MASARYKOVA UNIVERZITA PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA ÚSTAV BOTANIKY A ZOOLOGIE
TESTOVÁNÍ SMĚSNÝCH NEBO SEKVENČNĚ APLIKOVANÝCH FUNGICIDŮ NA RŮST ORCHIDEOIDNÍCH MYKORHIZNÍCH HUB IN VITRO
Diplomová práce
Michaela Šteslová
Vedoucí práce: RNDr. Milan Baláž, Ph.D.
Brno 2012
Bibliografický záznam Autor:
Název práce:
Bc. Michaela Šteslová Přírodovědecká fakulta, Masarykova univerzita Ústav botaniky a zoologie Testování směsných nebo sekvenčně aplikovaných fungicidů na růst orchideoidních mykorhizních hub in vitro
Studijní program:
Biologie
Studijní obor:
Učitelství biologie pro střední školy, Učitelství matematiky pro střední školy
Vedoucí práce:
RNDr. Milan Baláž, Ph.D.
Akademický rok:
2011/2012
Počet stran:
46
Klíčová slova:
orchideoidní mykorhiza; Epulorhiza; Ceratobasidium; Coprinus; karbendazim; propokonazol
Bibliographic Entry Author:
Bc. Michaela Šteslová Faculty of Science, Masaryk University Department of Botany and Zoology
Title of Thesis:
Testing of mixed or sequentially applied fungicides on the growth of orchid mycorrhizal fungi in vitro
Degree programme:
Biology
Field of Study:
Upper Secondary School Teacher Training in Biology, Upper Secondary School Teacher Training in Mathematics
Supervisor:
RNDr. Milan Baláž, Ph.D.
Academic Year:
2011/2012
Number of Pages:
46
Keywords:
orchid mykorhiza; Epulorhiza; Ceratobasidium; Coprinus; carbendazim; propiconazole
Abstrakt Studium funkcí orchideoidní mykorhizy (OM) je v současné době velmi limitováno absencí vhodné metody přípravy orchidejí s potlačenou mykorhizou. Vzhledem k časové náročnosti testování využití fungicidů k potlačení OM jejich aplikací přímo k hostitelským rostlinám znamená využití in vitro testování výrazné usnadnění. Ve své bakalářské práci jsem pozorovala četný vznik kmenů rezistentních ke karbendazimu (karb) a propikonazolu (prop), které v počátečních fázích byly velmi účinné. Studium vlastností těchto kmenů, stejně tak jako možnosti zamezení vzniku rezistence sekvenční nebo simultánní aplikací karb a prop byly cíli mé diplomové práce. Ověřila jsem rezistenci OM houby z rodu Epulorhiza jak vůči karb, tak i prop. Zjistila jsem, že při kultivaci kmene rezistentního ke karb na médiu bez tohoto fungicidu dochází po několika týdnech k nárůstu mycelia, které tuto rezistenci ztratilo. Potvrdila jsem synergistický efekt sekvenční i simultánní aplikace karb a prop. Oba tyto postupy tedy lze doporučit pro další testování vedoucí k přípravě orchidejí s potlačenou mykorhizou.
Abstract The study of orchid mycorrhiza (OM) functioning is very limited by a lack of a method suitable for creation of orchid plants with restricted OM development. With respect to a time consuming testing of fungicides effect using plants, in vitro system represents a highly effective way to quantify effect of fungicides on OM fungi. In my bachelor thesis I observed emergence of many strains resistant either to carbendazim (carb) or propiconazole (prop), despite both these fungicides were highly effective in preventing growth of OM fungi. The aims of my diploma work were i) to assess properties of these resistant strains and ii) to study sequential application of carb and prop or their application as mixture (simultaneous application). I confirmed the resistance of specific strains of the OM fungus from the genus Epulorhiza to carb and prop. I observed growth of mycelia lacking resistance to carb when resistant strain was cultivated for several weeks on media without this fungicide. I confirmed synergisms of both sequential and simultaneous application of carb and prop. Both these approaches I can thus recommend for further testing, leading to creation orchids with restricted mycorrhiza.
Na tomto místě bych ráda poděkovala vedoucímu své bakalářské práce RNDr. Milanu Balážovi, Ph.D. za odborné rady, konzultace a trpělivost při zpracování mé diplomové práce.
Prohlašuji, že jsem diplomovou práci vypracovala samostatně a použila jen prameny a literaturu uvedenou na seznamu. Souhlasím s uložením práce v knihovně Přírodovědecké fakulty Masarykovy univerzity a s jejím využitím ke studijním účelům.
V Brně dne 10. května 2012
………………………………
Obsah 1
2
3
Literární přehled ............................................................................................................... 10 1.1
Orchideoidní mykorhizní symbióza ......................................................................... 10
1.2
Houby tvořící OM .................................................................................................... 12
1.3
Příprava rostlin s omezenou mykorhizou................................................................. 13
1.4
Fungicidy.................................................................................................................. 14
1.5
Působení fungicidů na orchideoidní mykorhizu....................................................... 17
1.6
Rezistence hub vůči fungicidům .............................................................................. 18
Materiál a metody............................................................................................................. 22 2.1
Houbové izoláty ....................................................................................................... 22
2.2
Testované fungicidy ................................................................................................. 22
2.3
Kultivační postup ..................................................................................................... 22
2.4
Experiment 1 ............................................................................................................ 23
2.5
Experiment 2 ............................................................................................................ 23
2.6
Experiment 3 ............................................................................................................ 25
2.7
Experiment 4 ............................................................................................................ 26
2.8
Experiment 5 ............................................................................................................ 26
2.9
Experiment 6 ............................................................................................................ 27
2.10
Hodnocení růstu kolonií ........................................................................................... 27
2.11
Statistická analýza dat .............................................................................................. 27
Výsledky........................................................................................................................... 28 3.1
Experiment 1 ............................................................................................................ 28
3.2
Experiment 2 ............................................................................................................ 30
3.3
Experiment 3 ............................................................................................................ 33
3.4
Experiment 4 ............................................................................................................ 36
3.5
Experiment 5 ............................................................................................................ 37
3.6
Experiment 6 ............................................................................................................ 39
4
Diskuse ............................................................................................................................. 40
5
Citovaná literatura ............................................................................................................ 43
9
LITERÁRNÍ PŘEHLED
1 Literární přehled 1.1 Orchideoidní mykorhizní symbióza Orchideoidní mykorhiza (OM) je endotrofním typem mykorhizy a vytvářejí ji zástupci čeledě vstavačovitých, Orchidaceae. Tuto čeleď s počtem druhů od 20 000 do 35 000 lze považovat za jednu z největších a nejrozmanitějších v rostlinné říši (Cribb et al. 2003). V České republice roste přibližně 24 rodů a asi 60 druhů s početnými mezirodovými kříženci. Nejznámější lokality v České a Slovenské republice jsou například Belanské Tatry, Strážovské vrchy, Bílé Karpaty, Beskydy, Vsetinská pahorkatina a České středohoří (Průša 2005). Tato čeleď je nejohroženější nejen u nás, ale v celém světě. Hlavními důvody jsou například znečištění životního prostředí eutrofizací nebo přímá destrukce a zánik stanovišť. Dalším důvodem je přeměna luk či pastvin na ornou půdu, tedy devastace stanovišť (Wotavová et al. 2003). Orchideje můžeme nalézt v nejrůznějších prostředích, některé rostou terestricky, epifyticky, jiné lithofyticky. Mohou být také liánovitého charakteru, např. Vanilla. Za nejmenší orchidej je považována Rhizanthella spp., která je řazena mezi podzemní druhy (Smith et Read 1997). Spojení s houbovými symbionty - OM je známé již od 19. stolení (Smith et Douglas 1987). Životní cyklus hostitelských rostlin je na této symbióze závislý, protože rostliny bez ní v reálých podmínkách nedokáží vyklíčit. Hyfy specifické houby prorůstají do klíčícího semene a poskytují rostlině vitaminy, aminokyseliny, uhlíkaté látky a další živiny (Arditti et al. 1990). To potvrzuje i fakt, že všechny orchideje mají plody s velkým množstvím prachových semen o malé hmotnosti (0,3-14 µg) obsahující minimální množství lipidů, proteinů a škrobových zrn (Taylor et al. 2004; Arditti et Ghani 2000; Smith et Read 2008). Značnou roli hraje i v následném růstu semenáčů a pravděbodobně i u dospělých orchidejí. V dospělosti nepochybně vytvářejí OM nezelené druhy orchidejí, např. Neottia nidus-avis, Corallorhiza trifida, protože kvůli potlačené listové ploše jsou fotosynteticky nesoběstačné (Hudák et al 1997). Symbióza těmto orchidejím zabezpečuje přísun uhlíkatých látek, které jsou nezbytné pro jejich život. Na Zemi se vyskytuje přibližně 160 druhů nezelených orchidejí (Leake 1994). Nicméně pro většinu orchidejí platí, že v dospělosti mají dobře rozvinutou a fotosynteticky aktivní listovou plochu, dochází tedy ke změně způsobu výživy. Výhradní role OM je později částečně nebo úplně nahrazena fotosyntetickou asimilací CO2. Přesto většina fotoasimilujících druhů orchidejí
bývá mykorhizními houbami kolonizována.
