VÝZKUMNÝ ÚSTAV ROSTLINNÉ VÝROBY, V.V.I.
Určování háďátek Xiphinema diversicaudatum a X. vuittenezi pomocí polymerázové řetězové reakce
Metodika pro praxi
Shesh Kumari Praha, 2008
Určování háďátek Xiphinema diversicaudatum a X. vuittenezi pomocí polymerázové řetězové reakce
Ing. Shesh Kumari, Ph.D. Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i. Odbor rostlinolékařství Drnovská 507, Ruzyně 16106 Praha 6 Česká republika Email:
[email protected]
VÚRV, v.v.i., Praha 2008
Tato publikace vznikla s podporou grantu MZe 0002700603
© Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i., 2008
ISBN: 978-80-87011-98-0
Metodika je určena pro Státní rostlinolékařskou správu. Bude využita pro molekulární identifikace háďátek druhu X. diversicaudatum a X. vuittenezi.
Oponenti: Ing. Vladimír Gaar
Ing. Petr Svoboda, CSc.
Státní rostlinolékařská správa Diagnostická laboratoř Praha Drnovská 507, Ruzyně 161 06 Praha 6
Chmelařský Institut s.r.o. Kadaňská 2525, Žatec 438 46
Metodika byla schválena MZe ČR pod č.j. 47822/2008-18020
Obsah 1
Cíl metodiky.......................................................................................... 1
2
Morfologické a morfometrické metody ............................................. 1
3
2.1
Úvod ................................................................................................................. 1
2.2
Obecná charakteristika rodu Xiphinema ........................................................... 2
2.3
Stručný popis Xiphinema diversicaudatum ...................................................... 4
2.4
Stručný popis Xiphinema vuittenezi.................................................................. 9
Molekulární metodika ....................................................................... 13 3.1
Extrakce DNA ............................................................................................... 13
3.2
Pre-PCR .......................................................................................................... 15
3.3
PCR................................................................................................................. 20
3.4
Post-PCR......................................................................................................... 21
4
Výsledky elektroforézy ...................................................................... 24
5
Srovnání ″novosti postupů″.............................................................. 25
6
Závěr.................................................................................................... 25
7
Literatura............................................................................................ 27
8
7.1
Použitá literatura ............................................................................................. 27
7.2
Původní poznatky VÚRV, v.v.i. k PCR ......................................................... 29
7.3
Původní poznatky ze světa k PCR .................................................................. 29
Přílohy ................................................................................................. 30 8.1
Jak se vyhnout PCR kontaminaci ................................................................... 30
8.2
Přepočty .......................................................................................................... 32
8.3
Potřebné věci .................................................................................................. 34
8.4
Referenční materiál......................................................................................... 36
1 Cíl metodiky Hlavním cílem této práce je rychlá identifikace druhů háďátek X. diversicaudatum a X. vuittenezi pomocí spolehlivé, specifické a selektivní metody polymerázové řetězové reakce (PCR).
2 Morfologické a morfometrické metody 2.1 Úvod Fytoparazitická háďátka rodu Xiphinema (Nematoda: Longidoridae) způsobují přímé škody rostlin napadením jejich kořenových buněk. Některé druhy jsou i přenašeči nepovirů a jsou ekonomicky významné (Taylor and Brown 1997), proto rod Xiphinema postupně dostává větší taxonomickou pozornost. Nárůst počtu nových druhů, z nichž je mnoho morfologicky a morfometricky podobných, zdůrazňuje potřebu dalšího precizního zkoumání a diagnostické charakteristiky. Nutnost přesné identifikace druhů je klíčová pro studia jejich škodlivosti, vztahu virus-vektor a efektivní kontrolu. Identifikace druhů Xiphinema je založena hlavně na morfologických znacích a morfometrických datech samiček (Loof a Luc, 1990; 1993; Loof a kol., 1996). Druhy Xiphinema je taxonomicky těžké identifikovat i pro zkušeného nematologa, protože morfologické a morfometrické hodnoty jednotlivých druhů se silně překrývají. Kromě toho se jedna populace může skládat z více druhů. Navíc, jestliže jsou v půdních vzorcích nalezeny pouze larvy, může být mikroskopická identifikace problematická. Poměrně nová studia (Wang a kol., 2003; Oliveira a kol., 2005) mají velký potenciál pro molekulární identifikace druhů Xiphinema. Wang a kol. (2003) navrhovali druhově specifické primery pro čtyři druhy rodu Xipinema a pomocí polymerázové řetězové reakce (PCR) je úspěšně aplikovali pro identifikaci druhů X. diversicaudatum; X. index; X. italiae a X. vuittenezi. Ovšem pro běžnou praxi je optimalizovaná metoda PCR použitím jednotlivých chemikálií časově náročná, proto je v této metodice zpracována rychlá diagnostika háďátek druhů X. diversicaudatum a X. vuittenezi použitím PCR kuliček (PCR-beads). Ačkoli bylo dokázáno, že pro rutinní identifikaci fytoparazitických háďátek je základní diagnostika DNA rychlejší než tradiční strategie použití morfologie a morfometrických hodnot (Wang a kol., 2003; Oliveira a kol., 2005), je morfologická identifikace dosud nezbytným předpokladem pro základní diagnostiku DNA. Kombinace molekulárních a morfologických studií může být nejspolehlivějším přístupem pro identifikaci druhů Xiphinema. Proto je v této metodice také prezentován krátký popis dvou druhů.
