MASARYKOVA UNIVERZITA Přírodovědecká fakulta

MASARYKOVA UNIVERZITA Přírodovědecká fakulta

Ivo PAPOUŠEK MOLEKULÁRNĚ-GENETICKÉ ANALÝZY DRUHŮ RODU CARASSIUS VE STŘEDNÍ EVROPĚ

Disertační práce

Školitel: prof. RNDr. Jiřina Relichová, CSc. Školitel-specialista: RNDr. Věra Lusková, CSc.

Brno, 2008

Bibliografická identifikace

Jméno a příjmení autora: Mgr. Ivo Papoušek Název disertační práce:

Molekulárně-genetické analýzy druhů rodu Carassius ve střední Evropě

Název disertační práce anglicky:

Molecular-genetic analyses of Carassius species in the central Europe

Studijní program:

Biologie

Studijní obor (směr), kombinace oborů: Obecná a molekulární genetika Školitel:

prof. RNDr. Jiřina Relichová, CSc.

Školitel-specialista: RNDr. Věra Lusková, CSc. Rok obhajoby:

2008

Klíčová slova v češtině:

Carassius, Carassius auratus, genetická diverzita, sekvencování, mtDNA, kontrolní oblast, cytochrom b, mikrosatelity, hybridizace

Klíčová slova v angličtině:

Carassius, Carassius auratus, genetic diversity, sequencing, mtDNA, control region, cytochrome b, microsatellites, hybridization

© Ivo Papoušek, Masarykova univerzita, 2008

Rád bych poděkoval své školitelce prof. RNDr. Jiřině Relichové, CSc., školitelcespecialistce RNDr. Věře Luskové, CSc., a doc. Ing. Stanislavu Luskovi, CSc. za vedení mé disertační práce a nesčetné podnětné rady, příspěvky a připomínky, trpělivost a ochotu. Dále děkuji všem svým spolupracovníkům z Ichtyologického oddělení Ústavu biologie obratlovců AV ČR, v. v. i., Karlu Halačkovi, Janu Mendelovi, Lukáši Vetešníkovi, Evě Bartoňové, Janu Kociánovi a Miroslavu Prokešovi, kteří prováděli sběry vzorků, morfometrické a karyologické analýzy, vytvářeli nedocenitelné pracovní prostředí a předávali mi své zkušenosti a cenné rady. Děkuji rovněž zahraničním kolegům Ladislavu Pekárikovi a Jánu Koščovi za poskytnuté vzorky a podněty, které přispěly k řešení studované problematiky. Největší díky patří mé rodině a přátelům za dlouhodobou podporu a porozumění, nejen při přípravě této práce, ale ve všech oblastech mého života.

Prohlašuji, že jsem tuto práci vypracoval samostatně. Veškerou literaturu a ostatní prameny, z nichž jsem při přípravě práce čerpal, řádně cituji a uvádím v seznamu použité literatury.

Abstrakt V oblasti střední Evropy se vyskytují dva druhy rodu Carassius: nativní karas obecný (Carassius carassius Linnaeus 1758) a nepůvodní karas stříbřitý (Carassius auratus Linnaeus 1758), který je považován za jeden z nejúspěšnějších invazivních druhů ve vodách Evropy. V oblasti biologie a taxonomie forem, které jsou souhrnně označovány jako „karas stříbřitý“, však stále existuje mnoho nejasností. V předkládané práci byla studována genetická diverzita komplexu karasa stříbřitého (Carassius auratus) technikami přímého sekvencování dvou úseků mitochondriální DNA: kontrolní oblasti a genu pro cytochrom b. Molekulárně-genetické analýzy prokázaly ve vodách České republiky a Slovenska přítomnost čtyř oddělených fylogenetických linií, které odpovídají čtyřem formám komplexu karasa stříbřitého. Jsou to formy Carassius auratus gibelio, Carassius auratus auratus, Carassius auratus langsdorfii a čtvrtá forma neznámé identity. Zjištěná vysoká genetická diverzita může mít souvislost s vysokou invazivní úspěšností karasa stříbřitého. Analýza čtyř mikrosatelitových markerů potvrdila hybridizaci mezi karasem obecným a formou Carassius auratus gibelio v oblasti dolního toku řeky Dyje. Analýza mitochondriální DNA prokázala, že jde o produkty jednosměrného křížení samců C. carassius a samic formy C. a. gibelio. Jedná se o první záchyt těchto hybridů na území České republiky. Analýza šesti mikrosatelitových markerů a sekvencování mitochondriální DNA populace karasa stříbřitého z umělého mokřadu v zátopovém pásmu řeky Moravy prokázaly koexistenci dvou klonálních linií karasa stříbřitého, odpovídajících formám Carassius auratus gibelio a Carassius auratus langsdorfii.

Dissertation abstract Two species of the genus Carassius occur in the central Europe: the native crucian carp (Carassius carassius Linnaeus 1758) and the non-indigenous silver crucian carp (Carassius auratus Linnaeus 1758), which is considered to be one of the most successful invasive species in the waters of the Europe. However, there is still much confusion in the field of biology and taxonomy of forms, which are collectively labeled as the „silver crucian carp“. In the proposed thesis, genetic diversity of the silver crucian carp (Carassius auratus complex) has been studied by methods of direct sequencing of two segments of the mitochondrial DNA: the control region and the cytochrome b gene. Molecular-genetic analyses have proven existence of four distinct phylogenetic lineages, which correspond to four forms of the silver crucian carp complex, in the waters of the Czech Republic and Slovakia. Those forms are Carassius auratus gibelio, Carassius auratus auratus, Carassius auratus langsdorfii and a fourth form of unknown identity. Uncovered high genetic diversity could relate to the high level of invasive success of the silver crucian carp. Analysis of four microsatellite markers has confirmed hybridization between the crucian carp and the Carassius auratus gibelio form in the lower reach of the Dyje River. Analysis of the mitochondrial DNA proved that those hybrids resulted from unidirectional hybridization between C. carassius males and C. a. gibelio females. Such hybrids have been found on the territory of the Czech Republic for the first time. Analysis of six microsatellite markers together with sequencing of the mitochondrial DNA in a silver crucian carp population from an artificial wetland in the Morava River floodplain have proven a coexistence of two clonal lineages of the silver crucian carp in the wetland. Those two lineages correspond to the Carassius auratus gibelio and Carassius auratus langsdorfii forms.

OBSAH 1. 2.

Úvod............................................................................................................................ 10 Literární přehled........................................................................................................ 12 2.1. Použité názvosloví................................................................................................ 12 2.2. Taxonomie a systematika karasa stříbřitého (Carassius auratus komplex) ............ 13 2.2.1. Formy Carassius auratus gibelio a Carassius auratus auratus...................... 13 2.2.2. Tzv. japonské formy ..................................................................................... 15 2.3. Přehled šíření karasa stříbřitého s ohledem na oblasti střední Evropy.................... 16 2.4. Biologie karasa stříbřitého .................................................................................... 23 2.4.1. Popis............................................................................................................. 23 2.4.2. Pohlaví, ploidie a rozmnožování ................................................................... 24 2.5. Význam karasa stříbřitého a jeho vliv na ostatní ichtyofaunu ................................ 26 2.6. Molekulárně-genetické markery diverzity ryb....................................................... 27 2.7. Využití mitochondriálních markerů ...................................................................... 32 2.7.1. Mitochondriální DNA................................................................................... 32 2.7.2. Kontrolní oblast ............................................................................................ 33 2.7.3. Gen pro cytochrom b .................................................................................... 34 3. Cíle disertační práce................................................................................................... 35 4. Materiál a metody ...................................................................................................... 36 4.1. Genetická diverzita komplexu Carassius auratus v ČR a na Slovensku ................ 36 4.1.1. Sběr vzorků a DNA extrakce......................................................................... 36 4.1.2. Použité molekulární markery ........................................................................ 39 4.1.3. Statistické vyhodnocení ................................................................................ 41 4.2. Analýza hybridizace mezi karasem stříbřitým a karasem obecným ....................... 42 4.3. Analýza mikrosatelitových markerů u populace karasa stříbřitého z umělého mokřadu Chomoutov ............................................................................................ 43 5. Výsledky ..................................................................................................................... 45 5.1. Genetická diverzita komplexu Carassius auratus v ČR a na Slovensku ................ 45 5.1.1. Analýza kontrolní oblasti .............................................................................. 45 5.1.1.1. Molekulární charakterizace ....................................................................... 45 5.1.1.2. Geografické rozložení haplotypů............................................................... 47 5.1.1.3. Vztah haplotypů, ploidie a pohlaví ............................................................ 48 5.1.1.4. Fylogenetická analýza ............................................................................... 49 5.1.1.5. Haplotypová síť ........................................................................................ 51 5.1.2. Analýza genu pro cytochrom b...................................................................... 52 5.2. Analýza hybridizace mezi karasem stříbřitým a karasem obecným ....................... 53 5.3. Analýza mikrosatelitových markerů u populace karasa stříbřitého z umělého mokřadu Chomoutov ............................................................................................ 56 6. Diskuse........................................................................................................................ 58 6.1. Posouzení vhodnosti použitých technik a markerů ................................................ 58 6.2. Genetická diverzita komplexu Carassius auratus v ČR a na Slovensku ................ 59 6.3. Linie G – forma Carassius auratus gibelio ........................................................... 61 6.4. Linie L – forma Carassius auratus langsdorfii...................................................... 63 6.5. Linie M ................................................................................................................ 66 6.6. Linie A – forma Carassius auratus auratus .......................................................... 67 6.7. Hybridizace mezi karasem stříbřitým a karasem obecným .................................... 67 7. Závěr........................................................................................................................... 70 8. Seznam použité literatury .......................................................................................... 71

9. Seznam použitých zkratek ......................................................................................... 84 10. Přílohy – soubor publikací......................................................................................... 85

1. ÚVOD Rod karas (Carassius) je významným rodem ryb z čeledi Cyprinidae, v současnosti celosvětově rozšířeným. Ornamentální formy karasa stříbřitého, tzv. „zlatá rybka“, jsou dokumentovány již od počátku vlády dynastie Sung v Číně mezi roky 968 a 975 n. l. (Balon 2004, 2006). Karas stříbřitý je využíván jako modelový organismus v biologii, v řadě zemí představuje významný objekt rybářství a tvoří i významnou část rybích společenstev v přírodních ekosystémech. Jednotlivé formy karasa stříbřitého patří k nejčastějším subjektům introdukce ryb ve světě s nejvyšší mírou úspěšnosti (García-Berthou et al. 2005). I přes tato fakta a výzkumnou pozornost, která je tomuto rodu věnována, existuje stále mnoho nejasností v oblasti biologie a taxonomie forem, které jsou souhrnně označovány jako „karas stříbřitý“ (Lusková et al. 2004). V oblasti střední Evropy se v současnosti vyskytuje karas obecný (Carassius carassius Linnaeus 1758), který je zde původním taxonem. Karas obecný zde v minulosti patřil mezi obecně rozšířené druhy (Libosvárský 1963a,b), v současnosti je však považován za druh ohrožený (Lusk et al. 2004). Dalším zástupcem rodu Carassius je karas stříbřitý (Carassius auratus Linnaeus 1758), který je pro tuto oblast druhem nepůvodním. Vzhledem k negativnímu vlivu na původní diverzitu je tento nepůvodní taxon hodnocen jako „invazivní“. Termín „karas stříbřitý“ je vzhledem k dosud nevyjasněné a nejednoznačné taxonomii v této práci používán jako souhrnný název pro několik forem. Karas stříbřitý je považován za jeden z nejúspěšnějších invazivních druhů ve vodách Evropy (Lusk et al. 1998a; Lusk & Lusková 2005). Od šedesátých let minulého století se začal postupně šířit v povodí Dunaje a pronikat do vod jednotlivých států. První nálezy ze slovenského povodí Dunaje pocházejí z roku 1961 (Balon 1962) a z povodí Tisy z roku 1963 (Žitňan 1965). V české části tehdejšího Československa byl karas stříbřitý poprvé zjištěn v oblasti soutoku Dyje a Moravy v roce 1976 (Lusk et al. 1977). Pronikl tam automigrací z Dunaje přes slovensko-rakouský úsek Moravy. Karas stříbřitý se plně naturalizoval, vytvořil stabilní populace a stal se trvalou součástí rybího osídlení většiny přírodních i umělých ekosystémů v České republice i na Slovensku (Lusk 1986, Lusk et al. 1996, Halačka et al. 2003, Lusková et al. 2004). Základní předpoklady vysoké úspěšnosti karasa stříbřitého v obsazování nových areálů v souvislosti s introdukčními aktivitami člověka nebo v důsledku vlastních migračních aktivit spočívají především v oblasti jeho specifických biologických vlastností. Tento taxon se

10

vyznačuje širokou ekologickou valencí, nenáročností. Specifická je jeho reprodukční variabilita a výkonnost, když se uplatňuje jak pohlavní tak i nepohlavní forma reprodukce spolu s vícedávkovým výtěrem. Výskyt jednopohlavních samičích populací zejména v prvních etapách okupace nového areálu významně zvyšuje reprodukční potenciál. Po stabilizaci osídlení nových biotopů proběhla postupně transformace na smíšený typ populací, kde se vyskytují samci i samice, vedle nepohlavní se tedy objevuje i pohlavní forma reprodukce. Zajímavý je i výskyt několika ploidních stavů: diploidních a triploidních, případně i víceploidních jedinců. Význam tohoto „stavu“ nebyl dosud zcela objasněn. Tento stav je možno označit jako tzv. „diploidně-polyploidní komplex“ (Vasil’eva & Vasil’ev 2000, Halačka et al. 2003; Lusková et al. 2004; Vetešník 2005). Významným činitelem, který ovlivňuje životaschopnost, je i genetická variabilita. V tomto směru jsou dosavadní znalosti o karasu stříbřitém nedostatečné, a proto se tato oblast stala i tématem předkládané disertační práce. Ichtyologické oddělení Ústavu biologie obratlovců Akademie věd ČR, v. v. i., jehož jsem od roku 2005 členem, se tématem biodiverzity ryb včetně problematiky nepůvodního taxonu karasa stříbřitého aktivně zabývalo v následujících projektech: Ø „Molecular and other genetic markers applied in the conservation of populations of endangered, rare, and vanishing fish species in the Czech Republic“ (2001-2005; IPS5045111). Ø „Intraspecific diversity in selected fish species (family: Cyprinidae, Cobitidae) in the conditions of Central Europe“. Tento projekt byl podporován Evropskou unií (Improving Human Potential Programme – Access to Research Infrastructures, 2005; HPRI-CT-2001-00180). Ø „Genetická diverzita ohrožených druhů ryb – nezbytný základ efektivní ochrany biodiverzity“ (2005-2007; MŽP ČR VaV/SM/6/3/05). Ø „Genetická, populační a reprodukční variabilita invazní ryby, Carassius „gibelio“ s alternujícím bisexuálně/asexuálním rozmnožováním ve střední Evropě“ (2005-2007; GA ČR 206/05/2159) Ø „Biodiverzita ryb v oblasti soutoku Moravy a Dyje – podpora a stabilizace populací vzácných a ohrožených druhů (2007-2009; MŽP ČR VaV/SP/2d4/55/07).

Primárním cílem doktorské práce bylo přispět k hlubšímu poznání komplexu Carassius auratus ve vodách České republiky a Slovenska z pohledu molekulární genetiky. 11

2. LITERÁRNÍ PŘEHLED 2.1. Použité názvosloví Vzhledem k problému taxonomické identity „karasa stříbřitého“ v této podkapitole uvádím názvosloví ryb, jak jej používám v této práci. V citacích používám původní názvy autorů. Pro vlastní výsledky a závěry jsem použil následující klasifikaci: Pojem „Carassius auratus“ chápu jako komplex většího počtu tzv. „forem“, přičemž jednotlivé formy označuji trinomickým systémem Carassius auratus xxx; nejedná se však o označení poddruhu ve smyslu bývalé i v současnosti užívané taxonomické kategorie. Tento komplex je pracovní taxonomickou skupinou zahrnující všechny ryby doposud popsané pod názvem Carassius auratus, včetně rozlišovaných poddruhů a polyploidních asexuálně se množících biotypů. V českém jazyce tento komplex nazývám karas stříbřitý. Jednotlivé formy v této práci označuji následovně: Formu taxonomicky v literatuře označovanou jako Carassius gibelio, Carassius auratus, Carassius auratus gibelio, anglicky jako „gibel carp“, „German carp“, „Prussian carp“, „silver crucian carp“ aj., v jejíchž populacích se vyskytují diploidní i polyploidní jedinci, nazývám Carassius auratus gibelio. Formu v literatuře označovanou Carassius auratus, Carassius auratus auratus, anglicky „goldfish“, česky pracovně „zlatá rybka“ či „karas zlatý“, která tvoří výlučně diploidní (sexuální) populace nebo je uměle chována v mnoha morfologických varietách pro okrasné účely, označuji Carassius auratus auratus. Formu taxonomicky v literatuře označovanou jako Carassius langsdorfii nebo Carassius auratus langsdorfii, japonsky „ginbuna“, jejíž populace jsou tvořeny diploidními a/nebo polyploidními jedinci, kteří se mohou rozmnožovat gynogeneticky či sexuálně, nazývám Carassius auratus langsdorfii. Další formy byly dosud nalezeny pouze v Japonsku: Carassius auratus buergeri, japonsky „nagabuna“, „kinbuna“ nebo „okinbuna“, Carassius auratus grandoculis, japonsky „nigorobuna“. Tyto formy jsou někdy považovány za pouhé morfologické varianty C. a. langsdorfii. Mimo pracovní skupinu Carassius auratus komplex stojí diploidní druhy, které se množí sexuálně: karas obecný (Carassius carassius Linnaeus 1758), anglicky „silver crucian carp“, japonsky „funa“, a karas Cuvierův (Carassius cuvieri Temminck & Schlegel 1846), anglicky „Japanese (white) crucian carp“, japonsky „gengorobuna“.

12

2.2. Taxonomie a systematika karasa stříbřitého (Carassius auratus komplex) Taxonomické hodnocení a systematické názvosloví karasa stříbřitého je v současnosti velmi komplikované a matoucí. Vývojové vztahy mezi formami jsou nejasné, jednotlivé formy mají proměnlivé biologické vlastnosti (úroveň ploidie, sexuální či asexuální formy reprodukce, migrabilitu) a morfometricky a anatomicky jsou často obtížně rozlišitelné. V posledních letech problém dále komplikuje respektování či nerespektování kategorie poddruh (subspecies) a její povyšování na druhovou úroveň. Proto se lze setkat s přístupy, kdy někteří autoři komplex karasa stříbřitého chápou jako poddruhy druhu Carassius auratus (např. Berg 1949, Banarescu 1964, Pelz 1987, Baruš & Oliva 1995, Sczerbowski 2002) a používají označení Carassius auratus auratus a Carassius auratus gibelio, jiní (např. Kottelat 1997, Kottelat & Freyhof 2007) uvedené poddruhy označují jako samostatné druhy Carassius auratus a Carassius gibelio, případně Carassius langsdorfii (Kalous et al. 2007).

2.2.1. Formy Carassius auratus gibelio a Carassius auratus auratus Vědecký název formy Carassius auratus gibelio komplexu karasa stříbřitého je vztahován k taxonu Cyprinus gibelio (Bloch 1782). Marcus Elieser Bloch jako první v Evropě popsal druh Cyprinus gibela v roce 1780 v knize „Oekonomische Naturgeschichte der Fischer in den Preußischen Staaten besonders der Märkischen Pommerschen Provinzen“. Jako typovou lokalitu uvedl Churmark, Pomořansko a Magdebursko, oblasti v dnešním Německu a Polsku. V roce 1782 nebo 1783 Bloch změnil název Cyprinus gibela na Cyprinus gibelio, a pod tímto názvem je uveden v Blochově katalogu (Kalous 2002, 2005). Rok změny názvu je nejasný: Hensel (1971), Kottelat (1997) aj. uvádějí rok 1782, Banarescu (1964), Baruš & Oliva (1995), Szczerbowski (2002) aj. rok 1783. Pod názvem Cyprinus gibelio se nacházejí čtyři exempláře v Blochově sbírce muzea „Museum für Naturkunde der Humbolt-Universität zu Berlin“ v Berlíně, v lahvi s označením ZMB 3203 (Paepke 1999). Podle Paepkeho (1999) však byly při prohlídce materiálu zjištěny dvě lahve se stejným označením ZMB3203. V jedné lahvi se nachází karas obecný a láhev je správně označena Cyprinus carassius (Carassius carassius). V druhé lahvi je také Carassius carassius, láhev je však označena Cyprinus gibelio. Omyl zjistil Paepke (1999) a uvádí možnost, že během 19. století došlo k záměně nebo ke špatné determinaci. Při studiu sbírkového materiálu záměnu potvrdil Kalous (2005). Zůstává nejasné, jaký druh ryby Bloch popsal.

