMCU/ml, 4 - chym. přír. syřidlo o deklarované síle 145 IMCU/ml, 5 - chymosinové mikrobiálné syřidlo o deklarované síle 950 IMCU/ml, 6 – chym. mikrob. syřidlo o deklarované síle 1 000 IMCU/ml) a spektra jednotlivých syřidel.
154
VÝSLEDKY A DISKUSE
Obr. 69 Diskriminační analýza pro rozlišení chymosinových (□) a pepsinových syřidel (∆). NIR spektrum pepsinového a chymosinového syřidla.
Obr. 70 Diskriminační analýza pro rozlišení chymosinových přírodních (□) a mikrobiálních syřidel (∆). NIR spektrum přírodního a mikrobiálního syřidla. Při porovnávání spekter šesti různých syřidel pomocí DA (obr. 68) došlo k vytvoření klastrů, a i k tvorbě tzv. „diskriminačního kříže“. Stejného výsledku bylo dosaženo při porovnávání syřidel pepsinových a chymosinových (obr. 69). Lze tedy říci, že FT NIR spektrometr je natolik citlivý, že dokázal spolehlivě rozlišit jednotlivá syřidla od sebe, a také určit zda je srážecím enzymem pepsin či chymosin. Tato metoda by mohla v praxi usnadnit a urychlit rozeznání druhu syřidla, protože pro analýzu není nutno vzorek nijak upravovat a výsledky víme během několika sekund. V případě rozlišení syřidel chymosinových přírodního a mikrobiálního původu, se podařilo vytvořit klastry (Obr. 70), avšak spektra obou klastrů byla velmi blízko u sebe, což by mohlo zapříčinit nesprávnou identifikaci neznámého vzorku, protože struktura chymosinu je stále stejná jak v případě přírodního nebo mikrobiálního původu. Podle STRMISKY a ČERNÉ, jak uvádí TEPLÝ et al. (1976), lze od sebe chymosinové a pepsinové syřidlo rozeznat pomocí chemických metod, založených
155
VÝSLEDKY A DISKUSE inaktivaci enzymové aktivity syřidel v roztoku při pH 8. Při snížení pH roztoku 6 se obnoví aktivita pouze u chymosinového syřidla. Dále také můžeme použít pro rozlišení druhů syřidel i různé biochemické enzymatické metody. Všechny tyto metody jsou oproti naší metodě časově náročné, a to jak přípravu vzorků, tak i provedení vlastních analýz. Výsledky byly také publikovány ve Sborníku příspěvků z odborného semináře Mléko a sýry 2012, VŠCHT Praha. Stanovení stáří syřidel Základním požadavkem
syřidla je jejich spolehlivost, kterou charakterizují
vlastnosti jako stálá standardní síla, mikrobiologická čistota, trvanlivost, ale i schopnost vytvářet jakostní sýřeninu. Stárnutím syřidel se tyto charakteristiky výrazně mění. A proto dalším z cílů práce bylo, vytvořit kalibrační metodu, díky níž by bylo možno stanovit stáří syřidel. Na obr. 23 v příloze je ukázka vytvořených sýřenin různě starými syřidly, kdy sýřeni vytvoře použitím syřidla skladovaného otevření šest měsíců v lednici má viditelně horší soudržnost a jakost než sýřeni vytvoře za použití čerstvého syřidla. Pro tvorbu kalibračních modelů byla použita syřidla měřená: ihned otevření, syřidla skladová 3 a 6 měsíců v lednici. Spektra pro kalibraci byla podrobe první derivaci s úpravou regionu 7 265,37 – 5 401,21 cm-1. Spektra syřidel 3 a 6 měsících byla téměř totožná, obě se ale lišila od spektra syřidla čerstvého. Na obr. 71, lze vidět přehledné rozdělení spekter do clusterů a opět vytvoření diskriminačního kříže.
Obr. 71 DA pro rozlišení stáří syřidel: Syřidlo otevření a staré 3 a 6 měsíců. Průběh NIR spekter syřidla měřeného otevření a 3 a 6 měsících skladování.
156
VÝSLEDKY A DISKUSE Přístroj FT NIR tedy opět s vysokou přesností rozeznal různě stará syřidla. Tato orientační metoda by mohla v budoucnosti sloužit pro rychlé stanovení, že syřidlo vlivem doby skladování nemá takové jakostní parametry, jako mělo syřidlo čerstvé. Výsledky byly publikovány ve formě původní vědecké práce ve vědeckém časopise Acta Universitatis Agriculturae et Silviculturae Mendelianae Brunensis, Vol. 60, Is 6, s. 189 – 196, 2012, ISSN 1211-8516. 5.6.2 Sýřeniny V chemické laboratoři Ústavu technologie potravin, AF MENDELU v Brně byly analyzovány základní vlastnosti sýřenin vzniklých zasýřením plnotučného, polotučného a odtučněného sušeného mléka šesti různými syřidly (kap. 4.1.6.1) rozdílného stáří. Suši sýřenin byla stanove podle referenční metody a teoretická hmotnost sýřeniny (výtěžnost) pomocí uvedeného vzorce v metodice (kap. 4.2.1.6). Analýzy byly prováděny ve třech časových intervalech: začátku pokusu, kdy byla sýřeni vyrobe za použití čerstvého syřidla, a 3 a 6 měsících, kdy pro výrobu sýřeniny bylo použito syřidlo skladované 3 a 6 měsíců v lednici. Sýřeniny byly proměřeny integrační sféře v rotační kyvetě při 100 sc a rozlišení 8 cm-1. 5.6.2.1 Kvantitativní analýzy sýřenin Pro tvorbu kalibračních modelů pomocí metody PLS bylo použito celkem 43 sýřenin. Rozpětí referenčních hodnot pro jednotlivé parametry je vyjádřeno v tab. 13 kap. 4.1.1.6. Pro každý parament sýřeniny byl vybrán a případě upraven region spekter tak, aby bylo dosaženo co nejvyšších hodnot korelačních koeficientů kalibrace a validace tab. 47. Tab. 47: Úprava spekter a regionů pro vybrané oblasti vlnočtů pro kalibraci sýřenin. Parametr Suši (%) Výtěžnost (g)
úprava spektra bez úpravy druhá derivace
Vybraný region pro kalibraci úprava vlnočet (cm-1) 2st Derivative in range 8 081,86 – 5 071,77 2st Derivative in range 10 001,03 – 4 005,42
157
VÝSLEDKY A DISKUSE Při tvorbě kalibrací byla opět využita diagnostika Spektrum Outlier, Leverage a PC Score, pomocí nichž jsme při tvorbě obou kalibrací identifikovali čtyři odlehlé standardy a ignorovali je. Počet PLS faktorů (Tab. 47) byl pro obsah sušiny 6 a pro výtěžnost sýřeniny 10. Na Obr. 72 je znázorněn průběh funkce PRESS pro kalibrační model obsahu sušiny v sýřenině.
Obr. 72 Funkce PRESS pro stanovení obsahu sušiny sýřeniny s 6 PLS faktory. V tabulce 48 a 49 jsou uvedeny kalibrační a validační výsledky vytvořených kalibrací pro sušinu a teoretickou výtěžnost sýřeniny. Tab. 48 Kalibrační výsledky pro jednotlivé parametry sýřenin. Parametr
N
R
SEC
Suši (%) Výtěžnost (g)
40 40
0,998 0,999
0,253 0,234
CCV (%) 1,915 0,599
y = bx ± a
PLS
y = 0,9766x + 0,3096 y = 0,999x + 0,0411
6 10
N – počet vzorků, y = bx + a = regresní přímka, SEC – směrodatná odchylka kalibrace, CCV – kalibrační variační koeficient, R – korelační koeficient, PLS – počet faktorů.
Tab. 49 Validační výsledky pro jednotlivé parametry sýřenin. Parametr Suši (%) Výtěžnost (g)
n
R
SEP
PCV (%)
y = bx ± a
40 40
0,912 0,490
0,695 6,300
5,261 16,136
y = 0,9147x + 1,099 y = 0,2144x + 31,002
N – počet vzorků, y = bx + a = regresní přímka, SEP – směrodatná odchylka validace, PCV – predikční variační koeficient, R – korelační koeficient
Kalibrační modely pro sušinu a výtěžnost sýřeniny popsané korelačním koeficientem kalibrace (R) se směrodatnými odchylkami (SEC) se jeví jako vysoce spolehlivé s velmi silnou závislostí mezi laboratorními hodnotami a hodnotami
158
VÝSLEDKY A DISKUSE předpověděnými pomocí NIR spektroskopie, protože hodnota R sušiny je 0,999 ± 0,234 % a výtěžnosti sýřeniny 0,998 ± 0,234 g. Validační model kalibrace pro sušinu potvrzuje, že by měla být kalibrace plně funkční, protože korelační koeficient validace se směrodatnou odchylkou je 0,912 ± 0,695 %. Dle Obr. 73 můžeme usuzovat velkou těsnost mezi kalibračními a validačními hodnotami. Validační model pro výtěžnosti sýřeniny, bohužel poukázal špatnou predikci hodnot NIR spektroskopem, protože jeho hodnota korelačního koeficientu s odchylkou predikce je 0,490 ± 6,3 g. Na vysokou rozdílnost kalibračních a validačních hodnot poukazuje Obr. 74.
sušina [%] NIR
Sušina sýřeniny 18 y = 0,9766x + 0,3096 R = 0,988
16 14
y = 0,9147x + 1,099 R = 0,912
12 10 10
11
12
13
14
15
Kalibrace
Validace
Lineárny (Kalibrace)
Lineárny (Validace)
16 17 18 sušina [%] laboratorně
Obr. 73 Kalibrační a validační modely pro sušinu sýřeniny.
Obr. 74 Kalibrační a validační modely pro výtěžnost sýřeniny. Vysokou spolehlivost kalibrace sušiny potvrzuje i hodnota kalibračního variačního koeficientu 1,915 % a 5,261 %. Hodnota CCV pro kalibraci výtěžnosti splňuje požadovaný limit < 5 %, avšak PCV limit je překročen (CCV 0,599 %; PCV
159
VÝSLEDKY A DISKUSE 16,136 %). Pro zlepšení regresní závislosti a spolehlivosti, je nutné kalibraci doplnit o další standardy. Získané výsledky predikovaných NIR hodnot a referenčních hodnot, byly zhodnocení pomocí párového t - testu. Z Tab. 50 můžeme usuzovat, že se získané hodnoty průkazně neliší (P < 0,05). Tab. 50 Statistické vyhodnocení jednotlivých parametrů sýřenin. Parametr
N
xNIR
xREF
SD
t stat
t1 krit
t2 krit
Suši (%) Výtěžnost (g)
40 40
13,21 39,04
13,21 39,04
0,26 1,14
-0,019 -0,013
1,685 1,685
2,023 2,023
N – počet vzorků, xNIR – hodnoty predikované, xREF – hodnoty referenční, SD – směrodatná odchylka diference, tstat – t-test, t1(krit) – tabulková hodnota při α = 0,05, t2(krit) – tabulková hodnota při α = 0,01
Z uvedených výsledků vyplývá, že lze vytvořit velice dobrý kalibrační model pro stanovení sušiny sýřenin, avšak pro predikci jejich teoretické výtěžnosti, je třeba kalibraci vylepšit, abychom byli schopni predikovat přesnější výsledky. NIR spektroskopie je tedy vhodná pro stanovení jakostních parametrů sýřenin jako je např. sušina. Naši teorii potvrzuje práce SULTANEHA et ROHMA (2007), kteří použili NIRS metodu stanovení sušiny a bílkovin sýřeniny. V režimu difusní reflektance integrační sféře ve spektrálním rozsahu 2 000 - 12 000 cm-1, proměřili 242 vzorků sýřenin. Rozsah referenčních hodnot pro kalibraci sušiny byl 173 – 384 g/kg s aritmetickým průměrem 264,4 g/kg a pro kalibraci bílkovin 66,8 - 201,5 g/kg s průměrnou hodnotou 121,3 g/kg. Metodou PLS byly vyvinuty kalibrační modely pro nehomogenizované a homogenizované sýřeniny. Oba modely byly ověřeny křížovou validací. Pro nehomogenizované sýřeniny bylo dosaženo následujících výsledky koeficientů determinace R2 = 0,994 ± 0,502 % pro sušinu a R2 = 0,985 ± 0,548% pro bílkoviny. Po homogenizaci sýřenin se koeficienty determinace mírně zlepšily R2 =0,997 ± 0,388 % pro sušinu a R2 = 0,992 ± 0,381 % pro bílkoviny. Počet PLS faktorů pro kalibraci sušiny byl 9 a pro bílkoviny 10. Křížovou validací bylo dosaženo koeficientů determinace R2 = 0,997 pro sušinu a R2 = 0,994 pro bílkoviny. Jednoduchým t-testem bylo potvrzeno, že predikované výsledky
160
VÝSLEDKY A DISKUSE nebyly vyšší ani nižší, než výsledky referenčních hodnot. Jak potvrdily výsledky studie, NIR spektroskopie má vysoký potenciál pro rychlé sledování složení sýřenin. Sledováním sýřenin se zabývali i jiné práce. Například LEE et al. (1997) použili reflektanční NIR spektroskopii pro rychlou analýzu vlhkosti, bílkovin, tuku a laktosy v sýřenině při výrobě Čedaru. Vývojem multilineární regresní rovnice bylo dosaženo následujících koeficientů determinace kalibrací a validací pro: vlhkost 0,982 a 0,984; bílkoviny 0,965 a 0,964; tuk 0,951 a 0,957 a pro laktosu 0,909 a 0,982. Tyto výsledky naznačují, že NIRS je použitelná pro sledování chemických změn v sýřenině. FAGAN et al. (2009) použili VIS/NIR senzor pro stanovení vlhkosti sýřeniny a tuku syrovátky při výrobě sýru v sýrařské kádi. Pokus byl proveden za tří různých faktorů (sýřící teplota, koncentrace chloridu vápenatého a času krájení sýřeniny). Spektra byla snímá v sýrařské kádi během synereze a pak v 10 minutových intervalech. Spektrální data byla použita k vypracování modelů pomocí metody PLS. Bylo dosaženo korelačních koeficientů kalibrace a validace R = 0,91 a 0,95 pro vlhkost sýřeniny a R = 0,86 a 0,89 pro tuk syrovátky. Studie poukázala možnost použití NIR spektroskopie pro predikci důležitých ukazatelů při synerezi sýřeniny. Z výsledků naší práce a práce uvedených autorů lze usuzovat vysoký potenciál použití NIR spektroskopie pro analýzu parametrů jakosti sýřenin. 5.6.2.2 Kvalitativní analýzy sýřenin Jak je známo, při výrobě sýrů v primární fázi štěpení kaseinu syřidlem dochází k tomu, že rozštěpení kaseinu parakapakasein a glykomakropeptid odchází syřidlo společně s glykomakropeptidem do syrovátky a v parakapakaseinu je zadržováno jen nepatrné množství syřidla v průměru od 1 – 15 % z celkového množství (GUINEE et WILKINSON, 1992). Zajímalo nás, zda jsme schopni pomocí FT NIR spektrofotometru stanovit, jaké syřidlo bylo použito pro zasýření mléka a tedy pro tvorbu sýřeniny. Pro tvorbu kalibrace bylo použito 54 kalibračních spekter, která nebyla upravována.
