MASARYKOVA UNIVERZITA Přírodovědecká fakulta Biochemický ústav
Jana HLOŽKOVÁ SLOŽENÍ, NEMOCI A ANALÝZA VÍNA, LITERÁRNÍ REŠERŠE
Bakalářská práce
Vedoucí práce: Mgr. Jiří Žeravík, PhD. ___________________________________________________________________________ Brno 2008
Jméno a příjmení autora:
Jana Hložková
Název bakalářské práce:
Složení, nemoci a analýza vína, literární rešerše
Název v angličtině:
Analysis of wine
Studijní obor (směr):
Biochemie
Vedoucí bakalářské práce:
Mgr. Jiří Žeravík, PhD.
Rok obhajoby:
2008 Anotace v češtině
Tato bakalářská práce se zaměřuje na problematiku analýzy vína. První část se věnuje složení vína. V další části jsou rozebrány nejčastější nemoci a vady vína, které ovlivňují jeho výslednou kvalitu. Největší část je věnována metodám analýzy vína. Ke kontrole procesu výroby vína a jeho kvality se využívá stanovení alkoholů, sacharidů, kyselin, sirných a polyfenolických sloučenin. Analýza těchto látek se provádí analytickými metodami. Tyto metody jsou však drahé a časově náročné. Nové metody analýzy s využitím biosensorů by stanovení značně urychlily. Při opakovaném použití biosensoru by se snížila i cena samotné analýzy. Anotace v angličtině This bachelor thesis is focused on problems of wine analysis. The first part pays attention to wine structure. The next part breaks down the most common wine diseases and wine defects which influence its final quality. The biggest part of this work is contributed to methods of wine analyzing. To check the process of wine production and its quality we use alcohol, sugar, acid, sulphur and polyfenolic compound specifications. The analysis of these substances is done by analytic methods.
But these methods are expensive and time
consuming. New methods of analysis with the use of biosensors would speed up the whole specification. Also the price of the analysis would decrease by repetitive use of biosensors.
Klíčová slova v češtině: Víno, biosensor, analýza vína, složení vína, nemoci vína
Klíčová slova v angličtině: Wine, biosensor, analysis of wine, composition of wine, wine diseases
2
Prohlášení Prohlašuji tímto, že jsem zadanou bakalářskou práci vypracovala samostatně pod vedením Mgr. Jiřího Žeravíka, PhD. a uvedla v seznamu literatury veškerou použitou literaturu a další zdroje.
V Brně dne
_________________________________ podpis
3
Poděkování Chtěla bych poděkovat Mgr. Jiřímu Žeravíkovi, PhD. za odborné vedení a cenné rady, které mi poskytl při zpracování této bakalářské práce.
4
Obsah:
1. Úvod……………………………………………………………………………………...7 1.1. Historie výroby vína…………………………………………………………………7 1.2. Význam v lidské výživě……………………………………………………………..9 1.2.1. Francouzský paradox………………………………………………………...9 2. Složení vína……………………………………………………………………………..11 2.1. Anorganické látky………………………………………………………………….11 2.2. Jednoduché organické látky………………………………………………………..11 2.3. Vysokomolekulární látky…………………………………………………………..14 2.4. Výskyt mikroorganismů ve víně…………………………………………………...15 3. Fermentační a jiné procesy ve víně……………………………………………………..17 3.1. Octovatění………………………………………………………………………….17 3.2. Sirka………………………………………………………………………………..17 3.3. Jablečno-mléčné kvašení…………………………………………………………..18 3.4. Význam oxidu siřičitého…………………………………………………………...19 4. Analýza složení vína……………………………………………………………………20 4.1. Senzorické testování……………………………………………………………….20 4.2. Tradiční metody analýzy…………………………………………………………..20 4.2.1. Zjišťování cukernatosti a obsahu kyselin…………………………………..20 4.2.2. Stanovení titrovatelných kyselin……………………………………………20 4.3. Doporučené metody analýzy………………………………………………………21 4.4. NMR (nukleární magnetická rezonance)…………………………………………..22 4.5. Nové metody stanovení s využitím biosensorů……………………………………22 4.5.1. Biosensory………………………………………………………………….22 4.5.2. Imobilizace biomolekul…………………………………………………….25 4.5.3. Použití biosenosrů v praxi…………………………………………………..27 4.5.4. Stanovení ethanolu………………………………………………………….28 4.5.5. Stanovení methanolu……………………………………………………….32 4.5.6. Stanovení glycerolu………………………………………………………...32 4.5.7. Stanovení glukózy………………………………………………………….34 4.5.8. Stanovení fruktózy………………………………………………………….35 4.5.9. Stanovení sacharózy………………………………………………………...36 4.5.10. Stanovení polyfenolů……………………………………………………...37 4.5.11. Stanovení kyseliny mléčné………………………………………………..38 5
4.5.12. Stanovení kyseliny jablečné………………………………………………39 4.5.13. Stanovení kyseliny octové………………………………………………...40 4.5.14. Stanovení sloučenin síry…………………………………………………..40 4.6. Hodnocení použití biosensorů, bioelektronický jazyk……………………………..41 5. Závěr……………………………………………………………………………………42 6. Zkratky………………………………………………………………………………….43 7. Použitá literatura a citace……………………………………………………………….45
6
Víno povzbuzuje ducha, rozněcuje srdce, zbavuje neklidu, vyvolává veselí. Chudý se pokládá za bohatého, černé chmury a starosti se rozplývají, i čelo se vyjasňuje. Ovidius
1.ÚVOD Víno je alkoholický nápoj vznikající kvašením moštu z hroznů vinné révy. Z vína se stává velmi oblíbený nápoj, jehož kvalita za poslední století značně vzrostla. Je to způsobeno především použitím nových výrobních technologií, kterými dnes vinaři víno vyrábí. Pro hodnocení kvality vína se v současnosti používají analytické metody, jako např. chromatografie (GC, HPLC). Provedení takové analýzy si žádá finančně nákladné vybavení, kvalifikovaný personál a je poměrně hodně časově náročné. Navíc nelze stanovit více látek v jedné analýze najednou. Alternativou k těmto metodám je analýza pomocí biosensorů. Jejich výhodou je krátká doba analýzy, vysoká citlivost a především plná automatizace. Komplexní analýzy by bylo možné docílit použitím multikanálového biosensoru, tzv. bioelektronického jazyka. Jeho konstrukce je však prozatím předmětem studií.
1.1. Historie výroby vína Původ vína není příliš jasný. Pravděpodobně vinná réva vznikla z divokých forem na Blízkém východě. Podle některých zdrojů vznikla v oblasti okolo Kaspického moře. Odtud se dále šířila do Malé Asie, Íránu, Afghánistánu až do Číny a Indie. Postupně se rozšířila do severní Afriky, na Balkán a nakonec i do západní a střední Evropy. Egypt Staří Egypťané znali víno již 3200 let před naším letopočtem. Egypťané uchovávali víno v amforách, džbánech z pálené hlíny, které byly popsány ročníkem sklizně a jménem vedoucího vinice, odkud víno pocházelo. Amfory měly malý otvor, ze kterého unikal oxid uhličitý, vzniklý kvašením sladké šťávy. Jakmile byl proces kvašení ukončen, víno bylo přečištěno a přelito do jiného džbánu. Otvor byl uzavřen zátkou a zapečetěn. Podle
7
nástěnných maleb v Luxoru, pěstovali především odrůdu vinné révy zvanou Chrupka. Tato odrůda se dodnes v deltě Nilu pěstuje. Řecko Další oblastí, kde se hojně vyrábělo víno, bylo starověké Řecko. Hrozny se drtily v kamenném lisu, který měl nakloněné dno, aby šťáva z hroznů mohla lépe odtékat. Do vína byla přidávána pryskyřice, aby zůstalo mladé víno zdravé. Někdy přidávali i vonné látky jako med, mateřídoušku nebo skořici. Víno skladovali ve vacích z kůží domácích zvířat. Řím Do severní a střední Itálie byla vinná réva rozšířena Etrusky již v 11. století př.n.l., tedy ještě v době před založením Říma. Ve starém Římě vzniklo i mnoho knih o víně. Z těch, co se dochovaly, se dozvídáme jejich metody postupu výroby vína. Sladkou šťávou naplnili nádoby o objemu asi 600 l, kde probíhalo samotné kvašení. Tyto nádoby byly z pálené hlíny a měly tvar tykve. Po ukončení kvašení víno přelili do jiných nádob. V těchto nádobách se víno čistilo vaječným bílkem, kozím mlékem, ale i sádrou nebo dokonce křídou. Aby mladé víno udrželi co nejdéle, přidávali do něj kadidlo, pryskyřici, drcený mramor nebo jíl. Kvalitními víny plnili amfory, vytřené nerozpustným nátěrem. Neplné nádoby zalévali olejem, který bránil oxidaci nebo octovatění vína (Pátek, 1998). České země Počátky pěstování vinné révy u nás jsou datovány od 3. st.n.l., kdy ji k nám donesli římští legionáři. Ve 13. stol. dochází k rozvoji vinic a vinařství. Významnou roli hrály kláštery, které zakládaly souvislé celky vinic. Víno se stalo velmi oblíbeným nápojem a výroba vína se stala výnosným obchodem. V 16. a 17. stol. zakládají novokřtěnci vinice s jakostnějšími odrůdami a přináší nové metody pěstování vinné révy a výroby vína. Kvůli zvýšené produkci vína se staví nové vinné sklepy s velkoobjemovými sudy pro zrání vína, čímž se zlepšuje kvalita vína a vzrůstá jeho cena. Ve velkých sudech vína zrají pomaleji. Při delší době ležení vína dosahují dokonalejší harmonie. Vína se ponechávají delší dobu na kvasnicích, aby se odbourala kyselina jablečná a dosáhlo se tím příjemné harmonie všech jakostních složek. Koncem 17. stol. převažuje výroba dražších kvalitnějších vín a vysazují se kvalitnější odrůdy. Konec 18. stol. naopak znamená úpadek vinařství. O víno přestává být zájem, kvůli stoupající oblibě piva a kořalky. Další pohromou jsou pak začátkem 19. stol. houbové choroby, jako oidium, padlí révové, ale především révokaz. Po 2. světové válce
8
dochází k postupné obnově vinic, mechanizaci a změnám ve výrobě vína. Jde především o využití chemických postřiků révy a síření vína (Kraus et al., 1999).
1.2. Význam vína v lidské výživě Stále jsou předkládané důkazy o pozitivním i negativním vlivu konzumace vína na lidské zdraví. Už ze složení vína můžeme odhadovat jeho příznivý vliv na lidský organismus. Hlavní předností vína je voda, které obsahuje nejvíce (80-90%). Dalšími látkami obsaženými ve víně jsou pak alkoholy 8-15 %, cukry 0,2 – 5%, kyseliny 0,4 – 1,2%, glycerol 0,6 – 1%, minerální látky 0,1 – 0,4%, bílkoviny, polyfenoly (např. resveratrol), aromatické látky a vitamíny. Některé látky obsažené ve víně mají antioxidační účinky. Tyto látky zabraňují tvorbě usazenin v kardiovaskulárním systému člověka.
