Wanneer moleculaire analysen aanvragen bij hematologische aandoeningen? Barbara Denys Centrum voor Moleculaire Diagnostiek UZ Gent GAB, 1 juni 2010
Wat is de waarde van moleculaire biologie in de diagnostiek en followup van leukemieën en lymfomen? • Algemene organisatie • Technieken • Bijdrage diagnose, bepalen therapie, prognose en follow-up • Voordelen en beperkingen • Belang correcte staalname
Strategie: wanneer en welke test uitvoeren
Rol van het labo binnen de hemato-oncologie? Morfologie (beenmerg en perifeer bloed) ! Microscopie = basis van de hematologische diagnostiek voordeel: snel – geen geavanceerde techniek nadeel: beperkte gevoeligheid – geen bijkomstige info
Rol van het labo binnen de hemato-oncologie? Verfijning van diagnostiek fenotypering: flowcytometrie met monoklonale antilichamen → niveau van eiwit (functie van cel) genotypering: karyotypering - FISH – PCR/microarrays → niveau van genoom/DNA/RNA Detectie en/of analyse van nucleïnezuren in klinische stalen
Organisatie binnen UZ Gent Centrum Medische Genetica Gent (CMGG) • Erferlijk overdraagbaar • Technieken: karyotypering en FISH • Analysen binnen hematooncologie (verworven): – karyotypering, FISH bij diagnose AL en MDS – Karyotypering en FISH bij multiple myeloom – Karyotypering en BCR-ABL FISH bij CML – FISH CLL
Centrum Moleculaire Diagnostiek (CMD) • Verworven • Technieken: PCR, RTqPCR, sequencing • Analysen: – Opsporen en kwantificeren van fusiegenen en oncogen overexpressie (lymfomen en leukemie) – Opsporen van klonaliteit (lymfomen) – Opsporen van mutaties NPM1/FLT3 (AML), JAK2 V617F (MPN) – Sequencing immuunglobuline zware keten locus (CLL)
Centrum voor Moleculaire Diagnostiek (CMD) • 18 centra voor moleculaire diagnostiek (KB ’98) afgeschaft door arrest Raad van State in 2005 • 2005 – 2007: ex-CMD’s niet meer betaald door RIZIV, op kosten van ziekenhuis • Art 33bis in voege vanaf 01/08/2007: “De verstrekkingen moeten uitgevoerd zijn in een laboratorium dat, binnen de 2 jaar na het in werking treden van dit besluit, een ISO 15189 accreditatie, of een accreditatie volgens een gelijkwaardige laboratoriumnorm bezit voorde uitgevoerde verstrekkingen”
• April 2009: CMD UZG accreditatie behaald • 3 MLT’s voor de testen binnen hematooncologie (daarnaast 3 MLT’s voor virologische testen) • ~2000 arbeidsintensieve testen per jaar
Polymerase chain reaction of PCR • specifieke amplificatie van een bepaalde sequentie DNA/cDNA streng, afgebakend door de gekozen reagentia (primers), door herhaald kopiëren in cycli • bij elke cyclus worden vorige kopijen ook gekopieerd, zodat vermeerdering exponentieel verloopt (amplificatiefactor 2n; n = aantal cycli). • DNA polymerase enzym verlengt ‘primer’ door aanhangen nucleotiden (bouwstenen), complementair met ‘template’ DNA (matrijs). • Door amplificatie (1012) analytisch gevoelig, doch gevaar van contaminatie
Materiaal - WBC: isolatie na lyse RBC - Extractie DNA of RNA: digestie, alkalische lyse, precipitatie of adsorptie - RNA als template: moet eerst in DNA omgezet worden door reverse transcriptie (cDNA synthese); twee-staps PCR (betere gevoeligheid) - Reagentia: DNA polymerase, nucleotiden, primers, buffer - PCR toestel: thermische cycler; laat cyclische opwarming en afkoeling van reactiebuisjes
PCR = kettingreactie: opeenvolging van denaturatie, annealing en elongatie 1) denaturatie: complementaire DNA strengen uiteen halen, d.m.v. verhitting (95 °C) 2) annealing: hybridisatie van complementaire DNA fragmenten, i.h.b.primers; wordt mogelijk door ‘koelen’ (50 a 65 °C) 3) elongatie: door polymerase verlengen van de vrije 3’ residu’s, best bij 72 °C, wordt gestopt door verhitten: terug stap 1. T (°C) 95 72
50 ---
2
4
Real-time typisch 95 °C 15s; 60 °C 1min
6
t (min)
Detectie • Klassieke kwalitatieve PCR: Agar gelelectroforese (ethidium bromide) • Kwantitieve PCR m.b.v. real-time fluorescentie • Capillaire electroforese (fluorescentie) vb. klonaliteitsanalyse • Chromogene enzymreactie (ELISA, lijn hybridisatie)
Staal
Compartimentalisatie PCR Lab Archievering staal/DNA/RNA/cDNA
Pre-PCR Lab extractie DNA/RNA reverse transciptie
Mix lokaal aanmaak reagentia : voor amplificatie : na amplificatie
Sas
PCR Lab: amplificatie detectie (Post) PCR Lab amplificatie, detectie Afval
Moleculaire testen CMD UZ Gent – opsporen van fusiegen (-expressie): PML-RARA, TEL-AML, AML-ETO,.... bij acute leukemieën BCR-ABL bij CML t(11;14) en t(14;18) bij lymfomen (MCL/FL)
– opsporen van (onco-) gen overexpressie: WT1-overexpressie bij acute leukemieën
– opsporen van mutaties: NPM1 en FLT3 bij AML JAK2V617F bij MPN
– opsporen van klonale genherschikkingen: TCR en Ig genherschikkingen bij lymfomen
DEEL I: moleculaire diagnostiek bij ACUTE LEUKEMIEËN Belang diagnose, prognose en follow-up !
