BAHAN DAN METODE Tempat dan Waktu Penelitian Penelitian dilakukan di Laboratorium Kerjasama Bioteknologi IndonesiaBelanda (BIORIN) dan Laboratorium Biologi Molekuler dan Seluler Tanaman (BMST), Pusat Penelitian Sumberdaya Hayati dan Bioteknologi (PPSHB) IPB, dari bulan Maret 2006 sampai dengan Desember 2008 Bahan Penelitian Bahan tumbuhan yang digunakan sebagai sumber DNA adalah daun muda M. malabathricum. Vektor yang digunakan untuk pengklonan adalah fage BlueSTAR-1 (Novagen) (Gambar 2). Fage tersebut telah dipotong dengan XhoI dan mengalami penyisipan (fill-in) dengan nukleotida deoksisitosina trifosfat (dCTP) dan deoksitiminosina trifosfat (dTTP) sehingga menghasilkan potongan vektor yang mempunyai ujung menggantung (overhang) TC pada situs penyisipan.
Gambar 1 Vektor pengklonan fage BlueSTAR-1. Gambar 2. Vektor pengklonan fage BlueSTAR-1 Escherichia coli (E. coli) galur ER1647 digunakan sebagai inang untuk mengamplifikasi fage rekombinan. E. coli galur BM25.8 digunakan sebagai inang untuk memproses eksisi dari fage rekombinan menjadi plasmid rekombinan. E. coli galur DH5 digunakan sebagai inang untuk memperbanyak plasmid rekombinan.
13 Metode Penelitian Isolasi DNA total tumbuhan Isolasi DNA total tumbuhan dilakukan dengan mengikuti prosedur Chang et al. (1993) yang dimodifikasi, yaitu LiCl diganti dengan isopropranol/etanol absolut. Sampel diambil dari daun muda yang masih segar, dibuang bagian tulang daunnya, lalu dipotong-potong. Dua gram potongan daun dimasukkan ke dalam mortal, ditambah nitrogen cair secukupnya, dan digerus hingga halus. Bubuk sampel tersebut kemudian dimasukkan ke tabung falcon, dilarutkan dalam 6 ml 2x larutan penyangga cetyltrimethyl-ammonium bromide (CTAB) (2% CTAB, 0.1 M Tris-HCl pH 9.5, 20 mM EDTA, 1.4 M NaCl, 2% PVP) lalu ditambahkan 0.2% merkaptoetanol. Larutan tersebut dibolak-balik sampai rata, kemudian diinkubasikan dalam pemanas bergoyang pada suhu 65oC selama 60 menit. Selanjutnya
larutan
tersebut
ditambah
6 ml
larutan
kloroform:
isoamilalkohol (CI) (24:1), dibolak-balik selama 1.5 menit, kemudian disentrifugasi dengan swing-out rotor (Jouan, BR4i) pada suhu 4°C dengan kecepatan 4000 rpm selama 10 menit. Setelah terpisah, cairan di bagian atas dipindahkan ke tabung falcon baru dan ditambah isopropanol sebanyak 0.7x volume awal, kemudian diinkubasi pada suhu -20C selama 2 jam. Campuran disentrifugasi pada suhu 4C dengan kecepatan 4000 rpm, selama 20 menit. Setelah sentrifugasi, endapan kemudian dibilas dengan alkohol 70% lalu disentrifugasi kembali pada suhu 4C, dengan kecepatan 3000 rpm selama 10 menit. Endapan
yang
diperoleh
lalu
dikeringkan
dengan
vakum
dan
disuspensikan dalam TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0). Suspensi DNA dimasukkan ke dalam tabung ependorf, kemudian ditambah RNAse dengan konsentrasi akhir 100 g/ml dan diinkubasikan pada suhu 37oC selama satu malam untuk menghilangkan RNA. Suspensi DNA dicampur secara merata dengan 1 x volume fenol : kloroform : isoamilalkohol (PCI) (25:24:1),
dan
disentrifugasi dengan fix-angle rotor (Jouan, BR4i) pada suhu ruang dengan kecepatan 12000 rpm selama 10 menit. Cairan bagian atas dipindahkan ke tabung baru kemudian ditambah 0.1x volume 3 M Na-asetat pH 5.2 dan 2x volume etanol absolut dingin, dibolak-balik pelan lalu diinkubasi pada suhu -20C selama 2 jam.
