BAHAN DAN METODE
Tempat dan Waktu Percobaan
Penelitian dilaksanakan di Laboratorium llmu dan Teknologi Benih IPB Leuwikopo,
Darmaga dan Baranangsiang, Bogor, Laboratorium
Biologi Tanah IPB, Laboratorium Analisis Kimia Terpadu IPB, Laboratorium Biokimia Balittan Bogor, Laboratorium Mikrobiologi Jurusan Biologi IPB Bogor, Laboratorium Mikrobiologi PPBP Bogor serta Laboratorium Geologi Kuarter Palaentologi Puslitbang Geologi Bandung, serta areal Perkebunan Kemiri milik PT Djasulawangi di Cireundeu, Cibadak, Sukabumi, dan berlangsung dari Juli 1992 sampai dengan September 1994.
Tahap Penelitian
Penelitian ini rnenggunakan benih kemiri (A. moluccana) yang diambil dari Perkebunan Kemiri milik PT Djasulawangi di Cireundeu, Sukabumi. Seluruhnya ada tiga tahap penelitian, yaitu : 1. Penelitian I untuk menentukan tingkat-tingkat kemasakan benih kemiri yang diperlukan dalam penelitian Ill 2. Penelitian II untuk menentukan umur pohon kemiri serta jumlah biji dalam buahnya yang diperlukan dalam penelitian Ill 3. Penelitian Ill yang terdiri atas 2 percobaan, yaitu percobaan 1
untuk mempelajari faktor-faktor penyebab dormansi selama pemasakan benih, dan percobaan 2 untuk mempelajari
peranan T. reesei QM 9414 dan T. pseudokoningrl TKKS 01 dalam mempengaruhi proses pematahan dormansi.
Metode dan Pelaksanaan Percobaan Penelitian I. Tujuan dilaksanakannya penelitian I yaitu untuk menentukan tingkat-tingkat kemasakan benih yang akan dipilih untuk penelitian Ill berdasarkan ciri-ciri perubahan fisik buah dan perubahan fisiologi benih. Perkembangan pemasakan buah secara langsung diamati pada buah-buah yang berasal dari pohon yang telah berumur 7 tahun. Buah dengan ukuran yang sama dipetik dan dipilah-pilah menjadi enam warna kulit buah (eksokarp) yaitu hijau muda, hijau muda kecoklatan, hijau tua kecoklatan, hijau tua coklat merata dengan permukaan halus, coklat merata dengan permukaan kasar, coklat tua dan tampak kasar, mudah dipetik. Selanjutnya buah diseleksi lagi berdasarkan warna bagian-bagian buah yang lain seperti warna endokarp, arilus dan warna getah pada buah sehingga diperoleh 6 stadium. Umur benih pada masing-masing stadium ditentukan rnelalui studi fenologi mulai fase pembungaan. Benih-benih pada keenam stadium kemudian diekstraksi secara manual menggunakan pisau dan ditentukan kadar airnya serta ditimbang bobot kering benihnya. Buah yang telah dipilah-pilah berdasar degradasi warna kulit buah terlihat pada Gambar 2 dan Gambar 3.
Penelitian II. Tujuan dilaksanakannya peneiitian II yaitu untuk menentukan umur pohon induk serta benih dari buah berbiji satu atau dua yang akan dipilih untuk penelitian Ill. Buah berbiji satu dan dua yang berasal dari umur pohon induk 7 tahun dan 4 tahun yang telah mencapai tingkat masak fisiologi (stadium 5) dengan ciriciri seperti pada penelitian I,dipanen dan diekstraksi, dikeringkan dan ditanam di dalam bak plastik yang berisi medium campuran pasir : kompos (1 : 1)
Penelitian Ill. Tujuan dilaksanakannya penelitian Illyaitu untuk mempelajari faktor-faktor penyebab dormansi selama pemasakan benih (percobaan 1) serta mempelajari peranan T. reesei QM 9414 dan T. pseudokoningii TKKS 01 dalam mempengaruhi poses pematahan dormansi (percobaan 2).
Perwbaan 1 Buah dari 4 tingkat kemasakan yang meliputi tingkat masak K-1 (34 MSA), K-2 (38 MSA), K-3 (41 MSA) dan K-4 (43 MSA) dengan ciri-ciri seperti pada hasil penelitian 1 diekstraksi, dianalisis perubahan-perubahan fisiologi, biokimiawi dan fisik benihnya. Percobaan 1 disusun menggunakan Rancangan Acak Kelompok dengan satu faktor dan 3 ulangan, kecuali untuk tolok ukur kadar ABA, kadar lemak total endosperma, serta persentase benih pe-
-
cah setelah diberi periakuan nitrogen cair (benih pecah NJ hanya diulang dua kali.