1.2.1. Francouzský paradox Jako první ho popsal irský lékař Samuel Black již v roce 1819. Snažil se tím vysvětlit skutečnost, že Francouzi trpí nižším výskytem akutních srdečních příhod, než Američané, přestože je jejich jídelníček bohatý na nasycené tuky. Podle údajů Heart foundation počty úmrtí v důsledku infarktu mezi muži ve věku 35-74 let byly 230 na 100 000 obyvatel v USA, zatímco ve Francii to bylo pouze 83 na 100 000 obyvatel. Bylo to vysvětleno tím, že Francouzi pijí dlouhodobě menší množství červeného vína. Červené víno obsahuje velké množství polyfenolů, které v těle vychytávají volné radikály. To jsou vysoce reaktivní formy kyslíku, které mohou poškozovat cévy a přispívají k infarktu. Další účinnou látkou, kterou červené víno obsahuje je resveratrol. Resveratrol spolu s dalšími látkami obsaženými v hroznovém víně měl pozitivní výsledky v boji proti srdečním chorobám, rakovině a jiným onemocněním. Uvádí se, že léčivé účinky má pouze víno červené. Pravdou je, že i bílé hrozny mají příznivé účinky na lidské zdraví. Většina těchto látek je však obsažena jen ve slupkách z hroznů a pouze červené víno se kvasí se slupkami (Wikipedia). Objevily se také studie, které připisují snížené riziko infarktu samotnému alkoholu požívaného v malých dávkách. Byly prokázány příznivé účinky nejen u vína, ale i u piva, whisky, vodky a jiných alkoholických nápojů. Studie tvrdí, že pití malého množství alkoholu snižuje riziko aterosklerózy o 30-80 %. Malou dávkou je myšleno 20-40 g alkoholu u mužů a 20-30 g u žen denně. Zjistilo se, že alkohol zlepšuje profil krevních lipidů, zvyšuje hladinu HDL (lipoproteiny s vysokou hustotou) cholesterolu a snižuje LDL (lipoproteiny s nízkou hustotou), dále snižuje výskyt trombózy, snižuje krevní tlak, redukuje hladinu krevního 9
inzulínu a zvyšuje proudění krve ve věnčitých tepnách. Rovněž je známo, že pití alkoholu snižuje aktivitu sympatického nervového systému a tepovou frekvenci, což také snižuje riziko úmrtí. Přesto příčiny francouzského paradoxu jsou z lékařského hlediska stále nejasné a výzkum pokračuje. Můžeme tedy říct, že víno je v malých dávkách zdravé a lékaři ho doporučují. Jeho zdravost je ohrožena používáním chemických látek pro postřik hroznů a při výrobě vína. Proto mnoho lidí přechází na vína ekologické produkce, tzv. biovína, nebo na vína s přívlastkem, při jejichž výrobě je ze zákona zakázáno používání chemických látek kromě oxidu siřičitého.
10
2. SLOŽENÍ VÍNA 2.1. Anorganické látky Víno obsahuje 85-90% vody. Veškerá voda je biologického původu, prošla kořenovým a cévním systémem rostliny. Žádná voda se do vína již nepřidává. Minerální látky obsažené ve víně jsou draslík, vápník, hořčík, sodík, železo, sulfáty, fosfáty a další. Do rostliny se dostávají ve formě roztoků kořenovým systémem z půdy. V červených vínech nacházíme vyšší množství minerálních látek než ve vínech bílých. To je způsobeno rozdílnou výrobou obou vín. Minerální látky jsou důležité pro růst a činnost kvasinek. Největší zastoupení v popelu vína má draslík, dosahuje až 50%. S kyselinou vinnou tvoří vinany, které snižují kyselost vína a u starších vín se sráží za vzniku vinného kamene (Kuttelvašer, 2003).
2.2. Jednoduché organické látky Alkoholy Etanol vzniká při kvašení enzymatickým rozkladem sacharidů (glukózy). Víno obsahuje 1013 obj.% alkoholu. Pokud je obsah ethanolu nižší, vína jsou náchylná k octovatění. Metanol je obsažen pouze v malém množství. Vzniká rozkladem pektinových látek a celulózy. Glycerol je zastoupen pouze v malém množství. Při kvašení vysoce cukernatých moštů je jeho obsah vyšší. Zvýšeného množství glycerolu dosáhneme také při kvašení moštů z hroznů napadených ušlechtilou plísní Botrytis cinerea. Zpříjemňuje chuť vína a dodává mu plnost. Butanol a amylalkohol se vytváří se při autolýze kvasinek z aminokyselin. Zhoršují jakost vína svou hořkou chutí.
Aldehydy Ovlivňují tvorbu chuti a vůni u mladých i vyzrálých vín. Nejvýznamnější je acetaldehyd, který se tvoří při alkoholovém kvašení z pyruvátu. Jeho redukcí vodíkem vzniká ethanol. Váže se na kyselinu siřičitou přičemž vzniká kyselina acetaldehydsiřičitá. Při zrání se znovu rozkládá, až dokud mezi nimi nenastane rovnováha. Dále se také tvoří při kontaktu vína s kyslíkem, což způsobuje jeho zvětralou chuť.
11
Estery Estery nižších mastných kyselin jsou příjemně vonící kapaliny. Jsou součástí aromatických látek ve víně. Množství je závislé na kmeni kvasinek a při zrání se zvyšuje. Esterifikační procesy můžeme podpořit zvýšenou teplotou. Významnými estery ve víně jsou estery kyseliny octové, terpenových alkoholů, geraniolu nebo terpenolu.
Aromatické látky Jsou obsaženy především ve slupkách hroznů ve formě prekurzorů. Jsou směsí aromatických a alifatických alkoholů, jejich esterů s kyselinami, aldehydů a heterocyklických sloučenin. Množství a poměr jednotlivých aromatických i chuťových látek závisí na odrůdě vína. Jejich intenzita vzrůstá s vyzrálostí hroznů. Při přezrávání některých odrůd se po dosažení nejvyšší koncentrace množství aromatických látek snižuje. Primární aromatické látky se kvašením, zráním a stárnutím vína mění v sekundární. Jejich charakter se mění i v souvislosti s činností ušlechtilé plísně Botrytis cinerea v pozitivním smyslu nebo při napadení jinými plísněmi nebo bakteriemi ve smyslu negativním.
Barevné látky Víno obsahuje tyto barevné látky: antokyany, chlorofyly, flavonové látky, karoteny, xantofyly a také kvercetin a kvercitrin. Nejvíce barevných látek je obsaženo ve slupce hroznů, z nichž se dostávají do vína. Slupky zralých až přezrálých hroznů obsahují barevné částice, které mohou ovlivnit barvu vína, pokud zůstanou déle ve styku s moštem při lisování matoliny. Tyto částice jsou považovány za produkty degradace chlorofylu. Spolu s polyfenoly ovlivňují redoxní reakce ve víně.
Červená barviva Antokyany jsou glykosidy, které se skládají z aglykonu a glukózy. Aglykon je obsažený ve slupce a až po spojení s glukózou vytváří barvivo. Antokyany jsou zbarveny v rozmezí modré-fialové-červené. Barva závisí na pH, příslušném aglykonu a také na přítomnosti iontů kovů, se kterými vytváří komplex. Antokyanidin, oenidin a oenin jsou hlavními antokyanovými barvivy ve víně. Antokyany se ve víně vyskytují také ve formě bezbarvých sloučenin – leukoantokyanů. Větší množství těchto látek nalezneme především v pecičkách bobulí. Odtud přechází do kvasícího moštu při kvašení červených rmutů. Červené barvivo uložené ve slupce bobulí se vytváří spojením účinku světla s tvorbou tříslovin. Tvorbu antokyanů nepříznivě ovlivňuje přebytek přijatého dusíku, nedostatek vody a slunečního svitu. 12
Žlutá barviva Žlutá barviva obsažená ve víně představují především produkty degradace chlorofylu, karoten a xantofyl, dále pak kvercetin a kvercitrin. Chlorofyl se nachází v zelených částech rostliny. Je směsí chlorofylu a, který je modrozelený, a chlorofylu b, který je zelenožlutý. Ve zralých hroznech jsou přítomny jen jeho rozkladné produkty. Kvercetin a kvercitrin najdeme také v červených vínech. Způsobují hnědé zabarvení již starších červených vín. Jsou obsaženy v pecičkách, slupkách bobulí i v třapinách.
Sacharidy Proces vzniku sacharidů je ovlivněn slunečním zářením a složitým enzymatickým systémem. Většina sacharidů se znovu odbourá při dýchání za vzniku jiných látek např.: kyseliny glykolové, vinné, manitolu, sorbitolu. V prvních fázích zrání se vytváří více glukózy než fruktózy, postupem zrání se však jejich poměr vyrovnává. Glukóza je hlavním substrátem pro kvasineky rodu Saccharomyces při alkoholovém kvašení. Teprve po jejím vyčerpání se dalším substrátem stává fruktóza. Ostatní sacharidy jsou zastoupeny méně nebo jen ve stopových množstvích. Jsou to sacharóza, ribóza, xylóza, galaktóza, stachióza, rhamnóza, arabinóza, maltóza a další.
Kyseliny Na obsah kyselin v hroznech má zásadní vliv počasí. Při nižší teplotě, oblačném počasí a dostatku vody v půdě se vytváří více kyselin než sacharidů. Ve víně jsou přítomné především kyseliny vinná a jablečná. Tvoří se v počátcích vývoje bobulí a během zrání se jejich obsah snižuje v důsledku snížené tvorby a rozkladem v dýchacích procesech. Při vyšších teplotách dochází především k metabolizaci kyseliny jablečné. To znamená, že kyselina vinná bude zastoupena ve vyšší koncentraci. Při nižších teplotách bude převažovat kyselina jablečná. Proto vína z jižních oblastí obsahují méně kyseliny jablečné než vína z oblastí severních. Při školení a zrání vína bakterie mléčného kvašení metabolizují kyselinu jablečnou na kyselinu mléčnou. Dále jsou zde přítomny kyseliny citronová, jantarová a malonová. Ty jsou přítomny v menších množstvích než předchozí dvě, ale mají význam pro tvorbu aromatických a chuťových látek. Kyseliny ve víně vznikají také mikrobiální činností. Jde hlavně o kyseliny mléčnou, octovou a máselnou. Kyselina vinná vytváří s draslíkem a vápníkem málo rozpustné soli, jejichž rozpustnost se dále snižuje přítomností alkoholu a sníženou teplotou. Při vyšším obsahu draslíku ve víně vytváří přesycené roztoky, z nichž se může vysrážet vinný kámen. K jeho 13
vysrážení může dojít i po delší době, při náhlých změnách teplot nebo nešetrným zacházením s lahvemi.
Pektiny Vznikají rozkladem protopektinu, který se vytváří při asimilaci v bobulích. Pektiny jsou hydrofilní koloidy, které se dále enzymaticky štěpí až na kyselinu pektinovou. Nedozralé bobule mají vyšší obsah pektinu, který ve vylisovaných moštech vytváří koloidní roztoky. Ty ztěžují usazování pevných částeček moštu. K jejich vyčiření se používají enzymatické preparáty, které pektin rozkládají a vzniklé látky poté z moštu vypadnou. Zbylý pektin se rozkládá při kvašení.
Vitamíny Víno obsahuje hlavně vitaminy skupiny B a vitamin P, který vyztužuje buněčnou stěnu krevních destiček a zmenšuje riziko krvácení a edému (Kuttelvašer, 2003).
2.3. Vysokomolekulární látky Dusíkaté látky V moštu převažují ve formě proteinů. Při kvašení slouží jako potrava pro kvasinky, takže se jejich množství snižuje. Na konci kvašení se jejich obsah zase zvyšuje díky autolýze odumřelých kvasinek. Dalšími dusíkatými látkami, jejichž obsah se zvyšuje hlavně díky autolýze odumřelých kvasinek ke konci kvašení, jsou aminokyseliny. Arginin, fenylalanin a tyrosin se pozitivně podílí na tvorbě aromatických a chuťových látek. Aminokyseliny methionin, threoinin a leucin přispívají negativně. Aminokyseliny jsou také výživou pro kvasinky a bakterie mléčného kvašení.
