15
BAHAN DAN METODE
Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian berlangsung dari bulan Februari 2009 sampai Mei 2012 di Laboratorium Penelitian Fisiologi dan Biologi Molekular Tumbuhan serta Rumah Kaca Departemen Biologi FMIPA IPB, Darmaga, Bogor.
Bahan Penelitian Padi genotipe T309, IR64, Situbagendit, Danau Gaung, Grogol, Krowal Oval, dan Hawara Bunar digunakan dalam penelitian ini. Penelitian ini juga menggunakan bahan berupa tanaman transgenik T309 hasil penembakan dengan particle bombardment hasil pekerjaan Dr. Saptowo J Pardal dan tim di BB Biogen (Deptan), plasmid pFLAP dan pBD80 (Gambar 6 dan 7), plasmid pGEM-T Easy rekombinan pembawa gen B11 sebagai sumber gen untuk amplifikasi, serta plasmid rekombinan pGWB5 (Gambar 8) yang membawa gen B11 hasil pekerjaan Roslim (2011). SphIClaI
SalI
HindIII AscI
pFLAP
BamHI
KpnI EcoRI BglII NotI PacI
amp pFLAP GOI 35S CaMVTnos
r
Gambar 6 Peta linier pFLAP.
ApaI PspOMI Acc65I EcoRIKpnI
PacI
pBD80
ColE
oriV
NPTIII
LB
NPTII Pro‐GOI‐Term RB
Gambar 7 Peta linier pBD80.
B11
Gambar 8 Peta linier daerah T-DNA pGWB5 pembawa gen B11.
ClaI SphI HindIII AscI
pBD80
16
Metode Penelitian Konstruksi Plasmid Rekombinan Pembawa Gen B11 Gen B11 diamplifikasi dengan reaksi PCR (Polimerase Chain Reaction) menggunakan tiga macam
pasangan primer spesifik gen B11 yang telah
mengandung adapter situs BamHI dan SalI pada ujungnya. Hasil pita DNA yang diharapkan antara lain 200 pb (sekuen parsial), 500 pb (sekuen penuh), dan 573 pb (sekuen penuh hasil desain ulang). PCR dilakukan menggunakan Dreamtaq DNA polimerase (Fermentas, Kanada) dengan suhu penempelan primer 65oC. Hasil PCR divisualisasi pada 1% gel Agarose (LE GQ Top Vision, Fermentas, Kanada) dengan pewarnaan menggunakan 5µg/ml etidium bromida. Sebagai vektor entry, digunakan pFLAP. Plasmid pFLAP terlebih dahulu dipotong dengan enzim restriksi BamHI dan SalI (Fermentas, Kanada) dengan inkubasi 37oC selama 18 jam untuk membuatnya menjadi
linear. Kemudian
sisipan dan vektor FLAP dielektroforesis dan dipurifikasi dari gel (elusi) menggunakan kit Wizard SV Minicolumn PCR Clean-up System (Promega, USA), lalu selanjutnya diligasi dengan enzim T4 DNA ligase (Promega, USA). Hasil ligasi kemudian diintroduksikan ke dalam E. coli DH5α mengikuti prosedur kejutan panas (Sambrook et al. 1989). Plasmid pFLAP-B11 sebagai entry clone rekombinan yang dihasilkan, kemudian dipotong menggunakan enzim AscI dan PacI (New England Biolabs, USA). Pita DNA berukuran 1397, 1697, dan 1770 pb kemudian dielusi dari gel. Sebagai basis vektor ekspresi digunakan pBD80 yang sebelumnya dipotong terlebih dahulu dengan enzim yang sama (AscI-PacI), dielektroforesis pada 1% gel agarose, dan fragmen berukuran 11091 pb dielusi untuk mendapatkan fragmen linear dari pBD80. Hasilnya kemudian diligasi dengan beberapa jenis fragmen B11 dengan bantuan T4 DNA ligase sehingga diperoleh plasmid ekspresi pBIN- B11 rekombinan. Hasil ligasi kemudian ditransformasi kembali ke dalam E. coli DH5α mengikuti prosedur kejutan panas. Isolasi plasmid dilakukan dengan Wizard Minicolumn Plasmid Extraction kit (Promega, USA).