Verworven genetische afwijkingen: fusiegenen • Chromosomale translocatie geeft aanleiding tot ontstaan van een nieuw gen = fusiegen: opgebouwd uit coderende regio’s van beide chromosomen • Identificatie van fusiegenen: herschikking van genetisch materiaal tgv. structurele defecten resulteert in de vorming van fusiegenen (PML-RARA, TEL-AML1, etc.) Vb. inv(16) ⇨MYH 11/CBFβ
Causaal verband tussen expressie van dit gen en neoplasie (?)
Ziekte-specifiek RNA versus DNA Aanwezigheid degraderende enzymes DNase relatief instabiel/inactief RNase heel stabiel / renatureert na autoclaveren, zit op vingertoppen Bij lyse, sterven cel: RNasen actief
DNA stabiel in klinische stalen RNA niet stabiel in klinische stalen Beide kunnen geïsoleerd worden uit lichaamsvloeistoffen; verse en paraffine ingebedde weefsels
Screening fusiegenen bij nieuwe acute leukemie: Bepaling op RNA
Meestal ziekte-specifiek RNA Waarom?
genexpressie is abnormaal in neoplastische cellen, soms mede ten gevolgen van genomische afwijkingen
meer (m)RNA Betere gevoeligheid Waggot et al. Blood, 90 , 1997: 1712-1713
NIEUWE DIAGNOSE ACUTE LEUKEMIE ‘Verfijning’ van de diagnostiek Bloedstaal voor: Klinische biologie PCR
Flowcytometrie
CMGG Karyotypering
FISH
Na/Li-heparine buis
EDTA Geen heparine: werkt inhiberend op PCR
Staalname en transport CMD
• • • • •
Bij voorkeur beenmerg Perifeer bloed indien voldoende blasten perifeer EDTA bloed APARTE BUIS: cfr. Stabiliteit RNA Speciaal blauw aanvraagformulier met vermelding klinische info (‘leukemie’) • Buis moet binnen de 24h na afname naar CMD gezien het belang van de pre-analytische fase • Op die manier isolatie WBC zeker binnen 48h na staalname
Leukemie protocol Breed screenen met een kwalitatieve multiplex RTPCR bij diagnose (beenmerg of perifeer bloed) f tie
Po sit
ga
ief
ne STOP uitwerking tranlocaties
hernemen met specifieke real-time PCR voor overeenkomend gevonden fusiegen
Follow-up mogelijk m.b.v. specifieke real-time PCR van het gevonden fusietranscript
f
Po
Follow-up met realtime PCR WT1
Mutatie FLT3 en NPM1
tie ga ne
Kwantitatieve waarde gevonden fusietranscript bij diagnose
sit ief
WT1- overexpressie
Geen verdere moleculaire follow-up mogelijk
Prognostische merkers
Screening translocaties leukemie HemaVisionTM is een kwalitatieve multiplex RT-PCR test ontwikkeld om 28 verschillende translocaties of chromosomale herschikkingen, inclusief meer dan 80 breekpunten of splice variants, te detecteren , die specifiek voorkomen bij acute en chronische leukemie t(1;11)(p32;q23) MLL/AF1p, t(1;19)(q23;p13)E2A/PBX1, t(3;5)(q25.1;q34)NPM/MLF1, t(5;12)(q33;p13) TEL/PDGFRb, t(6:11)(q27;q23) MLL/AF6, t(8;21)(q22;q22)AML1/MGT8, t(9;12)(q34;p13) TEL/ABL, t(9;9)(q34;q34)SET/CAN, t(11;17)(q23;q21)MLL/AF17, t(11;19)(q23;p13.1) MLL/ELL, t(12;21)(p13;q22)TEL/AML1, t(15;17)(q22;q21)PML/ RARa , t(17;19)(q22;p13) E2A/HLF, t(X;11)(q13;q23)MLL/AFX,
t(1;11)(q21;q23)MLL/AF1q, t(3;21)(q26;q22)AML/EAP/MDS/EVI1, t(4;11)(q21;q23)MLL/AF4, t(5;17)(q35;q21)NPM/RARa, t(6;9)(p23;q34)DEK/CAN, t(9;11)(q22;q23) MLL/AF9, t(9;22)(q34;q11)BCR/ABL, t(10;11)(p12;q23)MLL/AF10, t(11;17)(q23;q21) PLZF/RARa, t(11;19)(q23;p13.3) MLL/ENL, t(12;22)(p13;q11) TEL/MN1, t(16;21)(q11;q22)TLS/ERG, inv(16)(p13;q22)CBFb/MYH11, TAL1deletion(p34)SIL/TAL1
Screening translocaties leukemie
