BAB V KESIMPULAN, SARAN & RINGKASAN V.1. Kesimpulan Berdasarkan hasil penelitian dapat disimpulkan bahwa: 1. Ekspresi hsa-miR-155-5p lebih tinggi 1,13 kali pada plasma darah penderita kanker nasofaring stadium lanjut dibandingkan dengan stadium awal, namun secara statistik tidak signifikan bermakna perbedaannya. 2. Ekspresi mRNA SOCS1 lebih rendah 1,1 kali pada plasma darah penderita kanker nasofaring stadium lanjut dibandingkan dengan stadium awal, namun secara statistik tidak signifikan bermakna perbedaannya. V.2. Saran 1. Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut menggunakan sampel yang lebih besar. 2. Hsa-miR-155-5p dapat dijadikan pertimbangan sebagai target terapi karsinoma Nasofaring, dan mRNA SOCS1 dapat sebagai indikator keberhasilannya. V.3. Ringkasan Karsinoma Nasofaring (KNF) adalah tumor ganas epithelial dengan tingkat insidensi serta rekurensi yang tinggi di dunia terutama Asia. Pemahaman akan deregulasi molekuler pada penderita karsinoma mendukung kemungkinan deteksi dini, penentuan prognosis dan pemberian terapi yang tepat. Mikro RNA (miR) diketahui berperan penting dalam regulasi post-transkriptional pada hampir semua jalur regulasi gen pada sel. MiR menghambat ekspresi gen dengan menarget mRNA (messanger RNA) hasil transkripsi yang kemudian didegradasi
50
51
sehingga tidak mencapai fase translasi dan protein tidak terbentuk. Adanya perubahan genetik dapat menyebabkan deregulasi mikro RNA yang dapat mengakibatkan berbagai penyakit, termasuk kanker. Hsa-miR-155-5p merupakan salah satu mikro RNA yang telah terbukti terkait dengan progesi karsinoma pada manusia. Diketahui bahwa salah satu target hsa-miR-155-5p adalah mRNA SOCS1. SOCS1 merupakan regulator negatif bagi STAT3 pada jalur JAK2. Penurunan jumlah protein SOCS1 mengakibatkan peningkatan aktivasi STAT3. STAT3 teraktifasi akan menjadi faktor transkripsi pada gen-gen berperan karsinoma seperti siklus sel, poliferasi, diferensiasi, invasi, angiogenesis pada berbagai proses selular yang dapat menginisiasi kejadian karsinoma nasofaring. Mikro RNA dapat tetap stabil didalam plasma karena berada dalam kompleks lipid atau lipoprotein seperti badan apoptotis, mikrovesikel, atau eksosom walaupun pada plasma terdapat ribonuclease. Kondisi ini memungkinkan deteksi ekspresi mikroRNA dan mRNA target melalui sampel plasma yang tergolong minimal invasive. Adanya perbedaan ekspresi mikro RNA dan mRNA targetnya juga dapat mengindikasikan progresifitas karsinoma, sehingga mungkin dijadikan suatu dasar penentuan prognosis dan keberhasilan terapi. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui perbedaan ekspresi hsa-miR-155-5p dan mRNA SOCS1 pada plasma darah pasien kanker nasofaring stadium awal dengan stadium lanjut. Analisis insilico interaksi hsa-miR-155-5p dengan mRNA SOCS1 dilakukan dengan basis data bioinformatika. Target penempelan hsa-miR-155-5p
52
terdapat disepanjang 401 nukleotida 3’UTR region dari mRNA SOCS1, yaitu pada posisi nukleotida ke 15-34 dengan nilai Minimum Free Energy (MFE) -15,50 kj/mol atau pada posisi nukleotida ke 218-242 dengan nilai MFE -15,90 kj/mol dan bahkan bisa juga pada posisi nukleotida ke 404-425 dengan nilai MFE -9,13 kj/mol. Penelitian dilakukan dengan tahapan cara : isolasi RNA dari sampel plasma darah dengan menggunakan miRCURY RNA Isolation Kit-Biofluid, pembuatan cDNA dari RNA hasil isolasi sebelumnya dengan kit Universal cDNA Synthesis kit II, 8-64 rxns dan mesin thermal cycler PCR (Biorad c1000) dan pengukuran miR-155 pada cDNA yang dibuat dengan qPCR menggunakan primer spesifik dan Mesin Real-time qPCR (Biorad CFX 96). Untuk mRNA SOCS1 