Detectie van methandiënon in urine door middel van GC- triple quadrupool MS

Detectie van methandiënon in urine door middel van GC- triple quadrupool MS Lore GELDOF

Verhandeling ingediend tot het verkrijgen van de graad van Master in de Biomedische Wetenschappen

Promotor: Prof. Dr. Ir. Peter Van Eenoo Vakgroep:

Klinische

biologie,

microbiologie en immunologie

Academiejaar 2010-2011

“De auteur en de promotor geven de toelating deze masterproef voor consultatie beschikbaar te stellen en delen ervan te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting uitdrukkelijk de bron te vermelden bij het aanhalen van resultaten uit deze masterproef.”

Datum

(handtekening student)

(Naam student)

(handtekening promotor)

(Naam promotor)

Woord vooraf Via deze weg wil ik nog een aantal personen bedanken die het mogelijk maakten om deze masterproef tot stand te brengen. Het realiseren van een masterproef vraagt immers heel wat motivatie en doorzetting. Ik wil deze personen dan ook alvast bedanken voor hun steun. Vooreerst wil ik mijn promotor Prof. Dr. Ir. Peter Van Eenoo bedanken voor de kans die hij mij gegeven heeft om mijn masterproef in het DoCoLab uit te voeren. Ik wil hem eveneens bedanken voor het veelvuldig nalezen en corrigeren van mijn tekst en het opstellen van goede deadlines. Ik wil bovendien ook mijn begeleider Nik bedanken om mij op een enthousiaste manier met raad en daad bij te staan. En eveneens voor de vele tijd die hij voor mij vrijgemaakt heeft. Daarnaast heeft hij me veel bijgeleerd over de werking van de toestellen. Ik wil hem hierbij ook bedanken voor al de hulp bij mijn praktisch werk. Mijn ouders wil ik eveneens bedanken voor de mogelijkheid die ze me gaven om deze opleiding te volgen. Ik wil hen en daarnaast ook mijn familie en vrienden bedanken voor de steun en motivatie die ze me gegeven hebben. Mijn medestudenten wil ik bedanken voor de praktische tips die ze me gaven bij het neerschrijven van deze masterproef. Ik wil dan ook nog in het bijzonder de studenten in het labo Annelies, Diedelinde en Danica bedanken voor de toffe momenten in het labo. Ten slotte wil ik nog de medewerkers van het DoCoLab bedanken: Koen, Kris, Wim, Pieter H., Pieter V.R., Leen, Lance, Simone, Jan, Fiona, Michaël, Dominique, Trui, Ann en Steven. Ik wil hen bedanken voor de vele praktische hulp, de goede sfeer in het labo en om me de nodige kennis omtrent het wielrennen bij te brengen.

Inhoudstafel Samenvatting ............................................................................................................................ 1 1. Inleiding ................................................................................................................................. 2 1.1 Doping .............................................................................................................................. 2 1.2 Anabole androgene steroïden ........................................................................................... 3 1.3 Metabolisme van anabole androgene steroïden ................................................................ 4 1.3.1 Fase I metabolisme .................................................................................................... 5 1.3.2 Fase II metabolisme ................................................................................................... 6 1.4 Detectie van anabole androgene steroïden ....................................................................... 7 1.4.1 Chromatografie .......................................................................................................... 7 1.4.2 Injecteren van staal..................................................................................................... 8 1.4.3 Gaschromatografische scheiding ............................................................................... 8 1.4.4 Interface ..................................................................................................................... 9 1.4.5 Massaspectrometrie.................................................................................................... 9 1.5 Methodevalidatie ............................................................................................................ 12 1.6 Probleemstelling ............................................................................................................. 13 1.7 Methandiënon ................................................................................................................. 13 2. Materialen en methoden .................................................................................................... 16 2.1 Producten en reagentia.................................................................................................... 16 2.2 Instrumentatie ................................................................................................................. 16 2.3 Excretiestudie ................................................................................................................. 17 2.4 Staalvoorbereiding .......................................................................................................... 18 2.5 Methodevalidatie ............................................................................................................ 19 3. Resultaten ............................................................................................................................ 20 3.1 Analyse van referentiestandaarden ................................................................................. 20

3.1.1 Full scan spectra van referentiestandaarden van methandiënon en metabolieten .... 20 3.1.2 Production scan van de geselecteerde precursorionen ............................................. 21 3.1.3 Opstellen van MRM methode .................................................................................. 21 3.1.4 Opstellen van SIM methode ..................................................................................... 22 3.2 Analyse van excretie-urines............................................................................................ 23 3.2.1 Full scan spectra van excretie-urines ....................................................................... 23 3.2.2 Opstellen MRM methode voor eventuele metabolieten van methandiënon en controleparameters ............................................................................................................ 25 3.2.3 Controle van de opgestelde MRM methode aan de hand van positieve en negatieve urines ................................................................................................................................. 28 3.2.4 Toepassen van de opgestelde MRM methode op de excretie-urines van 0-12 u ..... 30 3.2.5 Opstellen SIM methode voor metabolieten van methandiënon en controleparameters ............................................................................................................ 35 3.2.6 Toepassen van de opgestelde SIM methode op excretie-urines van 0-12 u ............ 35 3.2.7 Toepassen van de opgestelde MRM methode op excretie-urines vanaf 30 u .......... 36 3.2.8 Toepassen van de opgestelde SIM methode op excretie-urines vanaf 30 u............. 40 3.2.9 Vergelijking van detectietijden tussen de SIM en MRM methode .......................... 41 3.3 Methodevalidatie ............................................................................................................ 44 3.3.1 Herhaalbaarheid en bias ........................................................................................... 44 4. Bespreking ........................................................................................................................... 46 4.1 MRM methode toegepast op excretie-urines tot 12 u..................................................... 46 4.2 MRM methode toegepast op de excretie-urines vanaf 30 u ........................................... 47 4.3 Vergelijken van de MRM en SIM methode ................................................................... 48 4.4 Methodevalidatie ............................................................................................................ 48 5. Algemeen besluit ................................................................................................................. 49 6. Referenties........................................................................................................................... 50

Afkortingenlijst AAS

Anabole Androgene Steroïden

amu

atomic mass unit

CID

Collision Induced Dissociation

DHT

5α-dihydrotestosteron

DHEA

dehydroepiandrosteron

DoCoLab

DopingControleLaboratorium UGent

EI

Elektron Ionisatie

EIC

Extracted Ion Chromatogram

GC

Gas Chromatografie

HDL

High Density Lipoprotein

IS

Interne Standaard

LC

Vloeistof Chromatografie

LDL

Low Density Lipoprotein

LLE

Vloeistof-Vloeistof Extractie

LOD

Limit Of Detection

LOQ

Limit Of Quantification

+

M

Moleculair Ion

MPS

MultiPurpose Sampler

MRM

Multiple Reaction Monitoring

MRPL

Minimum Required Performance Limit

MS

Massaspectrometrie

MSTFA

N-Methyl-N-TrimethylsilylTrifluoroAcetamide

m/z

Massa/ladingsverhouding

PTV

Programmed Temperature Vaporisation

Q

Quadrupool

QC

Kwaliteitscontrole

RRT

Relatieve RetentieTijd

RSD

Residuele StandaardDeviatie

RT

RetentieTijd

SD

StandaardDeviatie

SIM

Selected Ion Monitoring

SRM

Single Reaction Monitoring

TMS

TriMethylSilyl

u

uur

WADA

Wereld AntiDoping Agentschap (rekenkundig) gemiddelde

Samenvatting Anabole androgene steroïden worden vaak misbruikt door sporters om hun prestaties te verbeteren. Om de fairplay te bevorderen is het gebruik van deze anabole steroïden verboden en werden ze op de dopinglijst van het Wereld Anti-Doping Agentschap geplaatst. Detectie van deze steroïden in urine van atleten gebeurt vaak aan de hand van gaschromatografie gekoppeld aan massaspectrometrie. Recent werd er een triple quadrupool massaspectrometer ontwikkeld voor gaschromatografie. Dit type massaspectrometer maakt het mogelijk om ‘single reaction monitoring’ (SRM) uit te voeren, wat een grotere selectiviteit met zich meebrengt dan de nu vaak toegepaste ‘single ion monitoring’ (SIM). Hierdoor is het mogelijk om de detectielimiet te gaan verlagen, wat er op zijn beurt voor zorgt dat het misbruik van de anabole androgene steroïden langer opspoorbaar blijft. In deze masterproef is het de bedoeling om een ‘single reaction monitoring’ methode te gaan ontwikkelen voor de detectie van methandiënon in urine. Methandiënon is immers één van de meest gedetecteerde exogene anabole steroïden en daarenboven is het metabolisme van dit steroïd reeds goed gekend. Om deze methode te kunnen ontwikkelen werd er gebruik gemaakt van excretie-urines, gecollecteerd na inname van methandiënon. De methode werd ontwikkeld voor reeds goed gekende metabolieten van methandiënon, maar daarnaast werd eveneens op zoek gegaan naar nog onbekende metabolieten. Zo werd er gezocht naar metabolieten die een langere detectietijd toelaten. Zowel de vrije fractie (ongecojugeerde steroïden) als de totale fractie van de steroïden werd bestudeerd. Er werd eveneens een ‘single ion monitoring’ methode opgesteld om de detectielimieten en detectietijden van beide methodes met elkaar te kunnen vergelijken. Uiteindelijk werd er een methode ontwikkeld voor de detectie van methandiënon, 6βhydroxymethandiënon, 17-epimethandiënon, epimethendiol, de mogelijke metabolieten M1 tot en met M9 en de eventuele metabolieten V1 tot en met V16. Van de mogelijk metabolieten bleven er na controle uiteindelijk maar 8 metabolieten over (M3, M4, M7, V3, V4, V8, V12 en V16). Voor alle steroïden bleek de SRM methode de beste detectielimiet en de langste detectietijden toe te laten. Gebruik van de triple quadrupool massaspectrometer brengt dus zeker voordelen met zich mee om het misbruik van methandiënon langer opspoorbaar te maken. Verder onderzoek zal nog nodig zijn om deze ‘nieuwe’ metabolieten verder te bestuderen en hun structuur te ontrafelen. Op basis van de resultaten van methandiënon lijkt het gebruik van SRM voor andere steroïden veelbelovend om de detectie van hun misbruik te verbeteren.

1. Inleiding 1.1 Doping Atleten wensen telkens hun beste prestatie neer te zetten. Om hun prestaties te bevorderen wordt er soms misbruik gemaakt van doping. De anabole androgene steroïden (AAS) zijn de vaakst gebruikte dopeermiddelen [1]. In 1999 werd het Wereld Anti-Doping Agentschap (WADA) opgericht om doping in de sport te bestrijden. Het bestrijden van doping heeft als doel om de fairplay in stand te houden en om de gezondheid van de atleet te beschermen. Het WADA stelt elk jaar een dopinglijst op met verboden middelen en verboden methoden. De verboden middelen worden onderverdeeld in tien klassen: S0.

Niet goedgekeurde middelen

S1.

Anabole middelen

S2.

Peptide hormonen, groeifactoren en verwante stoffen

S3.

Bèta-2 agonisten

S4.

Hormoon-antagonisten en modulatoren

S5.

Diuretica en andere maskerende middelen

S6.

Stimulantia

S7.

Narcotica

S8.

Cannabinoïden

S9.

Glucocorticosteroïden

Er wordt eveneens een onderscheid gemaakt tussen binnen en buiten competitie. Zo zijn de klassen S6 tot S9 enkel verboden tijdens de competitie terwijl de overige zowel binnen als buiten wedstrijdverband verboden zijn. De S0 klasse werd slechts in 2011 toegevoegd aan de verboden lijst. De anabole androgene steroïden behoren tot de anabole middelen en zitten dus vervat in de S1 klasse [2]. Om misbruik van verboden substanties of methoden op te kunnen sporen zijn er 35 geaccrediteerde dopingcontrolelaboratoria. Het DoCoLab of Dopingcontrolelaboratorium van de UGent is er hier één van. Naast het uitvoeren van dopingcontroles spelen ze ook een belangrijke rol in het onderzoek naar nieuwe methoden om doping te detecteren [3].