Pallisgaard et al, Blood 98: 574-588
Strehl et al., Blood 97:805-8 (2001)
Genetische diversiteit/ voorkomen fusiegenen bij AML
Rol cytogenetische afwijkingen (fusiegenen, mutaties) bij prognose Disease-free survival according to cytogenetics at diagnosis
Ferrara et al., Crit review Onco/Hematol 2007
Translocaties in acute lymfatische leukemie
Pui et al., NEJM 350:1535-1548 (2004)
Prognostisch belang van translocaties in acute lymfatische leukemie
Pui et al., NEJM 350:1535-1548 (2004)
Belang detectie fusietranscripten bij follow-up Real-time PCR kwantificatie van fusietranscripten bij leukemie is relevant voor de follow-up and detectie van minimale residuele ziekte of MRD
BELANG gevoelige detectie en kwantificatie ‘minimal residual disease’ (MRD):
Follow-up BELANG gevoelige detectie ‘minimal residual disease’ (MRD): kwantitatieve real-time PCR • sensitiviteit: >> FISH • 10-4 – 10-5
serial molecular monitoring
Nashed et al., J. Mol. Diag. 5:63-72 (2003)
MRD BELANG detectie en kwantificatie ‘minimal residual disease’ (MRD):
monitoring respons op therapie detectie vroege relaps relatie MRD resultaten en klinisch ziekteverloop (outcome) risk assessment (voorspellende waarde fusietranscript levels) kwantitatieve RT-PCR fusietranscripten beperkt (25% van de AML patiënten)
Continue monitoring/follow up
Bepaling fusiegen expressie met kwantitatieve ‘real-time’ RT-PCR EAC protocol LEADING ARTICLE: “Standardization and quality control studies of ‘real-time’ quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction of fusion gene transcripts for residual disease detection in leukemia” – A Europe Against Cancer Program J Gabert, E Beillard, VHJ van der Velden, W Bi, D Grimwade, N Pallisgaard, G Barbany, G Cazzaniga, JM Cayuela, H Cave, F Pane, JLE Aerts, D De Micheli, X Thirion, V Pradel, M Gonza´lez, S Viehmann,M Malec, G Saglio and JJM van Dongen
Leukemia 2003
Kwantificatie Standaardisatie
Overzicht belangrijkste fusiegenen waarvoor kwantitatieve opvolging Translocatie
Fusiegen
Voorkomen
Prognose
t(9;22) (q34;q11)
ABL/BCR: p190 en p210
Pre B-cel ALL: 25-30% volwassenen; 2-5% kinderen
Slechte prognose
t(8;21) (q22;q22)
ETO/AML1
AML: 5-12 %, AML M2: 30 %
Goede prognose
t(4;11) (q21;q23)
V/MLL 11q23 abnormaliteiten
5% pre B-cel ALL Meest frequente 11q23 abnormaliteit bij pre B-ALL
Slechte prognose
t(9;11) (p22;q23)
MLL-AF9
Precursor B-cel ALL 11q23: 5-6 % van AML (M4-5)
Intermediaire prognose
t(12;21)(q12;q22)
TEL/AML-1
25% pre B-ALL bij kinderen
Goede prognose
inv(16) (p13;q22)
MYH11/CBFbeta
8-12 % van AML, zeer hoge associatie met AML M4 eos
Goede prognose
t(1;19) (q23;p13)
E2A-PBX1
3-5% kinderen - 3% volwassen ALL
prognose controversieel
t(15;17)(q22;q21)
PML/RARalfa
5-8 % van AML, associatie met AML M3: > 95%
Goede prognose
Overzicht fusiegenen: kwalitatieve PCR
Translocatie
Voorkomen
Voorkomen
Prognose
t(6;9) (p23;q34)
DEK/CAN
1% AML
Slechte prognose
t(1;22)(p13;q13)
OTT-MAL
AML bij kinderen: AML M7 of megakaryoblaste n leukemie zelden
Slechte prognose
HOX11L2 expressie
t(5;14)(35;32
T-ALL
Slechte prognose
Microdeletie 1p32
SIL-TAL
5-25% T-ALL
? controversieel
Moleculaire testen CMD UZ Gent – opsporen van fusiegen (-expressie): PML-RARA, TEL-AML, AML-ETO,.... bij acute leukemieën BCR-ABL bij CML
