BAB III Alat, Bahan dan Metode Penelitian Pada bagian ini akan diuraikan mengenai peralatan, bahan, dan metode yang digunakan dalam penelitian.
III.1
Alat-alat
Peralatan yang digunakan dalam penelitian merupakan peralatan standar yang biasa digunakan dalam pekerjaan mikrobiologi dan biologi molekular. Jenis peralatan meliputi peralatan gelas, non gelas, dan perangkat lunak komputer. Peralatan gelas terdiri dari cawan petri, gelas kimia, labu Erlenmeyer, gelas ukur, tabung reaksi bertutup, botol reagen, pipet tetes, batang pengaduk, batang bengkok gelas (spreader glass), labu Buchner dan corong penyaring (filter holder) (Duran, Schott, Germany; Pyrex, USA). Peralatan non gelas meliputi meliputi mikropipet dan tip mikropipet berukuran 2,5 μL, 10 μL, 100 μL, 1000 μL, dan 5000 μL serta tabung mikrosentrifuga berukuran 200 μL, 500 μL, 1500 μL, dan 2000 μL (Eppendorf, Germany; dan Gilson, France). Timbangan digital model 682B (Mettler Toledo, Switzerland) digunakan untuk penimbangan massa bahan kimia. Pengukuran pH larutan dapar dan media dilakukan dengan pH meter (Beckman, USA). pH meter portable (Hanna Inc.) digunakan untuk pengukuran pH di lapangan. Autoclave model no. 25X (Electric Pressure Steam Sterilizer, USA) digunakan untuk sterilisasi alat dan bahan. Shaking incubator Thermolyne digunakan untuk inkubasi yang memerlukan pengocokan dan inkubator model 2219 Multitemp II (Bromma, Sweden) untuk inkubasi tanpa pengocokan. Vortex (Genie Scientific Industries Inc. Model G 560E, LR 45227, USA) digunakan untuk pencampuran larutan dan pemecahan sel mikroba. Freezer -20oC (Forma Scientific, Inc., USA) digunakan untuk penyimpanan DNA dan freezer -80oC (Forma Scientific, Inc., USA) untuk penyimpanan stok gliserol. Refrigerator (Sharp, Japan) digunakan untuk menyimpan larutan, biakan bakteri pada media padat pada suhu 4oC. Mikroskop model YS100 (Nikon, Japan) digunakan untuk mengamati bentuk sel mikroba. Pengambilan gambar mikroba dan DNA dilakukan dengan kamera digital Coolpix P3 (Nikon, Japan).
27
Percobaan isolasi dan amplifikasi DNA menggunakan peralatan mikrosentrifuga (Beckman) untuk sentrifugasi pada suhu kamar, mikrosentrifuga dingin model biofuge (Heraus) untuk sentrifugasi pada suhu 4oC, alat PCR model Gene Cycler (Bio-Rad), dan spectrophotometer 100-60 (Hitachi). Pemisahan fragmen DNA dilakukan dengan menggunakan peralatan elektroforesis tipe EC250-9 EC (Apparatus Corp., USA) dan visualisasi hasil elektroforesis dilakukan dengan lampu ultraviolet (Cole Parmer Instruments, France). Dokumentasi hasil visualisasi tersebut dilakukan dengan kamera digital Coolpix P3 (Nikon, Japan). Pemisahan DNA dengan cara DGGE (denaturing gradient gel electrophoresis) dilakukan dengan menggunakan alat DCode System (BioRad). Alat Atomic Absorption Spectroscopy (AAS, GBC Avanta Ver. 2.02, Australia) digunakan untuk penentuan kandungan logam pada sampel air. Perangkat lunak komputer ClustalW, Phylip 6.3, GenDoc, dan Treeview digunakan untuk analisis penjajaran urutan nukleotida, konstruksi pohon filogenetik, dan visualisasi hasil penjajaran dan pohon filogenetik. Beberapa program online seperti BLASTN dari National Centre of Biotechnological Information (NCBI) melalui situs http://www.ncbi.nlm.nih.gov, dan CHECKCHIMERA
dari
Ribosomal
Database
Project
(RDP)
melalui
situs
http://rdp.cme.msu.edu masing-masing digunakan untuk penjajaran urutan nukleotida dengan data nukleotida yang ada di GenBank dan melihat kemungkinan adanya chimera.