Polyfenoly V hroznech jsou zastoupeny fenolovými kyselinami (kys. protokatechová, gallová, digalová), flavony a flavonoly, antokyany (viz. barevné látky) a tříslovinami. Flavonoly jsou obsaženy v bílých i červených odrůdách vín. Jejich barva je většinou žlutá a žlutozelená. Flavon-3-oly patří mezi katechiny. Vyskytují se jako polymerované třísloviny.
14
Třísloviny Jsou deriváty fenolů, katechinů a taninů, které tvoří koloidní roztoky. Patří mezi polyfenolické látky. Jako oenotaniny nazýváme třísloviny obsažené ve víně. Jejich podstatou jsou vazby mezi kyselinou digalovou a glukózou. Jsou obsaženy ve slupkách, pecičkách a třapinách hroznů. Nejvyšší obsah tříslovin je začátkem zrání hroznů. Dalším zráním se jejich obsah v hroznu snižuje. Do moštu se dostávají kvašením rmutů nebo ve zbytcích třapin na nezralých hroznech. Jsou vyžadovány v červených vínech, naopak v bílých vínech jsou spíše nežádoucí. Snížení jejich tvorby způsobuje přebytek přijatého dusíku a nedostatek železa. Třísloviny se do vína mohou dostat také vyluhováním z dubových sudů, ve kterých se víno skladuje. Flobafeny jsou kondenzované produkty tříslovin, vznikající enzymatickou oxidací katechinů. Mohou značně poškodit jakost vína. Jejich činností dochází k hnědnutí moštů i výlisků. Způsobují hořkou chuť vína (Kuttelvašer, 2003).
2.4. Výskyt mikroorganismů ve víně Kvasinky Převažují Saccharomyces vini (starší název: Saccharomyces cerevisiae) - důležitá je jejich odolnost vůči vyššímu obsahu alkoholu, cukrů, oxidu siřičitého, vhodnost pro výrobu sektů atd. Některé kmeny mohou tvořit kožovitý povlak na hladině vína tzv. mázdru – zamezuje průniku kyslíku do kvasu, tím podporuje anaerobní procesy, při kterých vzniká alkohol. Při aerobních procesech vznikají nežádoucí produkty, které znehodnocují víno. Kvasinky rodu Saccharomyces oviformis jsou rovněž obsaženy v kvasícím moštu spolu s vinnými kvasinkami. Jsou důležité hlavně pro dokvášení moštů, díky své odolnosti vůči vyšším obsahům alkoholu a cukrů. Mimo jiné, fermentačních procesů se účastní i tzv. divoké kvasinky např. Kloeckera apiculata, které jsou nejvíce zastoupeny v moštu na začátku kvašení. Jejich rozmnožovací schopnost je v této fázi kvašení nejvyšší. Při zvyšování obsahu alkoholu jejich počet rychle klesá. Pro potlačení činnosti těchto kvasinek stačí malé množství oxidu siřičitého (30-50 mg/l). Do této skupiny patří i následující kvasinky: Saccharomyces marxianus Hansen, Saccharomyces acidifaciens, Hansenula anomala apod.
15
Bakterie Ve víně se objevují pouze bakterie mléčného a octového kvašení. Na jiné nepříznivě působí nízké pH a obsah alkoholu, proto je ve víně nenajdeme. Bakterie způsobují celou řadu nemocí vína – octovatění, křísovatění, hořknutí červených vín, vláčkovatění atd. Mezi bakterie octového kvašení zařazujeme: Bacterium xylinum, Bacterium orleanse, Acetobacter pasterianum, Acetobacter ascedens. Bakterie mléčného kvašení patří: Bacterium gracile, Micrococcus malolacticus, Micrococcus acidovorax, Micrococcus vini, Bacterium mannitopoeum a Bacterium tartarophtorum (Kuttelvašer, 2003).
16
3. FERMENTAČNÍ A JINÉ PROCESY VE VÍNĚ 3.1. Octovatění Původcem octovatění vína jsou bakterie octového kvašení, které jsou zodpovědné za vyšší obsah těkavých kyselin, jako jsou kyselina octová, mravenčí a nižší mastné kyseliny (propionová, máselná). Octovatění vína se projevuje nepříjemným štiplavým zápachem a chutí po octu. Bakterie octového kvašení náleží mezi aerobní bakterie, které mohou žít pouze za přístupu kyslíku. Často napadají mladá vína, která nejsou na hladině chráněna oxidem uhličitým (Pátek, 1998). Pokud je umožněn přístup kyslíku, mají bakterie ideální podmínky pro rozmnožování. Ušlechtilé kvasinky, jako Saccharomyces cerevisiae, tvoří jen malé množství těkavých kyselin, jsou ve víně žádané. Divoké kvasinky, jako např. Apiculatus nebo Brettanomyces produkují mnohem větší množství těkavých kyselin. Zabránit octovatění vína můžeme použitím zdravých hroznů, čistým prostředím ve sklepě. Pomáhá také optimální síření. Oxid siřičitý inhibuje vývoj octových bakterií a divokých kvasinek. Rychlým nakvašením za použití čistých kultur kvasinek potlačíme nežádoucí kvasinky a zamezíme tvorbě těkavých kyselin. Doplňováním úbytku objemu ve skladovacích sudech zabráníme zvýšenému přístupu kyslíku k vínu. Octovatění patří mezi velmi nebezpečné nemoci vína. Není totiž možná náprava. Pouze v lehkých případech může pomoci scelování. Předtím je však nutné víno sterilizovat filtrací, aby se odstranily nežádoucí bakterie a kvasinky (Eder et al., 2006).
3.2. Sirka Mnoho látek obsažených ve víně má ve své struktuře síru. Pokud se tyto látky tvoří ve zvýšené míře, dochází ke změně vůně a chuti. Tato vada se označuje jako sirka. Napadá především mladá vína (Pátek, 1998). Existuje mnoho druhů sirky. Může být způsobena sirovodíkem (H2S) nebo merkaptany. Dále ji rozdělujeme podle fáze výroby vína, ve které se objeví. Může tedy souviset s kvašením, kvasinkami, skladováním apod. Klasickou sirku vyvolává H2S, který je produktem redukce síranu. Nejvíce se tvoří při kvašení během růstu kvasinek. Jeho přítomnost lze detekovat zápachem po zkažených vejcích.
17
Další je tzv. merkaptanová sirka vznikající reakcí H2S s ethanolem (popř. acetaldehydem) za vzniku 1,1-ethandithiolu. Pozná se podle zápachu po cibuli a gumě. Sirku mohou vyvolat také sulfidy a disulfidy. Pokud se během kvašení vytvoří větší množství H2S, zvedne se i koncentrace jiných látek vyvolávajících sirku. Je zde nebezpečí, že pokud se nezjistí jejich přítomnost ve víně, budou hydrolyzovat až několik měsíců po kvašení. Sirka se tedy může objevit až v hotovém víně stočeném do lahve. Příčiny sirky jsou různé a nelze říci, co je tou hlavní příčinou. Jednou z možných příčin mohou být zbytky postřikovacích prostředků obsahujících síru. Další příčinou může být zvýšené množství aminokyselin obsahujících síru. Určitý vliv na tvorbu H2S (a posléze sirky) má také obsah kyselin a hodnota pH moštu. Další příčinou vzniku sirky je ponechání mladého vína na kvasničním kalu. Pokud se víno včas nestočí, může vznikat sirka (chemickými a mikrobiologickými procesy) (Eder et al., 2006). K prevenci výskytu této nemoci je možné provést některé technologické kroky (dodržení koncentrace a ochranné lhůty postřikovacích látek, rychlé odkalení, rychlé stočení atd.), ale není možné úplně zabránit vzniku sirky. Sirku můžeme odstranit provětráním. H2S reaguje se vzdušným kyslíkem za vzniku vody a síry. Provětráním se ale zároveň ztrácí aroma vína. Další možností je síření mladého vína. H2S je oxidován oxidem siřičitým na vodu a síru, která se usadí na dně a je poté odstraněna při přetáčení nebo filtrování vína (Pátek, 1998). Pokud ani jedna z předešlých metod nezabírá, je možné použít síran měďnatý nebo citran měďnatý. Ani tato metoda však není zcela účinná, protože síran měďnatý nereaguje s některými látkami, které vyvolávají sirku (disulfidy, estery kyseliny thiooctové) (Eder et al., 2006).
3.3. Jablečno-mléčné kvašení Víno obsahuje velké množství kyselin, především kyseliny jablečné a vinné, které se spolu s tříslovinami podílí na nepříjemné hrubé chuti, kterou je nutné zakrývat cukrem. Proto je nutné kyseliny částečně odstranit. K tomu se čím dál častěji používá biologické odbourání kyselin (BOK) pomocí mléčných bakterií. Tyto bakterie přeměňují kyselinu jablečnou na kyselinu mléčnou, která je méně kyselá, a na CO2 (Kraus et al., 1999). Kyselina jablečná je však pro bakterie mléčného kvašení až druhým substrátem, hned po spotřebě glukózy. Enzymy podílející se na BOK dále přeměňují kyselinu pyrohroznovou na kyselinu mléčnou a acetaldehyd na ethanol, což má jednoznačně pozitivní vliv na výsledné víno. BOK může 18
produkovat také nežádoucí vedlejší produkty. Přeměňuje fruktózu, kyselinu glukonovou, citrónovou a pyrohroznovou, polyalkoholy a glycerin na kyselinu octovou, acetoin a vyšší alkoholy. Tyto produkty vznikají, pokud dojde k infekci nežádoucími bakteriemi. Na BOK se podílí dva druhy bakterií mléčného kvašení, homofermentativní a heterofermentativní. Homofermentativní bakterie tvoří kyselinu D,L-mléčnou a malé množství kyseliny octové. Některé druhy mohou vytvářet diacetyl, který na víno působí senzoricky negativně. Mezi homofermentativní bakterie patří například Pediococcus damnosus a kmeny druhů Lactobacillus. Heterofermentativní bakterie vytváří větší množství kyseliny octové z glukózy a vedlejší produkty, jako jsou ethanol a acetaldehyd. Mezi tyto bakterie patří Oenococcus oeni, který se pro BOK využívá nejčastěji. Přestože produkuje více kyseliny octové z cukrů, během odbourávání kyseliny jablečné vytváří méně vedlejších produktů (např. diacetyl) snižujících kvalitu vína. Pokud se proces nezastaví, bakterie mléčného kvašení přejdou na jiné substráty, např. na kyselinu vinnou, a tvoří dál kyselinu octovou a sekundární produkty. Pokud je proces zastaven předčasně, hrozí pozdější bakteriální aktivita. Optimální podmínky kultivace těchto bakterií zahrnují hodnotu pH, která by se měla pohybovat okolo 3,3-3,4, teplotu, jenž by měla být okolo 22 ˚C. Kvasniční kal nebo přidané preparáty jsou zdrojem živin. Množství SO2 by se mělo pohybovat na nízké úrovni, kvůli značné citlivosti bakterií mléčného kvašení na SO2 (Eder et al., 2006).
3.4. Význam oxidu siřičitého SO2 se do vín přidává z těchto důvodů: inhibuje působení divokých kvasinek, chrání víno před oxidací tím, že inhibuje enzymy využívající kyslík. Tyto enzymy svými oxidačními procesy snižují kvalitu vína. SO2 se ve víně vyskytuje ve formě volné (SO2) a vázané (HSO3-) kyseliny siřičité. Je to však látka toxická, proto je nutné dodržovat povolené dávkování. Při nedostatečném, ale i přehnaném dávkování SO2 může dojít k poškození vína (Eder et al. 2006).
