FACULTEIT GENEESKUNDE EN GEZONDHEIDSWETENSCHAPPEN
Academiejaar 2012 - 2013
Kwaliteitsbeheer en -optimalisatie van humane celculturen in de weefselbank UZ Gent: Gebruik van hyaluronzuur voor de applicatie van epidermale celsuspensies
Yne MAES
Promotor: Prof. Dr. Hilde Beele Co-promotor: Caroline Van Geyt
Scriptie voorgedragen in de 2de Master in het kader van de opleiding
MASTER OF MEDICINE IN DE GENEESKUNDE
FACULTEIT GENEESKUNDE EN GEZONDHEIDSWETENSCHAPPEN
Academiejaar 2012 - 2013
Kwaliteitsbeheer en -optimalisatie van humane celculturen in de weefselbank UZ Gent: Gebruik van hyaluronzuur voor de applicatie van epidermale celsuspensies
Yne MAES
Promotor: Prof. Dr. Hilde Beele Co-promotor: Caroline Van Geyt
Scriptie voorgedragen in de 2de Master in het kader van de opleiding
MASTER OF MEDICINE IN DE GENEESKUNDE
Voorwoord Ten eerste zou ik mevr. Caroline Van Geyt willen bedanken voor de volledige begeleiding van deze masterproef. Bedankt om samen met mij na te denken over de testen, om mijn protocols kritisch te beoordelen en mijn teksten na te lezen en nog zoveel meer. Vervolgens wil ik ook prof. dr. Hilde Beele bedanken voor de medewerking aan de viscositeitstesten, de kritische opmerkingen en het sturen in de juiste richting van mijn masterproef. Ook mevr. Martine De Mil zou ik willen bedanken voor het helpen opstellen van mijn protocols, voor haar medewerking aan de viscositeitstesten en voor alle hulp (en ondersteuning bij de stressmomenten) in het labo. Tenslotte zou ik ook nog prof. dr. Nanja Van Geel willen bedanken voor haar medewerking aan de viscositeitstesten en de toelating om de vitiligo-behandeling bij de patiënt mee te volgen.
Inhoudsopgave Titelblad.................................................................................................................................................. Auteursrecht........................................................................................................................................... Voorwoord.............................................................................................................................................. Inhoudsopgave........................................................................................................................................ Abstract.................................................................................................................................................1 Inleiding................................................................................................................................................3 1. Weefselbank.................................................................................................................................3 2. Huidpigmentatie ..........................................................................................................................4 2.1 Epidermale cellen..................................................................................................................4 2.2 Leukoderma..........................................................................................................................5 3. Chirurgische behandelingen voor leukoderma............................................................................6 3.1 Patiëntenselectie....................................................................................................................6 3.2 Indeling chirurgische behandelingen....................................................................................6 3.3 Autologe transplantatie van epidermale cellen: procedure UZ Gent ...................................8 4. Hyaluronzuur.............................................................................................................................10 4.1 Eigenschappen....................................................................................................................10 4.2 Gebruik voor medische toepassingen..................................................................................10 Materialen en Methoden.....................................................................................................................13 1. Hyaluronzuurproducten zoeken.................................................................................................13 2. Viscositeitstesten........................................................................................................................14 3. Homogeniteits- en viabiliteitstesten...........................................................................................16 3.1 Aanmaak van test-celsuspensie op basis van fibroblasten..................................................16 3.2 Test 1...................................................................................................................................18 3.3 Test 2...................................................................................................................................22 3.4 Test 3...................................................................................................................................24 4. Interpretatie van resultaten.........................................................................................................25 Resultaten...........................................................................................................................................26 1. Hyaluronzuurproducten selecteren............................................................................................26 2. Viscositeitstesten........................................................................................................................27 3. Homogeniteits- en viabiliteitstesten...........................................................................................28 3.1 Test 1...................................................................................................................................29 3.2 Test 2...................................................................................................................................32 3.3 Test 3...................................................................................................................................35 Discussie.............................................................................................................................................38 Referenties..........................................................................................................................................40 Bijlagen................................................................................................................................................... Bijlage 1: Begrippenlijst.................................................................................................................... Bijlage 2: Viscositeitstesten............................................................................................................... Bijlage 3: Aanmaken celsuspensie fibroblasten................................................................................ Bijlage 4: Homogeniteits- en viabiliteitstesten: test 1....................................................................... Bijlage 5: Homogeniteits- en viabiliteitstesten: test 2....................................................................... Bijlage 6: Homogeniteits- en viabiliteitstesten: test 3....................................................................... Bijlage 7: Verschillen tussen de testen............................................................................................... Bijlage 8: Celtelling test 1................................................................................................................. Bijlage 9: Celtelling test 2.................................................................................................................
Abstract Inleiding Behandeling van leukoderma-patiënten (vb. segmentale vitiligo) is niet eenvoudig. Bij een geselecteerde patiëntenpopulatie kan men echter door middel van transplantatie van autologe epidermale cellen (van een gezonde huidzone naar de huidzone met leukoderma) terug repigmentatie bekomen bij een groot deel van de patiënten. Om de applicatie van de donorcellen op de aangetaste huidzone te vereenvoudigen kan viscositeit van de celsuspensie verhoogd worden door toevoeging van hyaluronzuur. Door de groeiende interesse in hyaluronzuur binnen verschillende domeinen van de medische sector komen meer en meer producten op de markt met verschillende ketenlengtes en eigenschappen. In deze masterproef worden een aantal van deze producten onderworpen aan tests omtrent de parameters viscositeit, homogene celverdeling en viabiliteit van cellen in celsuspensie.
Materialen en Methoden In een eerste fase werden hyaluronzuurproducten opgelijst en op basis van een aantal selectiecriteria (i.v.m. beschikbaarheid, afleveringvorm en totaal volume, concentratie van het eigenlijke hyaluronzuur en prijs van het product) werden zeven producten geselecteerd waarop testen werden uitgevoerd. Voor de viscositeitstest werd telkens gedurende één minuut een druppel van een hyaluronzuurproduct (al dan niet verdund) op de handrug aangebracht en er werd gekeken of deze druppel van de handrug liep op het moment dat de hand in verticale positie werd gebracht. Voor de homogeniteits- en viabiliteitstesten werden 3 testen verricht. Voor elk van deze testen werd een celsuspensie van fibroblasten samengevoegd met een hyaluronzuurproduct of een neutrale controle en met rust gelaten gedurende enkele uren (op kamertemperatuur of onder gekoelde omstandigheden). Na deze contacttijd werd iedere celsuspensie verdeeld over een aantal recipiënten en werden de cellen na toevoeging van cultuurmedium in kweek gebracht. Na een vastgelegd tijdsinterval werden de celaantallen van iedere well en/of iedere petrischaal visueel gescoord en/of geteld.
1
Resultaten en discussie Na de viscositeitstesten vielen er twee producten af die niet viskeus genoeg waren. Nog drie producten vielen af bij de homogeniteits- en viabiliteitstesten omdat er geen homogene verdeling was van de celsuspensie. De overige twee producten lijken wel goed te scoren op alle parameters en zijn wellicht bruikbaar als medium voor het aanbrengen van epidermale celsuspensies. Er kunnen echter geen definitieve conclusies getrokken worden door de kleinschaligheid van het onderzoek, de steekproefvariaties bij de celtellingen en de verschillen tussen de testen. Er zijn ook aanwijzingen dat de temperatuur of de viscositeit een invloed hebben op de viabiliteit van de cellen, maar deze hypothesen werden in verdere testen niet bevestigd.
2
Inleiding Deze masterproef kadert in het kwaliteitsbeheer en optimalisatie binnen de Weefselbank in het UZ Gent. Meer in het bijzonder werd voor deze masterproef geopteerd om te focussen op de applicatie van epidermale celsuspensies in het kader van de behandeling van leukodermapatiënten, waarbij meer in het bijzonder een optimalisatie van de hanteerbaarheid van de celsuspensie dient te gebeuren zonder al te extreme kosten. Prof.dr. N. Van Geel [1] heeft in het verleden aangetoond dat de hanteerbaarheid van de celsuspensie kan verhoogd worden door toevoeging van het hyaluronzuurproduct 'Provisc'. Vooral bij gebogen oppervlakken (zoals lippen, oogleden, ...) en grote verticale oppervlakken. Intussen wordt hyaluronzuur voor zeer veel indicaties gebruikt en komen er meer en meer analoge producten voor humaan gebruik op de markt, weliswaar met variabele samenstelling en andere ketenlengtes van het hyaluronzuur. In deze masterproef worden verschillende van deze hyaluronzuurproducten bestudeerd aan de hand van een aantal parameters (viscositeit, homogene celverdeling en viabiliteit van de cellen), omdat deze parameters een rol kunnen spelen in de bruikbaarheid van het product voor de applicatie van epidermale celsuspensies. De verwerking van de epidermale celsuspensie gebeurt in het labo van de Weefselbank. Daarom leek het aangewezen om eerst de werking van een bank voor menselijk lichaamsmateriaal te schetsen, meer in het bijzonder de Weefselbank van het UZ Gent. Vervolgens worden huidpigmentatie, leukodermabehandelingen en hyaluronzuur besproken. Tenslotte wordt de huidige procedure van autologe transplantaties van epidermale cellen binnen het UZ Gent toegelicht.
1. Weefselbank Binnen het Universitair Ziekenhuis Gent is de Weefselbank sinds het begin van de jaren '90 verantwoordelijk voor de wegname, de bereiding, het testen, de bewaring en de distributie van humane weefsels en cellen voor klinische toepassingen (ook greffes genaamd). De weefsels en cellen zijn afkomstig van ofwel levende ofwel overleden donoren en kunnen gebruikt worden voor autologe toepassingen (hierbij is het donorweefsel afkomstig van de patiënt zelf) of allogene toepassingen (waar donor en acceptor niet dezelfde persoon zijn).
3
De Weefselbank van het Universitair Ziekenhuis Gent is een gecentraliseerde bank voor menselijk lichaamsmateriaal en omvat 6 door het FAGG erkende verschillende banken: [2] • bank voor oftalmische greffes (hoornvlies (cornea) en sclera greffes) • bank voor bot- en pees greffes (muskulo-skeletale greffes) • bank voor amnionmembraan greffes voor oftalmische toepassing • bank voor huidcelculturen (keratinocyten) • bank voor gehoorsbeentjes (tympano-ossiculaire greffes) • bank voor bloedvaten (vasculaire greffes) Het onderzoek voor deze masterproef kadert zich binnen de bank voor huidcelculturen, waarbij de cellen afkomstig zijn van levende donoren en bedoeld zijn voor autologe toepassingen (namelijk leukodermabehandeling).
2. Huidpigmentatie 2.1 Epidermale cellen De belangrijkste cellen in de opperhuid (epidermis) die een rol spelen bij de pigmentatie van de huid zijn keratinocyten en melanocyten: Keratinocyten (hoorncellen) vormen het hoofdbestanddeel van de opperhuid. Deze cellen ondergaan een proces van keratinisatie (= verhoorning) en schilferen uiteindelijk af aan het oppervlak als kernloze, verhoorde cellen. Er bestaan gespecialiseerde verbindingen tussen de keratinocyten onderling, waardoor de huid een mechanische barrière vormt tussen het organisme en de buitenwereld. Deze cellen ontvangen melanosomen van de melanocyten en en vormen zo ook een barrière voor UV-licht en beschermen op die manier hun eigen celkern, alsook de onderliggende weefsels tegen schade door UV-straling. Melanocyten (pigmentcellen) maken slechts 3-5% uit van de epidermale cellen en bevinden zich in de diepste laag van de opperhuid. Hun belangrijkste functie is het aanmaken van melanine, de stof die verantwoordelijk is voor de pigmentatie. Deze melanine wordt door de melanocyt aangemaakt in melanosomen en wordt via de dendrieten (= uitlopers) van de melanocyt doorgegeven aan een dertigtal keratinocyten in zijn omgeving. De keratinocyten nemen de melanosomen vervolgens op (via fagocytose) waar de melanosomen aanwezig 4
blijven als barrière tegen UV-straling. De hoeveelheid melanine die gevormd wordt door de melanocyt is afhankelijk van verschillende factoren: genetische aanleg, bepaalde hormonen en UV-licht.
2.2 Leukoderma Leukoderma is de verzamelnaam voor huidaandoeningen die gepaard gaan met verminderde pigmentatie en die niet op een vasculaire oorzaak berust. Deze groep van aandoeningen treft ongeveer 1% van de bevolking. De vermindering van de pigmentatie is het gevolg van een vermindering (hypomelanose) of wegvallen (amelanose) van de productie van melanine in de huid. Dit kan berusten op twee mechanismen: ofwel is er een verminderd aantal melanocyten, ofwel zijn er voldoende melanocyten maar is er een vermindering in hun functioneren [3]. Enkele van de meest voorkomende leukoderma zijn: albinisme, pityriasis versicolor, pityriasis alba, postinflammatoire hypopigmentatie, hypopigmentatie bij atrofische huidziekten, progressieve maculaire hypomelanose, lepra en vitiligo. Vaak veroorzaken deze aandoeningen geen fysieke last, maar op psychisch vlak kan deze aandoening belastend zijn op verschillende aspecten van het leven [4]. Behandeling van de aandoening heeft dus niet alleen een cosmetisch effect, maar kan ook voor de levenskwaliteit van de patiënt veel betekenen. De conventionele behandeling van leukoderma hangt af van de oorzaak van de aandoening: vb. corticosteroïden bij behandeling van vitiligo of het bestrijden van het oorzakelijke micro-organisme bij pityriasis versicolor en bij lepra. Ook therapie met UV-licht (psoralenen in combinatie met UVA-straling, of kortgolvige UV-B-straling) kan aangewend worden om de melanineproductie te stimuleren. Als alternatief kunnen ook camouflagetechnieken zoals tatoeëren aangewend worden. Indien deze conventionele behandelingen geen of onvoldoende effect hebben, kan bij een geselecteerde groep patiënten met leukoderma ook een chirurgische behandeling overwogen worden, waarbij transplantatie van autologe melanocyten centraal staat.