1
2.2 Obecná charakteristika rodu Xiphinema Kmen Nematoda Třída Adenophorea Podtřída Enoplia Řád Dorylaimida Podřád Dorylaimina Nadčeleď Dorylaimoidea Čeleď Longidoridae Podčeleď Xiphineminae Rod Xiphinema Volně žijící fytofágní háďátka rodu Xiphinema (Cobb, 1913) jsou polyfágní a několik druhů je vektory nepovirů (Taylor a Brown, 1997). Tato dlouhá háďátka (1 až 6 cm) se odlišují od dalších parazitických háďátek dlouhým styletem od 89 m (X. lamberti) až po 336 m (X. filicaudatum), s vidlicovitým odontostyletem a odontoforem s patkami. Odontofor s bazálními křídly je rozlišujícím znakem rodu Xiphinema (obrázek 1). Odontostylet je spojen s cheilostomou epidermální, různě zahnutou membránou (vodicí prstenec). Dvojitý vodicí prstenec je umístěn na odontostyletu, těsně před jeho spojením s odontoforem. Amfidní póry mají širokou štěrbinu a amfidní váček je nálevkovitý. Hlavová část je kulatá nebo lehce zploštělá, navazuje na tělní obrys nebo je spojená se spojovacím článkem. Pysky jsou sloučeny, obvykle s uspořádáním papil v počtu 6 + 10. Dvoudílný jícen je typický pro Dorylaimida - užší přední trubicovitá část (která je obvykle jako smyčka, když je odontostylet ve stažené pozici) a zduřený žláznatý a svalnatý zadní bulbus. Jícnové žlázy jsou tři (dvě ventrosublaterální a jedna dorzální). Střevo je jednoduché, dobře vyvinuté prerektum je několikrát delší než šířka těla v oblasti anusu. Vulva se obvykle nachází ve středu párových gonád, občas se může nacházet před nebo za mediánem. Svalnatá vagina vedoucí k mohutnému ovijektoru leží v pravém úhlu k tělní ose a je dobře vyvinuta. Genitální trakty jsou typicky amfidelicky zahnuté, ale mohou být i pseudomonodelfické nebo mono-opistodelfické. Struktura gonád je často rozdílná, s charakteristickými rysy pro jednotlivé druhy. Samičky mohou mít jeden nebo dva vaječníky. Pokud se vyskytují oba vaječníky, jsou umístěny naproti sobě a zahnuty.
2
Obrázek 1 . Xiphinema. A: Přední část prvního larválního stadia; B: Přední část druhého až čtvrtého larválního stadia; C: Přední část samičky; D: Celkový tvar samečka; E: Celkový tvar samičky; F-M : Ocas samičky a samečka ( X. pachtaicum, X. vuittenezi, X. diversicaudatum a X. brevicollum). 1: Funkční stylet; 2: Náhradní stylet; 3: Odonstostylet; 4: Odontofor; 5: Vodící kroužek; 6: Bazální křídla; 7: Mukro; 8: Přídatné kopulační orgány. (částečně podle Kumari, 2005)
3
Genitální trakt samečků je diorchický, protikladný, zadní varle bývá zahnuto. Obě varlata jsou spojena společným chámovodem těsně před kloakou. Spikuly jsou dorylaimoidní, velké a párové. Kopulační svaly jsou šikmé a prominentní. Kopulační přídatné orgány jsou ve formě adanálních párů a poté ventromediální série pěti až deseti papil. Počet a uspořádání těchto papil má význam pro charakteristiku druhů. Samečci mají párové spikuly, ale nemají gubernákulum ani burzu. Tvar ocasu je rozdílný, ale většinou podobný u každého pohlaví. Ocas může být krátký, zaoblený ale i zúžený, kuželovitý, zřídka i nitkovitý.
