BAB III BAHAN DAN METODE PENELITIAN
3.1 Waktu dan Lokasi Penelitian 3.1.1. Lokasi Penelitian Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Bioteknologi Perikanan dan Kelautan Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan Universitas Padjajaran. Sampel usus ikan di peroleh dari dari dua tempat yang berbeda. Bawal air tawar didapat dari Balai Pengembangan Produksi Budidaya Air Tawar Tasik (BPPBAT) dan bawal bintang didapat dari Muara Angke Jakarta. 3.1.2. Waktu Penelitian Waktu yang dibutuhkan untuk melaksanakan penelitian ini adalah 1 bulan dilaksanakan pada bulan Februari sampai dengan bulan Maret 2013. 3.2 Alat dan Bahan 3.2.1. Alat Isolasi dan Pemurnian Bakteri 1. Cawan petri sebagai tempat isolasi serta pemurnian bakteri 2. Mikropipet untuk mengambil larutan dalam jumlah sedikit (dibawah 1 ml). 3. Inkubator untuk melakukan inkubasi bakteri. 4. Autoklaf untuk melakukan sterilisasi. 5. Oven untuk melakukan sterilisasi kering. 6.
Hot plate untuk memanaskan medium
7.
Tabung reaksi untuk menyimpan NaCl
8.
Tabung Erlenmeyer steril dan plastik sampel untuk menyimpan medium
9.
Rak tabung reaksi untuk menyimpan tabung reaksi
10. Gelas ukur untuk mengukur volume larutan yang digunakan. 11. Laminar sebagai tempat melakukan kegiatan isolasi dan pemurnian bakteri.
30
31
12. Bunsen untuk menghindari kontaminasi data isolasi ataupun pemurnian bakteri. 13. L glass untuk meratakan hasil ekstraksi saat isolasi bakteri. 14. Jarum ose untuk melakukan permunian bakteri. 15. Pinset untuk mengambil sampel
B. Deteksi Proteolitik 16. Cawan petri sebagai tempat medium dan pengujian 17. Jarum ose untuk memindahkan isolat murni ke cawan petri yang berisi medium. 18. Inkubator untuk melakukan inkubasi bakteri sebelum pengujian 19. Hot plate untuk memanaskan medium 20. Bunsen untuk mencegah kontaminasi saat memindahkan bakteri 21. Gelas ukur untuk mengukur volume larutan 22. Timbangan digitaluntuk menimbang bahan
C. Identifikasi Bakteri dengan 16S rRNA 1. Kultur Cair -
Botol duran scot untuk menyimpan medium
-
Tabung reaksi untuk tempat kultur cair
-
Jarum ose untuk memindahkan biakkan bakteri
-
Bunsen untuk mencegah kontaminasi saat pemindahan bakteri
-
Shaker Incubator untuk inkubasi bakteri
2. Isolasi DNA -
Rak microtube untuk menyimpan microtube
-
Mikro pipet untuk mengambil larutan DNA dan larutan kimia.
-
Centrifuge untuk memisahkan larutan
-
Microtube untuk menyimpan ekstraksi DNA
-
Timbangan analitik untuk menimbang berat sampel
-
Waterbath untuk inkubasi ekstrak DNA
-
Vortex untuk menghomogenkan larutan
32
3. Polymerase Chain Reaction -
Termal cycler untuk melakukan amplifikasi DNA
-
Microtube untuk wadah komponen PCR
4. Elektroforesis Gel Agarose -
Gelas ukur untuk mengukur larutan TBE
-
Timbangan analitik untuk menimbang agarose
-
Cetakan gel agarose (sisir) untuk mencetak gel agarose dan membuat sumursumur untuk penempatan hasil ekstraksi
-
Hot plate dan Magnetic Stirrer
untuk membuat larutan agarosa dengan
pelarut TBE -
Sendok pipih untuk memindahkan gel agarose
-
Alat elektroforesis untuk memisahkan pita DNA dengan bantuan arus listrik
-
Power supply untuk penyalur arus listrik
-
Ultraviolet Transilluminator untuk melihat hasil akhir elektroforesis.
3.2.2. Bahan Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini meliputi a. Proses isolasi bakteri 1.
Sampel usus Ikan Bawal air tawar (Colossoma macropomum)
2.
Sampel usus Ikan Bawal bintang (Trachinotus blochii)
3.
NaCl fisiologis
4.
dH2O
5.
Kapas dan kain kasa
6.
Plastik dan plastik wrap
7.