14 Setelah diinkubasi, larutan tersebut lalu disentrifugasi kembali pada suhu 4oC dengan kecepatan 14000 rpm selama 10 menit. Endapan DNA dibilas dengan etanol 70% dingin dan disentrifugasi kembali pada suhu 4C, dengan kecepatan 14000 rpm selama 30 menit. Endapan DNA tersebut dikeringkan dengan vakum kemudian disuspensikan di dalam TE pH 8. Pemotongan parsial DNA tumbuhan DNA total tumbuhan hasil isolasi dipotong secara parsial dengan cara mencampurkannya dengan enzim Sau3AI (Takara) pada suhu 37ºC selama 30 menit dengan berbagai konsentrasi [0.01, 0.015, 0.02 dan 0.04 unit (U) tiap µg DNA], sehingga diperoleh fragmen DNA berbagai ukuran dan tumpang tindih (overlap). Penyisipan nukleotida pada ujung fragmen DNA tumbuhan Kedua ujung fragmen DNA tumbuhan hasil pemotongan secara parsial terlebih dahulu disisipi dengan dua nukleotida untuk mencegah terjadinya penyambungan kembali di antara fragmen tersebut sesuai dengan prosedur Novagen (1997). Fragmen DNA sebanyak 20 g dicampur dengan
larutan
penyangga yang mengandung 50 mM Tris-HCl pH 7.3, 10 mM MgCl2, 50 g/ml bovin serum albumin (BSA), 1 mM deoksiadenosina trifosfat (dATP), 1 mM deoksiguanosina trifosfat (dGTP) (Novagen), 4 µl 100 mM ditiotreitol (DTT), dan 20 unit Klenow DNA polimerase (Takara) dalam volume total 400 l. Campuran tersebut diinkubasikan pada suhu 30oC selama 30 menit. Selanjutnya campuran tersebut dipanaskan pada suhu 70oC selama 10 menit untuk menghentikan reaksi tersebut. Fragmen DNA yang berukuran 7-20 kb diisolasi dengan menggunakan kolom Chroma Spin 1000 (Clontech 1999). Penyisipan fragmen DNA ke dalam vektor Fragmen DNA yang ujungnya telah disisipi nukleotida (fill-in) tersebut selanjutnya disisipkan ke dalam vektor fage dengan cara mencampur 0.5 g fragmen DNA (fill in) dengan 0.5 g BlueSTAR-1 (Novagen), 4.5 unit T4 DNA ligase (Takara), dan buffer ligasi [30 mM Tris-HCl pH 7.8, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 1 mM ATP, 5% polietilen glikol (PEG) 8000], dalam volume total 10 l. Campuran tersebut kemudian diinkubasi pada suhu 4oC selama 24 jam.
15 Pengemasan fage rekombinan DNA fage rekombinan hasil ligasi, selanjutnya dikemas dalam protein mantel. Sebanyak 10 l hasil reaksi ligasi dicampur dengan 50 l protein ekstrak pengemas (Gigapack III, Stratagene) sesuai prosedur Stratagene (2003). Campuran diinkubasikan pada suhu 22oC selama dua jam. Reaksi dihentikan dengan menambahkan 440 l bufer SM (5.8 g/l NaCl, 2 g/l MgSO47H2O, 0.01% gelatin, dan 50 mM Tris-HCl, pH 7.5). Jumlah titer ditentukan dengan melakukan transveksi ke E. coli galur ER1647. Transveksi fage ke dalam E coli Transveksi fage ke dalam E. coli dilakukan mengikuti prosedur Suharsono (2002). Sebanyak 100 l E. coli galur ER1647 (OD600=1) dicampur dengan 100 l fage . Fage hasil pengemasandiencerkan 100 kali agar memudahkan penghitungan. Campuran diinkubasi dalam balok pemanas (heat block) pada suhu 37oC selama 30 menit, kemudian ditambah 4 ml molten top agarose (10 g/l bacto-tryptone, 5 g/l NaCl, 6 g/l agarosa) bersuhu 47oC dan telah ditambah X-gal dengan konsentrasi akhir 500 ppm untuk mengidentifikasi rekombinan. Campuran tersebut disebar dalam cawan petri yang mengandung 15 ml media luria bertani (LB) padat (10 g/l bacto-tryptone, 5 g/l ekstrak khamir, 10 g/l NaCl, 15 g/l bacto-agar) sesuai prosedur Novagen (1997). Setelah agarosa yang berada di atas media LB padat tersebut membeku, cawan ditutup, kemudian diinkubasikan pada suhu 37oC selama satu malam. Jumlah plak (plaque) putih (rekombinan) dan koloni biru (bukan rekombinan) dihitung guna menentukan persentase rekombinan dan penentuan jumlah titer. Eksisi plasmid dari fage Transveksi fage rekombinan dari plak bening dilakukan ke dalam E. coli galur BM25.8 (OD600=1) untuk melakukan eksisi dari bentuk fage rekombinan menjadi plasmid rekombinan. Eksisi dilakukan dengan mencampurkan 100 l E. coli galur BM25.8 (OD600=1) dengan 100 l fage rekombinan tersebut. Campuran tersebut diinkubasikan di dalam balok pemanas pada suhu 37oC selama 30 menit. Sebanyak 100 l campuran disebar di atas media LB padat yang mengandung ampisilin 100 ppm dengan menggunakan batang kaca bengkok.