13

Není pravděpodobné, že se jednalo o zdivočelou formu „zlaté rybky“. První umělý výtěr „zlaté rybky“ byl proveden v Nizozemí až roku 1728 (Sterba 1972). Do té doby byly „zlaté rybky“ do Evropy dováženy nákladně z Asie a nebyl důvod vypouštět je do volné přírody. Mohlo však docházet k náhodným únikům ze zahradních jezírek (Kottelat 1997). Bloch však v popisu uvádí, že ryba je obecně známá a uvádí i lokální názvy (Kalous 2005), což neodpovídá sporadickému výskytu v té době. Domestikovanou formu „zlaté rybky“ Bloch znal, pět exemplářů se nachází v jeho sbírce pod jménem Cyprinus auratus (Paepke 1999). Bloch pravděpodobně popsal křížence mezi karasem obecným (Carassius carassius) a kaprem (Cyprinus carpio), což podporují údaje o dvou řadách požerákových zubů u popisovaného jedince (Kalous 2005). V novodobější literatuře byly jako Carassius gibelio často označovány morfologické varianty Carassius carassius (např. Jeitteles 1863). Berg (1932) publikoval zjištění Drjagina, podle kterého lze na základě počtu žaberních tyčinek bezpečně rozlišit C. carassius a C. gibelio. V uvedené studii Berg použil název C. auratus gibelio vedle C. auratus typ. V rámci C. a. gibelio zmiňuje i Carassius auratus (karas stříbřitý), jehož původní výskyt lokalizuje do oblasti Číny, s ruským označením „zolotoj“ nebo „kitajskij“ karas. „Zolotaja rybka“ je podle něj domestikovaná forma C. auratus. Na základě publikovaných studií Berga (1932-1933, 1949) je název „gibelio“ spojen se současným karasem stříbřitým v povodí Amuru. Hensel (1971) provedl srovnání meristických a plastických znaků vlastního materiálu s morfologickými informacemi z literatury týkající se ryb označených jako Carassius auratus auratus a Carassius auratus gibelio. Došel k závěru, že morfologicky nelze zmíněné poddruhy rozlišit a doporučil název C. auratus pro druh bez rozdělení na poddruhy. Pelz (1987) rozlišuje Carassius auratus na poddruhy na základě ploidie. Podle něj je třeba diploidní karasy západní Evropy považovat za poddruh Carassius auratus auratus a triploidní karasy za poddruh Carassius auratus gibelio. Vycházel přitom z předpokladu, že výskyt diploidních populací karasa stříbřitého ve vodách západní Evropy souvisí s rozšiřováním „zlaté rybky“, přičemž triploidní karasi migrují do západní Evropy z východních oblastí svého areálu. Vasil’eva & Vasil’ev (2000) se zabývali taxonomickým statutem triploidní formy Carassius auratus. Došli k závěru, že Carassius auratus gibelio není validním poddruhem druhu Carassius auratus, a jméno gibelio by mohlo být použito jako druhové pro triploidní populace v Evropě, na Sibiři a Dálném Východě případně v Číně, za dvou podmínek: 1) přiznání validity této triploidní formy jako samostatného druhu, tj. prokázání jediného 14

a ancestrálního původu v celém areálu výskytu, bez vzniku de novo, 2) pokud typové exempláře Cyprinus gibelio (Bloch 1782) prokazatelně zahrnují triploidní jedince. Tato podmínka však není splněna. Kalous (2005) vyjadřuje názor, že střední Evropu obývají dva diploidní, sexuálně se množící druhy, tj. původní karas obecný (Carassius carassius) a introdukovaný karas zlatý (Carassius auratus), který se na kontinent dostal v 17. století jako domestikovaná forma. Vedle těchto druhů se ve střední Evropě vyskytuje nepůvodní karas stříbřitý jako diploidně-polyploidní komplex hybridního původu, rozmnožující se dvojím způsobem, sexuálně nebo gynogeneticky. Do nalezení formálně správného názvu pro tento komplex doporučuje Kalous (2005) používat název Carassius 'gibelio' v jednoduchých uvozovkách. Tento názor však brzdí řada neznámých faktorů, které je třeba ověřit dalším vědeckým výzkumem: jednak jedince divokých populací C. a. auratus a C. a. gibelio často nelze vizuálně rozlišit a rovněž na základě dosavadních poznatků nelze odhadnout vývoj diploidních C. a. auratus v diploidní populaci C. a. gibelio a opačně.

2.2.2. Tzv. japonské formy V Japonsku autoři různých studií rozlišují vedle jednoznačně samostatného druhu Carassius carassius pomocí morfologických, karyologických a genetických analýz další taxony „karasa stříbřitého“ různé hodnoty. Jsou posuzovány buď jako poddruhy v rámci jednoho druhu Carassius auratus nebo jako samostatné druhy rodu Carassius (Teitler & Fujita 1993). Temminck & Schlegel (1846) popsali čtyři nové druhy: Carassius langsdorfii, Carassius buergeri, Carassius cuvieri a Carassius grandoculis. Nakamura (1969) cit. v Takai & Ojima (1989) rozlišuje v rámci druhu Carassius auratus pět poddruhů: Carassius auratus cuvieri (japonsky gengorobuna), Carassius auratus langsdorfii (ginbuna), Carassius auratus grandoculis (nigorobuna), Carassius auratus buergeri (nagabuna), a Carassius auratus ssp. (kinbuna). Hosoya (2000) cit. v Iguchi et al. (2003) provedl revizi na základě meristických znaků a ploidie a dosavadní taxony rozdělil do dvou druhů: Carassius cuvieri, který je endemický pro jezero Biwa, a Carassius auratus se zbývajícími biotypy jako poddruhy, přičemž na rozdíl od Nakamury označuje biotyp „nagabuna“ jako Carassius auratus ssp. 1, biotyp „kinbuna“ jako Carassius auratus ssp. 2 a název Carassius auratus buergeri užívá pro (u Nakamury nezmíněný) biotyp „okinbuna“. Další autoři považují biotypy „kinbuna“ a „okinbuna“ za poddruhy druhu Carassius buergeri, přičemž o biotypu „nagabuna“ se nezmiňují (Ohara et al. 2003). Murakami et al. (2001) zachovává stejné dělení jako Nakamura (1969), Carassius cuvieri však vyčleňuje na základě genetických analýz jako 15

samostatný druh. Ostatní tradičně rozlišované biotypy se podle Murakamiho et al. (2001) geneticky překrývají. Uvedení autoři se shodují na označení Carassius auratus langsdorfii biotypu „ginbuna“, Carassius auratus grandoculis biotypu „nigorobuna“ a Carassius (auratus) cuvieri biotypu „gengorobuna“. Shodují se také v tom, že biotypy „ginbuna“ a „nagabuna“ jsou diploidně-polyploidní biotypy schopné sexuálního i gynogenetického rozmnožování, zatímco ostatní biotypy jsou diploidní a rozmnožují se sexuálně (Murakami et al. 2001, Iguchi et al. 2003).

2.3. Přehled šíření karasa stříbřitého s ohledem na oblasti střední Evropy Původ formy Carassius auratus auratus je nutno hledat v oblasti Číny. Chov „zlaté rybky“ pro náboženské účely je zde poprvé zaznamenán koncem 10. století. Jednalo se o exempláře, které se od divoce žijící formy nazývané „chi“ lišily pouze barvou. Cílený umělý odchov je poprvé dokumentován až ve 12. století. Do Japonska byla domestikovaná forma importována na počátku 16. století (Balon 2004, 2006). Do Evropy byl C. a. auratus poprvé dovezen v 17. století (udávány roky 1611 nebo 1691) z Číny přes Jávu a Jižní Afriku do Portugalska (Baruš & Oliva 1995). Postupně byl dovážen i do dalších zemí, např. Anglie, Francie, Dánsko, Nizozemsko, Německo, Itálie aj. (Baruš & Oliva 1995, Balon 2004). Roku 1728 byl v Nizozemí poprvé v Evropě rozmnožen i v zajetí. Stal se tak běžnějším a v důsledku úniků z rybníčků a záměrného vysazování do volných vod se na územích introdukce velmi brzy vyskytl i ve volných vodách (Pelz 1987, Kottelat 1997). V současnosti se ve volných vodách západní Evropy vyskytují především zdivočelí potomci těchto „zlatých karasů“. Příkladem mohou být karasi z Pyrenejského poloostrova (Collares-Pereira & da Costa 1999) či z Velké Británie (Hänfling et al. 2005). Na území současné České republiky byl C. a. auratus dovezen jako akvarijní rybka zřejmě v 18. nebo 19. století (Kalous 2005). V současnosti je chován ve velkém množství barevných i tvarových odchylek v akváriích, parkových bazénech či rybníčcích, odkud příležitostně může pronikat (nebo být přenášen) do volných vod, jeho výskyt je však ojedinělý a nikde netvoří ani dočasné populace (Baruš & Oliva 1995). Dominantní a téměř výlučný výskyt karasa stříbřitého v České republice a na Slovensku připadá na formu C. a. gibelio. V současnosti lze mít za prokázané, že původní areál této ryby se nachází na Dálném Východě, zejména zahrnuje povodí Amuru, Koreu a Čínu (Berg 1949, Raicu et al. 1981, Zhou et al. 2001). Současný výskyt a geografické

16

rozšíření zahrnuje vodní toky a nádrže od západní Evropy (Nizozemsko) přes střední a jihovýchodní Evropu, Rusko až po východosibiřskou řeku Kolymu, dále Mongolsko, Čínu a Japonsko (Baruš & Oliva 1995, Szczerbowski 2002, Hänfling et al. 2005, Tsoumani et al. 2006, Li & Gui 2008 aj.). Historický výskyt a původnost C. a. gibelio v Evropě jsou dlouhodobě předmětem diskusí. Hensel (1971) popisuje záznam a vyobrazení ryby nalezené Marsilim roku 1726 v Dunaji a klasifikované jako Cyprinus III. Podle Hensela je tato ryba velmi podobná Carassius auratus gibelio i v detailech jako počet šupin v postranní čáře, tvar a povrch operkula (žaberního víčka). Holčík & Žitňan (1978) dále zmiňují nález Heinricha z roku 1856 ve stojatých vodách Slezska, tento nález však nebyl dokumentován. Výskyt tzv. „stříbrných karasů“ v Dunaji uvádí i Mahen (1931), opět bez dokladového materiálu. V rumunském úseku Dunaje byl C. a. gibelio poprvé pozorován kolem roku 1920 (Banarescu 1964). O původnosti C. a. gibelio v Evropě Balon (1962) soudil, že C. a. gibelio zjištěný v Dunaji reprezentuje autochtonní subspecii. Shodný názor vyjádřil Berg (1932, 1949), který považuje karasa stříbřitého za autochtonní prvek ichtyofauny Evropy. Gasowska (1936) považuje výskyt tohoto druhu v Evropě za důsledek přímého dovozu z Asie nebo za zpětný zvrat dovezeného zlatého karasa k původnímu typu. Rovněž podle Banarescu (1960) cit. Hensel (1971) všichni C. a. gibelio byli introdukováni do Evropy z Východní Asie a zde zdivočeli. Současné populace C. a. gibelio v povodí Dunaje pravděpodobně pocházejí z oblasti povodí Amuru. Při realizaci rozsáhlých introdukčních programů od konce 30. let do 60. let 20. století v bývalém Sovětském svazu docházelo k převozům ryb z Dálného Východu do západních oblastí Sovětského svazu. Karpevich & Bokova (1963) a Karpevich & Lokshina (1967) uvádějí přehled ryb introdukovaných v té době (celkem 43 druhů). Mezi prvními takto převáženými objekty byl i amurský C. auratus dovážený do oblastí východní Evropy (zejména do evropské části Sovětského svazu a do Bulharska) pro produkční účely. Zejména tyto dovozy se patrně staly výchozím zdrojem pro postupné rozšíření formy C. a. gibelio v Evropě. Karas stříbřitý byl převážen ve stádiu očních bodů, plůdku i dospělých jedinců a patřil mezi vůbec nejčastější objekty introdukcí v bývalém SSSR (Burmakin 1963). Přibližně až do poloviny 20. století byl C. a. gibelio pozorován pouze v oblasti delty Dunaje v Rumunsku (Holčík & Žitňan 1978). V jugoslávském úseku Dunaje byl poprvé zaznamenán v roce 1954 poblíž ústí řeky Tisy do Dunaje a v dolní části jugoslávského úseku Dunaje u Kladova v blízkosti bulharských hranic (Djisalov 1974). Podle Djisalova do střední části Dunaje v Jugoslávii pronikl z řeky Tisy. Tento názor je podle Holčíka & Žitňana (1978) 17

pravděpodobně správný, protože C. a. gibelio byl z Bulharska importován v roce 1954 na rybí farmu ve městě Szarvas v jihovýchodním Maďarsku, která je napájena z levostranného přítoku Tisy, řeky Körös. Z rybí farmy Szarvas C. a. gibelio pronikl do řeky Körös a poté řekou Tisou do Dunaje (Jászfalusi 1959 cit. Holčík & Žitňan 1978). Holčík & Žitňan (1978) předpokládají, že C. a. gibelio expandoval povodím Dunaje ze dvou až tří center. Prvním je zmiňovaná farma a tok řeky Körös, druhým centrem je delta a dolní tok Dunaje na území Rumunska, a třetím centrem mohly být některé bulharské přítoky Dunaje, do kterých se C. a. gibelio dostal z místních farem. Do bulharských vod se C. a. gibelio údajně dostal kolem roku 1949, kdy byl poprvé pozorován v jezeru Gebežnensko (později přejmenováno na Boleslawsko) poblíž Varny (Stojanov 1949 cit. Holčík & Žitňan 1978). Výskyt formy C. a. gibelio ve volných vodách tehdejšího Československa není prokázán před rokem 1960 na Slovensku a před rokem 1975 na území dnešní České republiky. Oliva & Hruška (1955) sice jeho výskyt u nás zcela nevylučují a tvrdí, že se mohl vyskytovat mozaikovitě, jak byl znám z polských, německých a ukrajinských vod, Libosvárský (1960-1961, 1962) je však přesvědčen, že výskyt tohoto „karasa stříbřitého“ je v převážné části evropských vod sekundární. Na základě názoru většiny dalších studií včetně současných (Lusk et al. 1977, Holčík & Žitňan 1978, Lusk et al. 1980, Lusk et al. 1998, Lusková et al. 2004, aj.) lze mít za prokázané, že C. a. gibelio je pro Československo (potažmo pro Českou republiku a Slovensko) nepůvodní. Současný výskyt formy C. a. gibelio v České republice a na Slovensku souvisí s jejím expanzivním šířením v povodí Dunaje. Holčík & Žitňan (1978) odvozují původ československých populací C. a. gibelio z výše zmiňovaného importu karasa stříbřitého na maďarské farmy. Tyto populace zřejmě pronikly do země Tisou na východě a Dunajem na jihu a jihozápadě Slovenska a dále se šířily na sever a západ. Diskuzi o problematice karasa stříbřitého v návaznosti na jeho další postupné šíření v oblasti střední Evropy otevřel exemplář, který pocházel ze zatopeného opuštěného lomu u Horní Suché na Těšínsku. Tento jediný poškozený exemplář Mišík & Holčík (1962) získali od sportovních rybářů z ostravského regionu, kteří jej používali jako nástražní rybičku při lovu dravců na Oravské přehradě. Balon (1962) však následně na základě odlišností v počtu análních ploutevních paprsků a v počtu šupin v postranní čáře označil tuto klasifikaci za chybnou a tvrdil, že se pravděpodobně jednalo o zdivočelého potomka uměle vysazených „zlatých karasů“.

18

První nesporný, dokumentovaný nález C. a. gibelio na území bývalého Československa uvádí Balon (1962) z hlavního toku Dunaje pod Medveďovem, kde ulovil čtyři dospělé samice. První záznam výskytu ve slovenském úseku řeky Tisy poblíž vesnice Veľké Trakany pochází od Žitňana (1965). Další izolované nálezy byly zaznamenány ve slovenském úseku Dunaje u Radvaně nad Dunajom v letech 1968-1970 (Hensel 1971). V následujících letech se C. a. gibelio postupně šířil do ostatních částí východního a jihozápadního Slovenska, přičemž v mnoha případech šlo již o výskyt masový (Holčík & Žitňan 1978, Lusk et al. 1980). Na území dnešní České republiky pronikl C. a. gibelio přes slovensko-rakouský úsek řeky Moravy z Dunaje. Poprvé byl pozorován v dolním úseku řeky Dyje u jezu v Břeclavi (ř. km 26,7) na jaře roku 1976 (Lusk et al. 1977). Je pravděpodobné, že se v této oblasti ojediněle vyskytoval o jeden až dva roky dříve. V letech 1976 a 1977 byl dokumentován jeho výskyt v řece Dyji až po ř. km 40 a v dolních úsecích řeky Moravy (ř. km 70-150). Postupně obsadil aluviální vody dolních úseků obou zmiňovaných toků. Následně se rozšířil do celého povodí Moravy a Dyje na Moravě nechtěnými převozy s násadami kapra, záměrným vysazováním a také lokálně vlastními migracemi v rámci migrační prostupnosti (Lusk et al. 1980, Lusk 1986). V povodí Odry byl pozorován v rybnících od roku 1974. V povodí Labe byla jeho přítomnost prokázána až v roce 1980, kdy byl uloven jeden exemplář v Jevanském potoce (pravostranný přítok Sázavy, povodí Vltavy) (Lusk 1986), a v dalších letech pronikl i přímo do povodí Labe. Na podzim 1983 byl jeho výskyt zjištěn při výlovu Staronechanického rybníka u Hradce Králové, kam byl o rok dříve dovezen z jižní Moravy jako nechtěná příměs s násadami tolstolobika a kapra (Lusk 1986). Další záznamy pocházejí z oblasti soutoku Orlice a Labe nedaleko Hradce Králové. V následujících letech se tento druh rozšířil i do dolní části Vltavy, Labe a přilehlých stojatých vod (Lohniský 1985, Lusk 1986, Kubečka 1989). Časový postup šíření C. a. gibelio do roku 1990 je patrný z Obr. 1.

19

Obr. 1. Šíření karasa stříbřitého ve vodách České republiky do roku 1990 (Halačka et al. 2003).

Lusk et al. (1980) uvádí dvě cesty, jimiž se v našich vodách C. a. gibelio šířil. První cestou je pronikání vodními toky a umělými kanály vlastními migračními aktivitami. Tímto způsobem se dostal na území ČR a SR přes Dunaj a Tisu a rozšířil svůj areál do většiny tekoucích vod. Z vodních toků a kanálů pronikl i do nádrží a rybníků při jejich napouštění nebo čerpání vody. Tah C. a. gibelio byl velmi agresivní, překonával i stupně a silný proud vody. Podle dalších pozorování podniká C. a. gibelio migrace zejména v období tření. V prvních letech byly tyto migrace nejvýraznější na jaře (Lusk et al. 1977). Podle Holčíka (1980a) byly dalším důvodem pozoruhodného rozšíření areálu C. a. gibelio také potravní migrace. Druhou cestou šíření je převoz a vysazování do vodních toků a nádrží, často s násadami kapra či v důsledku záměny s kaprem. Tímto způsobem se dostal i do uzavřených vodní nádrží, tůní, rybníků či rybničních soustav a překonal hranice povodí (Lusk et al. 1980). Do tohoto způsobu šíření spadá i těžko kontrolovatelné vysazování sportovními rybáři, kteří C. a. gibelio používají jako nástražní rybičku při lovu dravců. Podle Luska et al. (1980) jsou hlavní příčiny rychlého rozšíření a okupace nového areálu formou C. a. gibelio následující: 1) Biologické vlastnosti – původní populace C. a. gibelio v našich vodách byly monosexuální, tvořené pouze samicemi. Tyto populace měly vysokou plodnost a dávkový typ výtěru (dvě až čtyři dávky). Gynogenetický typ rozmnožování, který se u této formy uplatnil,

20

výrazně zvýšil reprodukční efekt a potenciál C. a. gibelio tak, že předstihuje ostatní druhy ryb, které se v našich vodách vyskytují. 2) Ekologické vlastnosti – C. a. gibelio je charakteristický širokou ekologickou valencí. Je schopen se přizpůsobit různým vodním biotopům: stojatým vodám (rybníky, nádrže, tůně, jezera) i vodám tekoucím (malé toky a kanály, ale i velké řeky). Je velmi odolný vůči nepříznivým podmínkám – snáší bezkyslíkové stavy, silné znečištění vody (zejména organického charakteru), mechanické poškození či poranění. 3) Činnost člověka – při rybářském obhospodařování tekoucích vod a rybníků byl C. a. gibelio často záměrně nebo neúmyslně či z neznalosti převážen a vysazován do dalších vodních biotopů. Tím člověk významným způsobem přispěl k jeho šíření v našich vodách. 4) Ostatní faktory – pokles početnosti dravých druhů ryb ve volných vodách a značná odolnost proti nemocem. Holčík (1980a) a Holčík & Kmeť (1986) podrobněji uvádějí možné důvody expanzivního rozšíření areálu výskytu C. a. gibelio v povodí Dunaje, přičemž vycházejí ze statistické analýzy úlovků. Autoři našli blízký negativní vztah mezi úlovky piscivorních druhů (štika obecná – Esox lucius, candát obecný – Sander lucioperca, sumec velký – Silurus glanis a bolen dravý – Aspius aspius) a úlovky C. a. gibelio v dolním toku Dunaje. Expanzi a značný nárůst abundance C. a. gibelio odvozují z posunu rovnováhy populací ryb v důsledku úbytku početnosti dravých druhů. Na tento posun C. a. gibelio zareagoval díky svým biologickým vlastnostem (vysoká plodnost, prodloužené třecí období, vysoká životaschopnost atd.) nejrychleji. Úbytek dravých ryb vysvětluje Holčík (1980a) zejména nadměrným lovem, redukcí počtu vhodných výtěrových míst a celkovým zhoršením hydrologických podmínek v Dunaji. Lze konstatovat, že v současnosti se C. a. gibelio vyskytuje ve všech vhodných vodách v celé České republice. Je běžný ve všech velkých řekách a v jejich záplavových územích (Lusková et al. 2002, Halačka et al. 2003, Lusková et al. 2004). Seznam lokalit nálezů je podrobněji rozebírán v Hanel & Lusk (2005). Tyto lokality zachycuje mapka na Obr. 2.

21

Obr. 2. Evidovaný výskyt Carassius auratus gibelio v období 1982-2005 (Hanel & Lusk 2005). Černou barvou jsou vyznačeny údaje o lokalitách potvrzené ichtyologickými průzkumy, okrovou barvou údaje s nižší spolehlivostí, získané v anketě mezi členy Českého rybářského svazu a Moravského rybářského svazu.

Obdobná situace je v současnosti na území Slovenska. Již koncem 70. let 20. století C. a. gibelio infiltroval povodí prakticky všech velkých slovenských řek s výjimkou povodí Popradu a řeky Slaná (Holčík & Žitňan 1978). V té době byl uváděn v povodí Bodrogu až po přehradu Zemplínska Šírava, po přehradu Ružín v povodí Hornádu, po Lučenec v povodí Ipeľu, po Novou Baňu v řece Hron, dále ve Váhu až po Trenčín a v celém slovenském úseku Dunaje a Moravy. V současnosti se vyskytuje i ve zmíněném povodí řeky Slané (Koščo et al. 2004) a v Popradu (Pekárik 2006, pers. comm.). Výskyt dalších forem karasa stříbřitého vedle C. a. auratus a C. a. gibelio na území České republiky a Slovenska nebyl zdokumentován až do konce 20. století. První záchyt formy Carassius auratus langsdorfii je datován do roku 2000, kdy byly při ichtyologickém výzkumu v řece Chrudimce v povodí Labe poblíž Bojanova chyceny dvě samice karasa stříbřitého „poněkud neobvyklého vzhledu“, se světlou břišní stranou a tmavou hřbetní stranou. Na základě morfologických, cytologických a molekulárně-genetických analýz byly tyto vzorky klasifikovány jako Carassius langsdorfii (Kalous et al. 2007). Autoři soudí, že se do našich vod dostaly náhodou s komerčně dováženými rybami z Japonska, například kapra „koi“.

22

2.4. Biologie karasa stříbřitého Tato podkapitola stručně shrnuje některé biologické vlastnosti karasa stříbřitého (Carassius auratus) s důrazem na formu Carassius auratus gibelio, která ve vodách České republiky a Slovenska tvoří stabilní populace.