Alumunium foil
8.
Kertas label
b. Uji Aktivitas Proteolitik 1. Medium marine agar 2. TSB 3. Susu skim
33
4. Akuades 5. NaCl 1M 6. Plastik wrap dan plastik tahan panas 7. Kertas label 8. Kapas 9. Kain kasa
c. Identifikasi Bakteri Secara Molekuler 1.
Kultur Cair
-
Nutrient Broth
-
Akuades
2.
Isolasi DNA Bakteri
-
Nuclease free water (NFW)
-
Promega Kit a. Nuclei Solution b. Protein Precipitation Solution c. Rehidration Solution
-
Ethanol absolute 70%.
-
Lysozime
-
RNAse
-
TE Buffer
-
Isopropanol d. Amplifikasi Gen 16S rRNA
-
DNA Template
-
PCR Master Mix (Promega)
-
Primer Forward F 16S rRNA
-
Primer Reverse R 16S rRNA
-
Nuclease Free Water
e.
Elektroforesis
-
Gel agarose dan akuades
-
Larutan pemberat dan pewarna (Loading dye)
34
-
Larutan Tris Borat EDTA (TBE)
-
Ethidium Bromide (EtBr)
-
DNA Ladder 1kb (Biolabs)
3.3 Metode Penelitian Penelitian ini dilakukan dengan menggunakan analisis deskriptif untuk mendapatkan data yang diperlukan. Dengan alur penelitiannya sebagai berikut: I.
Kultivasi Bakteri
Isolasi Sampel
Kultivasi bakteri (medium NA dan susu skim)
Subkultur s/d isolat tunggal
II.
Uji Aktivitas Proteolitik Uji Zona Bening (Aktivitas Proteolitik)
Pengambilan 10 isolat terbaik
III.
Analisis Molekuler Gen 16S rRNA Isolasi DNA Bakteri
Analisis molekuler 16S RNA (PCR) dan sekuensing Analisis bioinformatik 3.4 Prosedur Penelitian 3.4.1. Sterilisasi Alat dan Medium Sebelum melakukan isolasi ataupun pemurnian bakteri, perlu dilakukan sterilisasi alat guna mencegah kontaminasi dari alat ataupun medium yang digunakan. Sterilisasi dilakukan dengan 2 cara, yaitu sterilisasi uap dengan menggunakkan autoklaf dan sterilisasi kering dengan menggunakan oven.
35
Tabel 2. Hubungan Tekanan, Suhu dan Waktu pada Sterilisasi dengan Uap Bertekanan Tekanan Uap (ATM)
Suhu (°C)
0,0 100,0 0,5 111,3 0,7 115,5 1,0 121,5 1,3 126,5 2,0 134,0 Sumber. Mikrobiologi Dasar dalam Praktik (2010)
Waktu untuk Mematikan Spora Tahan Panas 15-60 15-60 12-5 12-5 3--5
Sterilisasi dengan autoklaf dilakukan dengan menyimpan alat atau medium yang akan digunakan di dalam autoklaf, lalu autoklaf dinyalakan hingga mencapai suhu 121°C, setelah mencapai suhu tersebut biarkan selama 15 menit untuk membunuh kontaminan mikroba yang kemungkinan didapat mengkontaminasi alat ataupun medium. 3.4.2 Kultivasi Bakteri dan Pemurnian Kultivasi bakteri dilakukan melalui beberapa tahap, yaitu: -
Membuat media nutrient agar dan susu skim dengan perbandingan 3:1, disterilisasi dengan wadah atau erlenmeyer terpisah dan dihomogenkan sebelum dituang ke dalam cawan petri.
-
Sampel usus yang telah diambil kemudian diukur derajat keasamannya pada bagian pyloric caeca.
-
Bagian usus yang termasuk pyloric caeca ditambahkan dengan NaCl fisiologis kemudian digerus dengan menggunakan sumpit dalam tabung ependorf
-
Memasukkan sampel yang telah digerus kedalam tabung reaksi yang berisi 90 ml NaCl fisiologis, kemudian dihomogenkan selama 2 menit
-
Mengambil 1,0 ml larutan menggunakan mikropipet dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi kedua. Begitu seterusnya hingga pengenceran 10 -7
-
Memasukan kedalam cawan petri yang telah berisi medium agar dan susu skim.