III. 2
Bahan-bahan
Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian meliputi zat kimia untuk pembuatan media dan reagen, primer untuk amplifikasi, dan enzim. Zat kimia yang digunakan mempunyai kualitas pro analysis (p.a) kecuali jika disebutkan lain. Zat kimia yang digunakan meliputi bakto tripton, bakto pepton, ekstrak ragi, bakto agar, beef extract, Na2HPO4, KH2PO4, NaCl, NH4Cl, MgCl2, EDTA, CaCl2, NaNO3, KNO3, MgSO4.7H2O, CaSO4.2H2O, FeCl3, MnSO4.H2O, H3BO3, ZnSO4.7H2O, CoCl2.6H2O, CuSO4.5H2O, Na2MoO4.2H2O, H2SO4, SDS, AgNO3, kloroform, isoamilalkohol, etanol, basa tris, gliserol, isopropanol, asam asetat
28
glasial, dan kalium asetat (Merck, Germany); etidium bromida, gelrite, xylene cyanol (Sigma Chemicals Co., USA); formamida, dapar PCR 10X (Tris Cl 10 mM, MgCl2 1,5 mM, KCl 59 mM) dan campuran dNTP (Amersham Pharmacia Biotech. Inc., USA); bromophenol blue (Pharmacia LKB Biotechnology Inc., Piscataway, NJ); agarosa (Gibco BRL, USA); glukosa, sukrosa, urea (USB, USA). Enzim yang digunakan dalam penelitian meliputi proteinase K (USB Corp. USA), lisozim (Amersham Life Science, UK), dan enzim DNA polimerase Taq (Fermentas). Primer-primer yang digunakan untuk keperluan amplifikasi fragmen gen 16S rRNA dan sekuensing tercantum dalam Tabel III.1. Tabel III.1 Jenis primer yang digunakan dalam reaksi amplifikasi PCR dan sekuensing.
1
Nama Primer Primer 1
2
Primer 2
3
Primer 3
4
Bact27 F
5
Uni1492 R
6
Com1-F
CAGCAGCCGCGGTAATAC
7
Com2-R
CCGTCAATTCCTTTGAGTTT
No
III. 3
Urutan (5’ → 3’)
Referensi
Keperluan
ATGGCTGTCGTCAGCT CGCCCGCCGCGCCCCGCGCC CGGCCCGCCGCCCCCGCCCC ACGGGCGGTGTGTAC CACGGGCGGTGTGTAC AGAGTTTGATC(A/C)TGGCT CAG GGTTAC(G/C)TTGTTACCTGC CGGA
Ferris et al., 1996
PCR
Ferris et al., 1996
PCR
Ferris et al., 1996
PCR/Sekuensing
Baker et al.,2001
PCR/Sekuensing
Baker et al.,2001
PCR/Sekuensing
Schwieger dan Tebbe, 1998 Schwieger dan Tebbe, 1998
Sekuensing Sekuensing
Metode Penelitian
Metode penelitian meliputi semua pengerjaan yang digunakan dalam penelitian berkaitan dengan penanganan sampel mikroba dan DNA, serta analisis filogenetik.