2.3 Stručný popis Xiphinema diversicaudatum Obrázek 2; Tabulky 1 a 2 Samičky Teplem usmrcení jedinci Xiphinema diversicaudatum (Micoletzky, 1927) Thorne, 1939 jsou na ventrální straně zahnuti do otevřené spirály. Tělní pokožka je hladká, vnější vrstva užší než vnitřní. Hlavová část je malá, hladce zaoblená, spojená s tělním obrysem. Amfidy jsou třmínkovité, postlabiální, téměř stejně široké jako oblast pysků. Délka těla je 3,4-5,4 mm. Odontostylet je dlouhý 120-147 µm, na bázi zřetelně rozvětvený. Odonofor s nápadnými bazálními křídly měří 67-91 µm. Vodící kroužek měří 104-135 µm od předního konce. Nervový prstenec je malý a nachází se za odontoforem. Jícen je dorylaimoidní (dvoudílný jícen - užší trubicovitá přední část a zduřený žláznatý a svalnatý zadní bulbus). Jádro dorzální jícnové žlázy se nachází blízko předního konce jícnového bulbusu a subventrální žlázy blízko středu. Vulva ve tvaru příčné štěrbiny je umístěna ve 38-45% těla. Genitální trakt je amfidelický, zahnutý. Každý vejcovod a děloha jsou připojeny pomocí svěrače. Nápadný pseudo Zorgán je přítomen a skládá se z 10-20 nepravidelných, 3-10 µm dlouhých kulovitých orgánů podobných květáku. Prerektum je 7-12 krát delší než šířka těla. Rektum je kratší než šířka těla v oblasti anusu. Ocas je kuželovitý, dorzálně vypuklý, ventrálně poněkud zploštěný, zakončený s prstovitě zakulaceným, 7-14 µm dlouhým mukrem. U některých jedinců mukro chybí, což je pravděpodobně způsobeno mechanickým poškozením. 4
Obrázek 2: Xiphinema diversicaudatum. A-F Celá háďátka. A: Sameček; B: Samička; C: J4; D: J3; E: J2; F: J1. G: Zadní pohlavní větev (šipka znázorňuje Z-orgán); H: Bulbus jícnu samičky; I: Vulva; J: Přední část těla samičky; K: Ocas samičky bez mukra; L: Ocas samičky s mukrem; M: Ocas samečka; N: Ocas J1; O: Ocas J2; P: Ocas J3; Q: Ocas J4. ( podle Kumari, 2006) 5
Samečci Samečci se obvykle vyskytují ve stejném počtu jako samičky, reprodukce je amfimiktická. Tvar těla, hlavová část, odontostylet a jícen jsou popsány stejně jako u samiček. Dvě varlata jsou umístěna napravo od střeva, jedno je zepředu roztaženo, druhé zahnuto; chámovod je vyplněn vřetenovitými spermiemi. Kopulační přídatné orgány se skládají z jednoho adanálního páru a 3-7 párů na ventrální straně. V oblasti přídatných orgánů se nachází silné šikmé kopulační svaly způsobující silné zakřivení ocasu. Spikuly jsou 63-79 µm dlouhé, v blízkosti středu na ventrální straně zahnuté. Ocas je podobný jako u samiček, jen více zahnutý díky přítomnosti kopulačních svalů. Larvy Přední část těla se podobá dospělým jedincům, ale celkově jsou menší, a s trochu odlišnými rozměry. Čtyři larvální stadia jsou rozpoznány podle délky těla a podle funkčního a náhradního odontostyletu. Náhradní odontostylet je vždy přítomen na přední straně jícnu a v prvním stadiu jeho přední konec leží v odontoforu funkčního odontostyletu (viz obrázek 1). Délka náhradního odontostyletu jednoho stadia se shoduje s délkou funkčního odontostyletu dalšího stadia (viz Tabulka 1). Pouze larvy čtvrtého stadia mají ocas podobný dospělým jedincům, u dřívějších stádií je více zúžen s nezřetelným mukrem. První larvální stadium má prodloužený kuželovitý, na ventrální straně obloukovitě prohnutý ocas (obrázek 2).
6
Tabulka 1. Morfometrické hodnoty Xiphinema diversicaudatum . Všechny hodnoty jsou v µm ve formě: střední hodnota ± směrodatná odchylka (rozpětí) (podle Kumari 2006) Lokalita Bílé Podolí Hostitel višeň Jedinci J1 J2 J3 J4 ♀ ♂ ♀ (menší) n L a b c c΄ V/spikuly Náhradní stylet Odontostylet Odontofor Celková délka styletu Největší šířka křídel Vzdálenost od ústního otvoru po vodící kroužek Délka bulbusu jícnu Šířka bulbusu jícnu Délka ocasu Délka hyalinních pysků Průměr těla v oblasti pysků u vodícího kroužku na bázi jícnu u vulvy u anusu na počátku hyalinní části
