Amersham WB system. Návod k obsluze. Překlad z anglického jazyka

Amersham™ WB system Návod k obsluze Překlad z anglického jazyka

Strana záměrně ponechána prázdná

Obsah

Obsah 1

Úvod ........................................................................................................................ 1.1 1.2 1.3 1.4

2

3

6 7 9 13

Bezpečnostní instrukce .......................................................................................

15

2.1 2.2 2.3 2.4

Bezpečnostní opatření ....................................................................................................................... Štítky ........................................................................................................................................................... Nouzové postupy .................................................................................................................................. Informace o recyklaci .........................................................................................................................

16 25 30 32

Popis systému .......................................................................................................

33

3.1 3.2 3.3

34 37 41

Přehled přístroje .................................................................................................................................... Elpho & scan jednotka ........................................................................................................................ Western jednotka ................................................................................................................................. 3.3.1 3.3.2 3.3.3

3.4 3.5 3.6

Přehled ................................................................................................................................................ Western oddíly jednotky ............................................................................................................. Cesty průtoku kapaliny ................................................................................................................

42 46 51

Přehled příslušenství a spotřebního materiálu ....................................................................... Spotřební materiál na předznačení .............................................................................................. Příslušenství a spotřební materiál pro elektroforézu ...........................................................

55 60 62

3.6.1 3.6.2 3.6.3 3.6.4

3.7

Amersham WB molecular weight markers ........................................................................ Amersham WB gel card .............................................................................................................. Amersham WB buffer strip a Amersham WB buffer strip holder ............................. Amersham WB paper comb ......................................................................................................

63 65 68 70

Příslušenství a spotřební materiál pro kroky Western blotování ....................................

71

3.7.1 3.7.2 3.7.3 3.7.4

Příslušenství a spotřební materiál pro přenos ................................................................... Sekundární protilátky – značení .............................................................................................. Držák na sušení – sušení karet PVDF .................................................................................... Membránový adaptér – PVDF skenování karty ................................................................

72 77 79 80

Ostatní příslušenství ............................................................................................................................ Přehled softwaru ...................................................................................................................................

81 83

Instalace ................................................................................................................

86

3.8 3.9

4

4.1 4.2 4.3

5

5

Co obsahuje tato příručka ................................................................................................................ Důležité informace pro uživatele ................................................................................................... Informace o právních předpisech ................................................................................................. Amersham WB system dokumentace ........................................................................................

Příprava místa instalace .................................................................................................................... Instalace hardware .............................................................................................................................. Instalace softwaru ...............................................................................................................................

87 90 103

Provedení pokusu .................................................................................................

108

5.1 5.2 5.3 5.4 5.5

109 113 115 118 122

Přehled ....................................................................................................................................................... Spuštění Amersham WB analyzer ................................................................................................ Nastavení experimentu v softwaru .............................................................................................. Provedení předznačení vzorků ....................................................................................................... Příprava Amersham WB molecular weight markers ...........................................................

Amersham WB system Návod k obsluze 29-0214-77 AE

3

Obsah

5.6

Provedení elektroforézy proteinu .................................................................................................. 5.6.1 5.6.2 5.6.3

5.7

124 129 131

Provedení přenosu ...............................................................................................................................

133

5.7.1 5.7.2 5.7.3 5.7.4

5.8

Příprava a připojení přenosových roztoků .......................................................................... Příprava přenosového sendviče .............................................................................................. Spuštění přenosu ........................................................................................................................... Postupy po přenosu ......................................................................................................................

134 136 150 154

Provádění značení a sušení .............................................................................................................

157

5.8.1 5.8.2 5.8.3 5.8.4

Příprava a připojení značících roztoků a roztoků protilátek ....................................... Provedení značení ......................................................................................................................... Postupy po značení ....................................................................................................................... Cyklus sušení ....................................................................................................................................

158 162 167 170

Skenování membrány a prohlížení výsledků ...........................................................................

172

Údržba ....................................................................................................................

177

6.1 6.2

179 184

5.9

6

Program údržby ..................................................................................................................................... Pokyny k údržbě .................................................................................................................................... 6.2.1 6.2.2 6.2.3

7

4

123

Před elektroforézou ....................................................................................................................... Cyklus elektroforézy ...................................................................................................................... Postupy po elektroforéze a skenování gel karty ...............................................................

Týdenní čištění přenosových a značicích průtokových cest ........................................ Postupy výměny ............................................................................................................................. Přemisťování jednotky přístroje ...............................................................................................

185 188 199

Referenční informace ..........................................................................................

200

7.1 7.2 7.3 7.4

Specifikace systému ............................................................................................................................ Průvodce odolností vůči chemikáliím .......................................................................................... Formulář Prohlášení o zdraví a bezpečnosti ............................................................................ Překlady názvů příslušenství a spotřebního materiálu .......................................................

201 205 206 208

Rejstřík ...................................................................................................................

209


1 Úvod

1

Úvod

Amersham WB system Amersham WB system je integrovaný systém pro SDS-PAGE a Western blotovací analýzu proteinů založenou na fluorescenční detekci. Elektroforézu, skenování, přenos a automatické značení provádí jeden systém. K dispozici jsou chemikálie pro předznačení a detekci protilátek, stejně jako spotřební materiál – gel a membrány. Amersham WB system obsahuje přístroj, Amersham WB analyzer, Amersham WB software (software) a příslušenství a spotřební materiál. Amersham WB analyzer se skládá ze dvou jednotek, jednotky Amersham WB elpho & scan a jednotky Amersham WB western. Systém podporuje mnoho aplikací, od rychlého screeningu složení proteinů nebo množství po pokročilou kvantitativní analýzu pro porovnání hladin proteinůmezi vzorky. Proteiny mohou být předznačené pomocí barvícího činidla Amersham WB Cy™5 a tedy přímo detekovány v gelu po elektroforéze. V pokusech Western , jsou vzorky proteinů neznačené nebo předznačené pomocí Cy5 přeneseny na membrány a cílové proteiny mohou být detekovány pomocí Cy3 anebo Cy5 konjugovaných sekundárních protilátek. Detekce na bázi fluorescence nabízí vysokou citlivost a široký dynamický rozsah a umožňuje multiplexní analýzu stejné Western blotovací membrány. Multiplexní analýza proteinů předznačených Cy5 a cíle detekovaného pomocí sekundárních protilátek označených Cy3 umožňuje normalizaci cílových signálů pomocí celkového proteinu v každém pruhu. Uživatelsky přátelský Amersham WB software pro řízení různých kroků pracovního postupu a automatické nebo ruční vyhodnocení výsledků je součástí systému. Seznam přeložených názvů příslušenství a spotřebního materiálu naleznete v Oddíl 7.4 Překlady názvů příslušenství a spotřebního materiálu, na straně 208.

V této kapitole Tato kapitola obsahuje následující oddíly: Oddíl

Viz strana

1.1 Co obsahuje tato příručka

6

1.2 Důležité informace pro uživatele

7

1.3 Informace o právních předpisech

9

1.4 Amersham WB system dokumentace


13

5

1 Úvod 1.1 Co obsahuje tato příručka

1.1

Co obsahuje tato příručka

Účel této příručky Návod k obsluze obsahuje pokyny pro bezpečnou instalaci, provoz a údržbu přístroje Amersham WB system.

Obsah této příručky Návod k obsluze obsahuje následující informace: •

informace o bezpečnosti a právních předpisech

•

popis systému, včetně příslušenství a spotřebního materiálu, které se v systému používají

•

pokyny k instalaci

•

informace o tom, jak provést experiment bezpečným způsobem

•

pokyny k údržbě uživatelem

•

specifikace a další referenční informace

Typografické konvence Softwarové položky lze v textu rozpoznat jako text psaný tučnou kurzívou. Dvojtečka odděluje úrovně nabídky, tedy File:Open znamená příkaz Open v nabídce File. Hardwarové položky lze rozpoznat jako text psaný tučným písmem (např. Power).

6


1 Úvod 1.2 Důležité informace pro uživatele

1.2

Důležité informace pro uživatele

Před prací s ... si přečtěte následující Amersham WB analyzer

Před instalací, použitím nebo údržbou přístroje si musí všichni uživatelé přečíst celý Návod k obsluze. Při práci se systémem mějte Návod k obsluze vždy po ruce Amersham WB analyzer. Nepracujte s přístrojem Amersham WB analyzer jiným způsobem, než jak je uvedeno v uživatelské dokumentaci. V opačném případě se vystavujete riziku poranění a můžete poškodit zařízení.

Určené použití Amersham WB system je systém umožňující proteinovou elektroforézu a Western blotting, spolu se skenováním gelových karet a PVDF karet. Proteiny mohou být předznačené pomocí Cy5 a tedy přímo detekovány v gelu po elektroforéze. V pokusech Western jsou vzorky proteinů neoznačené nebo označené pomocí Cy5 přeneseny na membrány a cílové proteiny mohou být detekovány pomocí Cy3 anebo Cy5 pomocí konjugovaných sekundárních protilátek. Detekce na bázi fluorescence nabízí vysokou citlivost a široký dynamický rozsah a umožňuje multiplexní analýzu stejné Western blotovací membrány Amersham WB system je určen pouze pro výzkumné účely a nesmí se používat v žádných klinických procedurách ani pro diagnostické účely.

Předpoklady Pro správnou obsluhu systému zamýšleným způsobem musí být splněny tyto předpoklady: •

Musíte mít základní znalosti práce na PC a operačního systému Microsoft® Windows®.

•

Měli byste rozumět koncepci elektroforézy a Western blottingu.

•

Přístroj a software musí být instalován v souladu s pokyny v Kapitola 4 Instalace, na straně 86.


7

1 Úvod 1.2 Důležité informace pro uživatele

Tip:

Chcete-li se dozvědět více o principech a metodách Western blottingu a jak provést úspěšný Western blotting, stáhněte nebo objednejte si příručku, Western Blotting – Principles and Methods 28-9998-97, na adrese www.gelifesciences.com.

Bezpečnostní pokyny Tato uživatelská dokumentace obsahuje bezpečnostní upozornění (VÝSTRAHY, VAROVÁNÍ a UPOZORNĚNÍ) týkající se bezpečnosti používání výrobku. Definice jsou uvedeny dále.

VÝSTRAHA VÝSTRAHA se používá pro označení nebezpečné situace a pokud jí nebude zamezeno, může dojít ke smrtelnému nebo vážnému úrazu. Pokud nebudou splněny a jasně pochopeny všechny uvedené podmínky, v žádném případě dále nepokračujte.

VAROVÁNÍ VAROVÁNÍ se používá pro označení nebezpečné situace, a pokud jí nebude zamezeno, může dojít k lehkému nebo středně těžkému úrazu. Pokud nebudou splněny a jasně pochopeny všechny uvedené podmínky, v žádném případě dále nepokračujte.

UPOZORNĚNÍ UPOZORNĚNÍ obsahuje pokyny, které musí být dodržovány, aby nedošlo k poškození výrobku nebo jiných součástí.

Poznámky a návrhy

8

Poznámka:

Poznámka slouží k označení informace důležité pro bezproblémové optimální užívání výrobku.

Tip:

Tipy obsahují užitečné informace, které mohou přispět ke zlepšení či optimalizaci postupů.


1 Úvod 1.3 Informace o právních předpisech

1.3

Informace o právních předpisech

Úvod V této kapitole jsou popsány směrnice a normy, které splňuje Amersham WB system.

Informace o výrobě Níže uvedená tabulka shrnuje požadované výrobní informace. Více informací najdete v dokumentu Prohlášení o shodě EU (DoC). Požadavek

Obsah

Název a adresa výrobce

GE Healthcare Bio-Sciences AB, Björkgatan 30, SE 751 84 Uppsala, Sweden

Shoda se směrnicemi EU Tento výrobek splňuje evropské směrnice, jejichž výčet je uveden v tabulce, protože splňuje příslušné harmonizované normy. Směrnice

Název

2006/42/ES

Směrnice o strojních zařízeních

2004/108/ES

Směrnice o elektromagnetické kompatibilitě (EMC)

2006/95/ES

Směrnice o nízkém napětí


9


Označení CE

Označení CE a příslušné prohlášení EU o shodě platí pro přístroj, pokud: •

používán jako samostatná jednotka nebo

•

je připojen k jiným výrobkům doporučeným nebo popsaným v uživatelské dokumentaci a

•

používaný ve stavu v němž jej dodal výrobce, společnost GE, s výjimkou změn popsaných v uživatelské dokumentaci.

Mezinárodní normy V tabulce níže je uvedeno, které požadavky norem tento výrobek splňuje. Norma

Popis

Poznámky

EN/IEC 61010-1, UL 61010-1, CAN/CSA-C22.2 č. 1010.1

Bezpečnostní požadavky na elektrická měřicí, řídicí a laboratorní zařízení.

Norma EN je harmonizována se směrnicí EU 2006/95/ES.

EN/IEC61326-1

Elektrická zařízení pro měření, regulaci a laboratorní použití - požadavky EMC.


EN ISO 12100

Bezpečnost strojního zařízení. Obecné principy pro design. Posouzení rizika a snížení rizika.

Norma EN ISO je harmonizována se směrnicí EU 2006/42/ES.

EN/IEC 60825-1

Bezpečnost při používání laserového zařízení.


(Emise podle CISPR 11, skupina 1, třída A)

10



Předpisy a normy pro laserové systémy Toto zařízení je laserový výrobek třídy 1 (IEC 60825-1:2007/EN 60825-1:2007). Tento přístroj vyhovuje bezpečnostním požadavkům na laserové záření uvedeným v Kodifikaci federálních předpisů (TITLE 21 CFR, kapitola 1, podkapitola J, část 1040-10 Laserové výrobky).

Shoda s FCC Toto zařízení vyhovuje části 15 předpisu FCC. Provoz zařízení podléhá dvěma následujícím podmínkám: Toto zařízení (1) nesmí způsobovat škodlivé rušení a (2) musí zaznamenávat jakékoliv přijímané rušení, včetně takového, které může způsobit nežádoucí fungování. Poznámka:

Upozorňujeme uživatele, že jakékoli změny nebo úpravy výslovně neschválené společností GE mohou zrušit oprávnění uživatele k provozu zařízení.

Toto zařízení bylo testováno a shledáno jako vyhovující limitům pro digitální zařízení třídy A podle části 15, předpisů FCC. Tyto limity poskytují přiměřenou ochranu proti škodlivému rušení při provozu zařízení v komerčním prostředí. Toto zařízení generuje, používá a může vyzařovat vysokofrekvenční energii a pokud není nainstalováno a používáno v souladu s návodem k použití, může způsobit škodlivé rušení rádiových komunikací. Provoz zařízení v obytné oblasti pravděpodobně způsobí škodlivé rušení, a v takovém případě bude uživatel muset odstranit rušení na vlastní náklady.

Environmentální shoda Předpisy

Název

2011/65/EU

Směrnice o omezení užívání některých nebezpečných látek v elektronických a elektrických zařízeních (RoHS)

2012/19/EU

Směrnice o odpadních elektrických a elektronických zařízeních (OEEZ)

Směrnice (ES) č. 1907/2006

Registrace, hodnocení, autorizace a omezení chemikálií (REACH)

ACPEIP

Správa regulace znečistění způsobeného elektronickými výrobky informační techniky, čínské omezení užívání nebezpečných materiálů (RoHS)


11


Shoda připojeného zařízení s předpisy Veškerá zařízení připojená k systému Amersham WB analyzer musí splňovat bezpečnostní požadavky normy IEC/EN/UL/CSA 61010-1, IEC/EN/UL/CSA 60950-1, nebo jiných příslušných národních bezpečnostních předpisů a norem. Zařízení musí být instalováno a používáno v souladu s pokyny výrobce. V rámci EU musí být připojené zařízení opatřeno označením CE.

12


1 Úvod 1.4 Amersham WB system dokumentace

1.4

Amersham WB system dokumentace

Úvod Tato část popisuje uživatelskou a související dokumentaci pro Amersham WB system.

Dokumentace pro uživatele V níže uvedené tabulce je uvedena uživatelská dokumentace, kterou má při dodání přiloženu Amersham WB system: Dokument

Hlavní obsah

Dostupnost

Amersham WB analyzer Pokyny pro vybalení

Tento návod popisuje, jak rozbalit Amersham WB analyzer.

Uvnitř přepravní krabice přístroje Amersham WB analyzer.

Návod k obsluze Amersham WB system

Tato příručka obsahuje informace potřebné k:

Anglická verze v tištěné podobě se dodává spolu se systémem.

•

bezpečné instalaci, manipulaci a údržbě Amersham WB system

•

provedení běžného experimentu bezpečným způsobem

Přeložené verze jsou k dispozici ve formátu PDF na disku CD s uživatelskou dokumentací.

Obsahuje také informace o bezpečnosti a právních předpisech, popis systému a referenční informace. Amersham WB system User Manual

Tato příručka obsahuje informace potřebné k: •

bezpečném provozu a údržbě Amersham WB system

•

plánování, provedení a vyhodnocení elektroforézy a Western experimentů

•

řešení problémů se systémem a výsledky

Integrovaná s Amersham WB software jako příručka ve formátu HTML v nabídce Nápověda. K dispozici také jako PDF soubor na CD s uživatelskou dokumentací.

Obsahuje také popis systému, referenční informace a údaje potřebné k objednání.


13

1 Úvod 1.4 Amersham WB system dokumentace

Dokument

Hlavní obsah

Dostupnost

Amersham WB software Help

Amersham WB software Help obsahuje informace o:

Integrovaná s Amersham WB software (v pravém panelu softwaru).

•

pracovních postupech uživatele pro provádění elektroforézy a Western experimentů

•

popisu softwaru

•

odkazy na Amersham WB system User Manual pro podrobné informace o manipulaci s přístrojem, příslušenstvím a spotřebním materiálem

Metodická příručka Metodická příručka Western Blotting – Principles and Methods poskytuje návod na kompletní Western pracovní postup při blottingu. Popisuje teoretické a praktické aspekty techniky spolu s užitečnými radami a tipy. Cílem příručky je dovést a inspirovat začátečníky i odborníky k úspěšnému Western blottingu. Stáhněte si nebo objednejte příručku Western Blotting – Principles and Methods 28-999897 na adrese www.gelifesciences.com.

Datové soubory a poznámky k aplikacím Datové soubory a poznámky k aplikacím lze objednat nebo stáhnout na adrese www.gelifesciences.com.

14


2 Bezpečnostní instrukce

2

Bezpečnostní instrukce

O této kapitole Tato kapitola popisuje bezpečnostní opatření a postupy nouzového vypnutí pro Amersham WB system. Rovněž jsou zde popsány štítky na přístroji a jsou zde uvedeny informace o recyklaci.

V této kapitole Tato kapitola má následující oddíly: Oddíl

Viz strana

2.1 Bezpečnostní opatření

16

2.2 Štítky

25

2.3 Nouzové postupy

30

2.4 Informace o recyklaci

32


15

2 Bezpečnostní instrukce 2.1 Bezpečnostní opatření

2.1

Bezpečnostní opatření

Úvod ZařízeníAmersham WB analyzer je napájeno síťovým napětím a pracuje s tekutinami, které mohou být nebezpečné. Před instalací, provozováním nebo údržbou jednotek přístroje se musíte seznámit s nebezpečími popsanými v této příručce. Během provozu a údržby systému a v rámci bezpečného zacházení s chemickými látkami vždy dodržujte místní předpisy a pokyny. Řiďte se pokyny určených pro prevenci úrazů osob, či poškození nebo zničení zařízení.. Bezpečnostní pokyny v této části jsou rozděleny do následujících kategorií: •

Všeobecné pokyny

•

Hořlavé kapaliny

•

Osobní ochrana

•

Instalace a přesun

•

Obsluha systému

•

Údržba

•

Vyřazení z provozu

Všeobecné pokyny VÝSTRAHA Nepoužívejte Amersham WB analyzer jinak, než je popsáno v Návod k obsluze.

VÝSTRAHA Nepoužívejte jakékoliv příslušenství nedodané nebo nedoporučené společností GE.

16



VÝSTRAHA Nepoužívejte přístroj Amersham WB analyzer, pokud nepracuje správně nebo vykazuje jakékoliv poškození, například: •

poškození napájecího kabelu nebo jeho koncovky

•

poškození způsobené pádem zařízení

•

poškození jiných částí, které mohou mít vliv na funkci

Hořlavé kapaliny VAROVÁNÍ Nebezpečí požáru. •

Jestliže došlo k rozlití tekutiny na vnější straně Elpho & scan nebo na krytu jednotky Western, odpojte přístroj a otřete tekutinu.

•

Jestliže došlo k rozlití tekutiny na jednotky přístroje a tato pronikla skrz kryt Elpho & scan nebo jednotku Western, odpojte napájecí kabel jednotky a kontaktujte servis.

VAROVÁNÍ Nebezpečí požáru. Ujistěte se před spuštěním přístroje, že odpadní hadička vedoucí z jednotky Western vede do láhve na odpad pod stolem a že nedochází k úniku. Prázdná odpadní láhev musí mít objem nejméně 4 litry.

VAROVÁNÍ Nebezpečí požáru. WA - Nepoužívejte přenosový ústrojný roztok s obsahem více než 40% ethanolu nebo 40% methanolu. Doporučuje se používat v přenosových roztocích pouze 20% etanol.


17


Osobní ochrana VÝSTRAHA Vždy používejte rukavice, ochranný pracovní oděv a ochranné brýle při manipulaci s gelovými kartami, PVDF kartami a ostatním spotřebním materiálem dodávaným s Amersham WB system.

VÝSTRAHA Při práci na předznačení proteinových vzorků: •

Vždy používejte ochranný oděv, ochranné rukavice a ochranné brýle.

•

Před provedením předznačení vzorků si přečtěte Bezpečnostní list (BL/MBL).

VÝSTRAHA Amersham WB analyzer je zařízení třídy A. V prostředí domácnosti může způsobovat rádiové rušení. V takovém případě je možné, že uživatel bude muset provést adekvátní opatření.

VAROVÁNÍ Nebezpečné látky. Pokud pracujete s nebezpečnými chemikáliemi či biologickými látkami, přijměte veškerá potřebná ochranná opatření, např. použijte ochranné brýle a rukavice odolné vůči daným látkám. Pro bezpečný provoz a údržbu zařízení a jeho vyřazení z provozu dodržujte platné lokální a/nebo vnitrostátní předpisy.

VAROVÁNÍ Po předznačení proteinů ve vzorcích může vzniknout silný zápach kvůli stopovému množství dimethylsulfidu (DMS) a dimethylsulfoxidu (DMSO). Může být třeba místní odvětrávání. Dodržujte místní předpisy a pokyny pro bezpečný provoz.

18



VAROVÁNÍ Během obsluhy a údržby přístroje vždy používejte rukavice, ochranný pracovní oděv a ochranné brýle Amersham WB analyzer.

VAROVÁNÍ Osobní ochranné prostředky (PPE). Při balení, rozbalování, přepravě nebo přemisťování používejte prostředky osobní ochrany: •

ochrannou obuv, pokud možno s ocelovou výztuhou

•

pracovní rukavice na ochranu před ostrými kraji

•

Ochranné brýle

Instalace a přesun VÝSTRAHA Umístěte systém Amersham WB analyzer v místnosti s ventilací, pokud budete používat methanol nebo jiné chemikálie vyžadující odvětrávání.

VÝSTRAHA Napájecí napětí. Před zasunutím koncovky napájecího kabelu do síťové zásuvky se ujistěte, že napájecí napětí odpovídá hodnotám uvedeným na přístroji.

VÝSTRAHA Zajistěte, aby byl systém umístěn na stabilním rovném stole s dostatečným prostorem umožňujícím větrání.


19


VÝSTRAHA Neblokujte přístup k hlavnímu vypínači a napájecímu kabelu. Hlavní vypínač musí být vždy snadno přístupný. Napájecí kabel se zástrčkou musí být vždy snadno odpojitelný.

VÝSTRAHA Ochranný uzemňovací a napájecí kabel. Přístroj Amersham WB analyzer musí být vždy připojen pouze k uzemněné síťové zásuvce. Používejte pouze schválený napájecí kabel se třemi vodiči, dodávaný nebo schválený GE, nebo v souladu se všemi platnými požadavky příslušných místních zákonů o elektrických zařízeních.