5
3. Chirurgische behandelingen voor leukoderma 3.1 Patiëntenselectie Omdat een chirurgische behandeling van leukoderma duur en tijdrovend is en voor de meeste technieken gespecialiseerde materialen en eventueel labo-apparatuur nodig is, dient er een strikte selectie te gebeuren van de patiënten waarbij men effect van de therapie verwacht. De meeste auteurs hanteren volgende selectiecriteria voor de chirurgische behandeling: − stabiliteit van de aandoening: een leukoderma wordt als stabiel beschouwd indien deze gedurende één jaar ongewijzigd aanwezig blijft; − afwezigheid van Koebnerfenomeen (= ontstaan van de huidaandoening na verwonding); − afwezigheid van hypertrofische littekens en keloïdvorming.
3.2 Indeling chirurgische behandelingen De chirurgische technieken worden in twee groepen verdeeld: de transplantatie van huidweefsel (tissue grafting) en de transplantatie van epidermale cellen (cellular grafting). 3.2.1 Transplantatie van huidweefsel (tissue grafting) In tegenstelling tot de transplantatie van epidermale cellen, zijn deze technieken minder tijdrovend en is er geen gespecialiseerde laboratoriumsetting nodig. Dit maakt dat deze procedures voor de patiënt goedkoper zijn en in meer ziekenhuizen kunnen uitgevoerd worden [5]. 3.2.1.1 Minigrafting (full-thickness punch greffes) Bij minigrafting worden cillindervormige full-thickness greffe(s) (= doorheen alle huidlagen) weggenomen uit de donorregio('s), met behulp van een scherp rond instrument. Deze worden vervolgens getransplanteerd naar de te behandelen acceptorzone waar men gelijkaardige punch-lesies heeft gecreëerd [6]. Dit vormt ook de goedkoopste methode, aangezien deze procedure de kortste behandelingsduur heeft en er geen speciale materialen nodig zijn [6]. 3.2.1.2 Split-thickness greffe Bij split-thickness greffes wordt met behulp van een dermatoom (= soort mesje) een dunne huidlaag weggenomen op een gepigmenteerde huidzone. Deze huidlaag vormt de greffe die vervolgens op de gedepigmenteerde huidzone wordt aangebracht, nadat deze acceptorzone ontdaan werd van zijn opperhuid (epidermis) [7]. Soms wordt deze dunne greffe ook onderhuids ingebracht op de acceptorzone [8]. 6
3.2.1.3 Suction blister greffe Bij de suction blister greffes wordt er op een onaangetaste huidzone een blaar gecreëerd met behulp van negatieve druk. Het dak van deze blaar wordt zorgvuldig verwijderd en gebruikt als greffe. Ook op de acceptorsite worden blaren gecreëerd (met behulp van cryotherapie, UVlicht of negatieve druk). Het dak van deze gedepigmenteerde blaren wordt verwijderd en de greffe (het blaardak van de gepigmenteerde huidzone) wordt aangebracht [5].
3.2.2 Transplantatie van epidermale cellen (cellular grafting) Bij deze methode worden de melanocyten op de te behandelen huidzone aangebracht onder de vorm van (in het labo geprepareerde) epidermale celsuspensies. Afhankelijk van de methode bevatten deze celsuspensies enkel melanocyten of een combinatie van melanocyten en keratinocyten. Het voordeel van transplantatie van epidermale cellen (in vergelijking met transplantatie van huidweefsel) is dat men huidzones kan behandelen die vele malen groter zijn dan de donor site. De nadelen zijn echter dat men voor het aanmaken van die celsuspensies over gespecialiseerde laboapparatuur en -infrastructuur dient te beschikken [5]. Donorsite en bereiden celsuspensie - Voor beide methoden van cellular grafting wordt ter hoogte van de donorsite een dun huidbiopt gepreleveerd (= weggenomen) met behulp van een dermatoom. In het laboratorium worden de cellen van het donorweefsel eerst van elkaar losgemaakt. Dit gebeurt meestal door een product met het enzym 'trypsine' toe te voegen aan de het weefsel. Dit enzym maakt de cellen van elkaar los bij een temperatuur van 37°C, daarom plaatst men het weefsel in een incubator om de trypsine te kunnen laten inwerken. Van zodra de cellen los zijn van elkaar wordt er een trypsine-inhibitor toegevoegd, zodat de werking van het trypsine stopt [9]. Fetal calf serum wordt hierbij meer en meer vervangen door producten waar geen dierlijke allergenen in zitten zoals soja-extracten of autoloog bloedplasma, sommige auteurs kiezen er voor om de trypsine niet te blokkeren, maar weg te wassen met PBS [10]. Daarna worden de cellen gecentrifugeerd. Hierdoor ontstaat een celpellet (= samengeperste cellen), die afhankelijk van de procedure kan opgelost worden in het cultuurmedium (voor gekweekte celsuspensies) of meteen in het aflevermedium (voor niet-gekweekte celsuspensies) [9]. Het medium waarin de celsuspensie afgeleverd wordt kan verschillen tussen de centra en zijn afhankelijk van de ervaring van de arts en laborant. Verder kozen Van Geel et al. voor het toevoegen van hyaluronzuur aan hun celsuspensies als biodegradeerbare carrier die de viscositeit (en dus ook de hanteerbaarheid) verhoogt [11]. 7
Acceptorsite – Ter voorbereiding van de acceptorsite kan, afhankelijk van de ervaring van de arts de epidermis op verschillende manieren verwijderd worden [12]. Daarna wordt de bereidde celsuspensie zorgvuldig uitgezaaid over de voorbereide acceptorsite en afgedekt met een nietinklevende bedekking. Sommige artsen kiezen er ook voor om op de acceptorsite blaren te creëren waar de aangemaakte celsuspensie wordt ingespoten, zodat het blaardak gebruikt wordt als natuurlijke bedekking van de greffe [12]. 3.2.2.1 Gekweekte celsuspensies Bij deze techniek zal men epidermale cellen uit de huid van de donorsite in kweek brengen gedurende enkele weken. Afhankelijk van het type celsuspensie dat men wil bekomen (keratinocyten en melanocyten, of enkel melanocyten) wordt een ander cultuurmedium gebruikt. Na de kweek worden de cellen terug losgemaakt met behulp van trypsine en verloopt het proces verder zoals voor de niet-gekweekte celsuspensies. Deze techniek heeft als voordeel dat men slechts een kleine huidzone nodig heeft als donorsite (waardoor de kans op littekenvorming kleiner wordt), terwijl men een grote huidzone (acceptorsite) kan behandelen [7]. 3.2.2.2 Niet-gekweekte celsuspensies Bij deze techniek gaat het steeds om een gemengde celsuspensie van keratinocyten en melanocyten, waarbij geen van beide celtypes gekweekt worden. Hierbij wordt de bekomen celpellet onmiddellijk opgelost in het aflevermedium (het medium waarin de cellen op de huidzones aangebracht zullen worden) [5].
3.3 Autologe transplantatie van epidermale cellen: procedure UZ Gent Voor de procedure van autologe transplantatie van epidermale cellen in het UZ Gent is er een samenwerking tussen de diensten Dermatologie en de keratinocytenbank die deel uitmaakt van de Weefselbank. 's Morgens meldt de patiënt zich aan op de dienst Dermatologie. Daar wordt eerst samen met de patiënt nog eens de volledige procedure doorlopen en kunnen vragen van de patiënt beantwoord worden. Er wordt ook duidelijk afgesproken met de patiënt welke zone(s) er zullen behandeld worden. Deze zones worden aangeduid met een dermatografisch stiftje en worden tenslotte ook nog gefotografeerd. Hierna kan de eigenlijke procedure van start gaan.
8
Er wordt begonnen met het wegnemen van de huid ter hoogte van de donorsite (meestal de bil van de patiënt). Hiervoor wordt de donorsite ontsmet en verdoofd en wordt er met een dermatoom een dun huidlaagje (van ongeveer 5 cm²) weggenomen en verbandmateriaal wordt aangebracht. Op de plaats van de donorsite ontstaat door deze methode een schaafwonde die meestal vanzelf geneest. Het stukje huid dat men heeft weggenomen wordt vervolgens in een recipiënt met fysiologische oplossing overgebracht naar de Weefselbank, waar het in de cleanroom onder steriele omstandigheden zal verwerkt worden. De patiënt blijft intussen op de dienst Dermatologie, waar men intussen de acceptorsite zal voorbereiden. Hierbij verdooft men de huid eerst (met een verdovende crème of met injecties van een locaal anestheticum). Vervolgens zal men met behulp van een CO2-laser de oppervlakkige epidermis verwijderen. De huid die men heeft weggenomen op de donorsite wordt door de laborant van de Weefselbank uit het recipiënt genomen en vervolgens eerst gespoeld met PBS. Vervolgens wordt de huid verknipt en worden de fragmenten in een petrischaal met trypsine in de CO2-incubator geplaatst op 37°C. Na 30 minuten komt de epidermis los van de dermis en kunnen de epidermale cellen ook van elkaar losgemaakt worden met behulp van een vortex. De resterende stukjes dermis worden verder niet gebruikt en worden uit het recipiënt verwijderd. Er wordt ook telkens een kleine hoeveelheid van de celsuspensie (5µL) gebruikt om een celtelling uit te voeren, hierdoor kan er een inschatting gemaakt worden over het totale celaantal van de celsuspensie die men zal transplanteren. Intussen wordt de rest van de celsuspensie gecentrifugeerd gedurende 5 minuten op 1200 rpm zodat een epidermale celpellet wordt bekomen. Het supernatans (= bovenstaande vloeistof) wordt verwijderd en de celpellet wordt opgelost in een volume hyaluronzuur en PBS zoals afgesproken met de arts (het aflevervolume wordt bepaald door de arts op basis van de grootte van de zone die men wil behandelen). Deze epidermale celsuspensie wordt terug overgedragen aan de dienst Dermatologie waar men deze zal aanbrengen bij de patiënt. Bij de patiënt wordt de celsuspensie vervolgens gelijkmatig over de volledige zone van de (intussen voorbereide) acceptorsite aangebracht, die vervolgens afgedekt wordt met polyurethaan verbandmateriaal. De volledige transplantatieprocedure vindt plaats op dezelfde dag waardoor de patiënt diezelfde dag nog terug naar huis kan. De patiënt krijgt wel de raad mee om zich gedurende enkele dagen rustig te houden.
9
Na 6 à 7 dagen komt de patiënt terug op controle en mag het verbandmateriaal verwijderd worden. De huid is dan echter nog broos en moet nog steeds voorzichtig behandeld worden. Ook de pigmentatie is dan nog niet zichtbaar, aangezien de melanocyten voldoende tijd nodig hebben om zich vast te hechten en melanine aan te maken. Eventueel kan na vier weken gestart worden met UV therapie om de aanmaak van melanine te stimuleren.
4. Hyaluronzuur 4.1 Eigenschappen Hyaluronzuur is een lineaire polysaccharide (= suikerketen) met een hoge moleculaire massa. Het is van nature aanwezig in de extracellulaire en pericellulaire matrix van bijna alle weke weefsels in het lichaam van gewervelde dieren (en dus ook bij de mens) [13]. De hoogste concentraties vindt men in het oog, de navelstreng en het synoviale gewrichtsvocht. Echter, de helft van de totale hoeveelheid hyaluronzuur in het lichaam vindt men terug in de huid [14]. De molecule wordt geproduceerd door membraangebonden enzymen (onder andere op het plasmamembraan van fibroblasten). Deze enzymen voegen suikers toe (glucuronzuur en N-acetylD-glucosamine) zodat de steeds langer wordende polysaccharideketens ontstaan [15]. Men ziet dat de productie van hyaluronzuur stijgt in prolifererende cellen, mogelijks heeft het hyaluronzuur een effect op de mitose van cellen. Hoewel hyaluronzuur deel uitmaakt van de extracellulaire matrix, heeft het een zeer snelle turnover (de halfwaardetijd varieert van 12 uur tot enkele dagen). Afbraak gebeurt zowel lokaal via opname in de cel (= endocytose), als in de lymfevaten of lever. Hyaluronzuur interageert met de cellen: niet alleen via de membraangebonden enzymen, maar ook via specifieke receptoren op bepaalde cellen (vb. CD 44). Dit speelt mogelijks een rol in de proliferatie (= groei en verspreiding) en differentiatie (= ontwikkeling van verschillende celtypes) van cellen en in de wondgenezing [14].
4.2 Gebruik voor medische toepassingen Doordat hyaluronzuur in zeer veel weefsels een belangrijke rol speelt, is hyaluronzuur een interessant product geworden voor de medische sector.
10
Het hyaluronzuur is afkomstig van 2 bronnen: Enerzijds komt hyaluronzuur voor in de weefsels van alle gewervelde dieren. Zo zijn er bepaalde weefsels met een hoge concentratie aan hyaluronzuur (zoals de hanenkammen, de huid van haaien, en runderogen), die een interessante bron vormen voor het bekomen van hyaluronzuur voor medische toepassingen. Doordat deze moleculen echter gebonden zijn aan cellen en aan andere moleculen van de extracellulaire matrix, dienen eerst een aantal zuiveringsprocedures doorgevoerd te worden vooralleer het hyaluronzuur verwerkt kan worden. Door deze complexiteit (en door het risico op zoönosen) is men op zoek gegaan naar andere bronnen van hyaluronzuur. Zo zijn er ook bepaalde micro-organismen die hyaluronzuur produceren (vb. bepaalde stammen van de Streptococcus zooepidemicus) waarvan de hoge moleculaire massa ook in de gunstige therapeutische range ligt, dit proces noemt men 'fermentatie'. Bij deze microorganismen bestaat echter nog steeds het risico op mutaties, waardoor potentieel toxines kunnen geproduceerd worden. Om die reden is de (minder complexe) productie van hyaluronzuur met behulp van fermentatie er nog niet in geslaagd om de (complexere) productie op basis van zuivering uit dierlijke producten van zijn marktpositie te verdringen [14]. Onderstaande voorbeelden zijn de belangrijkste indicaties waarvoor hyaluronzuur momenteel gebruikt wordt in de medische sector. Deze lijst is niet volledig en is slechts een kleine fractie van de vele toepassingen. Zo bewijzen ook de meer dan 19000 wetenschappelijke artikels die men over dit onderwerp vindt op Pubmed. Oogheelkunde Hyaluronzuur zorgt voor de viscositeit van het glasvocht, dat voor 98% uit water en slechts 2% uit hyaluronzuur
bestaat.