Obr. 3. Carassius auratus gibelio. Foto Karel Halačka.

2.4.1. Popis Karas stříbřitý je kaprovitá ryba střední velikosti, dorůstá velikosti až 50 cm a hmotnosti 3 kg, většinou jsou však nalézáni jedinci mnohem menší (Hanel & Lusk 2005). Tělo je pokryto velkými, lehce opadavými šupinami. Celkové zbarvení je stříbřitě šedé, s tmavší hřbetní částí těla, boky jsou světle stříbřité, šupiny jsou temně lemovány. Ústa jsou koncová, bez vousků. Horní linie hřbetní ploutve je mírně ventrálně vhloubena. Tělní dutina má černou výstelku s perleťovým leskem (Baruš & Oliva 1995, Szczerbowski 2002, Hanel & Lusk 2005). Z hlediska ekologických nároků jde o rybu bentopelagickou (obývající dno i otevřenou vodu), žijící ve sladkých i brakických vodách. Dává přednost větším vodám a zdržuje se i v korytech řek. Rozšířen je také ve slepých ramenech a melioračních kanálech zarostlých vodní vegetací, přizpůsobil se i životu ve stojatých vodách (rybníky, nádrže, jezera, tůně). Žije v hejnech.

23

Z potravního hlediska se jedná o všežravce, v jeho potravě se může nacházet zoobentos, zooplankton, sinice, řasy, suchozemský hmyz, detrit či úlomky rostlin (Lusk 1986). Je tak vážným potravním konkurentem hospodářsky významných druhů ryb, zejména kapra obecného, lína obecného a dalších druhů se shodným potravním spektrem. Délka jeho střeva nasvědčuje tomu, že je schopen využívat i rostlinnou potravu (Lusk & Baruš 1978).

2.4.2. Pohlaví, ploidie a rozmnožování Podle Baruše & Olivy (1995) není pohlavní dimorfismus u karasa stříbřitého podrobněji znám. Kux (1982) uvádí pro samce z dunajské delty jako spolehlivý rozlišovací znak zduřeninu na bázi prsních ploutví, která u samic chybí. Szczerbowski (2002) uvádí, že samci mají poněkud vyšší tělo a hřbetní ploutev. U formy karasa stříbřitého C. a. gibelio probíhá pohlavní i nepohlavní rozmnožování, v závislosti na ploidním statusu. Z hlediska ploidie a sexuality jedinců existují tři typy populací: unisexuální evropské populace karasa stříbřitého jsou tvořeny triploidními samicemi (3n = 135-160 chromozómů), bisexuální populace jsou diploidní (2n = 94-100) (Cherfas 1966, 1987). Morfologicky tyto populace nelze rozlišit (Golovinskaya et al. 1965). V některých biotopech se vyskytuje třetí druh populací, sestávající z jedinců obou pohlaví a různé ploidie, s pohlavní a nepohlavní reprodukcí. Tyto populace mají smíšený charakter a mohou být označovány jako diploidně-polyploidní komplex. Halačka et al. (2003) a Lusková et al. (2004) zjistili v populacích C. a. gibelio rovněž výskyt tetraploidních samic (4n = 200± chromozómů). S největší pravděpodobností lze na základě publikovaných prací (Peňáz et al. 1979, Lusk et al. 1980, Baruš & Oliva 1995) konstatovat, že první vlnu C. a. gibelio, která migrací pronikla v 60. a 70. letech 20. století na území dnešního Slovenska a České republiky, tvořily pouze triploidní samice, které se rozmnožovaly gynogeneticky. Analýza karyotypu byla však provedena pouze na několika jedincích a nelze tedy tvrdit s jistotou, že tehdejší samičí populace byly tvořeny pouze triploidními jedinci. Samci se začali v oblasti dolního toku řeky Dyje objevovat až začátkem 90. let 20. století, od druhé poloviny 90. let jsou v dolním toku řeky Dyje pozorováni pravidelně (Lusk et al. 1998a, Halačka & Lusková 2000, Halačka et al. 2003, Lusková et al. 2004). Populace tak získala charakter diploidně-polyploidního komplexu s dominancí triploidů. Obdobná postupná transformace původně jednopohlavních populací karasa stříbřitého na populace smíšené proběhla i na Slovensku (Černý & Sommer 1992, Lusková et al. 2004).

24

Jakým způsobem se v dosud unisexuálních populacích tvořených pouze samicemi objevili samci, zůstává dosud nejasné. Jednou možností je následná migrační vlna C. a. gibelio, která vedle triploidů obsahovala i diploidní jedince. Druhá alternativa naznačuje, že diploidní jedinci vznikli při reprodukci triploidů, přičemž stimulem k transformaci mohla být stabilizace populací v dané oblasti. Možnost, že malý počet diploidů byl již v první invazní vlně, která osídlila naše území, je extrémně nepravděpodobná (Halačka et al. 2003). Další možnost popisuje Goryunova (1962), podle níž výskyt samců může souviset se zhoršujícími se podmínkami prostředí, které způsobují vyhynutí ostatních druhů a tím absenci samců potřebných ke gynogenezi. Gynogenetické rozmnožování, ke kterému dochází u triploidních samic C. a. gibelio, je u obratlovců nezvyklým jevem. Výjimky z pohlavní reprodukce, mezi které gynogeneze spolu s hybridogenezí a partenogenezí u obratlovců patří, jsou zřejmě spojeny s hybridizací: kombinace dvou genomů určitých druhových párů vede k vychýlení poměru pohlaví u hybridů ve prospěch samic. Hybridní samice pak produkují vajíčka bez rekombinace a vznikají uniparentální linie (Dawley 1989). Tito jedinci hybridního původu jsou většinou charakterizováni diploidií či triploidií, vzácně tetraploidií. Ke vzniku triploidních jedinců vedla dvě stadia hybridizace. V prvním stadiu v důsledku hybridizace dvou bisexuálních diploidních druhů došlo ke vzniku diploidních unisexuálních (samičích) jedinců. V druhém stadiu pak při hybridizaci těchto diploidních samic se samci výchozích bisexuálních druhů (či třetího bisexuálního druhu) vznikli jedinci triploidní. Tetraploidní jedinci pak analogicky vznikají jako produkt hybridizace triploidních samic se samci diploidních bisexuálních druhů (Vasil’eva & Vasil’ev 2000). Obecně je při vlastní gynogenezi nedotčený genom matky přenesen do vajíčka, avšak pro jeho vývoj je nutná aktivace pomocí spermie samce stejného nebo jiného druhu ryb. Genetický materiál samce se na následném vývoji jedince nepodílí, výsledkem je potomstvo klonálního charakteru (Dawley 1989). U karasa stříbřitého gynogenezi poprvé popsali Golovinskaya & Romashov (1947, cit. Golovinskaya et al. 1965). Forma C. a. auratus (divoce žijící i v zajetí chované ornamentální biotypy) je výhradně diploidní a množí se bisexuálně. Pokud jde o japonské formy, u C. a. langsdorfii a u biotypu „nagabuna“ je podobná situace jako u C. a. gibelio, populace jsou tvořeny jedinci diploidními, triploidními, případně tetraploidními, a rozmnožují se bisexuálně (diploidi) i gynogeneticky (polyploidi). Ostatní formy jsou diploidní a rozmnožují se pouze bisexuálně (Murakami & Fujitani 1997, Murakami et al. 2001, Iguchi et al. 2003). 25

2.5. Význam karasa stříbřitého a jeho vliv na ostatní ichtyofaunu Karas stříbřitý byl v minulém století v zemích bývalého Sovětského svazu jedním z nejčastějších objektů tzv. aklimatizačních aktivit za účelem zvýšení produkce ryb v minulém století. Tyto aktivity se dotkly i některých dalších evropských zemí (např. Bulharsko, Rumunsko). V řadě oblastí se tak stal běžnou hospodářskou a konzumní rybou (Rusko, Maďarsko a další) a chová se v rybnících jako hlavní druh nebo společně s obsádkou jiných kaprovitých ryb. U nás běžné tržní uplatnění nemá a jeho nežádoucí produkce v rybnících má asi 30% hodnotu v porovnání s finanční hodnotou produkce kapra. Ve volných vodách rybářských revírů je karas stříbřitý loven sportovními rybáři. V podmínkách České republiky je karas stříbřitý hodnocen jako „nepůvodní invazivní druh“ a jeho výskyt a vliv na původní biodiverzitu je hodnocen výlučně negativně (Lusk & Lusková 2005). Nepůvodní druhy jsou obecně považovány za jedno z největších nebezpečí pro původní ichtyofaunu, neboť většina z nich přímo nebo nepřímo destruktivně působí na její složení a strukturu (Allendorf 1991, Holčík 1991). Specifické biologické vlastnosti karasa stříbřitého přispěly k velmi rychlému osídlení většiny vhodných biotopů a vedly k silnému konkurenčnímu tlaku na původní druhy s obdobnými nároky na biotop, např. karasa obecného (Carassius carassius), lína obecného (Tinca tinca) a slunku obecnou (Leucaspius delineatus). Důsledkem je vymizení či výrazné snížení početnosti populací uvedených i některých dalších druhů ryb (Lusk et al. 1998b, Halačka et al. 2003). Konkrétní údaje o antagonistických vztazích mezi populacemi karasa stříbřitého a ostatních kaprovitých ryb jsou známy z rybničních soustav, kde je karas stříbřitý potravním konkurentem kapra obecného a jiných hospodářsky cenných ryb. Přemnožení jeho populací vedlo k poklesu produkce kapra (Lusk et al. 1980, Lusková et al. 2002, Hanel & Lusk 2005). V aluviu řeky Dyje s nárůstem početnosti karasa stříbřitého nastal výrazný pokles populací lína obecného (Lusk et al. 1998b). Dalším negativním efektem je sexuální parazitismus, při kterém triploidní samice karasa stříbřitého využívají k aktivaci oocytů spermie samců jiných druhů kaprovitých ryb, např. jelce tlouště (Leuciscus idus), plotice obecné (Rutilus rutilus), cejna velkého (Abramis brama), cejnka malého (Abramis bjoerkna), lína obecného (Tinca tinca), karasa obecného (Carassius carassius) a kapra obecného (Cyprinus carpio). Tito samci se pak podílejí na rozmnožování vlastního druhu jen omezeně (Halačka et al. 2003, Lusková et al. 2004). Richardson et al. (1995) uvádí vliv karasa stříbřitého na kvalitu vody. Jeho působením dochází ke zvýšenému zákalu vody a také k poškozování a vykořeňování vodních rostlin.

26

Významný negativní vliv na populace nativních druhů ryb může mít i jejich hybridizace s karasem stříbřitým. Zprávy o takové hybridizaci však nejsou přes značné rozšíření karasa stříbřitého příliš početné. Výskyt hybridů karasa stříbřitého a karasa obecného v jezerech v Kazachstánu popsali Goryunova & Skakun (2002). Kux (1982) zmiňuje výskyt takových hybridů v deltě Dunaje. Několik hybridních jedinců nalezli také Mezhzherin & Liseckij (2004) ve vodách Polesí na Ukrajině. Hänfling & Harley (2003) a Hänfling et al. (2005) podávají zprávu o častém výskytu diploidních hybridů karasa stříbřitého s karasem obecným a kaprem obecným v přírodních podmínkách Velké Británie; podle autorů až 38 % britských populací karasa obecného obsahuje hybridy s karasem stříbřitým či kaprem obecným. Ojedinělý výskyt hybridů mezi kaprem obecným a karasem stříbřitým zjistili i Cherfas et al. (1994), Prokeš & Baruš (1996), Stráňai (1999) a Zhou et al. (2000). Výskyt životaschopných hybridů karasa stříbřitého s dalšími druhy cyprinidů je nepravděpodobný, jak naznačují výsledky experimentálních křížení s cejnem velkým, cejnkem malým a ploticí obecnou (Flajšhans et al. 2004, Vetešník 2008, pers. comm.). Výskyt hybridů s uvedenými druhy je podmíněn účastí diploidních jedinců karasa stříbřitého na reprodukci.

2.6. Molekulárně-genetické markery diverzity ryb Při mapování genetické diverzity ryb je v současnosti aplikován velký počet technik založených na využití molekulárních markerů, zejména proteinové analýzy allozymů nebo v současnosti převažujících DNA markerů, založených na existenci polymorfních variant DNA. Tyto varianty se navzájem liší délkou (např. mikrosatelity) nebo pořadím nukleotidů v DNA. Mezi vlastnosti molekulárních markerů, umožňující jejich využití, patří zejména (upraveno podle Weising et al. 2005): 1. střední až vysoký polymorfismus 2. kodominantní dědičnost (rozlišení homo- a heterozygotních stavů u diploidních organismů) 3. jednoznačná rozlišitelnost alel 4. častý výskyt v genomu 5. rovnoměrné rozložení v genomu 6. selektivně neutrální chování 7. snadná a rychlá dostupnost a testovatelnost (z hlediska náročnosti časové a materiální) 8. vysoká reprodukovatelnost výsledků

27

9. snadná výměna dat mezi laboratořemi 10. nízká cena analýz

Všechna tato kritéria sice v současnosti nesplňuje žádný typ molekulárního markeru, na výběr je však množství markerů, které v sobě kombinují některé (nebo většinu) zmíněných charakteristik (Weising et al. 2005). Techniky používané při studiu biodiverzity vodních organismů vesměs navazují na tzv. polymerázovou řetězovou reakci. Polymerázová řetězová reakce (polymerase chain reaction, PCR) je metoda umožňující namnožení specifických úseků DNA a tím i z velmi malého vzorku (teoreticky postačuje jediná molekula DNA) umožňuje získat dostatek materiálu pro další analýzy. Princip PCR objevil v roce 1983 americký biochemik Kary Mullis, který metodu rozpracoval a nechal si ji patentovat (Mullis et al. 1986). Metoda spočívá v mnohonásobné umělé syntéze specifického úseku DNA vymezeného dvěma oligonukleotidy (primery), které se komplementárně vážou v opačné orientaci každý k jednomu řetězci DNA. V opakovaném teplotním cyklu o třech fázích (denaturace DNA, připojení primerů (tzv. annealing), prodlužování primerů od jejich 3' konce) postupně dochází k hromadění specifického fragmentu DNA. Automatizace procedury umožnila její rozšíření a masovou aplikaci. Metoda má řadu modifikací umožňujících specifické použití. Mezi metody v současnosti používané v molekulární genetice ryb dále patří: •

Náhodně amplifikované polymorfní DNA (Randomly Amplified Polymorphic DNAs, RAPD) (Williams et al. 1990) RAPD je metoda založená na PCR, při které se používají velmi krátké primery (do

10 bp) a nízké teploty annealingu. Díky malé délce má primer v genomu mnoho komplementárních míst, na která nasedá; s vysokou pravděpodobností dva primery nasednou na komplementární řetězce blízko sebe (do 2 kb) v opačné orientaci. Takto vymezený fragment se namnoží. Výsledkem je směs velkého množství fragmentů o různé délce, které jsou následně elektroforeticky separovány. Množství získaných fragmentů lze ovlivnit volbou reakčních podmínek (např. teploty annealingu). Soubor proužků na elektroforetickém gelu může vytvářet druhově, populačně či individuálně specifický vzor. Výhodou metody je její univerzalita, která nevyžaduje předběžné znalosti o sekvenci DNA zkoumaného druhu, nevýhodou je omezená opakovatelnost a vysoká kontaminační citlivost.

28

Metoda je využívána pro diagnostiku pohlavních markerů, při genomovém fingerprintingu (Hulák et al. 2006), k identifikaci taxonů či klonálních linií (Partis & Wells 1996, Murakami et al. 2002) nebo v populačních studiích (Mendel et al. 2005). •

Polymorfismus délky restrikčních fragmentů (Restriction Fragment Length Polymorphism, PCR-RFLP) Metoda je založena na sekvenční specifitě restrikčních endonukleáz. Amplifikovaný

úsek DNA je vystaven účinkům restrikčních endonukleáz a vzniklé fragmenty jsou elektroforeticky rozděleny a vizualizovány na agarózovém či polyakrylamidovém gelu. Variabilita délky restrikčních fragmentů je dána vznikem či zánikem restrikčních míst v důsledku mutací, případně inzercí či delecí jednoho či více nukleotidů beze změny restrikčního místa. Analýza mitochondriální DNA pomocí RFLP byla v nedávné minulosti základem mnoha fylogenetických studií, je používána též k ověřování mikrotaxonomického členění druhů, k určování přítomnosti hybridních jedinců, identifikaci různých druhů ryb v potravinářství apod. (Brykov et al. 2002, 2005, Ohara et al. 2003, Aranishi 2005 aj.). •

Polymorfismus délek amplifikovaných fragmentů (Amplified Fragment Length Polymorphism, AFLP) (Vos et al. 1995) Metoda rovněž využívá PCR a štěpení restrikčními enzymy. Technika je založena na

ligaci adapterových sekvencí na konce restrikčních fragmentů a jejich následné amplifikaci pomocí PCR. Obdobně jako RAPD rychle generuje velké množství polymorfních markerů i u druhů bez předchozí hlubší znalosti o jejich genetické informaci, na rozdíl od RAPD vyniká vysokou mírou opakovatelnosti, má vysoké rozlišení a citlivost (Zima et al. 2004). Metoda je využívána např. pro mapování genetické diverzity, sledování procesů adaptace a reprodukční izolace či pro identifikaci původu rybích produktů v potravinářstvi (Campbell et al. 2003, Campbell & Bernatchez 2004, Maldini et al. 2006 aj.). •

Polymorfismus konformace jednořetězcové DNA (Single-Strand Conformation Polymorphism, SSCP) (Orita et al. 1989) Metoda

je

založena

na

změně

mobility

jednořetězcové

DNA

v nedenaturujícím polyakrylamidovém gelu v závislosti na sekundární struktuře jednořetězce. Tato sekundární struktura je dána především sekvencí nukleotidů (primární strukturou DNA). I bodová mutace tak změnou primární struktury může změnit i sekundární strukturu DNA 29

a tato změna je následně detekována. Metoda je využívána např. při analýzách blízce příbuzných taxonů či k identifikaci některých druhů v praktických aplikacích jako při kontrole původu konzumních ryb (Gil 2007). •

Denaturační gradientová gelová elektroforéza (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis, DGGE) (Fodde & Losekoot, 1994) Podobně jako SSCP i DGGE umožňuje separaci molekul DNA v polyakrylamidovém

gelu na základě odlišné sekvence. Fragment dvouřetězcové DNA prochází vlivem elektrického pole lineárně rostoucím gradientem koncentrace denaturačního činidla (např. močoviny či formamidu). V závislosti na teplotě tání (Tm) disociují jednotlivé domény DNA při různé koncentraci denaturantu, což má za následek sníženou elektroforetickou mobilitu fragmentu. Záměna jednoho páru bazí může změnit teplotu tání příslušné domény až o 1 °C a tím změnit pozici příslušného pruhu na elektroforetickém diagramu. Podobnou metodou je TGGE (teplotní gradientová gelová elektroforéza, Temperature Gradient Gel Electrophoresis, Myers et al. 1985), která však místo gradientu denaturačního činidla využívá teplotní gradient. Praktické aplikace obou metod jsou podobné jako u SSCP. •

Analýza mikrosatelitů Význam analýzy tzv. mikrosatelitů v molekulární genetice ryb se stále zvyšuje.

Mikrosatelity spolu s minisatelity patří do skupiny lokusů zvaných VNTRs (Variable Number Tandem Repeat loci). Jedná se o krátké, tandemově se opakující sekvenční motivy o délce 1-10 bp (nejčastěji jsou využívány di-, tri- a tetranukleotidové mikrosatelity), vyskytující se v kódujících i nekódujících oblastech prokaryotických i eukaryotických genomů (Zima et al. 2004). Počet opakování těchto motivů vykazuje značnou variabilitu (pro jeden lokus existují až desítky alel) a jednotlivé alely se liší délkou. Po amplifikaci pomocí PCR lze alely snadno rozlišit elektroforézou v agarózovém či polyakrylamidovém gelu, případně v automatických sekvenátorech. Mezi hlavní výhody mikrosatelitových markerů patří zejména jejich vysoká proměnlivost, která je důsledkem charakteristické vysoké mutační rychlosti, velký počet lokusů

distribuovaných

v

celém genomu,

kodominance

alel

umožňující

detekci

homozygotních i heterozygotních stavů, selektivní neutralita většiny lokusů, relativní snadnost analýzy a možnost analýzy více lokusů současně. Mezi nevýhody patří nutnost nalézt a identifikovat vhodné primery pro amplifikaci mikrosatelitů; u řady druhů však již byly popsány, často rovněž lze s výhodou použít 30

i mikrosatelity popsané u blízce příbuzného druhu. Vysoká mutační rychlost může vést k efektu velikostní homoplasie, kdy alely stejné velikosti u různých jedinců mohou být odlišné původem (nepochází ze společného předka), což může částečně zkreslit výsledky např. při analýzách populační diferenciace a evolučních vztahů mezi populacemi. Nevýhodou může být také vyšší finanční náročnost v případě použití fluorescenčně značených primerů a automatického sekvenátoru. Spektrum praktického využití mikrosatelitů je velmi rozsáhlé: využívány jsou v řadě studií pro posouzení variability, velikosti a struktury populací (např. Sušnik et al. 2004), pro studium hybridizace (např Hänfling et al. 2005), k identifikaci jedinců, při paternitních či forenzních analýzách (např. Renshaw et al. 2006, Dierkes et al. 2008), při konstrukci vazbových map atd. V této práci byla analýza mikrosatelitů využita pro detekci hybridizace mezi karasem obecným a karasem stříbřitým a pro charakteristiku klonálních populací karasa stříbřitého. •

Sekvencování DNA Přímé stanovení sekvence DNA má své kořeny v roce 1977, kdy byly dvěma

nezávislými týmy vyvinuty dvě odlišné metody sekvencování (Maxam & Gilbert 1977, Sanger et al. 1977). Rozvoj sekvenačních technik a zavedení automatických sekvenátorů postupně umožnily značné rozšíření této techniky. V současnosti je spolu s mikrosatelitovými analýzami nejpoužívanější metodikou – podle Zimy et al. 2004 tvořily studie sekvencí nukleových kyselin přibližně polovinu všech molekulárních studií a čtvrtinu všech fylogenetických studií. Mezi výhody sekvencování patří zejména možnost rychle získávat informaci o základní struktuře genetického materiálu, s velmi vysokým počtem zkoumaných znaků (nukleotidů). Nevýhodou jsou především poměrně značné provozní náklady. V současnosti je nejčastěji využívána modifikace Sangerovy metody, kdy v procesu asymetrické sekvenační PCR jsou v reakční směsi vedle primerů a směsi všech čtyř nukleotidů přítomny i jejich analogy, fluorescenčně značené dideoxynukleosidtrifosfáty. Při jejich náhodném začlenění do řetězce místo normálního nukleotidu dojde k zastavení syntézy řetězce. Výsledkem je směs produktů lišících se délkou vždy o jedinou bázi. Tyto fragmenty jsou následně separovány elektroforeticky v automatickém sekvenátoru a na základě detekce fluorescenční značky na konci fragmentu je zaznamenávána sekvence analyzovaného segmentu DNA do počítače.

