Základy analýzy potravin
Přednáška 8
BÍLKOVINY Důvody pro analýzu bílkovin v potravinách • posuzování nutriční hodnoty • celkový obsah bílkovin • aminokyselinové složení bílkoviny, volné aminokyseliny • obsah cizorodých nebo neplnohodnotných bílkovin • travitelnost bílkovin • kontrola dodržování receptury • celkový obsah bílkovin • přítomnost cizorodých bílkovin • určování původu suroviny, autenticita výrobku • aminokyselinové složení • stanovení jednotlivých frakcí bílkovin Některé pojmy Hrubý obsah bílkovin Čistý obsah bílkovin Obsah travitelných bílkovin
1
Základy analýzy potravin
Přednáška 8
METODY ZALOŽENÉ NA STANOVENÍ DUSÍKU Obsah dusíku v bílkovinách je průměrně 16 %. Stanovíme-li ve vzorku potraviny dusík a násobíme výsledek faktorem 6,25 (=100/16), získáme hrubý obsah bílkovin. Přepočítávací faktor závisí na druhu bílkoviny (je dán AK složením). Faktory bílkovina / dusík pro různé potraviny: Potravina Pšenice celozrnná mouka ostatní mouky, těstoviny otruby Rýže Ječmen, oves, žito Sója
Faktor Potravina Ořechy 5,83 para ořechy, arašídy 5,70 mandle 6,31 ostatní ořechy 5,95 Mléko a mléčné výrobky 5,83 Želatina a kolagen 5,71 Ostatní potraviny
Faktor 5,41 5,18 5,30 6,38 5,55 6,25
Stanovení dusíku a hrubé bílkoviny Kjeldahlovou metodou Význam: univerzální, mezinárodně akceptovaná metoda Podstata: • mineralizace vzorku kys. sírovou → konverze organických sloučenin dusíku na (NH4)2SO4 provedení: • záhřev s konc. H2SO4 za přít. katalyzátoru (elementární selen, Se+K2SO4, HgO, bezvodý CuSO4, K2SO4+CuSO4, TiO2 + CuSO4) v Kjeldahlově baňce nebo zkumavce • postupný ohřev, max. teploty 340-390°C (t.v. H2SO4 338°C) • doba běžně 20-60 min, úplný rozklad Lys, Trp, Tyr až po dalších 30-40 min po vyčiření (dusík obsažený v derivátech pyridinu, chinolinu, triazolu,… nelze stanovit, NO3-, NO2nitosloučeniny, nitrososloučeniny, až po redukci) 2
Základy analýzy potravin
Přednáška 8
• uvolnění amoniaku z mineralizátu zalkalizováním a jeho oddělení destilací s vodní párou: H2SO4 + NaOH → Na2SO4 + 2H2O (NH4)2SO4 + 2 NaOH → 2 NH3 + Na2SO4 + 2 H2O
Destilační přístroj podle Parnase a Wagnera
• titrační stanovení amoniaku: a) při destilaci se jímá amoniak do předlohy s odměrným roztokem H2SO4, nadbytek kyseliny se stanoví titrací hydroxidem: 2 NH3 + H2SO4 → (NH4)2SO4 H2SO4 + 2NaOH → Na2SO4 + 2 H2O Tashirův indikátor (methylčerveň + methylenová modř) b) amoniak se jímá do předlohy s nadbytkem kyseliny borité, vzniklý boritan amonný se titruje kyselinou (WINKLER) 3NH3 + H3BO3 → (NH4)3BO3 (NH4)3BO3 + 3 HCl → 3 NH4Cl + H3BO3 Tashirův indikátor 3
Základy analýzy potravin
Přednáška 8
Výpočet obsahu dusíku a bílkoviny: ad a) n(NH3) = 2 . [c(H2SO4).V(H2SO4) – 0,5 . c(NaOH).V(NaOH)] mmol m(N) = 14 . n(NH3) mg m(bílkovina) = 6,25 . m(N)