In
oogheelkundige
procedures
wordt
hyaluronzuur
gebruikt
als
oogheelkundig viscochirurgisch middel (OVD), waarbij het product door zijn hoge viscositeit het cornea endotheel beschermt tijdens operaties. Ook in kunsttranen wordt hyaluronzuur gebruikt omdat het door zijn hydrofiele eigenschappen zeer veel water kan vasthouden en zo de ogen kan beschermen tegen uitdrogen. Reumatologie Hyaluronzuur is een natuurlijk bestanddeel van de extracellulaire matrix van kraakbeen. Het is ook het hoofdbestanddeel van synoviaal vocht (= gewrichtsvocht), dat door de viscositeit zelfs bij hoge drukken niet uit het gewricht weggeperst wordt. Omwille van die reden gebruikt men hyaluronzuur in de reumatologie bij osteoarthrose als 'viscosupplementatie', waarbij men tracht de viscositeit van
11
het synoviaal vocht te herstellen en de extracellulaire matrix van het kraakbeen te voeden en versterken. Dermatologie De hydrofiele (waterbindende) eigenschappen van hyaluronzuur spelen een grote rol in de hydratatie van de huid. Deze rol in de hydratatie en de rol van hyaluronzuur als neutralisator van vrije radicalen maken dat verminderde productie van hyaluronzuur bij het ouder worden in verband wordt gebracht met de degeneratie van de huid op oudere leeftijd. Daarom is hyaluronzuur bestanddeel van veel antirimpelcrèmes. In de cosmetische dermatologie wordt hyaluronzuur ook gebruikt als filler voor het opvullen van rimpels en opspuiten van lippen. Ook op de wondheling heeft hyaluronzuur gunstige effecten en wordt het gebruikt voor de behandeling van chronische wonden. Wat het mechanisme hiervan is, is nog niet gekend, maar wellicht heeft hyaluronzuur invloed op de proliferatie en differentiatie van huidcellen.
12
Materialen en Methoden Deze masterproef is tot stand gekomen in verschillende fases. In een eerste fase werd een oplijsting gemaakt van producten die hyaluronzuur bevatten. Deze lijst werd op basis van een aantal criteria ingekort tot een selectie van zeven producten. In een tweede fase werd de viscositeit van deze geselecteerde producten beoordeeld en werden er op basis van de resultaten van deze test vijf producten weerhouden. In de derde fase werden de overblijvende producten getest op homogeniteit van de celverdeling en viabiliteit van cellen in de suspensie na toevoegen van hyaluronzuur. In een laatste fase werden de resultaten geïnterpreteerd.
1. Hyaluronzuurproducten zoeken Hyaluronzuur kent in de medische wereld zeer veel toepassingen. Daarom was het noodzakelijk om een lijst aan te leggen met hyaluronzuurproducten die geschikt zijn voor humaan gebruik, waarbij het hyaluronzuur als enige werkzame stof van het product vermeld word en waarbij hyaluronzuur verantwoordelijk is voor de viscositeit van het product. In deze lijst werden ook gegevens opgenomen in verband met de aflevervorm, de indicatie(s) waarvoor het product ontwikkeld werd, de concentratie, het totale volume en de oorsprong (dierlijk of bacterieel) van het hyaluronzuur. De producten op deze lijst werden gevonden via Google, Pubmed of Web of Science via de zoektermen 'hyaluronzuur', 'hyaluronic acid', 'hyaluronan' en 'natriumhyaluronaat'. Voor ontbrekende gegevens werd ook via Google naar de bijsluiter van de producten gezocht. Gegevens over beschikbaarheid en prijs van de producten konden niet via internet verkregen worden en daarom werd de database van de ziekenhuisapotheek van het Universitair Ziekenhuis Gent geraadpleegd. Om de lijst verder te verfijnen, werden vervolgens een aantal relevante selectiecriteria gekozen: Afleveringsvorm – enkel producten die beschikbaar zijn in een flacon of injectiespuit werden behouden. Concentratie – enkel producten met een minimumconcentratie van 5 mg/mL hyaluronzuur werden behouden. Prijs – producten die meer dan 60 euro per eenheid kosten werden van de lijst geschrapt, aangezien deze producten voor de patiënt geen prijsreductie geven in vergelijking met het huidige product.
13
Beschikbaarheid – enkel producten die vlot beschikbaar zijn via de ziekenhuisapotheek van het UZ Gent werden behouden. Op basis van deze selectiecriteria werd de oorspronkelijke lijst gereduceerd tot zeven producten. Via de ziekenhuisapotheek werden ook contactgegevens van leveranciers van deze producten verkregen en werd nagevraagd of we staaltjes konden ontvangen om een aantal parameters uit te testen.
2. Viscositeitstesten De eerste parameter die we uitgetest hebben is meteen ook de belangrijkste parameter in de kliniek. Het verhogen van de viscositeit van celsuspensies was immers de reden waarom hyaluronzuur initieel werd toegevoegd aan de celsuspensies bij de behandeling van leukoderma-patiënten. Vooral op gebogen lichaamsoppervlakken zorgt de hogere viscositeit ervoor dat de celsuspensie ter plaatse blijft en niet uit de acceptorzone wegvloeit. In de fysische wetenschappen is viscositeit een materiaaleigenschap die zeer duidelijk omschreven is en op gestandaardiseerde wijze gemeten kan worden, waarbij het meetresultaat wordt uitgedrukt in mPas. In de praktijk echter merken we dat gegevens over de viscositeit van de producten vaak niet terug te vinden zijn in de wetenschappelijke literatuur. Bovendien zijn de artsen en laboranten die betrokken zijn bij de applicatie van epidermale celsuspensies niet vertrouwd met de eenheid mPas. Daarom werd beslist om een meer subjectieve viscositeitstest uit te denken en deze te laten uitvoeren door personen die de klinische bruikbaarheid van het product op vlak van viscositeit goed kunnen inschatten (prof. dr. Hilde Beele, prof. dr. Nanja Van Geel en mevr. Martine De Mil). De test werd echter toch zo opgesteld dat ondanks de subjectiviteit van de test, er ook min of meer objectieve criteria in verband met de viscositeit werden vastgelegd in het protocol (zie protocol 'Viscositeitstesten' in bijlage). Aangezien in de epidermale celsuspensie (zoals aangebracht bij de patiënt), hyaluronzuur wordt toegevoegd aan een celsuspensie van epidermale cellen in fysiologische oplossing, moeten we er rekening mee houden dat het eindproduct minder viskeus zal zijn dan de viscositeit van het originele hyaluronzuurproduct. Om dit te simuleren werden daarom van elk van de uitgeteste producten telkens enkele relevante verdunningen aangemaakt met fysiologische oplossing. Van elk product werd ook getracht om minstens één verdunning dubbel aan te maken, om de homogene verdeling van het hyaluronzuur in een verdunning te kunnen objectiveren (en dus de reproduceerbaarheid beter te kunnen inschatten).
14
Tenslotte werd er ook telkens een kleurstof (standaard vulpeninkt) toegevoegd als hulp voor de visuele interpretatie van de viscositeit en voor de inschatting van de homogeniteit van de gemaakte oplossing. Elk van deze verdunningen werd vervolgens in een gecodeerd insulinespuitjes overgebracht, zodat een blinde beoordeling door de drie waarnemers kon gebeuren. Ieder van de drie waarnemers bracht een druppel van ongeveer 100 µL van de verdunning aan op de handrug en vervolgens werd gedurende één minuut gekeken hoe deze druppel zich gedroeg nadat de hand in verticale positie werd gebracht. Het al dan niet uitlopen van de druppel werd gescoord en eventuele commentaar werd genoteerd. Er werden ook foto's genomen om bij eventuele twijfels op terug te kunnen vallen. Vervolgens werd de hand gereinigd voor het testen van het volgende product. Interpretatie van de visuele scoring: +++
Het product is niet zichtbaar naar omlaag gevloeid
++
Het product is minder dan 1 cm naar omlaag gevloeid
+
Het product is 1-2 cm naar omlaag gevloeid
0
Het product is ongeveer 2 cm naar omlaag gevloeid
-
Het product is 2-3 cm naar omlaag gevloeid
--
Het product is meer dan 3 cm naar omlaag gevloeid, maar is niet van de handrug afgevloeid
---
Het product is van de handrug afgevloeid
Het was de bedoeling om deze test uit te voeren op alle producten die weerhouden werden na de selectie in fase 1. In deze test zijn we echter op drie punten afgeweken hiervan: • Het product 'Ostenil' was niet beschikbaar op het ogenblik van de testen, maar aangezien dit product een gekende verdunning is van het product 'Ostenil plus' kon ook van dit product de viscositeit (weliswaar onrechtstreeks) worden ingeschat. • Het product 'Healon Endocoat' is niet verkrijgbaar via de Ziekenhuisapotheek van het UZ Gent, maar omdat de firma ons ook van dit product staaltjes had bezorgd om uit te testen, werd dit product ook meegenomen in de test. • Na de test leek het voor alle waarnemers opportuun om dezelfde proefopstelling te maken met het product 'Provisc', aangezien dit product reeds klinisch bewezen heeft dat het een geschikte viscositeit bezit. Daarom werd nadien dezelfde proefopstelling gemaakt met de onverdunde en de 1/2 verdunde vorm van dit product. Deze stap gebeurde echter niet blind.
15
3. Homogeniteits- en viabiliteitstesten Voor het effect van de behandeling zijn de parameters homogene verdeling en viabiliteit van de cellen in een celsuspensie zeer belangrijke parameters. Als de viabiliteit van de epidermale cellen vermindert door toevoegen van hyaluronzuur, worden er minder viabele melanocyten aangebracht op de behandelde huidoppervlakte en is er minder kans op repigmentatie van deze zones, maar anderzijds mag de epidermale celsuspensie ook niet toxisch zijn voor fibroblasten (die de ondergrond vormen van de acceptorsite waarop de celsuspensie wordt aangebracht). Als de cellen echter niet homogeen verdeeld zijn over de celsuspensie, ontstaat er een ongelijke verdeling van de melanocyten over de behandelde huidzone(s) na applicatie en krijgt men een eerder vlekkerig aspect van de behandelde zone in plaats van een egale repigmentatie. Om deze twee parameters te onderzoeken waren er drie testen nodig. In de eerste test konden niet alle producten onderzocht worden door onvoorziene materiaalproblemen en hoge viscositeit van bepaalde producten (deze werd onderschat). De tweede test leverde wel bruikbare en deels verrassende resultaten op, waardoor er beslist werd om een aantal aspecten van de test te hernemen in een derde test om de reproduceerbaarheid en het effect van de eerder bekomen resultaten verder te kunnen onderzoeken.
3.1 Aanmaak van test-celsuspensie op basis van fibroblasten Hoewel in de praktijk de applicatie gebeurt met epidermale celsuspensies (keratinocyten en melanocyten), worden voor de testen omtrent de viabiliteit en homogene celverdeling fibroblasten gebruikt. Één van de belangrijkste redenen hiervoor is dat fibroblasten veel eenvoudiger en sneller te kweken zijn dan melanocyten. Bovendien kunnen melanocyten niet in vitro gekweekt worden zonder toevoeging van een tumorpromotor, hierdoor creëert men immers een onnatuurlijke situatie met mogelijks een andere effect op de interactie met het hyaluronzuur (de viabiliteit van tumorcellen is immers anders dan deze van gewone niet-tumorale cellen). Ook problemen omtrent het verkrijgen van een informed consent voor donormateriaal waaruit melanocyten kunnen gekweekt worden, maakt het gebruik van melanocyten moeilijker.
16
Alle cellen voor de homogeniteits- en viabiliteitstesten zijn afkomstig van in vloeibare stikstof ingevroren cellijnen van dezelfde donor (humane fibroblasten nr 23 uit de Medical Research Building Gent). Hiervan werden er 2 cryotubes ontdooid voor de eerste en tweede test (doordat de tweede test slechts één week na de eerste test plaatsvond, konden cellen van dezelfde kweek gebruikt worden). Nadien werd nogmaals één cryotube ontdooid voor de derde test. De ontdooide cellen werden vervolgens gedurende één week in kweek gebracht om voldoende cellen te hebben voor onze testen (zie protocol 'Aanmaken celsuspensie fibroblasten' in bijlage). Vlak voor iedere test werden de fibroblasten geoogst door ze te spoelen met PBS en daarna trypsine toe te voegen aan iedere petrischaal, waardoor de fibroblasten van de petrischaal en van elkaar loskwamen. Na toevoegen van een trypsine-inhibitor wordt de inhoud van iedere petrischaal overgebracht in een falconbuis om ze te centrifugeren gedurende 5 minuten op 1200 rpm (op een kleine hoeveelheid na, die intussen gebruikt zal worden om een celtelling op uit te voeren). Door de centrifuge vormen de fibroblasten een celpellet op de bodem van de falconbuis. Deze celpellet kan vervolgens (na afgieten van het supernatans) opgelost worden in PBS. Het toegevoegde volume PBS is afhankelijk van de hoeveelheid cellen in de celpellet (deze kan ingeschat worden door de celtelling) en de gewenste concentratie (vastgelegd in het testprotocol). Om die testconcentratie te bepalen werd er tijdens de kweekperiode vòòr de testen ook telkens een verdunningsreeks aangemaakt simultaan aan de celkweek, waarbij we de groei van een aantal op voorhand vastgelegde verdunningen van de cellen in een bepaald recipiënt trachten te simuleren. Deze werden vervolgens ook mee in kweek gezet. Zo kon er een idee gevormd worden over de groeisnelheid van de cellen en kon er ingeschat worden hoeveel cellen er dienden uitgezaaid te worden om een relevant celaantal te bekomen op het einde van de effectieve testen. De cellen die niet gebruikt werden voor de test werden verder in kweek gebracht gedurende de rest van de testperiode. Dit werd enerzijds uitgevoerd als een soort controle van de kweekomstandigheden (deze cellen werden in dezelfde incubator geplaatst als de cellen waarop de test gebeurde) en anderzijds als back-up mocht er iets mislopen.