1.2 Anabole androgene steroïden Anabole androgene steroïden worden ingedeeld in twee klassen: de endogene en de exogene steroïden. Testosteron, 5α-dihydrotestosteron (DHT), dehydroepiandrosteron (DHEA), androsteendion en androsteendiol zijn belangrijke endogene steroïden. De exogene steroïden zijn deze AAS die van nature niet in het lichaam voorkomen. Voorbeelden van exogene steroïden zijn nandrolon, methandiënon, stanozolol en mesterolon [4]. De basisstructuur van de steroïden is het perhydrocyclopentaanfenanthreen ringsysteem. Dit systeem bestaat uit vier ringen: de A-, B-, C- en D-ring. De zijketens op dit ringsysteem kunnen zich ofwel onder het vlak of boven het vlak bevinden. Deze posities van de zijketens worden dan respectievelijk de α- en de β-positie genoemd [5]. Het typevoorbeeld van de AAS is het endogene steroïd testosteron. Testosteron heeft het typische androstaanskelet met een methylgroep op het tiende en dertiende koolstofatoom (Figuur 1) [6].

OH

18 12 19

11

C

2 3

O

A 4

14

9

1

13

17

D

16

15

8 10 5

B

7

6

Figuur 1. Structuurformule van het belangrijkste endogene steroïd testosteron met nummering en benaming van het koolstofskelet.

Zoals de naam het doet vermoeden hebben de AAS zowel anabole als androgene eigenschappen. De steroïden stimuleren de stofwisseling en de opbouw van weefselbestanddelen (anabolisme). Deze anabole eigenschappen zorgen voor een toename van de spiermassa. Het viriliserende of vermannelijkende effect is toe te schrijven aan de androgene functies van het hormoon. Het is dus vooral omwille van deze anabole eigenschappen dat steroïden vaak misbruikt worden door sporters. Door synthetische analogen aan te maken werd geprobeerd om de anabole effecten van testosteron te verbeteren en te scheiden van zijn ongewenste androgene effecten. De anabole-androgene dissociatie is meestal het resultaat van modificaties ter hoogte van de A-ring van testosteron of DHT. Oraal ingenomen anabole steroïden worden sterk afgebroken door het ‘first-pass’ metabolisme in de lever. Om oraal actieve AAS te bekomen werden er modificaties uitgevoerd om dit metabolisme te kunnen omzeilen. Deze steroïden worden gekenmerkt door

een 17 α-alkyl substituent die het hepatische metabolisme van de 17β-hydroxyl groep sterisch hinderen. Methandiënon en stanozolol zijn voorbeelden van oraal actieve steroïden met een 17α-methyl groep [4]. Daarnaast kunnen de steroïden eveneens parenteraal toegediend worden via intramusculaire injectie of via een transdermale patch. Bij een intramusculaire injectie wordt er een veresterde vorm van de steroïden toegediend. Door hydrolyse worden de steroïden geleidelijk op de plaats van injectie vrijgesteld. Via een transdermale patch worden de steroïden eveneens geleidelijk afgegeven en gaan ze via de huid naar de bloedbaan [6]. Gebruik van de anabole androgene steroïden heeft echter heel wat nevenwerkingen. Zo kan het toedienen van hoge dosissen of het langdurig gebruik van oraal actieve AAS aanleiding geven tot leverdysfuncties. Een aantal algemene nevenwerkingen zijn acne, toegenomen agressiviteit en veranderingen in libido. Daarnaast is er een verhoogd risico op hart- en vaataandoeningen door een stijging van het LDL-cholesterol en daling van het HDLcholesterol. Bij vrouwen kan bovendien de menstruele cyclus verstoord worden en kunnen er mannelijke kenmerken tot expressie komen. Mannen kunnen impotentie, vergroting van de prostaat of prostaatkanker en gynaecomastie verkrijgen [4]. Het steroïd dat in deze masterproef verder zal bestudeerd worden is methandiënon (Figuur 2).

OH CH3

O

Figuur 2. Structuurformule van het exogene steroïd methandiënon.

1.3 Metabolisme van anabole androgene steroïden Zowel exogene als endogene steroïden worden meestal sterk gemetaboliseerd, met excretie van slechts kleine hoeveelheden van het oorspronkelijke steroïd in de urine. In het geval van de exogene steroïden is het bovendien zo dat de toegediende steroïden zelf meestal maar voor een korte periode na toediening opspoorbaar zijn. Om deze redenen gebeurt de detectie van de steroïden zelf slechts in beperkte mate. Detectie van AAS aan de hand van hun metabolieten laat langere detectie van het misbruik toe. Hiervoor is het dus belangrijk dat het metabolisme gekend is en dat de structuur van de metabolieten achterhaald wordt. Om het metabolisme te bepalen kunnen er excretiestudies uitgevoerd worden bij de mens waarbij een AAS wordt toegediend en de urine op regelmatige tijdstippen wordt gecollecteerd.

Het is echter wel zo dat niet alle AAS aanleiding geven tot unieke metabolieten, soms zijn er gemeenschappelijke metabolisatie pathways [4;5]. Het metabolisme van de anabole steroïden kan onderverdeeld worden in twee fasen: het fase I en het fase II metabolisme. In de fase I reacties wordt voornamelijk de basisstructuur van de steroïden veranderd. De AAS ondergaan enzymatisch gekatalyseerde reacties met als doel ze meer polair te maken, te inactiveren en hun eliminatie te vergemakkelijken. Fase I metabolisme vindt voornamelijk plaats in de lever. Fase II metabolisme zorgt voor conjugatie van de steroïden met endogene molecules zoals sulfaat of glucuronzuur. Deze conjugatiereactie maakt ze zo meer polair waardoor hun renale excretie bevorderd wordt [5].

1.3.1 Fase I metabolisme De enzymatische reacties die in deze eerste fase plaatsvinden zijn oxidaties, reducties en hydroxylaties. In Tabel 1 wordt per ring de fase I reacties vermeld. Naast de reacties in de tabel kan ook hydroxylatie optreden ter hoogte van het 18 e (en 19e) koolstofatoom. 5α- en 5β-reductie ter hoogte van de A-ring is de snelheidsbepalende stap in de 3-keto-4-een steroïden zoals testosteron. De enzymen die deze reacties katalyseren, 5α-reductase en 5βreductase, zijn voornamelijk in de lever gelokaliseerd. De verhouding van de 5α- en 5βisomeren is afhankelijk van de structuur van het steroïd. Zo zullen 3-keto-androsta-1,4-dien structuren, zoals methandiënon, niet gemetaboliseerd worden tot 5α-isomeren. De reductie van de koolstof-4,5 dubbele binding is irreversibel en wordt gevolgd door 3α- en 3β-hydroxy-reductie. Deze reductie treedt snel op bij het 5α-isomeer en wordt gekatalyseerd door het 3α-hydroxysteroïd dehydrogenase of 3β-hydroxysteroïd dehydrogenase. 3-keto reductie van een 5β-steroïd, zoals in het geval van methandiënon heeft enkel aanleiding tot de 3α-hydroxy structuur. Ter hoogte van de D-ring is de 17-oxidatie een belangrijke metabolisatieweg voor AAS met een secundaire 17β-hydroxy groep, zoals testosteron. Deze 17-keto metabolieten worden gevormd met behulp van het 17β-hydroxysteroïd dehydrogenase. Ditzelfde enzyme kan eveneens de 17-keto groep terug in de 17β-hydroxy groep omzetten. Bij de oraal actieve steroïden met een 17α-alkyl groep wordt de 17-oxidatie van de 17β-hydroxyl groep verhinderd [5].

Tabel 1. Fase I metabolisme ter hoogte van de vier ringen van de anabole steroïden [5].

A-ring 5α- en 5β-reductie 3α- en 3β-hydroxyreductie

B-ring

C-ring

6β-hydroxylatie

D-ring

12-hydroxylatie

17-oxidatie van 17βhydroxy groep 17β-hydroxylatie van

6,7-dehydrogenatie

17-keto steroïden 17α-hydroxylatie van

1,2-hydrogenatie

17-keto steroïden 16α- en 16β-

1,2-dehydrogenatie

hydroxylatie

verder metabolisme van A-ring

16-oxidatie

gemodificeerde AAS 17-epimerisatie verder D-ring metabolisme 1.3.2 Fase II metabolisme De conjugatiereacties in deze tweede fase worden eveneens enzymatisch gecontroleerd. Het fase I metabolisme wordt niet noodzakelijk opgevolgd door fase II. Er kan dus een onderscheid gemaakt worden tussen geconjugeerde en ongeconjugeerde metabolieten. De belangrijkste fase II reacties worden in Tabel 2 weergegeven [5]. Tabel 2. Fase II metabolisme ter hoogte van de A- en D-ring van de anabole steroïden [5].

A-ring sulfatatie van 3β-hydroxy groep glucuronidatie van 3α-hydroxygroep

D-ring glucuronidatie van secundaire 17β-hydroxy groep glucuronidatie van tertiaire 17β-hydroxy groep in 17βhydroxy-17α-methyl steroïden sulfatatie van secundaire 17β-hydroxy groep sulfatatie van 17β-hydroxy groep in 17β-hydroxy-17αmethyl steroïden en 17-epimerisatie

1.4 Detectie van anabole androgene steroïden De matrix die wordt gekozen voor de detectie van anabole steroïden bij atleten is urine. Afname van urine is immers minder invasief ten opzichte van bloedafname. Bovendien komen de AAS en hun metabolieten in een hogere concentratie voor in urine dan in bloed [4]. Het misbruik van AAS wordt gecontroleerd door de detectie van de AAS zelf, indien deze in de urine geëxcreteerd worden, en van hun metabolieten [5]. Voor de detectie van de endogene AAS is er een kwantitatieve bepaling nodig, aangezien ze van nature al in het lichaam voorkomen. Dit in tegenstelling tot de exogene steroïden waar een kwalitatieve analyse al voldoende is. De aanwezigheid van exogene steroïden levert immers direct een bewijs van misbruik op. De detectie van de AAS gebeurt vaak aan de hand van gaschromatografie gevolgd door massaspectrometrie (GC-MS) [3;4]. Daarnaast is er eveneens detectie mogelijk met behulp van vloeistofchromatografie-massaspectrometrie (LC-MS). LC-MS wint aan aandeel aangezien het geen derivatisatie vereist en dus snellere staalvoorbereiding toelaat [7;8]. LC-MS kan complementaire informatie geven, voornamelijk in het geval van thermisch labiele AAS, zoals trenbolon. GC-MS wordt dan weer bij voorkeur toegepast bij componenten die moeilijker te ioniseren zijn met de zachtere ionisatietechnieken gebruikt bij LC-MS, bijvoorbeeld in het geval van androstaandiol [8].

1.4.1 Chromatografie Chromatografie wordt vaak gebruikt voor de scheiding van oplossingen in zijn verschillende componenten. De oplossing wordt via de mobiele fase over de stationaire fase geleid. De componenten gaan zich verdelen over de twee fasen. De scheiding berust op een verschil in interactie met de stationaire fase, waardoor de componenten vertraagd worden (retentie). Zo elueren de componenten bij een verschillende retentietijd (RT). Bij gaschromatografie is deze mobiele fase een gas, het draaggas. De stationaire fase is vloeibaar of vast en is gecoat als dun laagje aan de binnenzijde van een capillaire kolom van fused silica (SiO 2) [6;9]. De belangrijkste onderdelen van de gaschromatograaf zijn weergegeven in Figuur 3. Om de chromatografische eigenschappen van de steroïden te verbeteren worden de AAS gederivatiseerd met trimethylsilyl (TMS). Door deze derivatisatie worden de stoffen vluchtiger en thermisch stabieler [4;10].

1.4.2 Injecteren van staal De monstercapaciteit van capillaire kolommen is zeer klein. Overbelading kan dus snel optreden. Daarom kan er gebruik gemaakt worden van verschillende injectors: split, splitless of ‘Programmed Temperature Vaporisation’ (PTV). In het geval van de split/splitless injector wordt het staal in een liner in een warme verdampingskamer gebracht zodat het staal verdampt. In de splitless modus wordt de ganse hoeveelheid naar de kolom geleid. Bij een split injectie gaat slechts een klein deel van het staal naar de kolom. De hoeveelheid die opgespoten wordt, wordt bepaald door de splitverhouding. In een PTV injector wordt de temperatuur van de liner via een temperatuurprogramma gereguleerd waardoor er grotere volumes staal opgespoten kunnen worden. De verdamping van het staal gebeurt immers meer geleidelijk. Het solvent heeft het laagste kookpunt en zal dus het eerst naar de kolom geleid worden of kan via een splitopening de liner verlaten (‘solvent vent’) [6;9].