10
LITERÁRNÍ PŘEHLED Na základě pozorování bylo zjištěno, že kořeny terestrických druhů mají oproti epifytickým druhům více kolonizované kořeny (Hadley et Williamson 1972). Stejně jako u jiných typů mykorhiz, i u OM symbiózy rozlišujeme kořenové a mimokořenové mycelium. Zatím je lépe probádáno mycelium kořenové s cílem objasnit mechanismus přenosu uhlíkatých látek uvnitř kořene. Mimokořenové mycelium je však pro funkci této symbiózy určující, jako u ostatních typů mykorhiz. OM houby produkují lytické enzymy (Hadley et Perombelon 1963, Hadley 1966, Smith 1966, Marchisio et al 1985), díky kterým uvolňují z půdy rozpustné látky. Ty se pak společně s minerálními látkami vstřebávají a transportují do kořene. U OM byly popsány dvě formy mykorhizní kolonizace kořenů orchidejí, tolypofágní a ptyofágní (Bernard 1909, Burgeff 1932, 1936). Tolypofágní forma je rozšířenější a běžnější typ a vyskytuje se jak u protokormů, tak u dospělých rostlin. K primárnímu průniku do pletiv kořene dochází z vnějšího půdního prostředí. Kořeny dospělých rostlin jsou kolonizovány přes kořenovou pokožku včetně kořenových vlásků (Peterson et Farquahar 1994). Houba se šíří pouze parenchymatickými buňkami primární kůry kořene. Nejblíže u povrchu kořene se nachází vrstvy průchozích buněk, kterými houba prorůsta bez většího větvení. Prorůstání hyf se děje výhradně symplastickou cestou, pravděpodobně přes plazmodezmy. Blíže ke středu kořene vytváří houba v hostitelských buňkách klubíčkovitě stočené hyfy, chatakteristické struktury zvané pelotony. Peloton je typická struktura pro mykorhizu, u volně žijících OM hub se nevyskytuje. Pozorování elektronovým mikroskope ukázalo, že buňky kořenové kůry nejsou nikdy v přímém kontaktu s rostlinnou cytoplazmou, ale jsou obklopeny vchlípenou cytoplazmatickou membránou hostitelských buněk, perifungální membránou (Hadley et al 1971, Nieuwdorp 1972, Peterson et al 1998). Mezi buněčnou stěnou houby a perifungální membránou se nachází mezilehlý prostor, který hraje důležitou roli v přenosech látek mezi rostlinou a houbou. Postupem času dochází k degeneraci pelotonů, tento proces nastává v rozmezí od dvou dnů (Purves et Hadley 1975) až po přibližně jeden měsíc od vzniku pelotonu (Burges 1939). Po pelotonu zůstane uvnitř buněk hostitele hmota houbového původu a velmi často dochází ke tvorbě pelotonu nového. Druhým typem OM je ptyofágní forma, která je známa pouze u několika druhů nezelených tropických orchidejí a dosud je velmi málo probádána. Žádný z českých zástupců ji zřejmě nevytváří. Od tolypofágní formy se liší destrukcí pelotonů. V případě ptyofágní formy dochází k lyzi jednotlivých hyf protůstajících do buněk primární kůry z rhizomorfy (svazek houbových vláken), narozdíl u tolypofágní formy podléhají lyzi celé pelotony. 11
LITERÁRNÍ PŘEHLED 1.2 Houby tvořící OM Houby, které nejčastěji tvoří mykorhizní symbiózu s orchidejemi řadíme do rodu Rhizoctonia. Bernard byl první, kterému se v roce 1904 podařila izolace tohoto druhu z kořene orchideje. V roce 1909 společně s Burgeffem poprvé popsaly pelotony a pokusili se o klasifikaci hub, které vyizolovali z kořenů orchidejí. Klasifikovali tři druhy rodu Rhizoctonia – R. repens, R. mucoroides a R. lanuginosa (Bernard 1909). Dříve byly za OM houby považovány také některé Ascomycota, dnes je za OM houby nepovažujeme, protože nejsou schopny vytvářet vnitrobuněčné hyfové smotky (Currah et al. 1997). Na základě morfologických znaků vegetativního mycelia byl rod Rhizoctonia rozdělen do několika anamorfních (anamorfní stádia – rozmnožují se pouze nepohlavně) rodů, například Moniliopsis, Ceratorhiza a Epulorhiza. Pozdějí se podařilo u některých izolátů indukovat teleomorfní stádia (pohlavní) (Warcup et Talbot 1967). Rod Rhizoctonia se podle těchto stádií dělí do tří hlavních kládů – Ceratobasidiales, Tulasnellales a Sebacinales, které řadíme do oddělení Basidiomycota. Podle pravidel v mykologii mají anamorfní a teleomorfní stadia téhož organismu dvě různá platná jména. Například anamorfnímu stadiu Ceratorhiza goodyerae – repentis odpovídá teleomorfní stadium Ceratobasidium cornigerum (Smith et Read 2008). Všechny houby vytvářející OM patří mezi stopkovýtrusné houby (Rasmussen 2002).
Za univerzálního
orchideoidního symbionta je považována Rhizoctonia repens, která byla izolována například z orchideje Dactylorhiza purpurella (Harvais et Hadley, 1967). Rozlišování jednotlivých druhů Rhizoctonia je obtížný úkol. Častěji se izoláty určují na základě anamorfních stádií, protože teleomorfními stádii se těžko získávají a rozdíly mezi nimi jsou u některých druhů velmi malé. Mycelium anamorfních stádií je tvořeno dvěma typy hyf, lineárních a tzv. moniliodních buněk. Lineární typ hyf je na povrchu hladký, výrazně přehrádkovaný, často se větvící a posléze se spájí. Moniliodní buňky jsou kratší, septované, vytvářejí řetízky a také mají schopnost se spájet. Pro druhové určení se využívají znaky jako počet jader v buňkách, rychlost růstu, barva kolonie, tvorba vzdušného mycelia a rozměry lineárních a monilioidních buněk. Jestliže jsou k dispozici teleomorfní stadia, tak se zjišťuje tvar a rozměry bazidií a bazidiospor. Charakteristickým znakem OM hub, schopnost saprofytního růstu, jsou hydrolytické enzymové aktivity těchto hub, zejména aktivita celulolytická, pektinolytická a fenolosidázová (Hadley et Perombelon 1963, Marchisio et al. 1985). Díky těmto aktivitám mohou OM houby využívat jako zdroj uhlíku a energie širokou paletu organických látek. Jako OM houby se
12
LITERÁRNÍ PŘEHLED mohou uplatňovat i některé izoláty Rhizoctonia izolované z kořenů jiných rostlin než orchidejí, izoláty rostoucí volně v půdě jako saprotrofní organizmy, nebo dokonce parazité jiných druhů rostlin. Například v kořenech Dactylorhiza purpurella byla zjištěna houba Rhizoctonia solani, která je častým patogenem rostlin čeledí Solanaceae a Cucurbitaceae (Downie 1957). Mezi OM houbami tedy najdeme parazitické houby, pudní saprofyty i houby, které tvoří ektomykorhizy. Orchideoidní mykorhizy nezelených druhů se vždy vyskytují v blízkosti ektomykorhiz a oby typy mykorhiz mohou být spojeny stejnou houbou, která zajišťuje transport energeticky bohatých látek z ektomykorhizní rostliny do orchideje (McKendrick et al. 2000). Při dlouhodobém soužití OM houby s orchidejí může dojít ke ztrátě schopnosti symbiotického soužití s jinými hostitely, s nimiž tvoří ektomykorhizy. Izoláty Sebacina vermifera získané z kořenů nebo z rhizosféry orchidejí Phyllanthus calycinus, vytvářejicí běžně arbuskulární mykorhizy, tvořily OM s orchidejemi Microtis, ale nebyly schopny tvořit ektomykorhizy s několika různými hostiteli (Warcup 1988).
1.3 Příprava rostlin s omezenou mykorhizou Pro experimentální studium mykorhizy je třeba získat kontrolní rostliny, u kterých je zcela potlačena mykorhiza (nemykorhizní rostliny), nebo alespoň částečně (semimykorhizní rostliny). Tyto rostliny mají nezastupitelný význam pro kvantifikaci růstové odezvy rostlin na vytvoření mykorhizní asociace, pro studium role OM v kompetičních vztazích s okolní vegetací. Jsou nutné pro experimenty, které se týkají zvýšeného příjmu minerálních látek, především fosforu. Pro studium fungování mykorhizních symbióz je vhodnější používat semimykorhizní rostliny, protože se fyziologicky více podobají rostlinám s rozvinutou mykorhizou. Možnosti přípravy rostlin s omezenou mykorhizou jsou nejvíce prostudovány u mykorhizy arbuskulární. Jako nejsnadnější se jeví metoda nezaočkování, to znamená, že rostliny se kultivují v substrátu či kultivačním médiu, které samo nesmí obsahovat žádné mykorhizní houby. Rostliny bez mykorhizy lze získat různými způsoby, mohou být vypěstovány z povrchově sterilních semen či získané některou z technik mikropropagace, např. somatickou embryogenezí. Neprobíhá-li experimentální práce v in vitro podmínkách, tak nelze jednoduše udržovat sterilitu kultivačního prostředí. Proto musí být rostliny kultivovány v substrátu, který je prostý kompatibilních mykorhizních hub. Toho se může docílit např. fumigací půdy, tedy aplikací par formaldehydu, chloropikrinu, metylbromidu či vapamu. Při terénních studiích je tato metoda nevhodná, protože takto ošetřená půda může být pro rostliny toxická (Menge
13
LITERÁRNÍ PŘEHLED 1982). Naopak často používanou metodou je tepelná sterilizace půdy. Výhodou je snadná příprava, např. autoklávováním. Půdu lze sterilizovat i γ-zářením, kdy se ovšem může z půdy uvolnit ve větší koncentraci toxický mangan nebo měď. Sterilizaci γ-zářením či fumigací lze používat pro laboratorní účely, nelze je však aplikovat při terénních studiích. Další alternativou je ošetření půdy fungicidem benomylem, který lze využít i při terénních studiích (Kahiluoto et al. 2000). Při použití fungicidů dochází zejména k redukci mimokořenového mycelia, zatímco vnitrokořenové mycelium nemůsí být výrazněji ovlivněno (Hutson et Miyamoto 1998). Kultivace rostlin bez mykorhizy je jedndušší v případě, že se spory dané kompatibilní mykorhizní houby nešíří anemochoricky na větší vzdálenosti. To je splněno například u arbuskulární mykorhizy, kdy není problém udržet nemykorhizní rostliny v běžném skleníku. Možná je i kultivace ve venkovním prostředí, když se zamezí vniknutí okolní půdy s autochtonními houbami do kultivačních nádob. U orchideoidní mykorhizy je situace odlišná, protože spory mykorhizních hub se snadno šíří vzduchem. Při kultivace ex vitro je možné zamezit přístupu spor například filtrací vzduchu, tato metoda se však z finančních důvodů nepoužívá. Nejvhodnější alternativou se tedy jeví požití fungicidů. Počátkem osmdesátých let minulého století byly jako první použity benzimidazoly, konkrétně thiabendazol (Alexander et al. 1984, Alexander et Hadley 1984, Alexander et Hadley 1985). Fungicidy jsou běžně používány i u jiných typů mykorhizních symbióz, k omezení růstu arbuskulárních hub byl v řadě terénních studií využit fungicid benomyl (West et al. 1993a, 1993b, Newsham et al. 1994, Kahiluoto et Vestberg 2000). Pro získání rostlin s potlačenou mykorhizou je vhodná aplikace fungicidů před vytvořením mykorhizní symbiózy.