36
-
Meratakan menggunakan L Glass
-
Menutup cawan petri dan lapisi dengan plastik wrap
-
Menyimpan dalam inkubator pada suhu 37 °C selama 24 jam Pemurnian bakteri dilakukan melalui beberapa tahap, yaitu:
-
Mengambil bakteri yang telah murni
-
Mengambil koloni bakteri yang terpisah
-
Menyeleksi koloni bakteri yang akan dimurnikan berdasarkan pada bentuk, warna dan kenampakkan lainnya.
-
Mengambil bakteri yang akan dimurnikan menggunakan jarum ose.
-
Memindahkan bakteri yang telah diambil ke cawan petri yang berisi medium agar lain menggunakan metode gores
-
Menutup cawan petri dan melapisinya dengan plastic wrap Proses tersebut diulangi hingga mendapat isolat murni dimana hanya terdapat
bakteri yang sama dalam isolat tersebut. 3.4.3 Uji Aktivitas Proteolitik Setelah didapat isolat tunggal dilakukan uji aktivitas proteolitik. Uji skrining ini dilakukan pada media agar dengan tambahan TSB, susu skim dan tepung kedelai dari volume agar. Pada pengujian ini dilihat zona bening yang dihasilkan. Pengujian ini dilakukan melalui beberapa tahapan, yaitu: -
Mengambil bakteri yang ada pada isolat tunggal menggunakan jarum ose.
-
Memindahkan bakteri menggunakan jarum ose kedalam cawan petri lain yang berisi medium agar + susu skim.
-
Melakukan kultivasi bakteri selama 2X24 jam.
-
Mengamati dan mengukur luasan zona bening yang dihasilkan. Zona bening merupakan respon dari bakteri terhadap TSB dan susu skim serta
tepung kedelai yang ditambahkan dalam medium. Dari seluruh isolat tunggal yang diuji aktivitas proteolitik, diambil 5 sampel yang menghasilkan indeks proteolitik terbesar (Indeks proteolitik = rata-rata diameter zona bening : rata-rata diameter bakteri). Kedua sampel tersebut kemudian dilanjutkan dengan identifikasi secara molekuler.
37
3.4.4. Analisis Molekuler 16S rRNA Analisis molekuler 16S rRNA dimaksudkan untuk mengidentifikasi lima isolat bakteri yang memiliki aktifitas proteolitik tertinggi. Tahapan ini meliputi: a. Persiapan bakteri menggunakan kultur cair Sebelum melakukan isolasi DNA genom dari bakteri, dilakukan kultur cair untuk perbanyakan bakteri dengan tahapan sebagai berikut: -
Menyiapkan medium untuk kultur cair (Nutrient Broth)
-
Memindahkan isolat yang telah dipilih untuk dilakukan analisis molekul dalam medium Nutrien Broth.
-
Melakukan inkubasi selama 24 jam dengan suhu 37°C.
b. Isolasi DNA genom bakteri Metode isolasi DNA genom bakteri menggunakan Promega kit, yang dijelaskan sebagai berikut: -
Setelah bakteri hasil kultur cair dalam medium Nutrien Broth keruh dilakukan pemindahan setiap kultur kedalam tabung ependorf 1,5 ml dan dilakukan sentrifugasi selama 2 menit dengan kecepatan tinggi (13.000 rpm) dengan mikrocentrifuge.
-
Mengambil pellet DNA dari hasil sentrifugasi.
-
Menambahkan 480 μl 50 mM EDTA.
-
Menambahkan 120 μl Lysozyme kemudian inkubasi selama 45 menit pada suhu 37°C.
-
Sentrifugasi selama 2 menit dengan kecepatan 13000 rpm
-
Mengambil pellet DNA dari hasil sentrifugasi.
-
Menambahkan Nuclei Lysis Solution. sebanyak 600 μl kedalam setiap tabung kemudian homogen dengan cara up down menggunakan mikropipet, inkubasi pada suhu 80°C selama 5 menit.
-
Menambahkan 3 μl RNase Solution kemudian inkubasi selama 15-60 menit pada suhu 37°C.
38
-
Menambahkan 200 μl Protein Precipitation Solution, vortex kemudian inkubasi pada suhu -20°C selama 5 menit dan disentrifugasi 13000–16000 rpm selama 3 menit.
-
Memindahkan supernatant ke tube yang steril sebanyak 600 μl tambahkan isopropanol kemudian homogen.
-
Melakukan sentrifugasi dan membuang supernatan.