19
4. ANALÝZA SLOŽENÍ VÍNA 4.1. Senzorické testování Hodnocení vín se provádí dvěma způsoby. Jednak chemickými rozbory, které zjišťují obsah základních složek vína a dále potom smyslovým posouzením vlastností a charakteru vína. Posouzení vína určuje jeho jakost, ale také může upozornit na nedostatky nebo vady. Degustátoři hodnotí čirost a čistotu vína, barvu, vůni, chuť a celkový dojem. K vyjádření i mírných rozdílů v jakosti používají speciální vinařské výrazy (Kraus et al., 2005).
4.2. Tradiční metody analýzy 4.2.1. Zjišťování cukernatosti a obsahu kyselin
Je důležité zjistit množství cukru a obsahu kyselin již v moštu nebo hroznech přímo na vinici v období sklizně. Díky tomuto stanovení je možné mošt předem upravit, aby nedocházelo k problémům před, během a po kvašení moštu, z důvodu přeslazeného moštu nebo vysokého obsahu kyselin. Cukernatost moštu se zjišťuje refraktometricky nebo moštoměry. Refraktometr stanovuje množství cukru v moštech nebo bobulích. Není úplně přesný, ale stačí pro předběžné stanovení při dozrávání hroznů. Má stupnici 0-35 refraktometrických stupňů. Pro stanovení se utrhne několik bobulí z různých částí vinice o různém stupni zralosti, z nich se udělá šťáva a ta se nanese na refraktometr. Přístroj udává hodnotu veškeré sušiny, proto je nutné z ní odečíst 1-2 % pro přibližné stanovení koncentrace zkvasitelných cukrů. Moštoměry se měří jen čistá část moštu. Před stanovením je tedy nutné nechat usadit nečistoty nebo mošt zfiltrovat. Mošt se nalije do odměrného válce a do něj se ponoří moštoměr tak, aby se nedotýkal stěn. Po ustálení se odečte hodnota na stupnici cukernatosti ve výši spodního menisku. Existuje několik druhů moštoměrů: klosterneuburský, Oechsleho nebo u nás nejčastěji používaný Moštoměr A (10-30) ČSN 25 7621 (Kraus et al., 2004).
4.2.2. Stanovení titrovatelných kyselin
Je nutné zjišťovat obsah kyselin v moštech kvůli dalším technologickým zásahům, jako odkyselení, BOK, popř. scelování. Stanovení se provádí titrací 0,3 M hydroxidem
20
draselným nebo sodným. Do titrovaného moštu se přidává fenolftalein. Spotřebované množství hydroxidu v ml odpovídá obsahu kyselin v g.l-1 v moštu (Kraus et al., 2004).
4.3. Doporučené metody analýzy Ebuliometrie Používá se pro stanovení alkoholu. Je založena na klesajícím bodu varu vody s vzrůstajícím obsahem alkoholu. Měření je ovlivněno několika interferencemi, především se jedná o interferenci sacharidů. Přesnost této techniky se pohybuje okolo 0,5 % alkoholu.
Destilace Destilací vzorku vína se oddělí těkavé látky od netěkavých. Obsah měřené složky (alkoholu) ve výsledném destilátu může být měřen hydrometrem, denzitometrem nebo pyknometrem. Měření je ovlivněno teplotou, proto je nutné ji neustále kontrolovat. Získané hodnoty se poté upraví pomocí tabelovaných hodnot (Australian Wine Research Institute, 2008).
NIR spektroskopie (blízká infračervená spektroskopie) Je to nedestruktivní analytická metoda, která umožňuje určit obsahy řady látek současně během jedné analýzy v čase několika sekund. Principem metody je měření odraženého, popř. prošlého záření vzorkem v oblasti vlnových délek od 900-2600, což je blízká infračervená oblast. Část energie záření je pohlcena absorbéry, což jsou dvouatomové vazby C-H, N-H, O-H, S-H, obsažené např. v bílkovinách, sacharidech apod. (Osborne a Fearn, 1986).
Chromatografie Analytická metoda, která je založena na opakovaném ustavení rovnovážného poměru analytu mezi stacionární a mobilní fázi (Ševčík, 2008). Je to metoda přesná a relativně rychlá. Ke stanovení látek ve víně se používá PC (papírová chromatografie), GC (plynová chromatografie), TLC (chromatografie na tenké vrstvě) nebo HPLC (vysokoúčinná kapalinová chromatografie). Kromě PC jde o poměrně drahé metody, které se používají jen ve velkých laboratořích.
21
Enzymatické stanovení Využívá enzymaticky katalyzované přeměny látek. Měří se absorbance přírůstku vedlejšího produktu reakce NAD(P)H. Kity jsou komerčně dostupné (Australian Wine Research Institute, 2008).
4.4. NMR (nukleární magnetická rezonance) Je to metoda založená na sledování interakcí magneticky aktivních jader umístěných v silném magnetickém poli s elektromagnetickým zářením v oblasti radiových vln. Vlivem molekulového okolí a vzájemných interakcí sledovaných jader dochází k charakteristickým posunům a štěpením signálů jednotlivých jader ve spektru. Tak je zpětně možné usuzovat na strukturu sledované molekuly nebo jejích částí (Laboratoř NMR spektroskopie, 2008). Tuto metodu je možné použít i ke kontrole složení a diagnostice pravosti vína. Metoda NMR umožňuje také kontrolu vín, které jsou už stočeny do lahví a zapečetěny.
4.5. Nové metody stanovení s využitím biosensorů 4.5.1. Biosensory
Biosensor je analytické zařízení, které kombinuje biorekogniční složku s vhodným fyzikálním převodníkem. Poskytuje elektrický signál, který je přímo úměrný koncentraci jedné nebo více stanovovaných látek ve vzorku (Skládal, 1999). Biosensor je složen ze 3 částí: -
biorekogniční složka rozpoznává stanovovanou látku, kterou buď specificky přeměňuje – biokatalytická reakce (např.: tkáně, mikroorganismy, organely, buňky, enzymy, atd.) nebo specificky váže – bioafinitní reakce (vazba protilátek s antigeny, hybridizace nukleových kyselin, vazba ligandů na receptory).
-
fyzikálně-chemický převodník – rozlišujeme několik typů: optický (fotometrie, fluorimetrie, amperometrie,
luminometrie,
nelineární
konduktometrie,
optika),
voltametrie),
elektrochemický
(potenciometrie,
piezoelektrický,
akustický,
elektromagnetický a kalorimetrický6. Přeměňuje výsledný signál z interakce analytu s biologickou složkou na jiný signál, který je lépe měřitelný (Skládal, 1999). -
elektronický nebo signální procesor zodpovědný za zobrazení výsledků
22
Obr. 1 Obecné schéma chemického sensoru převádějícího chemický stav či vlastnosti analyzovaného prostředí na elektrický signál, který lze dále zpracovat do informace v požadované formě (Barek et al., 2006)
Optický biosensor - biosonsor s povrchovou plazmovou rezonancí Je založen na opticko-elektrickém jevu, vznikajícím na rozhraní kov-dielektrikum, při totálním odrazu světla na tomto rozhraní. Při určitém úhlu světla dojde k maximálnímu přenesení energie světla na elektrony atomů kovu v povrchové vrstvě (tzv. plazmony), což se navenek projeví poklesem intenzity odraženého světla (Trögl, 2006). V praxi to vypadá tak, že měřený vzorek protéká podél tenké zlaté vrstvy, na jejímž povrchu jsou molekuly cíleně zachytávány. To je zprostředkováváno chemickou reakcí s receptory. Zachycené molekuly způsobí velmi malou změnu indexu lomu, která je přesně měřena pomocí speciální elektromagnetické vlny, šířící se po povrchu zlaté vrstvy (Homola et al., 2008).
23
Obr. 2 Schéma detekce molekul pomocí optického biosenzoru s povrchovým plazmonem (Homola et al., 2008)
Elektrochemický biosensor Využívá nejrůznějších změn elektrochemických parametrů. Musí obsahovat nejméně dvě elektrody, pracovní a referentní. Častěji však obsahuje i pomocnou elektrodu (systém je pak stabilnější). Referentní elektrody mají konstantní, přesně definovaný potenciál, který slouží k nastavení potenciálu pracovní elektrody. Jako referentní elektrody se používají elektrody vodíková, kalomelová, argentchloridová nebo merkurosulfátová. Pomocné elektrody jsou elektrochemicky neaktivní, dobré vodiče. Používá se Pt drátek, uhlíková tyčinka. Pracovní elektrody mohou být z různých materiálů, jako např. ušlechtilé kovy, skelný uhlík, grafit, vodivé polymery a další. Rozsah potenciálu se musí volit tak, aby nedošlo k elektrochemickému rozkladu materiálu elektrody nebo interferenčním reakcím (Skládal, 1999). Tyto elektrody tvoří aktivní část elektrochemického článku (detektoru) a jsou v přímém kontaktu s analyzovaným prostředím. Změna složení prostředí se promítne do změny vlastností článku, což se projeví elektrickým signálem jako výsledek interakce elektroda-analyt. Nevýhodou elektrochemických převodníků je možnost znečištění povrchu elektrody, což lze obejít např. použitím membrány, která zabrání přístupu nežádoucích látek k povrchu biosensoru (Barek et al., 2006). Amperometrické biosensory se používají, když známe potenciál oxidace (redukce) indikátorové/stanovované látky. Měřený proud je úměrný přírůstku nebo úbytku koncentrace elektroaktivních částic v roztoku. Příkladem amperometrického převodníku je Clarkova kyslíková elektroda, jejíž signál závisí na koncentraci kyslíku v roztoku. Při redoxní enzymatické reakci je možné použít vhodný redoxní mediátor, přenašeč elektronů. Tím se 24
minimalizuje vliv interferujících látek a zlepší se linearita a citlivost stanovení. (Barek et al., 2006) Příkladem takového typu biosensoru je glukometr, přístroj na měření glykémie u diabetiků. Jedná se o proužek napuštěný enzymem glukózaoxidasou (GOx). Při styku s krevním cukrem dojde k oxidačně-redukční reakci. K proužku jsou připojeny elektrody, které hodnotí okamžitou velikost elektrického proudu (množství elektronů) uvolňovaného v probíhající reakci (Brož, 2006). Konduktometrické biosensory zaznamenávají změny elektrické vodivosti, které jsou způsobené biochemickou reakcí biosložky a analytu. Konduktometrické metody jsou neselektivní, založené na biochemické tvorbě látek iontové povahy. Selektivitu je možné vylepšit použitím vhodné modifikace povrchu převodníku. Jejich výhodou je rychlé a jednoduché stanovení a nízká cena (Barek et al., 2006). Příkladem konduktometrického biosensoru je stanovení močoviny pomocí reakce s ureázou (Skládal, 1999).
NH2CONH2 + 3 H2O
ureáza
2 NH4+ + HCO3- + OH-
(1)
Základem potenciometrie je změna potenciálu vyvolaná akumulací náboje na rozhraní elektrody s roztokem. Měří se potenciál pracovní elektrody proti referentní elektrodě, přitom v systému neteče proud, je tedy zapotřebí měřící přístroj s velkým vstupním odporem (Skládal, 1999). Potenciometrické biosensory využívají iontově selektivní elektrody v kombinaci s imobilizovaným enzymem.