1.4 Fungicidy Fungicidy se běžně používají především k ochraně zemědělských plodin. První fungicid byl pro tyto účely použit na začátku dvacátého století. Postupně vyvíjené fungicidy byly děleny na organické a anorganické. Jednou z nejdůležitějších skupin organických fungicidů jsou dithiokarbamáty, patří sem ferbam, ziram, thiriam, zineb a další. Tyto organické fungicidy jsou obvykle efektivnější než fungicidy anorganické. Organické molekuly fungicidů lépe pronikají do buněk houby a lépe inhibují její metabolické děje. Porušují fyziologické prosesy houbových buněk například reakcí s enzymy, které jsou důležité pro tvorbu proteinů. Tyto fungicidy ovlivňují více metabolických procesů v houbě. Nevýhodou fungicidů je, že 14
LITERÁRNÍ PŘEHLED nepůsobí pouze na houby, ale zároveň i na jiné organismy. Například deriváty dinitrofenolu narušují oxidativní fosforylaci při aerobním dýchání a tudíž jsou více méně toxické pro velké množství aerobních organismů. Toto neselektviní působení
má někdy vliv na vznik
nežádoucích efektů i u ošetřených rostlin a dalších organismů, například savců. Když se na začátku šedesátých let na tyto nepříznívé efekty přišlo, bylo snahou zvýšit efektivitu na cílové houby a snížit nežádoucí účinky na životní prostředí. Díky tomu se podařilo vyvinout nové typy fungicidů, které působí pouze na cílové organismy a nejsou toxické pro rostliny, savce a další organismy. Aktivita těchto fungicidů je omezená pouze na určitý počet inhibicí buněčné fyziologie. Většinou působí jen na určitý metabolický děj houby. Nejúčinnějšími fungicidy jsou ty, které inhibují biosyntézu životně důležitých struktur. Problémem těchto fungicidů je vysoké riziko vzniku rezistence. I přes širokou nabídku těchto fungicidů jsou stále houby, na které neúčinkují. Proto je nezbytné používat i fungicidy, které působí na více metabolických dějů (Hutson et Miyamoto 1998). Existuje mnoho kritérií, podle kterých je možné fungicidy třídit. Obecně jsou tříděny podle chemické povahy,
způsobu
účinku
proti
houbám
a podle všeobecného
použití
(Nene et Thapliyal 1993). Třídění je možné i podle jejich účinku na stavbu a funkci houbových buněk. Podle tohoto třídění jsou fungicidy do více než deseti kategorií (Anonymous 2009). První kategorie je tvořena fungicidy, které inhibují syntézu nukleových kyselin. Do této skupiny patří fenylamidy, které inhibují tvorbu RNA polymerázy. Jsou účinné např. proti Peronosporales (Oomycota). V roce 1973 byla objevena nová třída fenylamidů, acylalaniny, s vysokou účinností in vitro. Patří sem např. metalaxyl, který inhibuje biosyntézu ribozomální RNA. Dalšímí zástupci jsou benalaxyl, furalaxyl. Acylalaniny jsou významné v boji proti Oomycota, kde je většina ostatních fungicidů méně účinná (Hutson et Miyamoto 1998). Do druhé kategorie patří fungicidy, které narušují mitózu a buněčné dělení. Ovlivňují biosyntézu ß-tubulinu a tím zabraňují vzniku dělícího vřeténka. V šedesátých letech byla představena jedna z nejdůležitějších skupin této kategorie fungicidů, benzimidazoly. Hlavní zástupci této skupiny jsou benomyl, karbendazim a thiabendazol. Karbendazim použitý ve formě zálivky při sázení rostlin do rašelinného substrátu potlačil úplně růst mimokořenového mycelia orchideoidní mykorhizní houby (Trojanová 2008). Byl-li karbendazim přidán k plně vytvořené OM, neměl již žádný účinek (Balážová 2009). Karbendazim je zpočátku při kultivaci in vitro velmi účinný v potlačení růstu izolátů OM hub,
15
LITERÁRNÍ PŘEHLED jeho účinnost je však časově omezena (Šteslová 2010). Benzimidazoly jsou účinné proti Ascomycota, Fungi Imperfecti jako je Botrytis, Fusarium a Verticillium (Hutson et Miyamoto 1998).. Tyto houby zahrnují rostlinné patogeny zeleniny, ovoce a okrasných květin. Tyto fungicidy jsou málo toxické pro Basidiomycota, proto je možné je použít k ochraně hub tohoto rodu, které napadla Trichoderma nebo Verticillium. Do třetí skupiny patří fungicidy, které zasahují do buněčného dýchání. Tato skupina je členěna na další, např. inhibitory oxidativní fosforylace ATP syntázy: fentin acetát, fentin chlorid. Dalšími zástupci jsou fluazinam, metominostrobin, ferimzon a další (Anonymous 2009). Fluazinam má široké užití proti rostlinným patogenům, užívá se k ochraně brambor, vinné révy. Fermizon se používá k ochraně rýže (Hutson et Miyamoto 1998). Do další kategorie patří fungicidy, které ihibují syntézu proteinů a aminokyselin. Syntézu methioninu inhibují AP fungicidy (anilin-pyrimidiny), patří sem cyprodinil a pyrimethanil. Syntézu proteinů inhibují i některá anibiotika (tetracykliny). AP fungicidy jsou účinné proti Ascomycota a Fungi Imperfecti (Hutson et Miyamoto 1998). Další kategorie zahrnuje fungicidy, které narušují biosyntézu ergosterolu v buněčných membránách. Zemědělsky nejvíce užívané se dělí do dvou podskupin – DMI fungicidy (látky inhibující demetylaci) a skupina fungicidů odvozená od derivátů morfolinu. DMI fungicidy se dále dělí na triazoly, pyrimidiny, piridiny, piperaziny a imidazoly. Jedním ze zástupců DMI fungicidů je bitertanol, který je dostupný jako komerční přípravek Baycor®25 WP, který se používá především proti strupovitosti ovoce.(www.agromanual.cz). Dalšímí zástupci jsou např. propikonazol, etaconazol. Tato kategorie fungicidů je účinná proti Ascomycota, Basidiomycota a Fungi Imperfecti. Přenos signálů v buňce ovlivňují fenylpyroly, azanaftalény a dikarboxidy. Zástupci dikarboxidů jsou např. iprodion a vinklozolin. Tyto fungicidy jsou efektivní v boji proti Botrytis, Sclerotinia a dalším rostlinným patogenům. Způsobují poruchu buněčné struktury při růstu a dělení. Fenylpyroly jsou účinné proti Ascomycota, Basidiomycota. Do další kategorie patří fungicidy, které ovlivňují syntézu buněčných membrán a lipidů. Patří sem např. chloroneb, který je účinný proti Rhizoctonia, Typhula a Botrytis. Další zástupce quintozen se používá proti Plasmodiophora, Fusarium a Pythium.
16
LITERÁRNÍ PŘEHLED Syntézu melaninu v buněčných stěnách narušují MBI fungicidy (melanin biosyntesis inhibitors). Zástupci jsou např. tricyklazol, fenoxanil a diklocymet. Tricyklazol v in vitro podmínkách vykazuje velmi slabou toxicitu proti Pyricularia oryzae i proti jiným houbám (Nene et Thapliyal 1993). Do zbylých kategorií patří fungicidy, které indukují obranné reakce hostitele, narušují syntézu glukanu. Některé fungicidy mají vliv na více metabolických procesů buňky houby, tzv. multi site action fungicidy (např. mancozeb). U některých fungicidů je jejich mechanismus působení stále neznámý (např. triazoxid).
1.5 Působení fungicidů na orchideoidní mykorhizu Účinek fungicidů na orchideoidní mykorhizu je narozdíl od jiných typů mykorhiz velmi málo probádané téma. Ve světové literatuře je popsáno jen několik případů, které zkoumaly především benzimidazoly (thiabendazol a benomyl). Ve studiích z 80. let (Alexander et al. 1984, Alexander et Hadley 1984, 1985) byl popsán účinek thiabendazolu na rozvoj mykorhizní asociace oddenkaté stálezelené orchideje Goodyera repens s houbou Rhizoctonia goodyerae-repentis. Tento fungicid byl aplikován v in vitro i ex vitro podmínkách. Při kultivaci in vitro byl thiabendazol aplikován do agarem ztužených médií v koncentraci 1 mg·l-1, v případě ex vitro kultivace byla použita 10x vyšší koncentrace a rostlina byla pěstována ve směsi perlitu s vermikulitem. Toto ošetření v případě agarových médií velmi účinně potlačilo růst mimokořenového mycelia a fungicid neprokazoval žádné známky fytotoxicity (Alexander et Hadley 1984). V případě ex vitro kultivace ani zvýšená koncentrace a aplikace před zasazením rostlin nedokázal fungicid zamezit růstu houby v pletivech orchideje, pouze růst snížil. Účinek thiabendazolu byl poté zkoumán v jedné terénní studii, která měla kvantifikovat roli OM v produkci semen a plodů druhu Dactylorhiza maculata (Vallius 2001). Fungicid byl ve formě 10 ml roztoku o koncentraci 250 g thiabendazolu na 1 litr acidifikované vody o pH 2,2 injekčně aplikován přímo do půdy kolem kořenů každé rostliny. Autorka uvádí, že pravidelně odebírala kořeny a zpracovala je metodou, kdy kořeny po projasnění barvila trypanovou modří (Phillips et Hayman 1970), přesto výsledky neposkytují žádné údaje o rozsahu mykorhizní kolonizace. Rozdíly mezi ošetřenými a neošetřenými rostlinami byly sice statisticky průkazné, ale je možné, že došlo k poškození kořenového systému rostlin injekční aplikací thiabendazolu. V úvahu přichází i možnost, že ošetřené rostliny reagovaly na acidifikaci mykorhizosféry.
17
LITERÁRNÍ PŘEHLED Vzhledem k účinnosti thiabendazolu byl dalším testovaným fungicidem benomyl, který patří také do skupiny benzimidazolů. V současné době je to nejpoužívanější fungicid vůbec. Benomyl byl aplikován ve směsi společně s propikonazolem pro ošetření tropické orchideje Lepanthes rupestris (Bayman et al. 2002). Směs byla aplikována na rostliny ve formě postřiku každé dva týdny, koncentrace benomylu činila 0,8 g·l-1, propikonazol byl v koncentraci 0,1 g·l-1. Bohužel, efekt směsi na mykorhizní symbiózu nebylo v tomto experimentu možné prokázat, protže daná orchidej je velmi málo mykorhizní. Benomyl byl pro redukci OM použit také ve studii Shimura a Koda (2005), kdy byl jeho efekt testován na střevíčník druhu Cypripedium macranthos var. Rebunense v umělých podmínkách. Protokormy byly přeneseny na médium obsahující 1,7 µmol, tj. přibližně 0,5 mg·l-1 benomylu (Shimura et Koda 2005). V tomto případě byl růst mykorhizní houby potlačen, nebyla schopna prorůstat z kolonizovaných protokormů. V dalším experimentu byl testován efekt benomylu na růst OM hub u tří druhů orchidejí pěstovaných v zeolitu, Dactylorhiza fuchsii, D. Majalis a Platanthera bifolia (Čuříková et al. 2009). Rostliny byly ošetřovány fungicidem o koncentraci 25mg.kg-1 substrátu ve dvoutýdenních intervalech. Růst mimokořenového mycelia nebyl ovlivněn, v případě kolonizace kořenů druhu D. fuchsii nebyla po jedné dávce aplikace fungicidu statisticky průkazně nižší oproti kontrole. Vliv vybraných fungicidů (thiabendazol, karbendazim, iprodion, kaptan, fosetyl-Al a propikonazol) byl také testován na oddělení fyziologie a anatomie rostlin v rámci bakalářských a diplomových prací (Kyjovská 2007, Trojanová 2008, Huĺuková 2009). Získané výsledky ve své disertační práci shrnula Balážová (2009). Některé z experimentů se zaměřily například na testování fungicidů s různými mechanismy působení, na srovnání účinnosti daných fungcidních látek při aplikaci do mykorhizosféry narozdíl od aplikace do bočního hyfového oddělení v rhizoboxovém systému. Dále se testoval vliv přídavku organické hmoty do pěstebního substrátu na účinnost fungicidů. Jako nejúčinnější se jeví aplikace fungicidů do rhizoboxového systému, do hyfosféry. Účinnost se snižovala se zvyšujícím se obsahem organické hmoty v substrátu. Fungicidy je nutné aplikovat před rozvojem mimokořenového mycelia a jejich účinek je závislý na užité koncentraci.
