3
Percobaan
3.1 Tempat dan Bahan Penelitian Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Penelitian Biokimia milik Program Studi Kimia Institut Teknologi Bandung. Ragi Saccharomyces cerevisiae yang mengandung plasmid YEp-bla diperoleh dari Laboratorium Biokimia ITB. Zat-zat kimia yang digunakan untuk media YNB padat meliputi yeast nitrogen base (YNB), glukosa, bakto agar, larutan L-Leusin, larutan L-Triptophan, dan L-Histidin. Untuk media YNB cair tidak ditambahkan bakto agar. Untuk penyiapan media yeast extract peptone (YEP) digunakan ekstrak ragi, bakto pepton, dan galaktosa. Fraksinasi dan dialisis enzim menggunakan ammonium sulfat, kantong selofan, dan BaCl2. Uji aktivitas enzim dengan Metode Fuwa menggunakan soluble starch (Merck), padatan KI, padatan I2, dan HCl 1M. Untuk melarutkan enzim digunakan buffer phosfat yang dibuat dari KH2PO4 dan K2HPO4. Pada penentuan massa molekul enzim dengan SDS-PAGE digunakan acrylamide mix 40% (acrylamide dan bis-acrylamide), buffer tris-glisin pH 8,8 dan 6,8, SDS, ammonium persulfat, temed, basa tris, glisin, coomasie briliant blue R-250, bromphenol blue 0,1%, gliserol 10% (v/v), metanol p.a., asam asetat glasial, dan marker protein. Untuk penentuan kinetika reaksi enzim dengan Metode dinitrosalicylic acid (DNS), penyiapan reagen DNS digunakan DNS, K-Na-tartarat, NaOH. Penentuan produk hidrolisis enzim menggunakan plat thin layer chromatography (TLC), butanol, etanol, metanol, dan H2SO4 pekat.
3.2 Peralatan Alat-alat gelas yang digunakan pada penelitian ini meliputi gelas kimia, labu erlenmeyer, labu takar, cawan petri, gelas ukur, tabung reaksi, batang pengaduk,dan pipet tetes. Alat-alat lain diantaranya peralatan elektroforesis protein (BIO-RAD), tabung valcon, botol semprot, kawat ose, tabung mikro, pipet Eppendorf ukuran 1-10μL, pipet Eppendorf ukuran 10-100μL, pipet Eppendorf ukuran 100-1000μL, pipet Eppendorf ukuran 1000-5000μL, tip untuk setiap pipet Eppendorf, kuvet plastik, stopwatch. Untuk penyiapan media dan sterilisasi alat digunakan alat
autoclave (Eyela Autoclave MAC-601 Tokyo Rikakikai Co.LTD). Kondisi aseptik dilakukan di dekat nyala api atau di ruang laminar flow (Oliphant, Ltd, Australia). Penimbangan bahan-bahan kimia menggunakan neraca analitik (Mettler Toledo AG 204, USA). Untuk menumbuhkan kultur ragi pada media YNB padat dilakukan dalam inkubator 30°C (Griffin). Untuk menumbuhkan inokulum dan produksi enzim pada media cair digunakan shaking incubator (Lab Line). Sel ragi dari inokulum pada suhu 4°C dipisahkan menggunakan mikrosentrifuga (Micro 22R Zentrifugen). Pemisahan sel ragi dari media produksi yang mengandung enzim dilakukan menggunakan sentrifuga suhu 4°C (Beckman J2-HS centrifuge). Enzim disimpan dalam freezer -20°C dan reagen-reagen disimpan dalam lemari dingin 4°C (Sharp non CFC). Pengukuran pH larutan seperti pada penyiapan larutan buffer menggunakan pH meter (Orion 420 A). Pemanasan larutan dilakukan menggunakan heater (Nuova-Thermolyne). Pengaduk magnetik dan vortex (vortex-genie by scientific industries) digunakan untuk menghomogenkan larutan. Aktivitas enzim diukur menggunakan Spectronic 20 Genesys dan menggunakan heating block (Thermolyne). Destaining hasil SDS-PAGE dilakukan di atas belly dancer.