Piezoelektrický biosensor Je vhodný pro detekci malých změn hmotností. Piezoelektrický krystal osciluje v elektrickém poli specifické frekvence. Rezonanční frekvence krystalu závisí na frekvenci aplikovaného elektrického pole a také na hmotnosti krystalu. Navázáním molekuly analytu na biosložku imobilizovanou na povrch piezoelektrického krystalu se změní hmotnost krystalu, následně klesne jeho rezonanční frekvence a tuto změnu je možné použít pro stanovení množství analytu vázaného biosložkou (Barek et al., 2006). Obecně jsou velice citlivé na vnější podmínky (např. vlhkost vzduchu), jejich výhodou je naopak nízká cena a rychlá odezva. Piezoelektrické biosensory se používají například pro sledování čerstvosti masa (fibrinolýza urokinázou-srážení krve, rozpad aktomyosinu s ATP) (Skládal, 1999).
4.5.2. Imobilizace biomolekul
Biomolekuly mohou být zachyceny do různých struktur membrán, gelů nebo polymerů. 25
Polyakrylamid (PAGE) se připravuje ze směsi akrylamidu a síťovací komponenty methylen-bis(akrylamidu) (MBAA), do něhož se imobilizuje enzym. Iniciace této reakce se provádí UV zářením. Poměr obou složek PAGE určuje porozitu výsledného gelu. MBAA zvyšuje stupeň zesítění, čímž snižuje i průchodnost. Nepatří mezi stabilní, neboť časem dochází k uvolňování biomolekul. Polyvinylalkohol
(PVA)
se
připravuje
hydrolýzou
krátkých
oligomerů
polyvinylacetátu, jejichž zesítěním se vytvoří polymer. Existuje několik způsobů zahájení polymerace. Jedním z nich je ozáření γ zářením. Tento způsob však může poškodit převodník a biomolekulu. Více se pro zesítění PVA používají triisokyanáty (TIC), které spojují postranní hydroxyly. Gel se připravuje tak, že se na povrch sensoru nejdříve nanese enzym. Po jeho zaschnutí se přidá PVA a následně TIC. Dále je možné enzym imobilizovat spolu se směsí modifikovaného oligomeru a bifunkčního polyethylenglykoldiglycidyletheru (PEGDGE) na povrch grafitové elektrody. Modifikovaný oligomer vzniká z poly-4-vinylpyridinu, který se částečně využije pro komplex s Os (mediátor), částečně se do něj kvarternizací zavedou aminoskupiny. Mediátor slouží k přenášení elektronů mezi enzymem a elektrodou. Další možností imobilizace biomolekul je vytvoření membrány přímo z těchto biomolekul (enzymů, bílkovin) zesítěním (retikulací) s vhodným bifunkčním činidlem. Nejčastěji se používá glutaraldehyd (GA), jehož směs s roztokem bílkoviny vytváří retikulum na povrchu sensoru nebo na podkladovém materiálu (polyamidová síťka, dialyzační membrána). Porozitu membrány ovlivňuje poměr GA a bílkoviny (Skládal, 1999).
Aktivace povrchu biosensorů Pracovní povrch biosensorů může být tvořen materiály: sklo, křemík, modifikace uhlíku (grafit, skelný grafit, kompozitní směs) a ušlechtilé kovy, především zlato a platina. Kovalentní vazba mezi biomolekulou a povrchem elektrody zajišťuje dlouhodobě stabilní imobilizaci. Existují různé metody kovalentní imobilizace. Pevná adsorpce thiosloučenin (thioly, disulfidy) na povrch zlata nebo částečně na povrch platiny a stříbra se využívá pro tvorbu monovrstev. Vzniká pevná sulfidová vazba se zlatem, která slouží jako podklad pro další imobilizační reakce. Adsorpcí dlouhých thioderivátů vzniká velmi hustá monomolekulární vrstva, jejíž povrch je elektricky izolován. Krátké thioderiváty zlepšují elektrochemické odezvy bílkovin a jiných látek.
26
Navázání biomolekul Biomolekuly se navážou na povrch sensoru nebo membrány nesoucí volné funkční skupiny. Navázání probíhá v přítomnosti vhodného činidla, které tuto kovalentní vazbu umožní. Pokud povrch sensoru nebo membrány obsahuje aminoskupinu, je nejlepší ji aktivovat vhodným bifunkčním činidlem. Často se využívá GA. Inkubací s povrchem se vytvoří Schiffova báze. Po promytí je další volná aldehydová skupina k dispozici pro tutéž reakci s aminoskupinou biomolekuly. Zbylé volné aldehydové skupiny se inaktivují reakcí s glycinem nebo ethanolaminem. Pro aktivaci karboxyskupiny se využívá reakce s karbodiimidy (CDI). Imobilizace citlivějších bílkovin se provádí pomocí CDI a N-hydroxysukcinimidu (NHS). Připraví se NHS derivát karboxylu, který následně reaguje s aminoskupinou např. bílkoviny. Reverzibilní imobilizaci s volnými cysteinovými zbytky umožňuje thiolová skupina.
Elektropolymerace Je imobilizační technika využívající elektrochemickou oxidaci k přípravě reaktivních monomerů. Tyto monomery posléze tvoří polymerní film na povrchu elektrody. Film je možné vytvořit i na povrchu mikroelektrod. Biomolekuly přítomné v roztoku se zachytí uvnitř vznikající membrány v průběhu elektropolymerace. Některé elektropolymerní vrstvy jsou vodivé, což značně ulehčuje přenos elektronů mezi biomolekulami a elektrodou. Časem dochází k uvolnění biomolekul do roztoku, protože nejsou uvnitř polymeru zachyceny dost pevně. To způsobuje i pokles aktivity. Je možné použít elektropolymerní film jen jako základní modifikaci povrchu elektrody a její povrch dále upravovat chemickými reakcemi (Skládal, 1999).
4.5.3. Použití biosensorů v praxi
Biosensory se uplatňují především v klinické diagnostice, méně pak v ochraně životního prostředí nebo kontrole potravin. V klinické diagnostice se nejčastěji používají glukózové biosensory (glukometry) pro měření hladiny glukózy u diabetiků. Mezi další analyty, které můžeme stanovit biosensory patří laktát, citrát, močovina, kreatinin atd. Některé biosensory mohou stanovovat více látek najednou, což značně zrychluje získání informací o pacientovi v krizovém stavu. Většinou jde o malé přístroje se snadným ovládáním, které poskytují srovnatelné výsledky s centrální laboratoří. 27
V ochraně životního prostředí se biosensory používají především ve vodohospodářství. Jde o sledování znečištění zdrojů pitné vody a vodních toků. Velké využití mají především imunosensory, které dokáží stanovit několik analytů najednou. Biosensory se také používají pro stanovení koncentrací jednotlivých látek ve víně. Pro tyto účely se využívají především elektrochemické biosensory. Biorekogniční složkou jsou zde nejčastěji enzymy. Jde především o oxidázy a reduktázy (dehydrogenázy). Enzymaticky katalyzované reakce jsou rychlé a velmi selektivní. Nejčastěji se řídí kinetikou podle Michalise a Mentenové, z níž vyplývá, že při dostatečném množství enzymu je rychlost reakce v určitém rozmezí přímo úměrná koncentraci stanovované látky (analytu). Můžeme tedy konstruovat kalibrační křivky a z nich kvantitativně stanovit obsah analytu (Skládal, 1999).
4.5.4. Stanovení ethanolu
Základem stanovení ethanolu biosensorem je reakce, při které dochází k oxidaci ethanolu enzymem alkoholoxidázou (AOx.) nebo alkoholdehydrogenázou (ADH) za vzniku acetaldehydu. Rovnice oxidace ethanolu při použití AOx: AOx
CH3-CH2-OH + O2 ethanol
CH3-CH=O + H2O2
(2)
acetaldehyd
Měřený proud je úměrný koncentraci ethanolu ve vzorku. Rovnice oxidace ethanolu při použití ADH: CH3-CH2-OH + NAD+
ADH
CH3-CH=O + NADH + H+
ethanol
(3)
acetaldehyd
Při této reakci je nutná účast kofaktoru NAD+ (nikotinamidadenindinukleotid). Redukovaný NAD+ se elektrochemicky reoxiduje na povrchu převodníku a měří se proud, který je úměrný koncentraci ethanolu. K reoxidaci dochází na všech typech elektrod až při vysokých potenciálech (0,9 V). Výhodnější je ale reoxidace za přítomnosti enzymu diaforázy (DP, lipoamiddehydrogenáza). Rovnice reoxidace NAD za účasti DP:
28
NADH + DPox
NAD+ + DPred + H+
(4)
DPred + Medox
DPox + Medred
(5)
Redukovaný mediátor (Med) se reoxiduje na povrchu převodníku. Proud, který je k reoxidaci potřeba je přímo úměrný koncentraci ethanolu. Jako mediátor se může použít hexakyanoželezitan draselný (Tkáč et al., 1999).
Obr. 3 Schéma vzniku analytického signálu (změny proudové odezvy) bienzymového amperometrického biosensoru na stanovení ethanolu (Valach a Šturdík, 2005)
Acetaldehyd vznikající oxidací ethanolu je dále substrátem enzymu aldehyddehydrogenázy (ALDH), která ho přeměňuje na acetát. Rovnice oxidace acetaldehydu: acetaldehyd + NAD+
ALDH
acetát + NADH + H+
(6)
Vznikající protony se stanoví potenciometricky.
Na přípravu ethanolových biosensorů se používá především AOx nebo ADH imobilizovaná na různých površích kombinovaná s amperometrickým převodníkem. Některé biosensory mají imobilizované dva a více enzymů, čímž slouží ke stanovení více látek. Například enzymy karboxylesteráza (CE) a AOx imobilizované na povrch kompozitní epoxy-grafitové
elektrody
(GECE-
graphite
epoxy
composit
electrode)
spojené
s amperometrickým převodníkem slouží k detekci aspartámu a ethanolu (Anik et al., 2006). Další biosensor pro stanovení ethanolu ve víně je tvořen AOx/chitosan imobilizovanými na eggshell membráně v kombinaci s kyslíkovým sensorem. Stanovení ethanolu je založeno na spotřebě rozpuštěného kyslíku ve vzorku obsahujícím ethanol. Pokles 29
kyslíkové hladiny se zaznamenává. Výsledky tohoto biosensoru jsou srovnatelné s výsledky získanými metodou plynové chromatografie. Pomocí elektronového mikroskopu byla odhalena struktura eggshell membrány a dále se zjistilo, že AOx je v této membráně úspěšně imobilizována (Wen et al., 2007).
Obr. 4 Eggshell membrána pod elektronovým mikroskopem: (1) čerstvá eggshell membrána a (2) eggshell membrána s imobilizovaným enzym/chitosan (Wen et al., 2007)
Nový amperometrický biosensor pro stanovení ethanolu využívá poly-neutrální červeň (PNR-poly neutral red) jako redoxního převodníku, který vytváří elektropolymerní film na karbonové elektrodě. Biorekogniční složkou je AOx z Hansenula polymorpha, která je imobilizována zesítěním s glutaraldehydem v přítomnosti hovězího sérového albuminu (BSA). BSA slouží ke stabilizaci enzymu (Barsan a Brett, 2008).
30
Obr. 5 (a) Navržený reakční mechanismus na PNR/AOx biosensoru při -0,30V proti saturované kalomelové elektrodě (SCE), (b) při použití negativnějšího potenciálu než -0,35V proti SCE (Barsan a Brett, 2008)
Vysoce stabilní a citlivý amperometrický bienzymový biosensor je tvořen AOx, izolovanou z termotolerantní kvasinky Hansenula polymorpha a z křenové peroxidázy (HRP), jako biorekogniční složky. HRP byla imobilizována do Os-komplexu modifikované anodové EDP (electrodeposition paints) v první vrstvě a AOx byla chycena v katodové EDP v druhé vnější vrstvě, čímž byl zajištěn rychlý elektronový přenos mezi enzymem a elektrodovým povrchem. Účinnost biosensoru je závislá na použitém potenciálu během elektrochemicky indukovaném EDP srážení a na chemickém složení použité EDP (Smutok et al., 2006).