VAROVÁNÍ Nikdy nepřesunujte jednotku Western s lahvemi stojícími na jednotce.

VAROVÁNÍ Těžký předmět. Bezpečné zvednutí přístrojů vyžaduje dvě osoby.

UPOZORNĚNÍ Každý počítač používaný s přístrojem musí být v souladu s IEC/EN/UL/CSA 60950-1 či jinými bezpečnostními předpisy. Měl by být instalován a používán v souladu s pokyny výrobce.

UPOZORNĚNÍ Odpojte kabely. Před přemísťováním jednotky přístroje vždy odpojte kabely, abyste zabránili poškození zařízení.

20



Obsluha systému VÝSTRAHA Roztříštění skla. Nespouštějte systém v případě, že je sklo v těsnicím víku jednotky Elpho & scan poškrábané nebo rozbité. Vypněte přístroj, odpojte napájecí kabel a obraťte se na autorizovaného servisního technika.

VÝSTRAHA Nebezpečí úrazu elektrickým proudem při činnosti v případě rozlití. Pokud existuje riziko, že krytem přístroje může prosáknout kapalina,Amersham WB analyzer, ihned přístroj vypněte, odpojte napájecí kabel a spojte se s příslušným autorizovaným servisním technikem.

VÝSTRAHA Po elektroforéze nebo po přenosu (v případě, že přenosový sendvič byl otevřen a PVDF karta byla umístěna ve značicím prostoru), zlikvidujte gel bezpečným způsobem. Přečtěte si bezpečnostní list (BL/MBL) gelové karty, kde najdete bezpečnostní pokyny týkající se gelu a jeho likvidace.

VAROVÁNÍ Pohyblivé části. Buďte opatrní při otevírání/zavírání zásobníku, aby nedošlo k zachycení prstů nebo oděvu, když je v pohybu. Nikdy neumísťujte láhve či lahvičky před jednotku Elpho & scan. Mohou spadnout při otevření podavače.

VAROVÁNÍ Nebezpečí úrazu elektrickým proudem. Vždy zastavte aktuální přenos, než začnete otírat kapalinu z přístroje nebo stolu.


21


VAROVÁNÍ Nebezpečí přiskřípnutí. Nedotýkejte se pohyblivé komory na značení během procesu

VAROVÁNÍ Neodstraňujte kryty Elpho & scan z jednotky. Uvnitř jednotky je laser třídy 3B.

VAROVÁNÍ Aby nedošlo k potřísnění nebezpečnými kapalinami, používejte těžké vstupní filtry připojené k hadičkám v lahvích.

UPOZORNĚNÍ Nepoužívejte jiné chemikálie než ty, které jsou uvedeny v Informacích o odolnosti vůči chemikáliím.

Údržba VÝSTRAHA Nebezpečí úrazu elektrickým proudem. Veškeré opravy musí provádět servisní technik oprávněný společností GE. Neotevírejte kryty a nevyměňujte díly, pokud to není výslovně uvedeno v uživatelské dokumentaci.

VÝSTRAHA Odpojte napájení. Před výměnou jakékoliv součásti jednotky přístroje vždy nejprve odpojte její přívod elektrické energie, pokud není v návodu k obsluze uvedeno jinak.

22



VÝSTRAHA Před otevřením víka servisního prostoru vyjměte všechny lahve ze stojanu na láhve.

VÝSTRAHA Pokud používáte nebezpečné chemikálie, vyvarujte se jejich rozlití a noste ochranné brýle či další vhodné osobní ochranné pomůcky. NaOH je zdraví škodlivá žíravina a je proto zdraví nebezpečný.

VÝSTRAHA K údržbě či opravě systému se smí používat pouze náhradní díly a příslušenství, které bylo schváleno nebo dodáno společností GE.

VÝSTRAHA Při výměně poškozeného napájecího kabelu použijte náhradní kabel stejného typu a rozměrů, který splňuje požadavky všech platných místních směrnic pro elektrická zařízení a je schválen společností GE.

VÝSTRAHA Před výměnou pojistky elektrické sítě vždy odpojte síťové napájení. Pro trvalou ochranu proti rizikem požáru nahrazujte pouze pojistkou stejného typu a výkonu, jak je uvedeno na štítku jednotky přístroje.

VAROVÁNÍ Pokud pracujete s nebezpečnými chemikáliemi, přijměte veškerá potřebná ochranná opatření, např. použijte ochranné brýle a rukavice odolné vůči použitým chemickým látkám. Pro bezpečnou obsluhu a údržbu systému dodržujte místní předpisy.


23


Servis VÝSTRAHA Před servisním zákrokem proveďte dekontaminaci zařízení tak, aby bylo zajištěno odstranění možných pozůstatků nebezpečných látek.

Vyřazení z provozu VÝSTRAHA Před vyřazením z provozu proveďte dekontaminaci zařízení tak, aby bylo zajištěno odstranění možných pozůstatků nebezpečných látek.

24


2 Bezpečnostní instrukce 2.2 Štítky

2.2

Štítky

Úvod Tento oddíl popisuje bezpečnostní štítky a štítky na přístrojích Amersham WB analyzers popisem nebezpečných látek. Informace o označení počítačového vybavení najdete v pokynech výrobce.


25


Umístění štítků na Amersham WB analyzer Na obrázku níže je znázorněno umístění štítků na jednotce Elpho & scan a na jednotce Western.

2

1

3 MärkskyltWB

of the 1D-unit.

CLASS 1 LASER PRODUCT

Complies with 21 CFR 1040.10 and 1040.11 except for deviations pursuant to Laser Notice No. 50 dated July 24, 2007. IEC/EN 60825-1:2007 Jan

Feb

Mar

Jul

Aug

Sep

Apr

May

Jun

Oct

Nov

Dec

4

5

Märkskylt1D

MärkskyltWB

6

Servicetag1D

ServicetagWB

7

26



Součást

Popis

1

Computer

2

Western unit

3

Identifikační štítek jednotky Amersham WB elpho & scan

4

Bezpečnostní štítek týkající se laserového světla

5

Identifikační štítek jednotky Amersham WB western

6

Elpho & scan unit

7

Only for service

Elpho & scan štítek jednotky Obrázek níže znázorňuje příklad identifikačního štítku na jednotce přístroje Elpho & scan. Štítek se nachází na zadním panelu jednotky systému. Märkskylt 1D

Märkskylt WB

Service tag 1D


27


Western štítek jednotky Obrázek níže znázorňuje příklad identifikačního štítku na jednotce přístroje Western. Štítek se nachází na zadním panelu jednotky systému. Märkskylt WB

Service tag 1D

Bezpečnostní symboly použité na identifikačních štítcích jednotky přístroje

Service tag WB Na štítcích jsou použity následující bezpečnostní symboly:

Štítek

Popis Upozornění! Před použitím systému si řádně prostudujte uživatelskou dokumentaci, zejména návod k obsluze. Neodstraňujte jaké koliv kryty a nevyměňujte součásti, pokud to není výslovně uvedeno v návodu k obsluze. Systém vyhovuje příslušným evropským směrnicím a normám. Více viz Mezinárodní normy, na straně 10.

Systém splňuje příslušné požadavky pro Austrálii a Nový Zéland.

Tento symbol znamená, že systém Amersham WB system byl certifikován celostátně uznávanou zkušební laboratoří (NRTL). Celostátně uznávaná zkušební laboratoř je organizace, jejíž shodu s právními požadavky v USA uvedenými v paragrafu 29 Sbírky federálních předpisů a nařízení USA (29 CFR), část 1910.7, uznala Agentura pro bezpečnost a ochranu zdraví při práci (OSHA).

28



Symboly týkající se nebezpečných látek použité na identifikačních štítcích jednotky přístroje Následující symboly na štítcích se vztahují k nebezpečným látkám: Štítek

Popis Tento symbol označuje, že odpadní elektrická a elektronická zařízení se nesmí likvidovat jako netříděný komunální odpad a je nutno zajistit oddělený sběr odpadu tohoto typu. V otázce vyřazení zařízení z provozu se, prosím, obraťte na autorizovaného zástupce výrobce.

Tento symbol signalizuje, že produkt obsahuje nebezpečné látky nad přípustné limity stanovené čínskou normou SJ/T11363-2006 „Požadavky na koncentrační limity určitých nebezpečných látek v elektronickém zařízení“.

Bezpečnostní štítek týkající se laserového světla Následující štítky se týkají laserového světla; první je umístěn na zadním panelu jednotky Elpho & scan. Druhý se nalézá uvnitř podavače Elpho & scan: Štítek

Popis

Located on the back side of the 1D-unit.

Toto zařízení je laserový výrobek třídy 1 (IEC 608251:2007/EN 60825-1:2007).

CLASS 1 LASER PRODUCT

Complies with 21 CFR 1040.10 and 1040.11 except for deviations pursuant to Laser Notice No. 50 dated July 24, 2007. IEC/EN 60825-1:2007 Jan

Feb

Mar

Apr

May

Jun

Jul

Aug

Sep

Oct

Nov

Dec

Tento přístroj vyhovuje bezpečnostním požadavkům na laserové záření uvedeným v Kodifikaci federálních předpisů (TITLE 21 CFR, kapitola 1, podkapitola J, část 1040-10 Laserové výrobky). Štítek také uvádí měsíc výroby.

Tento symbol uvidíte při otevření podavače Elpho & scan. Located on the inside of the front lid of the 1D-unit

Label Amersham WBremoved system Návod k obsluze 29-0214-77 AE

29

2 Bezpečnostní instrukce 2.3 Nouzové postupy

2.3

Nouzové postupy

Úvod V této části je popsán postup nouzového vypnutí přístroje Amersham WB analyzer a dopady v případě výpadku proudu.

Nouzové vypnutí

V případě nouzové situace odpojte síťové napájecí kabely ze zadních panelů jednotky Elpho & scan a jednotky Western. Tím zajistíte okamžité odpojení od napájení, i pokud se používá nepřerušitelný zdroj napájení (UPS).

Výpadek napětí Výsledek výpadku napájení je popsán níže: Výpadek napětí u …

způsobí...

Amersham WB analyzer

•

Veškeré probíhající experimenty se zastaví. Experimenty nebudou po návratu napájení do normálního stavu pokračovat. Poznámka: UPS může vyloučit možnost ztráty dat po výpadku napájení a poskytnout čas k řízenému vypnutí Amersham WB analyzer.

•

30

Čas zastavení bude zaznamenán v softwaru jednotek přístroje.


2 Bezpečnostní instrukce 2.3 Nouzové postupy

Výpadek napětí u …

způsobí...

Počítač

•

Počítač připojený k jednotce Elpho & scan se vypne.

•

Veškeré započaté experimenty budou pokračovat a budou dokončeny, pokud bude přístroj stále připojen k napájení.

•

Pokud je počítač restartován a kontakt byl obnoven, výsledky experimentu budou uloženy. Pokud je to možné, budou snímky nasnímány.

Restartujte po nouzovém vypnutí nebo výpadku proudu do přístroje. Po návratu napájení k normálu nebudou pokračovat žádné analýzy, které běžely v době nouzového vypnutí. Pokračujte následovně: Krok

Činnost

1

Pokud byly odpojeny napájecí kabely, připojte kabely k zadním panelům přístrojových jednotek. Ujistěte se, že jsou síťové vypínače na zadním panelu přístrojových jednotek zapnuté (I). Výsledek: Přístrojové jednotky jsou spuštěny.

2

Spusťte počítač a software (viz Spuštění softwaru, na straně 115). Pokud jsou jednotky přístroje připojeny, bude protokolová událost uložena v protokolu systému.

3

Chcete-li dokončit proces, který byl přerušen, otevřete dotyčný soubor experimentu. Poté otevřete Experiment Information dialog a zvolte Experiment log patřičnou kartu. Na Experiment logzjistěte, ve kterém kroku byl experiment přerušen. Odstraňte části kroku, které byly ukončeny, když byl proces přerušen, a znovu celý krok spusťte.


31

2 Bezpečnostní instrukce 2.4 Informace o recyklaci

2.4

Informace o recyklaci

Úvod Tato část obsahuje informace týkající se vyřazení přístroje Amersham WB analyzer z provozu.

Dekontaminace Zařízení Amersham WB analyzer je třeba před vyřazením z provozu dekontaminovat a je nutné dodržet veškeré místní předpisy týkající se sešrotování zařízení.

Likvidace, všeobecné pokyny Při vyřazování systému Amersham WB analyzer z provozu musí být rozdílné materiály tříděny a recyklovány v souladu s předpisy o ochraně životního prostředí.

Recyklace nebezpečných látek Zařízení Amersham WB analyzer obsahuje nebezpečné látky. Podrobné informace získáte od místního zástupce společnosti GE.

Likvidace elektrických komponent Odpadní elektrická a elektronická zařízení se nesmí likvidovat jako netříděný komunální odpad a musí být shromažďována odděleně. V otázce vyřazení zařízení z provozu se, prosím, obraťte na autorizovaného zástupce výrobce.

32


3 Popis systému

3

Popis systému

O této kapitole Tato kapitola popisuje různé části systému Amersham WB system. Systém Amersham WB system zahrnuje: •

Amersham WB analyzer (dvě jednotky)

•

příslušenství a spotřební materiál, které se používají při práci s přístrojem

•

počítač (není součástí balení)

•

Amersham WB software


Viz strana

3.1 Přehled přístroje

34

3.2 Elpho & scan jednotka

37

3.3 Western jednotka

41

3.4 Přehled příslušenství a spotřebního materiálu

55

3.5 Spotřební materiál na předznačení

60

3.6 Příslušenství a spotřební materiál pro elektroforézu

62

3.7 Příslušenství a spotřební materiál pro kroky Western blotování

71

3.8 Ostatní příslušenství

81

3.9 Přehled softwaru

83


33

3 Popis systému 3.1 Přehled přístroje

3.1

Přehled přístroje

Úvod V tomto oddílu najdete přehled přístroje Amersham WB analyzer. Amersham WB analyzer se sestává ze dvou jednotek: •

Amersham WB elpho & scan jednotka

•

Amersham WB western jednotka

Přístrojové jednotky jsou řízeny z PC, na němž běží Amersham WB software. Poznámka:

Přístrojové jednotky musí být při cyklu vždy připojeny k sobě navzájem. Obě jednotky musí být při spuštění experimentu na jednotce Western zapnuty.

Bezpečnostní vypínače Uvnitř jednotky Elpho & scan je vysoké napětí a dva lasery. Jednotka je vybavena dvojitými bezpečnostními spínači, které zastaví napájení převodníku s vysokým napětím a laseru, když se otevře zásobník. Uvnitř přenosové nádrže v jednotce Western je vysoké napětí. Jednotka je vybavena bezpečnostními spínači, které zastaví napájení, otevře-li se víko přenosové nádrže.

34



Obrázek Amersham WB analyzer Níže uvedený obrázek zobrazuje Amersham WB analyzer s jednotkou Elpho & scan nalevo a jednotkou Western napravo.

Obrázek panelů nástrojů Pro každý prostor na jednotkách přístroje je k dispozici stejné nastavení kontrolek (elektroforéza a skenování, přenos, značení a sušení). Jsou-li jednotky přístroje zapnuté, kontrolky s názvy prostoru se rozsvítí. Indikátory jsou umístěny na přístrojové desce na každé jednotce. Níže uvedený obrázek ukazuje přístrojové desky obou jednotek s rozsvícenými názvy prostorů.


35


Indikátory na přístroji Níže uvedená tabulka popisuje různé indikátory. Indikátory (Připraven/cyklus dokončen, Spustit a Chyba nebo varování) jsou shodné pro všechny prostory jednotek přístroje. V tomto příkladu indikátory TRANSFER jsou předmětem popisu. Indikátory stavu TRANSFER

Stav

Popis

Spuštění

Text se rozsvítí při spouštění jednotky a provádění interních testů.

Připraven/cyklus dokončen

Kontrolka se rozsvítí, když:

TRANSFER TRANSFER TRANSFER TRANSFER

•

je jednotka/prostor připraven na nový experiment

•

je dokončen krok experimentu (t.j. elektroforéza, skenování, přenos, značení nebo sušení).

TRANSFER

TRANSFER TRANSFER TRANSFER

TRANSFER

Cyklus

Kontrolka se rozsvítí: •

pokud v jednotce/prostoru probíhá cyklus

•

během čištění přenosových a značicích průtokových cest

TRANSFER

Poznámka: TRANSFER

Neotvírejte příslušná víka, probíhá-li v prostoru cyklus. Například otevření víka přenosového prostoru během přenosu zastaví cyklus přenosu a může mít vliv na výsledek.

TRANSFER

TRANSFER TRANSFER

Chyba nebo varování

Kontrolka se rozsvítí, dojde-li k chybě Více informací o chybách viz Amersham WB software. Návrhy na nápravu problému nabízí software.

36


3 Popis systému 3.2 Elpho & scan jednotka

3.2

Elpho & scan jednotka

Úvod Jednotka Elpho & scan se používá pro separaci vzorků proteinů ošetřených pomocí SDS v polyakrylamidovém gelu. Používá se také pro skenování gelů po elektroforéze a karet PVDF po značení a sušení ve Western experimentu. V tomto oddílu najdete přehled jednotky Elpho & scan.

Obrázek jednotky Elpho & scan Obrázek níže zobrazuje hlavní části jednotky Elpho & scan:

1

2

3

4

Součást

Popis

1

Panel nástrojů (s indikátory stavu)

2

Elpho & scan zásobník Pro založení gelových karet nebo karet PVDF.


37


Součást

Popis

3

Tlačítko vysunout

Chcete-li otevřít/zavřít zásobník prostoru elektroforézy a skenování. Poznámka: Zásobník lze otevřít pouze tehdy, když není spuštěn žádný experiment elektroforézy nebo skenování. Jakýkoli probíhající cyklus musí být nejprve zastaven pomocí vhodného pokynu softwaru, aby bylo možné vysunout zásobník. 4

Výškově stavitelné nohy (4 nohy, jedna noha na každém rohu)

Obrázek zadního panelu jednotky Elpho & scan Obrázek níže zobrazuje hlavní části zadního panelu jednotky Elpho & scan:

1

7

38

2

6

5

4

3



Součást

Popis

1

konektor USB kabelu (USB typ B) Pro připojení jednotky Elpho & scan k počítači.

2

Komunikační připojení pro jednotku Western (použijte ethernet kabel)

3

Přívod vzduchu

4

Hlavní vypínač Zapnuto=I, Vypnuto=O

5

Přihrádka pojistky (5x20 mm)

6

Napájecí konektor (60320/C14)

7

Výstupy vzduchu

Elpho & scan zásobník Zásobník Elpho & scan se používá k založení: •

gelových karet pro elektroforézu a skenování

•

PVDF karet na skenování. Při zakládání karet PVDF ke skenování musí být nejprve umístěna Amersham WB membrane adapter na plato karet (více informací viz Oddíl 5.9 Skenování membrány a prohlížení výsledků, na straně 172).

Zásobník se vysune z jednotky Elpho & scan stisknutím tlačítka na vysunutí na předním panelu.


39


Obrázek zásobníku Elpho & scan Následující obrázek ukazuje jednotku Elpho & scan s vysunutým zásobníkem a těsnicí víka na levém platu karet v otevřené poloze.

1

3

2

7 6

5

4 Součást

Popis

1

Západka Pro otevření těsnicího víka.

2

Těsnicí víko

3

Ukazatel polohy A a polohy B

4

Dutiny Pro držáky pufrových stripů s elektrickými konektory pro pufrové elektrody.

5

Vodicí piny Pro správné umístění gelových karet nebo membránových adaptérů, včetně karet PVDF.

6

Plato karet Pro chlazení gelových karet a jejich fixování na místě při skenování.

7

40

Ochranné sklo


3 Popis systému 3.3 Western jednotka

3.3

Western jednotka

Úvod Jednotka Western se používá na: •

přenos separovaných proteinů v gelu na membránu

•

značení proteinů na membráně pomocí primárních a potom sekundárních protilátek konjugovaných na CyDye™

•

sušení karet PVDF (před skenováním v jednotce Elpho & scan)

V tomto oddílu najdete přehled jednotky Western.

V tomto oddílu Tento oddíl obsahuje následující dílčí oddíly: Oddíl

Viz strana

3.3.1 Přehled

42

3.3.2 Western oddíly jednotky

46

3.3.3 Cesty průtoku kapaliny

51


41

3 Popis systému 3.3 Western jednotka 3.3.1 Přehled

3.3.1

Přehled

Úvod Tato část popisuje přehled prvků předního a zadního panelu jednotky Western.

Obrázek jednotky Western Obrázek níže zobrazuje hlavní části jednotky Western:

6

7

5

8

4 3 2 1

42

Součást

Popis

1

Víko prostoru protilátek

2

Plocha, jejímž stisknutím se otevře kryt prostoru na protilátky

3

Panel nástrojů (pro indikátory stavu)

4

Víko přenosové nádrže



Součást

Popis

5

Stojánek na láhve (a víko servisního prostoru) Poznámka: Stojánek na láhve vyjímejte pouze při kontrole čerpadel a hadiček nebo při výměně částí, jak je popsáno v Kapitola 6 Údržba, na straně 177.

6

Držáky hadiček

7

Víko značicího prostoru

8

Víko prostoru na vysoušení


43


Obrázek zadního panelu jednotky Western Obrázek níže zobrazuje hlavní části zadního panelu jednotky Western:

1

2

4

5

1

6

7

44

3

Součást

Popis

1

Vývody odpadních a přepadových hadiček

2

Komunikační připojení pro Elpho & scan (použijte ethernet kabel)

3

Napájecí konektor (60320/C14)

4

Přihrádka pojistky (5x20 mm)

5

Hlavní vypínač (Zapnuto=I, Vypnuto=O)

6

Výstupy vzduchu



Součást

Popis

7

Přívod vzduchu


45

3 Popis systému 3.3 Western jednotka 3.3.2 Western oddíly jednotky

3.3.2

Western oddíly jednotky

Úvod Tato část popisuje různé přihrádky na jednotce Western s otevřenými víky.

Obrázek přenosové nádrže Níže uvedený obrázek ukazuje přenosovou nádrž jednotky Western.

1

5

46

2

3

4

Součást

Popis

1

Vodicí drážky sendviče

2


3

Pravá přenosová elektroda



Součást

Popis

4

Filtr přenosové nádrže

5

Levá přenosová elektroda

Obrázek značicího prostoru Níže uvedený obrázek ukazuje značicí prostor jednotky Western.

1

2

3

4

5

6 Součást

Popis

1

Značicí komora

2

Víko značicí komory


47


Součást

Popis

3


4

Vodicí piny pro kartu PVDF (označeny oranžovými kroužky)

5

Víko značicího prostoru

6

Poklop víka značicí komory

Obrázek prostoru na sušení Níže uvedený obrázek ukazuje vysoušecí prostor jednotky Western.

1

48

2

Součást

Popis

1

Vodicí prvky membránové sušičky

2

Ukazatel polohy A a polohy B umístění



Obrázek prostoru protilátek Níže uvedený obrázek ukazuje prostor protilátek, kam se dávají zkumavky s 15 ml roztoku protilátek s primárními a sekundárními protilátkami před značením (levá strana). Více informací viz Připojte hadičky s roztokem protilátek, na straně 159. Pravá strana prostoru se používá pro skladování Amersham WB membrane adapters (membránové adaptéry).

1

2

7

3

6

4

5

Součást

Popis

1

Držák zkumavky

2

Hadičky

3

Zámek dveří (magnetický)

4

Membránové adaptéry

5

Držák membránových adaptérů

6

Zámek dveří

7

Ukazatel polohy zkumavky s roztokem A PRIMARY, A SECONDARY, B PRIMARYa B SECONDARY.


49


Obrázek servisního prostoru Níže uvedený obrázek ukazuje servisní prostor jednotky Western.

1

2

3

4

5

50

Součást

Popis

1

Blok přenosového ventilu

2

Značicí čerpadlo

3

Přenosové čerpadlo

4

Víko prostoru vzduchového filtru

5

Blok značicího ventilu


3 Popis systému 3.3 Western jednotka 3.3.3 Cesty průtoku kapaliny

3.3.3

Cesty průtoku kapaliny

Úvod Tato část ukazuje přenosové a značicí průtokové cesty na jednotce Western a popisuje základní principy práce s ní.