161
VÝSLEDKY A DISKUSE
Obr. 75 Diskriminační analýza sýřenin vyrobených různými syřidly. I odstranění
odlehlých
spekter
a upřesnění
regionu
pro zpřesnění
kalibračního modelu se nám nepodařilo získat spolehlivý model pro rozlišení sýřenin získaných zasýřením různými syřidly (Obr. 75). Kalibrace se nám nepodařila zdokonalit pravděpodobně proto, že obsah syřidla v sýřenině se pohybuje v minoritní koncentraci a podle MLČKA (2008) je FT NIR spektroskopie spíše vhodná pro stanovení majoritních složek.
162
ZÁVĚR
6 ZÁVĚR Disertační práce se zabývala možností rozšíření aplikace NIR spektroskopie v mlékárenském průmyslu při kontrole kvantitativních a/nebo
kvalitativních
parametrů ovčího a kozího mléka, mražených krémů, Olomouckých tvarůžků, sušené sladké syrovátky, syřidel a vytvořených sýřenin. Ovčí mléko Z výsledků práce vyplývá, že NIR spektroskopie je metoda, která může být použita jako adekvátní technika pro velmi rychlé orientační stanovení koncentrace mastných kyselin v tuku ovčího mléka, které jsou v něm zastoupeny v majoritním množství, jako např. kys. myristová, palmitová, olejová a stearová. Tvorba kalibrací mastných kyselin vyskytujících se v minoritním množství (koncentrace pod 5 %) jako je kys. kaprinová a laurová, byla obtížná, protože rozpětí referenčních hodnot bylo úzké a i když bylo použito dostatečné množství vzorků, i tak se nepodařilo vytvořit funkční modely. Kozí mléko Práce ověřila vliv vedlejší referenční metody kvalitu rekalibrací pro stanovení bílkovin, tuku, laktosy a kalibrace TPS. Byly získány velmi spolehlivé modely pro stanovení bílkovin, tuk a TPS. Kvalita rekalibrovaného modelu laktosy se použití referenčních hodnot získaných z vedlejší metody zhoršila. Vytvořené kalibrace poukazují možnost použití vedlejších metod, ale pouze v případě pokud není možné použítí přímé metody, protože vedlejší metoda v sobě nese riziko vnášení chyb do vyrvořených kalibrací. Z výsledků práce vyplývá, že FT NIR spektroskopii lze použít pro stanovení základních složek kozího mléka. Mražené krémy Práce ověřila možnost stanovení sušiny, tuku a bílkovin mražených krémů dvěma způsoby měření (ve skleněné kádince a Petriho misce se zrcátkem 0,3 mm) v režimu reflektance. Byla vypracová metodika pro lepší a spolehlivější kalibrace základního složení mražených krémů.
163
ZÁVĚR Výsledky potvrzují, že lze vytvořit velmi kvalitní kalibrace pro stanovení sušiny a tuku. Kalibrace pro obsah bílkovin jsou vhodnější pouze pro orientační použití. Jako vhodnější metodika měření vzorku byla vybrá metoda v kádince, protože poskytovala ve všech případech lepší výsledky. Aplikace této metody v praxi je schůdnější, protože nastiňuje měření pomocí on – line techniky, kdy je spektrum vzorku snímáno již při výrobě mraženého krému. Olomoucké tvarůžky Cílem kvantitativních analýz bylo vytvořit kalibrační modely pro stanovení sušiny, NaCl, pH a titrační kyselosti (°SH) olomouckých tvarůžků skladovaných při 5 °C a při 20 °C. Velmi spolehlivé kalibrace byly získány pro pH a sušinu tvarůžků skladovaných při 5 °C a 20 °C a množství NaCl (5 °C). Kalibrace pro ° SH (5 °C, 20 °C) a NaCl (20 °C) byly méně spolehlivé a vhodné spíše pro orientační stanovení hodnot. Jejich spolehlivost by se dala zvýšit rozšířením o více vzorků, aby se zaplněnily slepá místa v kalibraci, která vznikla vlivem širokého rozpětí referenčních hodnot. Kvalitativními
analýzami
byla
prokázá vhodnost
NIR
spektroskopie,
pro stanovení rozdílného stáří tvarůžků, rozdílného formování tvarůžku, což může být spojeno s jejich odlišním prozráváním a také se potvrdil rozdíl mezi tvarůžky vyrobenými jaře a v létě, což je spojeno s rozlišným složením mléka. Metoda FT NIR techniky může tedy sloužit k rychlé kontrole kvality suroviny, meziproduktu a finálního výrobku. Sušená sladká syrovátka Výsledky práce poukazují vhodnost použití NIR spektroskopie pro stanovení sušiny, bílkovin a obsahu vody v sušené sladké syrovátce, protože vytvořené kalibrace byly vysoce spolehlivé. Tato metoda může v praxi urychlit rutinní analýzy kontroly jakosti výrobku. Vlivem malého počtu vzorků se nepodařilo vytvořit spolehlivé kalibrace pro stanovení fyzikálně - chemických vlastností syrovátky jako je pH a ° SH. Tyto kalibrace byly popsány vysokým korelačním koeficientem kalibrace, ale nízkým korelačním koeficientem validace.
164
ZÁVĚR Syřidla a sýřeniny Syřidla Syřidla byla analyzová třemi různými metodami měření a jako nejvhodnější byla vybrá transmitanční technika měření neředěného syřidla v kyvetě. Byly vytvořeny kvantitativní kalibrace pro stanovení pH, času koagulace mléka, síly a dávky syřidla dle Soxhleta pro syřidla skladovaná v průběhu půl roku jak v lednici, tak i při pokojové teplotě. Byla vytvoře kvalitní a spolehlivá kalibrace pro pH syřidel. Ostatní kalibrace neposkytovaly dobré výsledky, avšak modely vytvořené syřidly z lednice lze je použít alespoň pro orientační stanovení hodnot, zatímco kalibrace vytvořené spektry syřidel skladovaných při pokojové teplotě byly zcela nefunkční. Kvalita kalibrací by se dala zlepšit použitím více standardů, ale hlavně použitím jiné metodiky pro získání referenčních hodnot. Na základě našich zkušeností bych jako vhodnější metodiku doporučila stanovení síly syřidla dle ISO157/IDF 2007 pro bovinní syřidla a ISO 176/IDF 2002 pro mikrobiální syřidla, které využívají pro zasyřování standardizovaný substrát. NIR spektroskopie také umožňuje rozlišit navzájem jednotlivá syřidla, stanovit druh syřidla (pepsinové či chymosinové, přírodní či mikrobiální) a dále rozeznat různě stará syřidla a jejich podmínky skladování. Problematikou stanovení jakostních parametrů syřidel s využitím blízké infračervené spektroskopie se doposud nikdo nezabýval, a proto by tato práce mohla přispět k možnostem výzkumu syřidel v oblasti NIR spektroskopie. Sýřeniny U sýřenin vyrobených syřidly skladovanými za standardních podmínek byla stanove suši a vypočte jejich teoretická výtěžnost. Byl získán velmi spolehlivý model pro stanovení sušiny. Kalibrace pro výtěžnost sýřeniny byla nefunkční, protože nebyl nalezen žádný vztah mezi referenčními a predikovanými hodnotami NIR spektroskopem. Z hlediska kvalitativního hodnocení jsme se pokusili stanovit, jakým syřidlem byla sýřeni vysrážena. Bohužel, NIR spektrofotometr nebyl schopen stanovit, jaké syřidlo bylo použito, protože v sýřenině zůstane zadrženo pouze minimální množství syřidla, které nestačí k detekci touto přístrojovou technikou.
165
ZÁVĚR Na základě výsledků práce lze NIR spektrofotometrii doporučit pro stanovení:
majoritně zastoupených MK v tuku ovčího mléka,
obsahu bílkovin, tuku a tukuprosté sušiny v kozím mléce,
obsahu sušiny a tuku při měření mražených krémů metodou v kádince a sušiny měřením Petriho misce se zrcátkem 0,3 mm,
pH a sušiny Olomouckých tvarůžků skladovaných při 5 °C a 20 °C a množství NaCl (5 °C) v Olomouckých tvarůžcích,
obsahu sušiny, bílkovin a obsahu vody v sušené sladké syrovátce,
pH syřidel a sušiny sýřeniny.
166
PŘEHLED LITERATURY
7 PŘEHLED POUŽITÉ LITERATURY ABILLEIRA, E., SCHLICHTHERLE – CERNY, H., VIRTO, M., DE RENOBALES, M. E., BARRON, L. J. R., 2010: Volatile composition and aroma-active compounds of farmhouse Idiazabal cheese made in winter and spring, Int Dairy J, 20: 537 – 544. ADAMOPOULOS, K. G., GOULA, A. M., PETROPAKIS, H. J., 2001: Quality Control During Processing of Feta Cheese – NIR Application. Journal of Food composition and Analysis, 14: 431 – 440. AFFANE, A. L. N., FOX, G. P., SIGGE, G. O., MANLEY, M., BRITZ, T. J., 2011: Simultaneous prediction of acidity parameters (pH and titrable acidity) in Kefir using near infrared reflectance spectroscopy. International Dairy journal, 21: 896 – 900. ALBANELL, E., CÁCERES, P., CAJA, G., MOLINA, E., GARGOURI, I. 1999: Determination of fat, protein and total solids in ovine milk by near-infrared spectroscopy. Journal of AOAC International, 82: 753 – 758. ALBANELL, E., CAJA, G., SUCH, X., ROVAI, M., SALAMA, A. A. K., CASALS, R., 2003: Determination of fat, protein, casein, total solids, and somatic cell count in goat’s milk by near-infrared reflectance spectroscopy. J AOAC, 86: 746 – 752 ALBANELL, E., MOUSSAOUL, Y., CAJA, G.,CASALS, R.,SALAMA, A. A. K., SUCH, X., 2007: Detetmination of fat, protein, total solid and fatty acids in ovine Milk by Near- infrared Reflectance Spectroscopy, pp.7 – 9. AL – QADIRI, H.M., LIN, M., AL – HOLY, M. A., CAVINATO, A. G., RASCO, B. A., 2008: Monitoring Quality Loss of Pasteurized Skim Milk Using Visible and Short Wavelength Near-Infrared Spectroscopy and Multivariate Analysis. J. Dairy Sci, 91 (3): 950 – 958. ANDERSEN, CH. M., FRØST, M. B, VIERECK, N., 2010: Spectroscopic characterization of low- and non-fat cream cheeses, International Dairy Journal, 20(1): 32 – 39. ANONYM, 2012: Navrhovanie experimentov – DOE (Design of Experiment) [cit. 2012-07 10]. Dostupné na:http://kme.elf.stuba.sk/moodle/pluginfile.php/1020/mod_reso urce/content/1/DEO%20Postup%20pri%20navrhu%20experimentu.ppt?forcedownload =1 ARVANITOYANNIS , I. S., TZOUROS , N. E., 2005: Implementation of quality control methods in conjunction with chemometrics toward authentication of dairy products. Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 45: 231 – 249 .
167
PŘEHLED LITERATURY AULRICH, K., MOLKENTIN, J., 2009: Potential of Near Infrared Spectroscopy for differentiation of organically and conventio-nally produced milk, Agriculture and Forestry Research, 4(59): 301 – 308. BALABIN, R. M., SMIRNOV, S. V., 2011: Melamine detection by mid- and nearinfrared (MIR/NIR) spectroscopy: A quick and sensitive method for dairy products analysis including liquid milk, infant formula, and milk poder. Talanta, 85 (1): 562 – 568. BARABÁSSY, S. P., KAFFKA, K. J., 1993: The application possibilities of the near infrared technique in the non destructive investigation of mixed milk powder products. J. Food Phys., 57: 39 – 48. BARABÁSSY, S., P., KAFFKA, K., J, 1995: The application of NIR for powdered milk products, p. 312 – 315. In: G. D. BATTEN et al. (ed), Leaping ahead with near infrared spectroscopy. NIR spectroscopy Group, Royal Australan Chemical Institute Pubblishing, North Melbourne, Australia, 540 p. BARABÁSSY, S., P., TURZA, S., 1996: Investigation of the lyophilization effect on mixed milk poder produkt by near infrared spectroscopy, p. 611 – 616. In: DAVIES, A. M. C., WILLIAMS, P. (ed.), Near Infrared Spectroscopy: The Future Waves, NIR Publications, Chichester, UK, 742 p. BENITO, J. M. T., OJEDA, B. C., ROJAS, S. F., 2008: Process Analytical Chemistry:Applications of Near Infrared Spectrometry in Environmental and Food Analysis: An Overview. Applied Spectroscopy Reviews, 43 (5): 452 – 484. BEEBE, K. R., KOWALSKI, B. R., 1987: Comparison of multivariate calibration and analysis. Anal. Chem., 59: 1007 – 1017. BEEBE, K. R., PELL, R. J., SEASHOLTZ, M. B., 1998: Chemometrics: A Practical Guide, John Wiley & Sons, 348 p., ISBN-10: 0471124516. BEN – GERA, I., NORRIS, K., H., 1968: Influence of fat concentration on absorption spectrum of milk in near-infrared region. Israel journal of agricultural research, 18 (3): 117. BERGLES, E., 2008: White Paper: NIR Spectral Engines, [cit. 2012-07 18]. Dostupné na: http://www.bayspec.com/userfiles/file/BaySpec%20White%20Paper%20%20NIR%20Spectral%20Engines.pdf BLANCO, M., VILLARROYA, I., 2002: NIR spectroscopy: a rapid-response analytical tool. Trends in analytical chemistry, 21 (4): 240 – 250.