Obr. 6 (a) Schématické znázornění struktury bienzymového sensoru, (b) reakční schéma a elektronový přenos z ethanolu přes AOx a enzymaticky vytvořený H2O2 dále přes HRP a polymerně vázané Os na elektrodu (Smutok et al, 2006) 31
4.5.5. Stanovení methanolu
Pro stanovení methanolu se využívá oxidace methanolu na formaldehyd katalyzované enzymem methanoloxidázou (MOx) nebo methanoldehydrogenázou (MDH) podle rovnice reakce (Tkáč et al., 1999): Při použití MOx: MOx
CH3OH + O2 methanol
HCHO + H2O2
(7)
formaldehyd
Při použití MDH: CH3OH + NAD+
MDH
methanol
HCHO + NADH + H+
(8)
formaldehyd
Enzymy MOx a MDH jsou součástí biosensorů pro stanovení methanolu. Tvoří biorekogniční složku biosensoru. Mohou být imobilizovány na různých nosičích a kombinovány s různými převodníky, nejčastěji však elektrochemickým převodníkem. Příkladem biosensoru pro stanovení methanolu je amperometrický biosensor s imobilizovanou MDH, PQQ-dependentního chinoproteinu, z Methylobacterium extorquens AM1 na hladkou karbonovou elektrodu. Jako elektronové přenašeče byly použity: ferrocen (Fc), ferrocen karboxylová kyselina (FcCOOH), N,N,N′,N′-tetramethyl-1,4-fenyldiamin (TMPD), N,N-dimethyl-p-fenyldiamin (DMPD), fenazin methosulfát (PMS) a Wursterova modř (WB). Pouze DMPD, TMPD a Fc byly shledány účinnými mediátory elektronových přenašečů pro enzym. Kvůli senzitivitě DMPD a TMPD ke kyslíku, byla MDH elektroda optimalizována s použitím suspenze Fc (Liu a Kirchhoff, 2007).
4.5.6. Stanovení glycerolu
Ke stanovení glycerolu se používá jeho oxidace na dihydroxyaceton za přítomnosti enzymu glyceroldehydrogenázy (GLDH). Rovnice reakce: C3H8O3 + NAD+
GLDH
C3H6O3 + NADH + H+
glycerol
dihydroxyaceton
32
(9)
Redukovaný NAD se přímo oxiduje na materiálu elektrody. Pro sestavení biosensoru se využívá imobilizace enzymu GLDH, ale také glycerokinázy (GK) nebo glycerol-3-fosfát oxidázy (GPO) na různé nosiče (Tkáč et al., 1999). Biosensor pro měření glycerolu systémem FIA (flow injection analysis – průtoková injekční analýza) byl zkonstruován použitím kovalentně imobilizované GK na skleněné kuličky umístěné v reaktoru (glass beads reactor) spojeném s GPO na membráně Immobilon AV na povrchu elektrody. Enzymy byly spojeny s H2O2 elektrodou. Biosensor byl použit k monitorování produkce glycerolu v průběhu alkoholové fermentace při různých pH a teplotách (Compagnone et al., 1998). Další amperometrický biosensor se používá pro stanovení glycerolu, glukózy a ethanolu. Biorekogniční složku tvoří enzymy – dehydrogenázy, které jsou integrované do redoxních hydrogelů použitím modifikovaného Os komplexu nevodivého polymeru (Os complex-modified non-conducting polymer), jako elektrochemického převodníku a poly(ethylenglykol)-diglycidyl ether (PEGDGE), jako síťovacího činitele. Všechny tři biosensory jsou funkční v podobných podmínkách (nosný pufr, pH, iontová síla), jsou tedy vhodné pro měření tří analytů v reálných vzorcích (Niculescu et al., 2003).
Obr. 7 Schéma mechanismu přeměny substrátů přes PQQ-dehydrogenázy integrované v redoxním hydrogelu pozměněných elektrod (Niculescu et al., 2003)
PQQ-dependentní glyceroldehydrogenáza (GlyDH) purifikovaná z Gluconobacter sp. 33 byla použita do biosensoru pro stanovení glycerolu. Čistý GlyDH vykazoval optimální aktivitu při pH 7,0-7,5 a nejvyšší stabilitu při pH 8,5-9,5. Dále bylo stanoveno, že maximální rychlost oxidace glycerolu je při 33-37 ˚C. Avšak rychlá enzymová inaktivace začíná již při teplotě vyšší než 35 ˚C. Výzkum substrátové selektivity imobilizované GlyDH (zesíťované glutaraldehydem) ukázal, že imobilizační proces snižuje aktivitu membrán buněk 33
Gluconobacter sp. 33 pro glukózu, sorbitol, mannitol a ethanol, ale zvyšuje ji pro methanol a dulcitol. Bylo zjištěno, že biosensory založené na membránách buněk Gluconobacter sp. 33 a na čisté PQQ-dependentní GlyDH jsou citlivé k Pb2+, Cd2+, Co2+, Cu2+, Ni2+ a Hg2+, které mohou způsobit jejich inaktivaci. Takový biosensor je vhodný pro detekci glycerolu a triglyceridů v reálných vzorcích vína (Lapenaite et al., 2005).
4.5.7. Stanovení glukózy
Základem stanovení je oxidace glukózy za přítomnosti enzymu glukózaoxidázy (GOx), která obsahuje kofaktor flavinadenindinukleotid (FAD). Další stanovení je založeno na stejné reakci, ale v přítomnosti enzymu glukózadehydrogenáza (GDH) a kofaktoru NADP+ (nikotinamidadenindinukleotidfosfát). Rovnice reakce v přítomnosti GOx:
D-glukóza + GOx / FAD
GOx
kyselina glukonová + GOx / FADH2
(10)
GOx / FAD + H2O2
(11)
GOx / FADH2 + O2
Pokud je amperometrickým převodníkem kyslíková elektroda, zaznamená pokles kyslíku, který je přímo úměrný koncentraci glukózy ve vzorku. V případě použití jiného převodníku, je možné FAD reoxidovat pomocí mediátoru, podle rovnice: FAD + Mred + 2H+
FADH2 + Mox
(12)
Mediátor předá na povrchu elektrody elektrony, čímž se sám oxiduje. Přírůstek proudu je přímo úměrný koncentraci glukózy ve vzorku. Rovnice reakce v přítomnosti GDH: glukóza + NADP+
GDH
kyselina glukonová + NADPH + H+
(13)
Redukovaný kofaktor se oxiduje na elektrodě pomocí mediátoru a enzymu DP (Tkáč et al., 1999). Glukózový biosensor nejčastěji využívá enzym GOx. Ten je imobilizován na různých površích. GOx byla kovalentně imobilizována na eggshell membránu a zesítěna glutaraldehydem. Glukózový biosensor byl vytvořen umístěním takto imobilizované GOx na 34
povrch sensoru s rozpuštěným kyslíkem. Detekční schéma bylo založeno na spotřebě rozpuštěného kyslíku po vystavení vlivu glukózovému roztoku. Snižující se hladina kyslíku byla monitorována a srovnána s koncentrací glukózy. Glukóza byla stanovována v reálných vzorcích, jako jsou komerční glukózové injekční preparáty a vína. Výsledky byly srovnatelné s hodnotami získanými z jiných analyzačních zařízení, založených na spektrofotometrických metodách (Wu et al., 2004). Další glukózový biosensor byl vyvinut s použitím neutrální červeně (NR-neutral red), jako mediátoru a elektrody na bázi bizmutového filmu (BiFE–bismuth film electrode), jako převodníku. Biorekogniční složkou byl enzym GOx. Výkonnost BiFE byla srovnatelná s výkonností elektrody ze skelného uhlíku (GCE). Vyvinutý biosensor byl použit u vzorků vína (Anik et al., 2008).
4.5.8. Stanovení fruktózy
Základem stanovení fruktózy je její oxidace za účasti enzymu fruktózadehydrogenázy (FDH), která obsahuje koenzym PQQ. Rovnice reakce:
D-fruktóza + FDH / PQQ
5-keto-D-fruktóza + FDH / PQQH2
(14)
PQQH2 se regeneruje stejně jako FADH2 v rovnici č. 11. Fruktózu lze dále stanovit její redukcí za účasti enzymu sorbitoldehydrogenázy (SDH) a mediátoru. Rovnice reakce:
D-fruktóza + NADH
SDH
D-sorbitol + NAD+ + H+
(15)
NAD+ se obnovuje stejně jako v rovnicích č. 4, 5. Proud tekoucí elektrodou je úměrný koncentraci fruktózy ve vzorku. Fruktózu je možné stanovit také enzymem manitoldehydrogenázou (MaDH).
Rovnice reakce:
D-fruktóza + NADH
MaDH
35
D-manitol + NAD+ + H+
(16)
Fluorimetricky se stanovuje úbytek NADH, který je přímo úměrný koncentraci fruktózy ve vzorku. Fruktóza se stanovuje také pomocí enzymů hexokinázy (HK), glukózafosfátizomerázy (PGI) a glukóza-6-fosfátdehydrogenázy (G6PDH). Rovnice reakcí:
D-glukóza + ATP
HK/Mg2+
D-fruktóza-6-P D-glukóza-6-P + NADP+
PGI
G6PDH
D-fruktóza-6-P + ADP
(17)
D-glukóza-6-P
(18)
D-glukonát-6-P + NADPH + H+ (19)
Produkce redukovaného NADP se stanovuje spektrofotometricky (Tkáč et al., 1999). K přípravě fruktózových biosensorů se využívá enzym FDH imobilizovaný na různé nosiče. Může být imobilizován na povrch pastové elektrody (Ikeda et al., 1991), do vrstvy fosfolipidu - po aktivaci materiálu elektrody se na ni adsorbovala vrstva fosfolipidu s enzymem (Kinnear a Monbouquette, 1997), na povrch elektrody zesítěním BSA glutaraldehydem (Xie et al., 1991). Fruktózový biosensor může sestávat také z enzymu MDH kovalentně imobilizované na modifikované kuličky z polyvinylalkoholu a zesítěné glutaraldehydem (Kiba et al., 1991).
4.5.9. Stanovení sacharózy
Nelze provést jen s pomocí jednoho enzymu. Je nutné kombinovat více enzymů najednou. Disacharid sacharóza je složen ze dvou monosacharidů: α-D-glukózy a β-Dfruktózy. Molekulu je nutné nejdříve hydrolyticky rozštěpit pomocí enzymu invertázy (INV). Rovnice reakce:
sacharóza
INV
α-D-glukóza + β-D-fruktóza
(20)
Poté je nutné převést α-D-glukózu na β-D-glukózu, pomocí enzymu mutarotázy (MUT). Rovnice reakce:
α-D-glukóza
MUT
36
β-D-glukóza
(21)
β-D-glukóza je výchozím substrátem pro enzym GOx. Reakce probíhá stejně, jako při stanovení glukózy (viz reakce č. 10, 11). Další možné stanovení sacharózy je pomocí enzymů sacharózafosforylázy (SP), fosfoglukózamutázy (PGM) a G6PDH. Rovnice reakcí:
sacharóza + Pi
SP
glukóza-1-fosfát + fruktóza PGM
glukóza-1-fosfát glukóza-6-fosfát + NADP+
G6PDH
(22)
glukóza-6-fosfát
(23)
6-fosfoglukonát + NADPH + H+
(24)
Přírůstek NADPH se stanovuje spektrofluorometricky (Tkáč et al., 1999). Na přípravu sacharózového biosensoru byly použity enzymy GOx, MUT a INV imobilizované na modifikované skleněné kuličky (Chen a Matsumoto, 1995), přímo na kyslíkovou elektrodu spolu s BSA zesítěné glutaraldehydem a překryté membránou (Xu et al., 1989), na polyamidovou membránu a zesíťované spolu s BSA a glutaraldehydem (Macholán et al., 1983) v kombinaci s amperometrickým převodníkem. Sacharózový biosensor byl vytvořen také použitím enzymů SP, PGM a G6PDH imobilizovaných na aktivované skleněné kuličky a optického převodníku (Kogure et al., 1997).
