BAB V. KESIMPULAN, SARAN, DAN RINGKASAN V. I. Kesimpulan 1. Frekuensi genotip AC dan CC lebih tinggi pada kelompok obesitas dibandingkan dengan kelompok normal namun secara statistik tidak berbeda signifikan (p=0,220). 2.
Individu dengan genotip AC memiliki risiko mengalami obesitas 1,658 lebih tinggi namun secara statistik tidak berbeda signifikan (p=0,320).
3. Individu dengan genotip AC atau CC memiliki nilai HOMA-IR 1,7 kali lebih tinggi dibandingkan dengan pembawa genotip AA (p=0,006). Individu pembawa alel C memiliki nilai HOMA-IR 2 kali lebih tinggi dibandingkan dengan pembawa alel A (p=0,000). 4. Individu obesitas dengan genotip AC/CC memiliki risiko 6,62 kali lebih tinggi untuk mengalami resistensi insulin (p=0,025) dan individu obesitas dengan alel C memiliki risiko 7,82 kali lebih tinggi untuk mengalami resistensi insulin (p=0,010). V. II. Saran 1. Pengukuran kadar ENPP1 perlu dilakukan agar dapat melihat perbedaan kadar ENPP1 antara kelompok obesitas dan normal. 2. Pengaruh polimorfisme K121Q gen ENPP1 terhadap proses transduksi sinyal insulin pada tahap aktiviasi IRS dan translokasi GLUT-4 perlu dilakukan karena sejauh ini polimorfisme K121Q gen ENPP1 baru diketahui memiliki pengaruh pada proses autofosforilasi di subunit-β reseptor insulin yang merupakan tahapan awal transduksi sinyal. 58
3. Terapi insulin bersamaan dengan pemberian inhibitor ENPP1 pada pasien diabetes melitus tipe 2 mungkin dapat mengoptimalkan kerja insulin yang diinjeksi ke tubuh pasien sehingga penelitian mengenai inhibitor ENPP1, terutama inhibitor untuk varian glutamin, perlu dilakukan. 4. Penelitian lebih jauh mengenai polimorfisme K121Q gen ENPP1 sebagai faktor risiko resistensi insulin pada individu obesitas perlu dilakukan pada etnis di Indonesia Timur karena terdapat perbedaan genetik antara Indonesia bagian barat dan Indonesia bagian timur. 5. Studi dengan gen lain perlu dilakukan karena resistensi insulin merupakan kondisi yang disebabkan oleh berbagai gen. V. 3. Ringkasan V. 3. 1. Latar Belakang Obesitas telah menarik perhatian masyarakat dunia karena prevalensinya yang terus meningkat dalam 30 tahun terakhir. Total penderita obesitas dengan usia 20 tahun ke atas diperkirakan melebihi setengah dari total orang dewasa di dunia, yaitu 205 juta penderita pria dan 297 juta penderita wanita. Obesitas dulunya identic dengan masyarakat Amerika dan Eropa karena pola makan seharihari di kedua benua tersebut sangat kaya lemak dan karbohidrat. Namun, obesitas kini menjadi masalah utama di negara-negara berkembang, salah satunya Indonesia. Prevalensi obesitas di Indonesia pada penduduk berusia 18 tahun ke atas sebesar 15.4% (Riskesdas, 2013). Angka prevalensi yang tinggi menyebabkan obesitas menjadi salah satu masalah kesehatan yang penting di Indonesia. Selain itu, obesitas dapat menjadi faktor risiko bagi penyakit lainnya
59
seperti diabetes tipe 2, aterosklerosis, stroke, hipertensi, dan berbagai kenis kanker (Nelson dan Cox, 2008). Resistensi insulin merupakan sindrom metabolik yang paling sering terjadi akibat obesitas. Obesitas dan resistensi insulin dapat disebabkan oleh berbagai faktor, seperti faktor lingkungan (pola makan dan aktivitas fisik), serta faktor genetik. Gen ectonucleotide pyrophosphatase phosphodiesterase 1 (ENPP1) merupakan salah satu gen yang dilaporkan memiliki hubungan dengan terjadinya resistensi insulin pada individu obesitas. Protein ini merupakan glikoprotein transmembran tipe II yang diekspresikan di jaringan adiposa dan juga ditemukan di jaringan yang terlibat dalam metabolisme glukosa dan lipid. Fungsi fisiologis gen ini belum diketahui secara pasti, namun protein ini dilaporkan berperan sebagai inhibitor langsung reseptor insulin (Pan et al., 2012). Fungsi penghambatan reseptor insulin oleh ENPP1 terjadi melalui interaksi protein ini dengan subunit-alfa pada reseptor insulin sehingga terjadi penurunan aktivitas fosforilasi tirosin pada subunit-beta reseptor insulin (Maddux dan Goldfine, 2000). Penurunan aktivitas fosforilasi pada subunit-beta reseptor insulin akan mengakibatkan terganggunya mekanisme kaskade dalam proses transduksi sinyal insulin yang kemudian berujung pada resistensi insulin. Kadar protein ini dilaporkan meningkat pada individu obesitas (Youngren dan Goldfine, 1997). Gen ENPP1 dilaporkan memiliki beberapa polimorfisme, namun polimorfisme K121Q merupakan jenis polimorfisme yang paling banyak diteliti. Polimorfisme K121Q gen ENPP1 merupakan suatu mutasi missense yang terjadi