3.3 Cara Kerja 3.3.1 Peremajaan Kultur Saccharomyces cerevisiae [YEp-bla] dan Penyiapan Inokulum pada media YNB Media YNB padat terdiri dari YNB 0,7% (b/v), glukosa 2% (b/v), bakto agar 2% (b/v). Bahan ini dilarutkan dengan dH2O lalu disterilkan dengan alat autoclave, kemudian setelah agak dingin ditambahkan larutan L-Leu 1% (v/v), L-His 0,2% (v/v), dan L-Trp 0,2 % (v/v). Penumbuhan kultur ragi Saccharomyces cerevisiae [YEp-bla] dilakukan dengan memindahkan kultur menggunakan kawat ose secara aseptik pada media YNB padat. Selanjutnya diinkubasi pada suhu 30°C selama 48 jam. Penyiapan inokulum dilakukan pada media YNB cair yang komposisinya sama dengan media YNB padat tetapi tanpa penambahan bakto agar. Inokulasi dilakukan secara aseptik dengan memindahkan koloni tunggal ragi dari media YNB padat ke media YNB cair yang baru. Selanjutnya media YNB cair yang berisi ragi diinkubasi pada 150 rpm, suhu 30°C selama 24 jam menggunakan shaking inkubator hingga diperoleh nilai OD600 sekitar 0,6-0,8. Pengukuran OD600 dilakukan dengan mengukur absorban media cair yang berisi kultur ragi pada panjang gelombang 600 nm.
15
3.3.2
Uji Kualitatif Aktivitas α-Amilase Rekombinan
Uji kualitatif aktivitas α-amilase rekombinan dari S. cerevisiae [YEp-bla] dilakukan dengan menumbuhkan kultur ragi pada media YNB padat secara aseptik dengan mengganti glukosa dengan galaktosa 2% (b/v), dan ditambah pati 1% (b/v). Kultur ragi ditumbuhkan selama 48 jam pada suhu 30°C, lalu ditambahkan larutan KI/I2 untuk mengetahui aktivitas α-amilase rekombinan.
3.3.3
Optimasi Kadar Penginduksi untuk Produksi α-Amilase Rekombinan
Penginduksi yang digunakan untuk produksi α-amilase rekombinan dari B. licheniformis pada ragi S. cerevisiae ini adalah galaktosa. Optimasi penginduksi dilakukan dengan membuat variasi konsentrasi galaktosa yang ditambahkan yaitu 1%, 2%, 3%, 3,5%, 4%, 4,5%, dan 5% (b/v). Produksi α-amilase rekombinan dilakukan pada media 3xYEP yang terdiri dari ekstrak ragi 3% (b/v), bakto pepton 6% (b/v), dan galaktosa. Bahan-bahan ini dilarutkan dalam dH2O lalu disterilkan dan didinginkan. Sel ragi diambil dari inokulum dengan cara mensentrifuga kultur ragi dalam inokulum pada kecepatan 6.000 rpm selama 10 menit secara aseptik. Kemudian sel ragi dimasukkan ke dalam media produksi dan diinkubasi dalam shaking incubator 150 rpm pada suhu 30°C. Setiap 24 jam OD600 sel ragi diukur dan dilakukan pengambilan sampel enzim untuk diukur aktivitasnya.
3.3.4
Produksi α-Amilase Rekombinan
Produksi α-amilase rekombinan dilakukan menggunakan media 3xYEP yang terdiri dari ekstrak ragi 3% (b/v), bakto pepton 6% (b/v), dan galaktosa 3% (b/v). Sebanyak 50 mL inokulum disiapkan untuk 500 mL media produksi. Sel ragi dari inokulum diambil dengan cara sentrifugasi lalu diinokulasi ke dalam media produksi secara aseptik. Kemudian media produksi berisi kultur ragi ini diinkubasi dalam shaking incubator 150 rpm pada suhu 30°C selama 72 jam. Isolasi enzim dilakukan dengan cara memisahkan media produksi dari pelet ragi menggunakan sentrifuga pada kecepatan 6000 rpm suhu 4°C selama 10 menit. Sel ragi dibuang dan supernatan yang berisi enzim disimpan dalam botol plastik di freezer -20°C.