– opsporen van (onco-) gen overexpressie: WT1-overexpressie bij acute leukemieën
– opsporen van mutaties: NPM1 en FLT3 bij AML JAK2V617F bij MPN
– opsporen van klonale genherschikkingen: TCR en Ig genherschikkingen bij lymfomen
Leukemie protocol Breed screenen met een kwalitatieve multiplex RTPCR bij diagnose (beenmerg of perifeer bloed) f tie
Po sit
ga
ief
ne STOP uitwerking tranlocaties
hernemen met specifieke real-time PCR voor overeenkomend gevonden fusiegen
Follow-up mogelijk m.b.v. specifieke real-time PCR van het gevonden fusietranscript
f
Po
Follow-up met realtime PCR WT1
Mutatie FLT3 en NPM1
tie ga ne
Kwantitatieve waarde gevonden fusietranscript bij diagnose
sit ief
WT1- overexpressie
Geen verdere moleculaire follow-up mogelijk
Prognostische merkers
Wt-1 overexpressie • Overexpressie Wilms tumour gene 1 (WT1) in leukocyten bij de meeste AML patiënten (~80%): pan-leukemische merker. • Klinische relevantie bepaling WT1 genexpressie voor MRD wordt in vraag gesteld • Geen prognostische waarde • Gevoeligheid WT1 als MRD merker is beperkt door de relatieve hoge achtergrond WT1 expressie in BM cellen bij patienten in remissie en gezonde individuen (geen hematologische maligniteit)
Bepaling WT1 gen expressie enkel nuttig voor followup patiënten zonder een meer specifieke en sensitieve MRD merker (fusiegen)
AML prognostic markers Mutations
overexpression
Flt3 ITD
40%
Adverse
BAALC
Adverse
NPM1
46-62%
Favorable
ERG
Adverse
MLL PTD
8-11%
Adverse
EVI1
CEBPa
15-19%
Favorable
MN1
N-RAS
9%
Unclear
WT1
80-90%
Adverse
PRANG
30-60%
Favorable
K-RAS
14%
Adverse Adverse
WT1
10%
Adverse?
PHAM/ALM 70%
Favorable
cKIT
25-30% CBFBAML
Adverse
Total microRNA
Adverse
miR181a
Favorable
PU-1
‘MOLECULAR PROGNOSTIC SCORE’
NPM1 en FLT3-ITD mutaties Incidentie NPM1 mutaties:
NPM1+ = goede prognose
- 25-35% van de AML - 50%-60% AML met normaal karyotype
Incidentie FLT3-ITD:
FLT-ITD = slechte prognose
25% < AML; hogere incidentie (40%) in NMP1+ AML
Gallagher, R. E. Blood 2005;106:3681-3682
DEEL II: moleculaire diagnostiek bij CML
Belang fusietranscript BCR-ABL a.d.h.v. een casus
Casus presentatie • man, 51 jaar • doorverwijzing huisarts wegens aanhoudende leukocytose • kliniek: - splenomegalie (miltdiameter 14cm) - geen adenopathie
Casus bloedwaarden Rode bloedcellen Hemoblobine Hematocriet MCV MCH MCHC RDW WBC PLT LDH urinezuur CRP
-
2.80 * 106 /µL 9.3 g/dL 28.2 % 97 fL 33.2 pg/cel 33.0 g/dL RBC + 17.7 % ++ 225 * 103 /µL 169 * 103 /µL + 2268 U/L + 8 mg/dL + 1.7 mg/dL
4.35 – 5.87 13.3 – 17.7 39.8 – 52.2 80.5 – 99.7 26.6 – 33.8 33 - 36 11.1 – 14.2 4 - 10 136 - 370 231 - 462 3.4 – 7 0 – 0.5
normocytaire anemie forse leukocytose geen trombopenie/trombocytose
CASUS morfologie PERIFEER
• opvallende hyperleukocytose • meerderheid segmenten maar ook myeloïde voorlopers (voornamelijk myelocyten) • blasten (<2%)
CASUS
morfologie
PERIFEER eosinofielen
normoblast basofiel
CASUS morfologie BEENMERG
hypercelrijk beenmerg/mergbrokjes
laag normaal aantal megakaryocyten
met een gestegen M/E verhouding
morfologie megakaryocyten: - kleinere - hypolobulaire/monolobulaire hoog normale eosinofilie
CASUS morfologie
BESLUIT MORFOLOGIE Beeld passend bij een chronisch myeloproliferatief proces; best passend bij CML in chronische fase. Te confirmeren met moleculaire diagnostiek.
