BAHAN DAN METODE Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian dilakukan pada bulan Juli 2010 sampai Juli 2011 di Laboratorium Bakteriologi Tumbuhan, Departemen Proteksi Tanaman, Fakultas Pertanian dan Laboratorium Mikrobiologi, Departemen Biologi, FMIPA, Institut Pertanian Bogor. Bahan Penelitian Isolat dan strain bakteri yang digunakan dalam penelitian ini tertera pada Tabel 1. Teliospora yang digunakan diambil dari gejala pustul karat putih (white rust disease) pada tanaman krisan. Seleksi dan Identifikasi Isolat Bakteri Antagonis yang Berpotensi Mengendalikan Penyakit Karat Putih Peremajaan Isolat. Isolat bakteri antagonis yang digunakan adalah dari kelompok bakteri gram negatif. Media yang digunakan adalah King’s B agar (protease pepton no.3 20 g, K2HPO4 1.5 g, MgSO4.7H2O 1.5 g, gliserol 15 ml, agar 15 g, dan aquades 1 L) untuk meremajakan bakteri kelompok Pseudomonas dan media Tryptic Soybean Agar (TSA) siap pakai (Difco) untuk kelompok bakteri antagonis lainnya. Potensi Antagonisme Isolat Bakteri Antagonis. Pengujian in-vitro terhadap cendawan karat dilakukan dengan
menggunakan metode yang
dikembangkan oleh Mueller et al. (2005) dengan modifikasi. Kultur bakteri antagonis yang berumur 24 jam diteteskan sebanyak 100 µl pada gelas objek dan dikeringanginkan. Setelah itu serbuk teliospora dari pustul cendawan karat P.horiana dipanen dengan menggunakan cover glass diletakan di atas kultur bakteri tersebut. Gelas objek disimpan pada cawan yang telah dilapisi kertas tisu yang dibasahi untuk menjaga kelembaban dan diinkubasi pada suhu 17°C selama 24 jam dalam kondisi gelap. Sebagai kontrol digunakan suspensi teliospora yang tidak diberi perlakuan bakteri antagonis. Setelah 24 jam, dilakukan pengamatan di bawah mikroskop untuk menghitung jumlah teliospora yang berkecambah. Penghitungan dilakukan dengan mengamati 100 teliospora untuk setiap perlakuan.
Tabel 1 Isolat bakteri Pseudomonas dan asalnya yang digunakan dalam penelitian ini IIsolat P1 P2 P11 P12 P13 P14 P15 P16 P17 P19 P21 P22 P24 P25 P26 P28 P29 P30 P32 P33 P34 P36 P38 P39 Pfd2 Pfd3 K2 K4 K6
Genus Pseudomonas kelompok fluorescens Pseudomonas kelompok fluorescens Pseudomonas kelompok fluorescens Pseudomonas kelompok fluorescens Pseudomonas kelompok fluorescens Pseudomonas kelompok fluorescens Pseudomonas kelompok fluorescens Pseudomonas kelompok fluorescens Pseudomonas kelompok fluorescens Pseudomonas kelompok fluorescens Pseudomonas kelompok fluorescens Pseudomonas kelompok fluorescens Pseudomonas kelompok fluorescens Pseudomonas kelompok fluorescens Pseudomonas kelompok fluorescens Pseudomonas kelompok fluorescens Pseudomonas kelompok fluorescens Pseudomonas kelompok fluorescens Pseudomonas kelompok fluorescens Pseudomonas kelompok fluorescens Pseudomonas kelompok fluorescens Pseudomonas kelompok fluorescens Pseudomonas kelompok fluorescens Pseudomonas kelompok fluorescens Pseudomonas kelompok fluorescens Pseudomonas kelompok fluorescens
Asal Isolat Koleksi laboratorium bakteriologi DPT Tembilah-Riau Citere-Pengalengan Koleksi laboratorium bakteriologi DPT Koleksi laboratorium bakteriologi DPT Landungsari-Malang Landungsari-Malang Koleksi laboratorium bakteriologi DPT Koleksi laboratorium bakteriologi DPT Koleksi laboratorium bakteriologi DPT Koleksi laboratorium bakteriologi DPT Koleksi laboratorium bakteriologi DPT Koleksi laboratorium bakteriologi DPT Koleksi laboratorium bakteriologi DPT Maribaya-Lembang Malabar-Pangalengan Koleksi laboratorium bakteriologi DPT Koleksi laboratorium bakteriologi DPT Koleksi laboratorium bakteriologi DPT Cibodas-Lembang Batu-Malang Segunung-Cipanas Malabar-Pangalengan Koleksi laboratorium bakteriologi DPT Tanaman kubis-MegaMendung,Bogor Tanaman kubis-MegaMendung,Bogor Mangunkerta-Cianjur Karanganyar-Cirebon Karanganyar-Cirebon