Obrázek přenosové cesty průtoku kapaliny Následující obrázek ukazuje detailní diagram průtoků v přenosovém procesu. Diagram ukazuje propojení mezi součástmi přístroje. Bílé štítky odkazují na označení hadiček. Modrá čísla odkazují na součásti přístroje. 5

T WASTE

T BUFFER

T WATER

1

3

4 2


51


Níže uvedená tabulka popisuje součásti v blokovém schématu: Součást

Popis

1

Blok přenosového ventilu Pro výběr roztoku, který by měl být čerpán přes cestu průtoku kapaliny.

2

Přenosová nádrž

3

Přenosové čerpadlo Pro čerpání roztoku přes cestu průtoku kapaliny.

4

Přenosová chladicí jednotka Pro ochlazení přenosového pufru, aby byla zachována jeho pokojová teplota.

5

Přepad přenosové nádrže

Princip procesu přenosu Během přenosu dochází k elektroforetickému přenosu oddělených proteinů v gelu na membránu. Princip procesu přenosu je popsán níže. Stupeň

Popis

1

Jakmile je Amersham WB transfer holder(s) (přenosový držák) vložen do přenosové nádrže, je tato naplněna přenosovým pufrem (zkumavka označená T Buffer).

2

Během přenosu je přenosový pufr čerpán přes přenosovou nádrž, přenosovou chladící jednotku, přenosové čerpadlo a blok přenosového ventilu a dochází tak k cirkulaci přenosového pufru během cyklu. Přenosová chladicí jednotka zajišťuje zachování pokojové teploty pufru během cyklu.

3

52

Po dokončení cyklu a po odstranění přenosových držáků, se použije k čištění cesty průtoku kapaliny ultra čistá voda (zkumavka označená T Water se použije k čištění).



Obrázek značicí cesty průtoku kapaliny Následující obrázek ukazuje detailní diagram průtoků v procesu značení. Blokové schéma ukazuje propojení mezi součástmi přístroje. Bílé štítky odkazují na označení hadiček. Modrá čísla odkazují na součásti přístroje. P WASTE

P WASTE

P CUSTOM

P WATER

P WASH

P FINAL WASH

P BLOCK

2 4

Prim A

Sec A

Prim B

5

Sec B

3

1

6

A

B

Níže uvedená tabulka popisuje součásti v blokovém schématu: Součást

Popis

1

Prostor protilátek se zkumavkami s roztokem protilátek obsahujícími primární a sekundární protilátky na pozice A a B.

2

Blok značicího ventilu Slouží pro výběr roztoku, který by měl být čerpán přes cestu průtoku kapaliny.

3

Značicí čerpadlo Pro čerpání roztoku přes cestu průtoku kapaliny.


53


Součást

Popis

4

Snímač vzduchu Slouží ke zjištění, zda je v hadičkách vzduch. Detektor vzduchu pozastaví cyklus, je-li láhev s roztokem prázdná.

5

Ventil značicí komory s voličem Chcete-li zvolit, zda se má směřovat roztok do značicích komor nebo ze značicích komor do odpadní výpusti.

6

Značicí komory

Princip procesu značení V procesu značení se primární protilátky navážou na proteiny na membráně a pak se sekundární protilátky konjugované na CyDye navážou na primární protilátky. Princip procesu značení je popsán níže. Stupeň

Popis

1

Značicí komora je předplněná prvním roztokem, což je zaznamenáno v protokolu značení v softwaru (blokovací roztok se používá jako výchozí). Předplnění značicí komory spouští uživatel výběrem vhodného pokynu v softwaru.

2

54

Karty PVDF se vkládají do značicích komor a provede se sekvenční inkubace (včetně mycích cyklů) membrány blokovacím roztokem, primární protilátkou a sekundární protilátkou.


3 Popis systému 3.4 Přehled příslušenství a spotřebního materiálu

3.4

Přehled příslušenství a spotřebního materiálu

Úvod Tato část poskytuje přehled příslušenství a spotřebního materiálu, které se používá s Amersham WB analyzer. Dále obsahuje informace o skladování spotřebního materiálu a informace o tom, jak si objednat spotřební materiál.

Příslušenství a spotřební materiál Níže uvedená tabulka obsahuje seznam příslušenství a spotřebního materiálu, které mají být použity s přístrojem u konkrétních prováděných úkonů. Příslušenství přístroje se dodává se systémem a spotřební materiál se objednává samostatně. Příslušenství, které má být nainstalováno, je popsáno v Oddíl 4.2 Instalace hardware, na straně 90 a příslušenství pro uživatelskou údržbu je popsáno v Příslušenství pro údržbu, na straně 188. Podrobný popis příslušenství a spotřebního materiálu naleznete v následujících částech. Úkol

Požadovaný spotřební materiál

Předznačení vzorků

•

Amersham WB Cy5

•

Amersham WB labeling buffer (Značkovací pufr)

•

Amersham WB loading buffer (Vkládací pufr)

•

Amersham WB MiniTrap™ kit (volitelný doplněk)

•

Amersham WB molecular weight markers (Markery molekulové hmotnosti)

•

Amersham WB gel card (Gelová karta)

•

Amersham WB buffer strip (Strip s pufrem)

•

Amersham WB loading buffer

•

Amersham WB paper comb (volitelný doplněk) (Papírový hřeben)

Cyklus elektroforézy


Požadované příslušenství

Podrobnosti viz ...

neuplatňuje se

Oddíl 3.5

Amersham WB buffer strip holder 1 (Držák stripů s pufrem)

Oddíl 3.6

55


Úkol



Podrobnosti viz ...

Amersham WB transfer holder1 (Přenosový držák)

Oddíl 3.7.1

Hadičky roztoku protilátky1

Oddíl 3.7.2

Western blotovacích kroků Přenos

Značení

•

Amersham WB gel card z cyklu elektroforézy

•

Amersham WB PVDF card (karta PVDF)

•

Amersham WB transfer paper (Přenosový papír)

•

Amersham WB sponge (Houba)

•

Laboratorně připravené přenosové roztoky (návod na přípravu viz Návody na přenosové roztoky, na straně 134)

•

Laboratorně připravené roztoky s primární protilátkou

•

Sekundární protilátka: Amersham WB goat anti-mouse Cy3/Cy5 (kozí anti-myší Cy3/Cy5) nebo Amersham WB goat anti-rabbit Cy3/Cy5 (kozí anti-králičí Cy3/Cy5)

•

PVDF karta z přenosového kroku

•

Laboratorně připravené značící roztoky (návod na přípravu viz Značicí roztoky a roztoky protilátek, na straně 158)

Sušení

PVDF karty z přenosového kroku

Amersham WB drying holder (Držák na sušení vzorků)

neuplatňuje se

Skenování karty PVDF v jednotce Elpho & scan

PVDF z kroku sušení

Amersham WB membrane adapter1 (Membránová adaptér)

Oddíl 3.7.4

Jiné

56



Úkol



Podrobnosti viz ...

Skenování štítků datové matice na gelových kartách a PVDF kartách jednotlivých balení (volitelné)

neuplatňuje se

Čtečka štítků matic (objednává se zvlášť)

Oddíl 3.8

1

Součástí dodávky obsahující Amersham WB analyzer.

Objednání spotřebního materiálu Dle experimentů, které mají být provedeny, jsou vyžadovány různé kombinace spotřebního materiálu. Průvodce výběrem spotřebního materiálu v sadě je k dispozici nawww.gelifesciences.com. Informace pro objednávání jednotlivého spotřebního materiálu viz Amersham WB system User Manual.

Skladování spotřebního materiálu Níže uvedená tabulka shrnuje podmínky skladování a požadavky na okolí pro různý spotřební materiál. Datum použitelnosti spotřebního materiálu je vytištěno na obalu. Spotřební materiál

Skladovací teplota

Prostředí

Spotřební materiál na předznačení

-15 °C až -30 °C

Chraňte obsah před přímým slunečním zářením. Vyhněte se opakovanému zmrazování a rozmrazení barvícího činidla Cy5. Zředěné barvící činidlo Cy5 by mělo být použito do 30 minut a nesmí být zmrzlé.


57


Spotřební materiál

Skladovací teplota

Prostředí

Amersham WB molecular weight markers

-15 °C až -30 °C

Chraňte markery molekulové hmotnosti (MW) před přímým slunečním zářením. Markery molekulové hmotnosti musí být vždy uloženy v mrazáku. Minimalizujte dobu vystavení pokojové teplotě před použitím a vyhněte se opětovnému zmrazení. Markery molekulové hmotnosti rozpuštěné ve vkládacím pufru s DTT lze rozdělit do alikvotů pro jednorázové použití, jsou-li zmrazeny bezprostředně po naředění. Alikvoty by neměly být skladovány déle než jeden týden.

Amersham WB gel card

4 °C až 8 °C

Skladujte v lednici nebo chladné místnosti.

Amersham WB buffer strips

4 °C až 8 °C

Skladujte v lednici nebo chladné místnosti.

Amersham WB PVDF card

Pokojová teplota

Skladujte karty PVDF v jednom balení a v krabici, ve které byly dodány. Uložte krabici na čistém a suchém místě, chráněném před světlem.

Amersham WB transfer paper

Pokojová teplota

Skladujte přenosové papíry na suchém místě a v krabici, ve které byly dodány. Chraňte před prachem.

Amersham WB paper comb

Pokojová teplota

Skladujte papírové hřebeny na suchém místě a v krabici, ve které byly dodány. Chraňte před prachem.

Amersham WB sponge

58

Pokojová teplota

Chraňte před prachem a přímým slunečním zářením.



Spotřební materiál

Skladovací teplota

Prostředí

Amersham WB goat anti-mouse Cy3/Cy5 nebo Amersham WB anti-rabbit Cy3/Cy5, lyofilizovaný

2 °C až 8 °C

Chraňte sekundární protilátky před světlem.

Rekonstituované sekundární protilátky (rekonstituované v ultra čisté vodě na koncentraci 1 μg/μl)

Skladujte alikvoty při teplotě 15 °C až -30 °C

Chraňte rekonstituované protilátky před světlem.

Primární protilátky

Viz pokyny výrobce.

Alikvoty by neměly být skladovány déle než 6 měsíců. Vyhněte se opakovanému zmrazování a rozmrazení.


Viz pokyny výrobce.

59

3 Popis systému 3.5 Spotřební materiál na předznačení

3.5


Úvod Spotřební materiál na předznačení se používá na předznačení proteinových vzorků s fluorescenčním barvivem. Fluorescenční předznačení vzorků: •

umožňuje detekci celkového proteinu při skenování gelové karty,

•

eliminuje potřebu dodatečného barvení gelu.

Kdy se používá předznačení proteinů Předznačení proteinů se vždy provádí před krokem elektroforézy při provádění: •

elektroforetických experimentů

•

Western experimentů s normalizací celkového proteinu.

Spotřební materiál na předznačení Spotřební materiál na předznačení je balen v oddělených fóliových sáčcích. Každý plastový sáček dostatečné množství chemikálií na roztok pro zpracování 10 gelových karet (kde se do 14 pruhů / gelových karet založí předznačené vzorky), tedy pro 140 individuálních identifikačních reakcí. Níže uvedená tabulka shrnuje obsah Spotřebního materiálu na předznačení. Spotřební materiál na předznačení

Obsah

Množství

Amersham WB Cy5

0,25 mg/ml (přibližně 250 pmol/μl) barviva Cy5 v DMSO

5 lahviček (modrá víčka)

Tris-pufr obsahující SDS s pH 8,7 (při 25 °C)

5 lahviček (černá víčka)

Amersham WB labeling buffer (Značkovací pufr)

60

35 μl Cy5 roztok barviva v jedné lahvičce (dost pro dvě gelové karty)

0,7 ml roztoku identifikačního pufru v jedné lahvičce (dostatečné množství na dvě gelové karty)


3 Popis systému 3.5 Spotřební materiál na předznačení


Obsah

Množství

Amersham WB loading buffer (Vkládací pufr)

50 mM Tris-Cl, 0,25% (w/v) Orange G, 4% SDS, 0,5 mM Lysin

5 lahviček (oranžová víčka) 0,7 ml roztoku vkládacího pufru v jedné lahvičce (dost pro dvě gelové karty)

Spotřební materiál na přípravu vzorků Níže uvedená tabulka popisuje Amersham WB MiniTrap kit. Spotřební materiál na přípravu vzorků

Funkce

Množství

Amersham WB MiniTrap kit

Souprava je určena pro rychlé a pohodlné vyčištění proteinových vzorků (>5 000 Mr) obsahujících interferující látky, např. imidazol.

•

30 balených jednorázových kolon PD MiniTrap G-25 s médiem Sephadex™ G-25

•

1 láhev 10× Amersham WB labeling buffer (14 ml zásobního roztoku)

•

Integrovaný stojan na kolonu, zásobník na odpad a držák na zkumavky


61

3 Popis systému 3.6 Příslušenství a spotřební materiál pro elektroforézu

3.6

Příslušenství a spotřební materiál pro elektroforézu

Úvod Pro proteinovou elektroforézu je zapotřebí následující příslušenství a spotřební materiál: •

Amersham WB buffer strip

•

Amersham WB buffer strip holder

•


•


•

Amersham WB paper comb, pokud bude provedeno čištění jamek na vzorky

•

Amersham WB loading buffer (informace o vkládacím pufru viz Oddíl 3.5 Spotřební materiál na předznačení, na straně 60)


62

Viz strana

3.6.1 Amersham WB molecular weight markers

63

3.6.2 Amersham WB gel card

65

3.6.3 Amersham WB buffer strip a Amersham WB buffer strip holder

68

3.6.4 Amersham WB paper comb

70


3 Popis systému 3.6 Příslušenství a spotřební materiál pro elektroforézu 3.6.1 Amersham WB molecular weight markers

3.6.1


Úvod Amersham WB molecular weight markers je směs devíti nativních a rekombinantních proteinů, Mr: 10 000 až 225 000, značené pomocí Cy3 i Cy5, pro určení molekulové hmotnosti proteinů na skenovaných gelových kartách a kartách PVDF. Software vypočítá kalibrační křivky molekulové hmotnosti. Jsou-li použity dvě kalibrační křivky molekulové hmotnosti, interpolovaná data z křivek se používají k vytvoření konkrétní kalibrační křivky pruhu vzorku. Pak se vypočítají molekulové hmotnosti všech detekovaných pásem v každém pruhu.

Obsah Každé balení Amersham WB molecular weight markers obsahuje roztok na zpracování 10 gelových karet (kde 2 dráhy/gelovou kartu jsou ošetřeny Amersham WB molecular weight markers).

Obrázek markerů MH Níže uvedený obrázek ukazuje velikosti Amersham WB molecular weight markers separované na gradientní gelové kartě (levý obrázek) a homogenní gelové kartě (pravý obrázek) Mr×103

225 97 66 50

225 97 66 50

35 25

35

20

20

14 10

14

25

10


63

3 Popis systému 3.6 Příslušenství a spotřební materiál pro elektroforézu 3.6.1 Amersham WB molecular weight markers

Proteiny markerů MH Níže uvedená tabulka ukazuje obsažené proteiny:

64

Protein

Molekulová hmotnost (Mr×103)

Rekombinantní protein

225

Fosforyláza b, králičí sval

97

Albumin, hovězí sérum

66


50


35


25

Trypsinový inhibitor, sójový bob

20

Alfa-laktalbumin, kravské mléko

14


10


3 Popis systému 3.6 Příslušenství a spotřební materiál pro elektroforézu 3.6.2 Amersham WB gel card

3.6.2


Úvod Tato část popisuje detaily gelové karty.

Typy gelových karet K dispozici jsou dva typy gelových karet: •

Homogenní gelová karta: Amersham WB gel card 14, 13.5%

•

Gradientní gelová karta: Amersham WB gel card 14, 8-18%

Složení gelu: Gely jsou prefabrikované v kazetě s gelovými kartami. Jedná se o polyakrylamidové/bisakrylamidové gely obsahující Tris-acetátový pufr.

Rozlišení při separaci proteinů Níže uvedená tabulka uvádí rozlišení při separaci proteinů pro jednotlivé typy gelových karet: Typ gelových karet

Separační rozlišení (Mr×103)

Amersham WB gel card 14, 13.5%, Homogenní

10 až 225

Amersham WB gel card 14, 8-18%, Gradientní

•

6 až 225 (předznačené proteiny)

•

3,5 až 225 (Western experimenty, Detekce protilátek)


65


Zobrazení přední strany gelové karty Níže uvedený obrázek ukazuje gelovou kartu přední stranou nahoru: 4

4

3

5

6

2 5

1

Součást

Popis

1

Psací povrch pro vlastní popisky Poznámka: Při psaní popisků vždy používejte tužku. Popisky mohou být zapsány také do softwaru.

2

Štítek s typem gelové karty

3

Krytí jamky se vzorkem ,které musí být odstraněno, jakmile je těsnící víko jednotky Elpho & scan uzavřeny, před aplikací vzorků.

4

Úchytky gelu k usnadnění manipulace s gelem, když je odstraněn z podkladu pro potřeby Western blotování.

66



Součást

Popis

5

Vodící otvory pro správné umístění gelových karet v zásobníku a přenosovém držáku Elpho & scan.

6

Štítek s indikátorem údajů matice, číslem šarže a ID

Zobrazení zadní strany gelové karty Níže uvedený obrázek ukazuje gelovou kartu zadní stranou nahoru: 1

2

1

Součást

Popis

1

Ochranné fólie , které jsou odstraněny před elektroforézou, aby došlo ke kontaktu mezi gelem a pufrovými pásy.

2

Ochranná fólie , která je odstraněna při přípravě přenosového sendviče (relevantní pouze u Western experimentů).


67

3 Popis systému 3.6 Příslušenství a spotřební materiál pro elektroforézu 3.6.3 Amersham WB buffer strip a Amersham WB buffer strip holder

3.6.3

Amersham WB buffer strip a Amersham WB buffer strip holder

Úvod Držáky pufrového stripu udržují pufrové stripy na místě během elektroforézy. Držáky pufrového stripu mají vestavěné elektrody, které umožňují kontakt mezi elektrodou a pufrovým stripem a tedy průtok elektrického proudu během cyklu. Pufrové stripy jsou vloženy do držáků před zahájením cyklu a zlikvidovány po jeho skončení. Tvar držáku navede uživatele při umístění pufrových stripů do držáků a při umísťování držáků do jednotky Elpho & scan. Více informací viz Příprava před spuštěním elektroforézy, na straně 124.

Pufr používaný v pufrových stripech Pufrem používaným v pufrových stripech je Tris-tricin.

Obrázek pufrových stripů Následující obrázek znázorňuje pufrové stripy.

68


3 Popis systému 3.6 Příslušenství a spotřební materiál pro elektroforézu 3.6.3 Amersham WB buffer strip a Amersham WB buffer strip holder

Obrázek držáků pufrových stripů Následující obrázek znázorňuje držák pufrových stripů.


69

3 Popis systému 3.6 Příslušenství a spotřební materiál pro elektroforézu 3.6.4 Amersham WB paper comb

3.6.4


Úvod Papírový hřeben se používá k vyčištění jamek na vzorky, když se po dobu několika minut proteiny přesunují do gelu. Doporučuje se vyčistit jamku na vzorky, aby došlo k odstranění přebytečného barviva, pokud jsou použity předem označené vzorky. Tím se snižuje pozadí, což zlepšuje detekci a kvantifikaci nízkoabundantních proteinů (<1 ng/pás) a proteinů s nízkou molekulární hmotností (Mr<40 000). Vyčistění jamky na vzorek obvykle zlepší rozlišení v rámci pásu, a to i neoznačených vzorků s vysokou koncentrací proteinů nebo vzorků velkých objemů. Více informací o tom, jak použít papírový hřeben najdete na Spouštění a monitorování elektroforézy a skenování gelu, na straně 129.

Obrázek papírového hřebenu Následující obrázek znázorňuje papírový hřeben.

70


3 Popis systému 3.7 Příslušenství a spotřební materiál pro kroky Western blotování

3.7

Příslušenství a spotřební materiál pro kroky Western blotování

Úvod Tato část popisuje příslušenství a spotřební materiál používaný pro přenos proteinů z gelu na membránu, značení membrány pomocí primárních a sekundárních protilátek a skenování karet PVDF.


Viz strana

3.7.1 Příslušenství a spotřební materiál pro přenos

72

3.7.2 Sekundární protilátky – značení

77

3.7.3 Držák na sušení – sušení karet PVDF

79

3.7.4 Membránový adaptér – PVDF skenování karty

80


71

3 Popis systému 3.7 Příslušenství a spotřební materiál pro kroky Western blotování 3.7.1 Příslušenství a spotřební materiál pro přenos

3.7.1

Příslušenství a spotřební materiál pro přenos

Úvod V této části jsou popsána následující témata: •

Amersham WB transfer holder (Příslušenství)

•

Amersham WB PVDF card (Spotřební materiál)

•

Amersham WB transfer paper (Spotřební materiál)

•

Amersham WB sponge (Spotřební materiál)

Amersham WB transfer holder Přenosový držák se používá během transferu. Obsahuje přenosový sendvič (houbu, přenosový papír, gelovou kartu, kartu PVDF přenosový papír a houbu) připravený před zahájením přenosu. Oddělené proteiny jsou přeneseny z gelu na membránu v průběhu přenosového cyklu. Vodící piny v přenosovém držáku zajistí, aby gelová karta a karta PVDF byly ve správné poloze při přípravě přenosového sendviče. Pomocí vestavěného válečku (při pohybu válečku přes sendvič po kolejničkách válečku) se odstraní vzduchové bubliny a je aplikován reprodukovatelný tlak na gelovou kartu a kartu PVDF pro rovnoměrný průběh přenosu. Více informací o tom, jak připravit přenosový sendvič, najdete v Začněte vytvářet přenosový sendvič, na straně 142.

72



Ilustrace přenosového držáku v zavřené poloze Obrázek níže ukazuje přenosový držák, pokud je uzavřen:

Ilustrace rozloženého přenosového držáku Obrázek níže ukazuje přenosový držák, pokud je demontovaný: 3

1

4

5

2

6

7

Níže uvedená tabulka popisuje různé části přenosového držáku. Součást

Funkce

Spodní část (černé víko)


73


Součást

Funkce

1

Závlačky

2

Vodící piny pro gelovou kartu a kartu PVDF

3

Válečkové dráhy (pro válečkové piny)

Horní část (bílé víko) 4

Válečkové piny (vejdou se do drážek válečku, používají se k instalaci víka)

5

Váleček

6

Rukojeť

7

Otvory pro závlačky

Amersham WB PVDF card V kroku přenosu jsou proteiny přeneseny z gelu do blotovací oblasti PVDF karty. KartaPVDF je nízko fluorescenční membránou PVDF. Níže uvedený obrázek ukazuje různé části kartyPVDF a jednotlivé balení karty PDVF.

2

1

1

3

1

4

5

6

7

3

Následující tabulka popisuje různé části karty PVDF a jednotlivé balení karty PDVF.

74



Součást

Popis

1

Vodící otvory Poznámka: Vodicí otvory pomáhají správnému umístění karty v přenosovém držáku, ve značícím prostoru, držáku na sušení a zásobníku Elpho & scan.

2

Psací povrch pro vlastní popisky Poznámka: Při psaní popisků vždy používejte tužku. Popisky mohou být zapsány také do softwaru.

3

Úchytky karty

4

Blotovací oblast

5

PDVF jednotlivé balení karty

6

PDVF karta s ochrannými papíry

7

Štítek s kódem produktu, číslo šarže, Identifikační číslo a Identifikátor údajů matic (obsahuje kód produktu, číslo šarže a identifikační číslo)

Amersham WB transfer paper Přenosové papíry se používají při přípravě přenosového sendviče. Následující obrázek ukazuje přenosový papír:


75


Amersham WB sponge Dvě houby se používají při přípravě přenosového sendviče. Houby je třeba vyměnit po každém cyklu. Následující obrázek ukazuje houbu.