‘Verfijning’ van de diagnostiek
Vermoeden nieuwe CML ‘Verfijning’ van de diagnostiek Bloedstaal voor: CMD PCR
CMGG Karyotypering
FISH
Na/Li-heparine buis
EDTA Geen heparine: werkt inhiberend
Staalname en transport CMD
• • • •
PERIFEER BLOED is voldoende EDTA bloed APARTE BUIS: cfr. Stabiliteit RNA Speciaal blauw aanvraagformulier met vermelding klinische info (‘nieuwe diagnose CML’ of ‘CML?’) • Buis moet binnen de 24h na afname naar CMD gezien het belang van de pre-analytische fase • Op die manier isolatie WBC zeker binnen 48h na staalname
CASUS
moleculair/(cyto)genetica
Enige CMPD die geassocieerd is met een ‘specifieke’ genetische afwijking: > 95% t(9;22)(q34;q11)
Gerelateerd aan pathogenese !
CASUS t(9;22)(q34;q11)
(cyto)genetica
Philadelphia chromosoom
kayotypering (CMG)
abnormaal karyotype bij patient:
46,XY,t(9;22)(q34;q11)[30]
BCR/ABL fusiegen
metafase FISH (CMG) BCR ABL
resultaat patiënt:
der(9)
99% van de onderzochte kernen positief voor t(9;22)
der(22) (Ph)
22
9
Bepaling fusiegen expressie met kwantitatieve ‘real-time’ RT-PCR EAC protocol LEADING ARTICLE: “Standardization and quality control studies of ‘real-time’ quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction of fusion gene transcripts for residual disease detection in leukemia” – A Europe Against Cancer Program J Gabert, E Beillard, VHJ van der Velden, W Bi, D Grimwade, N Pallisgaard, G Barbany, G Cazzaniga, JM Cayuela, H Cave, F Pane, JLE Aerts, D De Micheli, X Thirion, V Pradel, M Gonza´lez, S Viehmann,M Malec, G Saglio and JJM van Dongen
Leukemia 2003
Kwantificatie Standaardisatie
CASUS MOLECULAIR
genoom/DNA
ALL
mRNA
CML
Nashed et al., J. Mol. Diag. 5:63-72 (2003)
M-Bcr = ‘major’ breakpoint cluster region m-Bcr = ‘minor’ breakpoint cluster region
PCR BCR-ABL • Methode volgens gestandaardiseerd EAC protocol • real-time RT-PCR die de frequente junctietypes (b2a2/b3a2 bij p210 en e1a2 bij p190) detecteert. Andere zeldzame junctietypes worden niet opgespoord. • FISH steeds uitvoeren bij diagnose indien sterk vermoeden BCR-ABL en negatieve PCR
Voorspellende waarde ‘major molecular response’ (MMR) onder imatinib mesylaat (Glivec)
MMR
A best molecular response of at least a 3-log reduction in BCRABL mRNA levels predicts better progression-free survival. Kaplan-Meier survival curve is shown for patients achieving a best RQ-PCR level (at any time) above various thresholds. The panel compares patients with a best molecular response of at least 3 versus those below 3. These are landmark analyses starting at the time of CCR. RD Press et al, Blood, June 2006 (4250)
Moleculaire follow-up st Progression-free Progression-freeSurvival Survivalon on11st-line -lineImatinib Imatinibby byMolecular MolecularResponse Response(MR) (MR)at at12 12months months
100 % without progression
90 80 70 60 50 40 30 20 10
estimated rate of survival without progression at 42 months: No CCyR <3 log reduction >=3 log reduction
n=138 n=94 n=136
75% PFS 90% PFS
98% PFS
0 0 3 6 9 12 15 18 21 24 27 30 33 36 39 42 45 48 51
Months since randomization IRIS Study,update 2004
MMR Recommendation of European LeukemiaNet: incorporating molecular responses at 6, 12 and 18 months based on analysis ot the IRIS PCR data Evaluation Time
Optimal
Suboptimal
Failure
3 months
CHR and at least minor CR (Ph+ ≤ 65%)
No CHR
No HR
6 months
At least partial CR (Ph+ ≤ 35%)
No partial CR (Ph+ > 35%) and/or BCR-ABL (IS) > 10%