16
3.3.5
Fraksinasi Ammonium Sulfat dan Dialisis
Fraksinasi ammonium sulfat dilakukan dengan melarutkan sebanyak 218 g ammonium sulfat dalam 500 mL enzim di dalam ruang dingin lalu diaduk dengan pengaduk magnetik. Selanjutnya campuran diendapkan dengan cara sentrifugasi pada kecepatan 11.500 rpm selama 10 menit dan dibuang supernatannnya. Endapan dilarutkan dengan 1 mL buffer phosfat 20 mM pH 7. Dialisis dilakukan dengan memasukkan enzim ini ke dalam plastik selofan yang diikat bagian atas dan bawahnya. Lalu enzim dalam plastik selofan ini direndam dalam buffer phosfat 2mM pH 7 dan buffer diganti tiap 1 jam. Uji kualitatif ammonium sulfat dilakukan dengan menambahkan larutan BaCl2 1% (b/v) ke dalam cuplikan buffer. Dialisis dilakukan hingga semua ammonium sulfat terbebas dari enzim.
3.3.6
Penentuan Massa Molekul α-Amilase Rekombinan dengan SDS-PAGE
Penyiapan separating gel (5 mL) dilakukan dengan mencampurkan 2,325 mL dH2O, 1,275 mL acrilamide mix 40%, buffer tris-glisin 1,5 M pH 8,8 sebanyak 1,3 mL, SDS 10% sebanyak 50 μL, ammonium persulfat 10% 50 μL dan temed 2 μL. Campuran gel ini dimasukkan ke dalam cetakan gel dan dibiarkan mengering selama lebih kurang 30 menit. Stacking gel 5% (2 mL) disiapkan dengan mencampurkan 1,4825 mL dH2O, acrylamide mix 0,2475 mL, buffer trisglisin 1 M pH 6,8 sebanyak 0,25 mL, SDS 10% sebanyak 20 μL, ammonium persulfat 10% sebanyak 20 μL, dan temed 2 μL. Campuran gel dini dimasukkan ke dalam cetakan gel dan dipasang sisir untuk membuat sumur gel. Setelah gel mengeras, gel dalam cetakan kaca dimasukkan ke dalam sumur elektroforesis dan ditambahkan running buffer. Running buffer 1x dibuat dengan mencampurkan 3,03 g basa tris dengan 14,4 g glisin lalu dilarutkan dalam 1 L dH2O. Sampel buffer 1x dibuat dengan mencampurkan buffer tris-HCl 50 mM pH 6,8, SDS 2% (b/v), bromphenol blue 0,1%, dan gliserol 10% (v/v). Larutan staining dibuat dengan mencampurkan 0,25 g coomasie briliant blue R-250, metanol p.a.40 mL, dH2O 50 mL, dan asetat gasial 10 mL. Larutan destaining disiapkan dengan mencampurkan metanol p.a.40 mL, dH2O 50 mL, dan asetat gasial 10 mL. Enzim dan sampel buffer 1x dicampurkan dengan perbandingan 1:1 lalu dipanaskan pada suhu 100°C selama 10 menit. Sampel disuntikkan ke dalam sumur gel sebanyak 7,5 μL. Marker protein dimasukkan ke dalam sumur berbeda, sebanyak 5 μL. Elektroforesis selama 45 menit dengan tegangan 150 V. Gel dikeluarkan dari cetakan lalu dibagi dua. Bagian yang berisi marker ditambahkan larutan staining lalu diinkubasi pada 50°C selama
17
15 menit dan pada suhu ruang 2 jam. Kemudian larutan staining dibuang dan diganti dengan destaining, lalu disimpan di atas belly dancer. Bagian yang lain ditambahkan buffer phosfat pH 7 lalu diinkubasi pada suhu ruang selama 15 menit. Kemudian gel direndam dengan larutan pati 1% (b/v) dan diinkubasi selama 30 menit pada suhu 70°C, lalu larutan pati dibuang dan ditambahkan larutan KI/I2.
3.3.7
Penentuan Suhu Optimum α-Amilase Rekombinan
Penentuan suhu optimum α-amilase rekombinan ini dilakukan dengan Metode Fuwa [Fuwa, 1954]. Sebanyak 50 μL pati ditambahkan 50 μL enzim lalu diinkubasi dengan heating block pada suhu yang berbeda mulai dari 30°C-100°C. Setelah 10 menit ditambahkan HCL 1 M sebanyak 50 μL dan larutan KI/I2 50 μL. Campuran ini diencerkan hingga 1 mL dan dihomogenkan. Penyiapan larutan kontrol dilakukan dengan menambahkan enzim yang sudah diinaktivasi dengan menambahkan larutan HCL, setelah itu ditambahkan larutan pati dan KI/I2. Larutan blanko terdiri dari HCl dan KI/I2 lalu diencerkan hingga 1 mL dengan dH2O. Absorban ketiga larutan ini diukur pada panjang gelombang 600 nm.