76


3 Popis systému 3.7 Příslušenství a spotřební materiál pro kroky Western blotování 3.7.2 Sekundární protilátky – značení

3.7.2

Sekundární protilátky – značení

Úvod Cílové proteiny jsou identifikovány značením membrány primárními protilátkami a druhově specifickými sekundárními protilátkami konjugovanými pomocí CyDye. Při použití dvou různých druhů primárních protilátek (myší a králíků) a jedné sekundární protilátky konjugované pomocíCy3 a jedné sekundární protilátky konjugované pomocí Cy5, je možné provést multiplexní experiment s detekcí dvou proteinů současně na stejné membráně. K dispozici jsou následující varianty sekundárních protilátek konjugovaných pomocíCyDye: •

Amersham WB goat anti-mouse Cy3 (kozí anti-myší Cy3)

•

Amersham WB goat anti-rabbit Cy3 (kozí anti-králičí Cy3)

•

Amersham WB goat anti-mouse Cy5 (kozí anti-myší Cy5)

•

Amersham WB goat anti-rabbit Cy5 (kozí anti-králičí Cy5)

CyDye (konjugované na sekundární protilátky) BarvivaCyDye konjugovaná na sekundární protilátky mají své specifické excitační i emisní vlnové délky ve viditelném světle a jsou od sebe spektrálně odlišeny, což má za následek minimální výskyt nežádoucích signálů, viz tabulka níže. CyDye

Excitační vlnová délka

Emisní vlnová délka

Cy3

550 nm

570 nm

Cy5

649 nm

670 nm

Po excitaci jsou výsledné emisní fluorescenční signály zachyceny pomocí vícekanálového fluorescenčního snímač na jednotce Elpho & scan. CyDye má vysokou fotostabilitu. Signál na snímané membráně je stabilní po dobu >3 měsíců, je-li uložena v temnu.


77

3 Popis systému 3.7 Příslušenství a spotřební materiál pro kroky Western blotování 3.7.2 Sekundární protilátky – značení

Příprava a uchovávání rekonstituovaných sekundárních protilátek Rekonstituujte sekundární protilátky v 150 μl ultra čisté vody na lahvičku, na koncentraci 1 μg/μl. Rekonstituované sekundární protilátky míchejte vířivým pohybem a odstřeďujte ke dnu. Doporučuje se skladovat sekundární protilátky v alikvotech při -15 °C až -30 °C, a chránit je před světlem. Vyhněte se opakovanému zmrazování a rozmrazení.

78


3 Popis systému 3.7 Příslušenství a spotřební materiál pro kroky Western blotování 3.7.3 Držák na sušení – sušení karet PVDF

3.7.3

Držák na sušení – sušení karet PVDF

Úvod Amersham WB drying holder (Držák na sušení) směřuje a fixuje kartu PVDF do správné polohy pro nejlepší možný výsledek sušení.

Vyobrazení držáku na sušení Následující obrázky ukazují držák na sušení při zavření (nahoře) a držák na sušení při otevření (dole).


79

3 Popis systému 3.7 Příslušenství a spotřební materiál pro kroky Western blotování 3.7.4 Membránový adaptér – PVDF skenování karty

3.7.4

Membránový adaptér – PVDF skenování karty

Úvod Amersham WB membrane adapter (Membránový adaptér) směřuje a fixuje kartuPVDF do správné polohy pro nejlepší možný výsledek skenování a detekce v jednotce Elpho & scan.

Vyobrazení membránového adaptéru Následující obrázky ukazují membránový adaptér při zavření (vlevo) a membránový adaptér při otevření (vpravo):

80


3 Popis systému 3.8 Ostatní příslušenství

3.8

Ostatní příslušenství

Čtečka indikátoru matice Čtečka indikátoru matice se používá k zadání informací o gelové kartě a kartě PVDF (kód produktu, číslo a číslo šarže) do softwaru pomocí skenování datových indikátorů matic na štítku jednotlivého balení gelové karty a PVDF karty. Musí se objednat zvlášť (viz Informace pro objednání v Amersham WB system User Manual). Níže uvedený obrázek ukazuje čtečku indikátoru matice.

Držák vstupního filtru Držáky vstupního filtru se vstupními filtry se nacházejí na vstupních hadičkách, které jsou zavedeny do lahví na stojanu. Částice jsou filtrovány vstupním filtrem a držák vstupního filtru sám o sobě působí jako závaží, které drží hadičku na místě na dně láhve. Na následujícím obrázku je znázorněn držák vstupního filtru s instalovaným vstupním filtrem připojeným k hadičce.


81

3 Popis systému 3.8 Ostatní příslušenství

Držáky hadiček Pro kompenzaci napětí, když je hadička umístěna do lahví, a aby se zabránilo pádu láhve při poklesu hladiny kapaliny, musí být držák hadičky připevněn k hadičce. Viz obrázek níže:

Další příslušenství určené k instalaci uživatelem Přenosové elektrody a vodítka membránové sušičky musí být nainstalovány uživatelem. Více informací viz Instalace přenosových elektrod, na straně 93 a Nainstalujte vodítka membránové sušičky v sušicím prostoru, na straně 100.

Příslušenství pro údržbu uživatelem Popis příslušenství pro údržbu uživatelem viz Příslušenství pro údržbu, na straně 188.

82


3 Popis systému 3.9 Přehled softwaru

3.9

Přehled softwaru

Úvod Tato část poskytuje přehled o Amersham WB software.

Zobrazení úvodní obrazovky softwaru Na úvodní obrazovce softwaru je možné vytvářet nové experimenty a otevírat dříve uložené experimenty. Informace o tom, jak vytvořit a upravit experimenty v softwaru viz Vytvoření a nastavení experimentu, na straně 116.


83


Zobrazení hlavní obrazovky softwaru Níže uvedený obrázek ukazuje hlavní obrazovku softwaru pro Western experiment.

Plocha

Popis

1

Lišta nabídky Lišta nabídky se skládá ze čtyř nabídek: •

File: Vytvoření, otevření a uložení experimentů. Vytištění informací a ukončení softwaru.

•

Control: Přerušení procesu, prázdná přenosová komora a komora značení, spuštění čištění přenosových a značících průtokových cest.

•

Remote: Připojení a odpojení od vzdáleného přístupu k přístroji. Načtení přístupových kódů přístroje a správa vzdáleného uživatele. Úprava konfigurace vzdáleného připojení. Poznámka: Viditelnost pouze je-li připojen přístroj.

•

84

Help: Vytváření systémových zpráv. Otevření panelu s nápovědou, uživatelské příručky a About Amersham WB dialogu.



Plocha

Popis

2

Panel pracovního postupu Panel pracovního postupu zobrazuje různé kroky pracovního postupu v softwaru pro experiment. Je možné pohybovat se dopředu a dozadu a zobrazit a editovat informace a parametry v různých krocích před zahájením procesu (tj. elektroforézy, přenosu, značení, sušení nebo skenování membrány). Vždy je možné se vrátit a upravovat text v poli s informacemi v různých krocích pracovního postupu během procesu a po něm. Například lze tabulku vzorků vyplnit po spuštění elektroforézy. Poznámka: Pro experiment s elektroforézou, se kroky pracovního postupu TRANSFER, PROBING & DRYING a MEMBRANE SCANNING objeví v šedé barvě. Tyto kroky jsou součástí pouze Western experimentů.

3

Pracovní plocha Pracovní plocha zobrazuje textové informace, parametry a ovládací prvky pro aktuálně zobrazené kroky pracovního postupu.

4

Stavový panel přístroje Stavový panel přístroje ukazuje stav jeho připojení. Je-li přístroj připojen, ukazuje se zde stav každého hardwarového modulu (prostor pro elektroforézu a skenování, přenosový tank, značící prostor a prostoru na sušení) a postup každého cyklu v modulech. Lze otevřít několik experimentů najednou. Každý experiment vyžaduje otevření nové instance softwaru. Stavový panel přístroje bude ukazovat stav přístroje u všech otevřených pokusů. Jeden modul hardwaru lze použít najednou pouze na jeden experiment. To znamená, že lze spustit paralelně čtyři různé kroky pracovního postupu ze čtyř různých experimentů.

5

Panel nápovědy Panel nápovědy zobrazuje pokyny nápovědy pro obrazovku aktuálně zobrazenou na pracovní ploše. Při výběru nového kroku pracovního postupu se pokyny nápovědy automaticky aktualizují a zobrazí se nápověda pro aktivní obrazovku. Tip: Chcete-li zobrazit uživatelskou příručku obsahující podrobné informace o systému, zvolte Help:View user manual v liště nabídky, nebo stiskněte Ctrl+F1.


85

4 Instalace

4

Instalace

O této kapitole Tato kapitola popisuje, jak se instaluje Amersham WB system.


86

Viz strana

4.1 Příprava místa instalace

87

4.2 Instalace hardware

90

4.3 Instalace softwaru

103


4 Instalace 4.1 Příprava místa instalace

4.1

Příprava místa instalace

Proč příprava na místě? Místo pro přístroj v laboratoři je nutno naplánovat a připravit před instalací systému Amersham WB system. Výkonnostních specifikací systému lze dosáhnout pouze v případě, že laboratorní prostředí splňuje požadavky uvedené v této části. Vždy dodržujte všechny místní bezpečnostní předpisy.

Požadavky na prostor VÝSTRAHA Umístěte systém Amersham WB analyzer v místnosti s ventilací, pokud budete používat methanol nebo jiné chemikálie vyžadující odvětrávání.

Přístrojové jednotky by neměly být vystaveny přímému slunečnímu záření. Prach v atmosféře je třeba udržovat na minimu. Rozsah teploty a vlhkosti je specifikován v tabulce níže. Parametr

Povolený rozsah

Okolní teplota, provoz

15℃ - 32℃ Pro plný výkon: 16 °C až 28 °C

Okolní teplota, skladování a přeprava

-25 °C - +60 °C

Relativní vlhkost, provoz

20% až 80%, nekondenzující Pro plný výkon: 20 % až 70 %, bez kondenzace

Nadmořská výška

Maximálně 2 000 m

Prostředí

Používání pouze uvnitř


87


Požadavky na prostor VÝSTRAHA Neblokujte přístup k hlavnímu vypínači a napájecímu kabelu. Hlavní vypínač musí být vždy snadno přístupný. Napájecí kabel se zástrčkou musí být vždy snadno odpojitelný.

Přístrojové jednotky by měly být umístěny na laboratorním stole. Stůl musí být čistý, rovný, vodorovný, stabilní a schopný unést váhu, kterou ho zatěžuje Amersham WB system (přístrojové jednotky: 45 kg + hmotnost notebooku a kapalin umístěných na jednotce Western). Prostorové požadavky viz níže. Za přístrojovými jednotkami musí být kvůli větrání alespoň 10 cm volného prostoru. Prostor potřebný pro dvě jednotky je 90 cm. Nicméně doporučuje se stůl s rozměrem 140 cm, aby byl dostatečný prostor pro přípravu reagencií, manipulaci s gelovou kartou atd.

140 cm

60 cm

Požadavky na napájení Viz Oddíl 7.1 Specifikace systému, na straně 201.

88



Požadavky na počítač Parametr

Parametry

Operační systém

Windows 7 Professional, 32-bit or 64-bit, Anglická verze

Internetový prohlížeč

Windows Internet Explorer 8 a vyšší

Rozlišení obrazovky

1 280 × 800 nebo vyšší rozlišení

Výkon

Minimum: 2 GB fyzické paměti Doporučeno: 4 GB fyzické paměti

Poznámka:

Počítač by se měl instalovat, umístit a používat v souladu s pokyny a technickou specifikací výrobce počítače.


89

4 Instalace 4.2 Instalace hardware

4.2

Instalace hardware

Vybalení přístroje Amersham WB analyzer Viz pokyny pro vybalení Amersham WB analyzer.

Zvedněte přístrojovou jednotku na stůl VÝSTRAHA Zajistěte, aby byl systém umístěn na stabilním rovném stole s dostatečným prostorem umožňujícím větrání.

VÝSTRAHA Neblokujte přístup k hlavnímu vypínači a napájecímu kabelu. Hlavní vypínač musí být vždy snadno přístupný. Napájecí kabel se zástrčkou musí být vždy snadno odpojitelný.

VAROVÁNÍ Osobní ochranné prostředky (PPE). Při balení, rozbalování, přepravě nebo přemisťování používejte prostředky osobní ochrany: •


•


•

Ochranné brýle


90



Krok

Činnost

1

Zvedněte přístrojové jednotky ručně pomocí prostoru určeného na jejich zvedání na boku jednotek. Ujistěte se, že jsou jednotky umístěny na stabilní, rovný stůl.

2

Zvedněte první jednotku přístroje. Použijte místa k uchopení na spodku a boku přístroje s dutinami pěnové ochrany přístroje. Postavte přístroj na laboratorní stůl.

3

Zvedněte druhou jednotku přístroje a postavte ji na laboratorní stůl.


91


Krok

Činnost

4

Kvůli dobrému odvětrávání musí stát přístroj Elpho & scan vlevo a jednotka Western vpravo. Za přístroji musí být kvůli větrání alespoň 10 cm volného prostoru. K hlavnímu vypínači a napájecímu kabelu musí být volný přístup.

5

Seřiďte nožičky, aby stála jednotka vodorovně. To je důležité zejména u jednotky Western.

6

Pokud to není vyloučeno výrobcem a pokud se jedná o přenosný počítač, může být tento umístěn na horní části jednotky Elpho & scan. Viz technické parametry počítače s ohledem na životní prostředí. Pokud se používá počítač na desce stolu, je možné umístit monitor a klávesnici na svrchní část jednotky Elpho & scan. Systémová jednotka počítače nesmí být umístěna na svrchní část jednotky.

92



Odstraňte přepravní ochranné prvky z jednotky Elpho & scan K ochraně křehkých součástí skeneru v jednotce Elpho & scan jsou instalovány přepravní ochranné prvky. Odstraňte pečlivě přepravní ochranné prvky z jednotky, než zapnete napájení.

Instalace přenosových elektrod VÝSTRAHA Odpojte napájení. Před výměnou jakékoliv součásti jednotky přístroje vždy nejprve odpojte její přívod elektrické energie, pokud není v návodu k obsluze uvedeno jinak.

Krok

Činnost

1

Otevřete víko přenosové nádrže.


93


94

Krok

Činnost

2

Nejprve vložte levou přenosovou elektrodu úplně vlevo v přenosové nádrži a zatlačte dolů.

3

Pak vložte pravou přenosovou elektrodu úplně vpravo v přenosové nádrži a zatlačte dolů.

4

Zavřete víko přenosové nádrže.



Připojte jednotky přístroje a počítač a připojte napájecí kabely VÝSTRAHA Ochranný uzemňovací a napájecí kabel. Přístroj Amersham WB analyzer musí být vždy připojen pouze k uzemněné síťové zásuvce. Používejte pouze schválený napájecí kabel se třemi vodiči, dodávaný nebo schválený GE, nebo v souladu se všemi platnými požadavky příslušných místních zákonů o elektrických zařízeních.

VÝSTRAHA Napájecí napětí. Před zasunutím koncovky napájecího kabelu do síťové zásuvky se ujistěte, že napájecí napětí odpovídá hodnotám uvedeným na přístroji.

UPOZORNĚNÍ Každý počítač používaný s přístrojem musí být v souladu s IEC/EN/UL/CSA 60950-1 či jinými bezpečnostními předpisy. Měl by být instalován a používán v souladu s pokyny výrobce.

Krok

Činnost

1

Připojte počítač k jednotce Elpho & scan (kontakt: Computer) pomocí dodaného kabelu USB.

Poznámka: Doporučuje se vypnout režim spánku počítače nebo jej nastavit až na 3 hodiny, pokud je připojen k Amersham WB analyzer. Při vstupu do režimu spánku se přeruší připojení ke vzdálenému přístupu přístroje, což znamená, že se stav cyklu nezaznamená, dokud nebude počítač opět aktivní.


95


Krok

Činnost

2

Připojte jednotku Elpho & scan (kontakt: Western unitk jednotce Western (kontakt: Elpho and scan unit) pomocí dodaného ethernetového kabelu.

3

Připojte napájecí kabely ke konektorům napájecího kabelu jednotek.

4

Připojte napájecí kabel do uzemněné elektrické zásuvky. Informace o napětí a frekvenci viz Oddíl 7.1 Specifikace systému, na straně201.

Poznámka:

96

Nezapínejte hlavní přívod proudu, dokud nedokončíte všechna připojení.



Sestavte hadičkové věže jednotky Western Hadičkové věže pro hadičky jednotky Western nejsou předem sestaveny v balení a musí být sestaveny uživatelem. Krok

Činnost

1

Otevřete plastový sáček s věžemi a hadičkami.

2

Stiskněte každou věže dolů do otvoru a otočte jím ve směru hodinových ručiček, až zacvakne do správné polohy. Hadičky by měly být instalovány takto: Pozice věže

Hadičky

(při pohledu zpředu přístroje) Levá

T buffer a T water

Prostřední

P water, P blocka P wash

Pravá

P Final washa P Custom

Poznámka: Dávejte pozor, abyste při montáži věže neodstranili některý ze štítků hadiček.


97


Připevněte držáky hadiček Pro kompenzaci napětí, když je hadička umístěna do lahví, a aby se zabránilo pádu láhve při poklesu hladin kapalin, musí být držáky hadiček připevněny ke všem hadičkám. Poznámka:

Držáky hadiček musí být sestaveny pro všechny hadičky před připojením vstupních filtrů.

Krok

Činnost

1

Vložte hadičku dovnitř otvoru držáku hadiček.

2

Dále vložte otevřený konec hadičky do slotu držáku hadiček. Poznámka: Ujistěte se, že štítky hadiček jsou stále připojeny k hadičkám. Není nutné zachovat štítek uvnitř držáku hadiček.

Připojte vstupní filtry k hadičkám Vložte hadičku do držáku filtru s vstupním filtrem a otočte držák filtru pro upevnění hadiček.

98



Umístěte odpadní a přepadové hadičky VAROVÁNÍ Odpadové a přepadové hadičky musí být řádně upevněny, aby se zabránilo riziku jejich vypadnutí z nádrže na odpad.

Odpadové a přepadové hadičky umístěte tak, aby byly výpusti níže než stůl, na němž leží Amersham WB analyzer. Zkraťte hadičky na odpovídající délku, aby se zabránilo riziku jejich vypadnutí z nádrže na odpad.


99


Nainstalujte vodítka membránové sušičky v sušicím prostoru

100

Krok

Činnost

1

Otevřete plastový sáček se dvěma vodítky membránové sušičky.

2

Otevřete víko sušicího prostoru.



Krok

Činnost

3

Umístěte vodítka membránové sušičky do dvou slotů.

4

Uložte držáky na sušení v sušicím prostoru.


101


Nainstalujte čtečku identifikátorů matic (volitelné)

102

Krok

Činnost

1

Připojte kabel USB ke čtečce identifikátorů matic.

2

Připojte kabel USB k počítači.

3

Naprogramuje a ověřte funkčnost čtečky identifikátorů matic podle pokynů v uživatelské dokumentaci čtečky identifikátorů matic.


4 Instalace 4.3 Instalace softwaru

4.3

Instalace softwaru

Nainstalujte Amersham WB software Chcete-li nainstalovat software na počítači s Windows 7 Professional: Poznámka:

Je doporučeno nainstalovat všechny čekající aktualizace Windows před instalací softwaru a postupovat podle pokynů ve zprávách. Je doporučeno dokončit celý postup instalace (bez přerušení) po kliknutí na Install.

Krok

Činnost

1

Vložte DVD se softwarem do počítače. Když se zobrazí první dialogové okno průvodce, klikněte na tlačítko Install a nainstalujte požadavky na software.


103


104

Krok

Činnost

2

Jakmile se zobrazí dialogové okno Windows Security , klikněte na tlačítko Install .

3

Pokud byly úspěšně nainstalovány všechny požadavky, spusťte instalaci softwaru kliknutím na tlačítko Next v Welcome to the InstallShield Wizard for Amersham WB software dialogovém okně.



Krok

Činnost

4

Přečtěte si licenční smlouvu k softwaru. Pokud jste si přečetli a přijímáte licenční ujednání, zvolte možnost I accept.... a klikněte na Next.

5

•

Chcete-li změnit výchozí adresář (není doporučeno), klikněte na tlačítko Change a přejděte do požadovaného adresáře.

•

Klikněte na Next


105


Krok

Činnost

6

•

Chcete-li zkontrolovat nebo změnit nastavení instalace, klikněte na tlačítko Back.

•

Chcete-li zahájit instalaci, klikněte na tlačítko Install.

7

106

Klikněte na Finish chcete-li odejít z průvodce instalací.



Zkontrolujte komunikaci s přístrojem Krok

Činnost

1

Zapněte počítač, jednotku Elpho & scan a jednotku Western.

2

Spusťte Amersham WB software. Výsledek: Software zobrazí navázání komunikace s jednotkami přístroje. Není-li komunikace navázána: •

Kabelové připojení nebo připojení napájecího kabelu může být nesprávné: Zkontrolujte všechny instalace týkající se hardwaru.

•

USB ovladač může fungovat nesprávně: Změňte USB port počítače.


107

5 Provedení pokusu

5

Provedení pokusu

O této kapitole Tato část poskytuje přehled o dvou hlavních typech experimentů, které lze provádět pomocí Amersham WB system. Dále popisuje pracovní postup experimentu typu Western with total protein normalization.

Bezpečnostní opatření VAROVÁNÍ Během obsluhy a údržby přístroje vždy používejte rukavice, ochranný pracovní oděv a ochranné brýle Amersham WB analyzer.


108

Viz strana

5.1 Přehled

109

5.2 Spuštění Amersham WB analyzer

113

5.3 Nastavení experimentu v softwaru

115

5.4 Provedení předznačení vzorků

118

5.5 Příprava Amersham WB molecular weight markers

122

5.6 Provedení elektroforézy proteinu

123

5.7 Provedení přenosu

133

5.8 Provádění značení a sušení

157

5.9 Skenování membrány a prohlížení výsledků

172


5 Provedení pokusu 5.1 Přehled

5.1

Přehled

Úvod Tato část poskytuje přehled o dvou hlavních typech experimentů, které lze provádět: •

elektroforetické experimenty

•

Western experimenty (zahrnuje elektroforézu proteinů)

Tato část také popisuje pracovní postup v typickém experimentu (jak je popsáno v následujících oddílech), s příklady u jednotlivých typů experimentu Western with total protein normalization.

Elektroforetické experimenty V elektroforetických pokusech jsou vzorky předznačeny pomocí barviva Cy5 před elektroforézou. To umožňuje přímou detekci značených proteinů ve vzorku, což eliminuje potřebu pozdějšího barvení gelu. V kroku hodnocení po skenování gelu se provede automatická analýza proteinových pásů a výsledky jsou uvedeny v softwaru.

Western experimenty Ve Western experimentech jsou proteiny neznačené nebo značené pomocí Cy5 odděleny v gelu při elektroforéze a poté přeneseny z gelu na membránu. Membrána je značena pomocí primárních protilátek a sekundárních protilátek konjugovaných pomocí barviva Cy3 nebo Cy5 pro detekci cílového proteinu. Pro detekci celkového proteinu je vzorek předznačen pomocí Cy5. Po značení se membrána vysuší a potom oskenuje. V kroku hodnocení se provede automatická analýza proteinových pásů a výsledky jsou uvedeny v softwaru.


109


Všeobecný přehled pracovního postupu Níže uvedený obrázek ukazuje hlavní kroky v experimentu s elektroforézou a Western experimentu.

Elektroforetický experiment

Western experiment

Spuštění přístroje

Nastavení experimentu v softwaru

Příprava neznačených vzorků

Provedení předznačení

NEBO

na vložení

Provádění elektroforézy

Příprava a připojení

a skenování & gelu

přenosových roztoků

Příprava přenosového sendviče Příprava a připojení

Vyhodnocení výsledků Spuštění přenosu

značících roztoků a roztoků protilátek

Provádění značení & sušení

Skenování membrán(y)

Vyhodnocení výsledků

110



Pracovní postup – Western u experimentu s normalizací celkového proteinu Níže uvedený obrázek ukazuje hlavní kroky tohoto typu experimentu Western with total protein normalization. Tento pracovní postup se používá pro ilustraci, jak provést typický experiment, a je dále popsán v následujících částech. U ostatních typů pokusů viz Amersham WB system User Manual. Western experiment – Western s normalizací celkového proteinu




Provádění elektroforézy a skenování & gelu

Příprava a připojení přenosových roztoků

Příprava přenosového sendviče

Spuštění přenosu

Příprava a připojení značících roztoků a roztoků protilátek

Provádění značení & sušení

Skenování membrán(y) & prohlížení výsledků


111


Níže uvedená tabulka obsahuje seznam oddílů, v nichž jsou popsány kroky. Krok

Viz...