ad b) n(NH3) = n(HCl) = c(HCl).V(HCl) mmol
Spektrofotometrické stanovení dusíku s Nesslerovým činidlem amonné ionty obsažené v mineralizátu tvoří s Nesslerovým činidlem (K2HgI4 + NaOH) žlutě až hnědě zbarvený produkt o složení [Hg2I3NH2]n. Absorbance při 450 nm je úměrná obsahu NH4+. Kalibrace v rozsahu 20-60 µg dusíku (jako (NH4)2SO4). Stanovení čistého obsahu bílkovin bílkoviny se předem isolují srážením trichloroctovou kyselinou (nebo taninem nebo hydroxidem měďnatým), ve sraženině se stanoví dusík podle Kjeldahla a přepočte se na obsah bílkoviny Stanovení travitelných bílkovin vzorek se inkubuje s příslušným enzymem (pepsin – kyselé prostředí, trypsin – alkalické prostředí) při 37°C (24-48 hod); v nerozpustném zbytku se stanoví bílkoviny, výsledek se odečte od celkového obsahu a získá se obsah travitelných bílkovin
4
Základy analýzy potravin
Přednáška 8
SPEKTROMETRICKÉ METODY STANOVENÍ BÍLKOVIN • UV/VIS, MIR: stanovení v roztocích • NIR: stanovení i v tuhých vzorcích bez úpravy Stanovení bílkovin ultrafialovou spektrofotometrií a) absorpce vyvolaná aromatickými aminokyselinami (Tyr, Trp, Phe) při 280 nm • vliv interferentů (nukleové kyseliny…) se koriguje měřením při 260 nm (nutný alespoň 5 násobný přebytek bílkovin vůči nukleovým kyselinám) přibližný výpočet: cbílk = (1,45 . A280 – 0,74 . A260 )/b
[mg/ml]
b je délka absorpční dráhy (tloušťka kyvety) v cm • absorbance je ovlivněna aminokyselinovým složením bílkoviny a hodnotou pH roztoku Absorptivity některých živočišných bílkovin při 280 nm Bílkovina (původ) myosin (sval prasete) β-laktoglubulin (kravské mléko) laktoferrin (kravské mléko) ovomukoid (vaječný bílek) lysozym (vaječný bílek)
ε280
a280
-1 -1 (l.mol-1.cm-1) (l.g .cm ) 32,2.104 0,685
Mol.hmotnost (g.mol-1) 470 000
(1,6-1,9).104 0,90-1,04 (pH 2,6) 10,9.104 1,27
18 000
3,9.104
0,51
76 000
3,8.104
2,64
14 300
5
86 000
Základy analýzy potravin
Přednáška 8
b) absorpce peptidových vazeb v intervalu 205-235 nm • měření při 215 a 225 nm v prostředí pH 4-8 platí [µg/ml]
cbílk = 144 (A215-A225)/b
• mimořádná citlivost (možno stanovit až jednotky ng/ml) • interferují acetáty, sukcináty, citráty, ftaláty, barbituráty, stanovení neruší fosfáty, boráty, NaCl, (NH4)2SO4 a Tris c) měření absorpce peptidové vazby s korekcí obsahu aromatických AK dalším měřením při 280 nm pro koncentrace roztoků bílkovin v 0,02M fosfátovém pufru pH 6,8 platí cbílk = 0,3984 (A235 – A280) /b
[mg/ml]
0,3984 je převrácená hodnota rozdílu průměrných hodnot absorpčního koeficientu různých bílkovin při 235 a 280 nm Výhody: • nukleové kyseliny neinterferují (absorbují stejně při 235 a 280 nm) • analýza nevyžaduje kalibraci • výsledek je jen málo ovlivněn složením bílkoviny (odchylka výsledku od skutečné hodnoty je při bezkalibrační analýze menší než 20 % rel.)