7 6 18 14 22 1010 ± 81 1445 ± 90 2274 ± 210 3241 ± 349 4644 ± 369 (873-1102) (1320-1550) (1817-2559) (2636-3859) (3974-5484) 42,6 ± 2,80 43,0 ± 2,42 51,9 ± 4,15 59,6 ± 5,07 64,5 ± 3,25 (36,7-45,1) (39,6-45,6) (46,5-60,5) (52,0-71,2) (59,5-69,9) 4,1 ± 0,40 4,9 ± 0,29 5,9 ± 0,59 7,2 ± 0,76 9,5 ± 0,93 (3,4-4,6) (4,6-5,3) (4,9-7,1) (6,1-8,3) (7,8-11,4) 18,2 ± 1,14 23,6 ± 1,94 40,0 ± 5,91 61,5 ± 9,00 102,6 ± 8,95 (16,5-20,1) (20,6-26,3) (31,7-56,3) (48,0-78,8) (88,3-121,1) 3,64 ± 0,28 2,71 ± 0,32 1,84 ± 0,24 1,31 ± 0,13 0,88 ± 0,08 (3,36-4,07) (2,46-3,30) (1,40-2,21) (1,17-1,65) (0,73-1,02) — — — — 40,0 ± 1,49 (37,7-43,2) 67 ± 2,27 88 ± 5,05 111 ± 5,32 136 ± 4,99 — (62-69) (81-95) (97-118) (129-145) 51 ± 1,38 64 ± 1,17 87 ± 3,12 108 ± 4,26 132 ± 4,69 (49-52) (63-66) (81-93) (99-113) (123-138) 37 ± 1,90 46 ± 1,67 57 ± 2,06 69 ± 3,07 81 ± 3,11 (53-61) (63-73) (76-86) (34-39) (44-49) 87 ± 2,69 110 ± 2,32 144 ± 6,51 178 ± 5,87 213 ± 6,36 (83-90) (107-114) (125-154) (168-186) (200-224) 7 ± 0,58 9 ± 0,55 10 ± 0,99 11 ± 0,73 12 ± 0,75 (6-8) (8-9) (8-11) (10-13) (11-14) 41 ± 1,83 54 ± 4,13 79 ± 5,45 94 ± 8,17 120 ± 9,31 (39-44) (50-62) (69-93) (78-107) (104-135) 61 ± 5,19 72 ± 4,68 85 ± 5,18 96 ± 6,59 108 ± 6,62 (51-65) (64-76) (69-91) (83-109) (94-118) 14 ± 2,23 20 ± 1,83 24 ± 2,61 27 ± 2,83 32 ± 3,59 (12-18) (18-23) (18-28) (23-32) (26-40) 56 ± 4,47 62 ± 4,42 57 ± 5,07 53 ± 4,60 45 ± 4,19 (47-60) (55-66) (42-63) (48-61) (38-52) 9 ± 1,11 15 ± 2,28 19 ± 2,32 16 ± 1,79 16 ± 2,68 (7-10) (11-18) (14-23) (14-19) (11-21) 7 ± 0,53 8 ± 0,52 10 ± 0,84 11 ± 0,61 13 ± 0,75 (7-8) (8-9) (8-12) (10-12) (12-14) 16 ± 0,38 23 ± 1,94 29 ± 2,43 35 ± 3,20 45 ± 3,31 (16-17) (20-25) (26-35) (29-40) (40-50) 23 ± 2,21 32 ± 3,01 41 ± 4,58 51 ± 6,96 63 ± 4,44 (20-27) (28-36) (29-48) (37-61) (56-70) 24 ± 3,24 34 ± 2,66 44 ± 5,43 55 ± 7,27 72 ± 4,79 (20-30) (31-38) (30-54) (37-65) (64-83) 15 ± 1,38 23 ± 1,94 31 ± 3,53 41 ± 3,46 52 ± 5,15 (13-17) (20-26) (25-39) (32-46) (42-63) 6 ± 0,76 8 ± 0,82 11 ± 0,98 17 ± 1,45 24 ± 3,03 (6-8) (7-9) (9-13) (14-19) (19-28)
7
10 4591 ± 307 (4154-5126) 69,5 ± 3,78 (65,0-76,7) 8,9 ± 0,52 (8,1-10,0) 96,0 ± 9,61 (78,8-108,9) 0,99 ± 0,06 (0,92-1,09) 74 ± 5,09 (67-85) —
1 3245
132 ± 4,74 (124-140) 80 ± 2,79 (75-84) 212 ± 5,87 (202-220) 12 ± 1,37 (9-14) 120 ± 8,08 (109-133) 109 ± 5,59 (102-119) 31 ± 2,84 (25-35) 48 ± 5,35 (40-57) 17 ± 2,23 (14-21) 13 ± 0,74 (12-14) 42 ± 4,01 (36-47) 59 ± 5,38 (50-66) 66 ± 5,07 (58-73) 48 ± 3,62 (42-53) 24 ± 4,11 (18-32)
111
52,3 7,6 75,5 0,91 42,5 —
73 184 13 108 102 34 43 14 12 40 56 62 47 22
Tabulka 2. Morfometrické hodnoty Xiphinema diversicaudatum z České republiky (Hrušky), Slovenska a Jugoslávie. Všechny hodnoty jsou v µm ve formě: střední hodnota ± směrodatná odchylka (rozpětí)* Země Reference Jedinci n L a b c c΄ V/spikuly Odontostylet Odontofor Celková délka styletu Největší šířka křídel Vzdálenost od ústního otvoru po vodící kroužek Délka bulbusu jícnu Šířka bulbusu jícnu Délka ocasu Délka hyalinních pysků Délka mukra Přídatné orgány
Česká republika Kumari a kol., 2005 ♀ 22 4679 ± 254 (3993-4991) 66,9 ± 5,38 (57,1-76,5) 10,0 ± 0,59 (8,8-11,0) 93,0 ± 9,74 (77,5-120,0) 1,03 ± 0,09 (0,87-1,20) 44 ± 1,18 (41-45) 129 ± 3,76 (121-135) 85 ± 3,12 (79-89) 213 ± 4,46 (205-221) 13 ± 0,83 (11-15) 117 ± 5,93 (107-126) 101 ± 5,59 (94-114) 30 ± 3,25 (23-37) 51 ± 4,47 (40-60) 18 ± 1,74 (15-21) 10 ± 1,51 (7-13) —
Jugoslávie Barsi a Lamberti , 2000a
Slovensko
Jugoslávie
Slovensko
Barsi a Lišková a Kumari a kol., Lamberti, kol., 1992 2005 2000a
Lišková a kol., 1992