Referensi Nawangsih 2006 Penelitian ini Penelitian ini Penelitian ini Penelitian ini Penelitian ini Penelitian ini Penelitian ini Penelitian ini Penelitian ini Penelitian ini Penelitian ini Penelitian ini Penelitian ini Penelitian ini Penelitian ini Penelitian ini Penelitian ini Penelitian ini Penelitian ini Penelitian ini Penelitian ini Penelitian ini Penelitian ini Penelitian ini Penelitian ini Penelitian ini Penelitian ini Penelitian ini
Persentase perkecambahan dan persentase penghambatan dihitung menggunakan rumus berikut: %
100%
%
% 100 % %
Keterangan: Rumus diatas berlaku dengan asumsi bahwa teliospora pada perlakuan kontrol berkecambah 100%. Penghitungan Indeks Kitinolitik. Penghitungan aktivitas kitinase menggunakan metode yang digunakan Tahtamouni et al. (2006) dengan modifikasi. Isolat bakteri ditumbuhkan pada media LB 10% (tripton 1 g, NaCl 0.5 g, ekstrak khamir 0.5 g, dan aquades 1 L) dengan penambahan serbuk kitin 1%. Sebanyak 25 µl dari masing-masing kultur bakteri diteteskan pada media kitin (K2HPO4 0.7 g, MgSO4.7H2O 0.5 g, KH2PO4 0.3 g, FeSO4.7H2O 0.01 g, MnCl2 0.001, ZnSO4 0.001, koloidal kitin 1%, agar 20 g, dan aquades 1 L). Pengujian untuk setiap isolat dilakukan tiga ulangan dan diinkubasi pada suhu 30°C selama 14 hari. Lebar zona bening menunjukan indeks kitinolitik dari masing-masing isolat. Penghitungan berdasarkan persamaan ∆Y=Y2-Y1 (∆Y= besarnya indeks kitinolitik, Y2= diameter zona bening dan diameter koloni, dan Y2= diameter koloni). Pemilihan Bakteri Antagonis Potensial. Karakterisasi mekanisme antagonis dilakukan pada bakteri antagonis yang menunjukan sifat antagonisme yang paling baik dari bakteri antagonis lainnya secara kualitas dan kuantitasnya. Selain itu, pemilihan juga didasarkan pada tingkat sensitivitasnya terhadap antibiotik yang akan digunakan sebagai penanda seleksi. Plasmid yang membawa transposon yang akan digunakan memiliki gen penyandi resistensi terhadap kanamisin. Oleh karena itu dipilih bakteri antagonis yang sensitif terhadap kanamisin.
Sehingga
transposon
yang
menyisip
pada
genom
bakteri
menyebabakan bakteri memiliki sifat resistensi terhadap kanamisin. Isolat-isolat bakteri antagonis ditumbuhkan pada media LB yang mengandung antibiotik
kanamisin dengan konsentrasi 50 µg/ml semalaman. Setelah semalaman diamati pertumbuhannya. Jika bakteri tersebut dapat tumbuh pada media LB dengan kanamisin maka bakteri tersebut bersifat resisten terhadap antibiotik tersebut dan sifat sensitif ditunjukan dengan tidak adanya pertumbuhan. Selanjutnya bakteri yang sensitif tersebut dipilih untuk dikarakterisasi gen-gennya. Identifikasi Isolat Bakteri Antagonis Terpilih Perunutan Sekuens 16S rRNA dan Padanannya pada Gene Bank. Isolasi DNA bakteri antagonis dilakukan dengan menggunakan kit ekstraksi (Genaid) sesuai dengan protokol pada manualnya. Selanjutnya DNA tersebut diamplifikasi dengan menggunakan primer 16S rRNA yaitu 63f (primer forward5’- CAGGCCTAACACATGCAAGTC -3’) dan 1387r (primer reverse- 5’GGGCGGWGTGTACAAGGC-3’) (Marchesi et al. 1998). Komponen PCR yang digunakan adalah KAPA Taq Ready Mix (KAPA Biosystems) sebanyak 12.5 µl, 10 pmol untuk masing-masing primer, DNA genom, dan ddH2O hingga volume reaksi 25 µl. Tahapan PCR adalah predenaturasi pada suhu 94 ºC selama 2 menit, denaturasi pada suhu 95 ºC selama 1 menit, pelekatan primer (annealing) pada suhu 55 ºC selama 1 menit, pemanjangan (elongation) pada suhu 72 ºC selama 1.5 menit, proses ini diakhiri dengan pemanjangan DNA pada suhu 72 ºC selama 5 menit. Fragmen DNA hasil amplifikasi dielektroforesis menggunakan agarose dengan konsentrasi akhir 1%. Selanjutnya DNA tersebut disekuensing dengan menggunakan jasa PT. Genetika Science, dan dilihat kesamaan urutan basanya dengan menggunakan program BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/). Karakterisasi Sifat-Sifat Fisiologis dan Biokimia. Pengujian sifat fisiologis dan biokimia dilakukan mengacu pada Bergey Manual untuk bakteri hasil karakterisasi dengan molekuler yang telah dilakukan sebelumnya. Pengujian dilakukan dengan menggunakan Microgen Gn-ID A+B Panel (Microgen Bioproducts).