6
Základy analýzy potravin
Přednáška 8
Stanovení bílkovin biuretovým činidlem • Bílkoviny tvoří s biuretovým činidlem (CuSO4 + vinan sodno-draselný + NaOH) fialově zbarvené komplexy (λ= 540-560 nm nebo 310 nm). • stanovení je nespecifické (reagují také peptidy, interferuje amoniak a Tris) • výsledky jsou prakticky nezávislé na AK složení bílkoviny • malá citlivost (pracovní rozsah cca 0,1-10 mg bílk.). 0,40
560
0,35
b 544
0,30
c
Absorbance
0,25 0,20
663
0,15
a
0,10 0,05 0,00 -0,05 200
300
400
500
600
700
800
λ (nm)
a 4 ml činidla + 1 ml vody b 4 ml činidla + 1 ml vzorku (vaječný albumin 5 mg/ml) c rozdílová křivka
7
900
Základy analýzy potravin
Přednáška 8
Stanovení bílkovin Lowryho metodou Folin-Ciocalteovo činidlo (směs kyseliny fosfomolybdenové a fosfowolframové) poskytuje v alkalickém prostředí (pH 1010,5) za přítomnosti Cu2+ s bílkovinami modře zbarvený produkt (λmax = 745-750 nm). Činidlo reaguje se zbytky aromatických aminokyselin (Tyr, Trp); odezva je proto závislá na aminokyselinovém složení bílkoviny. Reakci dává i samotný Tyr. Stanovení je dosti citlivé (pracovní rozsah 10-200 µg bílk.).
8
Základy analýzy potravin
Přednáška 8
Spektrofotometrické stanovení bílkovin po reakci s organickými barvivy Principy: a) bílkovina se váže na rozpustné barvivo a vzniká nerozp. produkt → roztok se odbarvuje, tj. klesá absorbance (amidočerň, oranž G) b) vazbou bílkoviny na rozpustné barvivo se mění absorpční spektrum (Coomassie) Bradfordova metoda používá trifenylmethanové barvivo Coomassie brilliant blue G250 H3C
H3C
SO3H N
CH3 CH3
HN
OCH2CH3
N
+
SO3-
Reakce probíhá v kyselém prostředí; absorpční maximum barviva (480 nm) se po reakci s s bílkovinou posouvá na 595 nm (modrý roztok). Absorbance při 595 nm měřená proti roztoku činidla je úměrná koncentraci bílkoviny.
9
Základy analýzy potravin
Přednáška 8
Bradfordova metoda: absorpční spektra
595
1,2
b
1
596 c
Absorbance
0,8
480 0,6
a
0,4
638
0,2
0 400
450
500
550
600 nm
a činidlo b činidlo+bílkovina c diferenční křivka
10
650
700
750
800
Základy analýzy potravin
Přednáška 8
Vlastnosti spektrometrických metod stanovení bílkovin Metoda UVa
UV
λ
Citlivost Doba reakce 280/260 nm vysoká 0
205-235 nm velmi vysoká
s biuretovým 540-560 nm nízká činidlem (310 nm) b Lowry 745-750 nm vysoká
Bradford MIRc NIRd
595 nm vysoká 6460 nm střední -1 (1548 cm ) 2180 nm … nízká
Interferenty
aromatické sloučeniny, nukleotidy, nukleové kyseliny 0 peptidy, aromatické sloučeniny, složky pufrů (sukcinát, citrát, ftalát, barbiturát…) 15-40 min peptidy, amidy, NH3, Tris… 15-40 min aminokyseliny, NH3, složky pufrů, surfaktanty, cukry, alkoholy, lipidy… 2 min surfaktanty 0 voda 0
Poznámky: a – silná závislost na aminokyselinovém složení b – závislost na aminokyselinovém složení, činidlo málo stabilní c – přímá analýza mléka d – měření reflektance tuhých vzorků, náročná kalibrace
11