168
PŘEHLED LITERATURY
BLAQUEZ, C., DOWNEY, G., O’CALLAGHAN, D., HOWARD, V., DELAHUNTY, C., SHEEHAN, E., EVERARD, C. P., O'DONNELL, C, 2006: Modelling of sensory and instrumental texture parameters in processed cheese by near infrared reflectance spectroscopy. Journal of Dairy Research, 73: 58 – 69. BLAQUEZ, C., DOWNEY, G., O’DONNELL, C., O’CALLAGHAN, D., HOWARD, V., 2004: Prediction of moisture, fat and inorganic salts in processed cheese by near infrared reflectance spectroscopy and multivariate data analysis. Journal of Near Infrared Spectroscopy, 12: 149 – 157. BOKOBZA, L., 2002: Origin of Nera-infrared absorption bands, p. 12 – 14. In: SIESLER, H. W., OZAKI, Y., KAWATA, S., HEISE, H. M., MCCLURE, W. F., CHRISTY, A. (ed), Near-Infrared Spectroscopy : Principles, Instruments, Applications, Weinheim, Germanny, WILEY-VCH Verlag GmbH, 361 p., ISBN 3-527-30149-6 BORIN, A., FERRÃO, M. F., MELLO, C., MARETTO, D. A., POPPI, R. J., 2006: Least-squares support vector machines and near infrared spectroscopy for quantification of common adulterants in powdered milk, Analytica Chimica Acta, 579 (1): 25 – 32. BOYSWORTH, M. K., BOOKSH, K. S., 2007: Aspects of Multivariate Calibration Applied to Near-Infrared Spectroscopy, p. 207 – 229. In: BURNS, D. A., CIURCZAK, E. W., Handbook of Near infrared analysis. 3th ed., CRC Press, New York, 681 p, ISBN 0-8493-7393-X BOWER, J. A., 2009: Statistical methods for food science - Introductory procedures for the food practitioner, 1st ed., Blackwell Publishing Ltd, p 284 – 303, ISBN 978-1-40516764-2. BRANDÃO, M. C. M. P., CARMO, A. P., BELL, M. J. V., ANJOS, V. C., 2010: Characterization of milk by infrared spectroscopy, Inst. Latic. “Cândido Tostes”, 373 (65): 30 – 33. BRENNE, E., 1987: Near infrared analysis. General principles and potential use in the dairy industry, Journal Artikle, Meieriposten,73: 410 – 413. BÜCHI, 2005: Application note: NIRFlex N-500 Calibration for Ice cream, Company literature, [cit. 2012-08-22], Dostupné na: http://www.buechigmbh.de/uploads/media/icecream_04.pdf BURNS, D. A., CIURCZAK, E. W., Handbook of Near infrared analysis. 3th ed., CRC Press, New York: 2007, 681 p, ISBN 0-8493-7393-X.
169
PŘEHLED LITERATURY CARL, R. T., 1991: Quantification of the fat content of milk using a partial-leastsquares method of data analysis in the near infrared, Fresenius' Journal of Analytica Chemistry, 339 (2): 70 – 71. CASADO, P., BIANCO, C., POZAS, A., 1978: Analysis of dried milk by diffuse reflectance spectroscopy. Rev. Esp. Lecherria, 97: 108. CASTILLO, M., PAYNE, F. A, HICKS, C. L., LOPEZ, M.B., 2000: Predicting cutting and clotting time of coagulating goat's milk using difuse reflectance: efect of pH, temperature and enzyme concentration. International Dairy Journal, 10: 551 – 562. CATTANEO, T. M. P. GIARDINA, C., SINELLI, N., RIVA, M., GIANGIACOMO, R., 2005: Application of FT-NIR and FT-IR spectroscopy to study the shelf-life of Crescenza cheese, International Dairy Journal, 15: 693 – 700. CECCHINATO, A., DE MARCHI, M., GALLO, L., BITTANTE, G., CARNIER, P., 2009: Mid-infrared spectroscopy predictions as indicator traits in breeding programs for enhanced coagulation properties of milk. J. Dairy Sci, 92: 5304 – 5313. CECCHINATO, A., DE MARCHI, M., PENASA, M., CASELLAS, J., SCHIAVON, S., BITTANTE, G., 2012: Genetic analysis of beef fatty acid composition predicted by near-infrared spectroscopy. J Anim Sci., 90 (2): 429 – 38. CENTNER, V., 1999: Near infrared spectroscopy (NIR) and his technology application, CHEMagazín, 1 (9): 22 – 23. CENTNER V., 2002: Vícerozměrná kalibrace, p. 296 – 306. In: MELOUN, M., MILITKÝ, J.: Kompendium statistického zpracování dat, Metody a řešené úlohy včetně CD, PDF, Academia Praha, 766p. COPPA, M., FERLAY, A., LEROUX, CH., JESTIN, M., CHILLIARD Y., MARTIN, B., ANDUEZA, D., 2010: Prediction of milk fatty acid composition by near infrared reflectance spectroscopy. International Dairy Journal, 20 (3): 82 – 189. CWIKOVÁ, O., NEDOMOVÁ, Š., 2007: Vliv délky zrání olomouckých tvarůžků jejich senzorické a texturní vlastnosti. Acta Univ. Agric. Silvic. Mendel. Brun., 55 (5): 45 – 50. ČIŽMÁR, D., 2010: Vývoj kalibrační rovnice N-látky a škrob ve sladovnickém ječmeni metodou FT-NIRS, Bulletin 2010, 14 (1): 1 – 8. ČSN 57 0105-3, 2003: Metody zkoušení mléčných výrobků sušených a zahuštěných Část 3: Stanovení obsahu sušiny v zahuštěném slazeném a neslazeném mléce, Český normalizační institut, Praha, 8 p.
170
PŘEHLED LITERATURY ČSN 57 0105-5, 1985: Metody zkoušení mléčných výrobků sušených a zahuštěných. Stanovení celkového obsahu bílkovin, 12 p. ČSN 57 0105-8, 1981: Metody zkoušení mléčných výrobků sušených a zahuštěných. Stanovení titrační kyselosti, Český normalizační institut, Praha, 12 p. ČSN 57 0105-13, 2003, Metody zkoušení mléčných výrobků sušených a zahuštěných Část 13: Stanovení obsahu vody v sušeném mléce, Praha, Český normalizační institut. 4p. ČSN 57 0107, 1965: Metody zkoušení sýrů, tvarohů, krémů a pomazánek, Praha, Český normalizační institut, 35 p. ČSN 57 0107-3, 1982: Metody zkoušení přírodních a tavených sýrů. Stanovení obsahu vody a sušiny, 8 p. ČSN 57 0107-12, 1982: Metody zkoušení přírodních a tavených sýrů. Stanovení obsahu chloridu sodného, Český normalizační institut, Praha, 8 p. ČSN 57 0536, 1999: Stanovení složení mléka infračerveným absorpčním analyzátorem. Český normalizační institut, Praha, 12 p. ČSN 57 0803, 1981: Sušené mléko. Technické požadavky, Český normalizační institut, Praha, 12 p. ČURDA, L., KUKAČKOVÁ, O., 2004: NIR spectroscopy: a useful tool for rapid monitoring of processed cheeses manufacture. Journal of Food Engineering, 61: 557 – 560. ČURDA, L., KUKAČKOVÁ, O., NOVOTNÁ, M., 2002: NIR spektroskopie a její využití při analýze mléka a mléčných. Chem. Listy, 96: 305 – 310. DAŇKOVÁ, R., 2011: Vzužití NIR spektrokopie při kontrole sušených mléčných výrobků, Diplomová práce, Mendelova univerzita v Brně, Brno, 65 p. DE MARCHI, M., FAGAN, C. C., O’DONNELL, C. P., CECCHINATO, A., DAL ZOTTO, R., CASSANDRO, M., PENASA, M., BITTANTE, G., 2009: Prediction of coagulation properties, titratable acidity, and pH of bovine milk using mid-infrared spectroscopy. Journal of Dairy Science, 92 (1): 426 – 432. DERRICK, M. R., STULIK, D., LANDRY, J.M., 1999: Infrared Spectroscopy in Conservation Science, J. Paul Getty Trust, USA, 235 p., ISBN 0-89236-469-6 DE VILDER, J., BOSSUYT, R., 1983: Practical experiences wih an InfraAlyzer 400 in determining the water, protein and fat kontent of milk powder. Milchwissenschaft, 38: 65 – 69.
171
PŘEHLED LITERATURY DÍAZ – CARRILLO, E, MUÑOZ – SERRANO, A, ALONSO – MORAGA, A, SERRADILLA – MANRIQUE J., M., 1993: Near infrared calibrations for goat’s milk components: protein, total casein, α-, β- and κ-casein, fat and lactose. J Near Infrared Spectrosc, 1: 141 – 146. DIAZ – CARRILLO, E., MUNOZSERRANO, A., ALONSOMORAGA, A., SERRADILLAMANRIQUE, J. M., MUNOZ, A., 1995: Identification of main NIR absorption peaks from goat's milk, 6th International Conference on Near Infrared Spectroscopy , Leaping Adead with Near Infrared Spectroscopy, Australia , p. 79 – 83, ISBN: 0-909589-82-8 DOHNAL, L., 1999: Regrese a kalibrace, symposium klinické biochemie FONS, 2: 25 – 31, [cit. 2012-07-07]. Dostupné na: http://www1.lf1.cuni.cz/~ldohna/publik/Kap_5_Regrese_a_kalibrace.pdf DOWNEY, G. 1996: Authentication of Food and Food Ingredients by Near Infrared Spectroscopy. J. Near Infrared Spectrosc., 4: 47 – 61. DOWNEY, G., BERTRAND, D., ROBERT, P., KELLY, P. M., 1989: NIR Reflectance – a new use in the Dairy Industry, Food Kontrol, 20 (4): 18 – 20. DOWNEY, G., SHEEHAN, E., DELAHUNTY, C., O´CALLANGHAN, D., GUINEE, T., HOWARD, V., 2005: Prediction of maturity and sensory attributes of Cheddar cheese using near-infrared spectroscopy. Internal Dairy Journal, 15: 701 – 709. DRAČKOVÁ, M., JANDOVÁ, T., STANDAROVÁ, E., KORDIOVSKÁ, P., BORKOVCOVÁ, I., JANŠTOVÁ, B., NAVRÁTILOVÁ, P., VORLOVÁ, L., 2009a: Determination of polyamine content in curd cheese by Near-infrared reflectance spektrometry. Acta fytotechnica et zootechnica, 12: 121 – 126. DRAČKOVÁ M., HADRA L., JANŠTOVÁ B., NAVRÁTILOVÁ P., PŘIDALOVÁ H., VORLOVÁ L., 2008: Analysis of Goat Milk by Near-Infrared Spectroscopy. Acta Vet. Brno, 77: 415 – 422. DRAČKOVÁ, M., HADRA, L., TARTANOVÁ, I., VOZKOVÁ, L., VORLOVÁ, L., 2006: Využití FT-NIR v analýze pasterovaného mléka, Sborník přednášek semináře „Mléko a sýry 2006, Praha, p. 158 – 161, DRAČKOVÁ, M., NAVRÁTILOVÁ, P., HADRA, L., VORLOVÁ, L, HUDCOVÁ, L., 2009b: Determination Residues of Penicillin G and Cloxacillin in Raw Cow Milk Usány Fourier Transform Near Infrared Spectroscopy. Acta Vet. Brno, 78: 685 – 690.
172
PŘEHLED LITERATURY DRAČKOVÁ, M., ŘEŘUCHOVÁ, M., HALDRA, L., PŘIDALOVÁ, H., NAVRÁTILOVÁ, P., JANŠTOVÁ, B., VORLOVÁ, L., 2007: Hodnocení fyzikálněchemických vlastností sýrů s nízkodohřívanou sýřeninou pomocí FT-NIR. Sborník přednášek semináře „Mléko a sýry 2007, Praha, 180 – 182. DRAGOUNOVÁ, H., HEJTMÁNKOVÁ, A., KOUŘIMSKÁ, L., 2007: Ovčí mléko a jeho význam v lidské výživě, Agrární WWW portál AGRIS, [cit. 2012-0820]. Dostupné na: http://www.agris.cz/Content/files/main_files/75/153130/32_05.pdf ECKSCHLAGER, K., 1991: Chemometrie. Praha: Karolinum, 156 s. ISBN 80-7066487-8. FAGAN, C. C., CASTILLO, M., O'CALLAGHAN, D. J., PAYNE, F. A., O'DONNELL, C. P., 2009: Visible-near infrared spectroscopy sensor for predicting curd and whey composition during cheese processing, Sensing and Instrumentation for Food Quality and Safety, 3 (1): 62 – 69. ISSN 1932-7587. FERUS, M., 2006: FTIR spektrometrie plynných polutantů, Bakalářská práce, Ústav fyzikální chemie J. Heyrovského AV ČR , [cit. 2012-08-3] Dostupné na: http://www.jh-inst.cas.cz/~ftirlab/polutanty. FILHO, P. A. D. A., VOLERY, P.. 2005: Broad-based versus specific NIRS calibration: determination of total solids in fresh cheeses. Analytica. Chimica Acta, 544: 82 – 88. FONTECHA, J., BALLANATO, J., JUAREZ, M., 1993: Infrared and Raman spectroscopic Study of Casein in Cheese: Effect of Freezing and Frozen Storage. J. Dairy Sci., 76: 3303 – 3309. FRANK, J. F., BIRTH, G. S., 1982: Application of near infrared reflectance spectroscopy to cheese analysis. J. Dairy Sci., 65: 1110 – 1116. FRANKHUIZEN, R., 2007: NIR Analysis of Dairy products, p. 415 – 436. In: BURNS, D. A., CIURCZAK, E. W. (ed): Handbook of Near infrared analysis. 3th ed., CRC Press, New York: 2007, 681 p, ISBN 0-8493-7393-X. FRANKHUIZEN, R., VAN DER VEEN, N. G., 1985: Determination of major and minor constituents on milk powder and cheese by near infra-red reflektance spektroskopy. Milk Dairy, 39: 191 – 207. GAJDŮŠEK, S., 1997: Mlékařství II, MZLU, Brno, p. 84, ISBN 80-7157-278-0. GIANGIACOMO, R., BRAGA, F., GALLIENA, C., 1992: Use of NIR spectroscopy to detect whey powder mixed with milk powder, p. 399 – 407. In: MURRAY, I., COWE, I. A. (ed): Making light work: Advances in near infrared spectroscopy. VCH Weinhein, New York, 652 p. ISBN 3527284982
173
PŘEHLED LITERATURY GELADI, P., 2003: Chemometrics in spectroscopy. Part 1. Classical chemometrics: A review. Spectrochimica Acta, Part B, 58: 767 – 782. GODULA, M., 2010: Food Authenticity – Profiling Foods, ThermoFisher Scientific, [cit. 2012-07-27]. Dostupné na: http://www.google.cz/url?sa=t&rct=j&q=&esrc=s&source=web&cd=2&ved=0CHYQFj AB&url=http%3A%2F%2Fwww.ssica.it%2Fcomponent%2Foption%2Ccom_docman% 2Ftask%2Cdoc_download%2Fgid%2C434%2FItemid%2C133%2Flang%2Cit%2F&ei= tDwSUNvtAT54QSQroDAAg&usg=AFQjCNEA7PIA51xOVTDZn027crHcmx7i7A& sig2=kW51a1-MUyaRKCTxsm7pSg GONZÁLEZ – MARTÍN, I., HERNÁNDEZ – HIERRO, J., M., MORÓN –SANCHO, R., SALVADOR – ESTEBAN, J., VIVAR – QUINTANA, A., REVILLA, I., 2007: Determination of the percentage of milk (cow's, ewe's and goat's) in cheeses with different ripening times using near infrared spectroscopy technology and a remote reflectance fibre-optic probe, Analytica Chimica Acta, 604 (2): 191 – 196. GONZÁLEZ – MARTIN, M. M., HERNÁNDEZ HIERRO, J. M., REVILLA, I., VIVAR – QUINTANA, A. M., GONZÁLEZ – PÉREZ, C., 2009: The application of near infrared spectroscopy technology and a remote reflectance fibre-optic probe for the determination of peptides in cheese (cow´s, ewe´s and goat´s) with different ripening times, Food Chem, 114: 1564 – 1569. GONZÁLEZ – MARTÍN, I., HERNÁNDEZ – HIERRO, J., M., REVILLA, I., VIVAR – QUINTANA, A., LOBOS ORTEGA, I., 2011a: The mineral composition (Ca, P, Mg, K, Na) in cheeses (cow’s, ewe’s and goat’s) with different ripening times using near infrared spectroscopy with a fibre-optic probe. Food Chemistry, 127 (1): 147 – 152. GONZÁLEZ – MARTÍN, I., HERNÁNDEZ – HIERRO, J. M., SALVADOR– ESTEBAN, J., GONZÁLEZ – PÉREZ, C., REVILLA, I., VIVAR – QUINTANA, A., 2011b: Discrimination of seasonality in cheeses by near-infrared technology,J Sci Food Agric , 91: 1064 – 1069. GONZÁLEZ-MARTÍN, M. I.,HERNÁNDEZ-HIERRO1, J. M., VIVAR-QUINTANA, A., REVILLA, I., 2008: Detection of Seasonal Origin of Milk in Cheeses (Cow’s, Ewe’s and Goat’s) Using NIRS Technology and a Discriminant Analysis, 5 th IDF symposium on cheese ripening, Bern- Switzerland, 180. GOULDEN, J. D. S., 1957: Diffuse reflexion spectra of dairy products in the nearinfrared region. Journal of dairy research, 24 (2): 242 – 251.