No CHR No CR (Ph+ > 95%)
12 months
CCR
No CCR (Ph+ > 1%) and/or BCR-ABL (IS) > 1%
No partial CR (Ph+ > 35%) and/or BCR-ABL (IS) > 10%
18 months
MMR (≤ 0.1%)
No MMR (≤ 0.1%)
No CCR (Ph+ > 1%) and/or BCR-ABL (IS) > 1%
Baccarani et al., J Clin Oncol 2009 ASH 2009
Opvolging genormaliseerde ratio BCR-ABL (%) bij patiënt casus Ratio BCR-ABL/ABL (%) perifeer bloed KARYO: + FISH: +
1000,00000%
Diagnose
100,00000%
KARYO: FISH: -
10,00000%
Ratio BCR-ABL / ABL (%)
8 maand
1,00000%
14 maand 20 maand
0,10000% 0,01000%
4j 1m 3j 1m
4j 7m 5j 5m
start Glivec: 400 mg/dag
4j 7m
4j 1m
3j 1m
2j 2m
aa nd m
20
m 14
m
aa nd
aa nd
2j 2m
8
Di a
gn os e
0,00010%
5j 5m
0,00100%
DEEL III: JAK2V617F mutatie
Belang mutatiescreening bij chronisch myeloproliferatieve aandoeningen (MPN)
JAK2V617F mutatie verworven puntmutatie chrom 9 exon 14; G naar T op codon 617 => Valine naar phenylalanine
Involvement of Janus Kinases in Cytokine Signal Transduction (Panel A) and Structural Map of Janus Kinase 2 (Panel B)
2005: first reports by 4 groups gain-of-function point, resulting in a constitutive tyrosine phosphorylation activity -> cytokine-independent activation of JAK-STAT pathway proliferative and survival advantage to affected hematopoietic precursors
stimulatie erythropoïese zonder groeifactoren zoals EPO Goldman JM, NEJM 2005
Klinisch belang JAK2V617F DIAGNOSTISCHE WAARDE: ! Belangrijke moleculaire merker bij diagnose van BCR-ABL negatieve chronische myeloproliferatieve aandoeningen; heterogene groep met vaak complexe histologische diagnose JAK2 tijdperk: veel vereenvoudigd simpele en relatief goedkope assay Ziekte van Vaquez of polycythemia vera (PV): >95% JAK2V617F positief Essentiële thrombocytemie (ET): ~50% positief Primaire myelofibrose (PMF): ~50% positief
100% specifiek voor klonale aandoening Geen onderscheid mogelijk tussen de verschillende MPD
Klinisch belang JAK2V617F Revised WHO 2008: Presence of JAK2V617F = ‘major’ diagnostic criterion
Klinisch belang JAK2V617F PROGNOSE MUTATIESTATUS: ET patienten: verschillende studies tonen een prognostische waarde JAK2V617F MUTATIESTATUS (Vannucchi et al, Leukemia 2008): JAK2V617F + ET: hoger Hb and WBC, lager PLT aantal, verhoogd risico op PV transformatie !!! Meeste reports: associatie met veneuze trombosen, maar controversieel
Belang KWANTITATIEVE resultaten: • Verschillende JAK2V617F allele burden (%) tussen MPN categorieën • Associatie proportie mutante JAK2 allelen en fenotype, ziekteprogressie en risico op tromobose MAAR meer studies vereist • Mogelijkheid tot follow-up en opvolging JAK2V617F targeted therapy/JAK2 inhibitors (toekomst)
Vermoeden MPN • Opvallende polycythemie, met normale O2 saturatie • Trombocytose • Leukocytose ‘Verfijning’ van de diagnostiek Bloedstaal voor CMD (beenmerg niet nodig)
PCR t(9;22) of BCR-ABL bij leukocytose en vermoeden CML
OF
Mutatie JAK2V617F bij polycythemie en trombocytose
Andere mutaties • MPL mutaties – ‘myeloproliferatieve leukemie virus’ gen – codeert voor een trombopoïetine receptor (TPO) – Trombopoïetine (TPO) en MPL-receptor reguleren de productie van trombocyten – Meest voorkomende mutatie: MPLW515L en MPLW515K – 5% van PMF en 1% ET
• JAK2 exon 12 mutaties – Reeds meer dan 12 verschillende beschreven – JAK2V617F negatieve PV-patiënten (3-5%)
DEEL IV: moleculaire diagnostiek bij LYMFOMEN Wanneer PCR nodig? Belang diagnose en follow-up ?