4.5.10. Stanovení polyfenolů
Pro
stanovení
polyfenolických
sloučenin
se
využívají
enzymy
–
lakáza,
polyfenoloxidáza (tyrosináza) nebo HRP. Enzym lakáza obsahuje měď (Cu). Patří mezi oxidázy s širokou specifitou. Katalyzuje oxidaci fenolových sloučenin na jejich odpovídající chinony za současné redukce kyslíku na vodu.
Obr. 8 Mechanismus oxidace katalyzované lakázou (Gomes et al., 2004)
37
Enzym polyfenoloxidáza (PPO), také obsahuje Cu. PPO katalyzuje oxidaci fenolů na příslušné chinony. Polymerizace o-chinonů produkuje černé, hnědé a červené pigmenty (polyfenoly), což je příčinou hnědnutí ovoce. Základem biosensoru pro polyfenolické sloučeniny je enzym lakáza z Coriolus Versicolor, jako biorekogniční složka. Je imobilizovaná na polyethersulfonovou membránu. Biosensor byl testován pro detekci polyfenolů běžně se vyskytujících v červených vínech, jako jsou kyselina kávová, kyselina galová, katechin, rutin, trans-resveratrol, kvercetin a malvidin. Amperometrický převodník získal odpověď pouze pro katechin při +100 mV (proti Ag, AgCl) a kyselinu kávovou při -50 mV v roztoku acetátového pufru (pH 4,5) a obsahu ethanolu 12%. Při stejných experimentálních podmínkách neposkytovaly další testované polyfenoly žádnou odpověď. Tento biosensor je stále ve vývoji (Gomes et al., 2004).
4.5.11. Stanovení kyseliny mléčné
Kyselina mléčná se vyskytuje ve dvou izomerních formách jako L- a D-kyselina mléčná. Obě látky je možné stanovit použitím enzymů L-laktátdehydrogenázy (L-LDH) a D-laktátdehydrogenázy (D-LDH). Rovnice reakcí: kyselina D,L-mléčná + NAD+
D,L-LDH
pyruvát + NADH + H+
(25)
Redukovaný kofaktor se regeneruje, jako při stanovení ethanolu (rovnice č. 4, 5) Kyselinu mléčnou je možné stanovit také pomocí enzymu L-laktátoxidázy (LOD). Rovnice reakce: LOD
L-laktát +O2
pyruvát + H2O2
(26)
Celkové množství kyseliny mléčné ve vzorku se může stanovit použitím enzymů LOD, DLDH a peroxidázy (HRP). Rovnice reakce: D-laktát + NAD+
D-LDH
2 NADH + O2 + 2 H+
HRP
38
pyruvát + NADH + H+
(27)
2 NAD+ + 2 H2O
(28)
Celková koncentrace laktátu ve vzorku je úměrná spotřebě kyslíku, detekované kyslíkovou elektrodou (Tkáč et al., 1999). Biosensor pro stanovení laktátu je založen na LOD. Enzym byl imobilizován dvěma metodami na povrch komerční platinové plošné elektrody SensLab. Sensor s LOD imobilizovanou fyzikální adsorpcí na polymer Resydrol má užší dynamický rozsah a vyšší citlivost než LOD imobilizovaná elektrochemickou depozicí na poly-3,4-ethylendioxythiofen (PEDT). Imobilizační metoda však nemá vliv na provozní stabilitu a hodnotu pH optima. Biosensor byl použit pro analýzu laktátu ve vzorcích vína a vinného moštu. Výsledky získané tímto biosensorem byly srovnatelné s těmi, získanými standardní metodou iontové chromatografie (Shkotova et al., 2007). Další biosensor pro stanovení laktátu je založen na LOD imobilizované v polymerní membráně. Použitým detektorem může být buď Clarkova kyslíková elektroda nebo peroxidová elektroda. Nízký detekční limit těchto detektorů a relativně vysoká koncentrace laktátu ve vzorcích vína vyžaduje mnohonásobné zředění (v poměru 1:100 až 1:200), čímž se eliminují interference vyskytující se ve vzorku (Palleschi et al., 1994).
4.5.12. Stanovení kyseliny jablečné
Kyselinu jablečnou je možné stanovit pomocí enzymu L-malátdehydrogenázy (L-MDH) podle rovnice reakce: L-malát + NAD+
L-MDH
oxalacetát + NADH + H+
(29)
Redukovaný kofaktor se regeneruje na povrchu elektrody (stejně jako v rovnicích č. 4, 5) odevzdáním elektronů. Proud je úměrný koncentraci kyseliny jablečné ve vzorku. Dále je možné stanovení pomocí jablečného enzymu (ME-malic enzyme) a pyruvátoxidázy (POx). Rovnice reakce: L-malát + NADP+
ME
pyruvát + HPO42- + O2
pyruvát + NADPH + CO2 + H+
(30)
POx
(31)
acetylfosfát + CO2 H2O2
Proton vznikající reakcí kyseliny jablečné s ME je možné stanovit potenciometricky. Vznikající peroxid vodíku se stanoví na platinové elektrodě (Tkáč et al., 1999). 39
Pro konstrukci biosensoru byl využit ME a kofaktor NADP+, imobilizovaný na polymerní membránu. Změna pH, způsobená reakcí kyseliny jablečné s ME, byla zaznamenána pH metrem. Koncentrace kyseliny jablečné ve vzorku byla úměrná změně pH. Biosensor se používá pro stanovení kyseliny jablečné ve vzorcích vína i vinných moštů a poskytuje srovnatelné výsledky s těmi, získanými spektrofotometrickými metodami (Palleschi et al., 1994).
4.5.13. Stanovení kyseliny octové
Amperometrické stanovení kyseliny octové je možné použitím kombinace enzymů – acetátkinázy (AK), pyruvátkinázy (PK) a pyruvátoxidázy (POx). Rovnice reakcí: AK
acetát + ATP
ADP + PEP
pyruvát + O2 + Pi
PK
POx
ADP + acetylfosfát
(32)
ATP + pyruvát
(33)
acetylfosfát + CO2 + H2O2
(34)
Vznikající H2O2 se stanovuje amperometricky.
4.5.14. Stanovení sloučenin síry
Pro stanovení siřičitanů se využívá enzymaticky katalyzovaná reakce enzymem sulfitoxidázou (SOx) (Tkáč et al., 1999). Rovnice reakce: SO32- + O2 + H2O
SOx
SO42- + H2O2
(35)
Biosensor pro stanovení siřičitanů využívá imobilizace enzymu SOx na nylonovou membránu (Campanella et al., 1995), nebo např. fyzickým uchycením na kyslíkovou elektrodu (Smith, 1987). Jako převodník se používá kyslíková elektroda. Pro stanovení sulfitů se používají enzymy SOx a peroxidáza (HRP). Peroxidáza katalyzuje reakci 4-aminofenazonu (4-AAF) a 3-methyl-N-ethyl-N´-(β-hydroxyethyl)anilinu (MEHA) v přítomnosti peroxidu vodíku za vzniku derivátu anilinu (Tkáč et al., 1999). 40
Rovnice reakce: HRP
4-AAF + MEHA + H2O2
4-AMHA + 4 H2O
(36)
Ke konstrukci sulfitového biosensoru byly použity enzymy SOx a HPO imobilizované na aktivních skleněných kuličkách. K detekci byl použit optický detektor (De Astro a Fernández-Romero, 1995).
4.6. Hodnocení použití biosensorů, bioelektronický jazyk Asi největší výhodou biosensorů je velká selektivita odezvy, které u abiotických sensorů nelze dosáhnout. Většina enzymů používaných v biosensorech katalyzuje přeměnu pouze jednoho hlavního substrátu (chemické látky). Pokud je katalyzována i přeměna jiných látek, obvykle jde jen o látky strukturně podobné, rychlost reakce bývá o mnoho řádů nižší. Mezi další přednosti biosensorů patří velká rychlost odezvy. Podle konstrukce může biosensor reagovat na podnět téměř ihned nebo za několik hodin (Trögl, 2006). Jde tedy o značné urychlení např. v porovnání s rozborem v analytické laboratoři. Použití biologického materiálu sebou nese i některé potíže. Enzymy mají svoje optimální podmínky pro katalýzu (pH, teplota apod.), jejichž dodržení je nutné zajistit. Použití nevhodných podmínek vede ke snížení aktivity, a tím ke zkreslení výsledků, nebo až k denaturaci, která může vést ke zničení sensoru. Mnoho látek také způsobuje inhibici enzymů (např. těžké kovy) (Trögl, 2006). Nedostatky biosensorů by mohl vyřešit multikanálový biosensor, tzv. bioelektronický jazyk. Umožnil by snadnou a rychlou detekci vybraných analytů ve vzorku vína (alkoholy, sacharidy, kyseliny, polyfenolické a sirné sloučeniny), které určují výsledné vlastnosti vína. Výsledky získané tímto biosensorem by byly v podobě koncentrace stanovovaných analytů a simulace senzorického hodnocení. Prozatím nelze takový biosensor použít, protože jeho konstrukce je stále předmětem dalšího výzkumu.
41
5. ZÁVĚR Předkládaná bakalářská práce se zaměřuje na přehled problematiky analýzy vína. Zmiňuje jak metody v současnosti používané, tak metody, které se zatím v praxi nepoužívají a jsou předmětem studií. Víno je nesmírně komplexní matrice obsahující tisíce složek. V současné době se stanovuje jen malá část látek, které jsou obsaženy ve větším množství. Jedná se především o alkoholy, sacharidy, kyseliny, sirné a polyfenolické sloučeniny. Tyto látky se stanovují složitými analytickými metodami (chromatografie). Kontrola kvality vína je tedy velmi časově náročná, drahá a k obsluze přístrojů je zapotřebí kvalifikovaný personál. Také počet analýz, které je možné provádět je nedostačující. Výsledky se získávají i se zpožděním několika dnů, takže nelze včas podniknout příslušné kroky ke zlepšení kvality vína. Analýza vína je důležitá již v průběhu procesu kvašení. V některých případech je to jediná možnost odhalení různých vad, nedostatků a nemocí, které ovlivňují výslednou kvalitu vína. Je nutné odhalit procesy vedoucí ke znehodnocování vína včas. Pro urychlení laboratorní analýzy by bylo možné použít vhodné biosensory. Ty poskytují výsledky během několika minut, takže se dovídáme aktuální stav vína. Manipulace s biosensory je velmi snadná, jsou vhodné i pro malé vinaře. Ve velkých laboratořích značně urychlí analýzu, takže bude možné analyzovat více vzorků. Dalšího urychlení analýzy by bylo možné dosáhnout použitím multikanálového biosensoru, tzv. bioelektronického jazyka. Ten by stanovil více vybraných analytů najednou, takže by se nemuselo provádět více analýz. Prozatím nelze takový biosensor použít, neboť jeho konstrukce je stále předmětem studií.