Figuur 3. Opstelling van de gaschromatograaf [6].

1.4.3 Gaschromatografische scheiding De TMS-derivaten van AAS scheiden goed op een fused-silica capillaire kolom met crosslinked methylsilicone (zie Figuur 4) als de stationaire fase. De mobiele fase is helium (He), waterstof (H2) of stikstof (N2). De oven is meestal ingesteld op een bepaald temperatuurprogramma om een optimale scheiding te verkrijgen en de analysetijd zo kort mogelijk te houden. De gasflow van het draaggas bepaalt eveneens de mate van scheiding en de analysetijd. Aangezien de gebruikte kolom van de GC zeer apolair is, is het belangrijk dat de glucuronide-groepen, die polair zijn, van de geconjugeerde steroïden vooraf verwijderd worden. De detector die hier gebruikt zal worden is de triple quadrupool massaspectrometer [4].

Figuur 4. Structuur van de stationaire fase, dimethylpolysiloxaan [11].

1.4.4 Interface Er is een interface nodig tussen de gaschromatograaf en de massaspectrometer indien de gasflow hoger is dan de massaspectrometer kan verwerken. Op deze manier kan het drukverschil overbrugd worden [10]. Bij het gebruik van fused silica capillaire kolommen is een directe koppeling mogelijk. Deze koppeling gebeurd door middel van een transferline die verwarmd wordt. Aangezien de oplosmiddelpiek leidt tot een grote druktoename in de ionenbron is het noodzakelijk om de ionenbron uit te schakelen tijdens de elutie van het oplosmiddel (‘solvent delay’). Op deze manier wordt het filament van de ionenbron beschermd [10].

1.4.5 Massaspectrometrie Massaspectrometrie is gebaseerd op het scheiden van ionen volgens hun massa/ladingsverhouding (m/z) [10]. De belangrijkste componenten van de massaspectrometer worden weergegeven in Figuur 5.

Figuur 5. Hoofdcomponenten van een massaspectrometer [6].

Een eerste belangrijk onderdeel van de massaspectrometer (Figuur 5) is de ionenbron. In deze ionenbron worden componenten vanuit de gasfase geïoniseerd en verkrijgen ze dus een lading. De massaspectrometer werkt onder vacuüm om er voor te zorgen dat geïoniseerde moleculen niet met resterende gasmoleculen kunnen botsen. Dit zorgt er bovendien voor dat het filament niet doorbrandt [6]. Voor het ioniseren van anabole steroïden wordt er vaak gebruik gemaakt van elektron ionisatie (EI) [8]. Bij EI worden de moleculen gebombardeerd met elektronen. Op deze manier wordt er een elektron bij de molecule verwijderd en worden

er positief geladen ionen bekomen. Naast de ionisatie treedt er eveneens fragmentatie op. Deze fragmentatie zorgt ervoor dat er bijkomend extra structuurinformatie over de te analyseren verbinding bekomen wordt [10]. Naast de ionenbron is er een massa-analysator die zorgt voor de scheiding van de ionen door middel van een elektromagnetisch veld. De quadrupool analysator (Figuur 6) bestaat uit vier evenwijdige geplaatste staafvormige elektroden. Elk paar tegenoverliggende staven wordt gevoed door een gelijkspanningscomponent, VDC, en een radiofrequente wisselspanningscomponent, VRF. Door deze VDC en VRF ontstaat er een elektrostatisch veld binnen de quadrupool massafilter. Door dit elektrisch veld ondergaan de ionen oscillerende bewegingen. Enkel de componenten, zoals in Figuur 6, met een stabiele oscillerende beweging bereiken de detector [6;10].

Figuur 6. Een single quadrupool massaspectrometer [12].

De triple quadrupool massaspectrometer bestaat uit 3 quadrupolen die naast elkaar geplaatst zijn (Figuur 7). De eerste analysator (Q1) wordt gebruikt voor de selectie van precursorionen met een bepaalde m/z. Q2 doet dienst als ‘collisie cell’, waarbij de geselecteerde ionen worden gefragmenteerd door botsing met het collisiegas. Deze fragmentatie noemt men ‘collision induced dissociation’ (CID). Het collisiegas kan argon (Ar), stikstofgas (N2) of helium zijn. De derde quadrupool (Q3) is terug een massa-analysator die enkel de geselecteerde fragmentionen of productionen doorlaat voor detectie. Deze selectie van precursor- en production wordt ‘single reaction monitoring’ (SRM) genoemd [6].

Figuur 7. Een triple quadrupool massaspectrometer [13].

Voor de analyse van de anabole androgene steroïden met behulp van massaspectrometrie (Figuur 8) kan er gekozen worden voor het opnemen van volledige spectra (‘full scan mode’) of voor ‘selected ion monitoring’ (SIM). Bij SIM wordt de eerste analysator ingesteld op één of enkele ionen die een hoge specificiteit hebben voor de te analyseren verbinding terwijl bij de volledige spectra alle ionen tussen een bepaald massabereik afgescand worden. [10]. Bij het uitvoeren van tandem massaspectrometrie, bijvoorbeeld met een triple quadrupool massaspectrometer, kan er eveneens gebruik gemaakt worden van ‘single reaction monitoring’. Bij SRM wordt een bepaalde transitie (precursorion en production) gedetecteerd die specifiek is voor de te identificeren component. Door de mogelijkheid om SRM analysen te kunnen uitvoeren, kan een grotere selectiviteit en specificiteit bekomen worden met de triple quadrupool massaspectrometer. Er kan eveneens een ‘multiple reaction monitoring’ (MRM) methode toegepast worden. In dit geval worden er meerdere transities per component gedetecteerd. Een bijkomende mogelijkheid met de triple quadrupool MS is de ‘production scan’. Bij de ‘production scan’ wordt een geselecteerd precursorion gedissocieerd en worden alle bekomen productionen gescand. Door het toepassen van deze ‘production scan’ kunnen er gemakkelijker transities voor een bepaalde component opgesteld worden [6].

Figuur 8. De verschillende analysemethoden die met de triple quadrupool MS toegepast kunnen worden.

Ten slotte worden de ionen gedetecteerd aan de hand van elektron multipliers. De werking ervan is gebaseerd op het principe van secundaire elektronen-emissie. De ionen komen op een metaaloppervlak terecht waardoor er elektronen vrijkomen. Deze elektronen vallen op hun beurt op een tweede oppervlak en maken terug elektronen vrij. Dit wordt verschillende keren herhaald om zo het signaal te kunnen versterken [10].

1.5 Methodevalidatie Het is belangrijk om na het ontwikkelen van een methode deze te gaan valideren. Op deze manier kan er gecontroleerd worden of de methode wel geschikt is voor zijn doel en of deze voldoende betrouwbaar is [14]. Om een kwalitatieve methode te gaan valideren is het belangrijk om de selectiviteit, specificiteit en de aantoonbaarheidsgrens of de ‘Limit of Detection’ (LOD) te gaan bepalen. De selectiviteit is de mate waarin een methode het onderscheid kan maken tussen de analyt en de achtergrond of interferenties. De eigenschap van een methode om enkel en alleen de analyt te meten is de specificiteit. Om de selectiviteit en specificiteit te kunnen testen, worden er minimum 10 blanco stalen en minimum 10 blanco stalen aangerijkt met mogelijke interfererende stoffen geanalyseerd [14]. De LOD is de laagste concentratie die met een zekere statistische zekerheid kan worden gemeten. Om de LOD te gaan bepalen worden er stalen gespiked met verschillende concentraties van het steroïd. De LOD is dan de laagste concentratie waarbij de signaal tot ruis verhouding (S/N) minimum gelijk is aan drie. Het is belangrijk dat deze LOD lager is dan de ‘Minimum Required Performance Limit’ (MRPL). De MRPL is de concentratie die laboratoria routinematig moeten kunnen detecteren [14]. WADA legt de MRPL vast op 10 ng/ml voor de anabole steroïden. Voor enkele metabolieten van de steroïden methandiënon, stanozolol en 17α-methyltestosteron is deze limiet zelfs 2 ng/ml. Voor methandiënon moet een MRPL gehaald worden van 2 ng/ml voor de metaboliet epimethendiol [15]. Bij de validatie van kwantitieve methodes moet eveneens de bepaalbaarheidsgrens of ‘Limit of Quantification’ (LOQ) bepaald worden. De LOQ is de laagste concentratie aan een analyt die bepaald kan worden met een aanvaardbaar niveau van precisie (herhaalbaarheid) en juistheid (bias).

1.6 Probleemstelling Een nadeel van het gebruik van SIM is dat het aanleiding kan geven tot misidentificatie als dezelfde ionen ook bij een andere verbinding voorkomen. Om deze reden er gekozen worden voor tandem MS (MS/MS). Door de hogere selectiviteit en specificiteit van de SRM methode kunnen immers de interferenties en achtergrond gereduceerd worden. Er is immers een kleinere kans dat de interfererende component aanleiding zal geven tot hetzelfde production [10]. Dit heeft eveneens tot gevolg dat lagere concentraties kunnen gedetecteerd worden en dus een lagere detectielimiet verkregen wordt. Recent werd er een triple quadrupool massaspectrometer ontwikkeld die gekoppeld kan worden aan een gaschromatograaf. Dit type massaspectrometer werd reeds gebruikt in combinatie met vloeistofchromatografie. Er zijn nog geen studies gebeurd met de GC gekoppeld aan een triple quadrupool massaspectrometer omtrent de detectie van anabole steroïden. Het is bij deze masterproef dan ook de bedoeling om een SRM methode met behulp van de triple quadrupool massaspectrometer gekoppeld aan een gaschromotograaf te gaan ontwikkelen. De methode zal ontwikkeld worden voor het steroïd methandiënon aan de hand van excretie-urines. Het is hierbij de bedoeling om naast de reeds gekende metabolieten in de literatuur ook op zoek te gaan naar eventueel nieuwe metabolieten. Zowel de vrije fractie (ongecojugeerde steroïden) als de totale fractie van de steroïden zal bestudeerd worden. Daarnaast zal er eveneens een SIM methode opgesteld worden, zodat de detectietijden van de metabolieten tussen de SIM en SRM methode vergeleken kunnen worden.

1.7 Methandiënon Methandiënon (17α-methyl-17β-hydroxyandrosta-1,4-dien-3-on) of misschien beter gekend onder zijn merknaam Dianabol is een exogeen anabool androgeen steroïd dat al sinds 1959 op de markt is [16]. De structuurformule van methandiënon wordt weergegeven in Figuur 2 ( zie pagina 4). Methandiënon heeft een moleculair gewicht van 300,44 Dalton. Na derivatisatie met TMS wordt een moleculair ion bekomen met een m/z van 444 (300 + (2 x 72)). Methandiënon is een exogeen steroïd met orale activiteit. Deze orale activiteit wordt bekomen door de 17α-methyl substitutie. Dit heeft echter tot gevolg dat het bij orale inname schadelijk is voor de lever. In deze masterproef werd er voor methandiënon gekozen aangezien het één van de frequentst gedetecteerde exogene anabole steroïden is. Zo werd dit steroïd in 2009 in 3,3% van de positieve stalen voor anabole steroïden gedetecteerd [1]. Het metabolisme van methandiënon

werd bovendien al veelvuldig bestudeerd [7]. Op deze manier kon er een lijst met metabolieten van methandiënon die reeds in de literatuur beschreven zijn, opgesteld worden (zie Tabel 3). Voor de detectie van de inname van methandiënon wordt er vaak gebruikt gemaakt van het diagnostisch metaboliet 6β-hydroxymethandiënon [4]. 6β-hydroxymethandiënon is één van de vroegst te detecteren metabolieten van methandiënon in urine na inname van dit steroïd. De volgende steroïden worden ongeconjugeerd in de urine uitgescheiden: 17-epimethandiënon, 6β-hydroxymethandiënon, 6β-hydroxy-17epi-methandiënon en 17α,17β-dimethyl-18norandrosta-1,4,13-trien-3-on [16]. De metabolieten epimethendiol (17β-methyl-5β-androsta1-en-3α,17α-diol) en 18-normetenol (17α,17β-dimethyl-18-nor-5β-androsta-1,13-dien-3α-ol) laten detectie van methandiënon op lange termijn toe. Beide metabolieten worden als glucuronideconjugaten in de urine uitgescheiden. 17α-methyl-5β-androsta-3α,17β-diol is een gemeenschappelijke metaboliet van de steroïden methandiënon, methandriol en methyltestosteron [5].