29
III.3.1 Pengambilan sampel Sampel diambil dari dua lokasi di sekitar Kawah Hujan (E 107°48’14.38”, N 7°8’21.7” dan ketinggian 1690 m), Kamojang, Jawa Barat. Pengambilan sampel Kawah Hujan A dilakukan pada bulan Januari 2007, sedangkan sampel Kawah Hujan B diambil pada bulan Juni 2006. Pengukuran suhu air kawah dan pH (menggunakan pH indikator) di lokasi dilakukan selama 3 kali, yaitu pada bulan Juli 2004, Juni 2006, dan Januari 2007. Pengukuran pH air kawah menggunakan pH meter dilakukan di laboratorium. Lima liter masing-masing sampel air kawah dibawa ke laboratorium menggunakan jerigen yang sudah disterilkan dengan etanol dan dibilas dengan air kawah. Sampel sesegera mungkin dibawa ke laboratorium untuk ditangani sesuai keperluannya.
III.3.2 Isolasi mikroba dengan cara filtrasi Segera setelah tiba di laboratorium, sekitar 5 liter sampel air kawah disaring dengan filter membran berukuran 0,22 mikro meter menggunakan filter holder yang diisap dengan pompa vakum. Penyaringan dilakukan di laboratorium dalam kondisi aseptik. Mikroba beserta endapan lainnya yang tersaring pada filter dicuci dengan cara disuspensikan dalam 3 mL dapar STE (10mM Tris-HCl [pH 8.0], 0,1 M NaCl, 1mM EDTA). Suspensi dimasukkan ke dalam 2 tabung mikrosentrifuga dan disentrifugasi pada kecepatan 3000 x g. Supernatan dibuang dan pelet kembali dicuci dengan dapar STE sebanyak minimal 4 kali. Pelet yang telah dicuci disimpan di freezer -20°C sampai dilakukan isolasi DNA kromosom.
III.3.3 Isolasi mikroba dengan cara kultivasi Sampel air kawah sebanyak 50 mL ditambah dengan 1 mL media pengaya yang sudah dipekatkan 50 kali. Penambahan media pengaya ke dalam sampel dilakukan di lokasi pengambilan sampel. Media pengaya yang ditambahkan antara lain pepton 5% (b/v), media LB 25x pekat, media termus 50x pekat, campuran pepton 10% (b/v) dan ekstrak ragi 5% (b/v), media Castenhold D (Atlas, 1993) 50x pekat, media Czapek Dox (Atlas, 1993) 100x pekat, media sulfolobus 50x pekat, dan media sulfat-reducing 50x pekat. Komposisi media Casrenhold D, Czapek Dox, sulfolobus, dan sulfat-reducing dapat dilihat pada Lampiran A. Selama perjalanan
30
dari lokasi ke laboratorium, sampel diupayakan berada pada temperatur tinggi dengan cara dimasukkan ke dalam termos yang berisi air kawah. Sampel tersebut kemudian diinkubasi pada temperatur 70°C tanpa pengocokan setelah sampai di laboratorium. Inkubasi dihentikan setelah terlihat adanya peningkatan kekeruhan pada sampel dibandingkan dengan sebelum diinkubasi.
III.3.4 Pewarnaan Gram mikroba Preparat mikoba dibuat dengan membuat lapisan tipis kultur mikroba di atas kaca preparat dan difiksasi dengan cara pemanasan di atas api. Kultur terfiksasi kemudian ditetesi dengan pewarna Hucker (crystal violet) selama 1 menit dan dicuci dalam air mengalir selama tidak lebih dari 2 detik. Selanjutnya, lapisan tersebut direndam dalam larutam Mordant (Gram’s iodine) selama 1 menit. Warna dihilangkan melalui pencucian dengan etanol 95% dilanjutkan dengan pencucian dalam air mengalir. Preparat direndam dalam counterstain (Safranin O) selama 1 menit, kemudian dicuci dalam air mengalir dan dikeringkan. Mikroba yang sudah diwarnai dilihat di bawah mikroskop pada perbesaran 400 kali.