31

Sekvencování jaderných i mitochondriálních DNA markerů je v ichtyologii široce aplikováno ve velkém množství studií evoluce genů, taxonomických studiích, analýzách populační variability, v biogeografii, v širokém rozpětí fylogenetických studií, v konzervační genetice atd. V této práci bylo využito sekvencování dvou markerů mitochondriální DNA (kontrolní oblasti jako hlavního markeru a genu pro cytochrom b jako vedlejšího doplňkového markeru), které patří k nejvyužívanějším ve fylogenetických studiích ryb řádu Cypriniformes, pro něž poskytují dostatečnou variabilitu (Liu et al. 2002). Další podkapitola je tedy věnována mitochondriální DNA se zaměřením na tyto dva markery.

2.7. Využití mitochondriálních markerů 2.7.1. Mitochondriální DNA Mitochondriální DNA (též mtDNA) je malá zpravidla kruhová molekula DNA (u obratlovců cca 16 500 bází), která je v buňkách přítomna v několika stovkách až tisících kopií. U ryb nese 37 genů, z toho 24 kóduje součásti proteosyntetického aparátu mitochondrií (geny pro tRNA a rRNA) a 13 genů kóduje enzymatické proteiny respiračního řetězce (cytochrom b, NADH dehydrogenáza, cytochrom c oxidáza, ATP syntáza). Nejdůležitější nekódující sekvencí mtDNA je kontrolní oblast (control region, D-loop), která reguluje replikaci a transkripci mitochondriálního genomu. Schématická mapa mtDNA je na Obr. 4. Mitochondriální DNA má mnohé výhody, pro které je často používána při mapování genetické variability: 1) je relativně malá a snadno izolovatelná, 2) je haploidní a u většiny druhů maternálně děděná, 3) až na výjimky nepodléhá rekombinaci, 4) má vysokou evoluční rychlost, ve srovnání s jadernými sekvencemi 5-10x vyšší (Wilson et al. 1985), 5) mutace mají většinou podobu substitucí, vzácněji podobu inzercí/delecí (Avise 2004). Jednotlivé regiony mtDNA se liší rychlostí svého vývoje, a proto jsou jako molekulární markery vhodné pro odlišné typy studií. Geny pro ribozomální RNA jsou u ryb mírně konzervativní a jsou používány zejména pro fylogenetické studie na vyšších taxonomických úrovních (čeledí až řádů, Wiley et al. 1998). Další geny (např. geny pro ATP syntázu, cytochrom b či NADH dehydrogenázu) jsou poněkud variabilnější, a proto jsou používány pro fylogenetické studie na nižších úrovních (čeledí až rodů). Gen pro podjednotku I cytochrom c oxidázy (COI) je v současnosti často využíván jako tzv. „DNA barcode of life“ u řady druhů živočišných i rostlinných (Hebert et al. 2004, Ivanova et al. 2007, Ward &

32

Holmes 2007). Kontrolní oblast (control region) obsahuje mezi konzervativními funkčními oblastmi vysoce variabilní nekódující místa, a proto je často používána pro analýzu blízce příbuzných taxonů na úrovni rodů a druhů (např. Murakami et al. 2001).

Obr. 4. Schématická mapa mitochondriální DNA. Převzato a upraveno z Alexeyev et al. (2004).

2.7.2. Kontrolní oblast Kontrolní

oblast

(control

region,

D-loop)

je

hlavní

nekódující

oblastí

mitochondriálního genomu. Její délka se pohybuje mezi 880-1400 bp (Sbisa et al. 1997). Reguluje replikaci těžkého řetězce a transkripci všech mtDNA genů. Obvykle je považována za nejvariabilnější část mtDNA z hlediska nukleotidových substitucí, krátkých inzercí a delecí a dynamice proměnlivých tandemových repetic (Liu et al. 2002). Tyto mutace a strukturální

33

přestavby však nejsou distribuovány náhodně po celé kontrolní oblasti, ale ovlivňují především určitá hypervariabilní místa a domény (Yang 1996). Struktura kontrolní oblasti byla studována u mnoha obratlovců, nicméně u ryb zůstávala dlouho nejasná. V současnosti jsou v kontrolní oblasti rozeznávány tři domény: ETAS doména (u cyprinidů cca 240-260 bp), centrální doména (cca 340 bp) a CSB doména (cca 340-370 bp) (Liu et al. 2002). V ETAS doméně (extended termination-associated sequences) popsala u savců Sbisa et al. (1997) dva konzervativní bloky (ETAS1 a ETAS2). Liu et al. (2002) nalezl u řádu Cypriniformes pouze blok ETAS1. Doména se pravděpodobně podílí na regulaci replikace a transkripce mtDNA (Sbisa et al. 1997). Pro vysokou míru variability je považována za užitečnou pro studium vnitro- a mezidruhové evoluce (Liu et al. 2002). Centrální doména je nejvíce konzervována, její funkce je nicméně dosud neznámá. Southern et al. (1988) ji poprvé identifikoval u savců a popsal v ní pět konzervativních bloků (CSB-B až F). Lee et al. (1995) definoval u Teleostei pouze blok podobný CSB-D. Liu et al. (2002) nalezl motivy CSB-D, CSB-E a pozměněný (prodloužený) blok ECSB-F. CSB doména (conserved sequence block) je délkově nejvariabilnější a rozlišují se v ní tři větší konzervativní bloky CSB-1, CSB-2 a CSB-3. Podílí se na replikaci mtDNA (Sbisa et al. 1997). Liu et al. (2002) ji u řádu Cypriniformes shledal dosti konzervovanou a považuje ji proto za vhodnou pro fylogenetické studie.

2.7.3. Gen pro cytochrom b Cytochrom b je centrální katalytickou podjednotkou enzymu ubiquinol cytochrom c reduktázy, která je mj. součástí dýchacího řetězce mitochondrií (Esposti et al. 1993). Gen pro cytochrom b je mezi mitochondriálními DNA markery pravděpodobně nejlépe znám a je také nejpodrobněji popsán co do struktury a funkce svého proteinového produktu. Délka tohoto genu je přibližně 1140 bp (Irwin et al. 1991). Obsahuje pomalu i rychle se vyvíjející regiony a je tak považován za jeden z nejužitečnějších DNA markerů pro fylogenetiku. Je využíván ve velké řadě studií zabývajících se fylogenetikou ryb (např. Song et al. 1998, Zardoya & Doadrio 1999, Perdices & Doadrio 2001, Sloss et al. 2004, Tang et al. 2006 aj.). Má ovšem i svá omezení, zejména nevyvážené nukleotidové složení, saturaci na třetí pozici v kodonu a omezenou variabilitu v první a druhé pozici kodonu (Meyer 1994, Farias et al. 2001), proto je často využíván v kombinaci s dalšími markery.

34

3. CÍLE DISERTAČNÍ PRÁCE Karas stříbřitý, nepůvodní prvek, který se v průběhu 30 let stal významnou částí ichtyofauny České republiky, byl v posledních letech předmětem intenzivního výzkumného zájmu Ichtyologického oddělení Ústavu biologie obratlovců AV ČR, v. v. i. Oproti většině ostatních druhů má karas stříbřitý některé specifické vlastnosti, které mu umožnily stát se nejúspěšnějším okupantem, který osídlil vody Evropy. Vedle široké ekologické valence a nenáročnosti je pro něj charakteristická proměna ploidního a sexuálního statusu v průběhu času a s tím související i uplatňování sexuální a asexuální (gynogeneze) formy reprodukce. Souběžně s výzkumem těchto a dalších aspektů biologie karasa stříbřitého (formy gibelio) vyvstala i otázka jeho genetické diverzity a její případné souvislosti s vysokou úspěšností jeho okupace nových teritorií. Počáteční výzkumy genetické diverzity karasa stříbřitého byly soustředěny především na soutok řek Moravy a Dyje, oblast jeho prvního výskytu, kam pronikl automigrací z Dunaje. Na základě prvních analýz byly postupně vymezovány další dílčí problémy, které se staly předmětem výzkumu. Část problematiky byla zpracována v rámci této práce, další dílčí problémy je však nutno řešit v kontextu materiálu z oblasti Ukrajiny, Ruska a Dálného Východu, což bude předmětem dalšího budoucího výzkumu. Problematika genetické diverzity komplexu Carassius auratus ve vodách České republiky a Slovenska byla řešena v rámci grantového projektu „Genetická, populační a reprodukční

variabilita

invazní

ryby,

Carassius

‚gibelio‘

s alternujícím

bisexuálně/asexuálním rozmnožováním ve střední Evropě“ (grant GA ČR 206/05/2159, doba řešení 2005-2007, odpovědný řešitel RNDr. Věra Lusková, CSc.). Problematiku genetické diverzity této ryby jsem řešil samostatně a proto byla genetická diverzita karasa stříbřitého zvolena jako základní náplň předkládané disertační práce. V rámci řešeného tématu je možné vyčlenit následující tři dílčí cílové okruhy:

1. Posouzení genetické struktury populací komplexu karasa stříbřitého v České republice a na Slovensku s ohledem na možný výskyt různých forem a jejich identifikaci na základě analýz mitochondriální DNA 2. Molekulárně-genetická analýza hybridizace mezi karasem stříbřitým a karasem obecným na lokalitě v aluviálním území dolního toku řeky Dyje 3. Molekulárně-genetická analýza populace karasa stříbřitého z umělého mokřadu v zátopovém území řeky Moravy.

35

4. MATERIÁL A METODY 4.1. Genetická diverzita komplexu Carassius auratus v ČR a na Slovensku 4.1.1. Sběr vzorků a DNA extrakce Sběry vzorků pro molekulárně-genetické analýzy provedl kolektiv Ichtyologického oddělení ÚBO AV ČR, v. v. i., v letech 2004-2007. Šest vzorků z lokality č. 23 „Kežmarok“ poskytl Mgr. Ladislav Pekárik z Ústavu zoológie Slovenskej akadémie vied. Celkem bylo sebráno 338 jedinců karasa stříbřitého z 9 lokalit v České republice a 14 lokalit na Slovensku. Odlov jedinců byl prováděn elektrolovem. Geografickou polohu sběrových lokalit zachycuje mapa na Obr. 5, z níž je patrné, že se nacházejí ve všech hlavních povodích a oblastech, kde se karas stříbřitý vyskytuje. Přehledné informace o původu vzorků jsou uvedeny v Tab. 1.

Tab. 1. Přehled lokalit a počtů sebraných vzorků karasa stříbřitého. * – 11 ryb z lokality č. 7 „Soutok“ mělo fenotyp okrasné formy C. a. auratus č. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23

lokalita Střekov Novořecká bašta (tůň) Soběslav Vodňany Blatná CHKO Poodří Soutok Chomoutov Hrdibořice Trnava VN Kolíňany VN Duchonka Kalinovo Papradno Seňa Perín Veľké Trakany Hraň Zemplínská Šírava Oborín Sv.Mária Státní hranice Kežmarok

vodní tok Labe Lužnice Lužnice Blanice rybníky Odra Dyje/Morava umělý močál rybníky umělá nádrž Bocegaj Železnica Ipeľ Papradnianka Belžanský potok rybníky Tisa Trnávka Čierna voda Starý Laborec Radský kanál Panelový kanál Poprad

povodí

úmoří

Labe

Severní moře

Odra

Baltské moře

Dunaj

Černé moře

stát

Česká rep.

Dunaj

Černé moře Tisa

Visla

Baltské moře

Slovensko

počet 15 3 5 11 7 17 103 (11)* 41 2 7 4 9 5 6 1 19 6 10 43 12 2 4 6

36

Obr. 5. Mapa České republiky a Slovenska s vyznačením lokalit, na kterých byly sebrány vzorky karasa stříbřitého pro molekulárně-genetické analýzy. Čísla lokalit jsou shodná s Tab. 1.

Rybám byly na místě odebrány ústřižky ploutví do ethanolu a ryby byly následně puštěny zpět do vody nebo transportovány živé do laboratoře, kde byly prováděny další analýzy (morfologické, odběr krve pro stanovení ploidie, stanovení pohlaví apod.).

37

Kromě jedinců karasa stříbřitého chycených ve volných vodách České republiky a Slovenska bylo analyzováno 12 jedinců různých variet okrasného karasa (8x shubunkin, 2x teleskopka-demekin, 1x závojnatka-ryukin, 1x oranda), získaných z komerčních akvarijních chovů. U vybraných jedinců byla pracovníkem Ichtyologického oddělení ÚBO AV ČR, v. v. i., Ing. Karlem Halačkou, CSc., metodou krevních roztěrů nebo flowcytometricky stanovena ploidie a určeno pohlaví (v terénu v době tření nebo v laboratoři při pitvě). Přehled materiálu z hlediska ploidie a pohlaví je uveden v Tab. 2.

Tab. 2. Ploidie a pohlaví sebraných karasů stříbřitých č. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24

lokalita Střekov Novořecká bašta (tůň) Soběslav Vodňany Blatná CHKO Poodří Soutok Chomoutov Hrdibořice Trnava VN Kolíňany VN Duchonka Kalinovo Papradno Seňa Perín Veľké Trakany Hraň Zemplínská Šírava Oborín Sv.Mária Státní hranice Kežmarok akvaristika CELKEM

počet 15 3 5 11 7 17 103 41 2 7 4 9 5 6 1 19 6 10 43 12 2 4 6 12 350

samci 9

3 41

2 2

2 9 3 1

2 74

samice neurčeno 2n 6 10 3 5 11 1 7 6 8 6 53 9 66 41 2 5 4 7 5 6 1 19 2 6 6 8 4 11 23 29 9 7 1 1 4 6 3 7 12 203 73 144

3n 5

4n

neurčeno 3 5

10 7 11 34 41

3 2 7 4 9 5 6

1 16

1

6 14 5 1 4 6 155

1

50

Celková genomová DNA byla izolována z ústřižků ploutví standardní metodou extrakce pomocí proteinázy K, fenol-chloroform-isoamylalkoholové extrakce a precipitace ethanolem dle Sambrook et al. (1989) s malými modifikacemi:

1. Vzorek ploutve osušit a vložit do 1,5ml zkumavky; 2. Přidat 500 µl STE pufru;

38

3. Přidat 30 µl 10 % SDS; 4. Přidat 20 µl proteinázy K (10 mg/ml v 50% v/v glycerolu); 5. Inkubovat v termobloku při 50 °C přes noc; 6. V digestoři přidat 500 µl směsi fenol:chloroform:isoamylalkohol (PCIA) 25:24:1; 7. Točit 15 min na rotační míchačce; 8. Centrifugovat 15 min při 4 °C a 14 000 otáčkách za minutu (14 000/15´/4 °C) ; 9. Přenést horní vodnou fázi do nové zkumavky; 10. V digestoři přidat 500 µl PCIA; 11. Točit 10 min na rotační míchačce; 12. Centrifugovat 14 000/10´/4 °C; 13. Přenést horní fázi do nové zkumavky; 14. V digestoři přidat 500 µl směsi chloroform:isoamylalkohol 24:1; 15. Točit 10 min na rotační míchačce; 16. Centrifugovat 14 000/10´/4 °C; 17. Přenést horní fázi do nové zkumavky; 18. Přidat 3 díly 96% etanolu; 19. Jemně protřepat, a po vysrážení DNA pomalým obracením nechat klubíčko DNA sbalit a klesnout na dno; 20. Centrifugovat 14 000/30´/4 °C; 21. Odlít supernatant; 22. Přidat 350 µl 70% etanolu; 23. Centrifugovat 14 000/5´/4 °C; 24. Odsát supernatant a pelet vysušit pod alobalem.

Izolovaná DNA byla následně resuspendována v TE pufru (10 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 mM EDTA). Pokus o molekulárně-genetickou analýzu starších vzorků různého původu nebyl úspěšný pro fixaci těchto vzorků formaldehydem před dlouhodobým přechováváním v ethanolu, což znemožnilo úspěšnou izolaci DNA z těchto vzorků.

4.1.2. Použité molekulární markery Hlavním použitým molekulárním markerem byla část kontrolní oblasti (D-loop) mitochondriální DNA. Pro amplifikaci zvolené oblasti byly pracovníkem Ichtyologického oddělení ÚBO AV ČR, v. v. i., Mgr. Janem Mendelem, Ph.D., na základě analýzy 39

konsenzuálních sekvencí kontrolní oblasti u cyprinidů nově navrženy primery CarU32 (5‘-CCA AAG CCA GAA TTC TAA AC-3‘) a CarL509 (5‘-GCA TGT GGG GTA ATG A-3‘). Tyto primery byly použity k amplifikaci PCR produktu o délce 475-493 bp, pokrývajícího celou ETAS doménu a větší část centrální domény kontrolní oblasti (viz kapitola 2.7.2). Polymerázová řetězová reakce byla prováděna v termocycleru T-GRADIENT (Biometra, Německo) v celkovém objemu 50 µl. Složení reakční směsi: 1x reakční pufr, 1,5 mM MgCl2, 200 µM dNTP, 2 µM primery, 100 ng genomové DNA, 1,5 U Taq polymerázy. Amplifikace probíhala podle protokolu:

1. počáteční denaturace

95 °C/60 s

2. 32 cyklů

94 °C/45 s 50 °C/30 s 72 °C/45 s

3. finální extenze

72 °C/7 min

U vybraných jedinců byl amplifikován rovněž gen pro cytochrom b (1141 bp) s použitím primerů GluDG.L (5’-TGA CTT GAA RAA CCA YCG TTG-3‘, Palumbi 1996) a H16460 (5‘-CGA YCT TCG GAT TAA CAA GAC CG-3‘, Perdices & Doadrio 2001), s použitím stejného složení reakční směsi jako v případě amplifikace kontrolní oblasti, podle následujícího protokolu:

1. počáteční denaturace

95 °C/2 min

2. 34 cyklů

94 °C/45 s 58 °C/45 s 72 °C/90 s

3. finální extenze

72 °C/7 min

Produkty PCR reakcí byly přečištěny precipitací směsí PEG/Mg/NaAc (26% polyethylenglykol, 6,5 mM MgCl2.6H2O, 0,6 M NaAc.3H2O) následovně: 1. Do zkumavky se 40 µl amplifikátu napipetovat 40 µl PEG/Mg/NaAc; 2. Zamíchat na vortexu a nechat 10-15 min stát při laboratorní teplotě; 3. Centrifugovat 14 000/20´/4 °C; 4. Odsát supernatant a k peletu přidat 150 µl 96 % etanolu;

40

5. Centrifugovat 14 000/10´/4 °C; 6. Odsát supernatant a promýt 150 µl 70 % etanolu; 7. Centrifugovat 14 000/10´/4 °C; 8. Odsát supernatant a vysušit pelet; 9. DNA rozpustit ve 25 µl PCR vody.

Přečištěné PCR produkty byly následně použity pro sekvenační PCR s použitím kitu TM

BigDye

Terminator Cycle Sequencing Kit v1.1 (Applied Biosystems, USA) podle návodu

a instrukcí výrobce. Produkty sekvenační reakce byly přečištěny etanolovou precipitací: 1. Produkty sekvenační PCR přenést do zkumavek používaných pro sekvencování; 2. Přidat 2,5 µl 125 mM EDTA (5 µl zásobní EDTA:15 µl PCR vody); 3. Přidat 25 µl 96% etanolu; 4. Uzavřít, několikrát převrátit a nechat stát při laboratorní teplotě 15 min; 5. Centrifugovat 3000/30´/4 °C; 6. Ihned odsát supernatant a přidat 30 µl 70% etanolu; 7. Centrifugovat 1650/15´/4 °C; 8. Odsát supernatant a vysušit v termobloku pod alobalem při 60 °C; 9. Pelet rozpustit ve 20 µl formamidu.

Přečištěné produkty sekvenační PCR byly následně sekvencovány automatickým sekvenátorem ABI Prism 310 Genetic Analyser (Applied Biosystems, USA). Všechny analyzované fragmenty byly sekvencovány z obou (5’ a 3’) konců. Výsledné chromatogramy byly upraveny a sesazeny pomocí programu Lasergene v 6.0 (DNASTAR Inc., USA) nebo programem MEGA 4.0 (Tamura et al. 2007).

4.1.3. Statistické vyhodnocení Haplotypová diverzita (Nei 1987) byla vyhodnocena programem DnaSP 4.5.0 (Rozas et al. 2003). Chi-square test homogenity frekvence bází byl proveden v programu PAUP* 4.0b10 (Swofford 2003). Pro výběr evolučního modelu, který nejlépe odpovídal jednotlivým datovým souborům, byl ve všech případech použit program Modeltest 3.8 v internetové aplikaci Modeltest Server 1.0 (http://darwin.uvigo.es/software/modeltest_server.html) (Posada & Crandall 1998). Pro výpočet genetických vzdáleností a konstrukci fylogenetických stromů byl 41

vybrán model TN93 s gamma korekcí (TN93+G, Tamura & Nei 1993). Fylogenetické vztahy mezi haplotypy byly rekonstruovány v programech MEGA 4.0 a PAUP* 4.0b10 pomocí algoritmů neighbour-joining (NJ, Saitou & Nei 1987) a maximální úspornosti (maximum parsimony, MP). Pro zhodnocení robustnosti stromů byla použita bootstrap analýza (1000 replikací), která statisticky hodnotí pravděpodobnost konkrétní topologie stromu. Bayesova analýza (BI) byla aplikována programem MrBayes 3.1.2 (Huelsenbeck & Ronquist 2005). Stromy generované před dosažením stacionarity byly vyřazeny. Konsenzuální hodnota posteriorních pravděpodobností pro vygenerovaný strom byla stanovena na 50 %. Pro vizualizaci dat generovaných programem MrBayes byl použit program FigTree 1.1.2 (Rambaut 2008). Jako outgroupové sekvence pro zakořenění fylogenetických stromů byly použity vlastní sekvence karasa obecného a kapra obecného. Kromě sekvencí získaných při vlastním výzkumu byly při fylogenetických analýzách použity také sekvence kontrolní oblasti a genu pro cytochrom b od dalších autorů. Tyto sekvence byly získány z databáze GenBank (přístupová čísla EF633642-EF633680, NC006580, AB052299-AB052335, EF055472, AB111951, AB006953, AB045144). Pro posouzení genealogických vztahů mezi haplotypy kontrolní oblasti byla konstruována haplotypová síť pomocí programu Network 4.2.0.1 (Bandelt et al. 1999) s využitím algoritmu „median joining“.