Percobaan 2 Tujuan percobaan 2 ialah mempelajari pengaruh T. reesei QM 9414 dan T. pseudokoningiiTKKS 01 pada medium tanam terha-
dap perubahan penampakan fisik kulit benih secara makroskopis dan mikroskopis serta perubahan lignin kulit benih. Buah berbiji 2 dari tingkat kemasakan K-4 (lewat masak) dengan ciriciri seperti pada hasil penelitian I, dipanen dari pohon induk yang berumur 8 tahun. Kemudian benih dikeringkan dengan dianginanginkan untuk mencegah terjadinya keretakan kulit benih. Setelah benih disterilisasi dengan etanol dan HgCI, yang diasam kan dengan HCI pekat, kemudian ditanam di dalam erlenmeyer 500 ml secara aseptik pada 7 macam medium steril. Persiapan
ketujuh macam medium ditunjukkan pada Tabel 2. Setelah periode waktu 6 bulan, diamati perubahaan warna dan perubahan fisik kulit benih antar perlakuan. Selanjutnya untuk melihat perubahan kadar lignin kulit benih serta perubahan serat-serat selulosa kulit benih secara mikroskopis melalui Scanning Electron Microscope (SEM) dilakukan percobaan dengan menggunakan medium tanam yang dibubuhi suspensi mikroorganisme T. pseudokoningiiTKKS 01. T. pseudokoningii TKKS 01 diperoleh dari koleksi Laboratorium Mikrobiologi PPBP Bogor.
Tujuh Macam Komposisi Medium Dengan Pasir Kuarsa Sterii Sebagai Komponen Utama
Tabel 2.
Sandi Medium
Antifungi (Captan)
Antibakteri (Negram)
T, reesei Nutrisi Ekstrak Ekstrak QM9414 Mandels Kompos Tanah & Weber
Keterangan :
-
-
= tanpa
+ = diberi setiap erlenmeyer berisi 500 gram pasir kuarsa steril (Autoklaf se lama 2 jam pada 120°C) masing-masing erlenmeyer pada perlakuan yang berbeda berisi : 10 ml suspensi Trichoderma reesei QM 9414 (2.97 X 10' sporalml berdasar hitungan mikroskopis langswrg). . T. reeseiQM 9414 diperoleh dari koleksi Laboratorium Mikrobidogi FMlPA IPB. 5 ml antifungi steril (Swinex, miIIipe 0.2 pm) dengan konsentrasi 20 ppm 5 ml antibakteri steril (Autoklaf, 120°C, 15 menit), konsentrasi 30 ppm 30 ml nutrisi Mandels dan Weber (komposisi larutan lihat Lampiran 1) steril (autoklaf, 1 2OmC,15 menit) 30 ml larutan ekstrak kompos steril (radiasi, sinareoCo30 Kilogray selama 20 jam) 30 ml larutan ekstrak tanah steril (radiasi, "Co 30 Kilogray selama 20 jam)
Benih dari tingkat kemasakan 13-4 (lewat masak) setelah disterilisasi ditanam dalam glassjar yang berisi pasir steril lembab secara aseptik dengan berbagai perlakuan seperti pada Tabel 3. Tabel 3.
Macam-macam Perlakuan pada Percobaan 2 menggunakan T. pseudokoningii TKKS 01.
Sandi Medium *)
Keterangan :
10 ml Suspensi T. pseudokoningii TKKS 01 **)
Lama lnkubasi (MiWglJ)
*) Medium pasir kuarsa lembab steril **) Jumlah Spora 4.37 X 106spora/ml,3 hari setelah inkubasi pada medium Pdato Dextrose Broth. ***) Sebagai perlakuan kontrol (benih tidak ditanam)
Setelah periode inkubasi berakhir, dianalisis lignin kulit benih pada masing-masing perlakuan. Pengamatan secara mikoskopis terhadap perubahan serat-serat selulosa kulit benih dilakukan pada permukaan dan penampang lintang kulit benih dengan membandingkan serat-serat selulosa kulit benih perlakuan Po dengan serat-serat selulosa kulit benih yang diberi perlakuan P, dan P,.
Perubahan serat-serat kulit benih yang terjadi juga
dibandingkan dengan kerusakan serat-serat selulosa kulit benih yang mampu berkecambah 5 bulan dan 6 bulan setelah tanam.