174
PŘEHLED LITERATURY GRAPPIN, R., PITTON, C., NOEL, Y., 1991: Methodes rapides d’appreciation de la qualite du lait cru destine a la transformation fromagere. Nuevos me´todos tecnolo´gicos para productos la´ cteos; Consellerı´a de Agricultura: Ganderı´a e Montes, Santiago de Compostela, Spain, p. 85 – 109. GRONHOLZ, J., HERRES, W. 2001: Understanding FT-IR Data Processing., [cit. 2012-07-27]. Dostupné na: http://www.lightsource.ca/files/download.php?id=2677&view=1 GUINEE, T. P., WILKINSON, M. G., 1992: Rennet coagulation and coagulants in cheese manufacture. International Journal of Dairy Technology, 45: 94 – 104. HALL, J., W., CHAN, K., 1993: Near-infrared spectroscopic analysis of bovine milk for fat, protein ans lactose. In: Proceedings of Cheese Yield and Factors Affectings its Control, IDF Seminar, Cork, Ireland, International Dairy Federation Publishing, Bruxelles, Belgium, p. 230 – 239. HART – DAVIS, A., 2011: Věda, Obrazový průvodce vědy a techniky, Euromedia Group, k.s., pp 512, ISBN 978-80-242-3078-8. HAALAND, D. M., THOMAS, E. V., 1988a: Partial least-squares methods for spectral analyses. 1. Relation to other quantitative calibration methods and the extraction of qualitative information. Anal. Chem. 60: 1193 – 1202. HAALAND, D. M., THOMAS, E. V., 1988b: Partial least-squares methods for spectral analyses. 2. Application to simulated and glass spectral data. Anal. Chem. 60: 1202 – 1208. HAN, D. H., LU, C., LIU, Y., PI, F. W., 2007: Identification of reconstructed milk in raw milk using near infrared spectroscopy, Spectroscopy and Spectral Analysis, 27: 465 – 467. HANSEN P. W., 1998: Chemometrics and spectroscopy, Spectroscopic analysis of dairy products, Ph.D thesis, KVL, Kopenhagen, 126 p. HANUŠ, O., MACEK, A., JANU, L., GENCUROVÁ, V., JEDELSKÁ, R., KOPECKÝ, J., 2008: Jakost mléka, hlavní ukazatel pri zpenežení - welfare a zdravotní stav prežvýkavcu, kvalita syrového mléka, jeho nutričně zdravotní benefity a bezpečnost mléčného potravinového řetězce, Příloha: RUZ_1B44036_2008_P01, [cit. 2012-07-27]. Dostupné na: http://www.google.cz/url?sa=t&rct=j&q=&esrc=s&source=web&cd=4&ved=0CG4QFj AD&url=http%3A%2F%2Fwww.mze-vyzkuminfobanka.cz%2FDownloadFile%2F53067.aspx&ei=CmQSUOTLBM3HsgaImoHIBQ &usg=AFQjCNFYf1fn7-_dghVWjLvu_Q6I4_q9NA&sig2=jsM1Y7sOsStqOOxrY6sbA
175
PŘEHLED LITERATURY HADRA, L., Dračková, M.,Janštová, B., Navrátilová, P., Vorlová, L.,2006: Využití FT NIR v analýze pasterovaného kozího mléka, Sborník přednášek semináře „Mléko a sýry 2006, Praha, 124 – 127. HEISE, H. M., WINZEN, R., 2008: Fundamental Chemometric Methods, 47 – 72. In: SIESLER, H. W., OZAKI, Y., KAWATA, S., HEISE, H. M. (ed): Near-Infrared Spectroscopy: Principles, Instruments, Applications, John Wiley & Sons, 361 p. ISBN 978-0-471-67201-2. HOLÍK, M., 2007: Mezinárodní konference CHEMOMETRICS IV, Bulein, Chem Listy, 28 (1), http://chemicke-listy.cz/Bulletin/bulletin281/9701010.html. HONNER, M., 2008: Infračervená Spektrometrie, Skripta 3. kapitola, Výzkumné centrum západočeské univerzity v Plzni, [cit. 2012-08-3] Dostupné na: http://ttp.zcu.cz/files/pdf/skripta_kap3_irspektrometrie.pdf HURBURGH, CH. R, IGNE, B., 2010: The New Giudance Method for Calibration, Validation and Use of Near Infrared Analyzers, Iowa State University. 24 p., [cit. 201207-07]. Dostupné na: http://www.aocs.org/files/AMPresentation/37961_fulltext.pdf HOUDKOVÁ, M., 2012: Stanovení melaminu v mléce, Informační centrum bezpečnosti potravin, [cit. 2012-07-27]. Dostupné na: http://www.bezpecnostpotravin.cz/stanoveni-melaminu-v-mlece.aspx HOYER, H., 1997: Application NIR on–line analysis in the food industry, Process Control and Quality, 9: 143 – 152. CHEN, A., O., CHEN, Y., J., HSIEH, N., 1994: Quantitative analysis of composition by Near Infrared Spectroscopy and price estimation on raw bovine milk. J. Chinise Agricul. Chem., 32: 384 – 394. CHEN, M., IRUDAYARAJ, J., Mc MAHON, D., J., 1998: Examination of Full Fat and Reduced Fat Cheddar Cheese During Ripening by Fourier Transform Infrared Spectroscopy. Journal of Dairy Science, 81 (11): 2791 – 2797. CHEN, Y. J., IYO, CH., KAWANO, S., 1999: Development of calibration with sample cell compensation for determining the fat content of unhomogenised raw milk by a simple near infrared transmittance method. J. Near Infrared Spectrosc.,7: 265 – 273. IDF 157:2007 (ISO11815:2007): Milk. Determination of total milk – clotting activity of bovine rennets, 11 p. IDF 176:2012 (ISO 15174:2012): Milk and milk products. Microbial coagulants. Determination of total milk – clotting activity, 9 p.
176
PŘEHLED LITERATURY JACOB, M.,JAROS, D., ROHM., H., 2011: Recent advances in milk clotting enzymes, International Journal of Dairy Technology, 63: 14 – 33. JANKOVSKÁ, R., 2004: Využití blízké infračervené spektroskopie (NIR) při hodnocení vybraných mléčných produktů, Doctoral thesis, MZLU v Brně, 176 p. JANKOVSKÁ, R., ŠUSTOVÁ, K., 2003: Analysis of cow milk by near-infrared spectroscopy. Czech Journal of Food Science, 21 (4): 123 – 128. JANKOVSKÁ, R., ŠUSTOVÁ, K., KUCHTÍK, J., 2004: Využití FT NIR spektroskopie v analýze ovčího mléka, Mléko a sýry 2004. Praha: VŠCHT, p. 137 – 141. JANŠTOVÁ, B., NAVRÁTILOVÁ, P., DRAČKOVÁ, M., PŘIDALOVÁ, H., VORLOVÁ, L., 2009: Impact of Heat Treatment on the Freezing Points of Cow and Goat Milk. Acta Vet. Brno, 78: 679 – 684. JARKOVSKÝ, J., LITTNEROVÁ, S., 2011: Vícerozměrné statistické metody, [cit. 2012-07-10]. Dostupné na: http://www.iba.muni.cz/esf/res/file/bimat-prednasky/viceroz merne-statisticke-metody/VSM-01.pdf JHA, S. N., MATSUOKA, T., 2004: Detection of adulterants in milk using Near infrared spectroscopy, Journal of food science and Technology, 41: 313 – 316. JIRSA, O., HRUŠKOVÁ, M., ŠVEC, I, 2008: Hodnocení vlastností pšeničného těsta analýzou NIR spekter mouky. Chem. Listy, 102: 829 − 836. KAISER, G.,MARGUARDT, U., RUDZIG L., WÜST E., 1991: Unterschungen and Chedar-Käse mittels NIR-Analytik. Deutche Milchwirtschaft, 6: 158 - 159. KAMISHIKIRYO -YAMASHITA, H., HASEGAWA, K., MATOBA, T., 1991: Stability of 2179 nm as a key wavelenght for protein analysis by near-infrared spectroscopy. J. Jpn. Food. Sci. Technol., 38: 850 - 857. KANIA, P., 2007: INFRAČERVENÁ SPEKTROMETRIE, VŠCHT Praha, [cit. 2012-081]. Dostupné http://www.vscht.cz/anl/lach1/7_IC.pdf KARLBERG, B, 2006: Principles of NIR and MID-IR Spectroscopy, [cit. 2012-07 18]. Dostupné na: http://pdfwindow.com/a/PRINCIPLES%20OF%20NIR%20and%20 mid-IR%20SPECTROSCOPY KAROUI, R., BOSSET, J. O., MAZEROLLES, G., KULMYRZAEV, A., DUFOUR, E., 2005a: Monitoring the geographic origin of both experimental French Jura hard cheeses and Swiss Gruye`re and l’Etivaz PDO cheeses using mid-infrared and fluorescence spectroscopies. International Dairy Journal, 15: 275 – 286.
177
PŘEHLED LITERATURY KAROUI, R., De BAERDEMAEKER, J., 2007: A review of the analytical methods coupled with chemometric tools for the determination of the quality and identity of dairy products. Food Chemistry, 102: 621 – 640 . KAROUI, R., DUFOUR, E., PILLONEL, L., SCHALLER, E., PICQUE, D., CATTENOZ, T., BOSSET, J. O., 2005b: The potential of combined infrared and fluorescence spectroscopies as a Metod of determination of the geographic origin of Emmental cheeses. International Dairy Journal, 15: 287 – 298. KASEMSUMRAN, S., THANAPASE,W., KIATSOONTHON, A., 2007: Feasibility of Near-Infrared Spectroscopy to Detect and to Quantify Adulterants in Cow Milk, Analytical Sciences. The Japan Society for Analytical Chemistry, 23: 907 – 910. KAWANO, S., 2002: Sampling and sample presentation, p. 115 – 123. In: SIESLER, H. W., OZAKI, Y.,KAWATA, S., HEISE, H. M., MCCLURE, W. F., CHRISTY, A. (ed): Near-Infrared Spectroscopy: Principles, Instruments, Applications, Weinheim, Germanny, WILEY-VCH Verlag GmbH, 361 p., ISBN 3-527-30149-6 KAWASAKI, M., KAWAMURA, S., TSUKAHARA, M., MORITA, S.,KOMIYA, M., NATSUGA, M., 2008: Near-infrared spectroscopic sensing system for on-line milk quality assessment in a milking robot, Computers and Electronics in Agriculture, 63: 22 - 27. KLOUDA, P., 2003: Moderní analytické metody, Nakladatelství Pavel Klouda, Ostrava, 132 p., ISBN 80-86369-07-2. KUBANOVÁ, J., LINDA, B., 2007: Kritické hodnoty a kvantily vybraných rozdělení pravděpodobností. 1. dotisk vyd. Pardubice : Tiskařské středisko University Pardubice,. 53 p., ISBN 80-7194-852-755-7. KUKAČKOVÁ, O., 2001: Aplikační možnosti NIR spektroskopie při kontrole mléka a mlékárenských výrobků. Disertační práce, VŠCHT v Praze, 198 p. KUKAČKOVÁ, O., ČURDA, L., JINDŘICH, J., 2000: Multivariate calibration of raw cow milk using NIR spectroscopy. Czech J. Food Sci.,18: 1 - 4. LAPORTE, M. F., MARTEL, R., PAQUIN, P., 1998: The near-infrared optic probe for monitoring rennet coagulation in cow’s milk. International Dairy Journal, 8: 659 – 666. LAPORTE, M., F., PAQUIN, P., 1999: Near-Infrared analysis of fat, protein, and casein in cow’s milk, Journal of Agricultural and Food Chemistry., 47 (7): 2600 - 2605. LEE, S. J., JEON, I. J., HARBERS, L. H., 1997: Near-infrared reflectance spectroscopy for rapid analysis of curds during Chedar cheese making. J. Food Sci., 62: 53 - 56.