60
di ekson 4. Subsitusi basa adenine (A) oleh sitosin (C) menyebabkan terjadinya perubahan asama amino lisin (K) menjadi glutamin (Q) pada urutan kodon 121. Varian Q merupakan inhibitor insulin yang lebih kuat dibandingkan dengan varian K karena mampu berinteraksi tiga kali lebih kuat dengan reseptor insulin (Pizzuti et al., 1999; Costanzo et al., 2001). Beberapa penelitian di berbagai populasi melaporkan hasil yang berbeda mengenai hubungan polimorfisme K121Q gen ENPP1 dengan obesitas dan resistensi insulin. Polimorfisme ini dilaporkan berhubungan dengan obesitas pada populasi China di Beijing (Wan et al., 2006) dan populasi pria turki (Tanyolac et al., 2008). Polimorfisme K121Q gen ENPP1 juga dilaporkan berhubungan dengan peningkatan nilai HOMA-IR pada populasi India Utara (Prakash et al., 2013), namun tidak berhubungan dengan resistensi insulin pada populasi Kaukasia di Denmark (Rasmussen et al., 2000) dan populasi Jepang (Keshavarz et al., 2006). Hasil penelitian yang belum konsisten di berbagai populasi dan etnik menyebabkan studi mengenai polimorfisme gen ini menarik untuk dikaji. Sebagian besar studi mengenai hubungan ENPP1 dengan obesitas dan resistensi insulin telah dilakukan di Eropa, Amerika sekatan, China, Jepang, dan India, sedangkan studi di Indonesia belum dilaporkan. Oleh karena itu, penelitian ini bertujuan untuk mengetahui hubungan polimorfisme K121Q gen ENPP1 dengan resistensi insulin pada individu obesitas beretnis Jawa.
61
V. 3. 2. Metode Penelitian Studi Populasi Penelitian ini merupakan studi kasus-kontrol yang melibatkan 120 subjek penelitian. Namun, hanya 100 subjek penelitian yang memenuhi kriteria inkslusi dan dianalisis dalam studi ini. Subjek penelitian obesitas harus memenuhi syarat IMT > 25 kg/m2, bersuku Jawa, dan berusia 20-40 tahun. Subjek penelitian normal (kelompok kontrol) harus memenuhi syarat IMT 18-23 kg/m2, bersuku Jawa, dan berusia 20-40 tahun. Individu dengan glukosa darah puasa > 125 mg/dL dan wanita hamil akan dieksklusi. Izin melakukan penelitian ini telah didapatkan dari Komisi Etik Penelitian Fakultas Kedokteran, Universitas Gadjah Mada.
Pengambilan Sampel Darah dan Pengkuran Laboratorium Darah subjek penelitian akan diambil sebanyak 5 mL setelah melakukan puasa selama minimal 8 jam. Darah akan ditampung dalam tabung EDTA lalu disentrifuse pada kecepatan 3500 g selama 15 menit untuk medapatkan plasma dan buffy coat. Plasma-EDTA akan disimpan pada suhu -200 C untuk pengukuran insulin puasa dan sebagian diambil untuk pengukuran kadar glukosa darah puasa. Buffy coat yang didapatkan akan digunakan untuk isolasi DNA. Kadar glukosa darah puasa diukur dengan menggunakan metode GOD-PAP. Insulin puasa akan diukur dengan menggunakan metode ELISA. Analisis Genotip Isolasi DNA dilakukan dengan menggunakan kit GeneAid. Analisis genotip dilakukan dengan menggunakan metode polymerase chain reaction-
62
restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP). Primer yang digunakan adalah 5’-CTGTGTTCACTTTGGACATGTTG-3’ untuk forward dan 5’TCAAGGTCAGGTGCTCGTTGG-3’ untuk reverse. Kondisi temperature siklus PCR diatur 940C selama 5 menit untuk denaturasi awal, 940C selama 1 menit untuk denaturasi, 600C selama 1 menit untuk annealing, 720C selama 1 menit untuk tahap extention, dan 720C selama 7 menit untuk tahap final extention. Siklus PCR dilakukan sebanyak 35 siklus. Enzim AvaII digunakan untuk tahap restriksi dan inkubasi dilakukan selama semalam pada suhu 370C. Hasil restriksi akan dilihat dengan elektroforesis pada gel agarose 2%.