III.3.5 Isolasi DNA kromoson DNA kromosom diisolasi menggunakan metode lisis berbasis enzimatis yang merupakan modifikasi dari metode yang dikemukakan oleh Klijn et al. (1991), dan perusakan secara fisik, modifikasi dari metode Zhou et al. (1996). Metode enzimatis dilakukan sebagai berikut: pelet sel disuspensi dalam 200 µL dapar Tris Cl (pH 8,0) yang mengandung 8 mg/mL lisozim dan diinkubasi pada temperatur 37°C selama 1 jam. Sel kemudian dilisis dengan penambahan 200 µL dapar lisis yang mengandung SDS 2%, 0,8 mg/mL proteinase K, dan 200 mM EDTA pH 8,0. Proses lisis dilakukan pada temperatur 50°C selama 30 menit. Selanjutnya ditambahkan 150 µL larutan C dingin (60 mL CH3COOK 5M; 11,5 mL asam asetat glasial; 28,65 mL H2O) dan divorteks selama 10 detik. Campuran kemudian diinkubasi dalam es selama 5 menit dan selanjutnya disentrifugasi pada 16.000 x g, 4oC selama 10 menit. Supernatan dipindahkan ke dalam tabung mikrosentrifuga baru, kemudian ditambahkan 300 µL kloroform:isoamilalkohol
31
(24:1), divorteks dan disentrifugasi pada 16.000 x g selama 30 detik. Lapisan atas dipindahkan ke dalam tabung baru. Penambahan kloroform:isoamilalkohol (24:1) dilakukan sebanyak 2 kali. Selanjutnya, DNA diendapkan dengan penambahan 0,6 volum isopropanol dan diinkubasi pada temperatur ruang selama 1 jam. Setelah dilakukan sentrifugasi selama 15 menit pada kecepatan 16.000 x g, pelet DNA dicuci dengan 70% etanol sebanyak 3x, dikeringkan, dan akhirnya dilarutkan dalam ddH2O. Metode perusakan fisik (bead-beating) dilakukan sebagai berikut: pelet sel disuspensi dalam 300 µL dapar ekstraksi (100 mM Tris-Cl pH 8,0; 100mM EDTA pH 8,0; 100mM KH2PO4; dan 1,5M NaCl) yang mengandung 0,8 mg/mL proteinase K. Selanjutnya suspensi sel divorteks dengan kecepatan sedang selama 15 menit setelah ditambahkan glass bead steril. Ke dalam campuran kemudian ditambahkan 30 µL SDS 20% dan diinkubasi pada temperatur 65°C selama 2 jam. Pemurnian
DNA
dilakukan
dengan
penambahan
1x
volum
kloroform:isoamilalkohol (24:1), divorteks dan disentrifugasi pada kecepatan maksimum selama 30 detik. Lapisan atas dipindahkan ke dalam tabung baru. Langkah pemurnian DNA dilakukan selama 2 kali. Selanjutnya, DNA diendapkan dengan penambahan 0,6 volum isopropanol dan diinkubasi pada temperatur ruang selama 1 jam. Setelah dilakukan sentrifugasi selama 15 menit pada kecepatan 16.000 g, pelet DNA dicuci dengan 70% etanol sebanyak 3x, dikeringkan, dan akhirnya dilarutkan dalam ddH2O.
III.3.6 Elektroforesis gel agarosa Fragmen DNA dipisahkan dengan cara elektroforesis pada gel agarosa 1% dalam dapar TAE. 0,3 g agarosa dilarutkan dalam 30 mL dapar TAE 1 X (1 L TAE 50 X: 242 g tris base, 57,1 mL asam asetat glacial, 100 mL 0,5 M EDTA pH 8,0), dipanaskan hingga medidih kemudian didinginkan. Setelah mencapai suhu sekitar 55oC larutan (gel) dituang ke dalam cetakan yang sudah diberi sisir dan dibiarkan membeku. Marker DNA dan sampel sebanyak 10 μL yang akan dielektroforesis masing-masing dicampurkan dengan 2 μL loading buffer (0,25% bromphenol blue dalam 40% sukrosa), kemudian dimasukkan ke dalam sumur gel. Elektroforesis
32
dilakukan dalam dapar TAE 1X dengan tegangan 75 volt sampai warna biru loading buffer bermigrasi kira-kira 2/3 bagian dari panjang gel. Gel agarosa tersebut direndam di dalam larutan etidium bromida (10 μg/mL) selama 30-60 detik, kemudian gel direndam selama 5-10 menit dalam larutan 1 mM MgSO4 dan pita-pita DNA akan terlihat di bawah sinar UV.