Penaamatan
Penelitian I. Pengamatan dilakukan terhadap tolok ukur fisiologi yang meliputi bobot kering benih dan kadar air benih.
Bobot Kering Benih. Tiga butir benih dari masing-masing tingkat kemasakan dipecahkan dan dikeringkan selama 3 X 24 jam dengan suhu 60°C. Setelah didinginkan dalam desikator, bobotnya ditimbang.
Kadar Air Benih (Suyanto, 1992) Untuk menghitung kadar air, setelah buah diekstraksi, arilus dikupas dan yang tersisa dibersihkan dengan serbuk gergaji dengan cara meremas-remasnya. Selanjutnya benih dibersihkan dengan kain lap. Dua butir benih dipecahkan dengan martil sehingga butiran-butirannya relatif seragam. Pecahan benihnya segera dimasukkan ke dalam cawan porselen kering yang sudah ditimbang terlebih dahulu (M,).
Wa-
dah yang sudah diisi butiran benih ditimbang sebelum dimasukkan ke dalam oven 105OC selama 16 jam (MJ.
Kemudian wadah yang berisi
benih dikeluarkan dari oven dan segera dimasukkan ke dalam desikator selama 1 jam, lalu ditimbang (M,).
Pengukuran kadar air dilakukan de-
ngan tiga kali ulangan dan ditentukan berdasarkan bobot basah dengan rumus :
Penelitian II. Pengamatan yang dilakukan adalah daya berkecambah benih. Daya Berkecambah.
Daya berkecambah benih ditentukan berdasarkan jumlah kecambah normal yang tumbuh sampai hari ke-48 ditambah kecambah normal yang tumbuh sampai hari ke-100 dibagi jumlah benih yang ditanam dikalikan 100%. Kriteria kecambah normal ialah kecambah yang tumbuh tegak dengan panjang hipokotii dua kali panjang endosperma, kulit benih terlepas dari endosperma, dan kedua kotiledon tampak sehat antara endosperma.
Penelitian Ill. Percobaan 1. Pengamatan dilakukan terhadap tolok ukur fisiologi yang meliputi bobot kering benih, bobot kering benih tanpa kulit (endosperma dan kotiledon), dan kadar air benih. Untuk memudahkan pemisahan antara endosperma dan kulit benih, sebelumnya benih dimasukkan ke dalam nitrogen cair beberapa detik hingga kulit benih mudah pecah dan mudah dipisahkan dari endospermanya. Masing-masing benih tanpa kulit dan benih utuh sebanyak 3 ulangan (3 butir per ulangan) dikeringkan selama 3 X 24 jam dengan
suhu 60°C. Kemudian didinginkan dalam desikator dan ditimbang bobotnya.
Selanjutnya pengamatan terhadap tolok ukur biokimiawi yang meliputi kadar lignin kulit benih, kadar ABA, kadar asam amino, dan kadar kmak total.
Kadar lignin kulit benih. Kadar lignin kulit benih dianalisis berdasarkan metode asetil bromida mengikuti prosedur Johnson et a/. dalam Marton (1967). Tahapan analisis disajikan pada Gambar 4.
pi Kulit benih
-
Pencucian dan perendaman dengan alkohol dan air panas Penyanngan
7
!
Penyaringan melewati 40 mesh tertahan di 60 mesh
Gambar 3.
Tahapan Analisis Kadar Lignin Kulit Benih Kemiri (A. molmcana)
Sampel siap uji ditimbang 5 mg, dimasukkan ke dalam tabung reaksi, dibubuhi 5 ml pereaksi 25% asetilbromida dalam asetat glasial. Campuran dipanaskan selama 30 menit dalam penangas air 70°C, diaduk tiap 5 menit lalu didinginkan didalam penangas es selama 30 menit.