178
PŘEHLED LITERATURY LECO COMPORATION, 2005: Organic Application note: NIR Analysis of Whey Powders, Company literature, [cit. 2012-08-28], Dostupné na: http://www.leco.cz/cz/resources/application_note_subs/pdf/organic/-204.pdf LEFIER, D., GRAPPIN, R., POCHET, S., 1996: Determination of fat, protein and lactose in raw milk by Fourier Transform Infrared Spectroscopy and by analysis with a conventional filter based analyser. Journal of the Association of Official Analytical Chemists International, 79 (5): 711 - 717. LEFIER, D., LAMPRELL, H., MAZEROLLES, G., 2000: Evolution of Lactococcus strains during ripening in Brie cheese using Fourier transform infrared spectroscopy, Lait, 80: 247 - 254. LEVITIN, I. B., 1979: Infračervená technika, Bratislava: Alfa, 160 p., 63-237-79. LI, K., HAN, D., SUN, M., 2008, Identification of Reconstructed Milk in Raw Milk Using Near Infrared Spectroscopy, Journal of Agricultural Mechanization Research, 8: 145 - 147. LU, C., XIANG, B., HAO, G., XU, J.,WANG, Z., CHEN, CH., 2009: Rapid detection of melamine in milk powder by near infrared spectroscopy. J Near Infrared Spectroscop, 17: 59 - 67. LU, L. N., ZHANG, Y., ZHOU, D. W., 2004: Composition analysis of milk by using near infrared difuse reflection spectroscopy. Tianjin Daxue Xuebao (Ziran Kexue yu Gongcheng Jishu Ban). Journal of Tianjin University Science and Technology, 37: 1093 – 1096. LUŽOVÁ, T., 2011: Využití FT NIR spektrometrie kontrole kvality potravin, Disertační práce, Mendelova univerzita v Brně, Brno, 149 p. LUŽOVÁ, T., ŠUSTOVÁ, K., HORÁKOVÁ, R., 2007: Stanovení jakostních ukazatelů čerstvých kozích sýrů pomocí NIR spektroskopie, Sborník přednášek semináře „Mléko a sýry 2007, Praha, p. 195 - 197. LYNDGAARD, CH. B., ENGELSEN, S. B., VAN DEN BERG, F. W. J., 2012: Realtime modeling of milk coagulation using in-line near infrared spectroscopy. Journal of Food Engineering, 108: 345 – 352 MANLEY, M., DOWNEY, G., BAETEN, V., 2008: Spectroscopic Technique: Nearinfrared (NIR)Spectroscopy, p. 65 – 99. In: SUN, D. W. (ed): Modern Techniques for Food Authentication, Elsevier Inc., 720 p., ISBN: 978-0-12-374085-4.
179
PŘEHLED LITERATURY MANLEY, M., MC GILL, A. E. J., OSBORNE, B. G., 1994: The Effect of Light Scattering on NIR Reflectance and Transmittance Spectra of Wheat. J. Near Infrared Spectrosc., 2: 93 – 99. MARABOLI, A., CATTANEO, T. M. P., GIANGIACOMO, R., 2002: Detection of vegetable proteins from soy, pea and wheat isolates in milk powder by near-infrared spectroscopy. Journal of Near-infrared Spectroscopy, 10: 63 – 69. MARTEL, R., PAQUIN, P., 1991: Water absorption in fluid milk Fourier transform infrared spectroscopy. J. Dairy Sci., 74: 2073 - 2076. MASSART D. L., VANGDEGINSTE B. G. M., DEMING S. N., MICHOTTE Y., KAUFMAN L., 1988: Chemometrics :A textbook. Elsevier, Amsterdam, 488 p., ISBN 0-444-42660-4. MATĚJKA, P., 2006: Spektroskopie v blízké infračervené oblasti, [cit. 2012-0707]. Dostupné na: http://www.vscht.cz/anl/lach2/NIR.pdf MATĚJKA, P., DENDISOVÁ, M., 2010: Ramanova a infračervená spektrometrie vzorků v pevné fázi, VŠCHT Praha, [cit. 2012-08-1]. Dostupné na: http://www.vscht.cz/anl/josef/LabMolSpek/RamanIR%202010.pdf MAUER, L. J., CHERNYSHOVA, A. A., HIÁTY, A., DEERING, A., DAVIS, R., 2009: Melanine Detection in Infant Formula Powder Using Near- and Mid-Infrared Spectroscopy. J. Agric. Food Chem., 57 (10): 3974 – 3980. MAZEROLLES, G., DUBOZ, G., HUGOT, S., 2000: Détermination dea taux d´humidité et de matiére grasse de fromages de type pate pressée par spectroscopie proche infrarouge en mode transmission, Lait, 80: 371 - 379. MC CARTHY, W. J, KEMENY, G. J., 2007: Fourier Transform Spectrophotometers in the Near-Infrared, p. 79 - 91. In: BURNS, D. A., CIURCZAK, E. W. (ed): Handbook of Near infrared analysis. 3th ed., CRC Press, New York, 836 p., ISBN 0-8493-7393-X. MC CLURE, F. W., 2003: Revie: 204 years od Nera infrared technology: 1800 – 2003, NIR Publication, 11 (6): 487 – 518. MC CLURE, F. W., 2007: Analysis Using Fourier Transforms, p. 93 – 119. In: BURNS, D. A., CIURCZAK, E. W. (ed): Handbook of Near infrared analysis. 3th ed., CRC Press, New York, 836 p., ISBN 0-8493-7393-X. MC CLURE, W., F., TSUCHIKAWA, S., 2007: Instruments, p. 75 – 108. In: OZAKI, Y., MC CLURE, W. F., CHRISTY, A. A. (ed): Near- infrared spectroscopy in food science and technology, John Wiley & Sons, 424 p., ISBN 0471672017.
180
PŘEHLED LITERATURY MC MAHON, D. J., BROWN, R. J., ERNSTROM, C. A., 1984: Enzymic coagulation of milk casein micelles, Journal of Dairy Science, 67: 745 – 748. MC QUEEN, D. H., WILSON, R., KINNUNEN, A., JENSEN, E. P., 1995: Comparison of two infrared spectroscopic methods for cheese analysis. Talanta, 42: 2007 - 2015. MELOUN, M., MILITKÝ, J., 2002: KOMPENDIUM STATISTICKÉHO ZPRACOVÁNÍ DAT, Metody a řešené úlohy včetně CD, PDF, Academia Praha, 766 p. MÍKA, V., KOHOUTEK, A., NERUŠIL, P.,2008: Spektroskopie v blízké infračervené oblasti (NIR). Výběr praktických aplikací v zemědělství. METODIKA PRO PRAXI, Praha, 44 p. MILDE, D., 2008: INFRAČERVENÁ A RAMANOVA SPEKTROMETRIE 2004 - 2008, VŠCHT Praha, [cit. 2012-08-1] Dostupné na: http://ach.upol.cz/user-files/intranet/imir-raman-pdf-1287047361.pdf MLČEK, J., 2008: Využití NIR spektrometrie pro hodnocení kvality potravin a potravinových surovin. Disertační práce, Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně, Brno, 146 p. MLČEK, J., ROP, O., DOHNAL, V., ŠUSTOVÁ, K., 2011: Application of near infrared spectroscopy to estimate selected free amino acids and soluble nitrogen during cheese ripening. Acta veterinaria Brno, 80 (3): 293 - 297. MLČEK, J., ŠUSTOVÁ, K., 2006: Hodnocení texturních vlastností eidamských sýrů NIR spektrofotometrem. Sborník přednášek semináře „Mléko a sýry 2006, Praha, p. 106 - 111. MOUAZEN, A. M., DRIDI, S., ROUISSI, H., DE BAERDEMAEKER, J., RAMON, H., 2009: Prediction of selected ewe's milk properties and differentiating between pasture and box feeding using visible and near infrared spectroscopy. Biosystems Engineering, 104 (3): 353 - 361. MUNOZ, N., ORTIGOSA, M., TORRE, P., IZCO, J. M., 2003: Free amino acids and volatile compounds in an ewe’s milk cheese as affected by seasonal and cheese-making plant variations, Food Chem, 83:329 – 338. MUSELÍK, J., 2012: Aplikace blízké infračervené spektroskopie ve farmaceutické analýze. Chem. Listy, 106: 10 - 15. NĚMCOVÁ, I., ČERMÁKOVÁ, L., RYCHLOVSKÝ, P., 2004: Spektrometrické analytické metody I. Karolinum, Praha, 166 p., ISBN 80-246-0776-X.
181
PŘEHLED LITERATURY NIEMÖLLER, A., BEHMER, D., 2008: Use of Near Infrared Spectroscopy in the Food Industry, p. 67 - 84. In: IRUDAYARAJ, J., REH, C. (ed): Nondestructive Testing of Food Quality, Blackwell Publishing Ltd, Oxford, UK, 384 p., ISBN 0813828856. NICODOM s.r.o., 1997a: Aplikační list FT NIS spektroskopie: Stanovení bílkovin, sušiny a tuku v jogurtech, firemní literatura. NICODOM s.r.o., 1997b: Aplikační list FT NIS spektroskopie: Stanovení bílkovin, sušiny a tuku ve směsích na jogurty, firemní literatura. NICOLET.CZ, 2007a: TQ Analyst – stručný návod. Firemní literatura, 97 p. NICOLET.CZ, 2007b: TQ Analyst – Vývoj kalibračního modelu pro kvantitativní stanovení pomocí algoritmu PLS. Firemní literatura, 13 p. NICOLET.CZ, 2007c: TQ Analyst – Vývoj kalibračního modelu pro kvalitativní analýzu pomocí algoritmu Discriminant analysis, Firemní literatura, 10 p. NICOLETCZ.CZ, 2012: Antaris II, Nicolet CZ s.r.o., [cit. 2012-08-5] Dostupné na: http://www.nicoletcz.cz/nir-spektrometry/ NOVOTNÁ, M., 1998: Vznik a registrace spekter v infračervené a blízké infračervené oblasti, Letní škola NIR, MU Brno, p. 5 - 18. NUÑEZ -SANCHEZ, N., GARRIDO - VARO, A., SERRADILLA, J., ARES, L., 2002: Near infrared analysis of liquid and dried ewe milk. p. 179 – 182. In: CHO, R. K., DAVIES, A. M. C. (ed): Near Infrared Spectroscopy: Proceedings 10th International Conference, NIR Publications, Chichester, UK, 550 p., ISBN 0952866633. OLIVERI, P., DI EGIDIO, V., WOODCOCK, T., DOWNEY, G., 2011: Application of Class-Modelling Techniques to Near Infrared data for Food Authentication Purposes. Food Chemistry, 125 (4): 1450 – 1456. OSBORNE, B. G., 2001: Near-Infrared Spectroscopy in Food Analysis, p. 1 -14. In MEYERS, R. A. (ed): Encyclopedia of Analytical Chemistry: Applications: Theory and Instrumentation, 1 ed, John Wiley & Sons Ltd, Chichester, 2188 p., ISBN 0471976709. OSBORNE, B. G., 1993: Practical NIR Spectroscopy with applications in food and beverage alalysis, 2nd, Longman Scientific & Technical. 227 p., ISBN 0582099463. OSBORNE, B. G., DOUGLAS, S., FEARN, T., 1982: The application of near infrared reflectance analysis to rapid flour testing. J Sci Tech., 17: 355 - 362. OSBORNE, B. G., FEAM, T., 1986: Near infrared spectroscopy in Food Analysis, Longman Scientific & Technical, 200 p., ISBN 0470206756.
182
PŘEHLED LITERATURY OZAKI, Y., MORITA. S., DU, Y., 2007: Spectral analysis, p. 47 – 72. In: SIESLER, H. W., OZAKI, Y.,KAWATA, S., HEISE, H. M., MCCLURE, W. F., CHRISTY, A. (ed): Near-Infrared Spectroscopy: Principles, Instruments, Applications, Weinheim, Germanny, WILEY-VCH Verlag GmbH, 361 p., ISBN 3-527-30149-6 PANFORD, J. A., DEMAN, J. M., 1990: Determination of oil content of seeds by NIR: Influence of fatty acid composition on wavelength selection. Journal of the American Oil Chemists' Society, 67 (8): 473 - 482. PASCUAL, A. J. J.; MOLINA, P. M. P., 1994: Calibracio´n de un me´todo automa´ tico NIR analysis en la determinacio´n de las materias proteicas de la leche de oveja. Anales de Investigacio´n del Master en Ciencia e Ingenierı´a de los Alimentos; Universidad Polite´cnica de Valencia: Valencia, Spain, p 307 – 322. PASTIEROVÁ, E., 1991: Stanoveni bielkovin v sušenom mlieku metódou NIR. Bulletin PV, 30: 263 – 269. PASQUINI, C., 2003: Near Infrared Spectroscopy: fundamentals, practical aspects and analytical applications REVIEW. J. Braz. Chem. Soc., 14(2): 198 – 219. PAYNE, F. A., HICKS, C. L., MADANGOPAL, S., SHEARER, S. A., 1993: Fibre optic sensor for predicting the cutting time of coagulating milk for cheese production. Transactions of the ASAE, 36: 841 – 847. PENNER, M. H., 1994: Basic principles of spectroscopy, p. 317 – 324. In: NIELSEN, S.S. (ed): Intorduction to the Chemical Analysis of Foods, Boston, MA: Jones and Bartlett Publishes, 530 p., ISBN 0867208260 PEREA, S., DE LABASTIDA, E., F., NÁJERA, A., L., CHAVARRI, F., VIRTO, M., DE RENOVALES, M., et al., 2000: Seasonal changes in the fat cpmposition of Lacha sheep´s milk used for Idiazabal cheese manufacture, Eur Food Res Toechnol, 210: 318 – 323. PEREZ - MARIN, M. D., GARRIDO - VARO, A., SERRADILLA, J. M, NÚÑEZ, N., ARES, J. L., SANCHEZ, J.: Chemical and microbiological analysis of goat’s milk, cheese and whey by near infrared spectroscopy, p. 225 – 228. In: CHO, R. K., DAVIES, A. M. C. (ed): Near Infrared Spectroscopy: Proceedings 10th International Conference, NIR Publications, Chichester, UK, 550 p., ISBN 0952866633. PERTEN INSTRUMENTS, 1999: Application note 5.6: Rapid Analysis of Fat and Dry Matter in Ice Cream Mix Using a Diode Array Visible/NIR Spectrometer, Company literature,[cit. 2012-08-22], Dostupné na: http://www.atelectronic.dk/Ice%20cream%20mix%205.6.pdf
183
PŘEHLED LITERATURY PI, F., SHINZAWA, H., OZAKI, Y., HAN, D., 2009: Non-destructive determination of components in processed cheese slice wrapped with a polyethylene film using nearinfrared spectroscopy and chemometrics. International Dairy Journal, 19 (10): 624 – 629. PIERCE, M. M., WEHLING, R. L., 1994: Comparison of sample handling and data treatment methods for determining moisture and fat in Cheddar cheese by near-infrared spectroscopy. J. Agric. Food Chem., 42: 2830 - 2835. PILLONEL, L., DUFOUR, E., SCHALLER, E., BOSSET, J. O., DE BAERDEMAEKER, J., KAROUI, R., 2007: Prediction of colour of European Emmental cheeses by using near infrared spectroscopy: a feasibility study, European Food Research and Technology, 226 (1): 63 – 69. PILLONEL, L., LUGINBÜHL, W., PICQUE, D., SCHALLER, E., TABACCHI, R., BOSSET, J. O., 2000: Analytical methods for the determination of the geographic origin of Emmental cheese Mid and near-infrared spectroscopy, European Food Research and Technology. 216: 174 – 178. POULIOT, M., PAQUIN, P., MARTEL, R., GAUTHIER, S. F., POULIOT, Y., 1997: Whey Changes during Processing Determined by Near Infrared Spectroscopy. Journal Of Food Scienc, 62 (3): 475 - 479. PRAVDOVA, V., WALCZAK, B., MASSART, D. L., KAWANO, S., TOYODA, K., TSENKOVA, R., 2001: Calibration of somatic cell count in milk based on near-infrared spectroscopy. Analytica Chimica Acta, 450: 131 - 141. PRESER, 2012: Infračervená Spektrometrie – Kvalitattivní a Kvantitativní Stanovení, Katedra analytitické chemie, Přírodovědecká fakulta Univerzity Palackého v Olomouci, [cit. 2012-08-1], Dostupné na: http://ach.upol.cz/user-files/files/pac-07-2012.pdf PROCHÁZKOVÁ, Z., DRAČKOVÁ, M., REMEŠOVÁ, A., JANŠTOVÁ, B., PŘIDALOVÁ, H., VORLOVÁ, L., 2010: Využití blízké infračervené spektroskopie pro stanovení základních fyzikálně-chemických parametrů ovčího mléka, Potravinárstvo, 1 (4): 70 – 73. PURNOMOADI, A., BATAJOO, K. K., UEDA, K., TERADA, F., 1999: Influence of feed source on determination of fat and protein in milk by near-infrared spectroscopy. International Dairy Journal, 9: 447 - 452. RATCHEV, M., PETROVA, S., 1991: Analysis of dry milk infant foods by near infrared spectroscopy (NIR). J. Chromatography, 552: 273 – 279.