♀ 17 4200 ± 300 (3680-4640) 78 ± 5,31 (65,6-88,3) 8,9 ± 0,82 (7,6-11,2) 84,8 ± 5,71 (77,2-101,7) 1,18 ± 0,06 (1,04-1,28) 42,9 ± 1,50 (40,4-45,2) 130 ± 3,16 (124-134) 75 ± 2,26 (70-79) 204 ± 4,26 (196-213)
♀ 7 4300 (4000-4600) 78,0 (73-82) 9,2 (8,7-10,7) 86,0 (73-94) 1,20 (1,0-1,3) 43 (42-45) 142 (133-147) 76 (70-80)
115 ± 3,79 (107-121)
129 (119-133)
50 ± 3,41 (43-54) 16 ± 2,70 (8-19)
50,00 (49-56) 21 (19-21)
Průměr těla v oblasti pysků
13 ± 0,87 14 ± 0,30 (12-15) (13-14) u vodícího kroužku 43 ± 3,36 38 ± 1,07 (39-51) (36-40) na bázi jícnu 60 ± 5,12 48 ± 1,99 (53-68) (44-51) u vulvy 70 ± 5,52 54 ± 3,53 (60-79) (48-60) u anusu 49 ± 4,11 42 ± 1,59 (40-57) (38+44) na počátku hyalinní části 24 ± 2,67 19 ± 2,69 (20-31) (10-21) * hodnoty ze Slovenska jsou bez směrodatné odchylky
8
Česká republika
14 (13-14) 38 (35-41) 48 (42-49) 55 (52-56) 44 (42-49) 25 (21-28)
♂ 16 4686 ± 244 (4304-5133) 70,0 ± 3,98 (62,6-75,2) 9,1 ± 0,67 (8,2-11,0) 84,1 ± 7,62 (73,7-98,3) 1,17 ± 0,10 (1,04-1,32) 72 ± 3,43 (63-79) 131 ± 4,19 (125-138) 86 ± 3,00 (81-91) 217 ± 5,47 (208-227) 13 ± 0,93 (11-14) 123 ± 5,73 (112-131) 114 ± 6,00 (103-126) 28 ± 2,30 (22-32) 56 ± 5,00 (47-66) 18 ± 1,85 (14-20) 12 ± 1,25 (9-14) 6 ± 0,93 (4-8) 14 ± 0,70 (12-15) 42 ± 1,67 (40-45) 58 ± 4,78 (49-66) 67 ± 4,06 (60-72) 48 ± 2,12 (43-52) 19 ± 2,21 (15-23)
♂ ♂ 10 7 4200 ± 290 4400 (3740-4730) (4100-4700) 78,6 4,45 89,0 (72,9-86,4) (86-91) 8,7 0,43 9,2 (8,1-9,5) (8,2-11,3) 78,3 4,71 90,0 (70,2-83,3) (80-96) 1,22 ± 0,13 1,00 (0,98-1,48) (1,0-1,2) 69,8 ± 2,66 69 (65,7-72,8) (63-70) 130 ± 6,61 135 (120-141) (133-143) 74 ± 2,36 79 (70-76) (77-84) 204 ± 8,0 (195-216) 118 ± 5,37 (112-128)
123 (105-133)
54 ± 4,84 (47-64) 17 ± 1,89 (14-21)
48 (44-54) 19 (14-22)
14 ± 0,38 (13-14) 38 ± 1,38 (36-40) 48 ± 1,90 (43-50) 54 ± 2,37 (47-55) 44 ± 2,17 (41-48) 20 ± 3,37 (15-25)
13 (10-14) 36 (35-38) 48 (45-49) 49 (43-54) 46 (42-49) 24 (21-28)
2.4 Stručný popis Xiphinema vuittenezi Obrázek 3; Tabulky 3 a 4 Samičky Tělo Xiphinema vuittenezi Luc, Lima, Weischer & Flegg, 1964 je protáhle válcovité (2,6-4,1 mm) a má tvar otevřené spirály s větším zakřivením v jeho zadní polovině. Kutikula má zřetelnou vnější vrstvu v oblasti pysků. Hlavová část je hemisférická, zvýrazněna nepatrným důlkem za amfidními póry. Amfidy jsou třmínkovité, se štěrbinou podobnou pórům téměř stejně dlouhou jako šířka oblasti pysků. Amfidní póry jsou někdy viditelné jako nezřetelná čára. Odontostylet měřící 116-139 µm, je na bázi rozvětven, čímž vytváří pevné spojení k 66-92 µm dlouhému odontoforu se třemi velkými bazálními křídly. Vodicí kroužek měří 91-133 µm od předního konce. Nervový prstenec je malý a nachází se za odontoforem. Jícen je dorylaimoidní. Střevo obsahuje rozptýlené granule a vakuoly. Vulva (46-57%) je hluboká, s příčnou štěrbinou a svalnatým pyskem. Spermatéka je 2-3 krát delší než šířka těla. Vaječníky jsou zahnuty. V děloze se obvykle nachází tenké, neidentifikované, 8-10 µm dlouhé orgány (pseudo Z-orgány). Prerektum je 10krát delší než šířka těla. Ocas je kuželovitý, dorzálně vypuklý, ventrálně poněkud zploštěný, s prstovitě zakulaceným, 2-6 µm dlouhým mukrem. U některých jedinců mukro chybí, což je způsobeno mechanickým poškozením. X. vuittenezi má v porovnání s X. diversicaudatum kratší mukro, umístěné více ve středu ocasu, zatímco X diversicaudatum má mukro delší a je umístěno více ventrálně. Samečci Samečci tohoto druhu jsou hodně vzácní, rozmnožování je partenogenetické. Přední část těla se podobá samičkám. Zadní část