Tabel 3. Lijst met metabolieten van methandiënon en de massa’s van de moleculaire ionen als TMS-enolTMS-ether derivaat.

Naam steroïd

M+ (Dalton)

Referentie

Methandiënon (merknaam: Dianabol, Danabol) = methandrostenolon

444

[7;17;18;19]

444

[7;18]

532

[7;18]

532

[7]

442

[7]

442

[7]

446

[7;18]

442

[7;17;18]

= 17α-methyl-17βhydroxyandrosta-1,4-dien-3-on 1 2 3 4 5 6 7

17-epimethandiënon = 17β-methyl-17α-hydroxyandrosta-1,4-dien-3-on 6β-hydroxymethandiënon = 17α-methyl-6β,17β-dihydroxyandrosta-1,4-dien-3-on 6β-hydroxy-17-epimethandiënon = 17β-methyl-6β,17α-dihydroxyandrosta-1,4-dien-3-on 17α-methyl-17βhydroxyandrosta-1,4,6-trien-3-on 17α-hydroxymethyl-17β-methyl-18-norandrosta-1,4,13trien-3-on 17α-methyl-17β-hydroxy-5β-androsta-1-en-3-on 17β-hydroxymethyl-17α-methyl-18-norandrosta-1,4,13trien3-on

8

17α,17β-dimethyl-18-nor-5β-androsta-1,13-dien-3-on

356

[7]

9

17α,17β-dimethyl-18-norandrosta-1,4,13-trien-3-on

354

[7;18]

448

[7]

448

[7;18]

358

[7;18]

13 17α-methyl-5β-androsta-3α,17β-diol

450

[7;18]

14 17α-methyl-6β,16α,17β-trihydroxyandrosta-1,4-dien-3-on

620

[7]

15 17β-methyl-6β,16β,17α-trihydroxy-androsta-1,4-dien-3-on

620

[7]

16 17α-methyl-6β,16β,17β-trihydroxy-androsta-1,4,dien-3-on

620

[7]

17 17α-methyl-6β,12β,17β-trihdydroxy-androsta-1,4-dien-3-on

620

[7]

433

[17]

442

[7]

10 17α-methyl-5β-androsta-1-en-3α,17β-diol 11 12

18 19

Epimethendiol = 17β-methyl-5β-androsta-1-en-3α,17α-diol 18-normetenol = 17α,17β-dimethyl-18-nor-5β-androsta-1,13-dien-3α-ol

18-nor-epimethendiol =17β-methyl-18-nor-5β-androsta-1-en-3α,17α-diol 6-en-epimethandiënon = 17β-methyl-17α-hydroxyandrosta-1,4,6-trien-3-on

2. Materialen en methoden 2.1 Producten en reagentia Referentiestandaarden voor methandiënon (17α-methyl-17β-hydroxyandrosta-1,4-dien-3on) en de volgende metabolieten ervan: 6β-hydroxymethandiënon, 17-epimethandiënon en 17βmethyl-5β-androsta-1-en-3α,17α-diol (epimethendiol) werden aangekocht bij het ‘National Measurement Institute’ (Pymble, Australië). Als interne standaard (IS) wordt 17αmethyltestosteron gebruikt dat bekomen werd via Organon (Oss, Nederland). Het enzyme β-glucuronidase van Escherichia coli is afkomstig van Roche Diagnostics (Mannheim, Duitsland). N-methyl-N-trimethylsilyltrifluoroacetamide (MSTFA) is afkomstig van Karl Bucher (Waldstetten, Duitsland) en ethaanthiol komt van Acros (Geel, België). Dinatriumwaterstoffosfaat dihydraat (Na2HPO4.2H2O) p.a., natriumdiwaterstoffosfaat dihydraat (NaH2PO4.H2O) p.a., kaliumcarbonaat (K2CO3) p.a., natriumsulfaat (Na2SO4) p.a. en natriumchloride (NaCl) p.a. en ammoniumiodide (NH4I) werden aangekocht bij Merck (Darmstadt, Duitsland). Diethylether, methanol en natriumcarbonaat ( NaHCO3) p.a. komen van Fisher Scientific (Loughborough, UK). Pentaan p.a. en acetonitrille (ACN) werden aangekocht bij Biosolve (Valkenswaard, Nederland). Iso-octaan p.a. en ethaanthiol komen van Acros (Geel, België). De leverancier van de gassen gebruikt voor de GC-MS analyse, helium en stikstofgas, is Air Liquide (Bornem, België).

2.2 Instrumentatie De gebruikte gaschromatograaf is een Agilent 7890 GC (Agilent Technologies, Palo Alto, USA) met een 12,5 m J&W Ultra 1 capillaire kolom van Agilent. De capillaire kolom heeft een interne diameter van 200 µm en een film thickness van 0,11 µm. De stationaire fase van de kolom bestaat uit ‘cross-linked’ dimethylsilicone of dimethylpolysiloxaan. Helium wordt gebruikt als mobiele fase met een flow van 0,77 ml/min en een druk van 5,56 psi. De massaspectrometer is een Agilent 7000A triple quadrupool MS. Het collisiegas in de collisiecel is N2 (1,5 ml/min) en als quench gas wordt er helium (2,25 ml/min) gebruikt. De GC gekoppeld aan de triple quadrupool MS is eveneens uitgerust met een MPS2 autosampler en een PTV-injector van Gerstel (Mülheim en der Ruhr, Duitsland). 5 µl staal werd geïnjecteerd in de ‘solvent vent’ modus van de PTV-injector. Het volgende temperatuurprogramma werd voor de PTV gebruikt: 35°C gedurende 0,20 min en dan met

12°C/min opwarmen tot 310°C. De ‘vent flow’ was 125 ml/min met een ‘vent’ druk van 9 psi gedurende 0,2 min. Om injectie van dit grotere volume staal toe te laten, werd er gebruikt gemaakt van een ‘baffled’ liner. Het oventemperatuurprogramma was als volgt ingesteld: de initiële temperatuur was 60°C gedurende 0,20 min (‘cold on column’). Via deze ‘cold on column’ techniek kan er een betere scheiding van de componenten verkregen worden en worden er mooiere pieken bekomen, aangezien de componenten terug gaan condenseren aan het begin van de kolom. Dit zorgt eveneens voor dat de retentietijden van de componenten niet te veel verschuiven [20]. De temperatuur nam dan toe met 70°C/min tot 183°C vervolgens werd er opgewarmd met 5,1°C/min tot 220°C. Uiteindelijk werd er opgewarmd om tot de finale temperatuur van 310°C te komen met een snelheid van 50°C/min, deze temperatuur werd 1,8 min aangehouden. De transferline heeft een temperatuur van 310°C. De ‘solvent delay’ bedraagt 1,20 min. De temperatuur van de ionenbron is ingesteld op 250 °C. De totale run neemt telkens 12,81 min in beslag. Bij het opnemen van full scan massaspectra (MS1 scan) wordt er gescand van de m/z waarden 40 tot 700 met een scantijd van 350 ms en met als grootte van de stappen 0,1 amu. Als MS resolutie wordt er telkens voor ‘wide’ gekozen. Bij de opname van een production scan was de collisie-energie telkens vastgelegd op 15 eV met een scantijd van 350 ms. De MS1 werd ingesteld op het precursorion en de MS2 scande van een m/z van 40 tot een m/z van het precursorion + 5.

2.3 Excretiestudie De urinestalen die voor deze masterproef nodig zijn, werden afgenomen bij een excretiestudie (UZ Gent, project B67020084191). De proefpersonen in deze studie waren gezonde mannen met een leeftijd tussen de 21 en 60 jaar. Methandiënon werd aan één proefpersoon toegediend, hiervoor moest er één capsule met dit steroïd ingenomen worden. De capsule bevatte een dosis van 5 mg methandiënon. De urinestalen werden afgenomen op 0-2-4-6-912-24-30-36-48-72-96 u en dan verder om de 24 u tot 14 dagen (336 u) na de orale toediening van de anabole steroïden. Na afname werden de urinestalen in de diepvries (maximum -15°C) bewaard ter afwachting van de analyse van de stalen.

2.4 Staalvoorbereiding Er wordt 1 ml van de urinestalen overgebracht in een proefbuis. In het geval van de ‘full scan’ analyses werd er gebruik gemaakt van 5 ml urine. Bij elke reeks urinestalen zal er telkens ook een systeem blanco (water), een blanco (negatief urinestaal) en een positieve controle (steroïdvrije urine aangerijkt met referentiestandaarden van de bestudeerde steroïden) geanalyseerd worden ter controle. Aan de stalen wordt er 50 µl 17α-methyltestosteron (IS) toegevoegd. Vervolgens wordt er 1 ml fosfaatbuffer toegevoegd met een pH van 7,0. Enzymatische hydrolyse van de glucuronide-groepen wordt uitgevoerd met 50 µl βglucuronidase (E. coli) gedurende 1,5 uur bij 56±5°C. Op deze manier kan de totale fractie geanalyseerd worden. De totale fractie bevat dus zowel geconjugeerde als ongeconjugeerde steroïden. Na de stalen te laten afkoelen tot kamertemperatuur wordt er 300 mg NaCl en 2 ml vloeibare buffer NaHCO3/K2CO3 (2/1) met pH 9,5 toegevoegd. Vloeistof-vloeistof extractie (LLE) wordt met 5 ml diethylether uitgevoerd door de buizen 20 minuten te laten rollen en vervolgens te centrifugeren gedurende 5 minuten bij 2000-2800 toeren. Vervolgens wordt de organische fractie afgenomen en in een kleine sovirelbuis overgebracht. Deze organische fractie wordt gedroogd door toevoegen van 100 mg Na2SO4 en vervolgens drooggedampt onder een stikstofstroom bij kamertemperatuur. Als de batch niet direct geanalyseerd kon worden, werden de stalen na deze stap in de koelkast geplaatst. Voor de analyse werden de residuen dan nog 10 min extra gedroogd bij 80±5°C. Er wordt 20 µl acetonitrille aan de gedroogde residuen toegevoegd. Ten slotte worden de AAS gederivatiseerd met 50 µl Nmethyl-N-trimethylsilyltrifluoroacetamide (MSTFA) en in een tweede stap met 50 µl van een trimethylsilyl (TMS) -derivatiseringsoplossing. De TMS-derivatiseringsoplossing bevat MSTFA, ammoniumiodide (NH4I) en ethaanthiol (500:4:2). De derivatistering gebeurt in twee stappen waarbij de stalen telkens 30 minuten in de oven bij 80±5°C geplaatst worden [21]. Om te verhinderen dat MSTFA in het toestel terechtkomt, wordt er na de derivatisatie nog een tegenextractie, die in het DoCoLab opgesteld is, uitgevoerd. Op deze manier moet de liner minder snel vervangen worden. Dit zorgt er bovendien voor dat de derivatisatie langer stabiel is. Voor deze tegenextractie wordt er 125 µl gedestilleerd water en 500 µl pentaan/isoctaan (4/1) toegevoegd. De stalen worden goed gevortexd en de bovenste organische fase wordt in een vial overgebracht. Via de MPS2 autosampler wordt er vervolgens 5 µl uit de vials op de gaschromatograaf opgespoten. Om de vrije fractie (ongeconjugeerde steroïden) te kunnen analyseren wordt na het toevoegen van de IS meteen overgegaan naar de LLE, zonder de enzymatische hydrolyse uit te voeren.

Vervolgens worden de zelfde stappen voor de staalvoorbereiding gevolgd zoals hierboven beschreven. Indien er zuivere referentiestandaarden (opgelost in methanol) geanalyseerd worden, worden deze meteen drooggedampt onder een stikstofstroom en worden vervolgens dezelfde stappen gevolgd als hierboven beschreven.