4.2. Analýza hybridizace mezi karasem stříbřitým a karasem obecným Podrobnější molekulárně-genetické analýzy byly prováděny u pěti jedinců karasa obecného (tři samci, dvě samice), pěti jedinců C. a. gibelio (dva samci a tři samice – těchto pět ryb je zahrnuto v přehledu materiálu v Tab. 1 a 2 – lokalita č. 7 „Soutok“) a u devíti předpokládaných hybridů (čtyři samci a pět samic). Tyto ryby byly získány v říjnu roku 2005 elektrolovem v říčním rameni typu parapotamon v aluviálním území dolního toku řeky Dyje (48° 43’ 25‘‘ N, 16° 53‘ 20‘‘ E). Všem jedincům byl odebrán ústřižek ploutve do 96% ethanolu. Celková genomová DNA byla izolována podle protokolu uvedeného v kapitole 4.1.1. U zkoumaných jedinců byla amplifikována a sekvencována část kontrolní oblasti mtDNA podle protokolu uvedeného v kapitole 4.1.2. Dále byly amplifikovány čtyři mikrosatelitové markery GF17, GF29, MFW2 a MFW7 (Zheng et al. 1995, Crooijmans et al. 1997). Polymerázová řetězová reakce byla prováděna v termocycleru T-GRADIENT

42

(Biometra, Německo) v celkovém objemu 15 µl. Složení reakční směsi: 1x reakční pufr, 1,5 mM MgCl2, 200 µM dNTP, 2 µM primery, 30 ng genomové DNA, 0,5 U Taq polymerázy. Podmínky PCR byly následující:

1. počáteční denaturace

94 °C/2 min

2. 40 cyklů

92 °C/15 s 52-58 °C/20 s 72 °C/30 s

3. finální extenze

72 °C/10 min

Annealingová teplota byla 52 °C (marker GF29), 55 °C (GF17, MFW2) nebo 58 °C (MFW7). Získané PCR produkty byly 20x zředěny a podrobeny fragmentační analýze v automatickém sekvenátoru ABI Prism 310 Genetic Analyser (Applied Biosystems, USA). Velikosti alel byly odečteny v programu GeneScan 3.7 (Applied Biosystems, USA). Výsledné genotypy byly porovnány s rozmezími velikostí alel C. carassius a C. a. gibelio publikovaných v Hänfling et al. (2005). Pro vizualizaci genetických rozdílů mezi rodičovskými druhy a hybridy byla provedena trojrozměrná faktoriální korespondenční analýza (Factorial Correspondence Analysis, FCA) v programu Genetix 4.05.2 (Belkhir et al. 2004).

4.3. Analýza mikrosatelitových markerů u populace karasa stříbřitého z umělého mokřadu Chomoutov Ryby z lokality č. 8 „Chomoutov“ byly na základě vizuálního posouzení rozděleny do dvou skupin (vysokohřbeté a nízkohřbeté) v závislosti na výšce těla. Z každé skupiny bylo pro molekulárně-genetické analýzy použito 10 ryb. Všechny testované ryby byly triploidní samice. Vedle analýzy kontrolní oblasti mitochondriální DNA (viz kapitola 4.1) u nich byla provedena také analýza šesti mikrosatelitových markerů GF17, GF29, MFW7, MFW17, J1 a J62 (Zheng et al. 1995, Crooijmans et al. 1997, Yue & Orban 2002). Markery GF17, GF29 a MFW7 byly amplifikovány podle protokolu uvedeného v kapitole 4.2. Marker MFW17 byl amplifikován podle protokolu:

43

1. počáteční denaturace

94 °C/2 min

2. 40 cyklů

92 °C/15 s 58 °C/20 s 72 °C/30 s

3. finální extenze

72 °C/10 min

Markery J1 a J62 byly amplifikovány za podmínek:

1. počáteční denaturace

94 °C/2 min

2. 34 cyklů

94 °C/30 s 50-55 °C/30 s 72 °C/30 s

3. finální extenze

72 °C/5 min

Annealingová teplota byla 50 °C (marker J1) nebo 55°C (J62). Získané PCR produkty byly 20x zředěny a podrobeny fragmentační analýze v automatickém sekvenátoru ABI Prism 310 Genetic Analyser (Applied Biosystems, USA). Velikosti alel byly odečteny v programu GeneScan 3.7 (Applied Biosystems, USA).

44

5. VÝSLEDKY 5.1. Genetická diverzita komplexu Carassius auratus v ČR a na Slovensku 5.1.1. Analýza kontrolní oblasti 5.1.1.1. Molekulární charakterizace Nukleotidové sekvence o délce 475-493 bp byly získány celkem u 350 jedinců komplexu Carassius auratus. Alignment těchto sekvencí prokázal existenci 60 variabilních míst (12,2 %), včetně 23 inzercí/delecí; 59 variabilních míst bylo parsimonně informativních. Chi-square test homogenity frekvence bází mezi variabilními místy nevykázal statisticky významnou hodnotu P (chi square = 0,717; df = 45; P = 1,0). Frekvence bází proto byly považovány za homogenní. Variabilní místa konstituovala celkem 16 odlišných haplotypů, které byly označeny G01-G13, A01, L01 a M01 (Tab. 3). Tato označení vyplývají z dalších fylogenetických analýz, ale pro přehlednost jsou použita již zde. Identifikované haplotypy byly uloženy do databáze GenBank pod přístupovými čísly FJ167410-FJ167425. Sekvenční variabilita byla dána převážně tranzicemi (poměr Ti/Tv = 4,1). Jednotlivé haplotypy se mezi sebou lišily v 1-25 bp. Genetické vzdálenosti mezi jednotlivými haplotypy zhodnocené algoritmem TN93 se pohybovaly mezi 0 % (rozdíl pouze v inzercích/delecích) a 5,16 % (v průměru 1,67 %). Nejčastějším haplotypem byl G02 (163 jedinců, tj. 46,6 %), druhým nejčastějším haplotyp G04 (36 jedinců, tj. 10,3 %). Naopak haplotypy G08 a G10 se vyskytly u jediného jedince, blíže viz Tab. 3. Co se vztahu mezi haplotypy a původem zkoumaných jedinců týče, u jedinců karasa stříbřitého z volných vod ČR a Slovenska byly zaznamenány všechny identifikované haplotypy, u ryb z volné přírody (lokalita č. 7 „Soutok“) vykazujících fenotyp okrasných forem byly identifikovány haplotypy G04 a A01, u komerčně dostupných okrasných forem „goldfish“ byly zjištěny haplotypy A01 a G02.

45

Tab. 3. Přehled haplotypů a sekvenční variace kontrolní oblasti u zkoumaných C. auratus. Údaje týkající se původu ryb: Karas stříbřitý – populace z volných vod; ferální „goldfish“ – ryby z lokality č. 7 „Soutok“ vykazující fenotyp ornamentálních forem; „goldfish“ – komerčně dostupné zlaté rybky získané z akvarijních chovů. Číselné hodnoty reprezentují počty jedinců s příslušným haplotypem. Tečky znázorňují nukleotidy identické s první uvedenou sekvencí. Pomlčky znázorňují deleci v daném místě ve srovnání s první uvedenou sekvencí.

Variabilní místo Haplotyp

Karas stříbřitý

ferální „goldfish“

„goldfish“

celkem

111 1112222222 2333333333 3334444444 3445566777 8888888888 9999999244 5560223477 9001112345 5670122677 7130707789 0123456789 0123467618 1323599557 9890162962 6649634669

G01

17

G02

161

G03

3

G04

35

2 1

17

GACATA-TAT TACATTAATG CATTATATAG ATAATGTCTC ACTAATGAGT TTGTCATAGC

163

......A... .......... .......... ...GC..... .......... ....T.....

3

......A... .......... .....A...A ....C..... .......... ....T.....

36

......A--- ---------- -----..... ...GC..... .......... ....T.....

G05

2

2

......A... .......... .......... ...GC...C. .......... ....T.....

G06

17

17

......A... .......... .......... ...GC..... .......... ..........

G07

11

11

......-... .......... .......... ...GC..... .......... ....T.....

G08

1

1

......-... .......... .......... ...GC..... .......... ...GT....A

G09

7

7

......A... .......... .......... ...GC..... .......... ...GT.....

G10

1

1

......-... .......... .......... ...GC..... .......... ...GT.....

G11

5

5

....C.A... .......... .......... ...GC..... .......... ....T.....

G12

3

3

......A... ..A....... .......... ...GC..... .......... ....T.....

G13

8

8

......-... .......... .......... ....C..... .......... ..........

A01

1

21

...G..A... .......G.. T......A.A .CG.C.CT.. G.C-...... .CA...C...

L01

25

25

-G-..GA... .......... T.......GA TC..CA.T.T .TC-G.TGAC C.AG...G..

30

......A... .......... T.....G..A TC..C..T.T .....C.GA- ..AG.TC.T.

M01

30

celkem

327

10

11

10

12

46

5.1.1.2. Geografické rozložení haplotypů Počty jedinců příslušných haplotypů v jednotlivých povodích České republiky a Slovenska jsou uvedeny v Tab. 4. Výskyt haplotypu G02 byl téměř univerzální – jako jediný byl nalezen ve všech sledovaných povodích a lokalitách s výjimkou lokality č. 21 „Sv. Mária“ (z této lokality ovšem byli k dispozici pouze dva jedinci). Další haplotypy (G01, G06, G07, G09, G11, G13) byly zachyceny ve více povodích obou států. Naopak haplotypy G03, G05, G08, G10 a L01 byly zachyceny vždy jen na jediné lokalitě. Haplotyp G04 byl nalezen pouze v České republice (ve všech hlavních povodích), haplotyp G06 ve všech hlavních povodích mimo české i slovenské povodí Dunaje, haplotyp M01 v českém i slovenském úmoří Černého moře.

Tab. 4. Početní zastoupení jednotlivých haplotypů v povodích České republiky a Slovenska. Hd – haplotypová diverzita v daném povodí, S.E. – směrodatná odchylka haplotypové diverzity

haplotyp G01 G02 G03 G04 G05 G06 G07 G08 G09 G10 G11 G12 G13 A01 L01 M01 celkem Hd S.E.

Česká republika Slovensko komerční celkem chov Labe Odra Dunaj Dunaj Tisa Visla 6 3 7 1 17 32 5 67 25 31 1 2 163 3 3 7 3 26 36 2 2 1 4 8 4 17 1 10 11 1 1 4 1 2 7 1 1 3 2 5 3 3 1 7 8 1 10 10 21 25 25 5 3 22 30 41 17 146 31 97 6 12 350 0,096 0,706 0,552 0,342 0,757 0,600 0,609 0,062 0,075 0,043 0,101 0,033 0,215 0,029

Uváděné hodnoty haplotypové diverzity v rámci jednotlivých povodí je nutno chápat jako orientační, protože jsou ovlivněny počty vzorků z jednotlivých lokalit a počty 47

testovaných lokalit v rámci jednotlivých povodí. Přesto lze konstatovat, že v povodí Labe a ve slovenském povodí Dunaje byla zjištěna spíše nízká haplotypová diverzita, v ostatních povodích průměrná až vysoká (zejména v povodí Tisy, kde bylo nalezeno 12 různých haplotypů).

5.1.1.3. Vztah haplotypů, ploidie a pohlaví Výskyt haplotypů mezi jedinci v závislosti na ploidii a pohlaví je dokumentován v Tab. 5.

Tab. 5. Zastoupení jednotlivých haplotypů vzhledem k úrovni ploidie a pohlaví testovaných jedinců. Ploidie: 2n – diploid, 3n – triploid, 4n – tetraploid. „x“ značí záchyt příslušného haplotypu u jedinců dané ploidie či pohlaví.

haplotyp

počet

G01 G02 G03 G04 G05 G06 G07 G08 G09 G10 G11 G12 G13 A01 L01 M01 celkem

17 163 3 36 2 17 11 1 7 1 5 3 8 21 25 30 350

2n x x x x x x x

ploidie 3n 4n neznámo x x x x x x x x x x x x

samec x x x

x

x

x x x

x

x x x x

x

x

x

pohlaví samice neznámo x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x

Z celkového počtu 350 kusů C. auratus byla ploidie stanovena u 300 jedinců a pohlaví u 277 jedinců. Většina zkoumaných jedinců byla diploidní nebo triploidní. Haplotypy G01, G02, G04, G07 a G09 byly nalezeny u jedinců obou ploidií. Ryby s haplotypy A01 a M01 byly pouze diploidní, ryby haplotypů G06 a L01 byly pouze triploidní. Zbývající haplotypy se

48

vyskytovaly vzácně, takže nebylo možné vyhodnotit jejich případnou vazbu na úroveň ploidie. Byl rovněž zachycen jeden tetraploidní jedinec, nesl haplotyp G01. Pokud jde o závislost výskytu haplotypů na pohlaví, u samic byly nalezeny všechny haplotypy (což je vzhledem k maternální dědičnosti mitochondriální DNA pochopitelné). U samců, kteří byli až na čtyři triploidní výjimky vždy diploidní, bylo nalezeno 8 z celkového počtu 16 haplotypů. Zmínění čtyři triploidní samci nesli haplotypy G02 (dva kusy) a G04 (dva kusy).

5.1.1.4. Fylogenetická analýza Fylogenetická analýza 16 nalezených haplotypů kontrolní oblasti mitochondriální DNA byla provedena pomocí algoritmů „neighbour-joining“ (NJ), maximální úspornosti (MP) a Bayesovou analýzou (BA). I když se získané fylogenetické stromy v detailech liší topologií, analýza ve všech třech případech s vysokou bootstrapovou podporou (NJ, MP) či posteriorní pravděpodobností (BA) prokázala existenci čtyř jasně odlišených monofyletických haplotypových skupin či linií (Obr. 6, 7 a 8). Největší skupina G obsahuje 13 haplotypů (G01-13), linie A, L a M obsahují po jednom haplotypu (A01, L01 resp. M01). Genetické vzdálenosti na nukleotidové úrovni mezi takto definovanými liniemi se pohybují v rozmezí 3,16 % (vzdálenost M-L) a 4,94 % (vzdálenost L-A). Vzdálenosti těchto linií vzhledem k C. carassius dosahovaly hodnot 5,31-6,65 % (Tab. 6). Průměrná vnitrolinijní diverzita v rámci 13 haplotypů linie G činila 0,44 %.

Tab. 6. Párové genetické vzdálenosti mezi čtyřmi fylogenetickými liniemi komplexu Carassius auratus v ČR a na Slovensku a vzdálenosti těchto linií ke Carassius carassius založené na analýze kontrolní oblasti mitochondriální DNA.

G x G 0,0338 A 0,0487 L 0,0372 M C. carassius 0,0612

A x 0,0494 0,0379 0,0665

L

x 0,0316 0,0602

M

x 0,0531

C. carassius

x

49

Obr. 6. Fylogenetický strom 16 haplotypů kontrolní oblasti mitochondriální DNA nalezených u komplexu Carassius auratus v ČR a na Slovensku, získaný pomocí algoritmu „neighbour-joining“. Čísla u uzlů reprezentují hodnoty bootstrapové podpory topologie. Délky větví jsou v měřítku.

Obr. 7. Fylogenetický strom 16 haplotypů kontrolní oblasti mitochondriální DNA nalezených u komplexu Carassius auratus v ČR a na Slovensku, získaný pomocí algoritmu maximální úspornosti. Čísla u uzlů reprezentují hodnoty bootstrapové podpory topologie.

50

Obr. 8. Konsensuální fylogenetický strom 16 haplotypů kontrolní oblasti mitochondriální DNA nalezených u komplexu Carassius auratus v ČR a na Slovensku získaný pomocí Bayesovy analýzy. Čísla u uzlů reprezentují hodnoty posteriorních pravděpodobností topologie. Délky větví jsou v měřítku.

5.1.1.5. Haplotypová síť 16 nalezených haplotypů kontrolní oblasti, reprezentující 350 sekvencí, bylo použito pro konstrukci haplotypové sítě, která schematicky znázorňuje pravděpodobné vývojové vztahy mezi jednotlivými haplotypy (Obr. 9). Tuto síť lze rozdělit do čtyř oblastí korespondujících s nalezenými liniemi G, A, L a M. Síť dále ukazuje, že v rámci skupiny G, obsahující 13 haplotypů, je ancestrálním haplotypem nejčastěji se vyskytující haplotyp G02.

51

Obr. 9. Nezakořeněná haplotypová síť 16 haplotypů kontrolní oblasti mitochondriální DNA u komplexu Carassius auratus. Délky větví jsou v přibližném měřítku k počtu mutačních změn mezi jednotlivými haplotypy, s výjimkou haplotypu G04 (delece 17 bp je znázorněna jako jediný mutační krok). Mv1-8 – hypotetické haplotypy, které jsou přechodnými kroky mezi skutečně nalezenými haplotypy.

5.1.2 Analýza genu pro cytochrom b Pro potvrzení výsledků analýzy kontrolní oblasti (D-loop) byl sekvencován gen pro cytochrom b u celkem 12 vybraných jedinců komplexu Carassius auratus, a to vždy u tří jedinců s haplotypy D-loop G02, L01, M01 resp. A01, reprezentujících jednotlivé linie, a u jednoho jedince Carassius carassius, jehož sekvence byla použita jako outgroup. U každé trojice jedinců stejné linie D-loop byla zjištěna totožná sekvence genu pro cytochrom b, reprezentativní pro každou linii. Alignment čtyř získaných haplotypů o délce 1141 bp ukázal přítomnost 106 variabilních míst (9,3 %); 25 variabilních míst bylo parsimonně informativních. Sekvenční variabilita byla dána především substitucemi na třetí pozici v kodonu (95 variabilních míst), následuje pozice první (10 variabilních míst) a na druhé pozici bylo nalezeno jediné variabilní místo. Převládaly mutace typu tranzicí (poměr

52

Ti/Tv = 8,9). Nalezené haplotypy byly uloženy do databáze GenBank pod přístupovými čísly FJ169951-FJ169954. Genetické vzdálenosti na nukleotidové úrovni mezi haplotypy pro cytochrom b se pohybovaly v rozmezí 1,96 % (vzdálenost G-A) a 7,23 % (vzdálenost L-A). Vzdálenosti jednotlivých linií k C. carassius dosahovaly hodnot 10,55-10,86 % (Tab. 7). Fylogenetický strom konstruovaný pomocí algoritmu „neighbour-joining“ schematicky opět rozděluje čtyři linie podle podobného schématu jako v případě kontrolní oblasti (Obr. 10).

Tab. 7. Párové genetické vzdálenosti mezi čtyřmi fylogenetickými liniemi komplexu Carassius auratus v ČR a na Slovensku a vzdálenosti těchto linií vzhledem k Carassius carassius založené na analýze genu pro cytochrom b.

cytB G02 cytB A01 cytB L01 cytB M01 C. carassius

cytB G02 cytB A01 cytB L01 cytB M01 x 0,0196 x 0,0703 0,0723 x 0,042 0,0468 0,0693 x 0,1076 0,1055 0,1076 0,1086

C. carassius

x

Obr. 10. Fylogenetický strom čtyř haplotypů genu pro cytochrom b u komplexu Carassius auratus v ČR a na Slovensku, získaný pomocí algoritmu „neighbour-joining“. Čísla u uzlů reprezentují hodnoty bootstrapové podpory topologie. Délky větví jsou v měřítku.

5.2 Analýza hybridizace mezi karasem stříbřitým a karasem obecným U pěti jedinců karasa obecného (tři samci, dvě samice), pěti jedinců C. a. gibelio (dva samci, tři samice, všichni diploidní) a devíti předpokládaných hybridů (čtyři samci a pět samic) byla amplifikována a sekvencována část kontrolní oblasti mitochondriální DNA

53

a provedena fragmentační analýza čtyř mikrosatelitových markerů. Zjištěné genotypy ve čtyřech mikrosatelitových lokusech a haplotypy mitochondriální DNA jsou shrnuty v Tab. 8. Analýza čtyř mikrosatelitových markerů u kontrolních jedinců formy C. a. gibelio a jedinců C. carassius prokázala přítomnost alel, které spadají do velikostních rozmezí popsaných Hänflingem et al. (2005), s následujícími výjimkami: u C. carassius v markeru GF17 byla nalezena alela lišící se o jednu repetitivní jednotku (2 bp) od udávaných rozmezí a v markeru MFW7 byla kromě alel spadajících do udávaných rozmezí nalezena alela velikostně značně odlišná (158 bp), ale v souladu s poznatkem, že u C. carassius se vyskytují alely se sudou celkovou délkou. Celkem bylo u C. a. gibelio nalezeno v lokusu GF17 sedm alel (188-208 bp), v lokusu GF29 čtyři alely (195-201 bp), lokus MFW2 byl monomorfní (157 bp) a v lokusu MFW7 bylo zjištěno šest různých alel (175-195 bp). U C. carassius byly lokusy GF17 a MFW2 monomorfní (180 resp. 160 bp), v lokusu GF29 byly zjištěny čtyři alely (212-218 bp) a v lokusu MFW7 tři různé alely (158-190 bp). U devíti předpokládaných hybridních jedinců bylo nalezeno osm alel v lokusu GF17 (délka 180-210 bp), čtyři alely v GF29 (199-218 bp), dvě alely v MFW2 (157-160 bp) a jedenáct alel v MFW7 (158-199 bp; Tab. 8). Ve všech lokusech byla nalezena vždy jedna alela odpovídající C. carassius a jedna alela odpovídající formě C. a. gibelio (na základě velikostních rozmezí popsaných Hänflingem et al. (2005) nebo na základě alel pozorovaných u kontrolních jedinců). Jedinou výjimkou je marker GF17 u jedince HY05, u něhož se nicméně alela s předpokládaným původem z formy C. a. gibelio liší od očekávaných rozmezí pouze o jednu repetitivní jednotku (2 bp). V nejvariabilnějším markeru MFW7 byla u všech jedinců nalezena jedna alela, která odpovídá formě C. a. gibelio (lichá celková délka v patřičném rozmezí). Druhá alela u pěti jedinců odpovídala alele u kontrolních jedinců C. carassius, u třech dalších jedinců byla nalezena alela odpovídající rozmezí uváděnému Hänflingem et al. (2005). U posledního jedince byla nalezena alela lišící se o jednu repetitivní jednotku od zmíněného rozmezí.