těla je na ventrální straně silně zakřivena. Mají dvě roztažená varlata, umístěná naproti sobě. Spikuly jsou poměrně rovné, 58-68 µm dlouhé. Na ventrální straně se nachází jeden adanální pár a 4-5 párů kopulačních přídatných orgánů. Ocas je podobný jako u samiček, jen více zahnutý díky přítomnosti kopulačních svalů. Larvy Přední část těla se podobá dospělým jedincům, ale celkově jsou menší, a s trochu odlišnými rozměry. Čtyři larvální stadia jsou rozpoznány podle délky těla a podle funkčního a náhradního odontostyletu. Náhradní odontostylet je vždy přítomen na
9
Obrázek 3: Xiphinema vuittenezi. A-D: Přední část těla J1- J4; E-H: Ocas J1-J4; I: Stylet samičky; J, K: Přední část těla a ocas samečka; L: Ocas samičky bez mukra; M: Ocas samičky s mukrem. (podle Kumari, 2004)
10
Tabulka 3. Morfometrické hodnoty Xiphinema vuittenezi . Všechny hodnoty jsou v µm ve formě: střední hodnota ± směrodatná odchylka (rozpětí) (podle Kumari a kol. 2005) Lokalita Jedinci n L a b c c΄ V/spikuly Náhradní stylet Odontostylet Odontofor Celková délka styletu Největší šířka křídel Vzdálenost od ústního otvoru po vodící kroužek Délka bulbusu jícnu Šířka bulbusu jícnu Délka ocasu Délka hyalinních pysků Přídatné orgány Délka mukra Průměr těla v oblasti pysků u vodícího kroužku na bázi jícnu u vulvy u anusu na počátku hyalinní části
Polešovice J1 J2 J3 J4 12 13 17 19 850 ± 48 1247 ± 99 1632 ± 93 2430 ± 96 (798-949) (1086-1402) (1466-1765) (2214-2619) 32,6 ± 2,19 41,0 ± 3,00 38,7 ± 3,10 41,4 ± 2,05 (29,7-36,3) (36,5-46,9) (33,7-44,6) (36,9-44,9) 3,6 ± 0,28 4,1 ± 0,35 4,3 ± 0,43 5,3 ± 0,20 (3,3-4,2) (3,5-4,5) (3,0-4,8) (5,0-5,8) 18,1 ± 1,13 25,6 ± 1,64 37,4 ± 2,26 59,6 ± 5,08 (16,3-20,0) (23,4-29,0) (32,1-41,4) (49,7-69,1) 2,90 ± 0,36 2,34 ± 0,21 1,39 ± 0,14 0,94 ± 0,07 (2,32-3,42) (2,04-2,72) (1,13-1,71) (0,85-1,05) — — — — 62 ± 1,42 (60-64) 51 ± 1,07 (48-52) 37 ± 1,04 (36-39) 88 ± 1,23 (85-89) 8 ± 0,67 (7-9) 41 ± 1,57 (38-43) 70 ± 3,98 (62-76) 14 ± 1,80 (11-17) 47 ± 2,31 (44-51) 10 ± 0,88 (9-11) —
84 ± 3,96 (72-88) 62 ± 1,26 (59-63) 49 ± 1,90 (44-51) 110 ± 2,61 (105-114) 9 ± 0,49 (8-10) 57 ± 1,91 (53-61) 83 ± 4,54 (76-89) 15 ± 1,12 (13-17) 49 ± 2,69 (45-55) 13 ± 1,36 (11-15) —
108 ± 3,98 (102-114) 83 ± 4,25 (75-90) 57 ± 1,80 (54-60) 140 ± 5,71 (129-150) 11 ± 1,07 (9-13) 76 ± 3,10 (69-81) 96 ± 5,24 (81-103) 20 ± 2,38 (16-24) 44 ± 2,66 (39-49) 12 ± 1,91 (7-15) —
130 ± 2,55 (126-136) 105 ± 2,95 (100-112) 69 ± 1,92 (66-72) 174 ± 2,79 (167-181) 12 ± 0,90 (11-14) 96 ± 4,18 (86-104) 115 ± 5,44 (107-129) 24 ± 2,45 (19-28) 41 ± 3,33 (34-47) 12 ± 1,66 (10-17) —
—
—
—
—
8 ± 0,00 (8-8) 22 ± 1,56 (19-24) 26 ± 2,17 (23-29) 25 ± 2,62 (21-28) 16 ± 1,83 (14-19) 6 ± 0,58 (5-7)
9 ± 0,55 (8-10) 24 ± 1,78 (22-27) 30 ± 3,00 (25-34) 30 ± 3,25 (26-35) 21 ± 2,18 (18-24) 8 ± 0,77 (7-10)
10 ± 0,59 (9-11) 34 ± 3,37 (26-38) 42 ± 4,69 (32-48) 43 ± 4,93 (33-49) 32 ± 3,44 (24-38) 13 ± 1,84 (8-15)
12 ± 0,67 (11-13) 43 ± 2,04 (39-45) 56 ± 2,32 (52-59) 58 ± 3,08 (52-65) 43 ± 2,09 (40-47) 21 ± 2,11 (15-26)
11
♀ ♂ 28 3 3379 ± 223 3346 ± 33 (3008-4109) (3313-3379) 52,3 ± 2,97 55,0 ± 3,40 (48,3-60,9) (52,0-58,7) 6,9 ± 0,54 6,9 ± 0,29 (6,0-8,3) (6,7-7,2) 90,9 ± 8,13 83,1 ± 3,95 (79,0-108,5) (78,6-85,8) 0,81 ± 0,08 0,91 ± 0,06 (0,70-1,03) (0,86-0,98) 51 ± 1,12 65 ± 2,08 (49-55) (63-67) — — 128 ± 4,44 (117-134) 78 ± 2,39 (73-82) 206 ± 5,30 (192-213) 13 ± 0,90 (11-15) 108 ± 5,00 (101-118) 126 ± 5,55 (115-137) 29 ± 2,71 (24-35) 37 ± 2,88 (34-43) 14 ± 1,81 (10-17) — 4 ± 0,89 (2-6) 14 ± 0,84 (12-15) 45 ± 2,62 (40-49) 59 ± 3,11 (53-64) 65 ± 4,10 (55-74) 46 ± 2,88 (39-54) 29 ± 3,51 (23-37)