17
3.2 Test 1 Voor de eerste test werd er een protocol opgesteld waarbij de viabiliteit en de homogene verdeling op twee verschillende manieren zou worden getest (zie protocol 'Homogeniteits- en viabiliteitstesten: test 1' in bijlage). 3.2.1 Theoretische achtergrond van het protocol Voor het testen van de homogene celverdeling en viabiliteit van de cellen worden eerst celsuspensies (vanaf nu 'testmonsters' genoemd) aangemaakt door een bepaald volume van de homogene fibroblasten celsuspensie toe te voegen aan ieder hyaluronzuurproduct en controle. Dit wordt in duplo uitgevoerd aangezien het testprotocol twee verschillende testprocedures bevat. Gezien de aflevervolumes niet gelijk zijn voor de verschillende hyaluronzuurproducten, wordt er bij ieder volume aan hyaluronzuurproduct een gelijk volume aan celsuspensie toegevoegd zodat een verdunning 1/2 ontstaat. Daarna worden het testmonster gemengd met behulp van een vortex, om vervolgens gedurende 2 uur te laten rusten. Dit zorgt ervoor dat er voldoende contacttijd is tussen het hyaluronzuur en de cellen, zodat eventuele toxische invloeden zouden kunnen inwerken. Bovenstaande stappen werden bij 2 testmonsters (één hyaluronzuurproduct en één controle) nogmaals herhaald, maar waarbij de 2 uur contacttijd gebeurde onder gekoelde omstandigheden (4°C) in plaats van op kamertemperatuur. Op die manier kan er een inschatting gemaakt worden van de invloed van de omgevingstemperatuur op de viabiliteit van de cellen. Homogene celverdeling - Voor het testen van de homogeniteit van de celverdeling binnen ieder testmonster, wordt het testmonster opgesplitst in gelijke delen en zal na kweek (in een CO 2incubator bij 37°C en 10% CO2) de celverdeling van deze deel-suspensies bepaald worden. Indien de cellen in de celsuspensie homogeen verdeeld zijn, zou iedere well evenveel cellen moeten bevatten en worden bij het oogsten van iedere well evenveel cellen verwacht. Voor deze eerste test werd hiervoor gebruik gemaakt van een 24-well multiwellplaat waarin telkens één druppel (van 40µL) van het testmonster per well wordt aangebracht. Hierna krijgt iedere druppel de kans om open te vloeien en wordt er cultuurmedium voor fibroblasten toegevoegd. Voor een goede beoordeling van de homogeniteit is een voldoende laag celaantal nodig om kleine verschillen in homogeniteit te beoordelen (bij kleine verschillen in homogeniteit zullen er één of meerdere lege wells verwacht worden, terwijl er in andere wells veel cellen aanwezig zijn) en een voldoende hoog celaantal om de invloed van steekproefvariaties bij het tellen minder te laten doorwegen. Op basis van de eerste verdunningsreeks (gelijktijdig met de fibroblastenkweek, voorafgaand aan de test) 18
werd bepaald dat een gemiddelde van 2500 cellen per well van de 24-well multiwellplaat de ideale uitgangspositie is hiervoor. Bij dit celaantal zou er subconfluentie van de well bereikt worden tegen het einde van de test (op dag 5). Om 2500 fibroblasten per well te bekomen dient er gestart te worden met een celsuspensie van 125000 fibroblasten per mL (aangemaakt zoals hierboven beschreven). Viabiliteit - Daarnaast dient ook de viabiliteit van de cellen na contact met hyaluronzuur nagegaan te worden, hiervoor zal het tweede testmonster gebruikt worden. Enerzijds wordt voor deze parameter de toxiciteit van hyaluronzuur op de cellen onderzocht en anderzijds de invloed op de replicatiecapaciteit van de cellen na contact met hyaluronzuur. Om beide elementen te testen werd er enerzijds gebruik gemaakt van de contacttijd van 2 uur waarin er geen handelingen werden uitgevoerd (om op die manier de toxische invloed van het hyaluronzuur op de cellen te laten inwerken) en anderzijds door de fibroblasten na deze contacttijd in kweek te brengen (om ook de regeneratiecapaciteit mee te testen). Hiervoor wordt het testmonster na de contacttijd in een P100 petrischaal overgebracht en wordt er cultuurmedium aan toegevoegd. Deze petrischalen worden vervolgens gedurende 4 dagen in de CO2-incubator geplaatst bij 37°C en 10% CO2, om onder optimale omstandigheden om te kunnen delen. Na de kweek kunnen op de vijfde dag van de test de celaantallen van iedere petrischaal geteld worden en kan vergelijking gebeuren. Ook de twee testmonsters waarvan de 2 uur contacttijd bij 4°C plaatsvond zullen deze procedure doorlopen, zodat enkel de omgevingstemperatuur tijdens de contacttijd verschilt met de andere testmonsters.
3.2.2 Uitvoering van de test Op de eerste dag van de test werd al het nodige materiaal klaargezet, de cellen werden geoogst en een homogene celsuspensie van 125000 cellen per mL werd aangemaakt zoals beschreven in het protocol 'Aanmaken celsuspensie fibroblasten' (zie bijlage). Er werden 14 falconbuizen gelabeld en aan iedere falconbuis werd overeenkomstig een bepaalde hoeveelheid hyaluronzuurproduct of controle toegevoegd. Door de statische lading van de falconbuizen vielen deze producten echter niet in het midden van de bodem van de buis, maar bleven ze aan de wand kleven. De hoge viscositeit van sommige producten maakte ook dat het product daarna niet naar de bodem afvloeide en dus niet de volledige hoeveelheid hyaluronzuur in contact kwam met de celsuspensie.
19
Figuur 1 : Door de statische lading van de falconbuizen werd het hyaluronzuurproduct door de wand aangetrokken. De hoge viscositeit van sommige hyaluronzuurproducten zorgde er bovendien voor dat het product niet naar de bodem afvloeide.
Na 2 uur werd beslist om iedere falconbuis te centrifugeren (met behulp van’short spin’) en zo het hyaluronzuur alsnog in contact te brengen met de cellen. Mogelijks hebben deze extra manipulaties echter een invloed gehad op de viabiliteit van de cellen. Omdat de meest viskeuze producten minder in contact kwamen met de cellen werd beslist om nog 45 minuten toe te voegen aan de contacttijd na de korte centrifugatiestap. Homogene celverdeling - Omwille van de hoge viscositeit en het maximaliseren van de reproduceerbaarheid, werd in het protocol gekozen om met een repeteerpipet te werken. De tips van de repeteerpipet die we ter beschikking hadden, waren echter te kort om het testmonster op de bodem van de falconbuis te kunnen opzuigen en hierdoor waren we genoodzaakt om toch de conventionele pipetten te gebruiken. Bij deze pipetten vloeide het testmonster van sommige producten niet spontaan uit de pipet door hun hoge viscositeit. Dit leidde tot verlies van een deel van het testmonster en tot verlies van strikte reproduceerbaarheid van de druppelgrootte die in iedere well terechtkwam. Bij één van de testmonsters kon het testmonster zelfs niet spontaan uit de pipet vloeien en konden van dit product geen homogeniteitstesten gebeuren. Bij de ander producten konden er wel druppels gevormd worden en werden er zoveel mogelijk wells gevuld (soms konden niet alle 24 wells gevuld worden wegens verlies aan testmonster in de tip van de pipet). De druppelgrootte 40 µL bleek echter een te kleine hoeveelheid te zijn, aangezien bij het controlestaal de druppel reeds volledig verdampt was vooraleer er cultuurmedium kon worden toegevoegd. De testmonsters die wel hyaluronzuur bevatten zijn door de hydrofiele eigenschappen van het product gespaard gebleven van volledige uitdroging. Deze uitdroging van de druppels heeft wellicht een invloed op de viabiliteit van de cellen, waardoor resultaten op een andere manier zullen moeten beoordeeld worden en vergelijking tussen de producten onderling niet kan gebeuren.
20
Viabiliteit - Om toch de viabiliteit te kunnen testen werd bij de tweede reeks testmonsters eerst cultuurmedium toegevoegd om uitdroging te voorkomen. Daarna werd de inhoud van iedere falconbuis volledig overgebracht in een P100 petrischaal die daarna in de incubator werd geplaatst. Door een verschil in startvolume zullen de celaantallen niet gelijk zijn in alle P100 petrischalen (er werd immers gekozen om een verdunning 1/2 te bekomen in plaats van de totale celaantallen gelijk te houden). Bij de celtelling moet hierbij rekening gehouden worden en zal het celaantal uitgedrukt worden in percentage van het beginaantal om vergelijking mogelijk te maken. Volume hyaluronzuur = Volume celsuspensie
Eindvolume testmonster
A
1 mL
2 mL
B
1 mL
2 mL
C
0,85 mL
1,70 mL
D
0,85 mL
1,70 mL
E
0,6 mL
1,20 mL
F
1 mL
2 mL
Bf
2 mL
4 mL
Ff
2 mL
4 mL
Tabel 1: Het volume hyaluronzuur en celsuspensie en het totale volume van ieder testmonster. Deze volumes zijn afhankelijk van het aflevervolume van ieder product
Op dag 5 van de test werden de 24-well platen en de P100 petrischalen uit de incubator gehaald. Door de uitdroging en de extra manipulaties die gebeurd zijn bij de testmonster in de 24-well platen is vergelijking van het celaantal tussen de testmonsters onderling zinloos. Daarom werd er gekozen om in deze platen geen celaantallen te tellen maar in plaats daarvan een visuele scoring van het celaantal uit te voeren bij iedere well. Hierdoor kon de homogene verdeling binnen éénzelfde testmonster toch min of meer beoordeeld worden. De viabiliteit werd beoordeeld door celtelling van de P100 petrischalen van zowel de testmonsters die hun contacttijd op kamertemperatuur hadden als deze met contacttijd in gekoelde omstandigheden (4°C).
21
Celtelling gebeurde door oplossen van de celpellet in PBS, waarna een fractie van de suspensie gemengd werd met een gelijke hoeveelheid trypaanblauw. Hieruit werd driemaal 12 µL overgebracht in een Bürkertelkamer en werden in 25 hokjes de levende en dode cellen geteld. Hieruit werd het totale celaantal berekend van iedere petrischaal en werd er een omrekening gedaan naar percentage van oorspronkelijke celaantal. Het aantal getelde dode cellen geeft echter een vertekend beeld: dode cellen hechten zich niet vast aan de petrischaal waardoor deze reeds weggespoeld zullen worden met het medium tijdens de procedure.
3.3 Test 2 Om de problemen in de eerste test te omzeilen werd een nieuw testprotocol opgesteld (zie protocol 'homogeniteits- en viabiliteitstesten: test 2' in bijlage). 3.3.1 Theoretische achtergrond van het protocol Volgende wijzigingen werden aangebracht aan het nieuwe testprotocol ten opzichte van het protocol uit test 1: − Er werd beslist om in 9 P60 petrischalen te werken, in plaats van in een 24-well plaat. − De viabiliteit en de homogeniteit werd ditmaal samen getest worden aangezien er minder hyaluronzuurproductstaaltjes over zijn na het uitvoeren van de eerste test. − Er werd gebruik gemaakt van kortere proefbuisjes, zodat de tip van de repeteerpipet ditmaal wel tot aan de bodem van de proefbuis kan reiken. − Om problemen met het kleven van het hyaluronzuurproducten aan de wand van de proefbuizen op te lossen zal de hyaluronzuur eerst in de proefbuis worden gedaan en wordt deze daarna gecentrifugeerd. Pas daarna zal de celsuspensie worden toegevoegd aan de proefbuis. Hierdoor zijn er ook minder manipulaties van de cellen voor de contacttijd. − Het celaantal van de celsuspensie werd verdubbeld zodat steekproefvariaties in het tellen minder zullen doorwegen. − De contacttijd wordt verlengd naar 3 à 4 uur en erna zal er ook meteen een deel van het cultuurmedium toegevoegd worden aan de proefbuis, zodat uitdroging van het testmonster voorkomen wordt
22
− Er worden grotere druppels (van 160µL) in iedere P60 petrischaal gedaan, waarna het overige volume cultuurmedium wordt toegevoegd aan iedere petrischaal. − Het testmonster dat overblijft wordt in een P100 petrischaal met cultuurmedium overgebracht, zodat het totaal aantal cellen ook geteld kan worden. Het bekijken van de invloed van de omgevingstemperatuur op de viabiliteit van de cellen als randexperiment blijft ook behouden, maar zal enkel gebeuren met de staaltjes waar we voldoende product van hebben. Het volume van deze testmonsters wordt daarom ook gereduceerd tot 2 mL (zie tabel hieronder).
Volume HA
= Volume celsuspensie
Eindvolume testmonster
A
1 mL
2 mL
B
1 mL
2 mL
C
0,85 mL
1,70 mL
D
0,85 mL
1,70 mL
E
0,6 mL
1,20 mL
F
1 mL
2 mL
Af
1 mL
2 mL
Bf
2 mL
2 mL
Ff
2 mL
2 mL
Tabel 2: Het volume hyaluronzuur en celsuspensie en het totale volume van ieder testmonster gebruikt voor test 2.
Op de vijfde dag van de test worden de petrischalen visueel beoordeeld en binnen eenzelfde product met elkaar vergeleken om een idee te krijgen over de homogeniteit van de celverdeling. Hierna worden de cellen in iedere petrischaal afzonderlijk geoogst en geteld (zoals in test 1). Aangezien de petrischalen een gelijk volume aan testmonster bevatten, is er na deze test voor de P60 platen geen omrekening nodig (naar percentage van het celaantal waarmee gestart werd) om de resultaten tussen de verschillende producten te beoordelen.
23
3.3.2 Uitvoeren van de test Met deze aanpassingen aan het protocol kon deze test zonder grote problemen uitgevoerd worden. Bij 2 P60 petrischalen van product E was er echter schuimvorming bij de applicatie, wellicht door de aanwezigheid van een luchtbel in het testmonster. Bij het interpreteren van deze twee petrischalen dient hiermee rekening gehouden te worden. Bij het tellen van het eerste testmonster werden lage celaantallen gevonden, hierdoor kunnen fouten in de telling en steekproefvariaties een grote invloed hebben op de resultaten. Daarom werd beslist om de celpellets van de overige testmonsters in een lager volume (250 µL in plaats van 500 µL) op te lossen zodat meer cellen geteld kunnen worden. Er werd voor de interpretatie van de resultaten ook gekeken naar de totale celaantallen van alle P60 petrischalen én de P100 petrischaal van ieder product, waardoor er een omrekening moest gebeuren naar percentage van oorspronkelijk celaantal, zodat vergelijking van de resultaten mogelijk zou zijn.