III.3.7 Amplifikasi DNA 1 Amplifikasi DNA 1 merupakan amplifikasi fragmen gen 16S rRNA. Proses amplifikasi dilakukan dengan menggunakan metode PCR touchdown berdasarkan metode yang dikemukakan oleh Ferris et al. (1996). Enzim DNA polimerase yang digunakan untuk PCR adalah enzim Taq DNA polimerase. Sebanyak 25 μL campuran reaksi PCR (dapar PCR 1X; 20 pmol Primer 1; 20 pmol Primer 2; 10 mM dNTPs; MgCl2 1,5mM; 1 unit enzim DNA polimerase Taq; 0,5-2 μL DNA templat) digunakan untuk amplifikasi DNA kromosom. Siklus PCR adalah 1 menit untuk denaturasi pada 94°C, 1 menit untuk annealing, dan 1 menit untuk pemanjangan primer pada 72°C. Pada 10 siklus pertama, temperatur annealing menurun secara teratur dari 53°C sampai 43°C dengan interval 1°C per siklus. 20 siklus selanjutnya, temperatur annealing dilakukan pada 43°C. Pemanjangan primer terakhir dilakukan selama 10 menit.
III.3.8 Amplifikasi DNA 2 Amplifikasi DNA 2 merupakan proses amplifikasi DNA menggunakan metode standar PCR. Campuran total reaksi PCR (50 μl) mengandung dapar PCR 1X, 10 mM dNTP, pasangan primer masing-masing 20 pmol, MgCl2 3 mM, 2 unit enzim DNA polimerase Taq, dan ~10 ng DNA templat. Proses amplifikasi dilakukan dengan tahap denaturasi awal 94oC selama 4 menit dilanjutkan dengan 30 kali siklus PCR yang terdiri dari 1 menit untuk denaturasi pada 94oC, 1 menit untuk annealing pada 50oC, dan 1 menit untuk pemanjangan pada 72oC, diikuti oleh tahap akhir pemanjangan pada 72oC selama 10 menit. Kondisi PCR ini digunakan untuk mengamplifikasi pita-pita DNA hasil DGGE dan gen 16S rRNA utuh, masing-masing menggunakan pasangan primer P1 dengan P3 dan Bact27F dengan uni1492R.
33
III.3.9 Denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) Teknik pemisahan dengan cara DGGE (denaturing gradient gel electrophoresis) dilakukan berdasarkan metode Fischer dan Lerman (1983). Ada beberapa tahapan dalam melakukan elektroforesis tersebut, antara lain: penyiapan larutan, pembuatan gel, penyiapan sampel, dan elektroforesis. Semua peralatan dalam elektroforesis harus dalam keadaan bersih dan bebas lemak. Untuk keperluan tersebut maka pelat kaca yang digunakan sebagai cetakan dalam pembuatan gel dicuci terlebih dahulu dengan deterjen hingga bersih, kemudian dikeringkan dan terakhir dibersihkan dengan 70% alkohol teknis. Cetakan gel dengan ketebalan 1,5 mm berikut pompa pembuat gradien (gradient delivery system) dipersiapkan sesuai dengan petunjuk pada buku manual alatnya. Pembuatan reagen bervariasi sesuai dengan konsentrasi denaturan dan akrilamid yang akan digunakan. Denaturan 0% dan 100% harus dibuat sebagai stock solution. Larutan 100% denaturan terdiri dari campuran urea 7 M dan formamida 40% (b/v) ditambah larutan akrilamid dengan konsentrasi sesuai yang akan digunakan dalam dapar TAE 1x. Larutan dengan konsentrasi denaturan tinggi dan denaturan rendah yang akan digunakan dibuat dengan mencampurkan larutan stock denaturan 0% dan 100% tersebut. Kedua larutan dibuat dalam 2 wadah terpisah. Setelah ditambahkan