Oddíl 5.2 Spuštění Amersham WB analyzer, na straně 113


Oddíl 5.3 Nastavení experimentu v softwaru, na straně 115


Oddíl 5.4 Provedení předznačení vzorků, na straně 118

Provádění elektroforézy a skenování

Oddíl 5.6 Provedení elektroforézy proteinu, na straně 123


Oddíl 5.7.1 Příprava a připojení přenosových roztoků, na straně 134

•


•


Oddíl 5.7 Provedení přenosu, na straně 133


Oddíl 5.8.1 Příprava a připojení značících roztoků a roztoků protilátek, na straně 158

Provádění značení a sušení

Oddíl 5.8 Provádění značení a sušení, na straně 157

Skenování membrány a prohlížení výsledků

Oddíl 5.9 Skenování membrány a prohlížení výsledků, na straně 172

Kde hledat další informace Základní informace o pozadí a podrobné informace o tom, jak plánovat pokusy, viz Amersham WB system User Manual. Tuto lze otevřít ze softwaru, zvolíte-li Help:View user manual z lišty nabídky. Podrobné informace o programu najdete na Amersham WB software help, který je součástí softwaru (k dispozici v pravém panelu softwaru).

112


5 Provedení pokusu 5.2 Spuštění Amersham WB analyzer

5.2

Spuštění Amersham WB analyzer

Úvod V této části je popsáno jak spustit jednotky Amersham WB analyzer. Je možné nastavit si experiment s předstihem na kancelářském počítači bez připojení k přístroji. Poznámka:

Přístrojové jednotky musí být obě při cyklu zapnuty.

Spusťte jednotku Amersham WB elpho & scan Krok

Činnost

1

Na zadním panelu jednotky Elpho & scan zapněte spínač síťového napětí na I (Zapnuto).

Výsledek: Jednotka Elpho & scan se spustí. 2

Během spuštění panel s kontrolkami ukáže následující:

Jakmile je jednotka přístroje připravena k použití, zobrazí se bílý čtverec.


113

5 Provedení pokusu 5.2 Spuštění Amersham WB analyzer

Spusťte jednotku Amersham WB western Krok

Činnost

1

Na zadním panelu jednotky Western, zapněte spínač síťového napětí na I (Zapnuto). Poznámka: Jednotka Elpho & scan musí být zapnutý před tím, než je možné spustit jednotku Western.

Výsledek: Jednotka Western se spustí. 2

Během spuštění panel s kontrolkami ukáže následující:

Jakmile jsou oddíly jednotky Western připraveny k použití, rozsvítí se bílý čtverec pro každý ze tří oddílů (přenos, značení a sušení).

114


5 Provedení pokusu 5.3 Nastavení experimentu v softwaru

5.3


Úvod Tato část stručně popisuje, jak spustit a nastavit Amersham WB software a nastavit Amersham WB experiment v softwaru. Podrobné informace naleznete v Amersham WB software Help v pravém panelu softwaru.

Spuštění softwaru Krok

Činnost

1

Spusťte počítač a přihlaste se do systému Microsoft Windows.

2

Poklepejte na ikonu Amersham WB software na ploše.

Výsledek: Zobrazí se úvodní obrazovka softwaru

Tip:

Chcete-li zobrazit panel nápovědy s pokyny pro aktivní obrazovku, klikněte na tlačítko panelu s nápovědou nebo stiskněte F1. Chcete-li otevřít uživatelskou příručku, zvolte Help:View user manual nebo stiskněte Ctrl + F1.


115


Vytvoření a nastavení experimentu Krok

1

Popis kroku

Akce operátora Vyberte typ experimentu a klikněte na tlačítko Create. V tomto příkladu Western with total protein normalization. Výsledek: Na hlavní obrazovce se spustí software zobrazující EXPERIMENT & SAMPLES krok pracovního postupu. Přehled informací o hlavní obrazovce, viz Oddíl 3.9 Přehled softwaru, na straně 83.

2

•

Vyberte počet gelových karet pro experiment.

•

Zvolte typ gelové karty Informace o intervalech separace proteinů viz Rozlišení při separaci proteinů, na straně 65.

Výsledek: Tabulka Gel card A a možnosti v Antibodies for Membrane A oblasti jsou aktivovány.

116



Krok

Popis kroku

3

Akce operátora Zadejte informace o vzorku a připomínky do Gel card A tabulky (volitelné). Informace o markerech MH a automatický výpočet kalibrační křivky molekulární hmotnosti viz Oddíl 3.6.1 Amersham WB molecular weight markers, na straně 63. Tip: Stolek na vzorky není během elektroforézy uzamčen. Proto je možné vyplnit tabulku během elektroforézy, po spuštění cyklu, pokud potřebujete rychle cyklus spustit.

4

Zadejte název/popis Primary ab (against target) (volitelné) a vyberte odpovídající Labeled secondary ab na Gel card A patřičné kartě. V tomto protokolu byl použit k předběžnému značení Cy5. Vyberte sekundární protilátky konjugované k Cy3. Opakujte kroky 3–4 pro gelovou kartu B, je-li součástí experimentu. Tip: Můžete vytisknout protokol a používat jej v souvislosti s přípravou vzorků a předznačením. Chcete-li vytisknout protokol, klikněte na ikonu napravo od karty gelové karty nebo stiskněte Ctrl + P.


117

5 Provedení pokusu 5.4 Provedení předznačení vzorků

5.4

Provedení předznačení vzorků

Úvod Předznačení vzorků se vyžaduje pro detekci při provádění elektroforetických experimentů. Vyžaduje se také u experimentů typu Western při detekci celkového proteinu na membráně. V této části jsou popsána následující témata: •

Předpoklady pro předznačení

•

materiály potřebné pro předznačení

•

přípravy před spuštěním předznačení

•

označení vzorků (protokol předznačení)

V tomto příkladu se provádí předznačení lyzačních vzorků buněk/tkání, které budou použity při provádění experimentu typu Western with total protein normalization. Více informací o předznačení viz Amersham WB system User Manual.

Bezpečnostní opatření VÝSTRAHA Při práci na předznačení proteinových vzorků: •

Vždy používejte ochranný oděv, ochranné rukavice a ochranné brýle.

•

Před provedením předznačení vzorků si přečtěte Bezpečnostní list (BL/MBL).

VAROVÁNÍ Po předznačení proteinů ve vzorcích může vzniknout silný zápach kvůli stopovému množství dimethylsulfidu (DMS) a dimethylsulfoxidu (DMSO). Může být třeba místní odvětrávání. Dodržujte místní předpisy a pokyny pro bezpečný provoz.

Poznámka:

118

Chcete-li dosáhnout srovnatelné efektivnosti značení, důležité parametry, jako je pH, objem reakce, teplota a pufrové soli by měly zůstat neměnné. Efektivnost značení se bude zároveň lišit od proteinu k proteinu



Předpoklady pro předznačení vzorků dle protokolu předznačení ve Western experimentech Kompatibilní lyzační pufry Společné lyzační pufry na Tris bázi s pH 7–9 a s různými detergenty a solemi jsou kompatibilní s předznačením vzorků buněk/tkání, například: •

GE savčí pufr na extrakci proteinů

•

pufr RIPA

pH vzorku pH vzorku by se mělo pohybovat mezi 7 a 9. Optimální pH není zásadní pro buněčné lyzáty a tkáňové extrakty, protože signál celkového proteinu nevyžaduje vysokou citlivost. Signál celkového proteinu ve Western experimentu s normalizací celkového proteinu by měl být úměrný množství proteinu (není závislý na vysoké citlivosti).

Požadované roztoky a materiál Následující roztoky a materiály jsou potřeba k předběžnému značení proteinů •

Spotřební materiál na předběžné označování: Barvící činidlo Cy5, označovací pufr, vkládací pufr

•

Zásobní roztok 1 M DTT (dithiothreitol) (DTT a ultra čistá voda), pokud se provádí redukce SDS-PAGE

•

Ultra čistá voda pro ředění barvícího činidla Cy5

•

Původní lyzační pufr pro nastavení objemu reakce (pouze pokusy typu Western)

•

0,5ml mikrocentrifugační zkumavka

•

Ohřívací blok

•

Vír

•

Centrifuga


119


Příprava před spuštěním předznačení Krok

Činnost

1

•

-

1 lahvička Amersham WB Cy5

-

1 lahvička Amersham WB loading buffer

•

Rozmrazte úplně komponenty potřebné pro předznačení.

•

Nechte lahvičku Cy5 ohřát na pokojovou teplotu před otevřením, aby se zabránilo kondenzaci vlhkosti.

2

Krátce odstřeďujte kapalinu s barvícím činidlem Cy5 pomocí centrifugy.

3

Nastavte teplotu ohřívacího bloku na 95 °C.

4

Pro redukci SDS-PAGE přidejte redukční činidlo do vkládacího pufru: •

120

Vezměte si jednu od každé z těchto lahviček (dostatečné množství pro zpracování dvou gelových karet) z mrazáku:

Přidejte 29 μl zásobního roztoku 1 M DTT k 0,7 ml (jedna lahvička) vkládacího pufru a promíchejte vířivým mícháním.



Proveďte předznačení vzorku (Western protokol předznačení) Tip:

Níže uvedený protokol může být velikostí přizpůsoben dle potřeby.

Krok

Činnost

1

Proveďte označovací reakci v mikrocentrifugační zkumavce o obsahu 0,5 ml: •

Přidejte 2–19 μl buněčného lyzátu nebo vzorku tkáňového extraktu (max. 40 μg celkového proteinu) a doplňte na objem 19 μl původním lyzačním pufrem vzorku.

•

Přidejte 1 μl barviva Cy5 zředěného v poměru 1:10 v ultra čisté vodě. Poznámka: Zředěné barvivo musí být čerstvě připraveno a použito během 30 minut. Nelze jej zmrazit a znovu použít.

• 2

Krátce jej promíchejte vířivým mícháním.

Inkubujte při pokojové teplotě po dobu 30 minut. Poznámka: Ujistěte se, že doba značení a objem jsou stejné pro všechny vzorky. U tepelně citlivých vzorků inkubujte na ledu po dobu 30 minut.

3

Přidejte 20 μl vkládacího pufru.

4

Zahřívejte vzorky při teplotě 95 °C po dobu 3 minut.

5

Odstřeďujte vzorky směrem ke dnu. Celkový objem vzorku je 40 μl na reakci (doporučený objem vkládaného vzorku je 20 μl). Pokračujte vkládáním vzorků, jak je popsáno v Příprava před spuštěním elektroforézy, na straně 124. Pokud bude elektroforetická analýza provedena v pozdější fázi, uložte předznačené vzorky při -20 °C.


121

5 Provedení pokusu 5.5 Příprava Amersham WB molecular weight markers

5.5

Příprava Amersham WB molecular weight markers

Úvod Vyjměte jednu lahvičku s Amersham WB molecular weight markers (markery molekulové hmotnosti) (dostatečné množství na dvě gelové karty) z mrazáku a nechte zcela rozmrazit.

Western experimenty V experimentech typu Western musejí být Amersham WB molecular weight markers zředěny v poměru 1:20 vkládacím pufrem, než jsou vloženy do gelové karty. Před použitím musí být dodaný vkládací pufr zředěn ultra čistou vodou a obsahovat přidaný DTT. Krok

Činnost

1

Přidejte 29 μl zásobního roztoku 1 M DTT k 0,7 ml (jedna lahvička) vkládacího pufru. Zamíchejte vířivým mícháním.

2

Zřeďte vkládací pufr obsahující DTT se stejným objemem ultra čisté vody. Zamíchejte vířivým mícháním.

3

Zřeďte markery molekulové hmotnosti v poměru 1:20 s připraveným vkládacím pufrem.

Poznámka:

Markery molekulové hmotnosti mohou být dále zředěny připraveným pufrem, aby je bylo možné použít i na vzorky se slabým signálem. Nicméně pak je nutné zvolit možnost Stop electrophoresis on time.

Elektroforetické experimenty V Elektroforetických experimentech většinou není třeba ředit Amersham WB molecular weight markers. V případě potřeby je možné zředit markery molekulové hmotnosti vkládacím pufrem obsahujícím DTT (zředěným stejným objemem ultra čisté vody).

Opakování Doporučuje se použít dva pruhy markerů v cyklu, chcete-li získat nejlepší možné výsledky při automatické kalibraci molekulové hmotnosti proteinových vzorků v kroku hodnocení.

122


5 Provedení pokusu 5.6 Provedení elektroforézy proteinu

5.6

Provedení elektroforézy proteinu

Úvod Tato část popisuje, jak provádět elektroforézu proteinu, včetně: •

přípravy před spuštěním elektroforézy

•

provedení čištění jamek se vzorkem

•

spouštění a monitorování elektroforézy a skenování gelové karty

•

procesy po elektroforéze a skenování gelové karty


Viz strana

5.6.1 Před elektroforézou

124

5.6.2 Cyklus elektroforézy

129

5.6.3 Postupy po elektroforéze a skenování gel karty

131


123

5 Provedení pokusu 5.6 Provedení elektroforézy proteinu 5.6.1 Před elektroforézou

5.6.1

Před elektroforézou

Úvod Tato část popisuje vkládání pufrových stripů, gelových karet, připravených Amersham WB molecular weight markers a vzorků pro cyklus elektroforézy.

Příprava před spuštěním elektroforézy VÝSTRAHA Roztříštění skla. Nespouštějte systém v případě, že je sklo v těsnicím víku jednotky Elpho & scan poškrábané nebo rozbité. Vypněte přístroj, odpojte napájecí kabel a obraťte se na autorizovaného servisního technika.

VAROVÁNÍ Pohyblivé části. Buďte opatrní při otevírání/zavírání zásobníku, aby nedošlo k zachycení prstů nebo oděvu, když je v pohybu. Nikdy neumísťujte láhve či lahvičky před jednotku Elpho & scan. Mohou spadnout při otevření podavače.

Krok

1

Popis kroku

Akce operátora Umístěte pufrové stripy do držáků pufrových stripů tak, že vytlačíte dva pufrové stripy z jejich obalu přímo do držáků pufrových stripů. Poznámka: Aby se zabránilo kontaminaci pufrových stripů, nedotýkejte se pufrových stripů nebo se ujistěte, že máte čisté rukavice.

124



Krok

Popis kroku

2

Akce operátora Na jednotce Elpho & scan stiskněte tlačítko pro vysunutí. Výsledek: Zásobník se vysune.

3

Otevřete těsnicí víko pomocí západky.

4

Umístěte držáky pufrových stripů do dutin v platu karet desky v zásobníku.


125


Krok

5

Popis kroku

Akce operátora •

Vyjměte gelovou kartu z obalu (přední stranou nahoru).

•

Volitelné: Umístěte kurzor v poli ID v softwaru u pracovního kroku ELECTROPHORESIS & GEL SCANNING softwaru a naskenujte indikátor matice gelové karty (označeno oranžovým kroužkem) pomocí čtečky indikátorů matic. Případně zadejte pětimístné ID (např. 00123).

6

•

Otočte gelovou kartu tak, aby zadní strana směřovala nahoru (modré úchytky bez indikátorů jsou směrem nahoru).

•

Uchopte konec ochranné fólie ve spodní části gelové karty a opatrně ji odstraňte.

•

Uchopte konec ochranné fólie v horní části gelové karty a opatrně ji odstraňte.

Odstranění ochranné fólie umožní kontakt mezi gelem a pufrem při založení gelové karty na platu karet. Dávejte pozor, abyste se nedotkli gelového povrchu.

126



Krok

Popis kroku

7

Akce operátora •

Otočte gel tak, aby přední strana směřovala nahoru (tj. krytí jamek se vzorky směřuje nahoru). Poznámka: Ujistěte se, že je plato karet úplně suché.

•

Umístěte gelovou kartu na plato karet tak, že vyrovnáte otvory na rámu gel karty s vodicími piny označenými oranžovými kroužky.

Poznámka: Dávejte pozor, aby nedošlo k poškrábání plata karet ostrým předmětem.

8

•

Zavřete těsnicí víko.

•

Uchopte konec krytí jamek se vzorky a opatrně jej vyjměte.

Tip: Přehmátněte si při odstraňování krytí jamek se vzorky tak, aby jste jej vždy drželi tak blízko u jamek, jak je to jen možné. Poznámka: Pokud se krytí jamek se vzorky přetrhne: Nechte gelovou kartu v zásobníku se zavřeným těsnicím víkem. K odstranění zbytku krytí použijte například pinzetu.


127


Krok

9

Popis kroku

Akce operátora Vložte vzorky, pufr anebo markery molekulové hmotnosti do jamek (běžně 20 μl/jamku) jak je uvedeno na EXPERIMENT & SAMPLES obrazovce softwaru. Poznámka: Nikdy neotevírejte víko poté, co byly vzorky založeny. Poznámka: Všechny jamky musí obsahovat vzorek, vkládací pufr (zředí se stejným objemem ultra čisté vody) nebo markery molekulové hmotnosti. Doporučuje se dát vkládací pufr do jamek 1 a 16 a markery molekulové hmotnosti do jamek 2 a 15.

10

Po vložení všech vzorků stiskněte tlačítko pro vysunutí. Výsledek: Zásobník je vložen do jednotky Elpho & scan.

128


5 Provedení pokusu 5.6 Provedení elektroforézy proteinu 5.6.2 Cyklus elektroforézy

5.6.2

Cyklus elektroforézy

Úvod V této části je popsáno jak spustit a monitorovat elektroforézu.

Spouštění a monitorování elektroforézy a skenování gelu Krok

Popis kroku

1


Akce operátora •

V ELECTROPHORESIS & GEL SCANNING konkrétním pracovním kroku použijte výchozí nastavení pro elektroforézu a skenování gelové karty, jak je vidět na snímku obrazovky.

•

Volitelné: Zvolte Pause for sample well cleanup after 5 minutes, je-li třeba použít papírový hřeben. Další informace viz Oddíl 3.6 Příslušenství a spotřební materiál pro elektroforézu, na straně 62. Doba pozastavení se vypočítává z napětí a aktuálního nastavení. Výchozí nastavení této doby je 5 minut.

•

Volitelné: Zadejte poznámku o gelových kartách v Note polích.

129

5 Provedení pokusu 5.6 Provedení elektroforézy proteinu 5.6.2 Cyklus elektroforézy

Krok

2

Popis kroku

Akce operátora Klikněte na Start v Electrophoresis oblasti. Výsledek: Spustí se cyklus elektroforézy. Průběh cyklu se zobrazuje v křivkách zobrazujících proud, napětí, působení nebo teplotu. Zobrazí se také uplynulý čas cyklu. Tip: Během elektroforéza máte čas připravit pufry a roztoky na jednotlivé kroky Western. Více informací viz Oddíl 5.7.1 Příprava a připojení přenosových roztoků, na straně 134 a Oddíl 5.8.1 Příprava a připojení značících roztoků a roztoků protilátek, na straně 158.

3

130

Pokud byl zvolen Pause for sample well cleanup after 5 minutes , postupujte podle následujících pokynů. 1

Otevřete zásobník.

2

Umístěte hřeben do jamek se vzorky a nechte jej v nich cca 5 sekund.

3

Zavřete zásobník a pokračujte v cyklu.


5 Provedení pokusu 5.6 Provedení elektroforézy proteinu 5.6.3 Postupy po elektroforéze a skenování gel karty

5.6.3

Postupy po elektroforéze a skenování gel karty

Úvod Tato sekce popisuje, jak odstranit gelovou kartu a vyčistit jednotku Elpho & scan po elektroforéze.

Vyjmutí gelových karet VÝSTRAHA Po elektroforéze nebo po přenosu (v případě, že přenosový sendvič byl otevřen a PVDF karta byla umístěna ve značicím prostoru), zlikvidujte gel bezpečným způsobem. Přečtěte si bezpečnostní list (BL/MBL) gelové karty, kde najdete bezpečnostní pokyny týkající se gelu a jeho likvidace.

Poznámka:

Cyklus přenosu by měl začít do jedné hodiny po dokončení elektroforézy.

Krok

Činnost

1

Pokud je elektroforéza připravena a bílá kontrolka „připraven“ se rozsvítí na přístrojové desce, stiskněte tlačítko pro vysunutí na jednotce Elpho & scan. Výsledek: Zásobník se vysune.

2

Otevřete těsnicí víko pomocí západky.

3

Vyjměte gelovou kartu a položte ji vzhůru nohama na stůl.

4

Přejděte ke Očistěte jednotku Elpho & scan, na straně 132. Poznámka: Doporučuje se vyčistit jednotku Elpho & scan po jednotlivých cyklech. Nicméně pokud vám to čas nedovoluje, přejděte k přenosu a vyčistěte jednotku v pozdější fázi experimentu.


131

5 Provedení pokusu 5.6 Provedení elektroforézy proteinu 5.6.3 Postupy po elektroforéze a skenování gel karty

Očistěte jednotku Elpho & scan Krok

Činnost

1

Vyjměte držáky pufrových stripů ze zásobníku a zlikvidujte pufrové stripy.

2

Otřete jakoukoli kapalinu z plata karet hadříkem, který nepouští vlákna, v případě potřeby namočeným do 50% ethanolu.

3

Otřete jakoukoli kapalinu a nečistoty z ochranného skla hadříkem, který nepouští vlákna, v případě potřeby namočeným do 50% ethanolu. Poznámka: Pro dosažení dobrého výsledku při skenování gelové karty a karty PVDF je důležité, aby bylo ochranné sklo čisté.

4

Zavřete těsnicí víko a stiskněte tlačítko pro vysunutí na jednotce Elpho & scan . Výsledek: Zásobník se zasune.

5

Držák pufrových stripů vyčistěte pod tekoucí vodou a odstraňte soli a pufr. Nechte držáky pufrovacího stripu uschnout na vzduchu vzhůru nohama.

Pokračujte přenosem Proveďte jednu z následujících možností: •

Pokud byly přenosové roztoky připraveny a připojeny k jednotce Western, Pokračujte s pokyny v Oddíl 5.7.2 Příprava přenosového sendviče, na straně 136. jinak

•

132

Postupujte podle pokynů v Oddíl 5.7.1 Příprava a připojení přenosových roztoků, na straně 134


5 Provedení pokusu 5.7 Provedení přenosu

5.7

Provedení přenosu

Úvod Tato část popisuje, jak připravit přenosový sendvič, jak spustit a sledovat přenosový cyklus a postupy, které mají být provedeny v rámci přenosového cyklu.


Viz strana

5.7.1 Příprava a připojení přenosových roztoků

134

5.7.2 Příprava přenosového sendviče

136

5.7.3 Spuštění přenosu

150

5.7.4 Postupy po přenosu

154


133

5 Provedení pokusu 5.7 Provedení přenosu 5.7.1 Příprava a připojení přenosových roztoků

5.7.1


Úvod Tato část popisuje, jak připravit a připojit pufry a roztoky pro přenos. Přenosové roztoky mohou být připraveny v průběhu cyklu elektroforézy a musí být připojeny před zahájením přenosového cyklu.

Návody na přenosové roztoky VÝSTRAHA Umístěte systém Amersham WB analyzer v místnosti s ventilací, pokud budete používat methanol nebo jiné chemikálie vyžadující odvětrávání.

VAROVÁNÍ Nebezpečí požáru. WA - Nepoužívejte přenosový ústrojný roztok s obsahem více než 40% ethanolu nebo 40% methanolu. Doporučuje se používat v přenosových roztocích pouze 20% etanol.