3.4 Test 3 3.4.1 Theoretische achtergrond van het protocol Deze derde test werd uitgevoerd om de reproduceerbaarheid van de resultaten van de vorige test (met name de invloed van de omgevingstemperatuur op de viabiliteit van de cellen) te onderzoeken en dit voor de producten die een goed resultaat leverden in de eerste twee testen. Er werd getracht om
het testprotocol van de tweede poging zoveel mogelijk over te nemen en slechts op enkele
punten wijzigingen door te voeren. Aangezien er voor deze derde test opnieuw cellen ontdooid werden, werd er simultaan met de celkweek een nieuwe verdunningsreeks aangemaakt om een celaantal te vinden waarbij de cellen na 4 dagen subconfluentie bereiken in een well van een 6-well plaat. Deze verdunningsreeks gaf een ideaal celaantal van 75.000 cellen per well, wat neer komt op ongeveer 500.000 cellen per mL celsuspensie. Gezien in deze test de invloed van de temperatuur een belangrijke bijkomende parameter is om te onderzoeken, werden nu van àlle deelnemende hyaluronzuurproducten (en controle) twee testmonsters aangemaakt waarbij bij het ene testmonster de contacttijd zal plaatsvinden op kamertemperatuur en waarbij de contacttijd van het andere testmonster onder gekoelde omstandigheden (4°C) zal gebeuren. 24
Voor deze derde test was de repeteerpipet niet meer beschikbaar waardoor er terug gewerkt werd met een conventionele pipet, maar door de wijzigingen die aan het protocol zijn aangebracht sinds de eerste test werden hierdoor toch geen problemen verwacht. Om te vermijden dat er eerst omgerekend dient te worden vooraleer de resultaten vergeleken kunnen worden, werd er beslist om niet meer een 1/2 verhouding na te streven tussen het hyaluronzuurproduct en de toegevoegde celsuspensie, maar aan ieder hyaluronzuurproduct (onafhankelijk van het volume) steeds hetzelfde volume aan celsuspensie (1 mL) toe te voegen.
3.4.2 Uitvoeren van de test Het uitvoeren van de test liep volledig zoals beschreven in het protocol (op een rekenfout in de celtelling na, maar dit heeft geen repercussies op de vergelijking van de celaantallen tussen en binnen de verschillende testmonsters). Tijdens de test werd er opgemerkt dat er bij één product verschillen zichtbaar waren in de viscositeit van de inhoud van de verschillende wells van hetzelfde testmonster (zowel bij de contacttijd op kamertemperatuur als de contacttijd onder gekoelde omstandigheden), hierdoor kon visueel reeds aangetoond worden dat er geen homogene verdeling was van het hyaluronzuur over het testmonster.
4. Interpretatie van resultaten Interpretatie van de resultaten gebeurde aan de hand van de vergelijking met het oorspronkelijke celaantal (althans het theoretische celaantal dat ieder recipiënt zou bevatten, indien de cellen homogeen over het testmonster verdeeld zijn). Berekeningen en grafische voorstelling van de resultaten gebeurden met het rekenblad 'LibreOffice Calc'. Er werden geen statistische tests uitgevoerd, gezien de kleine steekproefaantallen en de grote variatie tussen de testen.
25
Resultaten 1. Hyaluronzuurproducten selecteren In een eerste fase werden via Pubmed, Web of Science en Google zoveel mogelijk hyaluronzuurproducten voor medisch gebruik opgezocht, dit leverde een lijst op van een honderdtal producten. Deze producten werden vervolgens vergeleken met de database van de ziekenhuisapotheek van het UZ Gent. Slechts een kleine fractie van de producten bleek beschikbaar te zijn. Deze staan in onderstaande lijst (tabel 3), waarin ook gegevens vermeld staan over de firma, afleveringsvorm en volume, hoeveelheid hyaluronzuur, indicatie waarvoor het product gebruikt wordt en de prijs.
Hyaluronzuurproducten beschikbaar via de ziekenhuisapotheek UZ Gent Naam
Firma
Vorm & volume
Hoeveelheid
Indicatie
Prijs
Adant
Tramedico BV
Injectiespuit 2,5mL
25 mg HA
Reumatologie
23,32€
Durolane
Smith & Nephew healthcare Injectiespuit 3 mL
60 mg HA
Reumatologie
159,53€
BV Healon
Abbott Medical Optics
Injectiespuit 0,55 mL 5,5 mg HA
Oogheelkunde
38,30€
Healon5
Abbott Medical Optics
Injectiespuit 0,6 mL
13,8 mg HA
Oogheelkunde
47,97€
HealonGV
Abbott Medical Optics
Injectiespuit 0,85 mL 11,9 mg HA
Oogheelkunde
47,97€
Hyalase
Chauvin Bausch & Lomb
Oogdruppels 10 mL
24 mg HA
Oogheelkunde
17,00€
Hyalobarrier
Nordic Pharma
Flacon 10 mL
400 mg HA
Gynecologie
157,00€
Jaloplast
FidiaPharmaceutici
Gel/crème
0,20% HA
Wondzorg
8,08€
Ostenil
TRB Chemedica
Injectiespuit 1 mL
10 mg HA
Reumatologie
16,85€
Injectiespuit 2 mL
20 mg HA
26,50€
Ostenil plus
TRB Chemedica
Injectiespuit 1 mL
20 mg HA
Reumatologie
53,00€
Synvisc
Genzyme corporation
Injectiespuit 10 mL
48 mg hylan
Reumatologie
108,12€
Viscoseal
TRB Chemedica
Flacon 10 mL
20 mg HA
Reumatologie
44,46€
Tabel 3: Lijst van hyaluronzuurproducten (en hun kenmerken) die te verkrijgen zijn via de ziekenhuisapotheek van het UZ Gent. De producten die in het grijs aangeduid staan voldoen aan alle vooropgestelde selectiecriteria (afleveringsvorm: flacon of injectiespuit; minimumconcentratie van 5 mg/mL HA en prijs < 60€)
De lijst werd vervolgens verder gereduceerd op basis van criteria omtrent afleveringsvorm, concentratie en prijs. Omwille van zowel de afleveringsvorm als de concentratie kwamen de producten 'Hyalase' en 'Jaloplast' niet meer in aanmerking voor onze toepassing. Ook de producten 'Durolane', 'Hyalobarrier' en 'Synvisc' werden niet weerhouden, omwille van de hoge kostprijs. De overige zeven producten (in het grijs aangeduid op tabel 3) voldeden wel aan alle vooropgestelde selectiecriteria en werden wel behouden. 26
2. Viscositeitstesten De viscositeit werd subjectief gescoord op basis van het openvloeien van een druppel op de hand. In onderstaande tabel zijn de resultaten hiervan weergegeven per product, waarnemer en verdunning. Resultaten van de viscositeitstesten Niet verdund Provisc 1 Adant
Ostenil plus
Viscoseal
Healon
HealonGV
Healon Endocoat
Healon5
Verdund tot 3/4
Verdund tot 1/2
HB
+++
NVT
MDM
++
HB
---
--
---
NVG
0
---
---
MDM
-
---
---
-
---
+
---
NVT
NVT
+
NVT
HB
+++
NVG
+++
+
MDM
+++
+
HB
---
NVG
---
MDM
---
HB
+
NVG
++
MDM
+++
HB
+++
NVG
NVT
Verdund tot 1/4
NVT
NVT
NVT
NVT
NVT
NVT
NVT
++
++
+++
+++
+++
MDM
+++
++
++
HB
+++
--
--
NVG
+++
--
++
MDM
+++
0
-
HB
+++
+++
+++
+++
++
NVG
+++
+++
+++
++
-
MDM
+++
+++
+++
++
+
NVT
NVT
NVT
Tabel 4: Subjectieve scoring van de viscositeit door drie verschillende waarnemers (HB, NVG en MDM) 1 minuut na uitvloeien van een druppel van 100 µL op de handrug in verticale positie. Interpretatie van de resultaten: +++: het product is niet zichtbaar naar omlaag gevloeid; ++: het product is minder dan 1 cm omlaag gevloeid; +: het product is 1-2 cm omlaag gevloeid; 0: het product is ongeveer 2 cm omlaag gevloeid; - : het product is 2-3 cm omlaag gevloeid; -- : het product is verder dan 3 cm omlaag gevloeid, maar is niet volledig van de hand afgevloeid; --- : het product is van de handrug afgevloeid. Van ieder product werd de onverdunde vorm en eventueel relevante verdunningen beoordeeld. Enkele verdunningen werden dubbel aangemaakt om de reproduceerbaarheid van de viscositeit van hyaluronzuur in een verdunning te kunnen inschatten. 1
Het product 'Provisc' maakt geen deel uit van deze test, maar kan wel gebruikt worden om de klinische relevantie van resultaten te
beoordelen.
27
Gezien het product 'Provisc' in de praktijk een geschikte viscositeit heeft, worden de resultaten vergeleken met dit product. Rond deze resultaten wordt er een nog een marge gehanteerd (omdat de resultaten afkomstig zijn van slechts één steekproef), daardoor wordt de grens gelegd op maximaal 2 cm naar beneden vloeien (score 0) voor het onverdunde product en maximaal 3 cm (score -) voor de verdunningen tot 1/2. De producten 'Adant' en 'Viscoseal' werden op basis van deze grenswaarden uitgesloten van verdere testen, omdat deze producten zelfs in de onverdunde vorm niet aan de viscositeitsvereisten voldoen. Bij het product Healon Endocoat werd er een grote variatie opgemerkt in de viscositeit van de verdunning (wat kan wijzen op een inconsistente verdeling van het product in een oplossing) en waren er delen van de verdunning waarbij de viscositeit niet voldeed aan de vereisten (het product liep soms meer dan 3 cm naar beneden). Bovendien is dit product niet beschikbaar via de ziekenhuisapotheek. Daarom werd ook dit product uitgesloten van volgende testen. Twee producten (HealonGV en Healon5) werden door de waarnemers in de onverdunde vorm beschouwd als 'te viskeus', maar aangezien bij de verdunningen deze commentaar niet werd herhaald (en er in de kliniek telkens met verdunningen zal worden gewerkt), werd dit niet beschouwd als een exclusiecriterium en werden deze producten toch behouden voor verdere testen.
3. Homogeniteits- en viabiliteitstesten Vanaf hier zijn alle hyaluronzuurproducten (en controle) gecodeerd met een letter tussen A en F. Dit om een meer overzichtelijke en objectievere beoordeling te kunnen maken van de resultaten. Het bijbehorende product bij iedere letter vindt men terug in de tabel hieronder:
A
Ostenil plus
B
Ostenil
C
Healon
D
HealonGV
E
Healon5
F
Controle: PBS
Tabel 5: Codering van de hyaluronzuurproducten
28
3.1 Test 1 3.1.1 Interpretatie van de 24-wellplaten Voor de beoordeling van de homogene celverdeling werd gekozen om een visuele score toe te kennen aan het geobserveerde celaantal van iedere well van de 24-well multiwellplaten (zie tabel 6). Deze score kan gebruikt worden om onderlinge vergelijkingen te doen binnen éénzelfde testmonster. Vergelijken tussen verschillende testmonsters is niet zinvol gezien in deze test de homogene verdeling binnen éénzelfde testmonster dient aan het licht te brengen en er bovendien teveel externe factoren een rol spelen bij de viabiliteit van de cellen (zie eerder: vb. extra manipulaties, uitdroging, ...). Door de hoge viscositeit van product E was het niet mogelijk om de homogeniteitstest uit te voeren voor dit product (zie eerder), hierdoor zijn er over dit product ook geen resultaten beschikbaar.
Visuele interpretatie celaantallen per well van de 24-well multiwellplaat A B 3
C D
d
0
0
b
a
a
0
a
a
a
a
b
0
b
b3
/2
/2
0
b3
b
/2
b
0
b
c
e
e
e
d
d
e
d
d
d
0
d
e
d
d
d
c
b
d
b
b
b
b
d
b
b
b
b
a
a
a
a
a
a
b
a
b
a
a
b
a
b
b
a
a
a
a
a
a
0
/
2
2
2
a
0
0
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
E1 F
a
0
/
2
/
/
/
2
/
2
/
2
2
/2
b
b
/
NVT b
0
0
0
a
a
a
a
0
0
a
0
a
a
b
b
b
b
b
Tabel 6: Visuele interpretatie van de celaantallen van iedere well van de 24-well multiwellplaat. a: <10 cellen b: 10-20 cellen; c: 20-50 cellen; d: 50-100 cellen; e: > 100 cellen 1
Van product E konden geen resultaten bekomen worden.
2
Door verlies van testmonster in de tip van de pipet konden sommige wells niet gevuld worden.
3
Bij enkele wells bij product A en bij alle wells van product C waren er veel losse (dode) cellen aanwezig.
Bij vergelijking van de wells binnen ieder product is er veel variatie op te merken (vooral bij producten A en B). De variatie kan veroorzaakt worden door drie factoren: 1) variaties in de homogeniteit van de start-celsuspensie 2) variaties in druppelgrootte aangebracht in iedere well (gezien geen gebruik kon gemaakt worden van de (nauwkeurigere) repeteerpipet) 3) geen homogene verdeling van de cellen in het testmonster
29
Enkel deze laatste factor is van belang voor dit onderzoek naar de homogene celverdeling. Echter het relatieve aandeel van elk van deze factoren is echter niet gekend, maar de eerste twee factoren zijn gemeenschappelijk bij alle testmonsters. Vergelijking met het controlestaal zou de invloed van deze eerste twee factoren dus in kaart kunnen brengen, maar aangezien het controlestaal (staal F) volledig uitgedroogd was kunnen de resultaten van de controle niet gebruikt worden en kan er hier geen uitsluitsel gedaan worden over invloed van hyaluronzuur op de homogene celverdeling.
3.1.2 Interpretatie van de P100 petrischalen Door het nastreven van de verhouding 1/2 bij deze testen zijn er verschillen in volume (en dus ook celaantal) tussen de verschillende petrischalen. Daarom werd per petrischaal het celaantal uitgerekend en daarna verrekend in functie van het celaantal waarmee gestart is (zie tabel 7).