larutan
amonium
persulfat
(APS)
10%
(b/v)
dan
tetrametiletilendiamin (TEMED), masing-masing larutan dimasukkan ke dalam syringe dan dipasangkan pada pompa pembuat gradien yang kemudian disambungkan dengan selang kecil untuk dimasukkan ke dalam cetakan gel. Larutan dimasukkan ke dalam cetakan gel kemudian dipasang sisir di bagian atasnya dan dibiarkan sampai memadat. Gel yang sudah membeku dipasangkan ke dalam alat untuk elektroporesis, kemudian dimasukkan ke dalam tangki elektroforesis berisi dapar TAE 1x yang sudah dipanaskan sebelumnya sampai temperatur 60°C. Sisir di atas gel dibuka dan masing-masing sumur dibersihkan dari sisa-sisa larutan dengan cara menyemprotkan dapar TAE dengan pipet atau syringe kecil. Electrophoresis control module dipasangkan dan dijalankan sampai sistem kembali mencapai temperatur 60°C. Sampel DNA sebanyak 5 – 10 μL DNA dicampurkan (1:1) dengan gel loading dye 2x (0,05% (b/v) bromophenol
34
blue, 0,05% (b/v) xylene cyanol, dan 70% gliserol) kemudian dimasukkan ke dalam masing-masing sumur di dalam gel. Elektroporesis dijalankan pada tegangan 200 volt dan temperatur 60°C selama 3-4 jam hingga warna loading dye mencapai batas tertentu bagian bawah gel. Setelah elektroforesis selesai, gel dilepas dari alat elektroforesis untuk diwarnai.
III.3.10 Pewarnaan DNA dengan perak nitrat (Silver staining) Pewarnaan DNA yang terdapat di dalam gel akrilamid didasarkan pada metode yang dikembangkan oleh Bassam et al. (1991). Gel hasil elektroforesis difiksasi dengan larutan asam asetat 10% (b/v) sebanyak 2 kali masing-masing selama 10 menit. Gel dicuci 3 kali dengan aqua dm masing-masing selama 2 menit kemudian direndam dalam larutan pewarna (AgNO3 0,1% (b/v), formaldehid 0,5% (v/v)) selama 30 menit. Setelah gel dicuci kembali dengan aquadest sebanyak 2 kali, gel direndam di larutan developing (Na2CO3 3% (b/v), formaldehid 0,5% (v/v), Natiosulfat 0,002 mg/mL) pada temperatur 4°C sampai pita pita DNA muncul. Tahap akhir dari pewarnaan adalah fiksasi dengan menggunakan asam asetat 10% (b/v) dan pencucian kembali dengan aqua dm. Gel kemudian dikeringkan di antara 2 plastik selofan.
III.3.11 Ekstraksi DNA dari gel DGGE Masing-masing pita yang terdapat pada gel DGGE dipotong dan disuspensi dalam 50 μL ddH2O, kemudian dididihkan selama 5 menit dan dibiarkan terdifusi selama satu malam pada 37oC. Larutan DNA dibiarkan di temperatur 4°C sampai dijadikan templat untuk proses re-PCR (Muyzer et al., 1993).
III.3.12 Penentuan urutan DNA Penetuan urutan DNA (sekuensing) dilakukan melalui jasa komersial di Macrogen Inc., Korea. Proses penentuannya adalah menggunakan metode Dye Terminator (3’-dye labelled dideoxynucleotide triphosphate) yang meliputi beberapa tahap, yaitu: penyiapan template, reaksi sekuensing, pemurnian produk PCR, dan elekroforesis dengan scanning fluoresence.