1.6 Rezistence hub vůči fungicidům Houby, na které se aplikují po delší dobu fungicidy si jsou schopny vyvinout proti těmto látkám určitou rezistenci. Metody jak předcházet vzniku rezistence hub k daným fungicidům jsou komplexní problém. Existuje několik postupů, jak tuto rezistenci oddálit nebo zamezit
18
LITERÁRNÍ PŘEHLED jejímu vzniku. Dva nejvhodnější způsoby, jak předejít vzniku rezistence hub na fungicidy s odlišným chemickým působením, jsou střídání fungicidů nebo simultánní aplikace více fungicidů zároveň – ve směsi. Postupy pro oddálení vzniku rezistence mohou zahrnovat jednoduché střídání, kdy po jedné aplikaci fungicidu A použijeme fungicid B, potom A, opět B atd. Další variantou je aplikace jendoho fungicidu po delší dobu (série aplikací), pak použití jiného fungicidu jednorázově nebo opět v sérii aplikací. Bývá vhodné použít i třetí fungicid v této řadě. Množství aplikací v jedné sérii je obvykle limitováno (Anonymous 2010). Pro směsi je typické užití více fungicidů najednou. Množství jednotlivých fungicidů ve směsi je voleno tak, aby potlačilo růst houby i při samotném aplikování. Směsi ke komerčnímu použití je možné získat již smíchané nebo si je podle potřeby můžeme namíchat sami a tak dávky jednotlivých složek postupně regulovat. Množství fungicidů ve směsi můsí být pečlivě vyváženo s ohledem na délku, po kterou jsou schopny působit. Ve směsích se nejčastěji kombinuje tzv. single site fungicid s tzv. multi site fungicidem. Příkladem takovéto směsi je fungicidní přípravek Curzate® Gold (účinné látky mancozeb – multi site a cymoxanil – single site)(www.agromanual.cz). Single site fungicidy působí pouze na určitý metabolický děj v buňce (mitóza buňky, biosyntéza sterolů). Houby si snáze vytvoří rezistenci na tento typ fungicidů, protože snadno vznikne mutace příslušného genu. Druhou složkou je multi site fungicid, který nepůsobí pouze na jeden metabolický děj, ale inhibuje více dílčích mechanismů. U takovýchto fungicidů je malá pravděpodobnost vzniku rezistence. Na trhu jsou k dostání i směsi dvou single site fungicidů např. ARTEA 330 EC (účinné látky cyprokonazol a propikonazol). Oba fungicidy řadíme do skupiny DMI fungicidů, které inhibují syntézu sterolu. Fungicidní přípravek ALTO COMBI 420 SC obsahuje účinné látky s různým mechanismem působení (cyprokonazol-DMI fungicid a karbandazim–benzimidazol, brání vzniku dělícího vřeténka při mitóze)(www.agromanual.cz). Zatím nelze jednoznačně určit, která z metod, střídání fungicidů nebo užití směsi, je vhodnější pro potlačení vzniku rezistence. Volba metody je jednak závislá na druhu houby, dostupnosti vhodného fungicidu a dalších faktorech. Střídání fungicidů se například doporučuje v situaci, kdy během jedné vegetační sezóny rostliny musíme fungicid často aplikovat. Nicméně cílem je vybrat takovou metodu, která mininimalizuje riziko vzniku rezistence.
19
LITERÁRNÍ PŘEHLED Riziko vzniku rezistence je definováno jako kombinace chemické povahy fungicidu, jeho interakcí s houbou a podmínkami prostředí. Je obvyklé, že jeden fungicid působí odlišně na různé druhy hub. Riziko vzniku rezistence se dělí na nízké, střední a vysoké. Determinace středního rizika bývá nejobtížnější. Fungicid nebo kombinace fungicid – konkrétní druh houby je řazen do kategorie nízkého rizika vzniku rezistence, jestliže se rezistence objevila pouze ve vzácných případech nebo vůbec. Jak již bylo zmíněno, řadí se sem především multi site fungicidy např. dithiokarbamáty, sulfamidy. Kombinace fungicid – houba je klasifikováná do vysokého rizika vzniku rezistence na základě rychlého nárůstu mycelia, již během krátkého používání. Dochází zde ke vzniku monogenních mutací. Do této skupiny se řadí fenylamidy, MBC fungicidy (methyl benzimidazole carbamates), dikarboximidy. Riziko vzniku rezistence je samozřejmě závislé na kombinaci fungicid – druh houby. Je možné že kombinace téhož fungicidu na dva různé druhy hub může být jednou řazena do vysokého a v druhém případě do nízkého rizika vzniku rezistence. Ve směsích je možné kombinovat fungicidy s různou mírou rizika vzniku rezistence. Směs dvou fungicidů sice nedokáže zabránit eventuálnímu vzniku rezistence vůči jednotlivým složkám, ale při správném používání může nástup rezistence významně oddálit. První typ směsi je kombinace dvou funcidů s nízkým rizikem vzniku rezistence. Užívání této směsi dvou fungicidů nemění riziko vzniku rezistence při používání jednotlivých složek samostatně. Další typ směsi kombinuje fungicid A s vysokým rizikem (single site) a fungicid B s nízkým rizikem (multi site) v případě, že není známá rezistence vůči fungicidu A. V tomthle případě se používá nižší dávka fungicidu A než při jeho samotné aplikaci. Tato dávka je dána kritickou hranicí, při které by musela mít viditelný účinek i při samostatném užití. Obvyklá dávka ve směsi nemůže být nižší než 50% dávka doporučená pro samostatnou aplikaci fungicidu. Pro docílení dlouhodobé ochrany se doporučuje 75% dávky. Dalším typem směsi je kombinace dvou single site fungicidů s odlišným mechanismem působení a neznámou rezistencí ani k jednomu fungicidu. Používání směsi může oddálit vznik rezistence k jednotlivým fungicidům. Proto je možné tuto směs používat účinně déle, než samotné fungicidy. Koncentrace fungicidů ve směsi by měla být stejná jako při jejich samostatné aplikaci. V případě, že je známá rezistence k jedné nebo oběma složkám směsi, nelze používat složky samostatně. Je-li známá rezistence na nějaký fungicid A, není vhodné ho kombinovat s fungicidem B s vysokým rizikem vzniku rezistence. Takováto směs může urychlit vznik rezistence vůči fungicidu B (Anonymous 2010).
20
LITERÁRNÍ PŘEHLED Vznik rezistence obecně ovlivňuje 1) počet aplikací téhož fungicidu, rychlost vzniku mutace je přímoúměrná frekvenci aplikace; 2) uniformita, střídání nebo aplikace fungicidů s odlišnými mechanismy snižuje vznik rezistence; 3) množství, dávka fungicidu použitá při jednotlivé aplikaci, 4) množství již narostlé houby před aplikací fungicidu (Brent et Hollomon 2007).
21
MATERIÁL A METODY
2 Materiál a metody 2.1 Houbové izoláty Ve svých experimentech jsem použila tři izoláty orchideoidních mykorhizních hub, izolovaných do čistých kultur a dále kultivovaných v Mykorhizní laboratoři Ústavu experimentální biologie PřF MU v Brně. Izolát 2006/7 byl získán izolací z druhu Serapias strictiflora a podle analýzy jeho ITS oblasti rDNA se jedná o blíže neurčený druh rodu Epulorhiza; v GenBank je izolát veden pod číslem EU418851 (Látalová a Baláž 2010). Izolát 2007/4 byl získán z kořenů Ophrys speculum (syn. O. vernixia). Podle sekvenování ITS oblasti ribozomální DNA se jedná o zástupce rodu Ceratobasidium. Izolát 2010/26 byl izolován z druhu Ophrys sicula (syn. O. lutea ssp. galilea) a dle sekvenování ITS oblasti ribozomální DNA se jedná o zástupce rodu Coprinus nebo Coprinellus. Případné využití specifických kmenů izolátu 2006/7 rezistentních k danému fungicidu, získaných v rámci mé bakalářské práce (Šteslová 2010) je indikováno v popisu příslušného experimentu.
2.2 Testované fungicidy Ve svých experimentech jsem použila dva fungicidy: komerční fungicidní přípravek Tilt® 250 EC obsahuje jako aktivní fungicidní látku propikonazol (v dalším textu označován zkratkou prop; 1-[ [2-(2,4-dichlorophenyl)-4-propyl-1,3-dioxolan-2-yl]methyl]-1,2,4-triazol; 250 g·l-1). Druhá fungicidní látka, karbendazim (v dalším textu označován zkratkou karb; methyl-N-/2-benzimidazolyl/-karbamát), byl aplikován jako čistá chemikálie (Sigma, kat. č. 378674).
2.3 Kultivační postup Veškerá kultivace hub probíhala na živném médiu na nedělených Petriho miskách o průměru 9 cm. Jako médium pro kultivaci jsem použila médium PDA (bramborovoglukózový agar, na 1 litr média je třeba extrakt z 200 g rozmixovaných brambor, 10 g agaru a 10 g glukózy) (Gryndler et al. 2004). Fungicidní látky byly do PDA média přidávány před jeho autoklávováním (20 min při 120 °C). Každý fungicid byl testován ve čtyřech koncentracích. Výchozí koncentrace byla volena jako doporučená dávka výrobce pro foliární aplikaci (c1), dálší tři koncentrace byly dekadická ředění výchozí koncentrace (dále v textu značeny c1/10, c1/100 a c1/1000). Jako konrtolní varianta (k) bylo použito vždy PDA médium pouze s přídavkem rozpouštědla, které bylo použito ke vnesení fungicidu do médií (96% ethanol v případě karb,
22
MATERIÁL A METODY čistý aceton u prop). Kultivace probíhala ve tmě při teplotě 20 ± 2 °C. Každá Petriho miska byla zaočkována agarovým bločkem 0,5 × 0,5 cm, který byl odebrán z okraje aktivně rostoucí kolonie daného houbového izolátu na PDA médiu.
2.4 Experiment 1 V experimentu 1 jsem testovala vliv karb na růst izolátu 2006/7 bez získané rezistence (značen jako wt) a čtyř kmenů téhož izolátu, rezistentních vůči karb, odvozených v rámci v mé bakalářské práce (Šteslová 2010). Tyto kmeny jsou dále v textu značeny karb c1 res, karb c1/10 res, karb c1/100 res a karb c1/1000 res, tyto zkratky označují koncentraci karb, na které byla rezistence odvozena. Izoláty karb c1 res a karb c1/10 res se lišily oproti wt změněnou morfologií (obr. 1). Výchozí koncentrace c1 činila 1 g·l-1 PDA média, toto množství karb bylo do média vneseno rozpuštěné v 10 ml roztoku s 96% ethanolem. Pro další koncentrace byl ethanolový roztok s karb postupně dekadicky ředěn tak , aby do všech médií byl vnášen vždy stejný objem (10 ml·l-1) roztoku karb v ethanolu. Stejný objem ethanolu byl přidán i do kontrolní varianty. Experiment byl založen 18. listopadu 2010, kdy jednotlivé Petriho misky byly zaočkovány příslušnými kmeny izolátu 2006/7. K zaočkování byly použity kolonie narostlé v rámci 1. experimentu mé bakalářské práce, tedy 273 dny staré. Uspořádání experimentu 1 bylo faktoriální (5 kmenů OM houby × 5 variant PDA média dle koncentrace karb). Jednotlivé varianty byly připraveny ve čtyřech opakováních a hodnoceny ve 14denním intervalu po dobu 98 dní. Cílem tohoto experimentu bylo (1) ověřit, zda postupný nárůst izolátu 2006/7 (Epulorhiza sp.) na médiích s karb v rámci mé bakalářské práce nebyl způsoben rozpadem karb; (2) zjistit, zda kmen, který si vyvinul rezistenci za nižší koncentrace karb v PDA, je či není rezistentní i vůči vyšším koncentracím karb.