Interpretatie petrischalen op basis van celtelling Telling 1 A B C D
E
F Bf
1
Ff
1
Telling 2
Telling 3
Gemiddelde
Levend
165000
66%
133000
53%
127000
50%
141666
56%
Dood
6000
2%
7000
2%
8000
3%
7000
2%
Levend
261000
104%
278000
111%
217000
86%
252000
100%
Dood
29000
11%
18000
7%
34000
13%
27000
10%
Levend
15400
72%
153000
72%
155000
72%
154000
72%
Dood
29000
13%
6000
2%
9000
4%
14655
6%
Levend
53000
24%
35000
16%
41000
19%
43000
20%
Dood
22000
10%
12000
5%
17000
8%
16666
7%
Levend
0
0%
0
0%
0
0%
0
0%
Dood
6000
4%
8000
5%
8000
5%
7333
4%
Levend
117000
46%
93000
37%
95000
38%
101666
40%
Dood
16000
6%
12000
4%
2000
<1%
10000
4%
Levend
426000
85%
404000
80%
403000
80%
411000
82%
Dood
26000
5%
22000
4%
2000
<1%
16666
3%
Levend
69000
13%
52000
10%
51000
10%
57333
11%
Dood
43000
8%
23000
4%
33000
4%
33000
6%
Tabel 7: Berekening celaantal per petrischaal (links) en omgerekend naar percentage van startaantal (rechts), na celtelling levenddood in een Bürkertelkamer. 1
producten Bf en Ff zijn dezelfde producten als B en F, maar waarbij de contacttijd gebeurde onder gekoelde omstandigheden (4°C)
in plaats van op kamertemperatuur (25°C).
30
De celaantallen vertonen grote verschillen, waarbij er zelfs 3 testmonsters (A, B en C) zijn die een hogere viabiliteit vertonen dan de controle, terwijl er ook 2 testmonsters (D en E) zijn waarbij de viabiliteit lager is. Ook bij contacttijd onder gekoelde omstandigheden zijn de testmonsters met hyaluronzuur zijn meer viabel dan die van de controle. Er is geen duidelijke reden waarom bepaalde testmonsters meer viabel zijn dan bij de controle. Mogelijks heeft hyaluronzuur een positief effect heeft op de regeneratiecapaciteit van de cellen. Anderzijds kan het ook zijn dat er een beschermend effect is opgetreden door de viscositeit van het hyaluronzuur tijdens de vele manipulaties in deze test. Als men de resultaten uitzet volgens viscositeit van ieder product (zie figuur 3), is er een trend te zien bij de testmonsters die wel hyaluronzuur bevatten: hoe lager de viscositeit van het product, hoe hoger de viabiliteit van de cellen. Het controle testmonster (die nochtans de laagste viscositeit heeft) volgt deze trend echter niet.
120 100 80 levend dood
60 40 20 0 A
B
C
D
E
F
Bf
Ff
Figuur 2: Berekend celaantal (in percentage van het startaantal) na celtelling levend-dood in een Bürkertelkamer; de balkjes van de grafiek staan in alfanumerieke volgorde. 1
producten Bf en Ff zijn dezelfde producten als B en F, maar waarbij de contacttijd gebeurde onder gekoelde
omstandigheden (4°C) in plaats van op kamertemperatuur (25°C)
31
120 100 80 60 40 20 0 F
B
C
A
D
E
Figuur 3: Berekend celaantal levende cellen van de testmonsters met contacttijd op kamertemperatuur (in percentage van het startaantal) na celtelling levend-dood in een Bürkertelkamer; de balkjes van de grafiek staan in volgorde van viscositeit (links minder viskeus dan rechts).
3.2 Test 2 3.2.1 Visuele beoordeling van de homogeniteit van de celverdeling Visueel werden er in bijna alle petrischalen talrijke fibroblasten aangetroffen (zie tabel 8). Deze fibroblasten kwamen voor in clusters die verspreid lagen over de ganse petrischaal. De enige uitzonderingen hierop zijn 2 petrischalen van product E waar er schuimvorming was bij de applicatie, de overige petrischalen bevatten wel talrijke fibroblasten. Ook bij product D zijn er petrischalen die opmerkelijk minder cellen bevatten, de reden hiervoor is onduidelijk en kan mogelijks betekenen dat de cellen niet homogeen verdeeld waren over het testmonster. Dit betekent ook dat voor de overige producten de cellen zich wel homogeen genoeg verdeeld hebben over het testmonster zodat er in iedere druppel (en dus in iedere well) talrijke cellen aanwezig waren. Dit is zowel bij contacttijd op kamertemperatuur (24,5°C) als onder gekoelde omstandigheden (4°C) het geval. Binnen éénzelfde testmonster waren er wel lichte visuele verschillen in celaantallen (zie tabel 8 en 9) maar globaal gezien lagen de resultaten dicht bijeen.
32
Visuele beoordeling P60 en P100 petrischalen met contacttijd op kamertemperatuur (24,5°C) P60 1
P60 2 P60 3 P60 4 P60 5 P60 6 P60 7 P60 8 P60 9 P100 1
A
Veel cellen, in grote eilandjes
0
0
0
0
+
0
+
-
Weinig cellen, witte waas
B
Minder cellen dan A
0
+
0
0
+
0
-
+
Witte waas, toch veel cellen
Weinig cellen
+
0
0
+
0
0
+
0
Witte waas, toch veel cellen
Veel cellen, minder gegroepeerd
0
0
--- 3
-
0
-
-
-- 3
E
Cellen, maar minder dan bij D
+
-
--- 2
--- 2
0
-
0
-
Grote groep centraal, verder weinig cellen
F
Weinig cellen
0
0
0
0
0
-
0
0
Subconfluent
C D
Veel cellen
Tabel 8: Visuele beoordeling van de petrischalen van testmonsters met contacttijd op kamertemperatuur (24,5 °C). De P60 petrischalen werden beoordeeld ten opzichte van de eerste petrischaal (P60 1) van ieder product: 0 = gelijkaardig celaantal; + = hoger celaantal; - lager celaantal. 1
Bij de grote P100 petrischalen van product A, B en C is er een onverklaarde witte waas te zien.
2
Bij de P60 petrischalen 4 en 5 van product E was er schuimvorming van de druppel bij het aanbrengen.
3
Bij de P60 petrischalen van product D waren er petrischalen met zeer weinig of quasi geen fibroblasten.
Visuele beoordeling P60 en P100 petrischalen met contacttijd onder gekoelde omstandigheden (4 °C) P60 1
P60 2 P60 3 P60 4 P60 5 P60 6 P60 7 P60 8 P60 9 P100
Af
Veel cellen, minder dan bij A
-
-
+
0
0
-
-
+
Veel cellen, minder dan bij A
Bf
Indruk van weinig cellen door groepering
0
0
0
0
-
-
0
0
Veel cellen, maar nog niet (sub)confluent
Weinig cellen, in groepjes
0
0
0
-1
0
0
0
-
Subconfluent
Ff
Tabel 9: Visuele beoordeling van de petrischalen van testmonsters met contacttijd onder gekoelde omstandigheden (4°C). De P60 petrischalen werden beoordeeld ten opzichte van de eerste petrischaal (P60 1) van ieder product: 0 = gelijkaardig celaantal; + = hoger celaantal; - lager celaantal. 1
Bij één P60 petrischaal van product Ff is er een onverklaarde witte waas te zien.
Bij de P100 petrischalen van producten A, B en C en bij één P60 petrischaal van product Ff werd er een witte waas aangetroffen, de oorzaak hiervan is onduidelijk maar contaminatie kan hier niet uitgesloten worden. Dit kan mogelijks een effect hebben gehad op de cellen.
33
3.2.2 Celtelling Het aantal cellen die geteld werden in de Bürkertelkamer zijn zeer lage getallen (zie bijlage). Hierdoor kan een telfout of steekproefvariaties in de celtelling een grote invloed hebben op de interpretatie van de resultaten. Dit maakt dat de celtelling van één petrischaal op zich niet veel waarde heeft en dat beoordeling dient te gebeuren op basis van globale resultaten, vb. som van de celaantallen (zie tabel 10). Resultaten celtelling P60 en P100 petrischalen in percentage van startaantal A Celaantal P60
1
Celaantal P100 Totaal
2
3
B
C
D
E
F
Af
Bf
Ff
311%
383%
277%
627%
405%
533%
822%
722%
933%
35%
394%
595%
344%
63%
555%
108%
604%
608%
134%
390%
461%
465%
268%
547%
365%
646%
726%
Tabel 10: Celaantallen per petrischaal zoals berekend in percentage van het (theoretische) startaantal. 1
Gemiddelde van de resultaten van de P60 petrischalen
2
Gemiddelde van de resultaten van de 3 tellingen van de P100 petrischaal
3
Totale celaantal (P60 en P100 petrischalen)
Opmerkelijk bij de interpretatie van deze tabel is dat de celaantallen van de testmonsters met contacttijd onder gekoelde omstandigheden bij alle resultaten (zowel die van de P60 petrischalen als die van de P100 petrischaal als het totaal celaantal) hoger liggen dan de celaantallen van de testmonsters met contacttijd op kamertemperatuur (zie tabel 10 en figuur 4). Mogelijks heeft de temperatuur dus een effect op de viabiliteit van de cellen.
1000 900 800 700 600
Celaantal P60 Celaantal P100 Totaal celaantal
500 400 300 200 100 0 A
B
C
D
E
F
Af
Bf
Ff
Figuur 4: Grafische weergave van het celaantal in iedere petrischaal, in percentage van het celaantal aan begin van de test.
34
Ook opmerkelijk is dat bij testmonsters A, E en Af, er zeer grote verschillen zijn tussen de P60 petrischalen en de P100 petrischaal, waarbij de resultaten van de P100 schaal zelfs meer dan 70% lager liggen dan deze van de P60 schaal (zie tabel 10 en figuur 4). Men kan zelfs opmerken dat de resultaten niet of nauwelijks boven het theoretische startaantal komen, terwijl men bij de P60 petrischalen net hoge aantallen ziet. Dit wijst op een onaanvaardbaar verschil in homogene verdeling van de cellen in het testmonster. De overige resultaten zijn vergelijkbaar met elkaar. Hierbij is het totale celaantal van C en D beter dan bij B, maar er is een grotere homogeniteit in de resultaten van B. Deze drie producten worden meegenomen naar de volgende test.
3.3 Test 3 Resultaten celtelling 6 well multiwellplaat B
Bf
Telling 1
30
Telling 2
1
C
Cf
6
15
25
25
Telling 3
35
Telling 4 Telling 5 Telling 6 Gemiddelde % Mediaan %
2
2
Standaarddeviatie
3
1
D
Df
27
15
20
1
13
16
24
10
40
1
1
F
Ff
90
15
8
4
30
11
21
19
7
12
23
19
22
4
16
11
30
5
11
26
14
20
24
9
17
25
15
13
10
9
30
7
10
248 %
111 %
155 %
104 %
98 %
273 %
131 %
111 %
229 %
95 %
150 %
100 %
100 %
225 %
108 %
112 %
54%
53%
40%
80%
50%
243%
74%
54%
Tabel 11: Aantal cellen zoals geteld bij de celtelling van de 6 well-multiwelplaat in 25 hokjes van een Bürkertelkamer. 1
Het testmonster Xf is hetzelfde testmonster als X maar waarbij de contacttijd plaatsvond onder gekoelde omstandigheden.
2
Gemiddelde of mediaan van de 6 celtellingen, uitgedrukt in % ten opzichte van het start-celaantal.
3
Standaarddeviatie uitgedrukt in % ten opzichte van het start-celaantal.
Als men de waarden van de celtelling in de tabel bekijkt, valt op dat er bij sommige producten veel variatie zit tussen de resultaten van de tellingen van éénzelfde testmonster onderling (zie standaarddeviatie in tabel 11 en figuur 5). Net zoals in de vorige test zijn deze getelde aantallen kleine getallen en dient men er rekening mee te houden dat de verschillen mogelijks het gevolg kunnen zijn van steekproefvariaties of fouten in de celtelling en dus niet meteen betekenen dat de cellen niet homogeen verdeeld zijn over de celsuspensie. Gezien de verschillen gelijkaardig zijn in de controle testmonsters (behalve voor testmonster Df) gaat men ervan uit dat de verschillen inderdaad voornamelijk veroorzaakt zijn door steekproefvariaties of fouten in de celtelling. De testmonsters D en Df vertoonden visueel ook reeds grote verschillen in homogeniteit, waarbij verschillen in viscositeit opvielen tijdens het uitvoeren van de test (zie Materialen en methoden). 35
De celaantallen op het einde van deze test bevinden zich in de buurt van de celaantallen waarmee men de test begonnen is (zie tabel 11 en figuur 6). Dit was anders bij de vorige twee testen waarbij er steeds een hoger celaantal was op het einde van de testen. Dit verschil in resultaten is te wijten aan de kortere duur van de test (4 in plaats van 5 dagen).
300 250 200 150 100 50 0 B
Bf
C
Cf
D
Df
F
Ff
Figuur 5: Standaarddeviatie in % van oorspronkelijke celaantal, als merker voor de homogeniteit van de celverdeling in het testmonster.
Omdat er bij de celtelling een aantal uitschieters opvielen die veel invloed zouden kunnen hebben op het gemiddelde celaantal (zoals bij de telling van Df, waarbij telling 1 minstens 3x hoger ligt dan de overige tellingen van hetzelfde testmonster), werd niet alleen gekeken naar het gemiddelde celaantal maar werd er ook rekening gehouden met de mediaan (zie tabel 11 en figuur 6). We zien echter niet veel verschillen tussen dit gemiddelde en de mediaan, waardoor besloten kan worden dat de extreme waarden wellicht niet veel invloed hebben gehad op het eindresultaat.
300 250 200 mediaan gemiddelde
150 100 50 0 B
Bf
C
Cf
D
Df
F
Ff
Figuur 6: Grafische voorstelling van het gemiddelde en de mediaan, uitgedrukt in % ten opzichten van het oorspronkelijke celaantal.
36
De invloed van de temperatuur op de viabiliteit, die gezien werden bij de tweede test (waarbij de testmonsters met contacttijd onder gekoelde omstandigheden het beter deden dan de testmonster die contacttijd hadden op kamertemperatuur) werd in deze test niet bevestigd. Verder ziet men dat de resultaten bijna allemaal in dezelfde grootteorde liggen als het controle testmonster, op de resultaten van B, C en D f na. De reden voor deze drie hogere resultaten is niet meteen duidelijk maar kan mogelijks nog te wijten zijn aan steekproefvariaties.