Moleculaire testen CMD UZ Gent – opsporen van fusiegen (-expressie): PML-RARA, TEL-AML, AML-ETO,.... bij acute leukemieën BCR-ABL bij CML t(11;14) en t(14;18) bij lymfomen (MCL/FL)
– opsporen van (onco-) gen overexpressie: WT1-overexpressie bij acute leukemieën
– opsporen van mutaties: NPM1 en FLT3 bij AML JAK2V617F bij MPN
– opsporen van klonale genherschikkingen: TCR en Ig genherschikkingen bij lymfomen
Ig en TCR genherschikking
Basis diversiteit immuunreceptoren Basis klonaliteit: unieke genherschikking binnen maligniteiten
PCR gebaseerde klonaliteit
BIOMED-2 protocol Multiplex PCR Verbetering sensitiviteit Gestandaardiseerd protocol: betere inter-lab vergelijking
PCR gebaseerde klonaliteit
• Consensus primers, targeting framework regions (FR) of V and J gene-segments; FR flank complementary determining regions (CDR) • CDR3 variability results of both from gene-segment diversity and nucleotide removal or addition • in frame rearrangements differ 3 base-pares
Multiplex BIOMED-2 PCR TCR Vβ
Dβ
Jβ
Vβ family primers
Jβ primers
TCRB tubes A and B 5'
3' AACTATGTTTTGGTATCGTCA CACGATGTTCTGGTACCGTCAGCA CAGTGTGTCCTGGTACCAACAG AACCCTTTATTGGTACCGACA ATCCCTTTTTTGGTACCAACAG AACCCTTTATTGGTATCAACAG CGCTATGTATTGGTACAAGCA CTCCCGTTTTCTGGTACAGACAGAC CGCTATGTATTGGTATAAACAG TTATGTTTACTGGTATCGTAAGAAGC CAAAATGTACTGGTATCAACAA ATACATGTACTGGTATCGACAAGAC GGCCATGTACTGGTATAGACAAG GTATATGTCCTGGTATCGACAAGA TAACCTTTATTGGTATCGACGTGT GGCCATGTACTGGTACCGACA TCATGTTTACTGGTATCGGCAG TTATGTTTATTGGTATCAACAGAATCA CAACCTATACTGGTACCGACA TACCCTTTACTGGTACCGGCAG ATACTTCTATTGGTACAGACAAATCT CACGGTCTACTGGTACCAGCA CGTCATGTACTGGTACCAGCA
Vβ2 Vβ4 Vβ1/5 Vβ6a/11 Vβ6b/25 Vβ6c Vβ7 Vβ8a Vβ9 Vβ10 Vβ11 Vβ3/12a/13a/15 Vβ13b Vβ12b/13c/14 Vβ16 Vβ17 Vβ18 Vβ19 Vβ20 Vβ21 Vβ22 Vβ8b/23 Vβ24
TCRB tubes A and C: Jβ A primers 3' 5' GTGGTCTAAGTGTCAACATCCATTC (+53) CTGGTCCAATTGGCAACATCCATTC (+53)
Jβ1.2
TTCAACCGAGTGACAACATCCATTC
(+55)
Jβ1.3
CTTGGGTCGAGAGACAGAACCCATAC
(+56)
Jβ1.4
CTGAGCTGAGAGGTAGGATCCATTC
(+55)
Jβ1.5
GTCCGAGTGACACTGTCCATAC
(+58)
Jβ1.6
TCCGACTGGCATGACCCATTC
(+56)
Jβ2.2
TCCGACTGGCACGACCCGCTC
(+58)
Jβ2.6
GTCCGAGTGCCAATGTCCATTC
(+52)
Jβ2.7
TCRB tubes B and C: Jβ B primers 3' AGTGGCACGATCCATTCTTCC
5' (+59)
Jβ2.1
ACTGTCACGAGCCATTCGCCC
(+58)
Jβ2.3
AGAGTCACGACCCATTCGACC
(+59)
Jβ2.4
CACGAGCCACACGCGC
(+57)
Jβ2.5
Dβ Dβ1 primer
Jβ1.1
Dβ2 primer
Jβ Jβ primers
TCRB tube C Dβ1
(-252)
5' 3' GCCAAACAGCCTTACAAAGAC
Dβ2
(-137)
5' 3' TTTCCAAGCCCCACACAGTC
BIOMED-2 report: Leukemia 2003; 17: 2257-2317
Multiplex BIOMED-2 PCR IgH
Detectie klonaliteit in B-cel maligniteiten IGH
IGK
all IGH
DH-JH
VH-JH
DH-JH
VH-JH +DH-JH
Vκ-Jκ
Kde
Vκ-Jκ + Kde
+ IGK
+ Kde*
100%
11%
100%
94%
75%
100%
100%
78%
B-CLL/SLL (n=56) 100%
43%
100%
96%
61%
100%
100%
73%
FL (n=109)
84%
19%
86%
63%
59%
84%
100%
64%
MZL (n=41)
88%
51%
95%
68%
54%
83%
100%
68%
DLBCL (n=109)
79%
30%
85%
61%
58%
80%
98%
72%
TOTAL (n=369)
88%
28%
91%
73%
60%
88%
99%
70%
MCL (n=54)
* Combination of two Ig gene rearrangements without somatic mutations
BIOMED-2 B-cell malignancy report: PAS Evans et al, Leukemia 2007;21:207-241
Detectie klonaliteit in T-cel maligniteiten Vβ-Jβ
TCRB Dβ-Jβ
T-PLL (n=33)
94%
47%
100%
94%
100%
T-LGL (n=28)
86%
62%
96%
96%
100%
PTCL-U (n=47)
85%
67%
98%
94%
100%
AILT (n=37)
70%
61%
89%
92%
95%
ALCL (n=43)
70%
48%
74%
74%
79%*
TOTAL (n=188)
80%
58%
91%