17
Transformasi Tanaman Padi dengan Gen B11 Transformasi menggunakan particle bombardment. Transformasi dengan particle bombardment dilakukan oleh Dr. Saptowo J Pardal dan timnya di BB Biogen, Cimanggu, Bogor. Hanya satu tanaman T0 fertil hasil penembakan yang diperoleh untuk kemudian dianalisis lebih lanjut. Infeksi A. tumefaciens pada kalus padi. Kultur A. tumefaciens AgL0 pembawa plasmid biner pGWB5 (Gambar 8) hasil pekerjaan Roslim (2011) dengan OD660 = 0.6 digunakan untuk menginfeksi kalus dua genotipe yang berbeda (T309 dan IR64). Kalus disiapkan dengan menumbuhkan biji padi genotipe T309 dan IR64 pada media MS (Lampiran.1) yang mengandung 2 ppm 2,4-D. Kalus kemudian diinfeksi dengan merendamnya di dalam suspensi A. tumefaciens dalam media ko-kultivasi cair yang mengandung 100 µM acetosiringone. Seleksi dilakukan menggunakan higromisin 5 ppm. Regenerasi kalus dilakukan menggunakan media MS + 2 ppm BAP (Lampiran.2). Infeksi A. tumefaciens pada embrio muda padi. Infeksi embrio muda dilakukan sesuai metode Hiei dan Komari (2008). Bahan embrio muda dipanen dari malai padi berumur 7 hari setelah penyerbukan saat biji masih dalam bentuk cairan (matang susu). Terdapat 5 jenis media yang dipergunakan, antara lain media ko-kultivasi, media resting, media pre-regenerasi, media regenerasi, dan media pengakaran. Komposisi media sesuai dengan Hiei dan Komari (2008) disajikan pada Lampiran 3 Infeksi A. tumefaciens secara in-planta. Infeksi in-planta dilakukan pada tujuh genotipe padi (IR64, Situbagendit, Hawara Bunar, Krowal Oval, Danau Gaung, Grogol, dan T309) sesuai prosedur yang dilakukan oleh Supartana et al. (2005) dengan sedikit modifikasi. Biji padi yang akan digunakan dioven pada 30oC selama 24 jam untuk memcahkan dormansi. Setelah dioven, tanpa dikupas terlebih dahulu, biji disterilisasi permukaan menggunakan larutan NaOCl 1% selama 15 menit dan dibilas 3x menggunakan akuades steril. Selanjutnya biji direndam dalam akuades selama 24 jam hingga daerah embrio terlihat berwarna putih. A. tumefaciens yang digunakan untuk infeksi adalah suspensi A. tumefaciens dengan OD660 = 1.0 (Hiei & Komari 2009) dalam akuades steril. Embrio dari biji yang telah direndam kemudian ditusuk menggunakan jarum
18
(diameter 0.5 mm) yang sebelumnya dicelupkan dalam suspensi A. tumefaciens sedalam kira-kira 1-1.5 mm. Biji yang embrionya telah ditusuk kemudian diletakkan pada cawan petri yang sebelumnya diberi alas kapas dan kertas saring basah, lalu diinkubasi selama 7 hari pada suhu 23oC (gelap).
Evaluasi Tanaman Hasil Transformasi dan Penanaman Padi di Rumah Kaca Seleksi antibiotik. Seleksi antibiotik dilakukan terhadap kalus padi hasil infeksi secara aseptik dan biji generasi T1 hasil infeksi secara in-planta. Seleksi terhadap kalus hasil transformasi pBIN-B11 menggunakan kanamisin 25 ppm, sedangkan pada kalus hasil transformasi pGWB5-B11 menggunakan higromisin 30 ppm. Seleksi dilakukan selama 2-3 minggu pada media regenerasi yang ditambahkan antibiotik sesuai konsentrasi masing-masing antibiotik (Lampiran 2) dengan suhu ruang kultur 28oC dan intensitas cahaya 300 PPFD (Photo Proton Flux Density) Seleksi biji T1 hasil infeksi secara in-planta dilakukan dengan menumbuhkan biji pada larutan higromisin 20 ppm dalam air steril. Skoring hasil seleksi antibiotik dilakukan pada hari keempat pengujian. Biji yang mampu berkecambah normal (memunculkan akar dan tunas) merupakan biji putatif transgenik. Uji toleransi terhadap cekaman Al. Analisis toleransi Al dilakukan untuk biji generasi T1 dan T2 menggunakan parameter Root-Re-Growth (RRG) dengan cekaman 15 ppm Al (Al diberikan dalam bentuk larutan AlCl3·6H2O) sesuai dengan metode yang diuraikan Miftahudin et al. (2002) (Lampiran 4). Kategori sensitif jika nilai RRG < 2 cm, dan toleran jika nilai RRG ≥ 2 cm. Uji sisipan tanaman hasil transformasi. Isolasi DNA untuk keperluan uji insersi dilakukan dengan metode isolasi cepat menggunakan buffer lisis SDS seperti diuraikan dalam Miftahudin et al. (2004). Pengujian insersi terhadap keberadaan sisipan dilakukan dengan teknik Polymerase Chain Reaction (PCR). DNA padi diamplifikasi menggunakan mesin PCR (Esco Swift Maxi, Singapura) dengan primer yang didesain dari sekuen gen B11 dan sekuen gen penyandi ketahanan terhadap antibiotik kanamisin dan higromisin menggunakan PCR kit Dreamtaq (Fermentas, Kanada). Komposisi reaksi PCR adalah sebagai berikut:
19 100 ng DNA template, 1x buffer PCR (mengandung 2 mM Mg2+), 0.2 mM
dNTPs, 0.4 µM masing-masing primer, dan 1 unit Taq Polimerase dalam 20 µl total reaksi PCR. Kondisi PCR adalah sebagai berikut: pre denaturasi 94oC selama 5 menit, 35 siklus yang terdiri dari denaturasi (94oC selama 30 detik), penempelan primer 30 detik, polimerisasi (72oC selama 30 detik), dengan pasca-PCR 72oC selama 10 menit. Suhu penempelan primer disesuaikan dengan suhu optimum masing-masing primer. Hasil PCR dianalisis menggunakan elektroforesis gel agarose 1% dengan pewarnaan menggunakan 5µg/ml etidium bromida. Gel hasil elektroforesis didokumentasikan menggunakan WiseDoc Gel Documentation System (Daihan Scientific, Korea Selatan). Khusus untuk tanaman padi hasil infeksi in-planta, isolasi dilakukan pada daun bendera tiap anakan. DNA masing- masing anakan kemudian dibuat bulk untuk tiap rumpun. Uji insersi tahap pertama dilakukan pada DNA bulk tiap rumpun. Rumpun yang menunjukkan hasil positif, diuji lebih lanjut untuk tiap anakannya. Analisis ekspresi tanaman hasil transformasi. Uji ekspresi pada generasi T3 dilakukan dengan terlebih dahulu mengisolasi RNA total dari daun padi dengan reagen Trizol (Invitrogen, USA) sesuai prosedur yang diberikan produsen. Sintesis cDNA dilakukan menggunakan kit Superscript III Reverse Transcriptase (Invitrogen, USA) sesuai instruksi produsen menggunakan primer oligo dT18. Komposisi reaksi sintesis cDNA sebagai berikut: 5000 ng RNA yang telah diperlakukan DNAse, 1x first strand buffer, 1 µM primer oligo dT18, 0.5 mM dNTPs, 10 mM DTT, 40 unit enzim RTase, dan 0.01% ddH2O yang telah diperlakukan DEPC hingga total reaksi 20 µl. Uji ekspresi dilakukan dengan reaksi PCR biasa dengan reaksi yang seperti disebutkan sebelumnya namun menggunakan template berupa cDNA dengan primer B11 serta ubiquitin sebagai kontrol internal. Analisis semi kuantitatif hasil RT-PCR dilakukan menggunakan software AlphaView (Alpha Innotech, USA). Penanaman padi di rumah kaca. Padi hasil kultur jaringan sebelum ditanam di rumah kaca terlebih dahulu diaklimatisasi bertahap pada ruangan laboratorium pada tabung reaksi berisi akuades selama 7 hari. Setelah itu, tanaman ditanam pada bak semai selama 14 hari, kemudian ditanam pada pot yang berupa ember plastik di rumah kaca. Media tanam yang digunakan adalah campuran
20
tanah dan pupuk kandang dengan perbandingan 3:1 yang telah dilumpurkan sebelumnya selama 14 hari. Pemupukan dilakukan menggunakan pupuk majemuk NPK (1:1:1) dengan 3x aplikasi yaitu pada saat tanam (0 MST), 4 MST, dan 7 MST dengan dosis 0.8 gram per tanaman. Untuk padi hasil infeksi in-planta, tidak dilakukan aklimatisasi. Biji padi langsung disemai pada bak semaian. Setelah 14 hari kemudian ditanam pada pot di rumah kaca seperti yang dilakukan pada penanaman sebelumnya. Analisis bulk pada padi hasil infeksi in-planta. Isolasi DNA dilakukan pada tiap anakan dari rumpun padi hasil infeksi in-planta dengan metode yang seperti disebutkan sebelumnya. DNA tiap anakan dari rumpun yang sama kemudian dicampur dengan proporsi yang sama (DNA bulk rumpun). PCR tahap pertama dilakukan menggunakan DNA bulk rumpun. Rumpun yang terdeteksi positif kemudian dianalisis lebih lanjut untuk tiap anakannya, sehingga diperoleh data anakan yang positif dari tiap sampel rumpun. Efisiensi transformasi dihitung dengan persentase anakan positif dari total anakan yang diuji.