184
PŘEHLED LITERATURY REID, L. M., O'DONNELL, C. P., DOWNEY, G., 2006: Recent technological advances for the determination of food authenticity, Trends in Food Science & Technology, 17: 344 - 353. REVILLA, I, VIVAR-QUINTANA, A. M., LURUEÑA-MARTÍNEZ, M. A., GONZÁLEZ-MARTÍN, I., HERNÁNDEZ-HIERRO, J. M., GONZÁLEZ-PÉREZ, C., 2008: Determination of Ripening Time, Breed and SCC Level in Zamorano Cheeses Using NIRS Technology and Chemometric Studies, 5 th IDF symposium on cheese ripening, Bern- Switzerland, 186 – 187. REVILLA, I., GONZÁLEZ - MARTÍN, I., HERNÁNDEZ - HIERRO, J. M., VIVAR - QUINTANA, A., GONZÁLEZ - PÉREZ,C.,LURUEÑA - MARTÍNEZ, M.A., 2009: Texture evaluation in cheeses by NIRS technology employing a fibre-optic probe. Journal of Food Engineering, 92 (1): 24 – 28. RODRIGUEZ - OTERO, J. L.; CENTENO, J.; HERMIDA, M., 1997a: Applications of near infrared transflectance spectroscopy to the analysis of fermented milks. Milchwissenschaft, 52: 196 - 200. RODRIGUEZ - OTERO, J. L., HERMIDA, M., 1996: Analysis of Fermented Milk Products by Near-Infrared Reflectance Spectroscopy. Journal of AOAC International, 79 (3): 817 - 821. RODRIGUEZ - OTERO, J., L., HERMIDA, M., CENTENO, J., 1997b: Analysis of Dairy Products by Near-Infrared Spectroscopy: A Review. J. Agric. Food Chem., 5 (8): 2815 - 2818. RODRIGUEZ - OTERO, J. L., HERMIDA, M., CEPEDA, A., 1995: Determination of Fat, Protein, and Total Solids in Cheese by Near-Infrared Reflectance Spectroscopy. Journal of AOAC International, 78(3): 802 - 806. RU, Y. J., GLATZ, P. C., 2000: Application of near infrared spectroscopy (NIR) for monitoring the quality of milk, cheese, meat and fish. Asian Austral J Anim Sci, 13: 1017 - 1025. RŮŽIČKOVÁ, J., ŠUSTOVÁ, K., 2006a: Determination of selected parameters of quality of the dairy products by NIR spectroscopy. Czech J. Food Sci., 24: 255 – 260. RŮŽIČKOVÁ, J., ŠUSTOVÁ, K., 2007: Využití NIR spektroskopie při analýze sušeného mléka, Sborník přednášek semináře „Mléko a sýry 2007, Praha, p. 190 - 194. SAPUTRA, D., PAYNE, F. A., LODDER, R. A., SHEARER, S. A. 1992: Selection of near-infrared wavelengths for monitoring milk coagulation using principal component analysis. Transactions of the ASABE, 35 (5): 1597 - 1605.
185
PŘEHLED LITERATURY SATO, T.; KAWANO, S.; IWAMOTO, M., 1990: Detection of foreign fat adulteration of milk fat by near infrared spectroscopic method. Journal of Dairy Science, 73: 3408 - 3413 SILAGHI, F. A., GIUNCHI, A., FABBRI, A., RAGNI, L., 2010: Estimation of rheological properties of gelato by FT-NIR spectroscopy. Food Research International, 43: 1624 – 1628. SIVAKESAVA, S., IRUDAYARAJE, V., 2002: Rapid Determination of Tetracycline in Milk by FT-MIR and FT-NIR Spectroscopy. J. Dairy Sci, 85: 487 – 493. SKEIE, S., FETEN, G., ALMØY, T., ØSTLIE, H., ISAKSSON, T., 2006: The use of near infrared spectroscopy to predict selected free amino acids during cheese ripening. International Dairy Journal, 16: 236 – 242. SØRENSEN, L. K., JEPSEN, R., 1997: Detection of cheese batches exposed to Clostridium tyrobutyricum spoilage by near infrared spectroscopy. J. Near Infrared Spectrosc., 5: 91 - 97. SØRENSEN, L. K., JEPSEN, R., 1998a: Comparison of near infrared spectroscopic techniques for determination of semi-hard cheese constituents. Milchwissenschaft, 53 (9): 263-267. SØRENSEN, L. K., JEPSEN, R., 1998b: Assessment of Sensory Properties of Cheese by Near-infrared Spectroscopy. International Dairy Journal, 8: 863 - 871. SUN, D. W. 2008: Infrared Spectroscopy For Food Quality Analysis And Control, Elsevier - Academic Press, 448 p., ISBN: 978-0-12-374136-3, SØRENSEN, L., K., SNOR, L., K., 1998: Comparison of near infrared measuring techniques for cheese analyses. Near Infrared Spectroscopy: Prooceedings of the 9th International Conference, NIR Publications, p. 823 - 827. SPITZER, K., KÜNNEMEYER, R., WOOLFORD, M., CLAYCOMB, R., 2005: Online milk spectrometry: Analysis of bovine milk composition. Proceedings of SPIE – The International Society for Optical Engineering, 5852: 698 – 707. SULTANEH, A., ROHM, H., 2007: Using near infrared spectroscopy for the determination of total solids and protein content in cheese curd, International Journal of Dairy Technology, 60 (4): 241 – 244. SUNDARAM, J., KANDALA, CH. V., BUTTS, CH. L., CHEN, CH. Y., SOBOLEV, V., 2011: Nondestructive NIR Reflectance Spectroscopic Method for Rapid Fatty Acid Analysis of Peanut Seeds, Peanut Science,. 38 (2): 85 - 92.
186
PŘEHLED LITERATURY ŠAŠIĆ, S., OZAKI, Y., 2001: Short Wave Near-Infrared Spectroscopy of Biological Fluids. 1. Quantitative Analysis of Fat, Protein, and Lactose in Raw Milk by Partial Least-Squares Regression and Band Assignment. Analytical Chemistry, 73(1): 64 - 71. ŠIŠKANOVÁ, T., 2010: Potraviny, Přednášky z Analytické chemie II, [cit. 2012-0707]. Dostupné na: HTTP://ESO.VSCHT.CZ/CACHE_DATA/1293/WWW.VSCHT.CZ/ANL/PAN2/I/SYNOPSE13_2009.P DF
ŠUSTOVÁ, K., 2007: Appraisal of the influence of the temperature at the composition of cow's milk by FT NIR spectroscopy, Acta Univ. Agric. Silvic. Mendel. Brun., 55 (4): 95-101. ŠUSTOVÁ, K., BUCHAR, J., JANKOVSKÁ, R., KUBIŠ, I., SEDLÁČKOVÁ, M., 2002: VYUŽITÍ FYZIKÁLNÍCH METOD PŘI HODNOCENÍ TAVENÝCH SÝRŮ. SBORNÍK PŘEDNÁŠEK SEMINÁŘE „MLÉKO A SÝRY 2002“, PRAHA, P.187 191. ŠUSTOVÁ, K., KUCHTÍK, J., 2007: Stanovení obsahových složek kozího mléka pomocí FT NIR spektrometrie. Acta Univ. Agric. Silvic. Mendel. Brun., 60 (4): 103 109. ŠUSTOVÁ, K., KUCHTÍK, J., KRÁČMAR, S., 2006: Analysis of ewe's milk by FT Near Infrared spectroscopy: measurement of samples on Petri dishes in reflectance mode. Acta Univ. Agric. Silvic. Mendel. Brun., 59 (2): 131 - 138. ŠUSTOVÁ, K., RŮŽIČKOVÁ, J., KUCHTÍK, J., 2007: Application of FT Near Spectroscopy for Determination of True Protein and Casein in Milk. Czech J. Anim. Sci., 52 (9): 284 – 291. TABAYEHNEJAD, N., CASTILLO, M., PAYNE, F. A., 2012: Comparison of total milk-clotting activity measurement precision using the Berridge clotting time method and a proposed optical method. Journal of Food Engineering, 108: 549 – 556. TAKAMURA, H., ENDO, N., MATOBA, T., 1998: Near infrared spectroscopic determination of moisture content in foods: Extraction method by organic solvent. J. Near Infrared Spectrosc., 6: 235 - 240. TALPUR, F. N., BHANGER, M. I., KHOOHARO, A. A., ZUHRA MEMON, G., 2008: Seasonal variation in fatty acid composition of milk from ruminants reared under the traditional feeding system of Sindh, Pakistan. Livest Sci, 118:166–172. TANG, Y. K., HO, S. W. N., XU, R. J., 1997: Determination of fat, MSNF and sucrose contents in commercial ice-cream by Near infrared spectroscopy. Proceedings of the Nutrition Society of Australia, 21: 142.
187
PŘEHLED LITERATURY TENKL, L., ŠEC, K., KESNER, F., 2009: Infračervená spektroskopie - alternativní instrumentální technika při kontrole výroby. Kvasný průmysl, 55 (7–8): 188 - 191. TEPLÝ, M., MAŠEK, J., HAVLOVÁ, J., 1976: Syřidla živočišná a mikrobiální, 1 vydání SNL - Nakladatelství technické literatury, Praha:, 288 p., 04-812-76. THERMO FISHER SCIENTIFIC Inc., 2008: The Advantage of Resolution in the FTNIR Quantification of Fatty Acid Components in a Quaternary Mixture, [cit. 2012-0820]. Dostupné na: https://www.thermo.com/eThermo/CMA/PDFs/Product/productPDF_57592.PDF TRCHOVÁ, M., 2006: Jak vibrují atomy v molekulách, Ústav makromolekulární chemie Akademie věd ČR, [cit. 2012-08-1] Dostupné na: http://archiv.otevrenaveda.cz/users/Image/default/C1Kurzy/NH2006pdf/15.pdf TRILČOVÁ, A., ČOPÍKOVÁ, J., COIMBRA, M. A. BARROS, A. S., KŘÍSTKOVÁ, H., EGERT, L., SYNYTSYA, A., 2005: Využití infračervené spektroskopie při sledování kvality kakaového prášku. Chem.listy, 99: 821 - 824. TSENKOVA, R., 1999: Near infrared spectroscopy for cow milk composition analysis: influence mastitis, 9th International Conference of Near Infrared Spectroscopy – Towards the Third Millennium, Verona, p. 13 - 18. TSENKOVA, R., ATANASSOVA, S., OZAKI, Y., TOYODA, K., ITOH, K. 2001: Near-infrared spectroscopy for biomonitoring: influence of somatic cell count on cow’s milk composition analysis. International Dairy Journal, 11: 779 - 783. TSENKOVA, R., ATANASSOVA, S., TOYODA, K., OZAKI, Y., ITOH, K., FEARN, T. 1999: Near-Infrared Spectroscopy for Dairy Management: Measurement of Unhomogenized Milk Composition. J. Dairy Sci., 82: 2344 - 2351. TSENKOVA, R., ITOH, K., NATSUGA, M., HIMITO, J., 1995: Near infrared monitoring of biological objects on a dairy farm, p. 565 – 572. In:.DAVIES, A. M. C., WILIAMS, P. (ed): Near infrared Spectroscopy: The Future Waves, NIR Publications Chichester,.742 p. ISBN 0952866609. ULBERT, F., 2003: Milk and dairy products, p. 357 – 377. In: LEES, M. (ed): Food Traceability and Authenticity , Cambridge :Woodhead Publishing Ltd, 612 p. ,ISBN 1 85573 526 1. USTUNOL, Z., HICKS, C. L., PAYNE. F. A., 1991: Diffuse reflectance profiles of eight milk-clotting enzyme preparations. J Food Sci, 56 (2): 411 – 415. VALNÍČEK, B., 2006: Nová spektroskopie. p. 55 - 58. In: FOLTA, J. (ed): Dějiny vědy a techniky 14. - Rozpravy NTM 200, Národní technické muzeum, Praha, 153 p.
188
PŘEHLED LITERATURY VAN DE VOORT, F. R., 1992. Fourier Transform infrared spectroscopy applied to foodanalysis. Food Res. International, 25: 397 – 403. VAN REUSEL, A.; KLIJN, C. J., 1987: Dye binding method for determination of protein content of milk. Rapid indirect methods for measurement of the major components of milk. International Dairy Federation: Brussels, Belgium, Chapter 3. VAN REUSEL, A., OGER, R., 1987: Turbidimetric determination of the fat content of milk. Rapid indirect methods for measurement of the major components of milk; International Dairy Federation: Brussels, Belgium, Chapter 5. VENKATESAN, P., DHARUMAN, C., GUNASEKARAN, S., 2011: A comparative study of principal component regression and partial least squares regression with application to FTIR diabetes data, Indian J.Sci.Technol., 4 (7): 740 – 746. VERBIESE, Y. 1981:Mesure d’humidite´ en continu par absorption infrarouge dans les industries agro-alimentaires et alimentaires (On-line moisture determination by infrared absorption in food industry). Ind. Alimen. Agric, 9: 759 - 768. VOLKA, K., et al, 1997: Analytická chemie I, Praha: VŠCHT, 228 p., ISBN 80-7080245-6. VUATAZ, G., 1990: Some NIR observation of laktose crystallization in milk powders during storage. In: R. Biston and N. Bastiaux-Thill (ed) Proceedings 3 rd Int. Conf. On Near-In-frared Spectroscopy. Agricultural Researchg Centre Publishing, Gembloux, Belgium, p. 218 - 234. WALCZAK, B., MASSART, D. L., 1998: Multiple outlier detection revisited, Chemometrics and Intelligent Laboratory Systems, 41: 1 - 15. http://meloun.upce.cz/docs/lecture/chemometrics/slidy/47da.pdf WANG, T. Z, ZHENG, L. M., TIAN, L. J., WU, P., ZHU, H., REN, F. Z., 2010: Analysis of milk and dairy products by near-infrared spectroscopy: a Review, Spectroscopy and spectral analysis, 30 (12): 3208 - 3212. WEAVER, R. W. V., 1984: Near infrared reflectance analysis applied to dairy products. Abstracts of Papers; Challenges to contemporary dairy analytical techniques; Royal Society of Chemistry: Reading, U.K. WEHLING, R. L., 2010: Infrared Spectroscopy, p. 413 - 424. In: NIELSEN, S. S.: Food Analysis, 4th ed., Cluwer Academic, Plenum Published, New York,. 550 p., ISBN 978-1-4419-1477-4. WEHLING, R. L., PIERCE, M. M., 1988: Determination of moisture in Cheddar by Nera infrared reflectance spectroscopy, J. Assoc. Off.Anal.Chem, 71: 571 - 574.