128 ± 1,00 (127-129) 79 ± 1,15 (78-80) 207 ± 2,08 (205-209) 13 ± 0,58 (12-13) 105 ± 1,15 (104-106) 124 ± 2,00 (122-126) 30 ± 2,08 (28-32) 40 ± 2,30 (39-43) 12 ± 0,58 (11-12) 6 ± 0,00 (6-6) 4 ± 0,58 (4-5) 14 ± 0,57 (13-14) 43 ± 1,53 (42-45) 59 ± 2,08 (57-61) 61 ± 4,00 (57-65) 44 ± 0,58 (44-45) 24 ± 1,53 (23-26)
Tabulka 4. Morfometrické hodnoty Xiphinema vuittenezi z České Republiky, Slovenska a Jugoslávie. Všechny hodnoty jsou v µm ve formě: střední hodnota ± směrodatná odchylka (rozpětí)* Země
Česká republika
Srbsko
Slovensko
Reference
Kumari, 2003
Barsi a Lamberti, 2000b
Liskova a kol, 1995
n L
219♀ 3315 ± 221 (2561-3809) 57,4 ± 4,28 (47,7-70,5) 6,7 ± 0,45 (5,2-7,7) 85,4 ± 8,49 (65,6-123,0) 0,95 ± 0,09 (0,68-1,34) 51,5 ± 1,54 (47,6-56,8) 128 ± 3,97 (116-139) 79 ± 2,79 (67-86) 207 ± 4,37 (194-216) 13 ± 1,02 (9-16) 103 ± 4,73 (91-129) 123 ± 5,25 (106-138) 29 2,91 (23-37) 39 ± 3,16 (30-47) 14 ± 2,00 (8-19)
30♀ 3400 ± 270 (2750-3920) 66,9 ± 4,06 (59,9-76,0) 6,9 ± 0,50 (5,7-7,8) 80,7 ± 5,81 (72,3-96,3) 1,09 ± 0,07 (0,93-1,22) 50,1 ± 1,32 (48,0-52,3) 127 ± 3,09 (118-131) 75 ± 2,12 (69-78) 202 ± 4,64 (189-209)
20♀ 3600 (3100-3800) 63 (56-72) 6,9 (6,2-8,1) 89,0 (76-101) 0,9 (0,8-1,3) 50,00 (48-53) 130 (120-137) 83 (77-92)
116 ± 6,08 (91-123)
113 (107-132)
42 ± 3,71 (34-48) 12 ± 1,23 (9,4-14,4)
39 (37-45) 13 (10-17)
14 ± 0,30 (14-15) 38 ± 1,02 (36-41) 46 ± 1,96 (43-50) 51 ± 2,81 (45-55) 39 ± 1,89 (35-43) 22 ± 2,01 (19-28)
14 (12-14) 39 (35-45) 48 (45-52) 57 (52-60) 41 (37-45) 28 (25-32)
a b c c΄ V/spikuly Odontostylet Odontofor Celková délka styletu Největší šířka křídel Vzdálenost od ústního otvoru po vodící kroužek Délka bulbusu jícnu Šířka bulbusu jícnu Délka ocasu Délka hyalinních pysků Přídatné orgány
13 (10-15) u vodícího kroužku 39 ± 2,24 (34-46) na bázi jícnu 51 ± 4,02 (41-61) u vulvy 57 ± 5,07 (43-70) u anusu 41 ± 2,67 (34-48) na počátku hyalinní části 27 ± 2,70 (17-36) * hodnoty ze Slovenska jsou bez směrodatné odchylky Průměr těla v oblasti pysků
12
Česká republika
Srbsko
Kumari a Barsi a Lamberti, Decreamer, 2006 2000b 8♂ 3201 ± 313 (2757-3730) 59,0 ± 3,93 (54,4-65,3) 7,0 ± 0,75 (5,9-8,0) 76,0 ± 8,93 (64,1-95,6) 1,11 ± 0,14 (0.98-1.43) 63 ± 2,07 (59-66) 124 ± 4,26 (117-130) 73 ± 0,83 (72-74) 197 ± 4,11 (191-203) 12 ± 1,04 (11-14) 104 ± 6,55 (96-117) 120 ± 5,34 (116-133) 24 ± 2,05 (21-26) 42 ± 2,97 (39-47) 12 ± 2,38 (8-16) 5 ± 0,35 (4-5) 13 ± 0,76 (12-14) 38 ± 2,33 (34-40) 50 ± 3,15 (45-55) 54 ± 5,18 (46-60) 40 ± 2,00 (37-44) 25 ± 2,76 (22-30)
3♂ 3400 ± 150 (3,25-3,54) 70,2 ± 3,55 (66,7-73,8) 7,0 ± 0,15 (6,9-7,2) 75,4 ± 6,51 (67,9-79,6) 1,15 ± 0,07 (1,11-1,23) 66,1 ± 2,31 (63,5-67,8) 124 ± 3,90 (120-128) 74 ± 1,04 (74-76) 199 ± 2,90 (196-201) 117 ± 5,65 (111-123) 45 ± 2,51 (43-48) 10 ± 1,37 (9-12)
14 ± 0,12 (14-14) 38 ± 0,35 (38-38) 45 ± 0,69 (45-46) 49 ± 2,21 (46-51) 39 ± 0,75 (39-40) 19 ± 1,64 (18-21)
přední straně jícnu a v prvním stadiu jeho přední konec leží za odontoforem funkčního odontostyletu (obrázek 1). Délka náhradního odontostyletu jednoho stadia se shoduje s délkou funkčního odontostyletu dalšího stadia (Tabulka 3). Pouze larvy čtvrtého stadia mají ocas podobný dospělým jedincům, u dřívějších stadií je více zúžen s nedostatečně zřetelným mukrem. První a druhé larvální stadium má prodloužený kuželovitý, na ventrální straně obloukovitě prohnutý ocas (obrázek 3).