Roztok

Návod

Množství/cyklus

Přenosový pufr

25 mM Tris, 192 mM glycin, 20% ethanol

1 000 ml

pH 8,3 Je možné použít v přenosovém pufru methanol místo ethanolu. Poznámka: Některé ethanoly mají auto fluorescenční vlastnosti, které povedou k vysokému membránovému pozadí. Ujistěte se, že ethanol používaný při přenosu není auto fluorescenční. Ultra čistá voda (používá se pro čištění)

134

Ultra čistá voda

1 000 ml


5 Provedení pokusu 5.7 Provedení přenosu 5.7.1 Příprava a připojení přenosových roztoků

Připojte hadičku k přenosovému pufru a ultra čisté vodě na stojanu na láhve VAROVÁNÍ Aby nedošlo k potřísnění nebezpečnými kapalinami, používejte těžké vstupní filtry připojené k hadičkám v lahvích.

Popis vstupních filtrů a držáků hadiček jsou uvedeny v podkapitole Oddíl 3.8 Ostatní příslušenství, na straně 81. Informace o tom, jak připojit příslušenství, jsou uvedeny v oddílu Připevněte držáky hadiček, na straně 98. Před zahájením přenosu připojte hadičku k přenosovému pufru a ultra čisté vodě (používané k čištění přenosové nádrže) takto: Krok

Činnost

1

Z levé věže s hadičkami založte hadičky označené: T Buffer do 1 000ml láhve s přenosovým pufrem

2

Umístěte hadičky označené T Water do 1 000ml láhve s ultra čistou vodou.


135

5 Provedení pokusu 5.7 Provedení přenosu 5.7.2 Příprava přenosového sendviče

5.7.2


Potřebné materiály Následující spotřební materiál a příslušenství je třeba k přípravě jednoho přenosového sendviče •

1 přenosový držák

•

1 gelová karta, která byla zpracována během cyklu

•

1 karta PVDF

•

2 houby

•

2 přenosové papíry

•

1 nádoba s přenosovým pufrem pro zvlhčení přenosových papírů

•

1 nádoba s minimálně 96% ethanolem pro předběžné zvlhčení karty PVDF

•

1 nádoba s přenosovým pufrem pro ustálení karty PVDF

Poznámka:

Některé ethanoly mají auto fluorescenční vlastnosti, které povedou k vysokému membránovému pozadí. Ujistěte se, že ethanol používaný při přenosu není auto fluorescenční.

Bezpečnostní opatření VÝSTRAHA Vždy používejte rukavice, ochranný pracovní oděv a ochranné brýle při manipulaci s gelovými kartami, PVDF kartami a ostatním spotřebním materiálem dodávaným s Amersham WB system.

136



Obrazový přehled sestavení přenosového sendviče Následující obrázek ukazuje přehled sestavení přenosového sendviče.

Níže uvedená tabulka stručně popisuje proces přípravy přenosového sendviče: Stupeň

Popis

1

Karta PVDF je navlhčená ethanolem a posléze ustálená v přenosovém pufru.

2

Jedna houba je umístěna ve spodní části přenosového držáku (černé víko).

3

Přenosový papír je předem navlhčen přenosovým pufrem a poté je umístěn do přenosového držáku.

4

Rám gelu, včetně gelu s oddělenými proteiny, se odstraní z podložky gelového rámu a je umístěn do přenosového držáku.

5

Karta PVDF je umístěna do přenosového držáku..

6

Druhý přenosový papír je předem navlhčen přenosovým pufrem a poté je umístěn do přenosového držáku.

7

Vzduchové bubliny se odstraní pomocí válečku vestavěného v přenosovém držáku.

8

Druhá houba je umístěna na přenosovém papíru.

9

Přenosový držák je uzavřen.


137


Příprava karty PVDF Následující pokyny popisují přípravu jednoho přenosového sendviče: Krok

Činnost

1

Vyjměte jedno jednotlivé balení karty PVDF z krabice karet PVDF.

Poznámka: Uschovejte si obal kvůli ID jednotlivé karty PVDF a také pro pozdější uložení. 2

138

Vyjměte kartu PVDF z obalu a nejprve odstraňte modrý ochranný papír.



Krok

Činnost

3

Volitelné: •

Před odstraněním druhého modrého ochranného papíru napište popisek (tužkou) na místo určené na popsání karty PVDF. Tip: Povrch na psaní lze použít k zapsání pozice (A nebo B), kde se karta používá PVDF.

•

Zvolte: TRANSFER krok pracovního postupu v softwaru. Umístěte kurzor v adekvátním poli Note a vepište text.


139


Krok

Činnost

4

Odstraňte druhý modrý ochranný papír.

Poznámka: Nedotýkejte se prsty blotovací oblasti (označená na obrázku červeným čtvercem). Držte kartu PVDF pomocí úchytek.

140



Krok

Činnost

5

Volitelné: Zadejte informace o kartě PVDF do softwaru. •

Zvolte: TRANSFER krok pracovního postupu v softwaru.

•

V oblasti Gel Cards & Membranes umístěte kurzor v adekvátním ID poli.

•

Zadejte identifikační číslo ručně nebo oskenujte identifikátor údajů matice na štítku jednotlivého balení karet PVDF.

•

Chcete-li zadat poznámku k membráně, umístěte kurzor do pole Note a vepište poznámku. Tip: Zadejte číslo šarže. Není součástí matice dat, ale je k dispozici na štítku na krabici karet PVDF.

6

Uchopte kartu PVDF za úchytky a navlhčete kartu v ethanolu ponecháním v nádržce s ethanolem po dobu přibližně 20 sekund.

7

Přesuňte kartu PVDF do nádoby s přenosovým pufrem na karty PVDF a nechte ji ustalovat po dobu alespoň 5 minut. Poznámka: Přesvědče se, že se karta PVDF během této doby pokryla přenosovým pufrem.


141


Začněte vytvářet přenosový sendvič Krok

1

2

142

Popis kroku

Akce operátora •

Umístěte přenosový držák černou stranou dolů.

•

Otevřete přenosový držák stisknutím západky a zvednutím bílého víka.

•

Zatlačte na víko, dokud čepy válečku nezapadnou do dvou dutin (označené na obrázku oranžovými kroužky).

•

Odstraňte bílý kryt zvednutím přes tyto dvě dutiny.

3

Umístěte první houbu na černé víko.

4

Navlhčete jeden přenosový papír v přenosovém pufru a umístěte jej na houbu na černém víku (úchytka přenosového papíru by měla být umístěna mezi vodícími piny).



Obrazový přehled demontáže gelové karty Následující obrázek znázorňuje rozložený pohled na díly gelové karty, na které bude rozložena po elektroforéze. 1

2

3

Níže uvedená tabulka stručně popisuje části gelu karty, které je třeba odejmout. Stupeň

Popis

1

Ochranná fólie. Tato fólie je odstraněna jako první.

2

Rám gelu Hrany rámu gelu se rozvolní od podložky rámu gelu (3 na obrázku) a poté se opatrně odstraní.

3

Podložka gelového rámu zůstane na stole.


143


Uvolněte rám gelu z podložky a umístěte jej do přenosového držáku Poznámka:

Krok

1

144

Popis kroku

Při uvolňování rámu gelu se nedotýkejte povrchu s gelem (označená červeným křížem).

Akce operátora Držte gelovou kartu pevně. Odstraňte ochrannou fólii uchopením konce označeného oranžovou šipkou a vytáhněte ji diagonálně ve směru šipky.



Krok

Popis kroku

Akce operátora

2

Umístěte gelovou kartu na stůl (odkrytou vrstvou gelu nahoru), jak je znázorněno na obrázku.

3

Uchopte rohy spodního rámu gelu a uvolněte jej mezi dolními rohy až po přerušovanou čáru a šipky. Poznámka: Při uvolňování gelu dále tiskněte prsty gelovou kartu směrem ke stolu.

4

Uchopte rohy horního rámu gelu a uvolněte rám gelu až po přerušovanou čarou. Ujistěte se, že se rám gelu zcela uvolnil od bílé pryžové zátky (označené horní oranžovou šipkou).


145


Krok

5

Popis kroku

Akce operátora Nadále pečlivě uvolňujte rám gelu z okrajů gelové karty, směrem ke spodnímu konci, dokud se rám gelu zcela neuvolní. Poznámka: Při uvolňování gelu dále tiskněte prsty gelovou kartu směrem ke stolu. Poznámka: Dávejte pozor, abyste se nedotkli gelu.

6

146

Uchopte úchytky rámu gelu a opatrně zvedněte gel z nosného rámu.



Krok

Popis kroku

7


Akce operátora Umístěte rám gelu na přenosový papír nasunutím vodicích otvorů v rámu gelu na otvory vodících čepů a válečkem gel přitlačte na přenosový papír.

147


Vložte kartu PVDF a dokončete přenosový sendvič Krok

1

Popis kroku

Akce operátora Uchopte obě úchytky karty PVDF prsty nebo použijte pinzetu s plochou špičkou. Vyjměte kartu z nádržky s přenosovým pufrem. Poznámka: Nedotýkejte se blotovací oblasti na kartě PVDF (označena na obrázku červeným čtvercem).

2

Vložte kartu PVDF na gelovou kartu nasunutím vodicích otvorů karty PVDF na vodicí piny a přitlačením karty PVDF na gel válečkem. Poznámka: Neupravujte umístění karty PVDF po umístění na gelovou kartu.

148

3

Navlhčete jeden přenosový papír v přenosovém pufru a umístěte jej na kartu PVDF (úchytka přenosového papíru by měla být umístěna mezi vodicími piny).

4

Odstraňte všechny vzduchové bubliny následovně: •

Vezměte si bílé víko a vložte jej do dvou dutin (vlevo snímek).

•

Uchopte úchytky přenosového papíru levou rukou a přetáhněte válec v drážkách držáku na druhou stranu přenosového držáku pravou rukou.



Krok

Popis kroku

Akce operátora

5

Umístěte druhou houbu na přenosový papír.

6

Zavřete přenosový držák tlakem na víko, dokud pojistné západky nezapadnou na své místo.


149

5 Provedení pokusu 5.7 Provedení přenosu 5.7.3 Spuštění přenosu

5.7.3


Úvod V této části jsou popsána následující témata: •

jak vložit přenosový držák do přenosové nádrže

•

jak spustit a monitorovat přenos

•

postupy, které mají být provedeny po přenosu

Před přenosem Ujistěte se, že byl připojen přenosový pufr a ultra čistá voda pro cyklus přenosu. Více informací viz Připojte hadičku k přenosovému pufru a ultra čisté vodě na stojanu na láhve, na straně 135.

150



Vložení přenosových sendvičů Krok

Popis kroku

Akce operátora

1


2

Vložte přenosové držáky do nádrže. Ujistěte se, že bílá šipka ukazuje směrem k šipce v přístroji (směrem k vám).

3



151


Spuštění a monitorování přenosu VAROVÁNÍ Nebezpečí úrazu elektrickým proudem. Vždy zastavte aktuální přenos, než začnete otírat kapalinu z přístroje nebo stolu.

Krok

152

Popis kroku

Akce operátora

1

Na hlavní obrazovce softwaru klikněte na tlačítko TRANSFER kroku pracovního postupu.

2

Použijte výchozí nastavení pro Transfer Protocol jak je znázorněno na obrázku obrazovky.



Krok

Popis kroku

3

Akce operátora Klikněte na Start v Transfer oblasti. Poznámka: Během přenosového cyklu se doporučuje připravit a připojit roztoky, které mají být použity v pracovním kroku značení. Více informací viz Oddíl 5.8.1 Příprava a připojení značících roztoků a roztoků protilátek, na straně 158.


153

5 Provedení pokusu 5.7 Provedení přenosu 5.7.4 Postupy po přenosu

5.7.4

Postupy po přenosu

Úvod V této části je popsáno čištění, které je třeba provést po přenosu

Odstraňte přenosový držák(y) Krok

Činnost

1


2

Odstraňte přenosové držáky. Pověste je úhlopříčně ve vnitřní přední části přenosové nádrže, nad hladinou kapaliny.

Poznámka: Aby se zabránilo vysoušení membrán, neotevírejte přenosové držáky v tomto kroku.

154



Vyčistěte přenosovou průtokovou cestu systému Poznámka:

Před zahájením čištění vyjměte přenosový držák.

Krok

Činnost

1

Jakmile je dokončen přenos, otevře se dialogové okno Transfer Completed – Clean Transfer Flow Path . Poznámka: Doporučuje se vyčistit přenosovou průtokovou cestu po jednotlivých cyklech. Pokud se rozhodnete vynechat čištění přenosové průtokové cesty, klikněte na Cancel a přejděte ke Přejděte ke značení., na straně 156. Nezapomeňte nicméně vyčistit přenosovou průtokovou cestu v pozdější fázi experimentu. Čištění lze provést výběrem Control:Clean Transfer flow path z lišty nabídky. V případě, že bylo čištění přeskočeno, je třeba přenosovou průtokovou cestu vyprázdnit manuálně výběrem Empty Transfer tank v Control nabídce.

2

Posuňte T Buffer hadičku do láhve s obsahem 1 000 ml ultra čisté vody (spolu s T Water hadičkou).

3

Klikněte na Start clean v Transfer Completed – Clean Transfer Flow Path dialogovém okně. Čištění se spustí a bude trvat přibližně 9 minut. Poznámka: Značení je možné začít při čištění přenosové průtokové cesty, viz Přejděte ke značení., na straně 156.

4

Zlikvidujte roztok v láhvi s vodou a umístěte hadičku do prázdné láhve.

5

Otřete horní část interiéru přenosové nádrže pomocí mokrého hadříku, který nepouští vlákna.

6

Odstraňte všechny zbývající vizuální částice, vlákna a kousky gelu pomocí pinzety.


155


Vyčistěte přenosový držák VÝSTRAHA Po elektroforéze nebo po přenosu (v případě, že přenosový sendvič byl otevřen a PVDF karta byla umístěna ve značicím prostoru), zlikvidujte gel bezpečným způsobem. Přečtěte si bezpečnostní list (BL/MBL) gelové karty, kde najdete bezpečnostní pokyny týkající se gelu a jeho likvidace.

Poznámka:

Tento krok proveďte, pokud byl přenosový sendvič otevřen a karta PVDF byla umístěna ve značicí komoře.

Krok

Činnost

1

Odstraňte gel z přenosového sendviče. Zlikvidujte gelu podle pokynů v BL/MBL a místních předpisů pro nakládání s odpady.

2

Odstraňte a zlikvidujte houby a přenosové papíry.

3

Vyčistěte různé části Přepravní držák pod tekoucí vodou.

4

Nechte Přepravní držák uschnout na vzduchu.

Přejděte ke značení. Proveďte jednu z následujících možností: •

Pokud byly roztoky na značení a s protilátkami připraveny a připojeny k jednotce Western, postupujte podle instrukcí v Oddíl 5.8.2 Provedení značení, na straně 162 jinak

•

156

Postupujte podle pokynů v Oddíl 5.8.1 Příprava a připojení značících roztoků a roztoků protilátek, na straně 158


5 Provedení pokusu 5.8 Provádění značení a sušení

5.8

Provádění značení a sušení

Úvod Tato část popisuje, jak provádět značení a sušení.


Viz strana

5.8.1 Příprava a připojení značících roztoků a roztoků protilátek

158

5.8.2 Provedení značení

162

5.8.3 Postupy po značení

167

5.8.4 Cyklus sušení

170


157

5 Provedení pokusu 5.8 Provádění značení a sušení 5.8.1 Příprava a připojení značících roztoků a roztoků protilátek

5.8.1


Úvod Tato část popisuje, jak připravit a připojit pufry a roztoky pro cyklus značení. Značicí roztoky a roztoky protilátek mohou být připraveny v průběhu přenosového cyklu a musí být připojeny před zahájením cyklu značení.

Značicí roztoky a roztoky protilátek Roztok

Návod

Množství/cyklus

Blokovací roztok

Tento systém je kompatibilní s většinou blokovacích roztoků, například 2% roztok činidla ECL PRIME v PBST (0,1% Tween ™ -20 v 1 × PBS), nebo 5% roztok albuminu, hovězího séra, v PBS.

70 ml

Použijte blokovací roztoky s nízkou auto fluorescencí, doporučení viz příručka pro Western Blotting – Principles and Methods. Mycí pufr

PBS-T (0,1% Tween-20 v 1×PBS)

560 ml

Konečný mycí pufr

PBS pH 7,4

290 ml

Roztok protilátky

Protilátky v PBS-T (0,1% Tween-20 v 1×PBS)

5 až12 ml

Informace, jak stanovit optimální koncentraci protilátek najdete v Amersham WB system User Manual. Ultra čistá voda (používá se k proplachování mezi kroky značení a čištění značící průtokové cesty)

158

Ultra čistá voda

760 ml



Připojte hadičku ke značicím roztokům na stojanu na láhve VAROVÁNÍ Aby nedošlo k potřísnění nebezpečnými kapalinami, používejte těžké vstupní filtry připojené k hadičkám v lahvích.

Popis vstupních filtrů a držáků hadiček jsou uvedeny v podkapitole Oddíl 3.8 Ostatní příslušenství, na straně 81. Informace o tom, jak připojit příslušenství, jsou uvedeny v oddílu Připevněte držáky hadiček, na straně 98. Před zahájením značení připojte hadičku od prostřední a pravé věže s hadičkami k roztokům používaným při značení následovně: Krok

Činnost

1

Z prostřední věže s hadičkami založte hadičky označené:

2

3

•

P Water do 1 000ml láhve s ultra čistou vodou

•

P Block do 100ml láhve s blokovacím roztokem

Z pravé věže s hadičkami založte hadičky označené: •

P Wash do 1 000ml láhve s promývacím roztokem (PBS-T)

•

P Final Wash do 500ml láhve s konečným promývacím roztokem (PBS)

Před zahájením snímkování připojte hadičky s roztokem protilátek v prostoru protilátek (viz dále v textu).

Připojte hadičky s roztokem protilátek Poznámka:

Roztoky protilátek by měly být připraveny a připojeny krátce před začátkem značení.


159


160

Krok

Činnost

1

Otevřete prostor protilátek na jednotce Western stisknutím symbolu vysunutí na víku prostoru protilátek.



Krok

Činnost

2

Vložte každou zkumavku s roztokem protilátky do příslušné polohy založením hadičky do zkumavky a přetažením zkumavky do správné polohy.

Níže uvedená tabulka popisuje, které protilátky by měly být umístěny ve které pozici zkumavek s protilátkou v prostoru protilátek.

3

Poloha

Popis

A PRIMARY

Poloha pro primární protilátky směrované proti membráně do polohy A ve značicí komoře.

A SECONDARY

Poloha pro sekundární protilátky směrované proti membráně do polohy A ve značicí komoře.

B PRIMARY

Poloha pro primární protilátky směrované proti membráně do polohy B ve značicí komoře.

B SECONDARY

Poloha pro sekundární protilátky směrované proti membráně do polohy B ve značicí komoře.

Uzavřete víko prostoru protilátek.

Poznámka:

Pro každou membránu existuje jedna zkumavka s protilátkou pro primární protilátky a jedna pro sekundární protilátky. To znamená, že jsou-li například vybrány dvě primární protilátky pro značení membrány v Position A, jsou smíchány ve stejné zkumavce s protilátkou a umístěné do polohy A PRIMARY.


161

5 Provedení pokusu 5.8 Provádění značení a sušení 5.8.2 Provedení značení

5.8.2

Provedení značení

Úvod Tato část popisuje jak: •

vložte karty PVDF do Značicích komor

•

spusťte a sledujte značení

Bezpečnostní opatření VÝSTRAHA Po elektroforéze nebo po přenosu (v případě, že přenosový sendvič byl otevřen a PVDF karta byla umístěna ve značicím prostoru), zlikvidujte gel bezpečným způsobem. Přečtěte si bezpečnostní list (BL/MBL) gelové karty, kde najdete bezpečnostní pokyny týkající se gelu a jeho likvidace.

VAROVÁNÍ Nebezpečí přiskřípnutí. Nedotýkejte se pohyblivé komory na značení během procesu

Před značením Ujistěte se, že pufry, ultra čistá voda, protilátky, blokovací a promývací roztoky jsou připojeny před zahájením značení. Poznámka:

162

Ultra čistá voda musí být vždy připojena, protože se používá k proplachování mezi jednotlivými kroky značení. Promývací roztok se používá k proplachování mezi primárními protilátkami k poloze A a B.



Předplňte značicí komoru a založte karty PVDF Krok

Popis kroku

1

Akce operátora Předplňte značicí komoru: •

Klikněte na tlačítko PROBING & DRYING kroku pracovního postupu v softwaru.

•

Klikněte na Pre-Fill v Probing oblasti. Výsledek: Značicí komora je naplněna několika mililitry prvního roztoku uvedeného v tabulce sekvence značení (ve výchozím nastavení blokovacího roztoku).

Poznámka: Po předplnění značicí komory:

2


•

Již není možné změnit typ prvního kroku v tabulce sekvence značení. Nicméně Dur. [min] a Repeat lze upravit.

•

Tlačítko Pre-Fill se změní na tlačítko Start a stavové hlášení Ready for Probing se zobrazí.

Otevřete víko značicího prostoru a pomocí západky otevřete víko značicí komory.

163


Krok

164

Popis kroku

Akce operátora

3

Otevřete přenosový držák a vyjměte houbu a přenosový papíru ze svrchní části karty PVDF.

4

•

Vyjměte kartu PVDF z přenosového držáku. Přidržte úchytky karty PVDF prsty nebo použijte pinzetu s plochou špičkou.

•

Umístěte kartu PVDF do značicí komory, viz krok č. 5.

•

Čištění přenosového držáku a nakládání s odpadem viz Vyčistěte přenosový držák, na straně 156.



Krok

Popis kroku

5

Akce operátora Umístěte kartu PVDF do předplněné značicí komory nasunutím vodicích otvorů v kartě PVDF na vodicí piny (označené oranžovými kroužky) a posunutím karty PVDF ve značicí komoře. Poznámka: Dávejte pozor, abyste se nedotkli blotovací plochy karty PVDF.

6


Zavřete víko značicí komory a víko značicího prostoru. Ujistěte se, že je víko značicí komory uzamčeno záchytkou.

165


Spuštění a monitorování značení Krok

Popis kroku

Akce operátora

1

V softwaru klikněte na tlačítko PROBING & DRYING kroku pracovního postupu.

2

Použijte výchozí nastavení pro Probing steps v Probing oblasti, jak je vidět na obrázku obrazovky.

3

Klepněte na Start. Výsledek: Spustí se značení. Probíhající krok značení se zobrazí v Probing oblasti.

166


5 Provedení pokusu 5.8 Provádění značení a sušení 5.8.3 Postupy po značení

5.8.3

Postupy po značení


vložit kartu PVDF do držáku na sušení

•

umístit držák na sušení do sušicí komory a spustit sušení

•

vyčistit značicí průtokovou cestu

Přesuňte kartu(y) PVDF do vysoušecího prostoru Krok

Činnost

1

Odstraňte jeden Amersham WB drying holder (držák na sušení) z vysoušecího prostoru a otevřete jej.

2

Uchopte prsty úchytky karty PVDF nebo použijte pinzetu s plochou špičkou a zvedněte kartu PVDF ze značicí komory.


167


168

Krok

Činnost

3

Umístěte kartu PVDF do držáku na sušení nasunutím otvorů karty PDVF na tři vodicí piny.

4

Zavřete držák na sušení. Ujistěte se, že je držák na sušení uzamčen záchytkou.

5

Umístěte držák(y) na sušení v příslušné poloze do vysoušecího prostoru (tj. kartu PVDF ve značicí pozici A do sušicí pozice A).



Vyčistěte značicí průtokovou cestu Poznámka:

Před zahájením čištění přesuňte kartu(y) PVDF do prostoru na vysoušení (viz pokyny výše).

Krok

Činnost

1

Jakmile je značení dokončeno, otevře se dialogové okno Probing Completed – Clean Probing Flow Path . Poznámka: Doporučuje se vyčistit značicí průtokovou cestu po jednotlivých cyklech. Pokud se rozhodnete vynechat čištění značicí průtokové cesty, klikněte na Cancel a přejděte k Oddíl 5.8.4 Cyklus sušení, na straně 170. Nezapomeňte nicméně vyčistit značicí průtokovou cestu v pozdější fázi experimentu. Čištění lze provést výběrem Control:Clean Probing flow path z lišty nabídky. V případě, že bylo čištění přeskočeno, je třeba značicí průtokovou cestu vyprázdnit manuálně výběrem Empty Probing chamber v Control nabídce.