16 Isolasi DNA plasmid rekombinan Isolasi DNA plasmid dilakukan terhadap kedua galur E. Coli baik dari galur BM25.8 maupun galur DH5.
Masing-masing plak bening dari galur
tersebut secara terpisah diambil sampelnya.
Satu koloni plak bening diambil
dari biakan dalam cawan dengan menggunakan tip kuning yang ujungnya telah dipotong. Masing-masing koloni plak bening ditumbuhkan di dalam 2 ml media LB cair yang mengandung 100 mg/l ampisilin yang diletakkan dalam inkubator bergoyang dengan kecepatan 250 rpm, pada suhu 37oC selama semalam. Bakteri diendapkan dengan sentrifugasi pada kecepatan 14000 rpm (Jouan, BR4i), pada suhu 4oC selama 10 menit. Endapan bakteri selanjutnya disuspensikan dalam 300 l larutan penyangga suspensi sel (10 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 7.5), kemudian ditambah 300 l larutan penyangga lisis (0.2 M NaOH, 1% SDS). Setelah bakteri tersebut mengalami lisis, ditambah 300 l larutan penyangga netralisasi (1.32 M Na-asetat pH 4.8). Campuran tersebut disentrifugasi pada suhu 4oC dengan kecepatan 14000 rpm selama 20 menit. Cairan yang mengandung DNA plasmid diekstraksi dengan larutan PCI, kemudian divorteks dan disentrifugasi pada suhu 4ºC, kecepatan 14000 rpm selama 20 menit. Supernatan diambil dan diperlakukan dengan RNAse (100 µg/ml) pada suhu 37oC selama semalam. Protein RNAse dipisahkan dari DNA plasmid dengan menambahkan larutan PCI. Cairan kemudian ditambah dengan 0.1x volume 3 M Na-asetat pH 5.2 dan 2x volume etanol absolut, diinkubasikan pada suhu -20oC selama dua jam. DNA plasmid selanjutnya diendapkan dengan sentrifugasi pada suhu 4oC, kecepatan 14000 rpm selama 20 menit. Endapan DNA plasmid dibilas dengan etanol 70% dan dikeringkan dengan vakum. DNA plasmid tersebut disuspensikan di dalam H2O. Transformasi bakteri Pembuatan bakteri kompeten mengikuti prosedur Nakayama dan Nishikata (1995) dalam Suharsono (2002). Satu koloni bakteri E. coli galur DH5 dikulturkan dalam 2 ml media LB cair pada inkubator bergoyang pada suhu 37oC, dengan kecepatan 250 rpm
selama semalam. Kemudian bakteri
tersebut disubkultur dalam 100 ml media LB cair dengan kondisi yang sama hingga OD600=0.6. Bakteri diendapkan dengan disentrifugasikan pada suhu 4oC
17 dengan kecepatan 4000 rpm selama 10 menit. Endapan bakteri disuspensikan dalam 3.3 ml larutan penyangga transformasi (TFB) (10 mM MES pH 6.3, 45 mM MnCl2.4H2O, 10 mM CaCl2.2H2O, 3 mM [Co(NH3)6]Cl3, 100 mM KCl, gliserol 10%, pH 7.5) dan diinkubasikan di dalam es selama 10 menit. Kemudian suspensi tersebut disentrifugasi pada kecepatan 4000 rpm. Endapan bakteri disuspensikan dalam 0.83 ml TFB dan ditambah 58.1 µl DMSO 99.9%, lalu diinkubasikan di dalam es selama 10 menit sehingga didapat bakteri kompeten E. coli galur DH5.
Sebanyak 50 l bakteri kompeten E. coli galur DH5
dicampur dengan 10 l (50-100 ng) DNA plasmid rekombinan yang diisolasi dari E. coli galur BM25.8 dan diinkubasikan di dalam es selama 25 menit. Campuran ini kemudian diinkubasi pada suhu 42oC selama 45 detik, dimasukkan kembali ke dalam es selama 5 menit. Campuran ini ditambah 100 l media 2x YT (16 g/l tripton, 10 g/l ekstrak khamir, 5 g/l NaCl, pH 7.0) dan diinkubasikan pada inkubator bergoyang 250 rpm, 37oC selama 20 menit. Selanjutnya bakteri disebar pada media LB padat yang mengandung ampisilin 100 ppm dan diinkubasikan pada suhu 37oC selama semalam.