2.5 Methodevalidatie Na het ontwikkelen van de kwalitatieve methode werd de methode eveneens gevalideerd. De validatie gebeurde aan de hand van een batch met 10 positieve urinestalen en een batch van 10 negatieve urinestalen. Als kwalitatieve controleparameters in elke batch zijn de interne standaard, 17αmethyltestosteron, en de transitie in de MRM methode ter controle van mono-TMS vorming belangrijk. Het toevoegen van een interne standaard maakt het mogelijk om te corrigeren voor variaties in de staalvoorbereiding en om relatieve retentietijden (RRT) en relatieve piekoppervlakten te berekenen. De RRT wordt bekomen door de retentietijd van de component te delen door de retentietijd van de IS. De controle van de derivatisatie gebeurd aan de hand van het mono-TMS gederivatiseerde androsteron. Het is belangrijk dat de monoTMS vorming lager is dan 10% om een efficiënte derivatisatie te verkrijgen. Om de methode te gaan valideren wordt de residuele standaarddeviatie (RSD) en de bias bepaald voor 6 calibratiepunten. Deze 6 calibratiepunten hebben een concentratie van 2 ng/ml, 5ng/ml, 10 ng/ml, 15 ng/ml, 20 ng/ml en 50 ng/ml. Per punt worden er 3 herhalingen uitgevoerd. Om te kunnen spreken van een goede herhaalbaarheid moet de RSD kleiner zijn dan de 2/3RSDmax van Horwitz ((2/3)*2(1-0,5logC)). De bias (%) wordt berekend aan de hand van de juistheid. De bias moet kleiner zijn dan 15%, voor het laagste punt moet dit lager zijn dan 20%. De laagste concentratie die met voldoende statistische zekerheid kan worden bepaald wordt als de LOQ genomen [14]. [14] [14]

3. Resultaten 3.1 Analyse van referentiestandaarden 3.1.1 Full scan spectra van referentiestandaarden van methandiënon en metabolieten Om een MRM methode op te kunnen stellen is het belangrijk om eerst full scan spectra op te nemen. De full scan spectra werden opgenomen van telkens 100 µl referentiestandaard van methandiënon (1 µg/ml), 6β-hydroxymethandiënon (20 µg/ml), 17-epimethandiënon (1 µg/ml) en epimethendiol (100 µl/ml). Aan de hand van deze massapectra kunnen de beste precursorionen geselecteerd worden. Bij de selectie van een precursorion wordt er op gelet dat dit ion een hoge m/z waarde heeft en dat het een voldoende hoge abundantie heeft. Op deze manier kan het na de fragmentatie nog teruggevonden worden en kunnen er voldoende productionen gevormd worden. In Figuur 9 wordt het massaspectrum van 6βhydroxymethandiënon weergegeven. De geselecteerde precursorionen worden weergeven in Tabel 4.

Figuur 9. Full scan massaspectrum van 6β-hydroxymethandiënon. Tabel 4. Selectie precursorionen uit full scan spectra referentiestandaarden.

Steroïd

Moleculair ion (M+) Precursorion

RT

RRT

methandiënon

444

444; 354; 339

9,73

0,99

6β-hydroxymethandiënon

532

517

10,32

1,05

17-epimethandiënon

444

444

8,96

0,91

epimethendiol

448

448; 358

6,92

0,71

3.1.2 Production scan van de geselecteerde precursorionen Door het opnemen van production scans wordt er nagegaan worden welke productionen voortkomen uit de bovenstaande geselecteerde precursorionen. In Figuur 10 wordt de product ion scan van 6β-hydroxymethandiënon weergegeven. Op deze manier was het mogelijk om de beste productionen te selecteren. Voor de productionen is het belangrijk dat ze voldoende specifiek zijn voor de component, daarom wordt er bij voorkeur ook geen ion met een te lage m/z waarde gekozen. Er dient eveneens voor gezorgd te worden dat het production een voldoende hoge abundantie heeft. Een transitie van een precursorion naar een production met een verschil van m/z 90 dient vermeden te worden, aangezien dit niet zo specifiek is. Dit fragmention komt immers overeen met TMS-OH ((CH3)3SiOH). Het ion met m/z 73 komt overeen met trimethylsilyl ((CH3)3Si) en is dus niet specifiek voor een bepaalde component, aangezien het eveneens afkomstig is van de trimethylsilylderivatisatie [8;9]. Vervolgens werd, met de beste transities van precursorion en production, een MRM methode samengesteld (zie Tabel 5).

Figuur 10. Product ion scan van 6β-hydroxymethandiënon met m/z=517 als precursor ion.

3.1.3 Opstellen van MRM methode De transities die gekozen werden voor methandiënon, 17-epimethandiënon, 6βhydroxymethandiënon en epimethendiol worden weergegeven in Tabel 5. Deze MRM methode werd vervolgens getest op de referentiestandaarden van methandiënon, 17-epimethandiënon, 6β-hydroxymethandiënon en epimethendiol. Aan de hand van de MassHunter software werd er een kwantitatieve methode opgesteld. In deze methode worden de transities en retentietijden van de componenten ingegeven. Aan de hand van deze methode was het dan mogelijk om de relatieve piekoppervlakten van de componenten in het chromatogram te bepalen. Deze relatieve piekoppervlakten geven een idee over de hoeveelheid van de steroïden er in de urine uitgescheiden wordt.

Tabel 5. Geselecteerde transities voor MRM methode.

Steroïd

Transitie

methandiënon

444 339

15

10

444  297

15

10

444  206

15

10

429  299

15

10

429  283

15

10

339  297

15

10

339  283

15

10

6β-hydroxymethandiënon 517  337

15

10

517  429

15

10

517  297

15

10

517  317

15

10

517  229

15

10

517  229

30

10

444  206

15

10

444  339

15

10

448  419

15

10

448  301

15

10

448  216

15

10

448  195

15

10

448 182

15

10

448  143

15

10

358  301

15

10

17-epimethandiënon

epimethendiol

Collisie-energie (eV) Dwell (ms)

3.1.4 Opstellen van SIM methode Naast de MRM methode werd er eveneens een SIM methode opgesteld voor de detectie van methandiënon, 17-epimethandiënon, 6β-hydroxymethandiënon en epimethendiol. De geselecteerde ionen kunnen teruggevonden worden in Tabel 6.

Tabel 6. Opstellen SIM methode voor de referentiestandaarden van methandiënon en enkele metabolieten.

Steroïd

Ionen

Dwell (ms)

methandiënon

444; 339; 206; 143

10

6β-hydroxymethandiënon

517; 294; 279; 229

10

444; 339; 206

10

448; 358; 216; 143

10

17-epimethandiënon epimethendiol

3.2 Analyse van excretie-urines 3.2.1 Full scan spectra van excretie-urines Van de excretiestudie werden de volgende urinestalen in full scan geanalyseerd: blanco urine van methandiënon en de stalen na 1 u, 2 u, 6 u, 9 u en 12 u na inname. De vrije fractie van de steroïden van deze stalen werd eveneens geanalyseerd. De verkregen full scan spectra werden beoordeeld met behulp van de MassHunter software voor kwalitatieve analysen. Bij het zoeken naar de reeds in de literatuur gekende metabolieten werd er gebruik gemaakt van de ‘extracted ion chromatogram’ (EIC) van het moleculair ion (M+) en het moleculair ion met een afgesplitste methylgroep (M +-15). Het afsplitsen van een methylgroep wordt immers vaak gezien bij de detectie van steroïden [8]. Deze metabolieten van methandiënon en hun overeenkomende moleculaire ionen na derivatisatie met MSTFA worden weergegeven in Tabel 3 (p. 15). De EIC van de verschillende urinestalen werden over elkaar gelegd (overlaid chromatograms). Naast deze m/z-waarden werd er eveneens gebruik gemaakt van m/z- waarden die vaak in steroïden teruggevonden worden. Op deze manier kunnen nieuwe metabolieten opgespoord worden. Zo is een fragmention met een m/z van 129 een goede indicator voor gederivatiseerde steroïden met een 3- of 17-hydroxyl functie. De aanwezigheid van een 17-methylgroep in TMS gederivatiseerde 17-hydroxy steroïden heeft aanleiding tot de fragmentionen met een m/z van 143 en een minder intens ion met m/z 130. Gederivatiseerde 17-keto steroïden worden gekarakteriseerd door het voorkomen van een m/z van 169 in het massaspectrum. Steroïdstructuren met een 1,4-dien-3-on die gederivatiseerd zijn, zoals methandiënon, genereren een intens fragment ion bij een m/z van 206 [8]. 17methyl-16,17-bis(trimethylsiloxy)steroïden vertonen fragmentionen met een m/z van 218 en 231, met 218 als het meest intense ion. Bijkomende karakteristieke fragmentionen bij deze steroïden zijn de ionen met een m/z van 117 en 147 [22]. Bij steroïden met een 17hydroxymethylgroep komt het fragmention met een m/z van 103 voor. Maar het ion met een

m/z waarde van M+-103 kan soms meer intens zijn. Daarnaast komt er ook een fragmention voor met m/z 133. Deze karakteristieke ionen komen voornamelijk bij methandiënon voor [23]. Voor de metabolieten van methandiënon zal er een evolutie in concentratie zijn na inname van methandiënon. Uiteraard moeten deze metabolieten afwezig zijn in de blanco preadministratieurine, de urine vooraleer methandiënon werd ingenomen. In Figuur 11 wordt dit geïllustreerd aan de hand van het EIC van m/z 339, bij een retentietijd van 5,98. Bij deze retentietijd is er een mooie evolutie van de hoeveelheid van M5 over de uren na inname op te merken. Het gaat hier om een mogelijke, nog onbekende metaboliet die hier M5 wordt genoemd. M5 vertoont de grootste piek bij 9u na de inname van methandiënon. Slechts na 2u is er excretie van M5, die te onderscheiden is van de negatieve urine en de blanco excretie urine.

Figuur 11. EIC van m/z 339 bij een RT van 5.98 in ‘overlaid chromatogram’ modus.

Het massaspectrum van de component die bij deze retentietijd elueert wordt weergegeven in Figuur 12. Om vertrekkende vanuit het massaspectrum transities te bekomen voor de metabolieten werden de gepaste precursor- en productionen geselecteerd (zoals dit gebeurde bij 3.1.2). In de full scan spectra kan de IS opgemerkt worden bij een RT van 9,8. Bij de gehydrolyseerde urinestalen werden op basis van de vergelijking tussen post- en preadministratieurines uiteindelijk 9 mogelijke metabolieten van methandiënon (M1 tot en met M9) gevonden naast epimethendiol, 6β-hydroxymethandiënon en methandiënon zelf. In de vrije fractie werden er 16 mogelijke metabolieten gevonden (V1 tot en met V16).

Figuur 12. Massaspectrum van metaboliet M5 bij een RT van 5,98.

3.2.2 Opstellen MRM methode voor eventuele metabolieten van methandiënon en controleparameters Aan de hand van de verkregen full scan massaspectra van de excretie-urines (zie 3.2.1) werd er een MRM methode ontwikkeld (Tabel 7). Hierbij werden eveneens de beste precursor en productionen geselecteerd om tot goede transities te komen van te detecteren componenten. Tabel 7. MRM methode voor detectie van mogelijke metabolieten methandiënon in excretie-urines en enkele controleparameters.