3.3.8
Penentuan pH Optimum α-Amilase Rekombinan
Penentuan pH optimum α-amilase rekombinan dilakukan dengan Metode Fuwa dengan menggunakan larutan buffer yang berbeda-beda untuk melarutkan pati dan enzim. Larutan buffer bervariasi dari pH 3 sampai pH 10. Larutan buffer pH 3 menggunakan buffer glisin-HCl, buffer pH 4 dan pH 5 menggunakan buffer asetat, buffer pH 6 dan 7 menggunakan buffer phosfat, buffer pH 8 dan pH 9 menggunakan buffer tris-HCl, dan untuk pH 10 menggunakan buffer glisin-NaOH. Sebanyak 50 μL larutan enzim dalam buffer ditambahkan dengan 50 μL pati yang dilarutkan dalam buffer yang sama. Lalu diinkubasi selama 10 menit pada suhu 70°C menggunakan heating block. Setelah 10 menit ditambahkan HCl 1 M sebanyak 50 μL lalu dihomogenkan dan ditambahkan larutan KI/I2 50 μL. Larutan ini diencerkan hingga 1 mL dengan dH2O. Penyiapan larutan kontrol dan blanko sama seperti penentuan kestabilan enzim terhadap suhu. Ketiga larutan diukur absorbannya pada panjang gelombang 600 nm.
18
3.3.9 Penentuan KM dan Vmaks Kinetika Reaksi α-Amilase Rekombinan Penentuan KM dan Vmaks dilakukan menggunakan metode DNS [Luchsinger and Corneskty, 1962]. Reagen DNS dibuat dengan mencampurkan 0,25 g DNS dan 75 g K-Na-tartarat. Lalu dilarutkan dalam 50 mL NaOH 2 M dan diencerkan hingga 250 mL. Reagen ini disimpan pada suhu 4°C dan stabil selama beberapa minggu. Pembuatan standar glukosa dilakukan dengan menyiapkan larutan glukosa standar dengan variasi konsentrasi dari 0,04%-0,08% (b/v). Sebanyak 100 μL larutan glukosa ditambahkan dengan 1 mL reagen DNS, lalu diinkubasi pada suhu 100°C selama 10 menit dan didinginkan. Absorban larutan diukur pada panjang gelombang 500 nm. Larutan sampel disiapkan larutan pati dengan variasi konsentrasi dari 0,1% sampai 0,8% (b/v). Sebanyak 50 μL enzim dicampurkan dengan 50 μL larutan pati, lalu diinkubasi 10 menit pada suhu 70°C. Kemudian ditambahkan reagen DNS 1 mL dan dipanaskan pada suhu 100°C selama 10 menit. Setelah dingin diukur absorban larutan pada panjang gelombang 500 nm. Blanko disiapkan dengan mengganti enzim dan pati dengan buffer phosfat pH 7 sebanyak 100 μL.
3.3.10 Analisis Produk Hidrolisis α-Amilase dengan TLC Analisis produk hidrolisis enzim pada variasi waktu inkubasi yang berbeda dilakukan dengan thin layer chromatography (TLC) menggunakan plat silika. Sebanyak 400 μL enzim direaksikan dengan larutan pati 5% (b/v) pada suhu 70°C dan dilakukan pengambilan sampel pada 0 jam, 1 jam, 2 jam, 4 jam, 7 jam, dan 24 jam. Enzim diinaktivasi dengan pemanasan dalam air mendidih. Masing-masing sampel ditotolkan sebanyak 3 μL pada plat TLC dengan jarak antar sampel lebih kurang 1 cm. Standar campuran glukosa (G1), maltosa (G2), maltotriosa (G3), maltotetraosa (G4), maltopentaosa (G5), maltoheksaosa (G6), dan maltoheptaosa (G7) juga ditotolkan sebanyak 1 μL pada plat TLC. Kemudian plat silika yang telah ditotolkan sampel dan standar gula, dielusi dengan eluen. Eluen yang digunakan adalah campuran pelarut organik, yaitu campuran butanol:etanol:air (5:5:3). Untuk melihat produk hidrolisis disemprotkan larutan penampak noda yang dibuat dari 50 % H2SO4 pekat dalam metanol. Kemudian plat TLC dipanaskan pada suhu 110°C selama 15 menit.
19