Karakterisasi Mekanisme Penghambatan Bakteri Antagonis Potensial Uji produksi Asam Sianida (HCN). Produksi asam sianida dapat diketahui dengan menggunakan indikator alkali pikrat (Reddy et al. 2008). Produksi asam sianida oleh isolat bakteri antagonis dapat dideteksi dengan perubahan warna kertas indikator dari kuning menjadi oranye kecoklatan pada kertas saring yang dicelupkan pada larutan indikator.
Kultur bakteri yang
berumur 24 jam diinokulasikan pada medium agar miring TSA yang ditambahkan 4.4 g/L glisin. Setelah itu pada masing-masing tabung reaksi diberikan sepotong kertas saring Whatman No.1 yang telah dicelupkan ke dalam larutan 0.5% asam pikrat dan 2% sodium karbonat (Na2CO3) sebagai indikator pada bagian dalam tabung reaksi. Kultur bakteri di dalam tabung reaksi diinkubasi pada suhu ruang selama 3 sampai 5 hari. Amplifikasi Gen Pengkode Antibiotik Fenazin dengan PCR. Gen pengkode antibiotik fenazin diamplifikasi dari DNA genom bakteri antagonis dengan menggunakan dua pasang primer yaitu PHZX: 5’-TTT TTT CAT ATG CCT GCT TCG CTT TC-3’ dan PHZY: 5’-TTT GGA TCC TTA AGT TGG AAT GCC TCC-3’ yang digunakan untuk mendeteksi adanya gen fenazin (phzXY), serta PHZ1 5’-GGC GAC ATG GTC AAC GG-3’ dan PHZ2 5’-CGG CTG GCG GCG TAT TC-3’ yang digunakan untuk mendeteksi adanya gen fenazin (phzAF). Komponen PCR yang digunakan adalah KAPA Taq Ready Mix (KAPA Biosystems) sebanyak 12.5 µl, 10 pmol untuk masing-masing primer, DNA genom, dan ddH2O hingga volume reaksi 25 µl. Produk PCR gen target menggunakan primer PHZX dan PHZY adalah 1.1 kb. Siklus PCR terdiri dari denaturasi awal 94 ºC selama 1.50 menit, dilanjutkan dengan 30 siklus denaturasi 94 ºC selama 45 detik, penempelan primer 58 ºC selama 45 detik, pemanjangan 72 ºC selama 1.75 menit
dan pemanjangan akhir 72 ºC selama 1 menit.
Sedangkan untuk produk PCR gen target menggunakan primer PHZ1 dan PHZ2 adalah 1.4 kb. Siklus PCR terdiri dari denaturasi awal 94ºC selama 2 menit, dilanjutkan dengan 30 siklus denaturasi 94ºC selama 1 menit, penempelan primer 56ºC selama 45 detik, pemanjangan 72ºC selama 1.75 menit dan pemanjangan akhir 75ºC selama 1 menit (Delaney et al. 2001).
Karakterisasi Peranan Aktivitas Kitinolitik Bakteri Antagonis dalam Mengendalikan Penyakit Karat Putih Mutagenesis dengan pUT Mini-Tn5Km1. Transposon mutagenesis dilakukan dengan metode konjugasi antara bakteri antagonis sebagai resipien dengan E.coli S17-1λ pir yang merupakan pembawa plasmid pUT mini Tn5-Km1 sebagai donor (De Lorenzo et al. 1990). Bakteri antagonis ditumbuhkan semalaman (suhu ruang, 100 rpm) pada media LB sampai konsentrasi sel 108 dan dipanen selnya dengan sentrifugasi selama 8 menit pada kecepatan 10.000 rpm. Setelah itu dicuci menggunakan NaCl 0.85% 3 kali. E.coli S17-1λ pir ditumbuhkan selama 18 jam (suhu 37 °C, 80 rpm) pada LB yang ditambahkan kanamisin 50 µg/ml dan ampisilin 50 µg/ml. Pemanenan dan pencucian sel dilakukan seperti sebelumnya. Kedua pelet diresuspensikan dengan 40 µl LB ,dicampur, dan diteteskan pada membran steril yang diletakan di atas media LA. Selanjutnya diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37 °C. Setelah 24 jam, membran diambil, dimasukan ke dalam tabung yang telah berisi 1 ml NaCl 0.85%, dan dikocok dengan vorteks. Sebanyak 100 µl kultur bakteri disebar pada media TSA yang ditambah kanamisin 50 µg/ml. Hasil transkonjugan ditunjukan dengan koloni yang dapat tumbuh pada media tersebut. Seleksi transkonjugan dilakukan pada media kitin untuk mendapatkan koloni transkonjugan dengan berbagai aktivitas kitinolitik. Masing-masing koloni transkonjugan dengan aktivitas kitinolitik yang berbeda selanjutnya diuji sifat antagonismenya untuk melihat peran dari aktivitas kitinolitik terhadap penghambatan perkecambahan teliospora.