42
6. Zkratky 4-AAF
4-aminofenazon
ADH
alkoholdehydrogenáza
AK
acetátkináza
ALDH
aldehyddehydrogenáza
AOx
alkoholoxidáza
BiFE
elektroda na bázi bizmutového filmu (bismuth film electrode)
BSA
hovězí sérový albumin
CDI
karbodiimid
CE
karboxylesteráza
D-LDH
D-laktátdehydrogenáza
DMPD
N,N-dimethyl-p-fenyldiamin
DP
diaforáza (lipoamiddehydrogenáza)
FAD
flavinadenindinukleotid
Fc
ferrocen
FcCOOH
ferrocen karboxylová kyselina
FDH
fruktózadehydrogenáza
FIA
flow injection analysis – průtoková injekční analýza
GA
glutaraldehyd
GDH
glukózadehydrogenáza
GECE
graphite epoxy composite electrode
GK
glycerokináza
GLDH
glyceroldehydrogenáza
GlyDH
glyceroldehydrogenáza
GOx
glukózaoxidáza
G6PDH
glukóza-6-fosfátdehydrogenáza
GPO
glycerol-3-fosfát oxidáza
HDL
lipoproteiny s vysokou hustotou
HK
hexokináza
HRP
křenová peroxidáza (horseradish peroxidase)
INV
invertáza
LDL
lipoproteiny s nízkou hustotou
L-LDH
L-laktátdehydrogenáza
L-MDH
L-malátdehydrogenáza
LOD
laktátoxidáza 43
MaDH
manitoldehydrogenáza
MBAA
methylenbisakrylamid
MDH
methanoldehydrogenáza
ME
jablečný enzym, malic enzyme
MEHA
3-methyl-N-ethyl-N´-(β-hydroxyethyl)anilin
MOx
methanoloxidáza
MUT
mutarotáza
NAD
nikotinamidadenindinukleotid
NADP
nikotinamidadenindinukleotidfosfát
NHS
N-hydroxysukcinimid
NR
neutrální červeň (neutral red)
PAGE
polyakrylamid
PEDT
poly-3,4-ethylendioxythiofen
PEGDGE
polyethylenglykoldiglycidylether
PEP
fosfoenolpyruvát
PGI
glukózafosfátizomeráza
PGM
fosfoglukózamutáza
PK
pyruvátkináza
PMS
fenazin methosulfát
PNR
poly-neutrální červeň
POx
pyruvátoxidáza
PPO
polyfenoloxidáza
PQQ
pyrolochinolinochinon
PVA
polyvinylalkohol
SDH
sorbitoldehydrogenáza
SOx
sulfitoxidáza
SP
sacharózafosforyláza
TIC
triisokyanát
TMPD
N,N,N′,N′-tetramethyl-1,4-fenyldiamin
WB
Wursterova modř
44
7. Použitá literatura a citace Adamcová, K.: Diplomová práce, Př F MU, Brno (2006) Anik, Ü., Odaci, D., Timur, S., Merkoçi, A., Alegret, S., Beşün, N., Telefoncu, A.: A biosensor based on graphite epoxy composite electrode for aspartame and ethanol detection, Analytica Chimica Acta 570 (2006) 165-169 Anik, Ü., Timur, S., Çubukçu, M., Merkoçi, A.: The usage of a bismuth film electrode as transducer in glucose biosensoring, Microchim Acta 160 (2008) 269-273 Australian Wine Research Institute: Practical Solutions - Establishing a winery laboratory, Australian Wine Research Institute [on line], [17.4.2008]. Dostupný na WWW: http://www.awri.com.au/practical_solutions/laboratory_establishment/methods/alcohol.as p Barek, J., Yosypchuk, B., Opekar, F., Švancara, I., Ferancová, A., Labuda, J., Fojta, M., Navrátil, T., Nesměrák, K., Novotný, L.: Možnosti inovací v elektroanalytické chemii, Praha (2006) Barsan, M.M., Brett, Ch.M.A.: An alcohol oxidase biosensor using PNR redox mediator at carbon film electrodes, Talanta 74 (2008) 1505-1510 Brož, J.: Současné možnosti monitorování glykémie, Remedia [on line] (2006), [11.5.2008]. Dostupný na www: http://www.remedia.cz/pdf/20060508012623PND_monitor%20glykemie_Broz.pdf Bucur, B., Mallat, E., Gurban, A.-M., Gocheva, Y., Velasco, C., Marty, J.-L., Noguer, T.: Strategies to develop malic acid biosensors based on malate quinone oxidoreductase (MQO), Biosensors and Bioelectronics 21 (2006) 2290-2297 Campanella, L., Cipriani, P., Martini, T. M., Sammartino, M. P., Tomassetti, M.: New enzyme sensor for sulfite analysis in sea and river water samples, Analytica Chimica Acta 305 (1995) 32 Compagnone, D., Esti, M., Messia, M.C., Peluso, E., Palleschi, G.: Development of a biosensor for monitoring of glycerol during alcoholic fermentation, Biosensors and Bioelectronics 13 (1998) 875-880 De Astro, M. D. L., Fernández-Romero, J. M.: Development of an optical flow-through biosensor for the determination of sulphite in environmental samples, Analytica Chimica Acta 311 (1995) 281 Eder, R. a kol.: Vady vína. Národní vinařské centrum, (2006) Gomes, S. A. S. S., Nogueira, J. M. F., Rebelo, M. J. F.: An amperometric biosensor for polyphenolic compounds in red wine, Biosensors and Bioelectronics 20 (2004) 1211-1216
45
Homola, J. a kol.: Optické biosenzory pro detekci chemických a biologických látek, Ústav fotonky a elektroniky AV ČR [on line], [27.1.2008] Dostupný na WWW: http://www.otevrena-veda.cz/ov/index.php?p=ufe_spr_2006&site=ufe Chaplin, M.: What are biosensors? London South Bank University [on line] (2004). [26.1.2008]. Dostupný na WWW: http://www.lsbu.ac.uk/biology/enztech/biosensors.html Chen, R. L. C., Matsumoto, K.: Biosensing of glucose, sucrose and lactate in beverages with an automated multi-channel flow analyzer, Bioscience, Biotechnology, Biochemistry 59 (1995) 813 Ikeda, T., Matsushita, F., Senda, M.: Amperometric fructose sensor based on direct bioelectricatalysis, Biosensors and Bioelectronics 6 (1991) 299 Kiba, N., Inoue, Y., Furusawa, M.: Flow-injection system for the fluorimetric determination of fructose with an immobilized mannitol dehydrogenase reactor, Analytica Chimica Acta 243 (1991) 183 Kinnear, K. T., Monbouquette H. G.: An amperometric fructose biosensor based on fructose dehydrogenase immobilized in a membrane mimetic layer on gold, Analalytical Chemistry 69 (1997) 1771 Kogure, M., Mori, H., Ariki, H., Kojima, C., Yamamoto, H.: Determination of sucrose using sucrose phosphorylase in flow-injection system, Analytica Chimica Acta 337 (1997) 107 Kraus, V. a kol.: Réva a víno v Čechách a na Moravě, Praha (1999) Kraus, V., Hubáček, V., Ackermann, P.: Rukověť vinaře, Praha (2004) Kraus, V., Kuttelvašer, Z., Vurma, B.: Encyklopedie českého a moravského vína, Praha (2005) Kuttelvašer, Z.: Abeceda vína, Praha (2003) Laboratoř NMR spektroskopie: Výuka NMR spektroskopie, Laboratoř NMR spektroskopie VŠCHT
v Praze
[on
line],
[18.4.2008].
Dostupný
na
WWW:
http://www.vscht.cz/nmr/vyuka.html Lapenaite, I., Kurtinaitiene, B., Razumiene, J., Laurinavicius, V, Marcinkeviciene, L., Bachmatova, I., Meskys, R., Ramanavicius, A.: Properties and analytical application of PQQ-dependent glycerol dehydrogenase from Gluconobacter sp. 33, Analytica Chimica Acta 549 (2005) 140-150 Liu, Q., Kirchhoff, J.R.: Amperometric detection of methanol with a methanol dehydrogenase modified electrode sensor, Journal of Electroanalytical Chemistry 601 (2007) 125-131 Lvova, L., Paolesse, R., Di Natale, C., D’Amico, A.: Detection of alcohols in beverages: An application of porphyrin-based Electronic tongue, Sensors and Actuators B 118 (2006) 439-447 46
Macholán, L., Konečná, H.: A biospecific membrane sensor for the determination sucrose, Collect. Czech. Chem. Commun. 48 (1983) 798 Niculescu, M., Mieliauskiene, R., Laurinavicius, V., Csöregi, E.: Simultaneous detection of ethanol, glucose and glycerol in wines using pyrroloquinoline quinone-dependent dehydrogenases based biosensors, Food Chemistry 82 (2003) 481-489 Osborne, B.G.,Fearn, T.: Near Infrared Spectroscopy in Food Analysis, Long-man Scientific and Technical, UK, (1986), 4-7, 117-122 Palleschi, G., Volpe, G., Compagnone, D., La Notte, E., Esti, M.: Bioelectrochemical determination of lactic and malic acids in wine, Talanta 41 (1994) 917-923 Pátek, J.: Zrození vína, všechno o pěstování, zpracování a konzumaci vína, Brno (1998) Shkotova, L. V., Goriushkina, T. B., Tran-Minh, C., Chovelon, J.-M., Soldatkin, A. P., Dzyadevych, S. V.: Amperometric biosensor for lactate analysis in wine and must during fermentation,
et
al.,
Materials
Science
and
Engineering
C
(2007),
doi:
10,1016/j.msec.2007.10.038 Skládal, P.: Biosensory, skripta, Př F MU, Brno (1999) Smith, V. J.: Determination of sulfite using a sulfite oxidase enzyme electrode, Analytical Chemistry 59 (1987) 2256 Smutok, O., Ngounou, B., Pavlishko, H., Gayda, G., Gonchar, M., Schuhmann, W.: A reagentless bienzyme amperometric biosensor based on alcohol oxidase/peroxidase and an Os-complex modified electrodeposition paint, Sensors and Actuators B 113 (2006) 590-598 SZPI: Kvalita nejlevnějších stolních vín, Q magazín [on line], [25.4.2008]. Dostupný na WWW: http://www.qmagazin.cz/potraviny/kvalita-nejlevnejsich-stolnich-vin-2.html Ševčík, J.G.K.: Plynová chromatografie a její aplikace v organické analýze, Univerzita Karlova
[on
line],
[17.4.2008].
Dostupný
na
WWW:
http://www.natur.cuni.cz/~sevcik/plyn_chrom.pdf Tkáč, J., Švitel, J., Šturdík, E.: Stanovenie významných látok v nápojoch biosenzormi, Chem. Listy 93 (1999) 518-526 Trögl, J.: Biosenzory, Odborné časopisy [on line], (2006), [27.1.2008] Dostupný na WWW: http://www.odbornecasopisy.cz/index.php?id_document=31055 Valach, M., Šturdík, E.: Bienzýmový biosenzor na stanovenie etanolu, Nova Biotechnologica V-I (2005) Wen, G., Zhang, Y., Shuang, S., Dong, Ch., Choi, M.M.F.: Application of a biosensor for monitoring of ethanol, Biosensors and Bioelectronics 23 (2007) 121-129
47
Wu, B., Zhang, G., Shuang, S., Choi, M.M.F.: Biosensors for determination of glucose oxidase immobilized on an eggshell membrane, Talanta 64 (2004) 546-553 Xie, X., Kuan, S. S., Guibault G. G.: A simplified fructose biosensor, Biosensors and Bioelectronics 6 (1991) 49 Xu, Y., Guibault, G. G., Kuan, S. S.: Sucrose enzyme electrode, Analytical Chemistry 61 (1989) 782
48