2.5 Experiment 2 V tomto experimentu jsem testovala efekt různé koncentrace karb v PDA médiu na růst 4 typů kmenů izolátu 2006/7 (obr. 2), získaných v rámci experimentu 1 této diplomové práce. Prvním kmenem byl izolát karb c1 res, přepasážovaný v rámci experimentu 1 mé diplomové práce na kontrolní PDA médium bez karb (ovšem s přídavkem 10 ml 96% etanolu na litr média), přičemž po 106 dnech růstu na tomto médiu měla narostlá kolonie morfotyp karb c1 res; v dalším textu je tento kmen značen jako karb c1 res → (PDA) → karb c1 res (zkratka
23
MATERIÁL A METODY v závorce udává použitý typ média). Tři zbylé kmeny použité v tomto experimentu lze analogicky označit jako karb c1 res → (PDA) →wt karb c1 res →(karb c1) → karb c1 res wt → (PDA) →wt (obr. 2). Výchozí koncentrace karb byla 1 g·l-1 PDA média, toto množství bylo do média vneseno v 10 ml 96% ethanolu; nižší koncentrace byly opět získány postupnými dekadickými ředěními. Experiment 2 byl založen 4. března 2011, jeho uspořádání bylo faktoriální (4 kmeny OM houby × 5 variant PDA média dle koncentrace karb). Jednotlivé varianty byly připraveny ve čtyřech opakováních a hodnoceny byly ve 14denním intervalu po dobu 56 dní. Cílem tohoto experimentu bylo ověřit, že nárůst izolátu 2006/7 morfotypu wt na médiu PDA bez karb z původního karb c1 res kmene, tedy scénář karb c1 res → (PDA) →wt, odpovídá znovuzískané citlivosti na karb.
Obrázek 1: Morfologie tří kmenů izolátu 2006/7 (Epulorhiza sp.), původního (a) a dvou rezistentních vůči karbendazimu (a,b), odvozených v rámci v mé bakalářské práce (Šteslová 2010) na PDA médiu s karbendazimem o koncentraci 100 mg·l-1 (b) nebo 1 g·l-1 (c) a použité k zaočkování experimentu 1.
24
MATERIÁL A METODY
Obrázek 2: Morfologie mycelia kmenů izolátu 2006/7 (Epulorhiza sp.), použité k zaočkování experimentu 2. Kmen rezistentní vůči karbendazimu (karb) o koncentraci 1 g·l-1 po 105 dnech od přeočkování na PDA médium bez karb v rámci experimentu 1 částečně (a) nebo téměř úplně (b) přerostl morfotypem téže houby bez získané rezistence. K zaočkování 1. a 2. varianty experimentu 2 byly použity pouze oblasti označené symbolem * (a,b). K zaočkovaní třetí varianty bylo použito mycelium kmene rezistentního ke karb o koncentraci 1 g·l-1 a udržované na PDA médiu s týmž obsahem karb (c), k zaočkování čtvrté varianty bylo využito mycelium kmene bez získané rezistence, udržované pouze na PDA médiu bez karb (d).
2.6 Experiment 3 V experimentu 3 jsem testovala efekt prop na růst izolátu 2006/7 wt a dvou kmenů téhož izolátu, rezistentních vůči prop, odvozených v rámci v mé bakalářské práce (Šteslová 2010). Kmeny jsou dále vedeny pod označením prop c1/100 res a prop c1/1000 res, tyto zkratky označují koncentraci prop, na které byla rezistence odvozena.Výchozí koncentrace fungicidu Tilt byla 0,5 ml·l-1 PDA média, což odpovídá 0,125 g prop na litr PDA média. Toto množství bylo vneseno do média jako roztok s čistým acetonem v poměru 1:1 (vol/vol). Nižší koncentrace prop byly ředěny pomocí acetonu a vnášeny do jednoho litru PDA média v množství 1 ml dané směsi. Kontrolní varianta obsahovala 1 ml acetonu na 1 litr PDA média. K přípravě
25
MATERIÁL A METODY inokula byly použity kolonie z 2. experimentu mé bakalářské práce, které byly dne 23. 12. 2010, tj. po 278 dnech, přepasážovány na čerstvé médium s příslušným obsahem prop. Po 49 dnech růstu byly tyto aktivně rostoucí kolonie dne 10. února 2011 využity k zaočkování tohoto experimentu. Uspořádání experimentu 3 bylo faktoriální (3 kmeny OM houby × 5 variant PDA média dle koncentrace prop). Jednotlivé varianty byly připraveny ve čtyřech opakováních a hodnoceny byly poprvé po 7 dnech od zaočkování, následně ve 14denním intervalu po dobu celkově 77 dní. Cílem tohoto experimentu bylo (1) ověřit, zda postupný nárůst izolátu 2006/7 (Epulorhiza sp.) na médiích s prop v rámci mé bakalářské práce nebyl způsoben rozpadem prop; (2) zjistit, zda kmen, který si vyvinul rezistenci za nižší koncentrace prop v PDA, je či není rezistentní i vůči vyšším koncentracím prop.
2.7 Experiment 4 V experimentu 4 jsem sledovala růst kmenů karb c1 res a wt izolátu 2006/7 na médiích s koncentrační řadou prop. Výchozí koncentrace přípravku Tilt byla 0,5 ml·l-1 PDA média. Toto množství bylo do média vneseno s čistým acetonem v poměru 1:1 (vol/vol). Dekadická ředění byla připravena stejně jako v experimentu 3. Kontrolní varianta obsahovala 1 ml acetonu na 1 litr PDA média. K zaočkování experimentu byly použity aktivně rostoucí kolonie na příslušných PDA médiích. Experiment byl založen 10. února 2012. Jednotlivé varianty byly připraveny v pěti opakováních a hodnoceny ve 14denním intervalu po dobu 70 dnů. Cílem tohoto experimentu bylo ověřit, zda kmeny karb c1 res a wt izolátu 2006/7 se navzájem liší svojí senzitivitou vůči prop. Tento experiment simuluje sekvenční aplikaci fungicidů.
2.8 Experiment 5 V tomto experimentu jsem testovala simultánní aplikaci karb a prop . Oba fungcicidy byly použity v c1/100 koncentraci. Byly připraveny čtyři varianty média, první varianta obsahovala karb i prop (K+P+), druhá varianta obsahovala pouze karb (K+P–), třetí pouze prop (K–P+) a čtvrtá byla bez fungicidů (K–P–). Všechny varianty byly připraveny tak, aby obsahovaly stejné množství rozpouštědel (1 ml acetonu a 10 ml 96% ethanolu na jeden litr média). Jednotlivé Petriho misky byly zaočkovány izoláty houby 2006/7, 2007/4 a 2010/26. 26
MATERIÁL A METODY Experiment byl založen 30. ledna 2012. Jednotlivé varianty byly připraveny v deseti opakováních a hodnoceny byly poprvé po 7 dnech od zaočkování, následně ve 14denním intervalu po dobu celkově 77 dní. Cílem experimentu bylo ověřit možný synergistický efekt simultánní aplikace karb a prop na dané izoláty hub.
2.9 Experiment 6 Tento experiment měl stejný design, použité organismy i cíle jako experiment 5. Na rozdíl od něj byly karb i prop použity v koncentraci c 1/1000. Experiment byl založen 29. března 2012, jednotlivé varianty byly hodnoceny ve dvou 14denních intervalech.
2.10 Hodnocení růstu kolonií V týdenním nebo 14denním intervalu jsem jednotlivé Petriho misky fotografovala digitálním fotoaparátem Olympus C-5050 v rozlišení 5 Mpx. Pořízené fotografie jsem podrobila analýze obrazu: nejprve jsem pomocí programu Corel Paint Shop Pro X2 (Corel Corporation, Ottawa, Kanada) provedla prahování jednotlivých fotografií
na základě lokálních maxim RGB
hodnot. Plochu mycelia jsem v takto připraveném binárním obrazu analyzovala v programu Image Tool verze 3 (University of Texas, USA).
2.11 Statistická analýza dat Rozdíly v účinnosti jednotlivých fungicidních ošetření na testované kmeny/izoláty byly hodnoceny
dvoucestnou
analýzou
rozptylu.
Homogenita
rozptylů
byla
testována
kombinovaným Hartley-Cochran-Bartlettovým testem, normalita reziduí byla hodnocena vizuálně pomocí grafu shody s normálním rozložením. V případě potřeby byla data před vlastní analýzou rozptylu transformována odmocninnou transformací. Rozdíly mezi jednotlivými průměry byly testovány Scheffeho0,05 testem. Data jsou prezentována ve formě průměr ± směrodatná odchylka. Pro výpočty byl použit software Statistica 9 (StatSoft, Tulsa, USA).
27
VÝSLEDKY
3 Výsledky 3.1 Experiment 1 V tomto experimentu jsem chtěla (1) ověřit, zda postupný nárůst izolátu 2006/7 (Epulorhiza sp.) na médiích s karb v rámci mé bakalářské práce nebyl způsoben rozpadem karb; (2) zjistit, zda kmen, který si vyvinul rezistenci za nižší koncentrace karb v PDA, je či není rezistentní i vůči vyšším koncentracím karb. Růst jednotlivých kmenů izolátu 2006/7 (Epulorhiza sp.) se získanou rezistencí ke karb, odvozenou v rámci mé bakalářské práce na PDA médiích s karb o koncentraci 1 g·l-1 (karb c1 res), 100 mg·l-1 (karb c1/10 res), 10 mg·l-1 (karb c1/100 res) a 1 mg·l-1 (karb c1/1000 res), popřípadě izolátu původního bez získané rezistence (wt), na nových PDA médiích s karb o koncentracích 0 (k) až 1 g·l-1 (c1), se nápadně lišil (obr. 4). Růst kmenů karb c1 res a karb c1/10 res (obr. 4 a,b) byl velmi podobný, po 98 dnech růstu činila velikost kolonie kmene karb c1 res rostoucího na c1 médiu 65 % velikosti kolonie na k médiu, případě karb c/10 res kmene činila tatáž hodnota 72 %. Velikost mycelií kmene karb c/10 res na c1/10 médiu se po 98 dnech statisticky průkazně nelišila od velikosti na c1 médiu (post-hoc Scheffého0,05 test, tab. 1). Tentýž závěr lze učinit i pro růst kmene karb c/100 res, u nějž rozdíly v růstu na médiích c1, c1/10 a c1/100 nebyly statisticky průkazné, přestože na médiu c1 byla velikost mycelií přibližně dvoutřetinová oproti velikosti na c1/100 médiu (tab. 1, obr. 4 c); vzhledem ke malému počtu opakování (n = 4) je však možné, že s větším rozsahem experimentu by tyto rozdíly byly průkazné. Obecně lze ovšem na základě mých dat konstatovat, že kmen, který si vyvinul rezistenci za nižší koncentrace karb v PDA, je rezistentní i vůči vyšším koncentracím karb, které navíc ani neinhibují rychlost jeho růstu. Zvýšený růst kmenů karb c1 res a karb c1/10 res na k médiu od přibližně 56 dne kultivace (obr. 4 a,b) byl způsoben postupným nárůstem mycelia morfotypu wt, který postupně začal přerůstat původní morfotyp rezistentních kmenů a jehož rychlost růstu byla vyšší (obr. 3). Rovněž růst kmenů karb c1/1000 res a wt byl velmi podobný (obr. 4 d,e). Oba tyto kmeny byly schopny velmi dobrého růstu na k médiu, kdy jimi vytvářená mycelia byla přibližně o polovinu větší než mycelia vytvářená na k médiu kmeny karb c1 res, karb c1/10 res a karb c1/100 res. Na všech Petriho miskách s PDA obsahujícím jakékoli množství přidaného karb nebyly oba tyto izoláty schopny růstu, s výjimkou jediného opakování (z celkového počtu 32), kdy u wt kmene na médiu c1/10 se odvodil nový rezistentní kmen. Lze tedy 28
VÝSLEDKY konstatovat, že postupný nárůst izolátu 2006/7 (Epulorhiza sp.) na médiích s karb v rámci mé bakalářské práce nebyl způsoben rozpadem karb, ale že došlo ke vzniku rezistence vůči danému fungicidu. Tabulka 1: Plocha mycelia izolátu 2006/7 (Epulorhiza sp.) s rezistencí ke karbendazimu odvozenou na médiích o koncentraci 1 g·l-1 (karb c1 res), 100 mg·l-1 (karb c1/10 res), 10 mg·l-1 (karb c1/100 res) a 1 mg karbendazimu na 1 litr média (karb c1/1000 res), popřípadě izolátu původního bez získané rezistence (wt), na PDA médiu s karbendazimem o koncentracích 0 (k, kontrola) až 1 g·l-1 (c1). Hodnoceno po 98 dnech růstu. Data představují průměry ze 4 opakování ± SD, průměry označené v rámci jednotlivých sloupců stejným písmenem se statisticky průkazně neliší (Scheffé0,05 test). 2
Plocha mycelia kmene izolátu 2006/7 (mm ) Médium
karb c1/10 res 1810 ± 231 b 1461 ± 153 ab
karb c1/100 res 2027 ± 214 b
c1/1 000
karb c1 res 1906 ± 446 b 1317 ± 122 ab
1600 ± 252 b
0±
0a
0±
0a
c1/100
1410 ± 81 ab
1404 ± 133 a
1027 ± 97 a
0±
0a
0±
0a
c1/10
1270 ± 108 a
1474 ± 89 ab
961 ± 102 a
0±
0a
0±
0a
c1
1241 ± 188 a
1298 ± 48 a
710 ± 261 a
k
karb c1/1000 res 2794 ± 213 b
15 ± 30 a
wt 3228 ± 256 b
15 ± 30 a
Obrázek 3: Mycelium karb c1 res kmene houby Epulorhiza sp. (izolát 2006/7) po 98 dnech růstu na PDA médiu bez přidaného karbendazimu. Původní morfotyp karb c1 res kmene (#) byl od přibližně 56 dne kultivace postupně přerůstán wt morfotypem (*).