2

Vložte nové prázdné hadičky na roztok s protilátkami do prostoru určeného na protilátky. Poznámka: Vždy založte čtyři nové prázdné hadičky.

3

Otřete značicí hadičky P Block P Wash a P Final Wash mokrou tkaninou a posuňte hadičku do láhve s ultra čistou vodou (obsahující P Water hadičku). V dialogovém okně softwaru zkontrolujte množství ultra čisté vody potřebné pro čištění a ujistěte se, že láhev obsahuje alespoň takové množství vody.

4

Klikněte na Start clean v Probing completed – clean probing system dialogovém okně. Čištění se spustí a bude trvat přibližně 13 minut. Poznámka: Sušení membrán může být spuštěno při čištění značicí průtokové cesty.

5

Když je čištění dokončeno, roztok v láhvi s vodou zlikvidujte a zlikvidujte odpadní vody v hadičkách s roztokem protilátky. Umístěte hadičky do prázdné láhve.


169

5 Provedení pokusu 5.8 Provádění značení a sušení 5.8.4 Cyklus sušení

5.8.4

Cyklus sušení

Úvod Tato část popisuje, jak provádět sušení karet PDVF. Výsledkem vysušení karty PVDF bude rovnoměrné a málo rušivé pozadí a silnější signály.

Cyklus sušení Krok

170

Popis kroku

Akce operátora

1

Ujistěte se, že držáky na sušení s kartou(ami) PVDF byly umístěny do sušící komory do správných pozic (t.j. karta PVDF ve značicí poloze A až po polohu na sušení A).

2

V PROBING & DRYING kroku pracovního postupu v softwaru klikněte na Start v Drying oblasti.


5 Provedení pokusu 5.8 Provádění značení a sušení 5.8.4 Cyklus sušení

Krok

Popis kroku

3

Akce operátora Když je ukončeno sušení: •

Otevřete víko sušicího prostoru.

•

Odstraňte držák/držáky na sušení.

•

Karta PVDF je připravena ke skenování. Pokračujte k Oddíl 5.9 Skenování membrány a prohlížení výsledků, na straně 172.

Poznámka: Pokud nejsou membrány úplně suché, klikněte na Start v Drying oblasti a spusťte nový cyklus sušení.


171

5 Provedení pokusu 5.9 Skenování membrány a prohlížení výsledků

5.9

Skenování membrány a prohlížení výsledků


umístit kartu PVDF v jednotce Elpho & scan

•

spustit a monitorovat skenování

•

prohlížet výsledky skenování

Umístěte kartu PVDF do zásobníku VAROVÁNÍ Pohyblivé části. Buďte opatrní při otevírání/zavírání zásobníku, aby nedošlo k zachycení prstů nebo oděvu, když je v pohybu. Nikdy neumísťujte láhve či lahvičky před jednotku Elpho & scan. Mohou spadnout při otevření podavače.

Krok

1

Popis kroku

Akce operátora Stiskněte tlačítko na vysunutí na jednotce Elpho & scan.

Výsledek: Zásobník se vysune.

2

172

•

Otočte západku směrem nahoru a otevřete těsnicí víko.

•

Otřete hadříkem, který nepouští vlákna, veškerou kapalinu a nečistoty z ochranného skla plata karet.



Krok

Popis kroku

3

Akce operátora •

Odeberte membránový adaptér z prostoru na protilátky v jednotce Western. Poznámka: Ujistěte se, že je membránový adaptér suchý a čistý.

•

Otevřete membránový adaptér a položte jej na plato karet nasunutím vodicích otvorů v membránovém adaptéru na vodicí piny. Poznámka: Dávejte pozor, aby nedošlo k poškrábání plata karet ostrým předmětem.

4

Otevřete držák na sušení.

5

Vyjměte kartu PVDF z držáku na sušení a vložte kartu do membránového adaptéru nasunutím vodicích otvorů v membránovém adaptéru na vodicí piny. Poznámka: Dávejte pozor, abyste se nedotkli blotovací plochy karty PVDF .


173


Krok

Popis kroku

Akce operátora

6

Zavřete membránový adaptér.

7

Zavřete těsnicí víko.

8

Na jednotce Elpho & scan stiskněte tlačítko pro vysunutí. Výsledek: Zásobník je uzavřen.

Spuštění a monitorování skenování membrány Krok

1

174

Popis kroku

Akce operátora V softwaru klikněte na tlačítko MEMBRANE SCANNING kroku pracovního postupu.



Krok

Popis kroku

Akce operátora

2

Použijte pro skenování membrány výchozí nastavení, jak je znázorněno na obrázku.

3

Klikněte na Scan v Membrane Scanning oblasti. Výsledek: Spustí se skenování membrány.

Průběh skenování se zobrazí v Membrane Scanning oblasti.

4

Jakmile je skenování dokončeno, zobrazí se snímky membrány v Membrane Scanning oblasti.

Zobrazení výsledků Krok 1

Činnost Klikněte na EVALUATION kroku pracovního postupu v softwaru. Výsledek: Snímky v oblasti Membrane Scanning jsou vyhodnoceny. Průběh hodnocení se zobrazí v liště průběhu.


175


Krok

Činnost

2

Pokud bylo provedeno vyhodnocení snímků, snímky se zobrazí na obrazovce Hodnocení, ukazujíce normalizované hodnoty pro experiment na Bar chart patřičné kartě. Další informace o tom, jak analyzovat výsledky, viz User Manual nebo software help.

Postupy po skenování membrány Krok

Činnost

1

Na jednotce Elpho & scan stiskněte tlačítko pro vysunutí. Výsledek: Zásobník se vysune.

2

Otevřete těsnicí víko.

3

Odstraňte membránový adaptér s kartou PVDF z plata karet.

4

Odstraňte kartu PVDF z membránového adaptéru. Tip: Karta PVDF může být uložena v usušeném stavu mezi dvěma filtračními papíry v původním jednotlivém balení karty PVDF. Signály na vysušené kartě PVDF jsou stabilní po dobu cca 3 měsíců.

5

Vyčistěte membránové adaptéry hadříkem, který nepouští vlákna, a vraťte adaptéry do úložného prostoru v prostoru na protilátky.

6

Vyčistěte držáky na sušení hadříkem, který nepouští vlákna, a vraťte je úložného prostoru ve vysoušecím prostoru.

7

Otřete plato karet hadříkem, který nepouští vlákna, v případě potřeby navlhčeným 50% ethanolem.

8

Otřete ochranné sklo hadříkem, který nepouští vlákna, v případě potřeby navlhčeným 50% ethanolem. Poznámka: Pro dosažení dobrého výsledku při skenování gelové karty a karty PVDF je důležité, aby bylo ochranné sklo čisté z obou stran.

9

Zavřete těsnicí víko a stiskněte tlačítko pro vysunutí na jednotce Elpho & scan . Výsledek: Zásobník se zasune.

176


6 Údržba

6

Údržba

O této kapitole Tato část obsahuje činnosti v rámci pravidelné údržby, které musí provádět uživatelAmersham WB analyzer, jakož i činnosti údržby, které by měly být provedeny v případě potřeby.

Bezpečnostní opatření VÝSTRAHA Nepoužívejte přístroj Amersham WB analyzer, pokud nepracuje správně nebo vykazuje jakékoliv poškození, například: •

poškození napájecího kabelu nebo jeho koncovky

•

poškození způsobené pádem zařízení

•

poškození jiných částí, které mohou mít vliv na funkci

VÝSTRAHA Nebezpečí úrazu elektrickým proudem. Veškeré opravy musí provádět servisní technik oprávněný společností GE. Neotevírejte kryty a nevyměňujte díly, pokud to není výslovně uvedeno v uživatelské dokumentaci.

VÝSTRAHA Odpojte napájení. Před výměnou jakékoliv součásti jednotky přístroje vždy nejprve odpojte její přívod elektrické energie, pokud není v návodu k obsluze uvedeno jinak.



177

6 Údržba

VÝSTRAHA K údržbě či opravě systému se smí používat pouze náhradní díly a příslušenství, které bylo schváleno nebo dodáno společností GE.

VÝSTRAHA Při výměně poškozeného napájecího kabelu použijte náhradní kabel stejného typu a rozměrů, který splňuje požadavky všech platných místních směrnic pro elektrická zařízení a je schválen společností GE.

VÝSTRAHA Před výměnou pojistky elektrické sítě vždy odpojte síťové napájení. Pro trvalou ochranu proti rizikem požáru nahrazujte pouze pojistkou stejného typu a výkonu, jak je uvedeno na štítku jednotky přístroje.

VAROVÁNÍ Pokud pracujete s nebezpečnými chemikáliemi, přijměte veškerá potřebná ochranná opatření, např. použijte ochranné brýle a rukavice odolné vůči použitým chemickým látkám. Pro bezpečnou obsluhu a údržbu systému dodržujte místní předpisy.


178

Viz strana

6.1 Program údržby

179

6.2 Pokyny k údržbě

184


6 Údržba 6.1 Program údržby

6.1

Program údržby

Úvod Tato část obsahuje činnosti údržby, které musí provádět uživatel Amersham WB analyzer. Údržba se dělí na: •

Po každé analýze

•

Týdenní údržbu

•

Měsíční údržbu

•

Každoroční údržba

•

Údržbu v případě potřeby


179


Program pravidelné údržby Uživatel přístroje Amersham WB analyzer by měl provádět následující úkony pravidelné údržby. Interval

Úkon údržby

Pokyn

Po každém cyklu na jednotce Elpho & scan •

Otřete tekutinu na platu s kartami

•

Otřete veškerou kapalinu a nečistoty z ochranného skla v těsnicím víku

•

Zkontrolujte, zda na skle těsnicího víka nejsou škrábance nebo skvrny a zkontrolujte, zda sklo pevně drží v rámu

•

Použijte hadřík, který nepouští vlákna, nebo papír, který nepoškrábe ochranné sklo nebo plato karet K odstranění skvrn použijte hadřík, který nepouští vlákna, navlhčený 50% ethanolem. Potřebujete-li vyměnit část těsnicího víka, požádejte o pomoc Servisní službu.

Zkontrolujte poklop těsnicího víka, když je rám uzavřený, a odstraňte všechny nečistoty

Vyčistěte držáky pufrovacího stripu

Vyčistěte držáky pufrovacího stripu pod tekoucí vodou, aby došlo k odstranění solí a pufru. Nechte držáky pufrovacího stripu uschnout na vzduchu vzhůru nohama.

Vyčistěte membránové adaptéry

180

Vyčistěte membránové adaptéry hadříkem, který nepouští vlákna, a vložte je do úložného prostoru v prostoru protilátek.



Interval

Úkon údržby

Pokyn

Po každém cyklu na jednotce Western Vyčistěte přenosovou průtokovou cestu

Pokud nebyla přenosová průtoková cesta vyčištěna po skončení přenosu, spusťte čisticí proces kliknutím na tlačítko Control:Clean Transfer flow path z lišty nabídky.

Vyčistěte značicí průtokovou cestu

Pokud nebyla značicí průtoková cesta vyčištěna po skončení značení, spusťte čisticí proces kliknutím na tlačítko Control:Clean Probing flow path z lišty nabídky.

Vyčistěte přenosový držák

Viz Vyčistěte přenosový držák, na straně 156.

Vyčistěte držáky na sušení

Vyčistěte držáky na sušení hadříkem, který nepouští vlákna, a vložte je do prostoru na vysoušení.

Odstraňte všechny částice v přenosové nádrži

Zkontrolujte nádrž a odstraňte všechny zbytky gelu nebo papírových vláken pomocí pinzety. Zkontrolujte filtr přenosové nádrže a vyměňte jej, pokud je špinavý, viz Vyměňte filtr přenosové nádrže, na straně 196.

Očistěte horní část přenosové nádrže


Otřete horní části přenosové nádrže vlhkým hadříkem.

181


Interval

Úkon údržby

Pokyn

Týdenní (nebo pokud přístroj nebudete používat několik dní) Čištění přenosové průtokové cesty v rámci údržby

Viz Oddíl 6.2.1 Týdenní čištění přenosových a značicích průtokových cest, na straně 185.

Čištění značicí průtokové cesty v rámci údržby

Viz Oddíl 6.2.1 Týdenní čištění přenosových a značicích průtokových cest, na straně 185.

Zkontrolujte a v případě poškození vyměňte následující díly:

Informace o tom, jak nahradit hlavy čerpadel, vzduchový filtr a vstupní filtr najdete v Oddíl 6.2.2 Postupy výměny, na straně 188.

•

čerpadla

•

hadičky

•

vzduchový filtr

•

vstupní filtr

Potřebujete-li vyměnit hadičky, kontaktujte servis.

Zkontrolujte a utáhněte konektory hadiček Interval

Úkon údržby

Pokyn

Vyměňte vzduchový filtr v modulu sušičky

Viz Vyměňte vzduchový filtr, na straně 189.

Každoročně

Může být nutné častěji vyměnit vzduchový filtr v případě, že je okolní prostředí znečištěnější než běžné laboratorní prostředí z důvodu přítomnosti prachu ve vzduchu.

182

Vyměňte hlavu přenosového čerpadla

Viz Vyměňte hlavu značicího nebo přenosového čerpadla, na straně 191.

Vyměňte hlavu značicího čerpadla

Viz Vyměňte hlavu značicího nebo přenosového čerpadla, na straně 191.



Interval

Úkon údržby

Pokyn

Vyčistěte prostor na vysoušení

Vyčistěte prostor na vysoušení od prachu a částic pomocí hadříku, který nepouští vlákna, navlhčeným ultra čistou vodou. Před použitím nechte tento prostor vyschnout.

Výměna přenosových elektrod

Viz Výměna přenosových elektrod, na straně 194.

Vyměňte držák stripů s pufrem

Informace o objednání viz Amersham WB system User Manual.

Výměna hlavní síťové pojistky

Viz Výměna hlavní síťové pojistky, na straně 197.

Vyměňte poškozený napájecí kabel

Viz Opatření na začátku této kapitoly.

Vyměňte filtr přenosové nádrže.

Zkontrolujte filtr a je-li znečištěn nebo poškozen, vyměňte jej.

Podle potřeby

Viz Vyměňte filtr přenosové nádrže, na straně 196. Výměna vstupních filtrů


Viz Výměna vstupních filtrů, na straně 196.

183

6 Údržba 6.2 Pokyny k údržbě

6.2

Pokyny k údržbě

Úvod V této části je popsána údržba, kterou je třeba provádět na přístroji Amersham WB analyzer.


184

Viz strana

6.2.1 Týdenní čištění přenosových a značicích průtokových cest

185

6.2.2 Postupy výměny

188

6.2.3 Přemisťování jednotky přístroje

199


6 Údržba 6.2 Pokyny k údržbě 6.2.1 Týdenní čištění přenosových a značicích průtokových cest

6.2.1

Týdenní čištění přenosových a značicích průtokových cest

Úvod Provádějte v rámci údržby čištění přenosových a značicích průtokových cest jednou týdně, nebo v případě, že přístroj nebude používán po dobu několika dní.

Čištění přenosové průtokové cesty v rámci údržby Procedura bude trvat asi 25 minut. Snímkování a sušení může být spuštěno souběžně. Poznámka:

Ujistěte se, že v nádrži nezůstal žádný přenosový držák.


Krok

Činnost

1

Zvolte v softwaru Control:Maintenance clean Transfer flow path nebo klikněte na tlačítko Maintenance clean Transfer na úvodní obrazovce softwaru. Výsledek: Otevře se dialogové okno Maintenance Clean Transfer Flow Path .


185


Krok

Činnost

2

•

Otřete horní části přenosové nádrže a přenosové hadičky vlhkým hadříkem.

•

Zkontrolujte, zda je filtr přenosové nádrže neporušený a čistý. V případě nutnosti filtr vyměňte.

3

Ponořte T Water hadičku do láhve s 2 000 ml ultra čisté vody.

4

Ponořte T Buffer hadičku do láhve s 1 000 ml 0,5 M NaOH.

5

Klikněte na tlačítko Start clean v dialogovém okně.

6

Jakmile je čištění dokončeno, přesuňte hadičky do prázdné lahve.

Poznámka:

Po čištění zlikvidujte všechny roztoky.

Čištění značící průtokové cesty v rámci údržby Procedura bude trvat přibližně 45 minut. Přenos a sušení mohou být spuštěny souběžně. Poznámka:

Ujistěte se, že ve značicí komoře nezůstaly žádné karty PVDF.


186



Krok

Činnost

1

Zvolte v softwaru Control:Maintenance clean Probing flow path nebo klikněte na tlačítko Maintenance clean Probing na úvodní obrazovce softwaru. Výsledek: Otevře se dialogové okno Maintenance Clean Probing Flow Path .

2

Otřete hadříkem značicí hadičky a hrany víka značicí komory.

3

Ponořte P Water hadičku do láhve s alespoň 1 000 ml ultra čisté vody.

4

Ponořte P Custom hadičku do láhve s alespoň 450 ml 0,5 M NaOH.

5

Umístěte hadičky P Block P Wash a P Final Wash do prázdné odpadní láhve.

6

Vložte a připojte čtyři čisté prázdné 15ml zkumavky do prostoru protilátek.

7

Klikněte na Start clean v dialogovém okně.

8

Jakmile je čištění dokončeno, přesuňte hadičky do prázdné lahve.

Poznámka:

Po čištění zlikvidujte všechny roztoky a zkumavky s protilátkou.


187

6 Údržba 6.2 Pokyny k údržbě 6.2.2 Postupy výměny

6.2.2

Postupy výměny

Úvod V této části je popsáno jak vyměnit: •

vzduchový filtr

•

hlavy přenosových a značících čerpadel

•

přenosové elektrody

•

filtr přenosové nádrže

•

vstupní filtry,

•

pojistku síťového napětí

Příslušenství pro údržbu Pro Amersham WB analyzer je potřeba k jeho údržbě následující příslušenství: •

hlavy čerpadla (pro přenosové čerpadlo nebo značicí čerpadlo)

•

vzduchový filtr

•

filtr přenosové nádrže

•

přenosové elektrody

•

sada vstupního filtru

•

pojistka (správnou pojistku najdete v Oddíl 7.1 Specifikace systému, na straně 201 )

Bezpečnostní opatření VÝSTRAHA Odpojte napájení. Před výměnou jakékoliv součásti jednotky přístroje vždy nejprve odpojte její přívod elektrické energie, pokud není v návodu k obsluze uvedeno jinak.

VÝSTRAHA Před otevřením víka servisního prostoru vyjměte všechny lahve ze stojanu na láhve.

188



Vyměňte vzduchový filtr Níže uvedené pokyny popisují postup výměny vzduchového filtru. Krok

Činnost

1

Otevřete víko separačního prostoru.

2

Otevřete víko nad prostorem, v němž se nachází filtr, otočením matice proti směru hodinových ručiček a jejím vyjmutím.


189


190

Krok

Činnost

3

Odeberte filtr z rámu směrem nahoru pomocí připojeného držáku.

4

Odstraňte horní část plastové mřížky na držáku, kde je umístěn filtr.

5

Vyměňte filtr za nový filtr a připevněte horní část plastové mřížky.

6

Vložte držák s novým filtrem do vodicích prvků v rámu.

7

Nasaďte víko prostoru na filtr zpět na místo a utáhněte matici ve směru hodinových ručiček.

8

Uzavřete víko servisního prostoru.



Vyměňte hlavu značicího nebo přenosového čerpadla Níže uvedené pokyny popisují, jak vyměnit hlavu čerpadla, při použití značicího čerpadla jako příklad. Výměna přenosové hlavy je podobná. Krok

Činnost

1

Otevřete kryt servisního prostoru, odkud je možný přístup ke značicímu a přenosovému čerpadlu.

Poznámka: Značicí čerpadlo se nachází nalevo a Přenosové čerpadlo napravo. 2

Odpojte hadičky čerpadla nalevo.


191


192

Krok

Činnost

3

Odpojte hadičky čerpadla napravo.

4

Odjistěte záchytku, která drží čerpadlo na místě.



Krok

Činnost

5

Otočte hlavu čerpadla proti směru hodinových ručiček.

6

Zvedněte hlavu čerpadla ze servisního prostoru. Poznámka: Při demontáži hlavy dávejte pozor, aby nedošlo k poškození nebo ohnutí některé hadičky z jednotky Western. Je-li některá hadička poškozená nebo ohnutá, je třeba ji nahradit novou. Požádejte o pomoc servisní službu.

7

Vybalte novou hlavu čerpadla.


193


Krok

Činnost

8

Položte novou hlavu čerpadla do správné polohy a otočte ve směru hodinových ručiček. Poznámka: Ujistěte se, že příslušné kolo hlavy čerpadla je ve správné poloze, aby pasovalo na hnací hřídel motoru čerpadla.

9

Zajistěte záchytku, která drží čerpadlo na místě.

10

Připojte hadičku čerpadla na pravé straně do pravého konektoru hlavy čerpadla.

11

Připojte hadičku čerpadla na levé straně do levého konektoru hlavy čerpadla.

12

Uzavřete víko servisního prostoru.

Výměna přenosových elektrod Pokud procedura přenosu selže, důvodem mohou být vadné přenosové elektrody. Doporučuje se vyměnit obě elektrody. Níže uvedené pokyny popisují, jak nahradit přenosové elektrody.

194

Krok

Činnost

1

Otevřete víko přenosového prostoru. Elektrody jsou umístěny na každé straně.



Krok

Činnost

2

Vytáhněte elektrodu.

3

Vložte novou elektrodu a stiskněte směrem dolů.

4

Tento postup opakujte stejným způsobem u elektrody na pravé straně.

5



195


Vyměňte filtr přenosové nádrže Poznámka:

Je-li přenosový filtr znečištěný, není možné jej vyjmout, vyčistit a dát jej zpět. Filtr musí být vyměněn.

Níže uvedené pokyny popisují, jak nahradit filtr přenosové nádrže. Krok

Činnost

1

Otevřete víko přenosové nádrže. Filtr je umístěn ve spodní části přenosové nádrže.

2

Propíchněte střed filtru pomocí pinzety. Poznámka: Neodstraňujte filtr uchopením za jeho hrany, neboť toto může poškodit těsnění filtru.

3

Použijte k uchopení příslušný otvor a vyjměte filtr.

4

Vložte nový filtr a zatlačte jej jemně na těsnění filtru.

Výměna vstupních filtrů Vyměňte vstupní filtr, je-li třeba, například pokud se filtry ucpou. Požadovaný materiál: Sada vstupního filtru.

196



Při výměně vstupního filtru a výztužné síťky postupujte podle níže uvedených pokynů. Krok

Činnost

1

Vytáhněte vstupní filtr a výztužnou síťku z držáku vstupního filtru.

2

Nasaďte novou výztužnou síťku a vstupní filtr na držák vstupního filtru a zatlačte filtr do správné polohy.

Výměna hlavní síťové pojistky VÝSTRAHA Před výměnou pojistky elektrické sítě vždy odpojte síťové napájení. Pro trvalou ochranu proti rizikem požáru nahrazujte pouze pojistkou stejného typu a výkonu, jak je uvedeno na štítku jednotky přístroje.

Krok

Činnost

1

Vypněte napájení Amersham WB analyzer nastavením vypínačů napájení na zadní straně jednotek Elpho & scan a Western do pozice vypnuto (0).

2

Odpojte síťové napájecí kabely od napájecích přívodů síťového napájení na jednotkách Elpho & scan a Western.

3

Vyhledejte přihrádku pojistky v panelu s konektory na příslušné jednotce.


197


Krok

Činnost

4

Do výřezu vedle přihrádky pro pojistky vložte malý šroubovák.

5

Otočte šroubovákem a otevřete přihrádku pojistky.

6

Vyměňte pojistky. Údaje o pojistce naleznete na štítku přístrojové jednotky na zadních panelech.

7

198

Vložte přihrádku pro pojistky do zásuvky na spojovacím panelu.