Steroïd androsteron

IS

RT (min) RRT 7,59

9,8

0,77

1

Transitie

Collisie-energie (eV) Dwell (ms)

239  167

15

10

239  117

15

10

446  301

15

10

446 198

15

10

mono-TMS

6,81

0,69

347  253

15

10

M1

9,54

0,97

446  143

15

10

431  143

15

10

444  206

15

10

444  339

15

10

505  143

15

10

358  143

15

10

448  216

15

10

354  193

15

10

354  324

15

10

446  267

15

10

446  133

15

10

450  246

15

10

450  194

15

10

M2

M3

M4

M5

M6

8,92

8,56

3,11

5,98

7,98

0,91

0,87

0,32

0,61

0,81

M7

M8

M9

V1

V2

V3

V4

V5

V6

V7

V8

V9

V10

9,87

10,58

10,74

3,63

5,3

5,94

6,5

7,5

7,78

8,1

8,25

9,12

9,28

1,01

1,08

1,09

0,37

0,54

0,60

0,66

0,76

0,79

0,82

0,84

0,93

0,94

450  143

15

10

550  507

15

10

550  458

15

10

548  206

15

10

548  231

15

10

634  529

15

10

619  265

15

10

313  117

15

10

313 185

15

10

420  217

15

10

289  217

15

10

217  95

15

10

432  133

15

10

339  133

15

10

432  206

15

10

408  354

15

10

354 206

15

10

354 229

15

10

427 281

15

10

427 148

15

10

427 131

15

10

442  339

15

10

422  309

15

10

422  237

15

10

422  143

15

10

502  339

15

10

473  339

15

10

443,5 339

15

10

427  317

15

10

427  215

15

10

427  129

15

10

450  199

15

10

450  156

15

10

522  168

15

10

V11

V12

V13

V14

V15

V16

A1

A2

A3

A4

9,36

9,69

9,84

10,48

10,7

10,76

0,95

0,99

1,004

1,07

1,09

1,10

522  256

15

10

522  417

15

10

536  169

15

10

536  253

15

10

536  291

15

10

445  339

15

10

445  157

15

10

339  157

15

10

550  230

15

10

517  230

15

10

550  244

15

10

433  354

15

10

433  253

15

10

433  343

15

10

605  463

15

10

605  542

15

10

605  113

15

10

605  243

15

10

605  449

15

10

605  403

15

10

358  253

15

10

358  216

15

10

532  337

15

10

532  281

15

10

532  337

15

10

532  297

15

10

442  339

15

10

442  337

15

10

442  133

15

10

442  228

15

10

442  281

15

10

Legende: M = eventuele metabolieten in totale fractie V = eventuele metabolieten in vrije fractie A = bijkomende metabolieten van methandiënon uit artikels [16,23] Mono-TMS = mono-TMS gederivatiseerde androsteron

3.2.3 Controle van de opgestelde MRM methode aan de hand van positieve en negatieve urines Om de geschiktheid van de mogelijke metabolieten uit het vorige experiment te controleren werden er telkens 10 negatieve urinestalen en 10 positieve urinestalen voor methandiënon geanalyseerd met behulp van de opgestelde MRM methode. Van deze urinestalen werd zowel de vrije fractie als de totale fractie geanalyseerd. De metabolieten die in de positieve urinestalen werden teruggevonden zijn weergegeven in Tabel 8 (totale fractie) en Tabel 9 (vrije fractie). Tabel 8. Detectie van metabolieten aan de hand van de opgestelde MRM methode in de totale fractie van 10 positieve urines.

Metabolieten

Positieve urines 1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

Methandiënon

X

X

X

X

X

X

X

X

X

X

6β-

X

X

X

X

X

X

X

X

X

X

17-epimethandiënon

X

X

X

X

X

X

X

X

X

X

epimethendiol

X

X

X

X

X

X

X

X

X

X

X

X

X

X

X

X

X

X

X

X

X

X

X

hydroxymethandiënon

M1 M2 M3

X

M4

X

X

X

X

X

X

M5

X

X

X

X

X

X

X

X

M6

X

M7 M8 M9

X

X

X

X

X

X

X

X

X

X

X

X

X

X

X

X X

X

Van de metabolieten gevonden in de totale fractie werden de volgende metabolieten echter teruggevonden in sommige negatieve urines: M5, M8 en M9. Bij het toepassen van de MRM methode op de vrije fractie van 10 negatieve urines werden de volgende metabolieten eveneens teruggevonden: V1, V5, V6, V9, V10, V13 en V14. Hieruit blijkt dat deze componenten geen metabolieten kunnen zijn van methandiënon, aangezien ze eveneens in blanco urines aanwezig zijn.

Tabel 9. Detectie van metabolieten aan de hand van de opgestelde MRM methode in de vrije fractie van 10 positieve urines.

Metabolieten

Positieve urines 1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

Methandiënon

X

X

X

X

X

X

X

X

X

X

6β-hydroxymethandiënon

X

X

X

X

X

X

X

X

X

X

17-epimethandiënon

X

X

X

X

X

X

X

X

X

X

Epimethendiol

X

X

X

X

X

X

M1 M2 M3 M4 M5 M6 M7 M8 M9 V1

X

X

X

V2 X

V3 X

V4

X

X

X

X

X

X

X

V5

X

X

X

X

X

X

X

X

X

X

V6

X

X

X

X

X

X

X

X

X

X

V7 V8 X

V9 V10

X

X

X

X

V11 V12 V13

X

V14

X

V15 V16

X X

X

X

X

3.2.4 Toepassen van de opgestelde MRM methode op de excretie-urines van 0-12 u De totale MRM methode met zowel de transities van de referentiestandaarden en van de gevonden metabolieten in de excretie-urines werd vervolgens nog eens toegepast op de batch van excretie-urines (zie 3.2.1) voor zowel de vrije fractie als de totale fractie. Op deze manier kan de relatieve piekoppervlakte van de metabolieten uitgezet worden ten opzichte van de tijd na inname van methandiënon. Deze grafieken kan je in de volgende figuren zien (Figuur 13 tot en met Figuur 22).

Totale fractie 0-12u 0,7 relatieve piekoppervlatke

0,6 0,5 0,4

methandiënon

0,3

17-epimethandiënon epimethendiol

0,2

6B-hydroxymethandiënon 0,1 0 0

2

4

6

8

10

12

tijd na inname methandiënon (u) Figuur 13. Detectie van methandiënon, 17-epimethandiënon, epimethendiol en 6β-hydroxymethandiënon in de totale fractie van de excretie-urines van 0-12 u aan de hand van de MRM methode.

Totale fractie 0-12u relatieve piekoppervlatke

0,15

0,1 methandiënon 17-epimethandiënon

0,05

epimethendiol

0 0

2

4

6

8

10

12

tijd na inname methandiënon (u) Figuur 14. Detectie van methandiënon, 17-epimethandiënon en epimethendiol in de totale fractie van de excretie-urines van 0-12 u aan de hand van de MRM methode.

Totale fractie 0-12u 0,5

relatieve piekoppervlakte

0,45 0,4 0,35 0,3 0,25 0,2

M4

0,15

M7

0,1 0,05 0 0

2

4

6

8

10

12

tijd na inname methandiënon (u) Figuur 15. Detectie van M4 en M7 in de totale fractie van de excretie-urines van 0-12 u aan de hand van de MRM methode.

Totale fractie 0-12u 0,004 relatieve piekoppervlakte

0,0035 0,003 0,0025 0,002 0,0015

M7

0,001 0,0005 0 0

2

4

6

8

10

12

tijd na inname methandiënon (u) Figuur 16 . Detectie van M7 in de totale fractie van de excretie-urines van 0-12u aan de hand van de MRM methode.

Totale fractie 0-12u relatieve piekoppervlakte

0,012 0,01 0,008 0,006

V4 V12

0,004

V16 0,002 0 0

2

4

6

8

10

12

tijd na inname methandiënon (u) Figuur 17. Detectie van V4, V12 en V16 in de totale fractie van de excretie-urines van 0-12 u aan de hand van de MRM methode.

Vrije fractie 0-12u 0,7 relatieve piekoppervlakte

0,6 0,5 0,4

methandiënon

0,3

17-epimethandiënon epimethendiol

0,2

6B-hydroxymethandiënon 0,1 0 0

2

4

6

8

10

12

tijd na inname methandiënon (u) Figuur 18. Detectie van methandiënon, 17-epimethandiënon, epimethendiol en 6β-hydroxymethandiënon in de vrije fractie van de excretie-urines van 0-12 u aan de hand van de MRM methode.

Vrije fractie 0-12u 0,07

relatieve piekoppervlakte

0,06 0,05 0,04 methandiënon

0,03

17-epimethandiënon

0,02

epimethendiol

0,01 0 0

2

4

6

8

10

12

tijd na inname methandiënon (u) Figuur 19. Detectie van methandiënon, 17-epimethandiënon en epimethendiol in de vrije fractie van de excretie-urines van 0-12 u aan de hand van de MRM methode.

Vrije fractie 0-12u relatieve piekoppervlakte

0,0006 0,0005 0,0004 0,0003 M4 0,0002

M3

0,0001 0 0

2

4

6

8

10

12

tijd na inname methandiënon (u) Figuur 20. Detectie van M3 en M4 in de vrije fractie van de excretie-urines van 0-12 u aan de hand van de MRM methode.

Vrije fractie 0-12u 0,004

relatieve piekoppervlakte

0,0035 0,003 0,0025 V3

0,002

V4

0,0015

V8

0,001

V12

0,0005 0 0

2

4

6

8

10

12

tijd na inname methandiënon (u) Figuur 21. Detectie van V3, V4, V8 en V12 in de vrije fractie van de excretie-urines van 0-12 u aan de hand van de MRM methode.

Vrije fractie 0-12u 0,00045 relatieve piekoppervlakte

0,0004 0,00035 0,0003 0,00025 V8

0,0002

V3

0,00015

V12

0,0001 0,00005 0 0

2

4

6

8

10

12

tijd na inname methandiënon (u) Figuur 22. Detectie van V3, V8 en V12 in de vrije fractie van de excretie-urines van 0-12 u aan de hand van de MRM methode.

3.2.5 Opstellen SIM methode voor metabolieten van methandiënon en controleparameters Naast de MRM methode werd er eveneens een SIM methode ontwikkeld aan de hand van de excretie-urines (zie 3.2.1). Zo wordt het mogelijk gemaakt om de detectietijden van de metabolieten tussen beide methodes met elkaar te vergelijken. Deze SIM methode met de geselecteerde ionen wordt weergegeven in Tabel 10. 3.2.6 Toepassen van de opgestelde SIM methode op excretie-urines van 0-12 u Deze SIM methode voor zowel de ionen voor de identificatie van de referentiestandaarden en de gevonden metabolieten in de excretie-urines werd vervolgens nog eens toegepast op de batch van excretie-urines (zie 3.2.1) voor zowel de vrije als de totale fractie.

Tabel 10. SIM methode voor de detectie van mogelijke metabolieten van methandiënon in excretie-urines en enkele controleparameters.

Steroïd

Ionen

Dwell (ms)

0,77

434; 329

10

IS

1

301; 198

10

M3

0,87

448; 358; 216

10

M7

1,01

550; 507; 458; 219

10

V3

0,60

432; 339; 133

10

V4

0,66

408; 354; 229

10

V8

0,84

427; 317; 215

10

V12

0,99

445; 339; 157

10

V16

1,10

605; 449; 403; 243

10

A1

358; 253; 185

10

A2

532; 337; 281

10

A3

532, 337; 297

10

A4

442; 339; 228; 194

10

androsteron

RRT

Legende: M= eventuele metabolieten in totale fractie V= eventuele metabolieten in vrije fractie A= bijkomende metabolieten van methandiënon uit artikels

3.2.7 Toepassen van de opgestelde MRM methode op excretie-urines vanaf 30 u Om na te gaan hoe lang de eventuele metabolieten gevonden in de excretie-urines van 1u tot 9u teruggevonden kunnen worden, werden er eveneens later afgenomen excretie-urines geanalyseerd met deze MRM methode. Hiervoor werd zowel de vrije fractie als de totale fractie van de excretie-urines van 30u, 36u, 48u, 72u, 96u, 120u, 144u, 168u, 192 u, 216u, 240u, 264u, 288u, en 312u na toediening van methandiënon geanalyseerd. Door de relatieve piekoppervlakte van de metabolieten uit te zetten ten opzicht van de tijd na inname van methandiënon wordt de detectietijd van de metabolieten bepaald. Deze grafieken worden weergegeven in de figurenFiguur 23 tot en met Figuur 30.

Totale fractie 0-312 u 0,7 relatieve piekoppervlakte

0,6 0,5 0,4

epimethendiol

0,3

17-epimethandiënon methandiënon

0,2

6B-hydroxymethandiënon 0,1 0 0

50

100

150

200

250

300

350

tijd na inname methandiënon (u) Figuur 23. Detectie van methandiënon, 17-epimethandiënon, epimethendiol, 6β-hydroxymethandiënon in de totale fractie van de excretie-urines van 0-312 u aan de hand van de MRM methode.

Totale fractie 0-312 u 0,14

relatieve piekoppervlakte

0,12 0,1 0,08 epimethendiol

0,06

17-epimethandiënon

0,04

methandiënon

0,02 0 0

50

100

150

200

250

300

350

tijd na inname methandiënon (u) Figuur 24. Detectie van methandiënon, epimethendiol en 17-epimethandiënon in de totale fractie van de excretie-urines van 0-312 u aan de hand van de MRM methode.

Totale fractie 0-312 u relatieve piekoppervlakte

0,5

0,375

0,25 M4 M7 0,125

0 0

50

100

150

200

250

300

350

tijd na inname methandiënon (u) Figuur 25. Detectie van M4 en M7 in de totale fractie van de excretie-urines van 0-312 u aan de hand van de MRM methode.