Analisis Statistik Uji Kolmogorov-Smirnov digunakan untuk uji normalitas data. Nilai OR dihitung dengan menggunakan uji regresi logistik. Perbandingan nilai IMT, glukosa darah puasa, insulin puasa, dan HOMA-IR antara kelompok obesitas dan normal
dihitung
dengan
menggunakan
uji
T
berpasangan,
sedangkan
perbandingan antara ketiga genotip dihitung dengan menggunakan ANOVA. Nilai p < 0.05 dinyatakan sebagai signifikan secara statistik. V.3. 3. Hasil dan Pembahasan Hubungan polimorfisme K121Q dengan obesitas Frekuensi genotip AC lebih banyak ditemukan pada kelompok obesitas dibandingkan dengan kelompok normal. Hasil studi ini menunjukkan bahwa individu pembawa C memiliki risiko obesitas yang lebih tinggi (OR 1.658; 95%
63
CI 06-4.5) dibandingkan dengan individu dengan genotip AA walaupun secara statistik tidak berbeda secara signifikan (p > 0.05). Alel C juga ditemukan dapat meningkatkan risiko obesitas dibandingkan dengan alel A (OR 1.020; 95% CI 0.679-4.348) namun secara statistik tidak berbeda secara signifikan (p > 0.05). Beberapa
penelitian
menunjukkan
bahwa
polimorfisme
K121Q
berhubungan dengan obesitas pada populasi pria Turki (Tanyolac et al, 2008), populasi China di Beijing (Wan et al., 2006), populasi dewasa Eropa (Ruoqi et al., 2010), dan populasi dewasa dan anak-anak di Meksiko (Meyre et al., 2007). Hasil studi yang telah dilakukan menunjukkan tidak adanya hubungan antara polimorfisme K121Q gen ENPP1 dengan obesitas (p > 0.05). Beberapa penelitian lain juga menunjukkan hasil yang sama, polimorfisme K121Q gen ENPP1 tidak berhubungan dengan obesitas pada populasi India Utara (Prakash et al., 2013), populasi Eropa (Matsuoka et al., 2006), dan populasi wanita turki (Tanyolac et al., 2008). Mekanisme ENPP1 dapat menyebabkan terjadinya obesitas belum diketahui secara pasti. Salah satu kemungkinan mekanisme protein ini menyebabkan obesitas adalah alel C yang dapat menyebabkan resistensi insulin di neuron hipotalamus sehingga fungsi insulin sebagai agen anorektik terganggu (Bruning et al., 2000). Namun, penelitian lebih jauh dibutuhkan untuk memberikan
konfrimasi
terhadap
mekanisme
terjadinya
obesitas
akibat
polimorfisme K121Q gen ENPP1. Hasil beberapa studi yang berbeda mengenai hubungan ENPP1 dan obesitas dapat disebabkan oleh perbedaan latar belakang lingkungan populasi dan perbedaan distribusi genotip di berbagai populasi.