6 Údržba 6.2 Pokyny k údržbě 6.2.3 Přemisťování jednotky přístroje

6.2.3

Přemisťování jednotky přístroje

Bezpečnostní opatření VAROVÁNÍ Osobní ochranné prostředky (PPE). Při balení, rozbalování, přepravě nebo přemisťování používejte prostředky osobní ochrany: •


•


•

Ochranné brýle


VAROVÁNÍ Nikdy nepřesunujte jednotku Western s lahvemi stojícími na jednotce.

UPOZORNĚNÍ Odpojte kabely. Před přemísťováním jednotky přístroje vždy odpojte kabely, abyste zabránili poškození zařízení.

Pokyny pro zvedání Krok

Činnost

1

Odpojte všechny šňůry a kabely od jednotek přístroje a odstraňte veškeré láhve na jednotkách.

2

Je třeba dvou osob. Při zvedání jednotky uchopte oběma rukama na každé straně jednotky a zvedněte.


199

7 Referenční informace

7

Referenční informace

O této kapitole V této kapitole jsou uvedeny technické specifikace systému Amersham WB analyzer. Tato kapitola obsahuje také přehled chemické odolnosti a zprávu o dekontaminaci, která musí být použita pro záznam údajů o dekontaminaci před servisním zákrokem.


200

Viz strana

7.1 Specifikace systému

201

7.2 Průvodce odolností vůči chemikáliím

205

7.3 Formulář Prohlášení o zdraví a bezpečnosti

206

7.4 Překlady názvů příslušenství a spotřebního materiálu

208


7 Referenční informace 7.1 Specifikace systému

7.1

Specifikace systému

Úvod V tomto oddílu jsou uvedeny údaje o specifikaci Amersham WB analyzer.

Rozsahy parametrů prostředí Parametr

Parametry

Rozsah teploty pro přepravu a skladování

-25 °C - +60 °C

Chemické prostředí

Viz Oddíl 7.2 Průvodce odolností vůči chemikáliím, na straně 205.

Provozní rozsah Parametr

Limity

Rozsah provozní teploty

15℃ - 32℃ Pro plný výkon: 16 °C až 28 °C

Relativní vlhkost

20% až 80%, nekondenzující Pro plný výkon: 20 % až 70 %, bez kondenzace

Nadmořská výška

Maximálně 2 000 m

Stupeň znečištění

2

Úroveň přechodného přepětí

Kategorie přepětí II

Prostředí

Používání pouze uvnitř


201


Specifikace systému Amersham WB analyzer Parametr

Parametry

Konfigurace systému

Stolní systém skládající se z externího počítače a dvou jednotek: Elpho & scan jednotka a jednotka Western Počítač není součástí dodávky.

Operační systém ovládacího počítače

PC se systémem Windows 7

Řídicí software

Amersham WB software

Spojení mezi jednotkami Elpho & scan a Western

Ethernetový kabel

Spojení mezi PC a jednotkou Elpho & scan

USB kabel (typ A až typ B)

Stupeň znečištění

2

Hladina akustického tlaku

Pod 80 dB(A)

Systémová specifikace jednotky Elpho & scan Parametr

Parametry

Rozměry (Š x H x V)

47 x 51 x 27 cm

Hmotnost (bez počítače)

25 kg

Napájecí zdroj

Napětí: 100-240 V AC ±10 % Kmitočet: 50–60 Hz

Spotřeba energie

Max. příkon: 300 VA

Pojistka

2x T4AH 250 V

Technické parametry skeneru

202

Parametr

Parametry

Obrazový snímač

Silikonová fotodioda



Parametr

Parametry

Zahřívací čas

Alespoň 1 minuta Poznámka: Zahřívání je součástí režimu automatického nastavení citlivosti.

Objektiv

F1,0/13 mm

Zdroj světla

Cy5: Modul laserové diody, 635 nm, 10 mW Cy3: Modul laserové diody, 532 nm, 10 mW

Obsluha

Plně automatický (automatická expozice, zaostřování ani jiná nastavení či kalibrace nejsou potřebné)

Maximální velikost vzorku

2 vzorky přibližně 80 x 65 mm2

Stupnice šedi

65 536 úrovní (16 bitů)

Dynamický rozsah

4,6 řádové hodnoty

Výstup zobrazení

Stupnice šedi 16 bitů (tif)

Technické parametry separace

1

Parametr

Popis

Napětí

250–600 V 1

Proud

20–50 mA1

Maximální výkon je 20 W / gelovou kartu. Maximální hodnoty pro parametry nelze dosáhnout současně.

Systémová specifikace jednotky Western Parametr

Parametry

Rozměry (Š x H x V)

43 x 53 x 39 cm


203


Parametr

Parametry

Hmotnost

20 kg

Napájecí zdroj

Napětí: 100–240 V stř. Kmitočet: 50–60 Hz

Spotřeba energie

Max. příkon: 400 VA

Pojistka

2x T4AH 250 V

Přenosové hadičky a konektory

Materiál hadiček: FEP, ID 1/8" Kovová, modrá Konektor hadičky: Matice 5/16"-24UNF 2-A

Značicí hadičky a konektory

Materiál hadiček: FEP, ID 0,063" Kovová, žlutá Konektor hadičky: Matice 1/4"-28UNF 2B

Technické parametry přenosu

1

Parametr

Popis

Napětí

10–100 V 1

Maximální výkon je 40 W. Maximální proud je 400 mA.

Technické parametry značení Parametr

Popis

Objemy, značení protilátek

5–12 ml

Technické parametry sušení

204

Parametr

Popis

Teplota

Maximálně 45 °C

Doba sušení

10 minut


7 Referenční informace 7.2 Průvodce odolností vůči chemikáliím

7.2

Průvodce odolností vůči chemikáliím

Úvod V této části je specifikována odolnost Amersham WB analyzer vůči některým chemikáliím nejčastěji používaným při elektroforéze a Western blottingu.

Učiněné předpoklady Uvedené skutečnosti vycházejí z následujících předpokladů: •

Synergické efekty směsí chemikálií nebyly zohledněny.

•

Předpokládá se pokojová teplota a omezený přetlak.

Poznámka:

Chemické vlivy jsou závislé na čase a tlaku. Není-li uvedeno jinak, jsou všechny koncentrace 100%.

Seznam chemikálií Seznam chemických látek používaných v gelových kartách a pufrových stripech nejdete v bezpečnostním listu (BL/MBL). Použití

Chemikálie

Koncentrace

číslo CAS a číslo EC

Obecné

Vodné pufry pH 4-10 (např. Tris, Glycin, Fosfát)

0–0,2 M

neuplatňuje se

Přenos

Etanol

40 %

64-17-5/200-578-6

Metanol

40 %

67-56-1/200-659-6

Chlorid sodný

0,2 M

7647-14-5/231-598-3

Chlorid draselný

50 mM

7447-40-7/231-211-8

Tween

1%

9005-64-5/500-018-3

Čištění průtokových cest

Hydroxid sodný

0,5 M

1310-73-2/215-185-5

Chlornan sodný

5%

7681-52-9/231-668-3

Čištění plata karet

Etanol

50%

64-17-5/200-578-6

Čištění povrchů

Etanol

96%

64-17-5/200-578-6

Jemně působící saponáty

neuplatňuje se

neuplatňuje se

Přenos& Značení


205

7 Referenční informace 7.3 Formulář Prohlášení o zdraví a bezpečnosti

7.3

Formulář Prohlášení o zdraví a bezpečnosti

Servis u zákazníka Zpráva On Site Service Health & Safety Declaration Form, jak je uvedena v příkladu níže, musí být použita pro záznam informací o dekontaminaci před servisním zásahem na místě.

On Site e Servicce Health & Safety y Declarration Form F Serv vice Ticket # #: To make the mutual protection an nd safety of GE E service persoonnel and our customers, c all equipment an nd work areas must be clean and a free of anyy hazardous contaminants c before b a Servicce Engineer starts a repair. To T avoid delayss in the servicing of your equipm ment, please ccomplete this checklist c and present p it to thee Service Engineer upon arrival. Equipmen nt and/or work k areas not sufficiently clean ned, accessible e and safe for an engineer m may lead to delays in servicin ng the equipment and could be subject to onal charges. additio

Yes

No

P Please review w the actions below b and ansswer “Yes” or “No”. P Provide explanation for any y “No” answeers in box belo ow. IInstrument ha as been cleaned of hazardo ous substance es. P Please rinse tu ubing or piping g, wipe down sscanner surfacces, or otherw wise ensure rem moval of any dangerous rresidue. Ensure the area aro ound the instru ument is clean. If radioactivitty has been ussed, please perform a w wipe test or otther suitable survey. A Adequate space and clearance is provideed to allow safe access for in nstrument servvice, repair or iinstallation. In some cases this may requirre customer to o move equipm ment from norrmal operating g location p prior to GE arrrival. C Consumabless, such as colu umns or gels, h have been rem moved or isola ated from thee instrument and a from a any area thatt may impede access to thee instrument . A All buffer / wa aste vessels are labeled. E Excess containers have bee en removed fr from the area to provide acccess.

Provide expla anation for an ny “No” answ wers here: Equip pment type / Product No:

Serial No:

I here eby confirm th hat the equipm ment specified above has beeen cleaned to remove any hazardous h sub bstances and that the area has been mad de safe and acccessible. Name:

Comp pany or institu ution:

Posittion or job tiitle:

Date (YYYY/MM/DD D):

Signe ed:

GE and GE monogram are trade emarks of General EElectric Company. GE Healthcare Bio-Sciences Corp, 800 Centennial A Avenue, P.O. Box 1327, Piscataway, NJ 08855-1 1327 © 2010-14 General Electric Com mpany—All rights resserved. First publishe ed April 2010. D DOC1149542/28-980 00-26 AC 05/2014

206


7 Referenční informace 7.3 Formulář Prohlášení o zdraví a bezpečnosti

Vrácení výrobku nebo servis Zpráva Health & Safety Declaration Form for Product Return or Servicing jak je uvedena v příkladu níže, musí být použita pro záznam informací o dekontaminaci před vrácením výrobku nebo servisním zásahem.

Healtth & Safeety Declaration n Form for Prroduct Return R oor Servic cing Return authorization numb ber:

and/or SService Tickett/Request:

To make sure the mu utual protectio on and safety of GE personn nel, our custom mers, transportation personn nel and our en nvironment, all equ uipment must be clean and free f of any hazzardous conta aminants before shipping to GE. To avoid d delays in the processing of your equipment, please complete this checklist and include it with your retu urn. 1. 2. 3.

Please notee that items will NOT be acce epted for servi cing or return without this fo orm Equipment which is not sufficiently clea aned prior to rreturn to GE may m lead to delays in servicin ng the equipment and could be subject to additional charges Visible contamination will be assumed hazardous and d additional clleaning and de econtaminatio on charges will be applied

Yes

No

P Please specifyy if the equipm ment has been n in contact wiith any of the following: R Radioactivity (p please specify) nfectious or ha azardous biolo ogical substan ces (please sp pecify) In O Other Hazardo ous Chemicals (please specifyy)

Equip pment must be e decontamin nated prior to service / retu rn. Please pro ovide a telephone number w where GE can contact you fo or additional iinformation concerning the e system / equ uipment. Telep phone No: Wateer

Liquid and/or gas in equipmentt is:

Ethan nol Nonee, empty Argo n, Helium, Nittrogen Liqui d Nitrogen Other, please specify Equip pment type / P Product No:

Serial No:

I here eby confirm th hat the equipm ment specified above has b been cleaned to t remove any y hazardous ssubstances an nd that the area has been mad de safe and accessible. Name:

Comp pany or instittution:

Posittion or job title e:

Date (YYYY/MM/DD D)

Signe ed:

To receive a return authorization n number or service numbeer, e call local tecchnical support or custome er service. please

GE and GE monogram are trade emarks of General EElectric Company. GE Healthcare Bio-Sciences Corp, 800 Centennial A Avenue, P.O. Box 1327, Piscataway, NJ 08855-1 1327, US © 2010-14 General Electric Com mpany—All rights resserved. First publishe ed April 2010. D DOC1149544/28-980 00-27 AC 05/2014


207

7 Referenční informace 7.4 Překlady názvů příslušenství a spotřebního materiálu

7.4

208

Překlady názvů příslušenství a spotřebního materiálu Název produktu anglicky

Překlad

Amersham WB labeling buffer

značkovací pufr

Amersham WB loading buffer

vkládací pufr


markery molekulové hmotnosti

Amersham WB gel card 14, 8-18%

gelová karta

Amersham WB gel card 14, 13.5%

gelová karta

Amersham WB buffer strip

strip s pufrem

Amersham WB PVDF card

PVDF karta

Amersham WB transfer paper

přenosový papír

Amersham WB goat anti-rabbit Cy3/Cy5

kozí anti-králičí Cy3/Cy5

Amersham WB goat anti-mouse Cy3/Cy5

kozí anti-myší Cy3/Cy5


papírový hřeben

Amersham WB buffer strip holder

držák stripů s pufrem

Amersham WB transfer holder

Přepravní držák

Amersham WB sponge

houba

Amersham WB membrane adapter

membránový adaptér

Amersham WB drying holder

držák na sušení vzorků


Rejstřík

Rejstřík B Barvivo Cy Excitační vlnová délka, 77 Bezpečnostní upozornění, 8 Bezpečnostní opatření Úvod, 16 Bezpečnostní vypínače, 34

C CE Shoda, 9 CyDye Emisní vlnová délka, 77

Č Čištění Držák na sušení, 176, 181 Držák pufrovacího stripu, 180 Držák pufrových stripů, 132 Elpho & scan jednotka, 132 Membránový adaptér, 176, 180 Prostor na vysoušení, 183 Přenosová nádrž, 181 Přenosová průtoková cesta, 155 Přenosové průtokové cesty, 181 Přenosový držák, 156 Značicí průtoková cesta, 169, 181 Čtečka identifikátorů matic Instalace čtečky identifikátorů matic , 102 Čtečka indikátoru matice Popis, 81

D Dekontaminace, 32 Dokumentace Datové soubory a poznámky k aplikacím, 14 Metodická příručka, 14 Amersham WB system Návod k obsluze 29-0214-77 AE

Uživatelská dokumentace, 13 Držák hadičky Popis, 82 Připevnění, 98 Držák na sušení , 79 Čištění, 176, 181 Držák pufrovacího stripu Čištění, 180 Držák pufrového stripu Popis, 68 Držák pufrových stripů Čištění, 132 Umístění do jednotky Elpho & scan , 125 Držák vstupního filtru Popis, 81

E Elektroforetický experiment Popis, 109 Přehled, 110 Elektroforéza Následné procesy, 131 Příprava , 124 Spouštění a monitorování , 129 Umístění držáků pufrových stripů Elpho & scan jednotka, 125 Umístění pufrových stripů do držáků pufrových stripů, 124 Vložení vzorků, 128 Vyjmutí gelové karty, 131 Elpho & scan jednotka, 37 Čištění, 132 Otevření, 125 Zavřít, 128 Elpho & scan zásobník, 39 Elpho & skenovací jednotka Spuštění, 113 Experiment Elektroforetické experimenty, 109 Vytvoření, 116 209

Rejstřík

Western experimenty, 109 Zadání informací o protilátkách, 117 Zadání informací o vzorku, 117

F Filtr přenosové nádrže Výměna filtru přenosové nádrže, 196

G Gelová karta Před elektroforézou odstraňte ochranné fólie, 126 Přehled demontáže, 143 Rozlišení při separaci proteinů, 65 Složení , 65 Typy, 65 Umístění na plato karet, 127 Uvolněte rám gelu od podložky gelu, 144 Volba typu, 116

H Hadičkové věže Sestavení, 97 Hlava čerpadla Výměna hlavy přenosového nebo značicího čerpadla, 191 Hlavní síťová pojistka Výměna hlavní síťové pojistky, 197 Houba Popis, 76 Umístění do přenosového držáku, 142

I Indikátory , 36 Informace o právních předpisech, 9 Dodržování právních předpisů u připojeného zařízení, 12 Mezinárodní normy, 10 Předpisy a normy pro laserové systémy, 11

210

Shoda s předpisy ochrany životního prostředí, 11 Informace pro objednávání Objednání spotřebního materiálu, 57 Instalace Instalace čtečky identifikátorů matic, 102 Instalace přenosových elektrod, 93 Instalace softwaru, 103 Instalace vodítek membránové sušičky, 100 Požadavky na okolní prostředí, 87 Požadavky na počítač, 89 Prostorové požadavky, 88 Sestavení hadičkových věží, 97

K Kontrola připojení přístroje, 107

L Likvidace elektrických komponent, 32

M Markery MH Obrázek, 63 Proteiny, 64 Membránový adaptér Čištění, 176, 180 Popis, 80 Umístění na plato karet, 173 Mezinárodní normy, 10

N Návody Přenosové roztoky, 134 Roztoky protilátek, 158 Značicí roztoky , 158 Nouzové postupy Nouzové vypnutí, 30 Výpadek napájení, 30

O Odstraňte krytí jamek se vzorky , 127


Rejstřík

Označení CE, 10

P Papírový hřeben Popis, 70 Postup, 130 Poznámky a tipy, 8 Požadavky na okolní prostředí, 87 Požadavky na počítač, 89 Procesy po elektroforéze, 131 Prohlášení o zdraví a bezpečnosti, 206–207 Prohlížení výsledků, 175 Prostor na sušení Popis, 48 Prostor na vysoušení Čištění, 183 Prostorové požadavky, 88 Prostor protilátek Popis, 49 Připojení roztoků protilátek, 160 Protilátka (sekundární) Konjugovaná barviva Cy, 77 Popis, 77 Skladování lyofilizovaných protilátek, 59 Skladování rekonstituovaných protilátek, 59 Předznačení , 118 Kompatibilní lyzační pufry, 119 pH vzorku, 119 Požadované roztoky a materiál, 119 Přípravy, 120 Western protokol předznačení), 121 přehled pracovního postupu Všeobecný , 110 Přehled pracovního postupu Western s normalizací celkového proteinu, 111 Přenos Cesta průtoku kapaliny, 51 Čištění průtokové cesty, 181 Čištění průtokové cesty v rámci údržby, 185


Čištění přenosové průtokové cesty, 181 Princip procesu přenosu, 52 Připojení roztoků, 135 Příprava a připojení roztoků, 134 Spuštění a monitorování, 152 Výměna filtru přenosové nádrže, 196 Výměna hlavy přenosového čerpadla, 191 Výměna přenosových elektrod, 194 Přenosová nádrž Čištění, 181 Popis, 46 Vložení přenosového sendviče, 151 Přenosové elektrody Instalace, 93 Výměna přenosových elektrod, 194 Přenosový držák Čištění, 156 Odstranění po dokončení cyklu, 154 Popis, 72 Přenosový papír Popis, 75 Přenosový sendvič Materiály, 136 Přehled sestavení, 137 Příprava, 136 Vložení do přenosové nádrže, 151 Přepravní ochranné prvky Odstranění, 93 Přístroj Elpho & scan jednotka, 37 Elpho & scan zásobník, 39 Indikátory , 36 Kontrola připojení přístroje, 107 Připojení jednotek přístroje, 95 Připojení k počítači, 95 Připojení napájecích kabelů, 96 Western jednotka, 41 211

Rejstřík

Pufrový strip Popis, 68 Umístění do držáků pufrových stripů, 124 Pufry Lyzační pufry, 119 Pufry a roztoky Blokovací roztoky, 158 Konečný mycí pufr, značení, 158 Mycí pufr, značení, 158 Přenosový pufr, 134 Roztok protilátky, značení, 158 Ultra čistá voda, čištění, 134, 158 PVDF karta Popis, 74 Přesunutí do vysoušecího prostoru, 167 Příprava , 138 Spuštění a monitorování, 174 Umístění do značicí komory, 165 Umístění v jednotce Elpho & scan , 172

R Recyklace, obecné pokyny, 32 Recyklace nebezpečných látek, 32 Roztoky Blokovací, 158 Protilátka, 158 Přenos, 134 Připojení přenosových roztoků, 135 Připojení roztoků protilátek, 160 připojení značicích roztoků, 159 Značicí, 158

S Servisní prostor Popis, 50 Výměna hlav čerpadel, 191 Výměna vzduchového filtru, 189 212

Shoda s FCC, 11 Skenování Procedury po, 176 Přípravy předem, 172 PVDF karta, 172 Software Instalace , 103 Přehled , 83 Spuštění, 115 Spotřební materiál Objednání, 57 Skladování , 57 Spuštění Spuštění a monitorování, 170

T Typografické konvence, 6

U Údržba Čištění přenosové průtokové cesty v rámci údržby, 185 Čištění značící průtokové cesty v rámci údržby, 186 Plán údržby, 177 Příslušenství, 188 Výměna filtru přenosové nádrže, 196 Výměna hlavní síťové pojistky, 197 Výměna hlavy přenosového nebo značicího čerpadla, 191 Výměna přenosových elektrod, 194 Výměna vstupního filtru, 196 Výměna vzduchového filtru, 189

V Vložení vzorků, 128 Vodítka membránové sušičky Instalace vodítek membránové sušičky, 100 Vstupní filtr Držák vstupního filtru, 81 Připojení vstupních filtrů k hadičkám, 98 Amersham WB system Návod k obsluze 29-0214-77 AE

Rejstřík

Výměna vstupního filtru, 196 Výrobní informace, 9 Vzduchový filtr Výměna vzduchového filtru, 189

W Western experiment Popis, 109 Přehled, 110 Western jednotka, 41 Prostor na sušení, 48 Prostor protilátek, 49 Přenosová nádrž, 46 Servisní prostor, 50 Spuštění, 114 Značicí prostor, 47 Western protokol předznačení), 121


Z Značení Cesta průtoku kapaliny, 53 Čištění průtokové cesty, 169 Čištění průtokové cesty v rámci údržby, 186 Princip procesu značení, 54 Předplnění značicí komory, 163 Připojení roztoků protilátek, 160 Připojení značicích roztoků, 159 Spuštění a monitorování, 166 Výměna hlavy značicího čerpadla, 191 Značicí Příprava značicích roztoků a roztoků protilátek, 158 Značicí prostor Popis, 47

213



Kontaktní informace na místní kancelář naleznete na adrese www.gelifesciences.com/contact GE Healthcare UK Limited Amersham Place Little Chalfont Buckinghamshire, HP7 9NA Spojené království www.gelifesciences.com

GE a monogram GE jsou ochranné známky společnosti General Electric Company. Amersham, Cy, CyDye, MiniTrap a Sephadex jsou ochranné známky GE Healthcare nebo jedné z jejích dceřiných společností. Microsoft a Windows jsou ochranné známky společnosti Microsoft Corporation. Tween je ochranná známka systému Uniqema Americas LLC. CyDye: Tento produkt se vyrábí na základě výhradní licence společnosti Carnegie Mellon University a vztahují se na něj americké patenty číslo 5569587 a 5627027. Koupě produktů CyDye v sobě zahrnuje i udělení omezené licence na použití těchto produktů CyDye pro interní výzkum a vývoj, nikoli však pro komerční účely. Licence na použití produktů CyDye pro komerční účely je předmětem zvláštní licenční smlouvy s GE Healthcare. Všechny ochranné známky jsou majetkem příslušných vlastníků. © 2014-2015 General Electric Company – Všechna práva vyhrazena. Poprvé vydáno v březnu 2014 Prodej veškerého zboží a veškerých služeb se uskutečňuje na základě podmínek prodeje společnosti koncernu GE Healthcare, která je dodává. Tyto podmínky jsou k dispozici na vyžádání. Nejaktuálnější informace vám poskytne místní zástupce společnosti GE Healthcare.

GE Healthcare Bio-Sciences AB Björkgatan 30, 751 84 Uppsala, Sweden GE Healthcare Europe GmbH Munzinger Strasse 5, D-79111 Freiburg, Germany GE Healthcare Bio-Sciences Corp. 800 Centennial Avenue, P.O. Box 1327, Piscataway, NJ 08855-1327, USA GE Healthcare Japan Corporation Sanken Bldg. 3-25-1, Hyakunincho Shinjuku-ku, Tokyo 169-0073, Japan

29-0214-77 AE 03/2015 a24

Amersham WB system. Návod k obsluze. Překlad z anglického jazyka

Recommend Documents