189
PŘEHLED LITERATURY WILLIAMS, P. C., STEVENSON, S. G., 1990: Near-infrared reflektance analysis: food industry applications, Elsevier Trends journals, p. 44 - 48. WILSON, R. H., 1994: Spectroscopic Techniques for Food Analysis, Wiley-VCH Verlag GmbH, 246 p., ISBN 1560810378. WITTRUP, CH., NØRGAARD, L., 1998: Rapid Near Infrared Spectroscopic Screening of Chemical Parameters in Semi-hard Cheese Using Chemometrics. J. Dairy Sci., 81 (7): 1803 - 1809. WOO, Y. A., TERAZAWA, Y., CHEN, J. Y., IYO, C., TERADA, F., KAWANO, S. 2002: Development of a new measurement unit (MilkSpec-1) for rapid determination of fat, laktose, and protein in raw milk using near-infrared transmittance spectroscopy. Applied Spectroscopy, 56: 599 – 604. WOODCOCK, T., FAGAN, C., O’DONNELL, C., DOWNEY, G., 2008: Application of Near and Mid-Infrared Spectroscopy to Determine Cheese Quality and Authenticity. Food and Bioprocess Technology, 1 (2): 117 - 129. WORKMAN, J., 2005: An Introduction to Near Infrared Spectroscopy, [cit. 2012-07 14]. Dostupné na: http://www.spectroscopynow.com/details/education/sepspec1881education/AnIntroduction-to-Near-Infrared-Spectroscopy.html?tzcheck=1#Refs WORKMAN, J., WEYER, L., 2008: Practical Guide to Interpretive Near-Infrared Spectroscopy, Taylor & Francis Group, LLC, 332 p., ISBN 978-1-57444-784-2, WU, D., FENG, S., HE, Y.: Infrared Spectroscopy Technique for the Nondestructive Measurement of Fat Content in Milk Powder. J. Dairy Sci, 2007, 90 (8): 3613 - 3619. WU, D., HE, Y., FENG, S., 2008: Short-wave near-infrared spectroscopy analysis of major compounds in milk powder and wavelength assignment, Analytica Chimica Acta, 610 (2):.232 – 242. YANG, J. H., WANG, J. Q., YANG, Y. X., BU, D. P., SUN, P., ZHOU, L. Y., YUAN, T. J., ZHANG J. X., 2012: Qualitative identification of cow, buffalo, and yak milks using near infrared spectroscopy (NIRS). Dairy Sci., 95 (2): 22 - 26. ZDŘÁLEK, P., 2007: Využití matematických metod při vyhodnocení zkoušek asfaltových směsí, [cit. 2012-07-09]. Dostupné na: http://www.fce.vutbr.cz/veda/JUNIORSTAV2007/pdf/Sekce_2.3/Zdralek_Petr_CL%28 2%29.pdf ZOU, Q., FANG, H., ZHANG, W., HE, Y., 2011: Application of near infrared spectroscopy (NIR) for evaluating cheese quality, Spectroscopy and spectral analysis, 31 (10): 2725 - 2729. 190
SEZNAM TABULEK
8 SEZNAM POUŽITÝCH TABULEK Tab. 1 Rozdělní infračervené oblasti (OSBORN, FEAM, 1986)….......................... Tab. 2 Vývoj nárůstu počtu publikací o aplikaci NIR spektroskopie (RODRIGUEZ – OTERO et al., 1997b; PASQUINI, 2003; KARLBERG, 2006…………………………………………………………………....................... Tab. 3 Oblasti použití NIR kvantitativních aplikací v potravinářském průmyslu (citace uvádí MANLEY et al., 2008)…………………………………….……...... Tab. 4 Oblasti použití NIR kvalitativních aplikací v potravinářském průmyslu (citace uvádí REID, et al. 2006; MANLEY et al., 2008).......................................... Tab. 5 Referenční hodnoty pro kalibrace mastných kyselin (MK) ovčího mléka %…………………………………..………………………………………. Tab. 6 Referenční hodnoty pro rekalibraci a kalibraci složek kozího mléka v %..................................................................................................................……... Tab. 7 Referenční hodnoty mražených krémů v %................................................. Tab. 8 Referenční hodnoty složek a fyzikálních vlastností Olomouckých tvarůžků…………………………………………………………………….……... Tab. 9 Referenční hodnoty složek a fyzikálních vlastností sladké sušené syrovátky…………………………………………………………………………... Tab. 10 Referenční hodnoty pH syřidel….……………………………………….. Tab. 11 Referenční hodnoty kalibrovaných parametrů syřidel skladovaných v lednici……………………………………………………………………………. Tab. 12 Referenční hodnoty kalibrovaných parametrů syřidel skladovaných při pokojové teplotě ………………………………………………………...…….. Tab. 13 Referenční hodnoty kalibrovaných parametrů sýřenin..…...………..…..... Tab. 14 Úprava spekter a regionů vybraných oblastí vlnočtů pro kalibrace obsahu mastných kyselin obsažených v tuku ovčího mléka ………..……………………. Tab. 15 Kalibrační výsledky mastných kyselin obsažených v tuku ovčího mléka.......................................................................................................................... Tab. 16 Validační výsledky mastných kyselin (MK) ovčího mléka ….............. Tab. 17 Statistické vyhodnocení mastných kyselin obsažených v tuku ovčího mléka………………………………………………………………………………. Tab. 18 Srovnání kalibračních a validačních výsledků mastných kyselin v tuku ovčího mléka získaných ALBANELLEM et al. (2007) a námi………………….. Tab. 19 Úprava spekter a regionů pro vybrané oblasti vlnočtů pro kalibraci kozího mléka ………………………………………………………………......................... Tab. 20 Kalibrační výsledky pro složky kozího mléka.………………..………….. Tab. 21 Validační výsledky pro složky kozího mléka …....................................... Tab. 22 Statistické vyhodnocení jednotlivých kalibrovaných složek kozího mléka….………………………………………………………………………….... Tab. 23 Srovnání kalibračních, validačních výsledků a PLS faktorů před rekalibrací vytvořených kalibrací složek kozího mléka..…….…………….............
191
13
30 32 50 79 80 81 82 83 84 84 85 86 95 96 97 101 102 104 105 106 108 109
SEZNAM TABULEK Tab. 24 Úprava spekter a regionů vybraných oblastí vlnočtů pro kalibrace mražených krémů………….…………………………………………………....….. Tab. 25 Kalibrační výsledky kalibrovaných složek mražených krémů…………… Tab. 26 Validační výsledky jednotlivých složek mražených krémů..……………... Tab. 27 Statistické vyhodnocení kalibrovaných složek mražených krémů t - testem………………………………………………………………….....……... Tab. 28 Úprava spekter a regionů vybraných oblastí vlnočtů pro kalibrace Olomouckých tvarůžků………....…………………………………..……………… Tab. 29 Kalibrační výsledky hodnot Olomouckých tvarůžků..……………............ Tab. 30 Validační výsledky Olomouckých tvarůžků….....………………………... Tab. 31 Statistické vyhodnocení jakostních parametrů Olomouckých tvarůžků….. Tab. 32 Úprava spekter a regionů pro vybrané oblasti vlnočtů pro kalibraci sušené sladké syrovátky………………………………………………………….………... Tab. 33 Kalibrační výsledky stanovovaných parametrů sušené sladké syrovátky…………………………………………………………………………… Tab. 34 Validační výsledky stanovovaných parametrů sušené sladké syrovátky……………………………………………………………………...……. Tab. 35 Statistické vyhodnocení kalibrovaných parametrů sušené sladké syrovátky………………………………...…………………………………………. Tab. 36 Použité regiony pro vytvoření kalibračních modelů DA při určení stáří syřidel (čerstvá a 3 měsíce skladovaná v lednici)………………………………...... Tab. 37 Kalibrační a validační výsledky pro stanovení pH syřidel…….……...…... Tab. 38 Statistické vyhodnocení jednotlivých parametrů syřidel….………………. Tab. 39 Úprava spekter a regionů pro vybrané oblasti vlnočtů pro kalibraci syřidel…………………………………………...………………………………..... Tab. 40 Kalibrační výsledky pro jednotlivé parametry syřidel…….…….………... Tab. 41 Validační výsledky pro jednotlivé parametry syřidel….….…….………… Tab. 42 Statistické vyhodnocení jednotlivých parametrů syřidel….....…………..... Tab. 43 Úprava spekter a regionů pro vybrané oblasti vlnočtů pro kalibraci syřidel při pokojové teplotě………………………………………………………………... Tab. 44 Kalibrační výsledky pro jednotlivé parametry syřidel při pokojové teplotě.....………………………………...………………………………………… Tab. 45 Validační výsledky pro jednotlivé parametry syřidel při pokojové teplotě…………………………………………...…………………………………. Tab. 46 Statistické vyhodnocení parametrů syřidel při pokojové teplotě.……...…. Tab. 47 Úprava spekter a regionů pro vybrané oblasti vlnočtů pro kalibraci sýřenin....……………….………………...………………………………………… Tab. 48 Kalibrační výsledky pro jednotlivé parametry sýřenin….……….……...... Tab. 49 Validační výsledky pro jednotlivé parametry sýřenin……..……..……..… Tab. 50 Statistické vyhodnocení jednotlivých parametrů sýřenin…...…..…..……..
192
113 113 114 115 122 123 124 126 133 134 134 137 142 144 145 145 146 146 148 150 150 150 153 157 158 158 160
SEZNAM OBRÁZKŮ
9 SEZNAM POUŽITÝCH OBRÁZKŮ 14 Obr. 1 Znázornění modelu harmonického oscilátoru (MILDE, 2008)…….……… Obr. 2 Znázornění křivky průběhu potenciální energie harmonického 15 a anharmonického oscilátoru (KLOUDA, 2003) ...……………………………….. Obr. 3 Různé druhy vibrací skupiny – CH2 – (MILDE, 2008)…...……….………. 16 18 Obr. 4 Elektromagnetické spektrum (dle PENNER, 1994)……………………….. Obr. 5 Schéma jedno paprskového disperzního infračerveného spektrometru (1. Zdroj záření, 2. Chopper (rotující zrcadlové segmenty), 3. Kyveta se vzorkem, 4. Srovnávací prostředí, 5. Monochromátor, 6. Detektor, 7. Vyhodnocovací zařízení 21 (KLOUDA, 2003)…………………………………………………………………. Obr. 6 Schematické znázornění interference dvou monochromatických vlnění Michalsonově interferometru a jeho převedení spektrum (dle KLOUDA, 23 2003)……………………………………………………….…………………….… 27 Obr. 7 Metody získávání NIR spekter (dle KAWANO, 2002)…………………..... Obr. 8 Kvantitativní NIRS kalibrace (převzato z HURBURGH et IGNE, 63 2010)………………………………………………………………………….……. 65 Obr. 9 NIR spektrum sušené syrovátky…...……………………………………….. Obr. 10 První a) a druhá b) derivace NIR spektra sušené syrovátky……………….
66
Obr. 11 Grafické znázornění metody nejmenších čtverců………………………….
69
Obr. 12 Znázornění aplikace diskriminační analýzy……………………...………... Obr. 13 Průběh NIR spekter ovčího mléka s maximálním a minimálním obsahem kys. palmitové a kys. olejové. S vyznačením oblastí a vlnových délek charakteristických pro absorpční skupiny tuku…………………..…..…………...... Obr. 14 Funkce PRESS pro stanovení kys. myristové v tuku ovčího mléka s počtem 10 PLS faktorů ..………………….………………..………………………………. Obr. 15 Kalibrační a validační modely pro stanovení zastoupení kys. kaprinové v tuku ovčího mléka………………………………………………….......................... Obr. 16 Kalibrační a validační modely pro stanovení zastoupení kys. laurové v tuku ovčího mléka………………………………………………………..…..................... Obr. 17 Kalibrační a validační modely pro stanovení zastoupení kys. kristové v tuku ovčího mléka….………………………………………………………………....….. Obr. 18 Kalibrační a validační modely pro stanovení zastoupení kys. palmitové v tuku ovčího mléka….…………………………………………………………….. Obr. 19 Kalibrační a validační modely pro stanovení zastoupení kys. stearové v tuku ovčího mléka……………………………………………………….....………......... Obr. 20 Kalibrační a validační modely pro stanovení zastoupení kys. olejové v tuku ovčího mléka……………………………………………………..….….……….…. Obr. 21 Průběh NIR spekter kozího mléka s maximálním a minimálním obsahem bílkovin…………………………………………………..….....................................