Totale fractie 0-312 u 0,004

relatieve piekoppervlakte

0,0035 0,003 0,0025 0,002 0,0015

M7

0,001 0,0005 0 0

50

100

150

200

250

300

350

tijd na inname methandiënon (u) Figuur 26. Detectie van M7 in de totale fractie van de excretie-urines van 0-312 u aan de hand van de MRM methode.

Totale fractie 0-312 u relatieve piekoppervlakte

0,012 0,01 0,008 0,006

V4 V12

0,004

V16 0,002 0 0

50

100

150

200

250

300

350

tijd na inname methandiënon (u) Figuur 27. Detectie van V4, V12 en V16 in de totale fractie van de excretie-urines van 0-312 u aan de hand van de MRM methode.

Vrije fractie 0-312 u 0,7

relatieve piekoppervlakte

0,6 0,5 0,4

epimethendiol

0,3

methandiënon 17-epimethandiënon

0,2

6B-hydroxymethandiënon 0,1 0 0

50

100

150

200

250

300

350

tijd na inname methandiënon (u) Figuur 28. Detectie van methandiënon, 17-epimethandiënon, epimethendiol en 6β-hydroxymethandiënon in de vrije fractie van de excretie-urines van 0-312 u aan de hand van de MRM methode.

Vrije fractie 0-312 u 0,07 relatieve piekoppervlakte

0,06 0,05 0,04 epimethendiol

0,03

methandiënon

0,02

17-epimethandiënon

0,01 0 0

50

100

150

200

250

300

350

tijd na inname methandiënon Figuur 29. Detectie van methandiënon, 17-epimethandiënon en epimethendiol in de vrije fractie van de excretie-urines van 0-312 u aan de hand van de MRM methode.

Vrije fractie 0-312 u 0,004

relatieve piekoppervlakte

0,0035 0,003

0,0025 0,002

V4

0,0015

V12

0,001

V16

0,0005 0 0

50

100

150

200

250

300

350

tijd na inname methandiënon Figuur 30. Detectie van V4, V12 en V16 in de vrije fractie van de excretie-urines van 0-312u aan de hand van de MRM methode.

3.2.8 Toepassen van de opgestelde SIM methode op excretie-urines vanaf 30 u De batchen van in 3.2.7 worden eveneens geanalyseerd met de opgestelde SIM methode.

3.2.9 Vergelijking van detectietijden tussen de SIM en MRM methode Na het analyseren van de totale fractie en de vrije fractie van de excretie-urines van 0-312 u met zowel de MRM als met de SIM methode werden de detectietijden van de verschillende componenten vergeleken. Bij het bepalen van deze detectietijden werd er eveneens rekening gehouden met het voorkomen van de transities van de qualifiers, die naast de quantifier gedetecteerd worden. Deze detectietijden worden in de volgende figuren (Figuur 31 tot en met Figuur 34) weergegeven. Deze eventuele metabolieten van methandiënon zijn wel niet steeds meteen direct na inname detecteerbaar. Deze tijden worden in Tabel 11 weergegeven. Het verschil tussen beide methodes kan je ook opmerken in de figurenFiguur 35 enFiguur 36.

Totale fractie MRM vs SIM 6B-OH ; 48 6B-OH ; 96 17-epi ; 36 17-epi ; 48 epimethendiol ; 72 epimethendiol ; 120

methandiënon ; 36 methandiënon ; 48

0

20

40

60

80

100

120

140

tijd na inname methandiënon (u) Figuur 31. Vergelijking van de detectietijden tussen de MRM en SIM methode voor de detectie van methandiënon, epimethendiol, 17-epimethandiënon en 6β-hydroxymethandiënon in de totale fractie. Legende: 6B-OH = 6β-hydroxymethandiënon Blauw = MRM 17-epi = 17-epimethandiënon Rood = SIM

Vrije fractie MRM vs SIM 6B-OH ; 72

6B-OH ; 96 17-epi ; 48 17-epi ; 48 epimethendiol ; 30 epimethendiol ; 36 methandiënon ; 12 methandiënon ; 36

0

20

40

60

80

100

120

tijd na inname methandiënon (u) Figuur 32.Vergelijking van de detectietijden tussen de MRM en SIM methode voor de detectie van methandiënon, epimethendiol, 17-epimethandiënon en 6β-hydroxymethandiënon in de vrije fractie. Legende: 6B-OH = 6β-hydroxymethandiënon 17-epi = 17-epimethandiënon

Blauw = MRM Rood = SIM

Totale fractie MRM vs SIM V16; 0 V16 ; 12 V12 ; 0 V12 ; 12 V4 ; 12 V4 ; 12 M7 ; 36 M7 ; 48 M4 ; 12 M4 ; 12 0

10

20

30

40

50

60

tijd na inname methandiënon (u) Figuur 33. Vergelijking van de detectietijden tussen de MRM en SIM methode voor de detectie van M4, M7, V4, V12, en V16 in de totale fractie. Legende: Blauw = MRM

Rood = SIM

Vrije fractie MRM vs SIM V12 ; 0 V12 ; 48 V8 ; 0 V8 ; 12 V4 ; 12 V4 ; 36 V3 ; 0 V3 ; 12 M4 ; 0 M4 ; 12 0

10

20

30

40

50

60

tijd na inname methandiënon (u) Figuur 34. Vergelijking van de detectietijden tussen de MRM en SIM methode voor de detectie van M4, V3, V8 en V12 in de vrije fractie. Legende: Blauw = MRM

Rood = SIM

Tabel 11. Tijd tot detectie voor de metabolieten met behulp van de MRM en SIM methode in zowel de totale als vrije fractie.

Metabolieten

Totale fractie

Vrije fractie

MRM

SIM

MRM

SIM

Methandiënon

2

6

6

6

Epimethendiol

1

6

6

6

17-epimethandiënon

1

2

1

6

6β-hydroxymethandiënon

1

12

1

6

M3

/

/

/

/

M4

1

1

6

/

M7

1

2

/

/

V3

/

/

6

/

V4

2

/

2

6

V8

/

/

6

/

V12

6

/

2

/

V16

1

/

/

/

Figuur 35. Detectie van epimethendiol in de totale fractie van de excretie-urine van 1u aan de hand van de MRM methode. De verschillend transities en hun bijhorende piek in het chromatogram worden weergegeven. De quantifier is in het zwart weergeven.

Figuur 36. Detectie van epimethendiol in de totale fractie van de excretie-urine van 1u aan de hand van de SIM methode. De verschillend transities en hun bijhorende piek in het chromatogram worden weergegeven. De quantifier is in het zwart weergegeven.

3.3 Methodevalidatie 3.3.1 Herhaalbaarheid en bias In Tabel 12 worden de resultaten van de methodevalidatie weergegeven, waaronder de bias (%) en de herhaalbaarheid (RSD (%)).

Tabel 12. Validatie van de MRM en SIM methode voor methandiënon, epimethendiol, 6βhydroxymethandiënon.

Concentratie

2 ng/ml

methandiënon

epimethendiol

17-epi

6β-OH

MRM

SIM

MRM

SIM

MRM SIM

MRM SIM

4,44

5,29

3,68

4,99

1,08

4,31

3,68

4,31

2/3RSDmax

SD

0,21

0,08

0,38

0,38

0,28

0,05

0,12

0,11

= 27,18

RSD 4,76

1,53

10,24

7,54

25,81

1,05

3,29

2,46

-122,24

-164,65

-83,81

-149,82

45,85

-115,68

-84,02

-115,26

6,56

7,39

14,97

15,20

4,45

6,22

5,48

6,11

bias 5 ng/ml 2/3RSDmax

SD

0,22

0,19

2,44

2,60

0,36

0,12

0,33

0,29

= 23,68

RSD 3,36

2,55

16,33

17,13

8,02

1,93

6,08

4,78

-31,20

-47,75

-199,36

-203,95

11,06

-24,37

-9,52

-22,15

8,96

9,79

8,71

6,40

10,73

9,97

9,13

9,58

bias 10 ng/ml 2/3RSDmax

SD

0,69

0,19

1,23

1,18

2,27

0,58

0,42

0,62

= 21,33

RSD 7,73

1,92

15,08

18,45

21,17

5,97

4,59

6,45

10,44

2,11

12,81

36,04

-7,37

0,28

8,61

4,23

13,73

14,59

15,25

13,50

17,09

13,97

13,88

14,46

bias 15 ng/ml 2/3RSDmax

SD

0,48

0,38

1,93

1,79

0,59

1,42

0,71

0,79

= 20,07

RSD 3,52

2,57

12,71

13,2

3,47

10,15

5,10

5,46

8,44

2,72

-1,72

9,97

-13,93

6,85

7,48

3,60

18,68

19,16

18,81

18,59

20,02

18,46

18,56

18,88

3,45

3,43

3,45

3,35

3,64

2,4

2,11

1,76

17,91

18,04

12,03

18,18

13,00

11,36

9,30

6,60

4,18

5,94

7,03

-0,09

7,69

7,17

5,59

51,86

52,44

43,47

42,45

55,13

52,95

46,04

45,49

6,05

7,35

0,69

0,66

9,20

8,42

3,32

3,37

bias 20 ng/ml 2/3RSDmax

SD

= 19,22

RSD 18,48 bias

50 ng/ml 2/3RSDmax

SD

= 16,74

RSD 11,67

14,01

1,58

1,03

16,68

15,90

7,21

7,41

-3,72

-4,88

13,05

15,00

-10,27

-5,90

7,92

9,02

bias

Legende: 17-epi= 17-epimethandiënon 6β-OH= 6β-hydroxymethandiënon = gemiddelde Rood = voldoet niet aan de gestelde eisen voor de herhaalbaarheid of bias

4. Bespreking Aan de hand van excretie-urines voor methandiënon kon er een MRM methode ontwikkeld worden voor de detectie van methandiënon, epimethendiol, 17-epimethandiënon, 6βhydroxymethandiënon, de eventuele metabolieten M1 tot en met M9 en de mogelijke metabolieten V1 tot en met V16. Na het toepassen van deze MRM methode op de excretieurines en op positieve en negatieve urines bleken enkel nog de metabolieten M3, M4, M7, V3, V4, V8, V12 en V16 over te blijven als eventuele metabolieten van methandiënon. Daarnaast was het wel steeds mogelijk om de reeds goed gekende metabolieten van methandiënon: epimethendiol, 17-epimethandiënon en 6β-hydroxymethandiënon te detecteren. De metabolieten A1 tot A4 werden niet teruggevonden in deze excretie-urines.

4.1 MRM methode toegepast op excretie-urines tot 12 u In de grafiek van de totale fractie valt het op dat 6β-hydroxymethandiënon tamelijk snel wordt uitgescheiden. Na 9u wordt al de hoogste concentratie bereikt. 6β-hydroxymethandiënon is dan ook al langer bekend als één van de vroegst te detecteren metabolieten van methandiënon [16]. Het valt meteen op dat 6β-hydroxymethandiënon een belangrijke metaboliet is van methandiënon, de piek is eveneens veel hoger dan voor epimethendiol en 17epimethandiënon. 6β-hydroxymethandiënon kan in een zelfde mate teruggevonden worden in de vrije fractie. 6β-hydroxymethandiënon wordt immers ongeconjugeerd uitgescheiden in de urine [16]. Methandiënon zelf wordt wel in een grotere hoeveelheid in de totale fractie teruggevonden, dit steroïd wordt immers wel geconjugeerd geëxcreteerd. 17-epimethandiënon wordt net zoals 6β-hydroxymethandiënon ongecojugeerd uitgescheiden. Dit is eveneens af te leiden uit de grafieken, 17-epimethandiënon wordt immers ook in grote mate teruggevonden in de vrije fractie, dit in tegenstelling tot methandiënon en epimethendiol die wel geconjugeerd worden [5;16]. In Figuur 14 is te zien dat epimethendiol geen zo’n hoge maximale concentratie bereikt. Het houdt wel langere tijd dezelfde relatieve piekoppervlakte aan. Epimethendiol komt dan ook overeen met een metaboliet die lange detectie van de inname van methandiënon mogelijk maakt [5]. M3 wordt enkele gedetecteerd in de vrije fractie, maar dit slechts in vrij geringe abundantie, waardoor het geen echt geschikte metaboliet is voor het opsporen van misbruik van methandiënon. M4 wordt voornamelijk in de totale fractie gedetecteerd en is dus een hoofdzakelijk geconjugeerde metaboliet van methandiënon. De maximale concentratie van M4 wordt reeds na 9 u bereikt en de relatieve piekoppervlakte is na 12 u al sterk afgenomen.