Setelah dibubuhi 2 ml etanol absolut 100%, campwan ini dipindahkan ke labu ukur 25 ml, segera dibubuhi 7 ml etanol absolut, dan 0.25 ml 7.5 M hidroksilamin hidroklorida. Campuran tersebut diencerkan dengan etanol sampai tanda tera. Saring dan baca absorbansi pada panjang gelombang 280 nm. Persentase lignin ditetapkan dengan menggunakan rumus : 100(Aa % lignin
=
-
Ab)V
-..-----------aW
Keterangan : Aa = absorban sarnpel Ab = absorban blanko V = volume dalarn liter = nilai absorbtivitas ligrtin standar (23.6 crn-'liter g-') a W = bobot kering sarnpel dalarn gram
Kadar ABA pada endosperma dan kofiledon (Neill dan Horgan, 1987)
Buah-buah sarnpel dari lapang segera diekstraksi, benih kemudian langsung dimasukkan ke dalam nitrogen cair untuk mencegah metabolisme lebih lanjut selama perjalanan ke laboratorium. Selanjutnya dilakukan thawing dan pemecahan kulit benih untuk memisahkan endosperma dari kulit benihnya. Kotiledon dipisahkan dari endosperma dengan cara membelah keping endosperma secara hati-hati. Segera kedua komponen benih tersebut dicelupkan kembali ke dalam nitrogen cair sebelum disimpan di dalam freezer (-20°C). Tahap analisis ABA meliputi ekstraksi dan pemurnian seperti terlihat pada Gambar 5.
Asam amino. Analisis terhadap asam amino yang dikandung dalam endosperma dan kotiledon membuhthkan persiapan sampel seperti persiapan yang dilakukan pada analisis ABA. Tahap analisis asam amino dapat dilihat pada Gambar 6 .
Ekstraksi :
2 gram sampel dalam metanol : asam asetat (80 : 20 VN)
.'
I
I
3
gerus pada suhu 4°C 1 (3X30ml) -- --. --
--
1 j
; saring, atur pH sekitar 8 - 10 1 Pemurnian : ,
' resin penukar kation + anion Dowex 20, dengan penyaring millipore organik
I
i
eluat diinjeksikan ke HPLC - dengan fase diam colom C,. I I - dan fase cair metanol : asam asetat - detektor dengan h 265 nm
1
/
Gambar 5.
I
Tahap Analisis ABA Endosperma dan Kotiledon Benih Kemiri (A. moluccana) (Modifikasi Neil1 dan Horgan, 1987)
Ekstraksi : dalam 50 ml HCI 6 N <
&
'l
di buble selama 30 menit dengan N, lalu hidrolisis 24 jam pada suhu 105OC
/'
\
saring
eluat
Derivatisasi :
i
30 ml eluat + 30 ml larutan derivat (30 rnl metanol + 30 ml fenil isotiosianat + 35 ml trimetil amina)
I
1
I I
dibiarkan bereaksi 2 menit, dikocok jI
[ encerkan dengan campuran 1 asetonitril : buffer Na-asetat (pH 5.6)
'I
40 : 40 V N
injeksikan ke HPLC (Colom Pico TAG) temperatur 38OC
Garnbar 6.
Tahap Analisis Asam Amino Endosperma dan Kotiledon Benih Kemiri (A. moluccana)
Kadar lernak total. Kadar lemak total pada endosperma ditentukan dengan menghitung bobot lemak yang dihasilkan melalui ekstraksi menggunakan soxhlet dengan larutan hexane. Pengamatan terhadap tolok ukur fisik meliputi bobot kering kulit benih, persentase benih pecah sesudah perlakuan nitrogen cair (benih pecah - NJ Bobot Kering Kulit Benih. Tiga butir benih untuk setiap ulangan setelah dipisahkan endosperma dari kulit benihnya ditimbang bobot keringnya dengan prosedur seperti yang dilakukan pada pelaksanaan bobot kering benih dan bobot kering benih tanpa kulit. Persentase benih yang pecah - N,. Setelah benih dicelupkan ke dalam nitrogen cair selama 14 hari, dihitung persentase benih yang pecah. Makin tinggi persentase benih yang pecah akibat perlakuan nitrogen cair menunjukkan makin rentan kulit benih tersebut.
Percobaan 2. Kerusakan struktur kulit benih karena perlakuan yang diberikan diamati melalui pemotretan dengan Scanning Electron Microscope. Prosedur pelaksanaan persiapan contoh sampai dengan pemotretan disajikan pada Gambar 7.
I Contoh kulit benih kemiri Ditempelkan pada specimen holder (Dotite, double sticky tape)
Dibersihkan dengan hand blower
i
f i
1
Diberi lapisan tipis (coating)
I
dengan gold-paladium selarna 4 menit, dalam alat Fine Coat Ion Spurner JFC 1100-JEOL -
-
-
-
---
-
.-
-
-% --
I
I
-
_ __-
I
Contoh dimasukkan ke dalam specimen chamber
r/_
-
1 1
Pengamatanlpemilihan image pada layar SEM ..--. -
1 Pemotretan
Gambar 7.
-
.
----
1
Tahapan Persiapan Pemotretan dengan SEM (Laboratorium PP,GL Bandung)