29
VÝSLEDKY
Obrázek 4: Časový průběh růstu čtyř kmenů izolátu 2006/7 (Epulorhiza sp.) s rezistencí ke karbendazimu odvozenou na médiích o koncentraci 1 g·l-1 (a), 100 mg·l-1 (b), 10 mg·l-1 (c) a 1 mg karbendazimu na 1 litr média (d), popřípadě izolátu původního bez získané rezistence (e), po přeočkování na nová PDA média s karbendazimem o koncentracích 0 (k, kontrola) až 1 g·l-1 (c1). n = 4.
3.2 Experiment 2 V experimentu 2 jsem chtěla ověřit, jestli nárůst izolátu 2006/7 morfotypu wt na médiu PDA bez karb z původního karb c1 res kmene, tedy scénář karb c1 res → (PDA) →wt, odpovídá znovuzískané citlivosti na karb. Růst izolátu 2006/7 (Epulorhiza sp.), kmenů karb c1 res → (PDA) → karb c1 res a karb c1 res → (c1) → karb c1 res (obr. 5a,c) byl s výjimkou zvýšeného růstu kmene karb c1 res → (PDA) → karb c1 res na k médiu velmi podobný. Tento výsledek potvrzují výsledky
30
VÝSLEDKY dvoucestné analýzy rozptylu a následných post-hoc Scheffého0,05 testů, kdy rozdíly mezi těmito dvěma kmeny nebyly průkazné, byla však průkazná interakce kmene houby s použitou koncentrací karb v PDA médiu (tab. 2,3). Výjimečně vysoký růst růstu kmene karb c1 res → (PDA) → karb c1 res na k médiu byl způsoben postupným nárůstem mycelia wt morfotypu, tedy jevem, který jsem pozorovala již v prvním experimentu. Rovněž růst kmenů karb c1 res → (PDA) →wt a wt → (PDA) →wt byl velmi podobný (obr. 5 b, d). Po statistickém vyhodnocení dat byla zjištěny pouze rozdíly v růstu na PDA médiu s různou koncentrací karb (tab. 4,5). Téměř identické chování kmenů karb c1 res → (PDA) → karb c1 res a karb c1 res →(karb c1) → karb c1 res a zcela identické chování kmenů karb c1 res → (PDA) →wt a wt → (PDA) →wt je potvrzením že morfotyp wt narostlý na médiu PDA bez karb z původního karb c1 res kmene ztrácí svoji původní rezistenci na karb. Tabulka 2: Výsledky dvoucestné analýzy rozptylu hodnotící plochu mycelia dvou kmenů izolátu 2006/7 (karb c1 res → (PDA) → karb c1 res a karb c1 res →(karb c1) → karb c1 res ) po 56 dnech růstu na pěti médiích, kontrolním PDA a čtyřech obsahujícím karbendazim v koncentracích c1 až c1/1000. Efekt kmen houby použité médium kmen houby × použité médium chyba
SS 42111 697229
d.f. 1 4
MS 42111 174307
F 1,67 6,90
P 0,206 <0,001
616631
4
154158
6,10
<0,001
783525
31
25275
Tabulka 3: Plocha mycelia kmenů izolátu 2006/7 (Epulorhiza sp.) s rezistencí ke karbendazimu odvozenou na médiu o koncentraci 1 g·l-1 (karb c1 res), kdy po přepasážování na PDA médium bez nebo s přídavkem karbendazimu o koncentraci 1 g·l-1 narostlo mycelium s morfotypem shodným s rezistentním kmenem; tato mycelia byla použita k zaočkování experimentu 2. Hodnoceno po 56 dnech růstu. Data představují průměry ze 4 opakování ± SD, průměry označené stejným písmenem se statisticky průkazně neliší (Scheffé0,05 test). Kmen izolátu 2006/7
Médium
karb c1 res →(PDA)→ karb c1 res
k
karb c1 res→ (c1)→karb c1 res
2
Plocha mycelia (mm )
c1/1 000
1560 ± 111 b 1000 ± 39 a
c1/100
1007 ± 105 a
c1/10
944 ± 64 a
c1
884 ± 155 a
k c1/1 000
1184 ± 187 ab 1047 ± 208 a
c1/100
1126 ± 143 ab
c1/10
1107 ± 178 ab
c1
1252 ± 264 ab
31
VÝSLEDKY
Tabulka 4: Výsledky dvoucestné analýzy rozptylu hodnotící plochu mycelia dvou kmenů izolátu 2006/7 (karb c1 res → (PDA) → wt a wt →(PDA) → wt ) po 56 dnech růstu na pěti médiích, kontrolním PDA a čtyřech obsahujícím karbendazim v koncentracích c1 až c1/1000. Efekt kmen houby použité médium kmen houby × použité médium chyba
SS 62151 19433312
d.f.
MS 1 62151 4 4858328
208727
4
52182
712804
29
24579
F 2,53 197,66
P 0,123 <0,001
2,12
0,103
Tabulka 5: Plocha mycelia kmenů izolátu 2006/7 (Epulorhiza sp.) morfotypu wt na médiu PDA bez karb z původního karb c1 res kmene (karb c1 res →(PDA)→ wt) a morfotypu wt na médiu PDA bez karb z původního wt (wt → (PDA) →wt ). Hodnoceno po 56 dnech růstu. Data představují průměry ze 4 opakování ± SD, průměry označené stejným písmenem se statisticky průkazně neliší (Scheffé0,05 test). Kmen izolátu 2006/7
Médium
karb c1 res →(PDA)→ wt
k
wt → (PDA) →wt
2
Plocha mycelia (mm )
c1/1 000
1788 ± 121 c 573 ± 78 c
c1/100
188 ± 189 ab
c1/10
81 ± 96 ab
c1
82 ± 95 ab
k c1/1 000
2097 ± 109 c 550 ± 192 ab
c1/100
129 ± 70 ab
c1/10
57 ± 114 a 280 ± 313 ab
c1
32
VÝSLEDKY
Obrázek 5: Časový průběh růstu čtyř kmenů izolátu 2006/7 (Epulorhiza sp.) na PDA médiu s koncentrací karbendazimu (karb) 0 (k) až 1 g·l-1 (c1) (a,b,c,d). K zaočkování byly využity kmeny se získanou rezistencí ke karbendazimu (karb) odvozenou na PDA médiu s karb koncentraci 1 g·l-1 (a,b,c), u nichž po přepasážování v rámci 1. experimentu na PDA médium bez karb (a,b) zůstal zachován morfotyp karb c1 res kmene (a), popřípadě došlo k návratu k wt morfotypu (b). Třetí kmen byl původní karb c1 res kmen přepasážovaný na PDA médium s 1 g karb na 1 litr média, u nějž zůstal zachován morfotyp rezistentného kmene (c). V poslední variantě byl k zaočkování použit původní, nerezistentní kmen izolátu 2006/7, který byl udržován na PDA médiu bez karb (d). n = 4.
3.3 Experiment 3 V tomto experimentu jsem měla za úkol (1) ověřit, zda postupný nárůst izolátu 2006/7 (Epulorhiza sp.) na médiích s prop v rámci mé bakalářské práce nebyl způsoben rozpadem prop; (2) zjistit, zda kmen, který si vyvinul rezistenci za nižší koncentrace prop v PDA, je či není rezistentní i vůči vyšším koncentracím prop. Zatímco růst kmenů wt a prop c1/1000 res byl identický (obr. 6 b,c) a lišil se pouze v závislosti na koncentraci prop v PDA médiu, růst kmene prop c1/100 res byl od těchto dvou výrazně odlišný, neboť jeho růst na médiích c1/1000 a c1/100 byl oproti růstu na k médiu snížen výrazně méně. Tento výsledek potvrzují výsledky dvoucestné analýzy rozptylu a následných post-hoc
33
VÝSLEDKY Scheffého0,05 testů, kdy rozdíly mezi růstem kmenů wt a a prop c1/1000 res nebyly průkazné, byla však průkazná interakce kmene houby s použitou koncentrací prop v PDA médiu (tab. 6,7). Kmen prop c1/100 res získaný v rámci mé bakalářské práce má tedy sníženou citlivost na prop. Ani tento kmen, stejně jako kmeny wt a prop c1/1000 res však není schopen růstu na médiích s vyššími koncentracemi prop – c1/10 a c1. Tabulka 6: Výsledky dvoucestné analýzy rozptylu hodnotící plochu mycelia tří kmenů izolátu 2006/7 (wt , prop c1/1000 a prop c1/100) po 77 dnech růstu na pěti médiích, kontrolním PDA a čtyřech obsahujícím propikonazol v koncentracích c1 až c1/1000. Efekt kmen houby použité médium kmen houby × použité médium chyba
SS 523897 48670381
d.f.