64
Polimorfisme K121Q gen ENPP1 sebagai faktor risiko resistensi insulin pada individu obesitas Pada studi ini ditemukan bahwa individu obesitas dengan genotip AA memiliki risiko resistensi insulin yang lebih tinggi dibandingkan dengan individu normal dengan genotip AA (OR 5.52; 95% CI 2.0-14.3) dan hasil ini signifikan secara statistik (p < 0.05). Individu obesitas dengan genotip AC juga memiliki risiko resistensi insulin yang lebih tinggi dibandingkan dengan individu normal dengan genotip AA (OR 6.62; 95% CI 1.3-34.5) dan hasil ini juga berbeda signifikan secara statistik (p < 0.05). Individu normal yang membawa genotip AC juga ditemukan memiliki risiko yang lebih tinggi untuk mengalami resistensi insulin dibandingkan individu normal dengan genotip AA (OR 1.471; 95% CI 0.32-6.7) namun hasil ini tidak berbeda signifikan secara statistik (p > 0.05). Hasil penelitian ini juga menunjukkan adanya perbedaan risiko resistensi insulin antara individu obesitas dengan genotip AA dan individu obesitas dengan genotip AC. Individu obesitas dengan genotip AC memiliki risiko 4.5 kali lebih tinggi untuk mengalami resistensi insulin, namun tidak signifikan secara statistik. Perbedaan IMT juga memberikan pengaruh yang berbeda walaupun genotip yang dimiliki kedua individu sama. Individu obesitas dengan genotip AC memiliki risiko resistensi insulin 1.2 kali lebih tinggi dibandingkan dengan individu normal dengan genotip AC, namun tidak berbeda signifikan secara statistik. Hasil ini sesuai dengan hasil penelitian yang telah dilaporkan sebelumnya pada populasi Kaukasia di Polandia (Bochenski et al., 2006) dan pada populasi India Utara (Prakash et al., 2013). Selain penelitian yang dilakukan pada suatu
65
populasi, beberapa penelitian in vitro pada sel HEK 293 manusia juga melaporkan adanya hubungan antara polimorfisme K121Q gen ENPP1 dengan resistensi insulin. Coztanzo et al. (2001) melaporkan bahwa varian glutamin (alel C) berhubungan dengan peningkatan risiko resistensi insulin walaupun tidak diekspresikan secara berlebihan. Varian Q yang terekspresikan akibat mutasi missense (A>C) memiliki aktivitas yang lebih tinggi dalam menghambat perubahan konformasi reseptor insulin sehingga proses autofosforilasi reseptor insulin dan aktivasi tirosin kinase akan terganggu. Beberapa penelitian lainnya pada berbagai populasi melaporkan hasil yang berbeda. Polimorfisme K121Q gen ENPP1 dilaporkan tidak berhubungan dengan resistensi insulin dan diabetes tipe 2 pada populasi Kaukasisa Denmark (Rasmussen et al., 2000), populasi India Tengah (Tripathi et al., 2013), dan populasi Jepang (Keshavarz et al., 2006). Hasil studi mengenai hubungan polimorfisme K121Q gen ENPP1 dan resistensi insulin yang masih kontradiksi dapat disebabkan oleh perbedaan distribusi genotip pada masing-masing populasi.
V. 3. 4. Kesimpulan 1.
Frekuensi genotip AC dan CC lebih tinggi pada kelompok obesitas dibandingkan dengan kelompok kontrol namun secara statistik tidak berbeda signifikan (p=0,220).
2.
Individu dengan genotip AC memiliki risiko mengalami obesitas 1,658 lebih tinggi namun secara statistik tidak berbeda signifikan (p=0,320).
66
3.
Individu dengan genotip AC atau CC memiliki nilai HOMA-IR 1,7 kali lebih tinggi dibandingkan dengan pembawa genotip AA (p=0,006). Individu pembawa alel C memiliki nilai HOMA-IR 2 kali lebih tinggi dibandingkan dengan pembawa alel A (p=0,000).
4.
Individu obesitas dengan genotip AC/CC memiliki risiko 6,62 kali lebih tinggi untuk mengalami resistensi insulin (p=0,025) dan individu obesitas dengan alel C memiliki risiko 7,82 kali lebih tinggi untuk mengalami resistensi insulin (p=0,010). V. II. Saran
1. Pengukuran kadar ENPP1 perlu dilakukan agar dapat melihat perbedaan kadar ENPP1 antara kelompok obesitas dan normal. 2.
Pengaruh polimorfisme K121Q gen ENPP1 terhadap proses transduksi sinyal insulin pada tahap aktiviasi IRS dan translokasi GLUT-4 perlu dilakukan karena sejauh ini polimorfisme K121Q gen ENPP1 baru diketahui memiliki pengaruh pada proses autofosforilasi di subunit-β reseptor insulin yang merupakan tahapan awal transduksi sinyal.
3. Terapi insulin bersamaan dengan pemberian inhibitor ENPP1 pada pasien diabetes melitus tipe 2 mungkin dapat mengoptimalkan kerja insulin yang diinjeksi ke tubuh pasien sehingga penelitian mengenai inhibitor ENPP1, terutama inhibitor untuk varian glutamin, perlu dilakukan. 4.
Penelitian lebih jauh mengenai polimorfisme K121Q gen ENPP1 sebagai faktor risiko resistensi insulin pada individu obesitas perlu dilakukan pada
67
etnis di Indonesia Timur karena terdapat perbedaan genetik antara Indonesia bagian barat dan Indonesia bagian timur. 5. Studi dengan gen lain perlu dilakukan karena resistensi insulin merupakan kondisi yang disebabkan oleh berbagai gen.
68