dilakukan One-Step qRT-PCR menggunakan kit KAPA™ SYBR. Dilakukan analisa hasil qRT-PCR dengan Biorad CFX ManagerTM Software untuk mengetahui nilai Quantification cycle (Cq), quantification curve dan melting curve. Perbedaan ekspresi miR-155 dan mRNA SOCS1 pada plasma pasien karsinoma nasofaring dapat diketahui menggunakan rumus Livak Method : 2-∆∆Cq. Melalui medote Livak, dihasilkan perhitungan 2-∆∆Cq sebesar 1,13 kali untuk fold change ekspresi hsa-miR-155-5p pada plasma stadium lanjut kanker nasofaring dibandingkan dengan stadium awal, sedangkan untuk mRNA SOCS1 didapatkan hasil fold change sebesar -1.102. Nilai positif (+) dari perhitungan ∆∆Cq menunjukkan adanya peningkatan ekspresi (upregulated) sedangkan nilai negatif/minus (-) menunjukkan adanya penurunan ekspresi (downregulated). Berbeda dengan ekspresi hsa-miR-155-5p yang justru meningkat pada stadium
53
lanjut, nilai fold change sebesar - 1,10 menunjukkan bahwa ekspresi mRNA SOCS1 plasma KNF menurun (downregulated) 1,1 kali pada stadium lanjut dibandingkan dengan stadium awal. Hasil qRT-PCR selanjutnya dikonfirmasi dengan elektroforesis. Elektroforesis menggunakan gel agarose 2% di running dengan listrik sebesar 100 Volt selama 30 menit. Tampak band sampel plasma KNF stadium awal lebih tebal dibandingkan dengan stadium lanjut. Kenaikan ekspresi hsa-miR-155-5p pada stadium lanjut menunjukkan adanya peningkatan ekspresi hsa-miR-155-5p seiring progesifitas sel kanker seperti yang dikatakan oleh Li et al. (2012) dan Abba et al. (2014), hsa-miR-1555p merupakan salah satu mikro RNA yang telah terbukti terkait dengan progesi karsinoma pada manusia , selain itu Zheng et al. (2012) menyatakan bahwa peningkatan miR-155 berkorelasi dengan prognosis yang buruk pada kanker. Liu et al. (2013) menyatakan bahwa ekspresi miR-155 pada serum penderita kanker payudara berasosiasi dengan stadium klinik. Perhitungan dengan metode Livak menunjukkan hasil yang sebaliknya untuk ekspresi mRNA SOCS1. Terjadi penurunan ekspresi (downregulated) akan mRNA SOCS1 pada plasma stadium lanjut KNF dibandingkan dengan stadium awal KNF. Hasil ini mendukung teori bahwa mRNA SOCS1 merupakan salah satu mRNA target dari hsa-miR-155-5p, dimana peningkatan akan hsa-miR-155-5p berakibat terjadinya penurunan ekspresi SOCS1 . Sebagaimana penelitian Huang et al. (2013) juga membuktikan ada korelasi negatif antara level ekspresi miR-155 dan SOCS1. Pada penelitian Zhao et al (2013), hsa-miR-155-5p terekspresikan lebih tinggi pada stadium lanjut Human Laryngeal Squamous Cell Carcinoma dibandingkan dengan stadium
54
awalnya yang diikuti dengan penurunan ekspresi SOCS1 dan peningkatan ekspresi STAT3 pada stadium lanjut. Penelitian David et al. (2014) menunjukkan penurunan ekspresi SOCS1 seiring progresifitas adenokarsinoma kolon. Ekpresi SOCS1 ditemukan sangat rendah pada stadium lanjut. Identifikasi akan mekanisme molekuler yang berperan pada kanker nasofaring adalah penting dalam keberhasilan perawatan. Penggunaan sampel plasma memungkinkan dalam pemeriksaan molekular pada kanker nasofaring karena memiliki pola ekspresi yang serupa dengan jaringan kanker itu sendiri. Kestabilan hsa-miR-155-5p dan mRNA SOCS1 di plasma darah KNF telah terbukti dan dapat dianalisis secara kuantitatif. Dengan diketahuinya perbedaan ekspresi hsa-miR-155-5p dan mRNA SOCS1 plasma KNF antar stadium awal dan stadium lanjut, keduanya dapat dijadikan indikator progesifitas KNF dengan penggunaan sampel cukup dari plasma. Hsa-miR-155-5p yang terbukti sebagai onkomir dapat dijadikan pertimbangan sebagai target terapi KNF, dan mRNA SOCS1 dapat sebagai indikator keberhasilannya.