-
Pellet dari hasl sentrifugasi ditambahkan 600 μl
ethanol 70% dan
homogenkan -
Melakukan sentrifugasi dengan kecepatan 13000-16000 rpm selama 2 menit
-
Menambahkan etanol dan keringkan pellet selama 10-15 menit
-
Setelah kering tambahkan Rehydrate solution 50 μl dan inkubasi pada suhu 65°C selama 1 jam.
c.
Amplifikasi DNA dengan Primer Gen 16S rRNA Amplifikasi gen pengkode 16S rRNA dilakukan dengan Polymerase Chain
Reaction (PCR) untuk mendapatkan sekuen gen 16S rRNA yang akan digunakan sebagai bahan sekuensing untuk menentukan jenis bakteri. Primer yang digunakan adalah primer universal 16S rRNA dengan urutan sebagai berikut (Sadi, 2009); (Bano dan Hollibough, 2002): Tabel 3. Primer 16S rRNA Universal
Primer
Urutan Nukleotida(5’-3’)
Forward primer
F: GAGTTTGATCCTGGCTCAG
Reverse primer
R: GGCTACCTTGTTACGACTT
Komponen reaksi PCR dan siklus PCR dapat dilihat pada Tabel 4 dan Tabel 5.
39
Tabel 4. Komponen Reaksi PCR Komponen PCR
Konsentrasi Akhir
Nuclease Free Water Promega Master Mix Primer Forward Primer Reverse DNA template Sumber: Sadi, 2009
Volume (μl)
1x 0,5 μΜ 0,5 μΜ -
10,5 12,5 0,5 0,5 1
Tabel 5. Pengaturan Program PCR Siklus
Inisialisasi - Denaturasi - Annealing - Elongasi Final elongasi Final hold Sumber: Lewaru, 2012 d.
Suhu (°C)
Waktu
95 95 55 75 75 4
2 menit 30 detik 30 detik 1 menit 5 menit -
Jumlah Siklus 1 30 1 1
Elektroforesis Elektroforesis merupakan teknik pemisahan molekuler berdasarkan atas
ukurannya menggunakan medan listrik yang dialirkan pada suatu medium yang mengandung sampel yang akan dipisahkan. Teknik ini dapat digunakan dengan memanfaatkan muatan listrik yang ada pada makromolekuler. Adapun tahapan untuk melakukan elektroforesis sebagai berikut: 1. Persiapan Elektroforesis -
Membuat gel agarose (Konsentrasi 1 %) dan melarutkannya pada TBE buffer
-
Memanaskannya di atas hot plate
-
Menuangkan gel yang masih dalam keadaan panas dan cair ke atas lempeng (plate).
40
-
Menancapkan lembaran Perspex tipis yang berbentuk menyerupai sisir saat agar masih dalam keadaan panas dan belum memadat
-
Mencabut lembaran Perspex yang berbentuk sisir saat agarose telah memadat hingga membentuk sumur untuk memasukkan sampel hasil produk PCR.
-
Memasukkan gel agarose yang telah padat ke dalam suatu tangki yang berisi buffer TBE 2. Pelaksanaan Elektroforesis
-
Memasukan hasil amplifikasi DNA dan marker pada setiap sumur.
-
Menutup tangki dan mulai running elektroforesis dengan menghubungkan alat elektroforesis pada sumber listrik(Power Supply).
-
Sisi yang berisi hasil amplifikasi diberi arus negatif. Besarnya arus elektroforesis yaitu 75 volt selama 60 menit.
-
Dilakukan perendaman dengan Etbr selama 10-15 menit
-
Melakukan perendaman kembali dengan akuades untuk mencuci sisa Etbr.
-
Setelah selesai gel diangkat dengan menggunakan spatula dan ditiriskan. Dalam proses elektroforesis produk amplifikasi digunakan DNA Ladder 1 kb (Biolabs) terdiri dari fragmen mulai dari 500 sampai 10.000. Amplifikasi PCR menggunakan primer 16S RNA yang memiliki daerah target amplifikasi 1.500 bp.
3.4.5. Analisis Bioinformatik Produk gen 16S rRNA ditempatkan dalam 30 ml nuclease free water pada suhu 4 °C selama 24 jam. Produk gen 16S rRNA kemudian dipurifikasi dan dipilih empat isolat terbaik untuk dilanjutkan ke tahap sequencing. Hasil sequencing DNA dianalisis menggunakan perangkat bioinformatik kemudian diolah secara manual dan dicocokkan dengan data di www.ncbi.nih.nim.gov melalui program BLAST untuk menentukan jenis dari 4 isolat tersebut dari database Genbank yang ada.