37
Discussie Parameters In deze masterproef werd de klinische geschiktheid van de hyaluronzuurproducten herleid tot de parameters 'viscositeit', 'homogene celverdeling' en 'viabiliteit van de cellen'. Voor deze drie parameters werden testen ontwikkeld die dicht aanleunden bij de procedure die men momenteel gebruikt voor de applicatie van epidermale celsuspensies (zie Inleiding), zodat de interpretatie van de resultaten steeds beoordeeld kan worden in functie van de klinische geschiktheid. Op basis van deze testen zijn er twee producten (Ostenil en Healon) die goede resultaten geven op elk van deze parameters. De overige producten scoorden minder goed op één van deze parameters: voor de producten 'Adant', 'Viscoseal' en 'Healon Endocoat' was dit door de lage viscositeit en voor de producten 'Ostenil plus', 'HealonGV' en 'Healon5' was er geen homogene celverdeling of voldeed de viabiliteit van de cellen niet aan de vereisten. De kostprijs werd hierbij niet als parameter gebruikt, omdat deze reeds werd meegenomen in de selectiecriteria van de producten. Er is echter een aanzienlijk prijsverschil tussen de twee resterende producten (16,85 € tegenover 38,60 €) terwijl beide producten in de testen gelijkaardige resultaten vertonen. Kleinschaligheid van de experimenten Alle testen uitgevoerd voor deze masterproef zijn kleinschalige experimenten; voor iedere test slechts één staaltje van ieder product werd gebruikt (of twee, bij gelijktijdige testen onder gekoelde omstandigheden).
Er
werden
echter
wel
zorgvuldige
maatregelen
genomen
om
de
reproduceerbaarheid te verhogen (interpretatie door meerdere waarnemers, opsplitsing en celtelling in meerdere recipiënten, ...). Wijzigingen aan het testprotocol Ondanks het zorgvuldig opstellen en meermaals evalueren van het testprotocol door verschillende personen, zijn er bij iedere test zaken opgedoken waar er op voorhand te weinig rekening werd mee gehouden. Daarom werden na iedere test het testprotocol opnieuw geëvalueerd en herwerkt. Echter, hierdoor zijn de testen teveel verschillend van elkaar dat er geen vergelijking kan gebeuren tussen de resultaten van de testen onderling.
38
Hyaluronzuur In deze masterproef werden enkel producten uitgetest op basis van hyaluronzuur. Naar de toekomst toe kunnen er ook andere (kosteneffectievere) producten gezocht worden die ook voldoen aan dezelfde kwaliteitsvereisten op vlak van viscositeit, homogene celverdeling en viabiliteit van de cellen. Fibroblasten De testen werden allemaal uitgevoerd met celsuspensies op basis van fibroblasten. De fibroblast is echter geen epidermale cel (maar heeft wel gelijkaardige eigenschappen op vlak van toxiciteit door schadelijke agentia). Naar de toekomst toe is het daarom wenselijk dat er nieuwe testen uitgevoerd worden, met epidermale celsuspensies (keratinocyten en melanocyten). Viscositeit In de eerste homogeniteits- en viabiliteitstest werd een trend gezien waarbij er mogelijks een verband was tussen de viabiliteit van de cellen en de viscositeit van het hyaluronzuurproduct. Bij de testmonsters waarbij er hyaluronzuur werd toegevoegd zag men een hogere viabiliteit bij producten waarbij de viscositeit lager was. Deze trend werd bij de tweede en derde test niet bevestigd. Bij de eerste test zijn er echter meer manipulaties uitgevoerd die een invloed kunnen hebben op de viabiliteit (centrifugeren, vortexen, pipetteren, ...) dan bij de volgende testen. Mogelijks heeft toevoeging van hyaluronzuur met een lage viscositeit een beschermend effect gehad bij deze blootstelling aan manipulaties. Temperatuur In de tweede homogeniteits- en viscositeitstest werd er een trend gezien waarbij de testmonsters met contacttijd onder gekoelde omstandigheden een hogere viabiliteit vertonen dan dezelfde testmonsters met contacttijd op kamertemperatuur. Om deze temperatuursinvloed verder te onderzoeken werd een derde test gedaan waarbij van alle geteste producten zowel een testmonster werd aangemaakt met contacttijd op kamertemperatuur als onder gekoelde omstandigheden. De trend werd echter in deze derde test niet bevestigd en als men terugkijkt naar de resultaten van de eerste test is er ook hier geen evidentie dat er bij testmonsters met contacttijd onder gekoelde omstandigheden een betere viabiliteit is dan bij contacttijd op kamertemperatuur. De testomstandigheden waren echter verschillend in elk van deze drie experimenten (zie bijlage) en mogelijks hebben externe factoren een rol gespeeld bij het verschil in viabiliteit tussen de testmonsters met contacttijd op kamertemperatuur en deze met contacttijd onder gekoelde omstandigheden. Dit dient nog verder onderzocht te worden.
39
Referenties [1] van Geel N, Ongenae K, De Mil M, Naeyaert JM. Modified technique of autologous noncultured epidermal cell transplantation for repigmenting vitiligo: a pilot study. DERMATOLOGIC SURGERY 2001;27(10):873-6 [2] Universitair Ziekenhuis Gent: Weefselbank. Online 2012. opgehaald op 29 oktober 2012, van http://www.uzgent.be/wps/wcm/connect/nl/web/zorg/patienten/diensten/Weefselbank/Weefselbank. [3] Sillevis Smitt J.H., van Everdingen J.J.E., Starink Th.M., van der Horst H.E. Dermatovenereologie voor de eerste lijn. 8th edition. Bohn Stafleu van Loghum, 2009. [4] Ongenae K, Van Geel N, De Schepper S, Naeyaert JM. Effect of vitiligo on self-reported health-related quality of life. BRITISH JOURNAL DERMATOLOGY 2005;152(6):1165-72 [5] Budania A, Parsad D, Kanwar AJ, Dogra S. Comparison between autologous noncultured epidermal cell suspension and suction blister epidermal grafting in stable vitiligo: a randomized study. BRITISH JOURNAL OF DERMATOLOGY 2012;167(6):1295-301 [6] Njoo MD, Westerhof W, Bos JD, Bossuyt PM. A systematic review of autologous transplantation methods in vitiligo. ARCHIVES OF DERMATOLOGY 1998;134(12):1543-9 [7] Majid I, Imran S. Ultrathin split-thickness skin grafting followed by narrowband UVB therapy for stable vitiligo: an effective and cosmetically satisfying treatment option. INDIAN JOURNAL OF DERMATOLOGY, VENEREOLOGY AND LEPROLOGY 2012;78(2):159-64 [8] McGovern TW, Bolognia J, Leffell DJ. Flip-top pigment transplantation: a novel transplantation procedure for the treatment of depigmentation. ARCHIVES OF DERMATOLOGY 1999;135:1305–7 [9] Patel NS, Paghdal KV, Cohen GF. Advanced treatment modalities for vitiligo. DERMATOLOGIC SURGERY 2012;38(3):381-91 [10] Holla AP, Kumar R, Parsad D, Kanwar A. Modified Procedure of Noncultured Epidermal Suspension Transplantation: Changes are the Core of Vitiligo Surgery. JOURNAL OF CUTANEOUS AND AESTHETIC SURGERY 2011;4(1):44-5 [11] van Geel N, Ongenae K, De Mil M, Haeghen YV, Vervaet C, Naeyaert JM. Double-blind placebo-controlled study of autologous transplanted epidermal cell suspensions for repigmenting vitiligo. DERMATOLOGIC SURGERY 2004;140(10):1203-8 [12] Falabella R. Surgical approaches for stable vitiligo. DERMATOLOGIC SURGERY 2005;31(10):1277-84 [13] Fraser JRR. Hyaluronan: its nature, distribution, functions and turnover. JOURNAL OF INTERNAL MEDICINE 2003;242:27-33 [14] Kogan G, Soltes L, Stern R, et al. Hyaluronic acid: a natural biopolymer with a broad range of biomedical and industrial applications. BIOTECHNOLOGY LETTERS 2007;29(1): 17-25 [15] Laurent TC, Fraser JR. Hyaluronan. THE FASEB JOURNAL 1992;6(7):2397-2404
40
Bijlagen Bijlage 1: Begrippenlijst 24-well multiwellplaat
Steriele kunststof plaat bestaande uit 24 wells (= reservoirs) van 2cm² oppervlakte
6-well multiwellplaat
Steriele kunststof plaat bestaande uit 6 wells (= reservoirs) van 9,6 cm² oppervlakte
Allogeen
Afkomstig van een andere persoon
Autoloog
Afkomstig van dezelfde persoon
Confluentie
Situatie waarbij de bodem van het recipiënt volledig overgroeid is met cellen
Dermaal
Afkomstig van cellen van de (bindweefselstructuren van) dermis (= lederhuid)
Falconbuis
Steriele kunststof proefbuis met schroefdeksel
Fibroblast
Bindweefselcel
Fysiologisch
Oplossing van 0,9% NaCl in water waarvan de osmotische waarde gelijkaardig is aan die van lichaamsweefsels
Homogene celverdeling
Gelijkmatige verdeling van cellen
Incubator
Broedstoof
Keratinocyt
Hoorncel
Leukoderma
Huidaandoeningen te wijten aan verminderde pigmentatie
Melanine
Huidpigment
Melanocyt
Pigmentcel
P100 petrischaal
Steriele petrischaal met 100 mm diameter
P60 petrischaal
Steriele petrischaal met 60 mm diameter
PBS
Phosphate buffered saline; fysiologische oplossing met toevoeging van fosfaat als pH buffer
Subconfluentie
Situatie waarbij de bodem van het recipiënt voor 70-80% overgroeid is met cellen
Trypsine-EDTA
Trypsine gecheleerd met ethyleendiaminetetraazijnzuur, een enzym dat bij 37°C bindingen tussen cellen kan losmaken
Viabiliteit
Mate waarin cellen kunnen overleven en zich kunnen repliceren
Viscositeit
Mate waarin een vloeistof weerstand biedt tegen vervorming, maat voor de vloeibaarheid van een product.
Bijlage 2: Viscositeitstesten Benodigdheden: Producten
Instrumenten
Formulieren
Hyaluronzuurstaaltjes (7)
Insulinespuitjes (18)
Protocol
Fysiologische oplossing
Recipiënten om in te mengen
Invulformulier
Vulpeninkt
Pipetten en pipeteerhulp
Codeblad
Water en zeep, doekjes
Dermatografisch stiftje Latje fototoestel
Werkwijze: 1) Aanmaken hyaluronzuuroplossingen De hyaluronzuurproducten worden uit hun oorspronkelijke verpakking gehaald en geledigd in een recipiënt. Daarna worden de hyaluronzuuroplossingen aangemaakt in de verhoudingen zoals beschreven in het protocol. Dit gebeurt door de juiste hoeveelheden van het hyaluronzuurproduct en van de fysiologische oplossing op te zuigen en bijeen te brengen naar een nieuw recipiënt. Hier wordt dan nog een druppel vulpeninkt aan toegevoegd en het geheel wordt 5 keer op en neer gepipetteerd om tot een homogeen mengsel te komen. Een aantal verdunningen worden 2 maal aangemaakt om invloed van het verdunningsproces in kaart te kunnen brengen (vb. geen homogene verdeling binnen het mengsel). Daarna wordt de homogene hyaluronzuuroplossing overgebracht in een insulinespuitje. Dit spuitje wordt genummerd en de naam van de hyaluronzuuroplossing wordt opgeschreven op het codeblad bij het overeenkomstige nummer. De nummering is noodzakelijk om een blinde beoordeling te kunnen bekomen. 2) Blinde beoordeling viscositeit De viscositeit wordt beoordeeld door Prof. van Geel, Prof. Beele en Martine De Mil. Dit gebeurt onafhankelijk van elkaar en aan de hand van het invulformulier. Eerst wordt er met behulp van een dermatografisch stiftje 2 lijnen aangebracht op de handrug, op 2 cm van elkaar. Daarna wordt de hand horizontaal op de tafel geplaatst met de handrug naar boven en wordt er 100 µl hyaluronzuuroplossing op de handrug aangebracht net naast de lijn aan de kant
van de duim. Er wordt een eerste foto genomen. Daarna wordt de handrug in verticale positie gebracht (suppinatie van de hand; met de duim naar boven), wordt er een kleine slag gegeven met de ulnaire zijde van de hand tegen de tafel en wordt er 1 minuut gewacht. Dan wordt de hand terug horizontaal gebracht en wordt er een nieuwe foto genomen. De hyaluronzuuroplossingen worden beoordeeld op basis van het ter plaatse blijven van de oplossing. De bevindingen worden genoteerd op het invulblad en eventuele commentaar kan ook neergeschreven worden. Daarna wordt de hand gereinigd, en wordt op dezelfde dezelfde procedure doorlopen voor het volgende product. 3) Verdunningen
Product
Volume HA
Volume fysiologisch
% HA
TRB_01
Ostenil Plus
600µL
0 µL
2%
TRB_02
Ostenil Plus
300µL
300µL
1%
TRB_03
Viscoseal
600µL
0µL
0,5%
ADANT_01
Adant
600µL
0µL
1%
ADANT_02 (2x)
Adant
450µL
150µL
0,75%
HEALON_01
Healon
600µL
0µL
1%
HEALON_02
HealonGV
600µL
0µL
1,4%
HEALON_03
HealonGV
450µL
150µL
1,05%
HEALON_04
HealonGV
300µL
300µL
0,7%
HEALON_05
Healon5
600µL
0µL
2,3%
HEALON_06
Healon5
450µL
150µL
1,725%
HEALON_07 (2x) Healon5
300µL
300µL
1,15%
HEALON_08
Healon5
150µL
450µL
0,575%
HEALON_09
Healon EndoCoat 600µL
0µL
3%
300µL
1,5%
HEALON_10 (2x) Healon EndoCoat 300µL
4) Invulblad Naam beoordeelaar: ___________________ Datum beoordeling: _____/_____/________ Schrijf hier uw bevindingen over de staaltjes: Nummer
Blijft oplossing
concentratie 1
ter plaatse? J/N
2
J/N
3
J/N
4
J/N
5
J/N
6
J/N
7
J/N
8
J/N
9
J/N
10
J/N
Beoordeling en commentaar
11
J/N
12
J/N
13
J/N
14
J/N
15
J/N
16
J/N
17
J/N
18
J/N
Algemene opmerkingen:
Meest geschikte product:
Bijlage 3: Aanmaken celsuspensie fibroblasten Benodigdheden: Producten
Instrumenten
Toestellen
Cryotube met ingevroren
Falconbuizen 15 mL
Laminaire flow (LAF)
fibroblasten
P100 petrischalen
Centrifuge
Ethanol 70%
Bürkertelkamer
CO2-incubator
Cultuurmedium fibroblasten
Microscoop
Trypaanblauw Werkwijze: –
Zet 15 minuten op voorhand de laminaire flow aan en reinig de werkoppervlakken.