35
III.3.13 Analisis filogenetik Dalam penelitian ini beberapa data perlu dilakukan analisis dengan bantuan program komputer, antara lain: analisis adanya chimera pada urutan DNA sampel, penjajaran urutan DNA sampel dengan urutan DNA yang ada di GenBank, pengambilan urutan DNA dari GenBank, penyuntingan urutan DNA, penjajaran urutan DNA menggunakan program ClustalW versi 1.83, dan konstruksi pohon filogenetik menggunakan program Phylip 3.62. III.3.13.1 Analisis chimera dan penjajaran urutan DNA Semua urutan DNA sampel yang akan dianalisis dikonfirmasi keberadaan urutan chimera sebelum dilakukan penjajaran. Analisis chimera dilakukan menggunakan program komputer CHECK-CHIMERA dari Ribosomal Database Project (Maidak et al. 2000) yang dapat diakses dari dari situs http://rdp.cme.msu.edu. Urutan yang diduga merupakan chimera tidak dianalisis lebih lanjut. Kemiripan urutan DNA sampel dengan urutan DNA yang sudah dideposit di GenBank dapat diketahui melalui penjajaran urutan DNA sampel dengan data nukleotida di NCBI melalui situs http://www.ncbi.nlm.nih.gov. Penjajaran dilakukan dengan menggunakan program BLASTN (Altschul et al. 1997). Selanjutnya, sekitar 100 urutan DNA yang mempunyai kemiripan tertinggi dengan sampel di-download melalui situs yang sama. File disimpan dalam bentuk FASTA (teks) untuk mempemudah penyuntingan. Data yang diambil dari GenBank memiliki ukuran yang berbeda-beda. Untuk mendapatkan analisa yang benar, harus digunakan urutan DNA dengan ukuran dan posisi yang sama pada gen. Untuk mengetahui posisi tersebut dilakukan penjajaran menggunakan program ClustalW versi 1.83 (Thomson et al. 1994). Selanjutnya, daerah di luar posisi tersebut dihilangkan. Data yang sudah sama ukuran dan posisinya dikelompokkan ke dalam satu file dalam bentuk Text Document menggunakan program notepad. Prosedur untuk melakukan penjajaran nukleotida menggunakan program ClustalW disampaikan pada Lampiran B.
36
III.3.13.2 Konstruksi pohon filogenetik Pohon filogenetik dikonstruksi menggunakan program Phylip 3.62 (Felsenstein, 1989). Data masukan (input file) yang digunakan untuk mengkonstruksi pohon filogenetik adalah urutan nukleotida yang sudah dijajarkan menggunakan program ClustalW dalam format phy. Jarak evolusi dihitung dengan menggunakan metode F84 sesuai dengan default program DNADIST. Pohon filogenetik dikonstruksi berdasarkan perhitungan matriks jarak dengan metode neighbor-joining (Saitou dan Nei, 1987) menggunakan program NEIGHBOR. Program SEQBOOT digunakan untuk analisis bootstrap dengan memasukkan nilai set data 1000. Prosedur untuk mengkonstruksi pohon filogenetik disampaikan pada Lampiran B. III.3.14 Analisis kandungan kimia air kawah Analisis kadar logam dalam air kawah dilakukan dengan metode spektroskopi serapan atom atau AAS. Untuk pembuatan kurva standar, dibuat larutan standar 1000 ppm dari masing-masing logam yang akan dianalisis. Zat yang digunakan sebagai standar antara lain: (NH4)2Fe(SO4)2, CaCO3, MnSO4, MgCl2, NaCl, Al2(SO4)3, KCl. Larutan standar dengan konsentrasi lebih kecil yang berada dalam rentang pengukuran serapan yang baik dibuat dengan cara mengencerkan larutan standar 1000 ppm. Selanjutnya, terhadap sampel dan larutan standar dilakukan pengukuran serapannya pada panjang gelombang yang sesuai. Analisis kadar Cl- dan SO42- dilakukan di Lab Kimia Analitik FMIPA ITB. Kadar NO3-, NO2-, dan F- dianalisis di Lab Air Teknik Lingkungan ITB, menggunakan jasa layanan masyarakat.
37