MS 2 261949 4 12167595
2542155
8
317769
1506128
44
34230
F 7,653 355,464
p 0,001 <0,001
9,283
<0,001
Tabulka 7: Plocha mycelia dvou kmenů izolátu 2006/7 (Epulorhiza sp.) s rezistencí k propikonazolu odvozenou na médiích o koncentraci 1,25 mg·l-1 (prop c1/1000 res) a 12,5 mg·l-1 (prop c1/100 res), na pěti médiích PDA s koncentrací propikoanzolu 0 až 125 mg·l-1. Hodnoceno po 77 dnech růstu. Data představují průměry ze 4 opakování ± SD, průměry označené stejným písmenem se statisticky průkazně neliší (Scheffé0,05 test). Kmen izolátu 2006/7
Médium
prop c1/1000 res
k
2569 ± 113 1335 ± 306
c1/1 000
d c
623 ± 295 a
c1/100
prop c1/100 res
2
Plocha mycelia (mm )
c1/10
0±
0a
c1
0±
0a
k c1/1 000
2135 ± 69 d 1948 ± 140 cd
c1/100
1421 ± 314 c
c1/10
0±
0a
c1
0±
0a
34
VÝSLEDKY
Obrázek 6: Časový průběh růstu tří kmenů izolátu 2006/7 (Epulorhiza sp.) s rezistencí k propikonazolu, odvozenou na médiích o koncentraci 1,25 mg·l-1 (a) a 0,125 mg·l-1 (b), popřípadě izolátu původního bez získané rezistence (c), po přeočkování na nová PDA média s propikonazolem o koncentracích 0 (k, kontrola) až 125 mg·l-1 (c1). n = 4.
35
VÝSLEDKY 3.4 Experiment 4 Cílem tohoto experimentu simulujícího sekvenční aplikaci fungicidů bylo ověřit, zda kmeny karb c1 res a wt izolátu 2006/7 se navzájem liší svojí senzitivitou vůči prop. Plocha mycelia hodnocená po 70 dnech růstu ukázala na odlišný růst obou izolátů a tedy na jejich rozdílnou senzitivitu vůči prop (tab. 8, 9). Kmen wt rostl na k a c1/1000 médiích statisticky průkazně rychleji než karb c1 res kmen, na c1/100 médiu byl schopen růst pouze wt kmen, nikoli však karb c1 res kmen. Na vyšších koncentracích prop v médiu, tedy c1/10 a c1 nebyl schopen růst ani jeden z testovaných izolátů. Výsledky tedy potvrzují rozdílnou citlivost těchto dvou kmenů téhož druhu houby na prop (obr. 7). Tabulka 8: Výsledky dvoucestné analýzy rozptylu hodnotící plochu mycelia dvou kmenů izolátu 2006/7 (karb c1 res a wt) po 70 dnech růstu na pěti médiích, kontrolním PDA médiu a čtyřech obsahujícím propikonazol v koncentracích c1 až c1/1000. Efekt kmen houby použité médium kmen houby × použité médium chyba
SS 1180877 17165930
d.f.
MS 1 1180877 4 4291482
1289002
4
322250
490961
40
12274
F 96,209 349,639
p <0,001 <0,001
26,255
<0,001
Tabulka 9: Plocha mycelia dvou kmenů izolátu 2006/7 (Epulorhiza sp.), karbendazim rezistentního, odvozeného na médiu o koncentraci 1 g·l-1 (karb c1 res) a nerezistentního wt, na pěti médiích PDA s koncentrací propikoanzolu 0 až 125 mg·l-1. Hodnoceno po 70 dnech růstu. Data představují průměry z 5 opakování ± SD, průměry označené stejným písmenem se statisticky průkazně neliší (Scheffé0,05 test). Kmen izolátu 2006/7
Médium
karb c1 res
k
1117 ± 155 c 321 ± 173 b
c1/1 000
wt
2
Plocha mycelia (mm )
c1/100
0±
0a
c1/10
0±
0a
c1
0±
0a
k
1949 ± 170 828 ± 156
c1/1 000
d c
198 ± 123 ab
c1/100 c1/10
0±
0a
c1
0±
0a
36
VÝSLEDKY
Obrázek 7: Časový průběh růstu kmene izolátu 2006/7 (Epulorhiza sp.) (a) s rezistencí ke karbendazimu (karb c1 res) , odvozenou na médiu o koncentraci 1 g·l-1 (karb c1 res) a (b) původního wt izolátu bez získané rezistence, po přeočkování na nová PDA média s propikonazolem o koncentracích 0 (k, kontrola) až 125 mg·l-1 (c1). n = 5.
3.5 Experiment 5 Cílem experimentu bylo ověřit možný synergistický efekt simultánní aplikace karb a prop v koncentraci c1/100 na tři izoláty hub, 2006/7, 2007/4 a 2010/26. Ten byl potvrzen pouze u izolátu 2006/7: pokud rostl tento izolát na médiu K+P–, došlo po 77denní kultivaci na 3 Petriho miskách z 10 ke vzniku a růstu rezistentního kmene, zatímco na médiu K+P+ jsem vznik rezistence na žádné z 10 Petriho misek nepozorovala. Zbylé dva izoláty byly v růstu ovlivněny zejména karb, prop ve variantě K–P+ u izolátu 2007/4 pouze mírně, u izolátu 2010/26 výrazněji snížil rychlost růstu na začátku kultivace, přesto nebyl schopen jej účinněji potlačit (obr.8).
37
VÝSLEDKY
Obrázek 8: Časová závislost růstu mycelia izolátů 2006/7 (a), 2007/4 (b) a 2010/26 (c) na přítomnost fungicidů karb (K+) a prop (P+). Koncentrace karb činila 10 mg·l-1, koncentrace prop činila 12,5 mg·l-1. n = 10.
38
VÝSLEDKY 3.6 Experiment 6 Cílem experimentu bylo ověřit možný synergistický efekt simultánní aplikace karb a prop v koncentraci c1/1000 na tři izoláty hub, 2006/7, 2007/4 a 2010/26. Tento efekt nebyl potvrzen ani u jednoho testovaného izolátu. V nízkých koncentracích (c1/1000) byl karb výrazně účinnějším fungicidem v redukci růstu všech tří izolátů než prop (obr. 9).
Obrázek 9: Časová závislost plochy mycelia izolátu 2006/7 (a), 2007/4 (b) a 2010/26 (c) na přítomnost fungicidů karb (K+) a prop (P+). Koncentrace karb činila 1 mg·l-1, koncentrace prop činila 1,25 mg·l-1. n = 10.
39
DISKUSE
4 Diskuse Studium funkcí OM je v současné době výrazně limitováno absencí vhodné metody přípravy orchidejí s potlačenou mykorhizou. Nejschůdnější cestou k jejich získání se jeví použití fungicidů. Testování efektu fungicidů na růst OM hub v in vitro systémech při kultivaci na agarových médiích představuje vhodný předstupeň jejich testování v ex vitro experimentech, přestože se jedná o z hlediska výživy OM houby výrazně zjednodušený systém. Toto testování se stalo i cílem mé diplomové práce, když jsem v návaznosti na svou bakalářskou práci 1) zjišťovala vlastnosti kmenů izolátu 2006/7 (Epulorhiza sp.) rezistentních ke karb a prop, 2) ověřovala možnosti využití sekvenční nebo simultánní aplikace různých fungicidů k omezení vzniku rezistence a růstu OM hub. Vznik rezistence se ukázal jako velmi výrazný problém, v mé bakalářské práci jsem pozorovala po 56 dnech kultivace izolátu 2006/7 na PDA médiu s karb o koncentraci 1 g·l-1 u 3 ze 4 Petriho misek nárůst mycelia, přestože tento fungicid byl zpočátku vysoce účinný v redukci růstu této houby. Protože nebylo možno vyloučit možný postupný rozpad karb, testovala
jsem
ve
své
diplomové
práci
vlastnosti
těchto
rezistentních
kmenů.
Po přepasážování na nová média s variabilním obsahem karb jsem prokázala, že se opravdu jedná o kmen se získanou rezistencí. Navíc, pokud byla rezistence získána na médiu s karb c1/10, po přepasážování na médium c1 nebyl jeho růst snížen. Naproti tomu kmen s rezistencí získanou na médiu s karb c1/100 byl schopen růstu na všech koncentracích karb, ale s jeho zvyšující se koncentrací se jeho růst snižoval. Tento výsledek je v souladu s účinky karb jakožto fungicidu ze skupiny benzimidazolů, které inhibují syntézu ß-tubulinu. Pokud po aplikaci benzimidazolů vzniknou rezistentní kmeny hub, ani jejich zvýšená koncentrace již není schopna růstu těchto kmenů zabránít (Matsuo et al 1999). Neočekávaným výsledkem bylo, že kmen izolátu 2006/7 rezistentní ke karb, který má výrazně změněnou morfologii mycelia, po přepasážování na PDA médium bez karb po několika týdnech růstu, kdy vykazoval výhradně karb c1 res morfologii, začal být postupně přerůstán wt morfotypem téže houby. Možným vysvětlením je, že k inokulaci byla použita směs wt a karb c1 res kmenů, přičemž wt byl schopen na karb c1 médiu přežívat a po odstranění stresoru (karb) začal převládat. Vzhledem k faktu, že k nárůstu wt morfotypu došlo až po několika týdenní kultivaci je spíš pravděpodobné, že přepínání morfotypů wt a karb rezistentích je způsobeno nějakým blíže neznámým epigenetickým mechanismem.
40
DISKUSE Vlastnosti wt i karb c1 res morfotypu narostlého na PDA médiu z původního karb c1 res kmene jsem porovnávala s původním wt kmenem pěstovaným na PDA médiu a původním karb c1 res kmenem pěstovaným na karb c1 médiu. Prokázala jsem, že wt morfotyp narostlý na PDA médiu z původního karb c1 res kmene měl identickou senzitivitu vůči karb jako původní wt izolát, jinými slovy po odstranění stresoru (karb) narostlo mycelium, které ztratilo svoji rezistenci vůči karb. Narozdíl od karb rezistentních kmenů izolátu 2006/7 kmeny rezistentní k prop nebyly schopny růst na vyšších koncentracích prop než na kterých byly odvozeny. Rovněž v tomto případě bylo potvrzeno, že se jedná o získanou rezistenci k prop, nikoli o rozpad tohoto fungicidu v PDA médiích v rámci mé bakalářské práce. Jak jsem zjistila ve své bakalářské a nyní i v diplomové práci, jak prop tak karb jsou při potlačení růstu izolátů 2006/7 (Epulorhiza sp.), 2007/4 (Ceratobasidium sp.) a 2010/26 (Coprinus/Coprinellus sp.) vysoce účinné.