54

Tab. 8. Mikrosatelitové genotypy a haplotypy mitochondriální DNA u formy C. a. gibelio (CAG), C. carassius (CC) a předpokládaných hybridů (HY). Pohlaví: M – samec, F – samice. CAG, CC – rozmezí velikostí alel uváděné Hänflingem et al. (2005) pro C. a. gibelio/C. carassius. Mikrosatelitové alely s pravděpodobným původem z formy C. a. gibelio jsou vyznačeny kurzívou, alely mimo rozmezí CAG a CC jsou vyznačeny tučně.

Mikrosatelitový lokus Číslo jedince

pohlaví

GF17

GF29

MFW2

MFW7

mtDNA

CAG01

M

188/188

195/201

157/157

175/175

G02

CAG02

F

188/188

199/199

157/157

175/175

G02

CAG03

M

190/204

197/199

157/157

177/181

G04

CAG04

F

194/208

197/197

157/157

183/183

G02

CAG05

F

192/198

197/201

157/157

179/195

G04

CC01

M

180/180

212/212

160/160

158/158

C. carassius

CC02

F

180/180

214/214

160/160

158/158

C. carassius

CC03

M

180/180

212/216

160/160

180/180

C. carassius

CC04

M

180/180

214/218

160/160

158/180

C. carassius

CC05

F

180/180

218/218

160/160

158/190

C. carassius

HY01

M

180/190

199/212

157/160

158/177

G04

HY02

M

180/192

199/218

157/160

180/195

G02

HY03

F

180/192

199/218

157/160

158/181

G04

HY04

F

180/188

199/212

157/160

158/179

G04

HY05

M

180/184

199/212

157/160

176/183

G02

HY06

F

180/204

199/214

157/160

180/199

G09

HY07

F

180/210

199/218

157/160

158/175

G02

HY08

M

180/194

199/212

157/160

179/196

G04

HY09

F

180/194

199/212

157/160

158/177

G04

CAG

186-220

193-207

157

175-199

CC

182

210-228

160

178-196

Trojrozměrná faktoriální korespondenční analýza (FCA) znázornila genetické rozdíly mezi rodičovskými taxony a hybridy. Rozdělila testované jedince na základě jejich

55

multilokusových genotypů do tří oddělených skupin reprezentujících oba rodičovské taxony a hybridy (Obr. 11).

Obr. 11. Trojrozměrná faktoriální korespondenční analýza multilokusových genotypů u Carassius auratus gibelio, Carassius carassius a jejich hybridů.

Analýza haplotypů mitochondriální DNA prokázala, že všichni předpokládaní hybridní jedinci nesou haplotyp odpovídající formě C. a. gibelio, a vzhledem k maternální dědičnosti mtDNA vznikli jednosměrným křížením samců C. carassius a samic formy C. a. gibelio.

5.3 Analýza mikrosatelitových markerů u populace karasa stříbřitého z umělého mokřadu Chomoutov U dvou desetičlenných skupin jedinců karasa stříbřitého z lokality č. 8 „Chomoutov“ (vysokohřbeté a nízkohřbeté ryby) byla kromě analýzy kontrolní oblasti mitochondriální DNA provedena také analýza šesti mikrosatelitových markerů. U každé skupiny byl zjištěn jediný multilokusový mikrosatelitový genotyp a všechny ryby z každé skupiny také nesly stejný haplotyp mitochondriální DNA (Tab. 9).

56

Tab. 9. Mikrosatelitové genotypy a haplotypy mitochondriální DNA u 20 jedinců karasa stříbřitého z umělého mokřadu v Chomoutově. mtDNA – haplotyp kontrolní oblasti mitochondriální DNA.

vysokohřbeté 188/190/192 GF17 GF29 199/199or207/207 Mikrosatelitový MFW7 179/179or199/199 lokus MFW17 222/222or226/226 147/147or163/163 J1 176/176or178/178 J62 G02 mtDNA

nízkohřbeté 190/190or192/192 191/191or199/199 175/175or199/199 212/212or216/216 127/127or135/135 124/124or178/178 L01

Analýza mikrosatelitů ukázala, že v mokřadu jsou přítomny dvě klonální linie gynogeneticky se rozmnožujících triploidních samic Carassius auratus. Tyto linie jsou odděleny: v lokusech MFW17 a J1 nesdílí ani jednu alelu a ve zbývajících lokusech se liší nejméně jednou alelou.

57

6. DISKUSE 6.1. Posouzení vhodnosti použitých technik a markerů Pro analýzu genetické variability komplexu Carassius auratus v České republice a na Slovensku byla jako primární použita metoda sekvencování mitochondriální DNA. Sekvencování mtDNA je v současnosti považováno za vysoce účinnou metodu pro taxonomické a systematické studie (Freeland 2005, Allendorf & Luikart 2007). Jako vhodné markery byly zvoleny dva úseky mtDNA, které patří mezi nejuniverzálnější a nejpoužívanější molekulární markery, a to kontrolní oblast (control region, D-loop) a gen pro cytochrom b. Jako hlavní marker bylo zvoleno sekvencování kontrolní oblasti, což je hlavní nekódující oblast mtDNA, považovaná v jejím rámci za nejvariabilnější úsek, který je proto často používaný i pro analýzu blízce příbuzných taxonů na úrovni rodů a druhů. Primery CarU32 a CarL509, které byly nově navrženy na základě analýzy konsenzuálních sekvencí mtDNA zástupců čeledi Cyprinidae dostupných v databázi GenBank, byly lokalizovány do konzervativní oblasti bezprostředně předcházející kontrolní oblasti (CarU32) a do centrální domény kontrolní oblasti (CarL509) tak, aby byla jejich použitelnost co nejuniverzálnější u širokého spektra druhů. Produkt amplifikovaný těmito primery o délce cca 470-500 bp pokrýval celou ETAS doménu (která je ze tří domén kontrolní oblasti mtDNA nejvariabilnější) a zhruba dvě třetiny centrální domény kontrolní oblasti. Lze konstatovat, že navržené primery svou úlohu splnily dle očekávání, neboť s jejich použitím byl po optimalizaci podmínek polymerázové řetězové reakce cílový úsek úspěšně amplifikován nejen u jedinců komplexu karasa stříbřitého, ale také u karasa obecného a kapra obecného (takto získané sekvence byly použity jako outgroupové při fylogenetických analýzách), cejna velkého či plotice obecné. Byla potvrzena předpokládaná vysoká variabilnost ETAS domény, představující v alignmentu o délce 493 bp (Tab. 3) úsek mezi 36. až 290. nukleotidem. V této oblasti se nacházelo 40 z 60 celkově detekovaných variabilních míst. Úsek centrální domény zahrnutý do amplifikovaného produktu obsahoval zbývajících 20 variabilních míst. Sekvencování kontrolní oblasti splnilo svůj účel, neboť při analýze 350 jedinců komplexu karasa stříbřitého z 22 lokalit (v případě okrasných forem také z umělého chovu) umožnilo zhodnotit genetickou variabilitu tohoto komplexu na území České republiky a Slovenska. Jako doplňkový marker pro potvrzení závěrů analýzy kontrolní oblasti byl zvolen gen pro cytochrom b. Pro jeho amplifikaci a sekvencování byly použity v literatuře publikované

58

a osvědčené primery GluDG.L (Palumbi 1996) a H16460 (Perdices & Doadrio 2001). Amplifikace proběhla úspěšně u všech testovaných jedinců a získané výsledky i přes užší rozsah analýz podpořily výsledky analýzy kontrolní oblasti. Kromě sekvenační analýzy mitochondriální DNA byly ve studiích zahrnutých do předkládané práce využity také mikrosatelitové (jaderné) markery. Pro analýzu hybridizace mezi karasem stříbřitým a karasem obecným byly podle dostupné literatury vytipovány čtyři mikrosatelitové markery GF17, GF29, MFW2 a MFW7 (Zheng et al. 1995, Crooijmans et al. 1997) odvozené z genomu karasa stříbřitého nebo kapra obecného, které byly Hänflingem et al. (2005) úspěšně použity pro detekci hybridizace mezi různými formami komplexu karasa stříbřitého, karasem obecným a kaprem obecným. Analýza těchto čtyř markerů proběhla a podařilo se touto cestou geneticky rozlišit rodičovské druhy i jejich hybridy. Pro bližší charakteristiku populace komplexu karasa stříbřitého v umělém mokřadu Chomoutov bylo úspěšně použito celkem šest mikrosatelitových markerů GF17, GF29, MFW7, MFW17, J1 a J62 (Zheng et al. 1995, Crooijmans et al. 1997, Yue & Orban 2002) odvozených z genomu karasa stříbřitého nebo kapra obecného. Pomocí těchto mikrosatelitů byly v mokřadu identifikovány dvě klonální linie karasa stříbřitého. Celkově se tedy všechny použité molekulární markery osvědčily pro účely, pro které byly použity.

6.2. Genetická diverzita komplexu Carassius auratus v ČR a na Slovensku Pro posouzení genetické diverzity populací komplexu karasa stříbřitého v České republice a na Slovensku byla sekvencována část kontrolní oblasti mitochondriální DNA (D-loop) u 338 vzorků z 23 populací z volných vod a u 12 vzorků pocházejících z komerčních chovů. Gen pro cytochrom b byl sekvencován u 12 vzorků. Fylogenetické analýzy obou markerů prokázaly na území České republiky a Slovenska přítomnost čtyř distinktních genetických linií, které byly označeny A, G, L a M, z nichž jedna, linie G, vykazuje v markeru D-loop značnou haplotypovou bohatost (zahrnuje 13 haplotypů), zatímco ostatní linie jsou zastoupeny jediným haplotypem. Zřetelné oddělení těchto linií je dokumentováno mezilinijními genetickými vzdálenostmi, které dosahovaly hodnot 3-5 % (D-loop) resp. 2-7 % (cytochrom b), přičemž pozorovaná vnitrolinijní diverzita v rámci linie G byla o řád nižší (0,44 %). Fylogenetické stromy a genetické vzdálenosti naznačují bližší příbuznost linií A a G ve srovnání s ostatními liniemi, což je patrné zejména z malé genetické vzdálenosti mezi liniemi A a G v markeru cytochrom b. Tento vývojový vztah je pozorovatelný i na

59

haplotypové síti, kde mají linie A a G společného předka reprezentovaného hypotetickým haplotypem mv5. Pro porovnání nalezených linií s existující taxonomickou strukturou byly využity sekvence z databáze GenBank a dalších publikovaných prací (např. Murakami et al. 2001, Li & Gui 2008). Pro toto porovnání byl jako reprezentativní haplotyp linie G vybrán její nejfrekventovanější haplotyp G02. Jednoduchý fylogenetický strom, obsahující vybrané sekvence D-loop haplotypových linií A, G, L a M, Carassius cuvieri, Carassius carassius a forem komplexu Carassius auratus, naznačuje pozici linií A, G, L a M v rámci rodu Carassius (Obr. 12). Oba fylogenetické stromy (NJ a MP) vykazovaly shodnou topologii a graficky znázorňují, že haplotypová linie G odpovídá formě C. a. gibelio, haplotypová linie A formě C. a. auratus, haplotypová linie L je nejbližší formě C. a. langsdorfii a haplotypová linie M stojí mimo ostatní známé formy C. auratus.

Obr. 12. Vztah zjištěných fylogenetických linií (černé tečky) k jednotlivým formám komplexu C. auratus na základě sekvencí kontrolní oblasti. Čísla u uzlů reprezentují hodnoty bootstrapové podpory topologie (NJ/MP). Délky větví jsou v měřítku vzhledem k analýze NJ.

Srovnání sekvencí genu pro cytochrom b u vybraných jedinců (haplotypy kontrolní oblasti G02, L01, M01, A01) a Carassius carassius se sekvencemi získanými z GenBank (sekvence C. a. buergeri a C. a. grandoculis nejsou k dispozici) poskytlo fylogenetické

60

stromy shodné topologie (Obr. 13), potvrzující, že linie G odpovídá C. a. gibelio, linie A odpovídá C. a. auratus, linie L je blízká C. a. langsdorfii a linie M je poměrně izolovanou součástí komplexu C. auratus.

Obr. 13. Vztah zjištěných fylogenetických linií (černé tečky) k jednotlivým formám komplexu C. auratus na základě sekvencí genu pro cytochrom b. Čísla u uzlů reprezentují hodnoty bootstrapové podpory topologie (NJ/MP). Délky větví jsou v měřítku vzhledem k analýze NJ.

Bližší poznámky o jednotlivých liniích jsou obsahem následujících podkapitol 6.3. až 6.6.

6.3. Linie G – forma Carassius auratus gibelio Haplotypy řazené do linie G byly nalezeny u většiny jedinců fenotypu karasa stříbřitého, diploidních, triploidních a také u jediného tetraploida. Tato linie jako jediná zahrnovala více než jeden haplotyp (13 haplotypů označených G01 až G13). Nejčastěji se vyskytujícím haplotypem vůbec byl haplotyp G02, což spolu s jeho centrální pozicí v rámci linie G v konstruované haplotypové síti naznačuje, že se jedná o haplotyp základní, původní (ancestrální), z nějž jsou zřejmě ostatní haplotypy této linie odvozeny. Této domněnce napovídá i skutečnost, že se ostatní haplotypy od G02 liší jen poměrně málo, obvykle pouze o 1-3 bp. Výjimkou je velká delece (18 bp) charakteristická pro haplotyp G04, o které ovšem lze předpokládat, že vznikla jednorázově. Nebyl totiž nalezen žádný haplotyp, který by mohl být mezikrokem při vzniku haplotypu G04 (haplotyp s delecí menšího rozsahu ve stejné oblasti). Kromě haplotypů skutečně detekovaných lze předpokládat i existenci dalších, které

61

v

této práci nebyly zachyceny, reprezentujících mutační mezikroky mezi skutečně

detekovanými haplotypy (viz Obr. 9). Vysoká haplotypová diverzita zjištěná v povodí Tisy a v českém povodí Dunaje (zejména na lokalitě č. 7 „Soutok“) může být částečně vysvětlena přítomností haplotypů, které se vyskytly jen u malého počtu jedinců na jediné lokalitě, přičemž tyto haplotypy jsou jen místně vzniklými náhodnými odchylkami. Takto mohly vzniknout např. haplotypy G05 z haplotypu G02 (liší se v 1 bp, nalezen u dvou jedinců na lokalitě č. 7 „Soutok“), G08 a G10 z haplotypu G09 (liší se ve 2 resp. 1 bp, nalezeny vždy u jediného jedince z lokality č. 16 „Perín“) či G12 z haplotypu G02 (liší se v 1 bp, nalezen u tří jedinců na lokalitě č. 19 „Zemplínská Šírava“). Ve srovnání se sekvencemi publikovanými jinými autory je haplotyp G02 identický se sekvencemi typickými pro formu C. a. gibelio např. z Číny (Li & Gui, 2008; přístupová čísla v databázi GenBank EF633642-EF633680). Stejný haplotyp jsme nalezli při rozpracované společné studii také u jedinců C. a. gibelio z území Ukrajiny a z řeky Volhy v Rusku. Z toho lze odvodit, že genetickou linii G lze ztotožnit s formou Carassius auratus gibelio a že v případě haplotypu G02 se může jednat o základní (ancestrální) haplotyp typický pro formu C. a. gibelio ve střední Evropě i v dalších částech areálu rozšíření. Tuto domněnku by bylo vhodné v budoucnu ověřit dalšími analýzami zaměřenými na ostatní části areálu výskytu této formy. Lze také dovodit, že tento dominantní haplotyp zřejmě tvořil hlavní část invazní vlny, která od 60. let 20. století území tehdejšího Československa postupně kolonizovala. Domněnku podporuje i fakt, že tento haplotyp je u triploidních samic, které invazní vlnu zřejmě tvořily, nejběžnější (nalezen u 67 ze 136 detekovaných triploidních samic). I o dalších haplotypech, vyskytujících se napříč povodími, často nalezených u většího počtu jedinců či triploidních samic (zejména G06, G07, G09) se lze domnívat, že mohly být součástí invazní vlny jako její menší část. Kromě jedinců fenotypu karasa stříbřitého jsme haplotyp G02 zaznamenali také u dvou jedinců ornamentální „zlaté rybky“ variety shubunkin z akvarijního chovu a u jednoho jedince variety shubunkin chyceného ve volné vodě v lokalitě č. 7 „Soutok“. Vzhledem k maternální dědičnosti mitochondriální DNA se u jedince z volné vody může jednat např. o hybrida generace F1 či pozdějších generací původně vzniklého křížením mezi samicí C. a. gibelio a samcem „zlaté rybky“ vypuštěným či uniklým do přírody. Pokud jde o jedince z akvarijního chovu, chovatelé těchto ornamentálních ryb formy C. a. auratus někdy taková křížení sami provádějí, aby zamezili dlouhodobému odchovu „zlatých rybek“ u zákazníků. Hybridní jedinci získaní chovatelem se totiž mohou fenotypově jevit jako „zlatá rybka“, ač jí ve skutečnosti geneticky nejsou. Při pokusu zákazníka křížit mezi sebou takové hybridy pak 62

bude výsledkem ozdobná „zlatá rybka“ jen zřídka. Ale i při odchovu geneticky čistých „zlatých rybek“ se mohou vyskytnout neatraktivní nebarevné exempláře, které pak chovatelé často vypouštějí do přírody, kde teoreticky může dojít ke křížení s formou C. a. gibelio.

6.4. Linie L – forma Carassius auratus langsdorfii Haplotyp L01, který je jediným detekovaným zástupcem genetické linie L, byl nalezen u 25 jedinců na jediné lokalitě, v umělém mokřadu v zátopovém pásmu řeky Moravy (lokalita č. 8 „Chomoutov“). Tento umělý mokřad byl vytvořen v roce 1996 a sestává z uzavřeného systému kanálů a větší nádrže, o celkové rozloze 0,13 ha (Obr. 14).

Obr. 14. Pohled na mokřadní systém v Chomoutově. Foto Karel Halačka.

Při velkých povodních v roce 1997 byl mokřad zatopen a kolonizován rybami přinesenými povodňovou vlnou. Dokumentováno je zde 15 druhů, mezi dominantní druhy patří plotice obecná (Rutilus rutilus), perlín ostrobřichý (Scardinius erythrophthalmus), okoun obecný (Perca fluviatilis) a karas stříbřitý (Horák et al. 2004).

63

Genetické analýzy mitochondriální DNA a šesti mikrosatelitových markerů prokázaly, že v tomto mokřadu koexistují dvě klonální populace triploidních samic karasa stříbřitého, které se rozmnožují gynogeneticky, přičemž jedna populace nese mitochondriální haplotyp G02 a druhá haplotyp L01. Kromě genetických analýz byly tyto dvě populace analyzovány i morfometricky a byla zjištěna statisticky významná odlišnost výšky těla a počtu žaberních tyčinek (Příloha II). Při porovnání s databází GenBank se haplotyp L01 nejvíce blížil haplotypům japonských forem Carassius auratus, jak je popsali Murakami et al. (2001). V této studii genetická analýza 169 jedinců Carassius spp. z Japonska, založená na sekvencování části kontrolní oblasti mitochondriální DNA o délce cca 330 bp, odhalila existenci 37 haplotypů rozdělených do tří hlavních fylogenetických clusterů: 1) cluster I je tvořen výhradně C. cuvieri

(gengorobuna);

2)

cluster

II

obsahoval

dva

haplotypy

polyploidních

C. a. langsdorfii a všechny haplotypy ornamentálních C. a. auratus; a 3) nejvíce heterogenní cluster III sestává z haplotypů diploidních, triploidních a polyploidních C. a. langsdorfii (ginbuna), diploidních C. a. grandoculis (nigorobuna) a triploidních C. a. buergeri (nagabuna). Sekvence získané v rámci disertační práce jsou delší než sekvence publikované Murakamim et al. (2001), srovnání tedy mohlo být provedeno pouze v rozsahu japonských sekvencí. Při tomto srovnání haplotyp L01 spadá do clusteru III a sdílí subcluster s haplotypy diploidních a triploidních C. a. langsdorfii z jezera Shiwa a jezera Imba (Obr. 15). Haplotypovou linii L nalezenou v České republice lze tedy považovat za zástupce formy Carassius auratus langsdorfii, skupiny, která je geneticky velmi heterogenní a má pravděpodobně polyfyletický původ z několika maternálních linií; Murakami et al. (2001) dokonce soudí, že i formy C. a. grandoculis (nigorobuna) a C. a. buergeri (nagabuna) jsou pouze morfologickými subvariantami C. a. langsdorfii (ginbuna). Tím dochází k potvrzení druhého záchytu C. a. langsdorfii na území České republiky, v podobě početné izolované populace; první nález dvou solitérních jedinců v povodí Labe publikoval Kalous et al. (2007). Otázkou je, jakou cestou se C. a. langsdorfii na území České republiky dostal. O jeho nálezu jinde v Evropě nejsou prozatím informace, což může souviset s tím, že genetické analýzy komplexu C. auratus nejsou běžně prováděné. Jedním z možných vysvětlení je, že tato forma byla dovezena přímo do střední Evropy jako příměs s dovozy kaprů „koi“ (Kalous et al. 2007). Nelze vyloučit ani možnost nechtěného dovozu z Číny, kam byly v minulosti japonské formy karasa stříbřitého dováženy (Ma et al. 2003), a následného šíření C. a. langsdorfii jako minoritní součásti okupačních populací tvořených převážně formou C. a. gibelio. Je dokladováno, že do Rumunska byly z Číny dováženy býložravé ryby (amur, 64

tolstolobik), a s nimi jako nechtěná příměs i další druhy, např. střevlička východní (Pseudorasbora parva), případně některé formy karasa stříbřitého (Banarescu 1964, Holčík 1980b, 1991).