M7 wordt enkel in de totale fractie gedetecteerd, maar met een kleinere abundantie dan M4. De concentratie aan M7 bereikt na 1 u zijn maximum en daalt hierna ook vlug terug en houdt dan van 6 u tot 12 u een zelfde concentratie aan. V3 wordt enkel in de vrije fractie gedetecteerd en bereikt na 1 u al zijn maximum en wordt slechts gedurende de eerste 12 u gedetecteerd. V3 is bijgevolg een kortetermijn-metaboliet van methandiënon. V4 wordt hoofdzakelijk teruggevonden in de totale fractie en steekt in beperkte hoeveelheid in de vrije fractie. In tegenstelling tot de totale fractie waar de concentratie aan V4 na 6 uur reeds afneemt, blijft de concentratie in de vrije fractie echter wel verder stijgen. Dit duidt op verschillen in fase II metabolisme volgens post-administratietijd. V8 wordt uitsluitend in de vrije fractie gedetecteerd en bereikt na 12 u zijn hoogste concentratie. V12 heeft in de totale fractie de hoogste relatieve piekoppervlakte en bereikt zijn maximale waarde na 9u. V16 wordt alleen in de totale fractie gedetecteerd met een minimale relatieve abundantie. Hieruit kunnen we afleiden dat de metabolieten M4, V4 en V12 voornamelijk geconjugeerde metabolieten van methandiënon zijn. M7 en V16 worden uitsluitend geconjugeerd geëxcreteerd. Terwijl de metabolieten M3, V3 en V8 uitsluitend in de vrije fractie gedetecteerd worden en dus als ongecojugeerde metabolieten worden uitgescheiden.

4.2 MRM methode toegepast op de excretie-urines vanaf 30 u Uit Figuur 24 blijkt dat epimethendiol inderdaad als een langetermijn-metaboliet van methandiënon kan beschouwd worden, aangezien deze metaboliet het langst gedetecteerd kan worden. De detectietijd van alle andere metabolieten is veel korter. M4 kan eveneens gedurende een relatief lange periode gedetecteerd worden, alhoewel de abundantie van M4 na 12 u al terug sterk daalde. M7 wordt eveneens gedurende een lange periode gedetecteerd. In de excretie-urines tot en met 12 u was te zien dat na 1 u reeds de maximale concentratie aan M7 in de urine bereikt werd. Het uitscheidingspatroon op het einde van de excretieperiode van 30 tot 240 u na de inname van methandiënon vertoont wel een pulsatief karakter. V12 is ook over een relatief lange periode te detecteren en vertoont eveneens een aantal terugkerende pieken. Dezelfde resultaten worden gezien in de vrije fractie en de totale fractie. M3 en V3 worden niet meer gedetecteerd in de excretie-urines na 30 u van de inname van methandiënon en zullen dus als kortetermijn-metabolieten kunnen beschouwd worden. V8 kan na 30 u niet meer gedetecteerd worden en dit zowel in de vrije als in de totale fractie. De

excretie van V16 in de urine vertoont na meer dan de 12 u na inname van methandiënon een vlugge afname. 4.3 Vergelijken van de MRM en SIM methode Bij het vergelijken van beide methodes wordt duidelijk dat de MRM methode een langere detectie van de metabolieten toelaat. In beide methodes blijkt epimethendiol de meest geschikte metaboliet te zijn om misbruik van methandiënon op te sporen. IN deze studie kon er aangetoond worden dat epimethendiol zelfs 2 dagen langer detecteerbaar is met de opgestelde MRM methode dan met de SIM methode (120 u versus 72 u). Bij de ‘nieuwe’ metabolieten van methandiënon blijkt M7 het langste detecteerbaar in de totale fractie en V12 in de vrije fractie. Uit de resultaten voor deze metabolieten blijkt eveneens dat de MRM methode de langste detectietijden toelaat. Beide metabolieten zijn echter niet zo lang detecteerbaar als epimethendiol. De structuren van de metabolieten V12 en M7 zijn echter nog niet volledig opgehelderd. V12 heeft een moleculair ion van 445 na derivatisatie met MSTFA. Dit komt niet overeen met één van de reeds gekende metabolieten van methandiënon, cfr. Tabel 3. Het massaspectrum bevat wel het ion met m/z 206 wat wijst op een gederivatiseerd steroïd met een 1,4-dien-3-on structuur [8]. Een ion met een m/z van 143 wordt echter niet teruggevonden in het massaspectrum. M7 komt niet overeen met een eerder gevonden metaboliet van methandiënon, cfr. Tabel 3 en heeft een M+ van 550, na derivatisatie. Een ion met een m/z van 143, dat karakteristiek is voor 17-gemethyleerde steroïden zoals methandiënon, wordt hier eveneens niet teruggevonden [8]. Het is wel zo dat de ionen met een m/z van 117 en 147 teruggevonden worden en dit zou karakteristiek zijn voor 17-methyl-16,17-bis(trimethylsiloxy)steroïden [22]. Daarnaast is het ook zo dat met MRM methode een vroegere detectie van het misbruik kan bereikt worden. In het geval van 6β-hydroxymethandiënon in de totale fractie is er een verschil van bijna een halve dag waar te nemen. Er is immers na 1 u al een detectie mogelijk met behulp van de MRM methode, waar dit met de SIM methode pas na 12 u is.

4.4 Methodevalidatie Met de MRM methode kan er een LOQ bereikt worden van 5 ng/ml voor 17-epimethandiënon en 6β-hydroxymethandiënon. Voor epimethendiol en methandiënon wordt er een LOQ gehaald van 10 ng/ml.

De SIM methode bereikt voor geen enkele van de referentiestandaarden een LOQ van 5 ng/ml. Een LOQ van 10 ng/ml wordt wel gehaald voor 17-epimethandiënon, methandiënon en 6β-hydroxymethandiënon. Voor epimethendiol wordt er slechts een LOQ van 15 ng/ml bereikt. Door het toepassen van de MRM methode kan er dus een betere LOQ gehaald worden voor 17-epimetandiënon, 6β-hydroxymethandiënon en epimethendiol in vergelijking met de SIM methode. Voor methandiënon zelf, blijkt de LOQ gelijk voor de MRM en de SIM methode. De lagere detectielimiet die kan gehaald worden, verklaart dan ook waarom aan de hand van de MRM methode een vroegere en langere detectie mogelijk is.

5. Algemeen besluit Een methode werd ontwikkeld voor de detectie van methandiënon, 6β-hydroxymethandiënon, 17-epimethandiënon, epimethendiol, en 8 ‘nieuwe’ metabolieten van methandiënon (M3, M4, M7, V3, V4, V8, V12 en V16). Voor alle steroïden bleek de MRM methode de beste detectielimiet en de langste detetectietijden toe te laten in vergelijking met de SIM methode. De opgestelde MRM methode werd gevalideerd en haalde een LOQ van 5 ng/ml voor 17-epimethandiënon en 6βhydroxymethandiënon. Voor epimethendiol en methandiënon wordt er een LOQ bereikt van 10 ng/ml. Gebruik van de triple quadrupool massaspectrometer brengt dus zeker voordelen met zich mee om het misbruik van methandiënon langer opspoorbaar te maken. Verder onderzoek zal nog nodig zijn om de geschiktheid van deze eventuele metabolieten nog uitgebreider te bestuderen en hun structuur te gaan bepalen. De metabolieten M7 en V12 dienen zeker verder gekarakteriseerd te worden als potentiële langetermijn-metabolieten van methandiënon. Het gebruik van de triple quadrupool massaspectrometer gekoppeld aan een gaschromatrograaf zou eveneens gebruikt kunnen worden om de detectie van andere steroïden te verbeteren.

6. Referenties 1.

2.

3. 4. 5. 6. 7.

8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15.

16. 17.

18.

19.

20. 21.

22.

23.

World AntiDoping Agency (WADA). Laboratory statistics , http://www.wadaama.org/Documents/Science_Medicine/AntiDoping_Laboratories/Lab_Statistics/WADA_2009_Labora toryStatisticsReport_Final.pdf (21/12/2010). World AntiDoping Agency (WADA). The 2011 Prohibited List, http://www.wadaama.org/Documents/World_Anti-Doping_Program/WADP-Prohibitedlist/To_be_effective/WADA_Prohibited_List_2011_EN.pdf (21/03/2011). www.wada-ama.org Kickman AT, Gower DB (2003). Anabolic steroids in sport: biochemical, clinical and analytical perspectives. Annals of clinical biochemistry 40: 321-356. Schänzer W (1996). Metabolism of anabolic androgenic steroids. Clinical chemistry 42: 1001-1020. www.wikipedia.org Pozo OJ, Lootens L, Van Eenoo P, Deventer K, Meuleman P, Leroux-Roels G, Parr MK, Schänzer W, Delbeke FT (2009). Combination of liquid-chromatography tandem mass spectrometry in different scan modes with human and chimeric mouse urine for the study of steroid metabolism. Drug testing and analysis 1:554-567. Thevis M, Schänzer W (2007). Mass spectrometry in sports drug testing: structure characterization and analytical assays. Mass spectrometry reviews 26: 79-107. Lipschitz C, Baars B, Van den Berg J, Janssen H-G, Maaskant J, Schoenmakers P, Tijsen R, Vonk N (1996). Gaschromatografie. Den Haag: Ten Hagen en Stam Lipschitz C, Baars B, Van Den Berg J, Janssen H-G, Schoenmakers P, Tijsser P, Vonk N (1997). Gaschromatorgrafie. Den Haag: Ten Hagen en Stam. http://chemwiki.ucdavis.edu/xApproaches/ChemCases/Silicones_1._Silicate_Structures/Silicones_5._O rganic_Silicones_at_General_Electric http://chemwiki.ucdavis.edu/Wikitexts/UCD_Chem_115_Lab_Manual/Lab_7%3A_Electrospray_Mass _Spectrometry http://www.chromatography-online.org/GC-Tandem/Quadrapole-Mass-Spectrometer/MS-MS/rs39.html Pieters I, De Logi E, Vandenkerckhove B, Van Eenoo P, Plum J, Verhofstede C (2009). Cursus goede laboratorium praktijk, hoofdstuk 10 : 51-69. World AntiDoping Agency (WADA). Technical document TD2010MRPL, http://www.wadaama.org/Documents/World_Anti-Doping_Program/WADP-ISLaboratories/WADA_TD2010MRPLv1.0_Minimum%20Required%20Performance%20Levels_Sept% 2001%202010_EN.pdf (21/12/2010) Schänzer W, Geyer H, Horning S (1998). Long-term determination of methandienone and mestanolone. Recent advances in doping analysis 5: 13-26. Fragkaki AG, Angelis YS, Tsantili-Kakoulidou A, Koupparis M, Georgakopoulos C (2009). Schemes of metabolic patterns of anabolic androgenic steroids for the estimation of metabolites of designer steroids in human urine. Journal of steroid biochemistry and molecular biology 15: 44-61. Lootens L, Meuleman P, Pozo OJ, Van Eenoo P, Leroux-Roels G, Delbeke FT (2009). uPA +/+- SCID mouse with humanized liver as a model for in vivo metabolism of exogenous steroids: methandienone as a case study. Clinical Chemistry 55:1783-1793. Schänzer W, Delahaut P, Geyer H, Machnik M, Horning S (1996). Long-term detetection and identification of methandienone and stanozolol abuse in athletes by gas chromatography-high-resolution mass spectrometry. Journal of chromatography B Biomedical applications 687: 93-108. Agilent Technologies (2009). Agilent Triple Quadrupole GC/MS techniques and operation (Student manual). Course number R1718A Volume 1. Kiousi P, Angelis YS, Lyris E, Koupparis M, Calokerinos AC, Atta-Politou J, Georgakopoulos CG (2009). Two-step silylation procedure for the unified analysis of 190 doping control substances in human urine samples by GC-MS. Bio-analysis 1: 1-11. McKinney AR, Ridley DD, Suann CJ (2001). Metabolism of methandrostenolone in the horse: a gas chromatographic-mass spectrometric investigation of phase I and phase II metabolism. Journal of chromatography B Biomedical applications 765: 71-79. Parr MK, Fußhöller G, Gütschow M, Hess C, Schänzer (2010). GC-MS(/MS) investigations on longterm metabolites of 17-methyl steroids. Recent advances in doping analysis (18): 64-73