89%
94%* (99%)
Vβ-Jβ + Dβ-Jβ
TCRG Vγ-Jγ
TCRB + TCRG
* 20% to 25 % of anaplastic large cell lymphomas do not have TCR gene rearrangements (null-ALCL) BIOMED-2 T-cell malignancy report: M. Brüggemann et al, Leukemia 2007;21:215-221
VOORDELEN PCR-gebaseerde klonaliteitsanalyse • Hoge klinische gevoeligheid (zie voorgaande tabellen) • Moleculaire diagnostiek vaak niet eerste lijn in de diagnostische uitwerking; vaak geen vers materiaal meer beschikbaar • Gefixeerd materiaal / paraffinecoupes nog bruikbaar voor PCR applicaties – CAVE belang fixatie protocol, waardoor beschadiging nucleïnezuren (gefragmenteerd); afh. Best gebufferde formol (4%) en minder dan 24h fixatieduur
NADELEN PCR-gebaseerde klonaliteitsanalyse • • • •
Complex Interpretatie vaak moeilijk Veel pitfalls Analyse vereist voldoende kwalitatief (niet gefragmenteerd) DNA; – niet altijd mogelijk op paraffinecoupes – Pseudoklonaliteit door preferentiële amplificatie bepaalde herschikkinge
• Vals negativiteit mogelijk: zeldzame herschikkingen, somatische hypermutatie
EXPERTISE VEREIST !
Toepassingen • DIAGNOSE – Histopathologische DD maligniteit vs reactief beeld: op vers en paraffine materiaal – B-cel maligniteiten: uitwerking vermoeden klonaliteit met flowcytometrie (niet altijd duidelijk) – T-NHL: uitwerking aberrant fenotype gevonden met flowcytometrie
• STAGING • Klonale verwantschap: klonaal verband aantonen tussen verschillende lymfoproliferatieve letsels of in geval van relapse? Secundaire tumor?
Vermoeden lymfoproliferatieve aandoening ‘Verfijning’ van de diagnostiek Bloedstaal voor: Klinische biologie UZ Gent
Flowcytometrie:
B-cel: bepaling mKappa / mLambda expressie T-cel: aantonen aberrante populatie (weinig specifiek)
PCR TCR genherschikking PCR
OF/EN
Ig genherschikking PCR
Mantelcellymfoom • t(11;14)(q13;q32) of BCL1-IGH = genetic hallmark • Overexpressie van cycline D1 (rol controle celcyclus) • Geen abnormaal fusieproteïne gevormd • PCR op DNA volgens BIOMED-2 protocol
PCR t(11;14) • De
gouden standaard = interphase FISH detectie alle mogelijke breekpunten door gebruik te maken van ‘breakpoint-flanking probes’
• De PCR-gebaseerde detectiemethode maakt gebruik van een primer in het uiterste 5’ gebied van de BCL1-MTC (85 bp regio) zodat ~ 40% van de breekpunten gedetecteerd kunnen worden. – diagnostische klinische gevoeligheid beperkt (hoog % vals-negatieve t.o.v. FISH), – Wel analytisch gevoelig: indien positief, nuttig voor MRD analyse.
BIOMED-2 protocol
Folliculair lymfoom • t(14;18)(q32;q21) of BCL2-IGH is karakteristiek • Frequentie varieert wel binnen de groep: – Graad 1 en 2: 85-90% – Graag 3a: 75% – Graad 3b: 10-15%
• Geen abnormaal fusieproteïne gevormd • PCR op DNA volgens BIOMED-2 protocol
PCR t(14;18) • De
gouden standaard = interphase FISH detectie zo goed als alle mogelijke breekpunten
• De PCR-gebaseerde detectiemethode; 3 sets van primers (MBR, 3’MBR en mcr) zodat ~ 60% van de breekpunten gedetecteerd kunnen worden. – diagnostische klinische gevoeligheid beperkt (hoog % vals-negatieve t.o.v. FISH), – Wel analytisch gevoelig: indien positief, nuttig voor MRD analyse. BIOMED-2 protocol
Vermoeden MCL of FL ‘Verfijning’ van de diagnostiek Bloedstaal voor: Klinische biologie PCR
Flowcytometrie
CMGG Karyotypering
FISH op celsuspensie Geen karyotypering meer!
FISH