–
Haal de te ontdooien cryotubes uit de vloeibare stikstof en laat ontdooien in een warmwaterbad. Ontsmet daarna de cryotubes met ethanol 70%.
–
Breng de cellen uit de cryotubes over in een Falcon-buis van 15mL en voeg cultuurmedium toe tot 10mL.
–
Centrifugeer af gedurende 5 minuten bij 1200 rpm, giet het supernatans af en los de celpellet op in cultuurmedium. Herhaal de centrifugestap en voeg hierna nogmaals 10 mL cultuurmedium toe.
–
Verdeel de celsuspensie over 4 P100 petrischalen, voeg cultuurmedium toe tot 10 mL per P100 petrischaal en laat de fibroblasten kweken in een CO2-incubator op 37°C en 10% CO2. Houd 1 mL celsuspensie opzij voor een celtelling met trypaanblauw in een Bürkertelkamer.
Cultuurmedium fibroblasten: Optimem 1
500 ml
Ultroser G 2%
10 ml
Glutamine 1%
5 ml
P/S + Fungizone
5 ml
Fetal Calf Serum 5%
25 ml
Bijlage 4: Homogeniteits- en viabiliteitstesten: test 1 Benodigdheden: Producten
Instrumenten
Toestellen
Humane fibroblastensuspensie
24-well multiwell platen (6x)
LAF
(125.000 cellen/mL in
P100 petriplaten (6x)
Pipeteerhulp
fysiologische oplossing) (6mL) Falconbuizen van 15 mL (12x)
repeteerpipet
Fysiologische oplossing (8 mL) Pipetten
Invertmicroscoop
Hyaluronzuurproducten
Vortex
Tips voor repeteerpipet
Trypaanblauw
Fototoestel
Cultuurmedium voor
Bürkertelkamer
fibroblasten
CO2-incubator op 37°C en 10%
Trypsine-EDTA
CO2 Koelkast 4°C
Werkwijze: 1) Aanmaken testmonsters in falconbuis: hyaluronzuur of fysiologische oplossing (controlestaal) samenvoegen bij gelijk volume aan celsuspensie (aan 125.000 cellen/ml). Vortex gedurende 10 seconden aan 1200 rpm. Ieder testmonster wordt in duplo gemaakt, waarbij de eerste reeks het prefix 1 krijgt (noteren op de falconbuis), en de tweede reeks het prefix 2. Op de falconbuizen wordt naast een prefix ook een letter genoteerd waarbij iedere letter staat voor een ander hyaluronzuur-product of controle (fysiologische oplossing), resulterend in testmonsters 1A tot 1F en 2A tot 2F. Iedere lettercombinatie wordt in een lijst gekoppeld aan het juiste product (of controle). Van één product, en van de controle, wordt er nog een derde testmonster aangemaakt (met prefix '3'). 2) De testmonsters met prefix '1' en '2' worden gedurende 2 uur op kamertemperatuur bewaard in de falconbuis. De kamertemperatuur dient dus op het moment van de test genoteerd te worden. De testmonsters met prefix '3' worden in de frigo geplaatst. 3) Ondertussen worden er 6 24-well multiwellplaten en 6 petrischalen klaargemaakt: 1. iedere multiwellplaat en petrischaal krijgt een letter tussen A en F 2. iedere multiwellplaat en petrischaal wordt gevuld met fysiologische oplossing en die
daarna weer afgezogen wordt, om zo een vochtige ondergrond te verkrijgen. (aanwezigheid van wondvocht bij de patiënt nabootsen) 4) In de multiwellplaten wordt per well één druppel van 40 µL aangebracht, van het testmonster uit de falconbuis met prefix 1 en de overeenkomstige lettercombinatie van die multiwellplaat. Theoretisch zou hierdoor iedere well 2500 cellen bevatten. De multiwellplaten worden vervolgens gedurende 10 minuten op 37°C en met 10% CO2 bewaard zodat de druppel voldoende tijd heeft om open te vloeien. Intussen worden de petrischalen bereidt. Het testmonster met prefix '2' wordt in de overeenkomstige P100 petrischaal overgebracht. 5) Na de 10 minuten wachttijd, worden er van alle multiwellplaten onder de microscoop foto's genomen van iedere druppel (zowel van het midden als van de rand). 6) Vervolgens wordt er cultuurmedium aan de testmonsters toegevoegd: 1. multiwellplaat: 960 µL cultuurmedium per well toevoegen, om zo een totaalvolume van 1 mL per well te bekomen 2. petrischaal: 8 mL cultuurmedium toevoegen, om zo een totaalvolume van ongeveer 10 mL per petrischaal te bekomen 7) Indien confluent wordt het tijdstip van confluentie genoteerd. Na 4 dagen worden de cellen geoogst (ongeacht confluentie) (= losmaken met trypsineEDTA) en geteld in een Bürkertelkamer met trypaanblauw om levend-dood te kunnen onderscheiden.
Bijlage 5: Homogeniteits- en viabiliteitstesten: test 2 Instrumenten
Producten
Toestellen
Pasteurpipetten
Fibroblasten in kweek
Toestel voor pasteurpipetten
Pipetten
PBS
Repeteerpipet
Tips voor repeteerpipet
Trypsine
Pipeteerhulp
Tubes waar repeteerpipet in kan Cultuurmedium fibroblasten
Bürkertelkamer + microscoop
Falconbuis 50 mL
Trypaanblauw
Vortex
P60 petrischalen
Hyaluronzuur
Centrifuge
P100 petrischalen
Incubator
Stiftje Werkwijze: − Cultuurmedium afzuigen met pasteurpipet. − 3 mL trypsine toevoegen per plaat, dit 5-10 min. in de incubator plaatsen tot cellen los zijn. − Medium toevoegen om trypsine te blokkeren. − Met pipet celsuspensie in falconbuis brengen. − Centrifugeren op 1200 toeren gedurende 5 min. − Bovenstaande vloeistof afgieten en celpellet oplossen in 10 mL (in falconbuis). − Cellen tellen in Bürkertelkamer onder microscoop: getelde celaantal noteren. − Berekenen hoe men verder moet verdunnen om 250000 cellen/mL te bekomen. − PBS toevoegen om verdunning te bekomen. Materiaal klaarzetten: 1. Tubes coderen van A tot F (evt. Met suffix 'f', voor de testmonsters met contacttijd onder gekoelde omstandigheden) 2. Lotnummers van de hyaluronzuur en PBS noteren 3. De producten een code toekennen tussen A en F 4. Repeteerpipet en tips klaarleggen − Het juiste hyaluronzuurpoduct in de juiste tube doen en volume noteren. − Eventueel centrifugeren (short spin) zodat hyaluronzuur zich onderaan de tube bevindt.
− Falconbuis met 125000 cellen/mL vortexen tot homogene celsuspensie. − Bij iedere tube met hyaluronzuur hetzelfde volume aan celsuspensie toevoegen met behulp van een pipettor waar het juiste volume kan ingesteld worden. − De tubes met de testmonsters vortexen gedurende 5 seconden op de hoogste stand. − 3 à 4 uur laten staan op kamertemperatuur of in de koelkast. Materiaal klaarzetten: 1. repeteerpipet en spuitjes klaarleggen 2. cultuurmedium en pipetten klaarleggen 3. 9 P60 petrischalen en P100 petrischaal coderen met A tot F (evt. met suffix 'f' voor testmonsters met contacttemperatuur onder gekoelde omstandigheden) − Testmonsters vortexen gedurende 5 seconden op de hoogste stand. − 1,25 mL opzuigen met repeteerpipet en druppelsgewijs, met druppels van 80 µL pipetteren in de 9 P60 petrischalen met overeenkomstige code − Onmiddellijk cultuurmedium aanvullen om uitdroging te voorkomen − De P60 petrischalen in de incubator plaatsen (CO2-incubator van 37°C met 10% CO2).
Bijlage 6: Homogeniteits- en viabiliteitstesten: test 3 Instrumenten
Producten
Toestellen
Fibroblasten
PBS
Pipetteerhulp
Pasteurpipetten
Hyaluronzuurproducten
Incubator
Pipetten
Cultuurmedium fibroblasten
Centrifuge
Falconbuis 50 mL
Trypaanblauw
Bürkertelkamer + microscoop
8 Falconbuizen 15 mL
Trypsine
Vortex
8 6-well multiwellplaten
Pipetteerhulp
Stiftje
Werkwijze: 1) Celsuspensie van 500.000 cellen/mL aanmaken: − Cultuurmedium afzuigen met pasteurpipet. − 3 mL trypsine toevoegen per plaat, dit 5-10 min. in de incubator plaatsen tot cellen los zijn. − Medium toevoegen om trypsine te blokkeren. − Met pipet celsuspensie in falconbuis brengen. − Centrifugeren op 1200 toeren gedurende 5 min. − Bovenstaande vloeistof afgieten en celpellet oplossen in 10 mL cultuurmedium (in falconbuis 50mL). − Cellen tellen in bürkertelkamer onder microscoop (met behulp van trypaanblauw): getelde celaantal noteren (levend-dood). − Berekenen hoe men verder moet verdunnen om 500.000 cellen/mL te bekomen. − Cultuurmedium toevoegen om verdunning te bekomen. Materiaal klaarzetten: 1. De (hyaluronzuur)producten een code toekennen. 2. Lotnummers van de hyaluronzuur en PBS noteren. 3. Per hyaluronzuurproduct 2 falconbuizen van 15mL labelen met de juiste code (1x frigo en 1x kamertemperatuur). 4. Pipettor en tips klaarleggen.
2) Hyaluronzuur en celsuspensie samenvoegen. − Ieder hyaluronzuurpoduct verdelen over de twee falconbuizen (de ene helft in de 'frigo'gelabelde buis, en de andere helft in de 'kamertemperatuur'-gelabelde buis), en volume noteren. − Eventueel centrifugeren (short spin) zodat hyaluronzuur zich onderaan de falconbuis bevindt. − Falconbuis met de celsuspensie uit stap 1 vortexen tot homogene celsuspensie. − Bij iedere falconbuis met hyaluronzuur of controle 1 mL celsuspensie toevoegen met behulp van een pipettor (= 500.000 cellen). − De falconbuizen met de testmonsters vortexen gedurende 5 seconden op de hoogste stand. − 3 à 4 uur laten staan op kamertemperatuur of onder gekoelde omstandigheden. Materiaal klaarzetten: 1. Pipettor en tips klaarleggen. 2. Cultuurmedium fibroblasten klaarleggen. 3. 8x 6-well multiwellplaten labelen met een letter : 4x 'frigo' + letter (B, C, D of F) en 4x 'kamertemperatuur' + letter (B, C, D of F). 3) Cellen uitzaaien − Cultuurmedium voor fibroblasten toevoegen totdat het totale volume van de falconbuis 12 mL bedraagt. − Testmonsters vortexen gedurende 5 seconden op de hoogste stand. − Telkens 2 mL opzuigen met een pippet en in elke well van de overeenkomstige 6-well multiwell overbrengen. − De rest van het cultuurmedium (1 mL per well) toevoegen en in de incubator plaatsen (CO2incubator van 37°C met 10% CO2). 4) Op dag 4: cellen oogsten en levend-dood tellen in een Bürkertelkamer (met behulp van trypaanblauw)
Bijlage 7: Verschillen tussen de testen Test 1
Test 2
Test 3
Repeteerpipet gebruikt Temperatuur
Nee Op kamertemperatuur
Ja Gekoeld
Nee Op kamertemperatuur
cultuurmedium Temperatuur hyaluronzuur
Allemaal op
Allemaal op
2 producten (C en D) en
en controle
kamertemperatuur
kamertemperatuur
controle onder gekoelde omstandigheden en 1 product
Reservoir
24-well multiwellplaat en
9 P60 petrischalen en P100
(A) op kamertemperatuur 6-well multiwellplaat
Concentratie cellen in
P100 petrischaal 125000 cellen per mL
petrischaal 250000 cellen per mL
333000 cellen per mL
Visueel in de 24-well
Visueel en celtelling in alle
Celtelling
multiwellplaat en telling in de
petrischalen
P100 petrischaal Mits omzetting in % van
Totaal P60 petrischalen
oorspronkelijk celaantal.
onderling vergelijkbaar, totale
toegevoegde celsuspensie fibroblasten Interpretatie resultaten
Vergelijking celtelling
Onderling vergelijkbaar.
celaantallen of P100 mits omzetting in % van het Contaminatie Testduur
Nee 5 dagen
oorspronkelijke celaantal. Mogelijks 5 dagen
Nee 4 dagen
Bijlage 8: Celtelling test 1
A
Telling 1
Telling 2
Telling 3
165
133
127
6
7
8
Levend
261
278
217
Dood
29
18
34
Levend
154
153
155
Dood
5
6
9
Levend
53
35
41
Dood
22
11
17
Levend
0
0
0
Dood
6
8
8
Levend
117
93
95
Dood
16
12
2
Levend
426
404
403
Dood
26
22
2
Levend
69
52
51
Dood
43
23
33
Levend Dood
B C D E F Bf Ff
Getelde celaantallen in de Bürkertelkamer na het tellen van 25 hokje. Iedere petrischaal werd 3x geteld.
Bijlage 9: Celtelling test 2 A
B
C
D
E
F
Af
Bf
Ff
P60 1
2
2
3
29
19
12
26
24
25
P60 2
3
1
1
22
18
18
23
22
17
P60 3
8
1
6
13
20
12
4
14
6
P60 4
3
9
3
1
0
15
13
20
15
P60 5
8
4
10
6
2
15
23
12
8
P60 6
1
16
5
18
2
12
8
10
18
P60 7
2
18
7
12
6
0
21
3
36
P60 8
0
8
6
10
2
2
22
9
22
P60 9
1
10
9
2
4
10
8
16
21
P100 telling 1
2
140
149
92
9
212
22
262
239
P100 telling 2
2
119
133
62
0
175
34
187
178
P100 telling 3
13
120
156
100
14
146
48
131
168
Getelde celaantal in de Bürkertelkamer na het tellen van 25 hokjes. Opmerking: de celpellet van testmonster A werd opgelost in 500µL, terwijl deze van de overige testmonsters opgelost werd in 250 µL