Pro zvládnutí cíle, jímž je získání orchidejí
s potlačnou mykorhizou, je však nutné zabránit vzniku rezistentních kmenů, které byly odvozeny při kultivaci na karb i prop. Z tohoto důvodu jsem testovala karb a prop aplikované simultánně a rovněž efekt prop na karb c1 res kmen 2006/7, což mělo simulovat sekvenční aplikaci těchto fungicidů. Sekvenční nebo simultánní aplikace fungicidů jsou v zemědělské praxi běžně využívány k prevenci vzniku rezistentních kmenů patogenních hub (Anonymous 2010). Dle mých znalostí nebyly dosud tyto postupy za účelem potlačení rozvoje mykorhizních symbióz využity. Vzhledem k nutnosti přípravit orchideje s omezeným rozvojem mykorhizy je však nezbytné možnou efektivitu těchto postupů otestovat, což se stalo cílem mé diplomové práce. V experimentu testujícím sekvenční aplikaci fungicidů jsem prokázala vyšší citlivost karb c1 res kmene izolátu 2006/7 oproti wt při jejich kultivaci na PDA s prop c 1/100 (obr. 7). Lze tedy konstatovat, že sekvenční aplikace těchto fungicidů, za předpokladu aplikace dostatečné dávky prop, může být efektivní cestou k potlačení OM. V experimentech testujících simultánní (směsnou) aplikaci karb a prop v koncentracích c1/100 a
c1/1000 byl prokázán jejich synergistický efekt pouze při použití v koncentraci c1/100
u izolátu 2006/7, kdy ve variantě K+P+ byl růst této houby zcela eliminován, zatímco na variantách K+P– a K–P+ byl růst mycelia pozorován. Ve všech ostatních případech nebyl synergismus fungicidů pozorován. Tento výsledek není neočekávaný, neboť pro minimalizaci 41
DISKUSE vzniku rezistentních kmenů je pro single-site fungicidy se středním až vysokým rizikem vzniku rezistence, což je jak karb, tak prop doporučováno používat ne méně než 50% dávku doporučovanou pro solo produkty. Vzhledem k tomu, že prop v koncentraci c1/1000 nebyl v redukci růstu izolátů 2006/7 a 2007/4 nikdy účinný a rovněž jeho účinnost v koncentraci c1/100 nebyla vysoká (Šteslová 2010), byla zvolena koncentrace prop příliš nízká. Z výsledků mé práce vyplývá, že simultánní i sekvenční aplikace fungicidů jsou vhodnými strategiemi přípravy orchidejí s omezeným rozvojem mykorhizy, které je třeba dále intenzivně studovat v systémech in vitro i ex vitro. Pozornost je třeba i nadále věnovat testování dalších jednotlivých fungicidních látek, které by byly schopny omezit růst OM hub. Například iprodion, který jsem využila ve své bakalářské práci a který patřil v c1 koncentraci mezi účinné fungicidy, byl v mezidobí stažen z trhu EU a není již dále běžně jako komerční fungicid dostupný. Naopak s vývojem nových fungicidních preparátů je možné, že se mezi nimi objeví i látky vysoce účinné proti OM houbám.
42
CITOVANÁ LITERATURA
5 Citovaná literatura Alexander C., Alexander I. J., Hadley G. 1984. Phosphate uptake by Goodeyra repens in relation to mycorrhizal infection. New Phytologist 97: 401–411. Alexander C., Hadley G. 1984. The effect of mycorrhizal infection of Goodyera repens and its control by fungicide. New Phytologist 97: 391–400. Alexander C., Hadley G. 1985. Carbon movement between host and mycorrhizal endophyte during the development of the orchid Goodyera repens Br. New Phytologist 101: 657–665. Anonymous. 2009. Mode of action of fungicides.FRAC classification on mode of action 2009. www.frac.info, accessed on May 10, 2010. Anonymous. 2010. FRAC recommendations for fungicide mixtures designed to delay resistance evoluion. www.frac.info, accessed on January 2010. Arditti J., Ernst R., Yam T.W., Glabe C. 1990. The contributions of orchid mycorrhizal fungi to seed germination. Lindleyana 5: 249–255. Arditti J., Ghani A. K. A. 2000. Numerical and physical properties of orchid seeds andtheir biological implications. New Phytologist 145:367-421. Balážová K. 2009. Využití fungicidů ke studiu orchideoidní mykorhizy. Disertační práce. PřF MU, Brno. Bayman P., Gonzáles E.J., Fumero J.J., Tremblay R.L. 2002. Are fungi necessary? How fungicides affect growth and survival of the orchid Lepanthes rupestris in the field. Journal of Ecology 90: 1002–1008. Bernard N. 1909. L’evolution dans la symbiose. Les orchidées et leur champignons commenseux. Annales des Sciences Naturelles; Botanique. Paris 9: 1–196. Brent K. J., Hollomon D.W. 2007. Fungicide resistance: The assessment of risk. Fungicide Resistance Action Committee, www.frac.info Burgef H. 1932. Saprophytismus und Symbiose. Studien an tropischen Orchideen. Jena, Gustav Fisher, 249 pp. Burgef H. 1936. Samenkeimung der Orchideen und Entwicklung ihrer Keimpflanzen. Jena, Gustav Fischer, 312 pp. Burges A. 1939. The defensive mechanism in orchid mycorrhiza. New Phytologist 38: 273283 Cribb P.J., Lell S.P., Dixon K.W., Barrett R.L. 2003. Orchid conservation:a global perspective. Natural History Publications (borneo): Kora Kinabala, Sabah.
43
CITOVANÁ LITERATURA Currah R.S., Zelmer C.D., Hambleton S., Richardson K.A. 1997. Fungi from orchid mycorrhizas. In: Arditti J, Pridgeon AM, eds. Orchid biology: reviews and perspectives, VII. London: Kluwer, 117–170. Čuříková M., Látr A., Vosátka M. 2009. Growth and viability of mycorrhizal extraradical mycelia associated with three temperate orchid species. Biologia (Sect. Bot.) 64: 63–68. Downie D. G. 1957. Corticium solani – an orchid endophyte. Nature 179: 160. Gryndler M., Baláž M., Hršelová H., Jansa J., Vosátka M. 2004. Mykorhizní symbióza. O soužití hub s kořeny rostlin. Academia, Praha, 366 pp. Hadley G. 1966. Cellulose as a carbon source for orchid mycorrhiza. New Phytologist 68: 933-939 Hadley G., Johnson R. P. C., John D. A. 1971. Fine structure of the host-fungus interface in orchid mycorrhiza. Planta 100. 191-199 Hadley G., Perombelon M. 1963. Production of pectic enzymes by Rhizoctonia solani and orchid endophytes. Nature 200: 1337 Hadley G., Williamson B. 1972. Features of mycorrhizal infection in some Malayan orchids. New Phytologist 71: 1111-1118 Harvais G., Hadley G. 1967. The development of Orchis purpurella in asymbiotic and inoculated cultures. New Phytologist 66: 217–230. Hudák J., Lux A., Masarovičová E. 1997. Plastid ultrastructure and carbbon metabolism of the saprophytic species Neottia nidus-avis. Photosynthetica 33: 587-594 Huľuková Z. 2009. Dlhodobé pôsobenie fungicídov na rozvoj orchideoidnej mykorízy. Bakalářská práce. PřF MU, Brno. Hutson D., Miyamoto J. 1998. Fungicidal activity. Chemical and biological approaches to plant protection. John Wiley & Sons, Chichester, England, 254 pp. Kahiluoto H., Vesteberg M. 2000. Creation of a non-mycorrhizal control for bioassay of AM effectiveness. 2. Benomyl application and soil sampling time. Mycorrhiza 9: 259– 270. Kyjovská Z. 2007. Role mykorhizní symbiózy v minerální výživě a kompetičních vztazích temperátních terestrických orchidejí. Diplomová práce. Př MU, Brno. Látalová K., Baláž M. 2010. Carbon nutrition of mature green orchid Serapias strictiflora and its mycorrhizal fungus Epulorhiza sp. Biologia Plantarum 54 (1): 97-104 Leake J. R. 1994. Tansley review No. 69: The biology of myco-heterotrophic (´saprophytic´) plants. New Phytologist 127: 171-216
44
CITOVANÁ LITERATURA Marchisio V. P., Berta G., FontanaV., Marzetti M. F. 1985. Endophytes of wild orchids native to Italy: their morphology, caryology, ultrastructure and cytochemical characterization. New Phytologist 100:623–641. Matsuo T., Yamamoto Y., Muraguchi H., Kamada T. 1999. Effects of amino-acod substitutions in β tubulin on benomyl sensitivity and microtubule functions in Coprinus cinereus. Mycoscience 40: 241–249. McKendrick S. L., Leake J. R., Read D. J. 2000. Symbiotic germination and development of myco–heterotrophic plants in nature: transfer of carbon from ectomycorrhizal Salix repens and Betula pendula to the orchid Corallorhiza trifida through shared hyphal connections. New Phytologist 145: 539–548. Menge JA. 1982. Effects of soil fumigants and fungicides on vesicular-arbuscular fungi. Phytopathology 72: 1125–1132. Nene YL, Thapliyal PN. 1993. Fungicides in plant disease control. (Third edition). International Science Publisher, New York, 691 pp. Newsham KK, Fitter AH, Watkinson AR. 1994. Root pathogenic and arbuscular mycorrhizal fungi determine fecundity of asymptomatic plants in the field. Journal of Ecology 82: 805–814. Nieuwdorp P.J. 1972. Some observations with light ad electron microscope on the endotropic mycorrhiza of orchids. Acta Botanica Neerlandica 21: 128–144. Peterson R. L., Farquahar M. L. 1994. Mycorrhizas – Integrated development between roots and fungi. Mycologia 86: 311-326 Peterson R. L., Uetake Y., Zelmer C. 1998. Fungal symbioses with orchid protocorms. Symbiosis 25: 29–55. Phillips JM, Hayman DS. 1970. Improved procedures for clearing roots and staining parasitic and vesicular-arbuscular mycorrhizal fungi for rapid assessment of infection. Transactions of the British Mycological Society 55: 158–161. Průša D. 2005. Orchideje České republiky. Nakladatelství Computer Preses, a.s. Edice Příroda Purves S. Hadley G. 1975. Movement of carbon compounds between the partners in orchid mycorrhiza. Endomycorrhizas, Academic Press, London, pp. 175-194. Rasmussen H. 2002. Recent developments i the study of orchid mycorrhiza. Plant and Soil 244: 149-163
45
CITOVANÁ LITERATURA Shimura H, Koda Y. 2005. Enhanced symbiotic seed germination of Cypripedium macranthos var. rebunense following inoculation after cold treatment. Physiologia Plantarum 123: 281–287. Smith S. E. 1966. Physiology and ecology of orchid mycorrhizal fungi with reference to seedling nutrition. New Phytologist 65: 488-499 Smith S. E., Douglas A. E. 1987. The Biology of Symbiosis: Contemporary Biology Series. Edward Arnold Ltd. London Smith S. E., Read D. J. 1997. Mycorrhizal symbiosis, 2nd ed. London: Academic Press. Smith S. E., Read D. J. 2008. Mycorrhizal symbiosis, 3rd ed. London: Academic Press, 787 pp. Šteslová M. 2010. Vliv vybraných fungicidů na rozvoj orchideoidní mykorhizy. Bakalářská práce. PřF MU, Brno. Taylor D. L , Bruns T. D., Hodges S. A. 2004. Evidence for mycorrhizal races in a cheating orchid. The Royal Society 271: 35–43. Trojanová L. 2008. Fungicidy jako prostředek k získání orchidejí s potlačenou mykorhizou. Diplomová práce. PřF MU, Brno. Vallius E. 2001. Factors affecting fruit and seed production in Dactylorhiza maculata (Orchidaceae). Botanical Journal of the Linnean Society 135: 89–95. Warcup J. H. 1988. Mycorhizal associations of isolates of Sebacina vermifera. New Phytologist 110: 227-231. Warcup J. H., Talbot P. H. B. 1967. Perfect states of Rhizoctonias associated with orchids. New Phytologist. 66:631–641. West H. M., Fitter A. H., Watkinson A. R. 1993a. The influence of three biocides on the fungal associates of the roots of Vulpia ciliata ssp. ambigua under natural conditions Journal of Ecology 81: 345–350. West H. M., Fitter A. H., Watkinson A. R. 1993b. Response of Vulpia ciliata ssp. ambigua to removal of mycorrhizal infection and to phosphate application under natural conditions. Journal of Ecology 81: 351–358. Wotavová K., Balounová Z., Kindlmann P. 2003. Factors affecting persistence of terrestrial orchids in wet meadows and implications for their conservation in a changing agricultural landscape. Biological Conservation 118: 271–279. www.agromanual.cz
46