70
193
95 97 98 99 99 99 100 100 104
SEZNAM OBRÁZKŮ
Obr. 22 Funkce PRESS pro stanovení tuku v kozím mléce s počtem 10 PLS faktorů.……………………………………………………………………………… Obr. 23 Kalibrační a validační modely pro stanovení bílkovin v kozím mléce........... Obr. 24 Kalibrační a validační modely pro stanovení tuku v kozím mléce……......... Obr. 25 Kalibrační a val. modely pro stanovení laktosy v kozím mléce....................... Obr. 26 Kalibrační a val. modely pro stanovení tukuprosté sušiny v kozím mléce….. Obr. 27 NIR spektra mraženého krému měřeného v kádince a Petriho misce...... Obr. 28 Funkce PRESS pro stanovení sušiny v mražených krémech metodou v Petriho misce se zrcátkem h = 0,3 mm s počtem 7 PLS faktorů…...…………….. Obr. 29 Kalibrační a validační výsledky pro stanovení sušiny metodou v kádince... Obr. 30 Kalibrační a validační výsledky pro stanovení sušiny metodou Petriho misce se zrcátkem h = 0,3 mm………………………...…...……………………….. Obr. 31 Kalibrační a validační výsledky pro stanovení tuku metodou v kádince..... Obr. 32 Kalibrační a validační výsledky pro stanovení tuku metodou Petriho misce se zrcátkem h = 0,3 mm…..………………………………………………….. Obr. 33 Kalibrační a validační výsledky pro stanovení bílkovin metodou v kádince……………………………………………………………………………. Obr. 34 Kalibrační a validační výsledky pro stanovení bílkovin metodou Petriho misce se zrcátkem h = 0,3 mm….……….……………………………...………….. Obr. 35 NIR spektra Olomouckých tvarůžků v různé fázi výroby a skladování za rozdílných teplot…………………………...……………………………………….. Obr. 36 NIR spektra Olomouckých tvarůžků ve tvaru tyčinek a koleček, vyrobených z jarního a letního mléka…………….………………………………......................... Obr. 37 Průběh funkce PRESS kalibrace NaCl při 20 °C s počtem PLS faktorů 8... Obr. 38 Grafické vyjádření závislosti kalibračních a validačních výsledků pro stanovení pH při 5 °C…………………………………………...……………….. Obr. 39 Grafické vyjádření závislosti kalibračních a validačních výsledků pro stanovení NaCl při 20 °C……………..…………...…………………………….. Obr. 40 DA pro tvarůžky před balením (□) a konci doby trvanlivosti (∆)……. Obr. 41 DA spekter tvarůžků skladovaných při 5 °C (□) a 20 °C (∆)………………. Obr. 42 Diskriminační analýza spekter tvarůžků skladovaných ve fázi tvarování (∆) a osušení (□)…………………………………………….….……………………... Obr. 43 Diskriminační analýza spekter tvarůžků ve tvaru koleček (∆) a tyčinek (□)………………………………………………………………………….. Obr. 44 Diskriminační analýza spekter tvarůžků vyrobených z jarního (∆) a letního (□) mléka……………………………………………………………………………... Obr. 45 Ukázka spektra sušené syrovátky s různým obsahem bílkovi…...…………... Obr. 46 Průběh funkce PRESS pro stanovení bílkovin v sušené sladké syrovátce s optimálním počtem PLS faktorů 8….…………...………………………………... Obr. 47 Kalibrační a validační modely pro stanovení sušiny sušené sladké syrovátky…………………………………………………………….…………….....
194
105 107 107 107 108 112 114 116 117 117 117 118 118 121 121 123 125 125 128 128 129 130 131 132 133 135
SEZNAM OBRÁZKŮ Obr. 48 Kalibrační a validační modely pro stanovení obsahu vody sušené sladké syrovátky …………………………..…………...………………………………........ Obr. 49 Kalibrační a validační modely pro stanovení obsahu bílkovin sušené sladké syrovátky……………………………………………………….……………………... Obr. 50 Kalibrační a validační modely pro stanovení pH sušené sladké syrovátky…………………………………………………………………………..... Obr. 51 Kalibrační a val. modely pro stanovení SH sušené sladké syrovátky….. Obr. 52 NIR spektrum syřidla ředěného 5% a neředěného. …………………... Obr. 53 DA syřidla ředěného 5% (∆) a neředěného (□)………………………… Obr. 54 NIR spektra syřidla získané různými technikami měření: světle modré spektrum – optická sonda (interactance), tmavomodré a fialové spektrum-integrační sféra (reflektance), červené spektrum - kyveta (transmitance); Schematické znázornění odrazu či průchodu záření u jednotlivých technik měření........…………………………..…………...………………………………....... Obr. 55 Diskriminační analýza různých technik měření syřidel (□) optická sonda, (o) kyveta a zrcátko s výškou 0,2 a 0,3 mm (∆)……………………….…………… Obr. 56 Diskriminační analýza syřidel měřených otevření a třech měsících v lednici v režimu reflektance optické sféře se zrcátkem s výškou A) 2 mm a B) 3 mm .………………………………………………………………………….... Obr. 57 Diskriminační analýza syřidel měřených otevření a třech měsících v lednici C) v režimu transmitance s využitím transflektanční kyvety s optickou drahou 1mm, D) v režimu interactance pomocí optické sondy…………………….. Obr. 58 Průběh funkce PRESS pro stanovení pH syřidel s optimálním počtem PLS faktorů 10………………………..…………...…………………………………….. Obr. 59 Kalibrační a validační modely pro pH syřidla.……………….…………… Obr. 60 Průběh funkce PRESS pro kalibraci síly syřidla s optimálním počtem PLS 10……………………………………………………………………………..... Obr. 61 Grafické znázornění kalibračních a validačních výsledků pro stanovení času koagulace mléka syřidlem skladovaným v lednici………………………………... Obr. 62 Grafické znázornění kalibračních a validačních výsledků pro stanovení síly syřidla skladovaného v lednici…….………………………………………….......... Obr. 63 Grafické znázornění kalibračních a validačních výsledků pro stanovení dávky syřidla skladovaného v lednici………………………………………………. Obr. 64 Funkce PRESS dávky syřidla s nejvíce klesajícím trendem s optimálním počtem PLS faktorů 5…….……………………………………………………….... Obr. 65 Grafické znázornění kalibračních a validačních výsledků pro stanovení času koagulace mléka syřidlem skladovaným při pokojové teplotě…...……………….. Obr. 66 Grafické znázornění kalibračních a validačních výsledků pro stanovení síly syřidla skladovaného při pokojové teplotě.……………….…………………………. Obr. 67 Grafické znázornění kalibračních a validačních výsledků pro stanovení dávky syřidla skladovaného při pokojové teplotě…..……………………………....
195
135 135 136 136 140 141
141 142
142
143 144 146 148 148 149 151 152 152 152 152
SEZNAM OBRÁZKŮ Obr. 68 Diskriminační analýza jednotlivých syřidel (1 - pepsinové přírodní syřidlo o deklarované síle 1:10 000, 2 – chymosinové přírodní syřidlo o deklarované síle 1:5 000, 3 – chym. přír. syřidlo o deklarované síle 150 IMCU/ml, 4 - chym. přír. syřidlo o deklarované síle 145 IMCU/ml, 5 - chymosinové mikrobiálné syřidlo o deklarované síle 950 IMCU/ml, 6 – chym. mikrob. syřidlo o deklarované síle 1 000 IMCU/ml) a průměrné NIR spektra syřidel…………………………………… Obr. 69 Diskriminační analýza pro rozlišení chymosinových (□) a pepsinových syřidel (∆). NIR spektrum pepsinového a chymosinového syřidla….…………….... Obr. 70 Diskriminační analýza pro rozlišení přírodních (□) a mikrobiálních syřidel (∆). NIR spektrum přírodního a mikrobiálního syřidla………….………………….. Obr. 71 Diskriminační analýza pro rozlišení stáří syřidel: Syřidlo otevření (∆), staré 3 měsíce (□) a 6 měsíců (o) a průběh NIR spekter v celém regionu syřidel měřených otevření a 3 a 6 měsících skladování…...……………………….... Obr. 72 Funkce PRESS pro stanovení obsahu sušiny sýřeniny s 6 PLS faktory…. Obr. 73 Kalibrační a validační modely pro sušinu sýřeniny…...…………….….…. Obr. 74 Kalibrační a validační modely pro výtěžnost sýřeniny……………….….... Obr. 75 Diskriminační analýza sýřenin vyrobených různými syřidly…………..…..
196
154 155 155
156 158 159 159 159
SEZNAM ZKRATEK
10 SEZNAM POUŽITÝCH ZKRATEK a
koeficient regresní přímky, v prostoru CIELab je to osa od červené do zelené barvy
AMK
aminokyselina
Asp
kyseli asparágová
α
hladi významnosti (α = 0,05), pravděpodobnost chyby prvního druhu,teoretická (předpokládaná) hodnota koeficientu a
b
koeficient regresní přímky, optická tloušťka absorbujícího prostředí, v prostoru CIELab je to osa od modré do žluté barvy
B
bílkoviny
bx ± a
parametry regresní rovnice
Cit
citrulin
CCSWA
common component and specific weights analysis)
CCV
kalibrační validační koeficient (%)
CLA
konjugovaná kys. linolová
CLS
klasická metoda nejmenších čtverců
ČSN
česká státní norma
δ
deformační vibrace, dráhový rozdíl
DA
diskriminační analýza (Discriminant analysis)
DA- PLS
metoda diskriminační analýzy spojená s využitím algoritmu nejmenších čtverců (partial least squares discriminant analysis)
DF
dietní vláknina
DTGS
deuterovaný triglycinsulfát – detektor
ελ
molární absorpční koeficient i-té složky při dané vlnové délce λ
FDA
faktorová diskriminační analýza
FT
Fourierova transformace
FIR
daleká infračervená oblast
Glu
kyseli glutamová
Gly
glycin
h
Planckova konstanta (6,626*1031 J/s), h = 0,2 a 0,3 mm – výška kovového zrcátka
197
SEZNAM ZKRATEK His
histidin
H0
nulová hypotéza (μ = μ1 = μ2)
IČ
infračervené spektrum
I DET
intenzita signálu z detektoru
IMCU
mezinárodní jednotka koagulace mléka (International milk coagulating units)
IR
infračervená spektroskopie, FTIR, FT IR
IS
integrační sféra spektrofotometru sloužící k měření vzorků (princip difúzní polokoule)
K
kádinka
KTJ
kolonie tvořících jednotek (KTJ/mL)
L
v prostoru CIELab je L světlost barvy
LF – NMR
nukleárně resonanční reflaxometrie (Low-field nuclear magnetic resonance spectroscopy)
LDA
lineární diskriminační analýza
LS – SVM
Lest squares – support vector machine
ν
frekvence elektromagnetického záření (Hz), valenční vibrace, frekvence oscilátoru
λ
vlnová délka
max
maximální hodnota
Met
methionin
min
minimální hodnota
MIR
střední infračervená oblast (middle infrared), FT MIR
MLR
vícenásobná lineární regrese (multiple linear regression)
MPLS
modifikovaná metoda částečných nejmenších čtverců
MTC
detektor mercury – cadmium – telluride
N
počet kalibračních vzorků
n
vibrační kvantové číslo (n = 0, 1, 2,…)
NIR
blízká infračervená oblast, FTNIR, FT NIR
NIRS
spektroskopie v blízké infračervené oblasti
Orn
ornithin
PC
souřadnicový systém hlavních komponent (principal component)
198
SEZNAM ZKRATEK PCA
analýza hlavních komponent (principal component analysis)
PCR
metoda hlavních komponent (principal component regression)
PCV
predikční variační koeficient (prediction coefficient of variation) (%)
PE
polyethylen
PLS
metoda částečných nejmenších čtverců, počet faktorů (partial least squares)
PSB
počet somatických buněk
PRESS
předpovězené reziduální chyby metody PLS (predicted residual error sum of squares)
R
korelační koeficient
R2
koeficient determinace
RMSECV
průměrná kvadratická chyba křížové validace (Root mean square error of cross validation)
RPD
zbytková odchylka predikce (residual prediction deviation)
RV
korelační koeficient validace
S
sušina
Sc
sken (scan)
SEC
směrodatná odchylka kalibrace (standard error of calibration)
SECV
směrodatná odchylka křížové validace (standard error in cross validation)
SEP
směrodatná odchylka validace (standard error of predictiontion)
Ser
serin
σ
vlnočet (cm-1)
SH
titrační kyselost ve stupních Soxhlet Henkel
SIMCA
metoda nezávislého modelování tříd analogů (Soft independent modeling of class analogy)
SNV
korekce rozptylu záření
Sx
směrodatná odchylka průměru
T
tuk
t-test
statistický test
Thr
threonin
tkrit(1)
tabulková hodnota při α = 0,05
199
SEZNAM ZKRATEK tkrit(2)
tabulková hodnota při α = 0,01
tstat
statistika t-test
TGS
triglycinsulfát – detektor
TvS
obsah tuku v sušině
UV/VIS
oblast ultrafialového záření, UV - VIS (ultraviolet/visible)
ν
frekvence oscilátoru
Val
valin
xNIR
průměrná hodnota předpověděná z NIR spektra
xp
průměr laboratorních hodnot složky
xREF
průměrná referenční hodnota
Z
zrcátko
200
PŘÍLOHY
PŘÍLOHY
201
PŘÍLOHY
Obr. 1 Významné události, které vedly k rozvoji FT IR spektroskopie (DERRICK, 1999).
202
PŘÍLOHY
Obr. 2 Infračervené spektrum (MILDE, 2008).
Obr. 3 Režim transmitance (MILDE, 2008).
Obr. 4 Režim reflektance (MILDE, 2008).
203
PŘÍLOHY
Obr. 5 Spektrofotometr FT NIR Antaris.
a)
b)
Obr. 6 a)Měření integrační sféře, kovová zkrátka s různou výškou reflexní plochy, Sample
Cup
Spinner
a rotující
kompresní
spektrofotometru FT NIR Antaris
Obr. 7 Optická sonda FT NIR Antaris.
204
kyveta,
b)
kyvetový
prostor
PŘÍLOHY
Obr. 8 Měření ovčího a kozího mléka pomocí integrační sféře se zrcátkem s reflexní výškou 0,3 mm.
Obr. 9 Měření mražených krémů integrační sféře a) v kádince b) v Petriho misce se zrcátkem s reflexní výškou 0,3 mm.
Obr. 10 Měření Olomouckých tvarůžků v rotační kyvetě integrační sféře.
205
PŘÍLOHY
Obr. 11 Měření sušené sladké syrovátky pomocí optické sondy.
Obr. 12 Analyzovaná syřidla.
Obr. 13 Měření syřidla integrační sféře pomocí zrcátka 2.
Obr. 14 Měření syřidla v transflektanční kyvetě
206
PŘÍLOHY
Obr. 15 Měření syřidla optickou sondou.
Obr. 16: Grafické vyjádření závislosti kalibračních a validačních výsledků pro stanovení pH u Olomouckých tvarůžků při 20 °C.
Obr. 17: Grafické vyjádření závislosti kalibračních a validačních výsledků pro stanovení SH u Olomouckých tvarůžků při 5 °C.
207
PŘÍLOHY
Obr. 18: Grafické vyjádření závislosti kalibračních a validačních výsledků pro stanovení SH u Olomouckých tvarůžků při 20 °C.
Obr. 19: Grafické vyjádření závislosti kalibračních a validačních výsledků pro stanovení NaCl u Olomouckých tvarůžků při 5 °C.
Obr. 20: Grafické vyjádření závislosti kalibračních a validačních výsledků pro stanovení sušiny u Olomouckých tvarůžků při 5 °C.
208
PŘÍLOHY
Obr. 21: Grafické vyjádření závislosti kalibračních a validačních výsledků pro stanovení sušiny u Olomouckých tvarůžků při 20 °C.
Obr. 22: Diskriminační analýza spekter šesti různých syřidel bez úpravy spektrálního regionu.
Obr. 23: Sýřeniny získané syřidlem čerstvým a 3 a 6 měsíců skladovaným v lednici.
209