Obr. 15. Fylogenetický strom vytvořený algoritmem NJ srovnávající haplotypy L01, M01 a A01 (černé tečky) s 37 haplotypy Carassius spp. z Japonska (1-37). Čísla u uzlů reprezentují odhad bootstrapové podpory topologie stromu. Uvedeny jsou jen hodnoty vyšší než 50 procent. Délky větví jsou v měřítku. 65

6.5. Linie M Haplotyp M01 (linii M) byl nalezen u diploidních jedinců (samců i samic) fenotypového vzhledu karasa stříbřitého na čtyřech lokalitách (jedna v ČR, tři na Slovensku) v povodí Dunaje a Tisy (lokality č. 7 „Soutok“, č. 10 „Trnava“, č. 12 „vodní nádrž Duchonka“ a č. 19 „Zemplínská Šírava“). Zatímco na prvních třech lokalitách byl výskyt tohoto haplotypu sporadický (Soutok: 5 ze 103 jedinců, Trnava: 1 ze 7 jedinců, vodní nádrž Duchonka: 2 z 9 jedinců), na lokalitě „Zemplínská Šírava“ přesáhlo jeho zastoupení padesát procent (22 ze 43 jedinců). Tato lokalita se nachází ve výtokovém profilu potoka Čierná voda pod jednou z vedlejších výpustí z údolní nádrže Zemplínská Šírava. Ostatní zde chycení jedinci nesli haplotypy linie G, většinou haplotyp G02. Při porovnání s databází GenBank nebyla nalezena žádná blízká sekvence, při srovnání se studií Murakami et al. 2001 se tento haplotyp nezařadil do žádného ze tří popsaných clusterů, ale vytváří samostatnou linii odštěpující se od clusteru II, již lze označit za samostatný cluster (Obr. 15). S ohledem na relativně vysokou genetickou vzdálenost od ostatních linií (Tab. 4) tato skutečnost vede k závěru, že linii M lze považovat za samostatnou formu komplexu karasa stříbřitého na stejné úrovni s C. a. gibelio, C. a. auratus a C. a. langsdorfii. Otázkou je identita této formy, o níž můžeme zatím pouze spekulovat. První možností je, že jde o samostatnou podvětev formy C. a. langsdorfii, která má podle Murakamiho et al. (2001) polyfyletický původ a je tedy značně diverzifikována, a jejíž heterogennost by tak byla dále prohloubena. Proti této variantě mluví výrazná genetická vzdálenost od dosud popsaných zástupců C. a. langsdorfii. Druhou možností je, že jde o první evropský výskyt jedné ze dvou forem, označované v Japonsku jako biotypy „kinbuna“ a „okinbuna“, které se stejně jako naše genetická linie M vyznačují diploidií a oboupohlavností. Pro potvrzení této varianty však zatím chybí dostupná genetická data. Třetí hypotetickou možností je, že jde o novou, dosud nepopsanou formu. V tomto směru vzniká potřeba dalších studií, zejména morfometrických, které dosud nebyly provedeny. Stejně nejasný je původ této formy ve střední Evropě; stejně jako v případě linie L se může jednat o důsledek dovozů z Japonska nebo z Číny. Rozptýlený výskyt v rámci povodí Dunaje a Tisy však hovoří pro hypotézu, že jedinci této formy byli minoritní součástí invazní vlny karasa stříbřitého.

66

6.6. Linie A – forma Carassius auratus auratus Haplotyp A01 (linie A) byl nalezen u téměř všech analyzovaných jedinců různých komerčně dostupných variet „zlaté rybky“ a u téměř všech jedinců „zlaté rybky“ variety shubunkin chycených ve volné vodě v lokalitě č. 7 „Soutok“. To svědčí o monofyletickém původu domestikovaných variet. Při porovnání s databází GenBank tento haplotyp odpovídá v celé délce sekvencím udávaným pro formu C. a. auratus (např. kompletní mitochondriální genom ornamentální formy wakin z Japonska, přístupové číslo AB111951). Také srovnání se studií Murakami et al. (2001) řadí haplotyp A01 do clusteru II obsahujícího haplotypy ozdobné „zlaté rybky“ z Japonska. Haplotypovou linii A lze tedy ztotožnit s formou C. a. auratus. Mimo jedinců s fenotypem charakteristickým pro „zlatou rybku“ byl tento haplotyp nalezen také u jednoho jedince fenotypu karasa stříbřitého z povodí řeky Odry, v populaci, jejíž všichni ostatní členové nesli haplotyp formy C. a. gibelio. V tomto případě se pravděpodobně analogicky s výskytem haplotypu C. a. gibelio u C. a. auratus jedná o hybrida samce C. a. gibelio a samice uprchlé či vypuštěné „zlaté rybky“.

6.7. Hybridizace mezi karasem stříbřitým a karasem obecným Při molekulárně-genetické analýze hybridizace mezi karasem stříbřitým a karasem obecným v lokalitě č. 7 „Soutok“ bylo provedeno sekvencování kontrolní oblasti mitochondriální DNA a fragmentační analýza čtyř mikrosatelitových markerů u devíti předpokládaných hybridů a u kontrolního vzorku pěti jedinců karasa obecného (Carassius carassius) a pěti jedinců formy C. a. gibelio. Po srovnání nalezených genotypů u předpokládaných hybridů s genotypy kontrolního vzorku rodičovských taxonů a s dříve publikovanými zjištěními autorů zabývajících se hybridizací mezi karasy ve Velké Británii (Hänfling et al. 2005) lze konstatovat, že všichni testovaní hybridní jedinci nesou ve všech testovaných lokusech jednu alelu původem z Carassius carassius a jednu alelu původem z C. a. gibelio, což podporuje teorii, že se jedná o hybridy generace F1. Žádný z předpokládaných hybridů nenesl multilokusový genotyp, v němž by některý lokus byl homozygotní pro alely z jednoho rodičovského taxonu a jiný lokus homozygotní pro alely z druhého rodičovského taxonu, což by podporovalo možnost post-F1 hybridizace. Podobně nebyl detekován ani multilokusový genotyp obsahující kromě lokusů heterozygotních vzhledem k původu alel také lokus s alelami pouze jednoho z rodičovských druhů, což by naznačovalo možnost původu zkoumaných „hybridů“ ze zpětného křížení hybrida generace F1 s jedním s rodičovských druhů. Při takovém zpětném

67

křížení sice může dojít k výskytu jedinců s heterozygotními genotypy ve všech čtyřech testovaných markerech, ale ze statistického hlediska se jejich zastoupení rychle snižuje z cca 6 % v první generaci zpětného křížení (BC-1) na méně než 0,3 % v generaci BC-2, atd. (Boecklen & Howard 1997). Také trojrozměrná faktoriální korespondenční analýza rozdělila testované jedince do tří nepřekrývajících se skupin, odpovídajících oběma rodičovským druhům a hybridům, i když vzhledem k vysoké variabilitě hybridů a kontrolních jedinců formy C. a. gibelio nelze zcela vyloučit i jiné možné rozdělení. Lze konstatovat, že analýza mikrosatelitových markerů prokázala hybridní původ všech testovaných předpokládaných hybridních jedinců, se závěrem, že s největší pravděpodobností jde o hybridy generace F1. Vedle molekulárně-genetické analýzy byly prováděny i meristické analýzy kontrolních jedinců a hybridů. Z vizuálního hlediska byli hybridi barvou podobni C. a. gibelio, tvar hřbetní ploutve spojoval rysy charakteristické pro oba rodičovské taxony: přední polovina hřbetní ploutve byla vypouklá jako u C. carassius, zadní polovina lehce vydutá jako u C. a. gibelio. Zbarvení vnitřní strany peritonea u hybridů bylo proměnlivé – někteří jedinci měli tmavší a někteří světlejší peritoneum, přičemž pro C. carassius je charakteristické světlé nepigmentované peritoneum a pro C. a. gibelio černé peritoneum. Statisticky významně byly všechny tři skupiny rozlišeny počtem žaberních tyčinek. Další meristické znaky (počet nerozvětvených paprsků v hřbetní ploutvi, počet rozvětvených paprsků v hřbetní ploutvi, počet nerozvětvených paprsků v řitní ploutvi, počet rozvětvených paprsků v řitní ploutvi a počet šupin v postranní čáře) sice rozlišily C. a. gibelio od C. carassius a hybridů, ne však C. carassius a hybridy (Příloha I). Zprávy o hybridizaci karasa stříbřitého s jinými druhy ve střední Evropě jsou dosti vzácné, v minulosti byl u nás zjištěn jen ojedinělý výskyt hybridů mezi karasem stříbřitým a kaprem obecným (Prokeš & Baruš 1996, Stráňai 1999). V našem případě se jedná o první nález křížence karasa stříbřitého a karasa obecného ve vodách České republiky. Negativní hybridizační efekt na původní druhy u nás tedy není zatím výrazný. Situace je výrazně odlišná např. od Velké Británie, kde molekulární analýzy ukázaly, že nativní karas obecný se často kříží se zavlečenými druhy, zejména karasem stříbřitým a kaprem obecným (Cyprinus carpio); hybridy s těmito druhy obsahovalo 38 % zkoumaných populací karasa obecného. Možné příčiny tohoto omezeného efektu hybridizace ve střední Evropě tkví v několika faktorech, především v tom, že výskyt hybridů karasa stříbřitého s ostatními druhy cyprinidů je podmíněn účastí diploidních jedinců karasa stříbřitého na reprodukci. Ve Velké Británii se ve volných vodách karas stříbřitý dlouhodobě vyskytuje v podobě ferálních populací diploidní 68

formy C. a. auratus, zatímco v podmínkách České republiky a Slovenska jednoznačně dominuje forma C. a. gibelio, jejíž výskyt dosud ve Velké Británii nebyl spolehlivě potvrzen. Přitom diploidní jedinci C. a. gibelio u nás byli zaznamenáni relativně nedávno, po roce 1990, a zastoupení čistě triploidních populací je dosud velmi výrazné. Dalším faktorem je, že hybridi mezi C. carassius, C. auratus a Cyprinus carpio u nás nejsou záměrně produkováni.

69

7. ZÁVĚR Výsledky předkládané disertační práce lze shrnout do několika bodů: Ø Molekulárně-genetické analýzy dvou úseků mitochondriální DNA prokázaly, že území České republiky a Slovenska osidlují čtyři formy komplexu karasa stříbřitého (Carassius auratus): Carassius auratus gibelio, Carassius auratus auratus, Carassius auratus langsdorfii a čtvrtá forma neznámé identity. Ø Taxonomický status těchto forem je nejasný, avšak skutečnost, že tyto formy lze navzájem spolehlivě rozlišit pouze geneticky, nikoliv na základě vnějších znaků, neumožňuje hodnotit tyto taxony jako samostatné druhy. Ø Genetická diverzita karasa stříbřitého je ve střední Evropě poměrně vysoká (zejména v povodí Dunaje a Tisy), což může mít souvislost s invazivní úspěšností tohoto druhu. Ø Celkem bylo identifikováno a do databáze GenBank zasláno 16 haplotypových sekvencí kontrolní oblasti a 4 haplotypové sekvence genu pro cytochrom b. Ø Byl identifikován pravděpodobný ancestrální haplotyp charakteristický pro formu Carassius auratus gibelio. Ø Pomocí analýzy mikrosatelitů byli v aluviálním území dolního toku řeky Dyje spolehlivě identifikováni hybridi mezi formou Carassius auratus gibelio a karasem obecným (Carassius carassius). Jedná se o první záchyt takových hybridů na území České republiky. Ø V umělém mokřadu v zátopovém pásmu řeky Moravy byla prokázána koexistence dvou početných klonálních populací karasa stříbřitého, reprezentujících formy Carassius auratus gibelio a Carassius auratus langsdorfii.

70

8. SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY Alexeyev, M. F., LeDoux, S. P. & Wilson, G. L. (2004). Mitochondrial DNA and aging. Clinical Science 107, 355-364. Allendorf, F. W. (1991). Ecological and genetic effects of fish introductions: synthesis and recommendations. Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences 48 (Supplement 1), 178-181. Allendorf, F. W. & Luikart, G. (2007). Conservation and the genetics of populations. 1st edition. Blackwell Publishing, Oxford. 664 s. Aranishi, F. (2005). PCR-RFLP analysis of nuclear nontranscribed spacer for mackerel species identification. Journal of Agricultural and Food Chemistry 53 (3), 508-511. Avise, J. C. (2004). Molecular Markers, Natural history, and Evolution. 2nd edition. Chapman & Hall, New York. 504 s. Balon, E. K. (1962). Ökologische Bemerkungen über die Standorten der Donaufische mit einer Beschreibung des Fundes des Carassius auratus gibelio (Bloch, 1783) und Alburnoides bipunctatus (Bloch, 1782). Věstník československé společnosti zoologické 26, 333-351 (in German). Balon, E. K. (2004). About the oldest domesticates among fishes. Journal of Fish Biology 65 (Supplement A), 1-27. Balon, E. K. (2006). The oldest domesticated fishes, and the consequences of an epigenetic dichotomy in fish culture. Journal of Ichthyology and Aquatic Biology 11 (2), 47-86. Banarescu, P. (1960). Einige Fragen zur Herkunft und Verbreitung der Süsswasserfischfauna der europäisch-mediterränen Unterregion. Archiv für Hydrobiologie 57, 16-134 (in German). Banarescu, P. (1964). Pisces – Osteichthyes. Fauna Republicii Populare Romine Vol XIII. Editura Academiei Republicii Populare Romine, Bucuresti. 961 s. (in Romanian). Bandelt, H., Forster, P. & Rohl, A. (1999). Median joining networks for inferring intraspecific phylogenies. Molecular Biology and Evolution 16, 37-48. Baruš, V. & Oliva, O. (1995). Fauna ČR a SR, Mihulovci a ryby (2). 1. vyd. Academia, Praha. 698 s. Belkhir, K., Borsa, P., Chikhi, L., Raufaste, N. & Bonhomme, F. (2004). GENETIX 4.05, logiciel sous Windows TM pour la génétique des populations. Laboratoire Génome,

71

Populations, Interactions, CNRS UMR 5171, Université de Montpellier II, Montpellier (France). Berg, L. S. (1932). Über Carassius carassius und C. gibelio. Zoologischer Anzeiger 98 (1), 15-18 (in German). Berg, L. S. (1932-33). Ryby presnych vod i sopredelnych stran. 1. izdanie. Izdavatelstvo Akademii Nauk SSSR, Leningrad. 543 s. (in Russian). Berg, L. S. (1949). Ryby presnych vod SSSR i sopredelnych stran. Chasť 2. 2. izdanie Izdavatelstvo Akademii Nauk SSSR, Moskva, Leningrad. 469-925 (in Russian). Boecklen, W. J. & Howard, D. J. (1997). Genetic analysis of hybrid zones: numbers of markers and power of resolution. Ecology 78 (8), 2611-2616. Brykov, V. A., Polyakova, N. E., Skurikhina, L. A., Dolganov, S. M., Eliseikina, M. G. & Kovalev, M. Y. (2002). Mitochondrial DNA variation in goldfish Carassius auratus gibelio from Far Eastern water reservoirs. Russian Journal of Genetics 38, 1176-1180. Brykov, V. A., Apalikova, O. V., Eliseikina, M. G. & Kovalev, M. Y. (2005). Mitochondrial DNA variation in diploid and triploid forms of silver crucian carp Carassius auratus gibelio. Russian Journal of Genetics 41, 659-663. Burmakin, E. V. (1963). Akklimatizacija presnovodnych ryb SSSR. Izvestija GosNIORCH 53, 3-317 (in Russian with English summary) Campbell, D., Duchesne, P. & Bernatchez, L. (2003). AFLP utility for population assignment

studies:

analytical

investigation

and

empirical

comparison

with

microsatellites. Molecular Ecology 12, 1979-1991. Campbell, D. & Bernatchez., L. (2004). Generic scan using AFLP markers as a means to assess the role of directional selection in the divergence of sympatric whitefish ecotypes. Molecular Biology and Evolution 21 (5), 945-956. Collares-Pereira, M. J. & Moreira da Costa, L. (1999). Intraspecific and interspecific genome size variation in Iberian Cyprinidae and the problem of diploidy and polyploidy, with review of genome sizes within the family, Folia Zoologica 48 (1), 61-77. Černý, J. & Sommer, N. (1992). Vek, rast a produkcia karasa striebristého Carassius auratus L. v ramene Dunaja r. km. 1825 v r. 1985-1990. Sborník z konferencie ichtyologickej sekcie SZS Bratislava, 46-58. Dawley, R. M. (1989). An introduction to unisexual vertebrates. In: Dawley, R. M. & Bogart, J. P. (eds.) Evolution and ecology of unisexual vertebrates. Bulletin 466, New York State Museum, Albany (NY), s. 1-18.

72

Dierkes, P., Taborsky, M. & Achmann, R. (2008). Multiple paternity in the cooperatively breeding fish Neolamprologus pulcher. Behavioral Ecology and Sociobiology 62 (10), 1581-1589. Djisalov, N. (1974). Rasselenije serebrjanogo karasja Carassius auratus gibelio (Bloch) v jugoslavskoj časti Dunaja. Materialy 16. sessii Smešannoj komissii po primeneniju soglašenija o rybolovstve v vodach Dunaja Bratislava, 363-372 (in Russian). Esposti, M. D., De Vries, S., Crimi, M., Ghelli, A., Patarnello, T. & Meyer, A. (1993). Mitochondrial cytochrome b:evolution and structure of the protein. Biochemica et Biophysica Acta 1143, 243-271. Farias, I. P., Ortí, G., Sampaio, I., Schneider, H. & Meyer, A. (2001). The cytochrome b gene as a phylogenetic marker: The limits for analyzing relationships among cichlid fishes. Journal of Molecular Evolution 53, 89-103. Flajšhans, M., Lusková, V., Vetešník, L., Halačka, K., Rodina, M., Lusk, S. & Gela, D. (2004). Diploidní, triploidní a tetraploidní karas stříbřitý Carassius auratus z dolního toku Dyje: první výsledky reprodukční charakteristiky a experimentální hybridizace. Biodiverzita ichtyofauny ČR V, 35-43. Fodde, R. & Losekoot, M. (1994). Mutation detection by denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE). Human Mutation 3 (2), 83-94. Freeland, J. (2005). Molecular Ecology. 1st edition. John Wiley & Sons, Chichester (England). 400 s. García-Berthou, E., Alcaraz, C., Pou-Rovira, Q., Zamora, L., Coenders, G. & Feo, C. (2005). Introduction pathways and establishment rates of invasive aquatic species in Europe. Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences 65, 453-463. Gasowska, M. (1936). Der Giebel – eine ostasiatische Silberkarausche (Carassius auratus gibelio Bloch). Zeitschrift für Fischerei und deren Hilfswissenschaften 34, 719-725 (in German). Gil, L. A. (2007). PCR-based methods for fish and fishery products authentication. Trends in Food Science & Technology 18, 558-566. Golovinskaya, K. A. & Romashov, D. D. (1947). Investigations in gynogenesis of the Crucian carp. Sbornik Nauchnykh Trudov Vserossijskogo Nauchno-Issledovatel'skogo Instituta Prudovogo Rybnogo Khozyajstva 4, 73-113 (in Russian with English summary). Golovinskaya, K. A., Romashov, D. D. & Cherfas, N. B. (1965). Odnopolyje i dvupolyje formy serebrjanogo karasja (Carassius auratus gibelio Bloch). Voprosy Ikhtiologii 5 (1), 614-628 (in Russian). 73

Goryunova, A. I. (1962). Periodičeskije izmenenija ichtiofauny v ozerach i rekach celinnogo kraja. Voprosy ikhtiologii 2 (25), 577-580 (in Russian). Goryunova, A. I. & Skakun, D. (2002). Biological characterization on crucian carps. Tethys Aqua Zoological Research 1, 33-48. Halačka, K. & Lusková, V. (2000). Polyploidie u karasa stříbřitého (Carassius auratus) v dolním toku Dyje – determinace pomocí velikostí jader erytrocytů. Sborník referátů z IV. České ichthyologické konference, 110-113. Halačka, K., Lusková, V. & Lusk, S. (2003). Carassius „gibelio“ in fish communities of the Czech Republic. Ecohydrology & Hydrobiology 3 (1), 133-138. Hanel, L. & Lusk, S. (2005). Ryby a mihule České republiky: Rozšíření a ochrana. 1. vyd. ČSOP Vlašim, Vlašim. 448 s. Hänfling, B. & Harley, M. (2003). A molecular approach to detect hybridization between crucian carp (Carassius carassius) and non-indigenous carp species (Carassius auratus and Cyprinus carpio) in UK waters, including a consideration of the taxonomic status of the giebel carp (Carassius spp.). Enviroment Agency R&D Technical Report W2-077/TR, Bristol, 1-32. Hänfling, B., Bolton, P., Halley, M. & Carvalho, G. R. (2005). A molecular approach to detect hybridisation between crucian carp (Carassius carassius) and non-indigenous carp species (Carassius spp. and Cyprinus carpio). Freshwater Biology 50 (3), 403-417. Hebert, P. D. N., Stoeckle, M. Y., Zemlak, T. S. & Francis, C. M. (2004). Identification of birds through DNA barcodes. PloS Biology 2 (10), 1657-1663. Hensel, K. (1971). Some notes on the systematic status of Carassius auratus gibelio (Bloch, 1782) with further record of this fish from the Danube River in Czechoslovakia. Věstník československé společnosti zoologické 35, 186-197. Holčík, J. & Žitňan, R. (1978). On the expansion and origin of Carassius auratus in Czechoslovakia. Folia Zoologica 27, 279-288. Holčík, J. (1980a). Possible reason for the expansion of Carassius auratus (Linnaeus, 1758) (Teleostei, Cyprinidae) in the Danube river basin. Internationale Revue der gesamten Hydrobiologie 65 (5), 673-679. Holčík, J. (1980b). Carassius auratus (Pisces) in the Danube River. Acta Scientiarum Naturalium Academiae Scientiarum Bohemoslovacae - Brno, 14 (11), 1-43. Holčík, J. & Kmeť, T. (1986). Simple models of the population dynamics of some fish species from the lower reaches of the Danube. Folia Zoologica 35 (2), 183-191.

74

Holčík, J. (1991). Fish introductions in Europe with particular reference to its central and eastern part. Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences 48 (Supplement 1), 13-23. Horák, V., Lusk, S., Lusková, V., Halačka, K. & Mendel, J. (2004). Ichtyofauna umělého mokřadu v PR Chomoutovské jezero, CHKO Litovelské Pomoraví. Biodiverzita ichtyofauny ČR V, 55-63. Hosoya, K. (2000). Cyprinidae. In: Nakabo, T. (ed.) Fishes of Japan with Pictorial Keys Species. 2nd edition. Tokai University Press, Tokio, s. 253-254 (in Japanese). Huelsenbeck, J. P. & Ronquist, F. (2005). Bayesian analysis of molecular evolution using MrBayes. In: Nielsen, R. (ed.) Statistical Methods in Molecular Evolution. 1st edition. Springer, New York, s. 183-232. Hulák, M., Kašpar, V., Flajšhans, M. & Linhart, O. (2006). Využití molekulárních metod a DNA markerů v genetice ryb – přehled. Bulletin VÚRH Vodňany 42 (2), 69-73. Cherfas, N. B. (1966). Jestestvennaja triploidija u samok odnopoloj formy serebrjanogo karasja Carassius auratus gibelio (Bloch) Genetika 2 (5), 16-24 (in Russian). Cherfas, N. B. (1987). Ginogenez u ryb. In: Kirpichnikov, V. S. (ed.) Genetika i selekcija ryb. 2. izdanie. Nauka, Leningrad, s. 309-335 (in Russian). Cherfas, N. B., Gomelsky, B., Ben-Dom, N., Peretz, Y. & Hulata, G. (1994). Assessment of triploid common carp (Cyprinus carpio L.) for culture. Aquaculture 127, 11-18. Iguchi, K., Yamamoto, G., Matsubara, N. & Nishida, M. (2003). Morphological and genetic analysis of fish of a Carassius complex (Cyprinidae) in Lake Kasumigaura with reference to the taxonomic status of two all-female triploid morphs. Biological Journal of the Linnean Society 79, 351-357. Irwin, D. M., Kocher, T. D. & Wilson, A. C. (1991). Evolution of the cytochrome b gene of mammals. Journal of Molecular Evolution 32, 128-144. Ivanova, N. V., Zemlak, T. S., Hanner, R. H. & Hebert, P. D. N. (2007). Universal primer cocktails for fish DNA barcoding. Molecular Ecology Notes 7, 544-548. Jázsfalusi, L. (1959). The German carp, the future fish of our dead river arms. Halázsat 6 (11), 207 (in Hungarian). Jeitteles, L. H. (1863). Die Fische den March bei Olmütz. Jahres-Bericht kaiserl.-königl. Gymnasium in Olmütz während des Schuljahres 1863, 3-33 (in German). Kalous, L. (2002). Revize komplexu Carassius auratus v České republice: shrnutí problémů a první výsledky. Písemná práce ke státní doktorské zkoušce. Praha.

75

Kalous, L. (2005). Příspěvek k revizi komplexu Carassius auratus v České republice. 108 s. Česká zemědělská univerzita v Praze. Fakulta agrobiologie, potravinových a přírodních zdrojů. Katedra zoologie a rybářství. Vedoucí disertační práce prof. RNDr. Miroslav Barták, CSc. Kalous, L., Šlechtová, V. Jr., Bohlen, J., Petrtýl, M. & Švátora, M. (2007). First European record of Carassius langsdorfii from the Elbe basin. Journal of Fish Biology 70 (Supplement A), 132-138. Karpevich, A. F. & Bokova, E. N. (1963). Peresadka ryb i vodnych bezpozvonočnych, provedennaja v SSSR za 1960-1961. Voprosy Ikhtiologii 2 (27), 366-395 (in Russian). Karpevich, A. F. & Lokshina, I. E. (1967). Peresadka ryb i vodnych bezpozvonočnych v 1964. Voprosy Ikhtiologii 6 (47), 1105-1118 (in Russian). Koščo, J., Košuth, P., Vetešník, L. & Halačka, K. (2004). Rast a pomer pohlaví karasa striebristého (Carassius auratus L.) v niektorých lokalitách východného Slovenska. Biodiverzita ichtyofauny ČR V, 123-127. Kottelat, M. (1997). European freshwater fishes. Biologia Bratislava 52 (Supplement 5), 51-53. Kottelat, M. & Freyhof, J. (2007). Handbook of European Freshwater Fishes. 1st edition. Publications Kottelat, Cornol (Switzerland). 646 s. Kubečka, J. (1989). Šíření karasa stříbřitého, Carassius auratus (Linnaeus, 1758) ve středním Polabí. Muzeum a současnost, Roztoky, ser. natur. 3, 43-50. Kux, Z. (1982). Příspěvek k problematice kříženců rodu Carassius. Acta Musei Moraviae 67, 181-188. Li, F.-B. & Gui, J.-F. (2008). Clonal diversity and genealogical relationships of gibel carp in four hatcheries. Animal Genetics 39 (1), 28-33. Libosvárský, J. (1960-1961). Populační a taxonomický rozbor karasa obecného (Carassius carassius L.) a rozšíření a původ obou druhů rodu Carassius L. Disertační kandidátská práce, 152 s. Libosvárský, J. (1962). Zur palaeoborealen Verbreitung der Gattung Carassius Jarocki 1822. Zoologische Jahrbücher 90, 197-210 (in German). Libosvárský, J. (1963a). Stáří a růst karasa obecného, Carassius carassius (L.) v některých vodách ČSSR. Zoologické listy 12, 239-258. Libosvárský, J. (1963b). Zum Geschlechtsverhältnis bei der Karausche Carassius carassius (L.). Zoologischer Anzeiger 170, 191-197 (in German).

76

Linnaeus, C. (1758). Systema Naturae, Ed. X. (Systema naturae per regna tria naturae, secundum classes, ordines, genera, species, cum characteribus, differentiis, synonymis, locis. Tomus I. Editio decima, reformata.) Holmiae. Systema Nat. ed. 10 v. 1: i-ii + 1-824. [Nantes and Pisces in Tom. 1, pp. 230-338; a few species on later pages. Date fixed by ICZN, Code Article 3.] Liu, H., Tzeng, C.-S. & Teng, H. Y. (2002). Sequence variations in the mitochondrial DNA control region and their implications for the phylogeny of the Cypriniformes. Canadian Journal of Zoology 80, 569-581. Lohniský, K. (1985). Změny rozšíření a druhové skladby ichthyofauny východních Čech v posledních desetiletích. Zpravodaj krajského muzea východních Čech 11 (2), 29-106. Lusk, S., Baruš, V. & Veselý, V. (1977). On the occurrence of Carassius auratus in the Morava river drainage area. Folia Zoologica 26, 377-381. Lusk, S. & Baruš, V. (1978). Morphometric features of Carassius auratus from the drainage area of the Morava River. Folia Zoologica 27, 177-190. Lusk, S., Baruš, V. & Kirka, A. (1980). Současné rozšíření a význam karasa stříbřitého v Československu. Živočišná výroba 25, 871-878. Lusk, S. (1986). Problematika karasa stříbřitého (Carassius auratus) v podmínkách Československa. Živočišná výroba 31, 945-951. Lusk, S., Halačka, K., Lusková, V. & Pražák, O. (1996). Fish assemblages of the “Soutok” area in southern Moravia, Czech Republic. AUC Biologica 40, 147-155. Lusk, S., Lusková, V. & Halačka, K. (1998a). Karas stříbřitý - 25 let od jeho přirozené introdukce. Sborník referátů z III. České ichtyologické konference, 135-140. Lusk, S., Lusková, V. & Halačka, K. (1998b). The status of tench (Tinca tinca L.) in aquatic habitats of the floodplain along the lower reaches of the River Dyje (Czech Republic). Polskie Archiwum Hydrobiologii 45 (3), 407-414. Lusk, S., Hanel, L. & Lusková, V. (2004). Red List of the ichthyofauna of the Czech Republic: Development and present status. Folia Zoologica 53, 215-226. Lusk, S. & Lusková, V. (2005). Invazivní druhy ryb v podmínkách České republiky. Sborník referátů z VIII. České ichtyologické konference, 135-140. Lusková, V., Halačka, K., Vetešník, L. & Lusk, S. (2002). Karas stříbřitý Carassius auratus v rybích společenstvech v oblasti dolního toku Dyje. Biodiverzita ichtyofauny ČR IV, 127-132.

77

Lusková, V., Halačka, K., Vetešník, L. & Lusk, S. (2004). Changes of ploidy and sexuality status of „Carassius auratus“ populations in the drainage area of the River Dyje (Czech Republic). Ecohydrology & Hydrobiology 4 (2), 165-171. Ma, X., Bangxi, X., Yindong, W. & Mingxue, W. (2003). Intentionally introduced and transferred fishes in China’s inland waters. Asian Fisheries Science 16, 279-290. Mahen, J. (1931). Příspěvek k systematice ryb kaprovitých. Sborník klubu přírodovědeckého v Brně 12, 33-47. Maldini, M., Marzano, F. N., Fortes, G. G., Papa, R. & Gandolfi, G. (2006). Fish and seafood traceability based on AFLP markers: Elaboration of a species database. Aquaculture 261, 487-494. Maxam, A. M. & Gilbert, W. (1977). A new method for sequencing DNA. Proceedings of the National Academy of Sciences USA 74, 560-564. Mendel, J., Lusková, V., Halačka, K., Lusk, S. & Vetešník, L. (2005). Genetic diversity of Gobio gobio populations in the Czech Republic and Slovakia, based on RAPD markers. Folia Zoologica 54 (1), 13-24. Meyer, A. (1994). Shortcomings of the cytochrome b gene as a molecular marker. Trends in Ecology and Evolution 9, 278-280. Mezhzherin, S. V. & Liseckij, I. L. (2004). Estestvennaja gibridizacija serebrjanogo karasja (Carassius auratus) i zolotogo (Carassius carassius) karasej: evoljucionnyj fenomen ili pogloščenie odnogo vida drugim? Reports of the NASU 9, 162-166 (in Russian). Mišík, V. & Holčík, J. (1962). A note on a Carassius auratus in Czechoslovakian Silesia. Věstník Československé společnosti zoologické 26 (4), 329-332. Mullis, K., Faloona, F., Scharf, S., Saiki, R., Horn, G. & Erlich, E. (1986). Specific enzymatic amplification of DNA in vitro: the polymerase chain reaction. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology 51, 263-273. Murakami, M. & Fujitani, H. (1997). Polyploid-specific repetitive DNA sequences from triploid ginbuna (Japanese silver crucian carp, Carassius auratus langsdorfi). Genes & Genetic Systems 72, 107-113. Murakami, M., Matsuba, C. & Fujitani, H. (2001). The maternal origins of the triploid ginbuna (Carassius auratus langsdorfi): phylogenetic relationships within the C. auratus taxa by partial mitochondrial D-loop sequencing. Genes & Genetic Systems 76, 25-32. Murakami, M., Matsuba, C. & Fujitani, H. (2002). Characterization of DNA markers isolated from the gynogenetic triploid ginbuna (Carassius auratus langsdorfi) by representational difference analysis. Aquaculture 208, 59-68. 78

Myers, R. M., Lumelsky, N., Lerman, L. S. & Maniatis, T. (1985). Detection of single base substitutions in total genomic DNA. Nature 313, 495-498. Nakamura, M. (1969). Cyprinid fishes of Japan – Studies on the life history of cyprinid fishes of Japan. Special Publications of the Research Institute for Natural Resources vol. 4, Tokio. 455 s. (in Japanese with English summary). Nei, M. (1987). Molecular Evolutionary Genetics. 1st edition. Columbia University Press, New York. 512 s. Ohara, K., Ariyoshi, T., Sumida, E. & Taniguchi, N. (2003). Clonal diversity in the Japanese silver crucian carp, Carassius langsdorfii inferred from genetic markers. Zoological Science 20, 797-804. Oliva, O. & Hruška, V. (1955). Poznámky k revizi našich karasů. Folia zoologica et entomologica 4 (1), 89-98. Orita, M., Iwahana, H., Kanazawa, H., Hayashi, K. & Sekiya, T. (1989). Detection of polymorphisms of human DNA by gel electrophoresis as single-strand conformation polymorphisms. Proceedings of the National Academy of Sciences USA 86, 2766-2770. Paepke, H. J. (1999). Bloch's fish collection in the Museum für Naturkunde der Humboldt Universität zu Berlin: an illustrated catalog and historical account, Theses Zoologicae 32, 1-216, Pls. 1-32. Palumbi, S. R. (1996). Nucleic acids II: the polymerase chain reaction. In: Hillis, D. M., Moritz, C. & Mable, B. K. (eds.) Molecular Systematics, 2nd edition. Sinauer Associates, Sunderland (MA), s. 205-247. Partis, L. & Wells, R. J. (1996). Identification of fish species using random amplified polymorphic DNA (RAPD). Molecular and Cellular Probes 10, 435-441. Pelz, G. R. (1987). Der Giebel: Carassius auratus gibelio oder Carassius auratus auratus? Natur und Museum 117 (4), 118-129 (in German). Peňáz, M., Ráb, P. & Prokeš, M. (1979). Cytological analysis, gynogenesis and early development of Carassius auratus gibelio. Acta Scientiarum Naturalium Academiae Scientiarum Bohemoslovacae - Brno, 13 (7), 1-33. Perdices, A. & Doadrio, I. (2001). The molecular systematics and biogeography of the European cobitids based on mitochondrial DNA sequences. Molecular Phylogenetics and Evolution 19, 468-478. Posada, D. & Crandall, K. A. (1998). Modeltest: testing the model of DNA substitution. Bioinformatics 14 (9), 817-818.

79

Prokeš, M. & Baruš, V. (1996). On the natural hybrid between common carp (Cyprinus carpio) and Prussian carp (Carassius auratus gibelio) in the Czech Republic. Folia Zoologica 45 (3), 277-282. Raicu, P., Taisescu, E. & Banarescu, P. (1981). Carassius carassius and C. auratus, a pair of diploid and tetraploid representative species (Pisces, Cyprinidae). Cytologia 46, 233-240. Rambaut, A. (2008). FigTree 1.1.2. Institute of Evolutionary Biology, University of Edinburgh. Dostupné k 1.10.2008 z: Renshaw, M. A., Saillant, E., Broughton, R. E. & Gold, J. R. (2006). Application of hypervariable genetic markers to forensic identification of ‘wild’ from hatchery-raised red drum, Sciaenops ocellatus. Forensic Science International 156, 9-15. Richardson, M. J., Whoriskey, F. G. & Roy, L. H. (1995). Turbidity generation and biological impacts of an exotic fish Carassius auratus, introduced into shallow seasonally anoxic ponds. Journal of Fish Biology 47 (4), 576-585. Rozas, J., Sánches-Delbarrio, J. C., Messeguer, X. & Rozas, R. (2003). DnaSP, DNA polymorphism analyses by the coalescent and other methods. Bioinformatics 19, 2496-2497. Sambrook, J., Fritsch, E. & Maniatis, T. (1989). Molecular cloning: a laboratory manual. 2nd edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York. 1659 s. Sanger, F., Nicklen, S. & Coulson, A. R. (1977). DNA sequencing with chainterminating inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences USA 74, 5463-5467. Sbisa, E., Tanzariello, F., Reyes, A., Pesole, G. & Saccone, C. (1997). Mammalian mitochondrial D-loop region structural analysis: identification of new conserved sequences and their functional and evolutionary implications. Gene 205, 125-140. Sloss, B. L., Billington, N. & Burr, B. M. (2004). A molecular phylogeny of the Percidae (Teleostei,

Perciformes)

based

on

mitochondrial

DNA

sequence.

Molecular

Phylogenetics and Evolution 32, 545-562. Song, C. B., Near, T. J. & Page, L. M. (1998). Phylogenetic relations among percid fishes as inferred from mitochondrial cytochrome b DNA sequence data. Molecular Phylogenetics and Evolution 10, 343-353. Southern, S. O., Southern, P. J. & Dizon, A. E. (1988). Molecular characterization of a cloned dolphin mitochondrial genome. Journal of Molecular Evolution 28, 32-42. Sterba, G. (1972). Akvaristika. 2. přepracované české vyd. Práce, Praha. 368 s. Stojanov, S. (1949). Lake Gebežnensko. Priroda i znanije 2 (6), 22 (in Bulgarian).

80

Stráňai, I. (1999). The find of a natural hybrid of Carassius gibelio (Bloch, 1782) x Cyprinus carpio (Linnaeus, 1758). Czech Journal of Animal Science 44, 515-522. Sušnik, S., Berrebi, P., Dovč, P., Hansen, M. M. & Snoj, A. (2004). Genetic introgression between wild and stocked salmonids and the prospects for using molecular markers in population rehabilitation: the case of Adriatic grayling (Thymallus thymallus L. 1785). Heredity 93, 273-282. Swofford, D. L. (2003). PAUP*. Phylogenetic Analysis Using Parsimony (*and Other Methods). Version 4 beta 10. Sinauer Associates, Sunderland (MA). Szczerbowski, J. A. (2002). Carassius auratus (Linnaeus, 1758). In: Banarescu, P. & Paepke, H. J. (eds.) The Freshwater Fishes of Europe, Vol. 5/III, Cyprinidae 2. AULA-Verlag, Wiesbaden, s. 5-41. Takai, A. & Ojima, Y. (1989). Conventional C-banding karyotypes and electrophoretic pattern of muscle protein in fish of genus Carassius from Ishigaki Island (Cyprinidae, Pisces). La Kromosomo II-54, 1782-1786. Tamura, K. & Nei, M. (1993). Estimation of the number of nucleotide substitutions in the control region of mitochondrial DNA in humans and chimpanzees. Molecular Biology and Evolution 10, 512-526. Tamura, K., Dudley, J., Nei, M. & Kumar, S. (2007). MEGA4: Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) software version 4.0. Molecular Biology and Evolution 24, 1596-1599. Tang, Q., Liu, H., Mayden, R. & Xiong, B. (2006). Comparison of evolutionary rates in the mitochondrial DNA cytochrome b gene and control region and their implications for phylogeny of the Cobitoidea (Teleostei: Cypriniformes). Molecular Phylogenetics and Evolution 39, 347-357. Teitler, N. M. & Fujita, K. (1993). The genus Carassius: an overview. Fourth Indopacific Fish Conference, Bangkok, 1-47. Temminck, C. J. & Schlegel, H. (1846). Pisces, Fauna Japonica Parts 10-14, s. 173-269. Vasil’eva, E. D. & Vasil’ev, V. P. (2000). K problemie proischoždenija i taksonomičeskogo statusa triploidnoj formy serebrannogo karasja Carassius auratus (Cyprinidae). Voprosy Ikhtiologii 40 (5), 581-592 (in Russian). Vetešník, L. (2005). Biologické charakteristiky karasa stříbřitého (Carassius auratus L.) s aspektem různé ploidie v podmínkách České republiky. 98 s. Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně. Agronomická fakulta. Vedoucí disertační práce prof. Ing. Petr Spurný, CSc. 81

Vos, P., Hogers, R., Bleeker, M., Reijans, M., van de Lee, T., Hornes, M., Frijters, A., Pot, J., Peleman, J., Kuiper, M. & Zabeau, M. (1995). AFLP: a new technique for DNA fingerprinting. Nucleic Acids Research 23 (21), 4407-4414. Ward, R. D. & Holmes, B. H. (2007). An analysis of nucleotide and amino acid variability in the barcode region of cytochrome c oxidase I (cox1) in fishes. Molecular Ecology Notes 7, 899-707. Weising, K., Nybom, H., Wolff, K. & Kahl, G. (eds.) (2005). DNA Fingerprinting in plants: Principles, methods, and applications. 2nd edition. CRC Press Taylor and Francis Group, Boca Raton. 472 s. Wiley, E. O., Johnson G. D. & Dimmick, W. W. (1998). The phylogenetic relationships of Lampridiform fishes (Teleostei: Acanthomorpha), based on a total-evidence analysis of morphological and molecular data. Molecular Phylogenetics and Evolution 10 (3), 417-425. Williams, J. G. K., Kubelik, A. R., Livak, K. J., Rafalski, J. A. & Tingey, S. V. (1990). DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers. Nucleic Acids Research 18 (22), 6531-6535. Wilson, A. C., Cann, R. L., Carr, S. M., George, M., Gyllensten, U. B., Helm-Bychowski, K. M., Higuchi, R. G., Palumbi, S. R., Prager, E. M., Sage, R. D. & Stoneking, M. (1985). Mitochondrial DNA and two perspectives on evolutionary genetics. Biological Journal of the Linnean Society 26, 375-400. Yang, Z. (1996). Among-site rate variation and its impact on phylogenetic analyses. Trends in Ecology and Evolution 11, 367-372. Yue, G. H. & Orban, L. (2002). Polymorphic microsatellites from silver crucian carp (Carassius auratus gibelio Bloch) and cross-amplification in common carp (Cyprinus carpio L). Molecular Ecology Notes 2, 534-536. Zardoya, R. & Doadrio, I. (1999). Molecular evidence on the evolutionary and biogeographical patterns of European cyprinids. Journal of Molecular Evolution 49, 227-237. Zhou, L., Wang, Y. & Gui, J. F. (2000). Genetic evidence for gonochoristic reproduction in gynogenetic silver crucian carp (Carassius auratus gibelio Bloch) as revealed by RAPD assays. Journal of Molecular Evolution 51, 498-506. Zhou, L., Wang, Y. & Gui, J. F. (2001). Molecular analysis of silver crucian carp (Carassius auratus gibelio) clones by SCAR markers. Aquaculture 201 (3-4), 219-228.

82

Zima, J., Macholán, M., Munclinger, P. & Piálek, P. (2004). Genetické metody v zoologii. 1. vyd. Nakladatelství Karolinum, Praha. 240 s. Žitňan, R. (1965). Ichtyofauna československého úseku Tisy. Zborník Východoslovenského múzea v Košiciach B 6, 61-67.

83

9. SEZNAM POUŽITÝCH ZKRATEK

AFLP BA bp COI CSB df DGGE ETAS GA ČR kb MP mtDNA MŽP ČR NJ n. l. PCR RAPD RFLP ř. km SSCP TGGE Ti Tv ÚBO AV ČR, v. v. i.

polymorfismus délek amplifikovaných fragmentů (Amplified Fragment Length Polymorphism) Bayesova analýza pár bazí (base pair) cytochrom c oxidáza podjednotka I conserved sequence block stupně volnosti (degrees of freedom) denaturační gradientová gelová elektroforéza (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis) extended termination-associated sequences Grantová agentura České republiky tisíc bazí (kilobasis) maximum parsimony mitochondriální DNA Ministerstvo životního prostředí České republiky neighbour-joining našeho letopočtu polymerázová řetězová reakce (Polymerase Chain Reaction) náhodně amplifikované polymorfní DNA (Randomly Amplified Polymorphic DNA) polymorfismus délky restrikčních fragmentů (Restriction Fragment Length Polymorphism) říční kilometr polymorfismus konformace jednořetězcové DNA (Single-Strand Conformation Polymorphism) teplotní gradientová gelová elektroforéza (Temperature Gradient Gel Electrophoresis) tranzice transverze Ústav biologie obratlovců Akademie věd České republiky, veřejná výzkumná instituce

84

10. PŘÍLOHY – SOUBOR PUBLIKACÍ

Příloha I Papoušek, I., Vetešník, L., Halačka, K., Lusková, V., Humpl, M. & Mendel, J. (2008). Identification of natural hybrids of gibel carp Carassius auratus gibelio (Bloch) and crucian carp Carassius carassius (L.) from lower Dyje River floodplain (Czech Republic). Journal of Fish Biology 72, 1230-1235.

Příloha II Vetešník, L., Papoušek, I., Halačka, K., Lusková, V. & Mendel, J. (2007). Morphometric and genetic analysis of Carassius auratus complex from an artificial wetland in Morava River floodplain, Czech Republic. Fisheries Science 73, 817-822.

Příloha III Papoušek, I., Lusková, V., Halačka, K., Koščo, J., Vetešník, L., Lusk, S. & Mendel, J. (2008). Genetic diversity of the Carassius auratus complex (Teleostei: Cyprinidae) in the central Europe. Journal of Fish Biology (submitted 10/2008).

85