3 Molekulární metodika 3.1 Extrakce DNA DNA se extrahuje pomocí metody dle Stanton a kol. (1998). Tato metoda extrakce DNA je jedna z nejefektivnějších a rychlejších metod. Používá se opakovaně od roku 2005 pro extrakce DNA X. diversicaudatum a X. vuittenezi v nematologické laboratoři VÚRV. Ani jeden vzorek extrahovaný touto metodu nebyl negativní, proto se tato metoda extrakce celkové DNA doporučuje pro extrakce DNA X. diversicaudatum a X. vuittenezi. Potřebné věci (viz obrázek 5) 1) Eppendorf zkumavky (0,5 ml sterilní) 2) Háďátka 3) Chladnička s mrazícím boxem 4) Petriho miska 5) pH-metr 6) Pipeta a špičky 7) Stereomikroskop 8) Sterilní jehly 9) Stojan na zkumavky 10) Termoblok na zkumavky 11) Roztoky:
0,25M NaOH 0,25M HCl 0,5 M Tris-HCl (pH 8) 2% Triton X-100
13
Obrázek 5. Potřebné věci pro extrakce DNA. 1: Inkubátor na zkumavky; 2: Stereomikroskop; 3: Box se špičkami; 4: Pipeta; 5: 2% Triton (X-100); 6: 0,5M TrisHCl; 7: 0,25M HCl; 8: 0,25M NaOH; 9: Rukavice; 10: Stojan na zkumavky; 11: 0,5 ml Eppendorf zkumavky; 12: Jehly; 13: Živá háďátka v Petriho misce; 14: Háďátka ve zkumavkách a stojan na zkumavky.
14
Postup 1) Napipetuje se 20 µl 0.25 M NaOH do každé 0,5 ml Eppendorf zkumavky. 2) Pod stereomikroskopem se přidají jednotlivá háďátka pomocí sterilní jehly do Eppendorf zkumavek. 3) Zkumavky se inkubují přes noc při pokojové teplotě. 4) Druhý den se zkumavky s háďátky inkubují 3 minuty při 99°C v termobloku. 5) Poté se přidá 10 µl 0.25 M HCl 5 µl 0.5 M Tris–HCl (pH 8) 5 µl 2% Triton X–100 6) Zkumavky se znovu inkubují 3 minuty při 99°C. 7) Zkumavky se nechají zchladit. 8) DNA je připravená pro PCR. Poznámka: DNA se může použít ihned pro PCR nebo se může skladovat pro další použití v -20°C či pro dlouhodobé použití v -70°C.
3.2 Pre-PCR Potřebné věci (viz obrázek 6) 1) Čisté PCR stojánky 2) Denaturovaný líh 3) DNA 4) Nádoba s ledem 5) Permanentní fixy 6) Pipety a špičky s filtrem 7) Rukavice 8) Sterilní ddH 2 0 9) Zkumavky s PCR kuličkami 10) Sense primer pro X. diversicaudatum D24 (5 ̦- GAG ATA TAA AGC GAA AAC CGC GAG -3 ̦) 11) Sense primer pro X. vuittenezi V18 (5 ̦-GTG GAA CGA AAA GAC CTC-3 ̦) 12) Společný antisense primer A-ITS1 (5 ̦- ACG AGC CGA GTG ATC CAC CGA TAA G -3 ̦)
15
Obrázek 6. Potřebné věci pro pre-PCR. 1: Stojan na pipety s pipetami; 2: Primery; 3: Nádoba na led; 4: Led; 5: dd H 2 O; 6: DNA; 7: Denaturovaný líh; 8: Rukavice; 9: Box se špičkami s filtrem; 10: Permanentní fixy; 11: Zkumavky s PCR kuličkami; 12: Stojan na zkumavky; 13: Popsané zkumavky s PCR kuličkami; 14: Špičky s filtrem.
16
Složení PCR kuliček ( IllustraTM PuReTaq Ready-To-Go PCR beads ) PCR kuličky jsou navrženy tak, aby spolehlivě amplifikovaly DNA při standardních reakčních podmínkách. PCR kuličky obsahují nezbytná činidla pro splnění preoptimalizace standardního PCR v reakčním objemu 25µl. Činidla nacházející se v každé zkumavce:
Přibližně 2,5 jednotky PuReTaq polymerázy
200 µM dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP)
BSA
Stabilizátory
Reakční pufr (10 mM Tris-HCl pH 9.0; 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl 2 ).
Činidla přidaná navíc jsou pouze voda, DNA a primery. Pokud je to nutné, může být navíc přidán MgCl 2 ; k uchování výpočtů pro determinaci, kolik roztoku MgCl 2 má být přidáno, tabulka je obsažena v příloze 8.2 metodiky. Skladování a zacházení s PCR kuličkami Uchovávat v pokojové teplotě ve vzduchotěsném fóliovém sáčku se sušidlem. Po otevření znovu uzavřít sáček - zahnout několikrát okraj a uzavřít klipem. V prostředí s vysokou vlhkostí skladovat neotevřený či použity sáček v exsikátoru pro maximální životnost produktu. Vyřadit každou kuličku, která byla náhodně vytlačena z příslušné zkumavky. Nosit vhodné ochranné oblečení, jako laboratorní kombinézu, bezpečnostní brýle a rukavice. Dbát na vyhnutí se kontaktu s pokožkou nebo očima. V případě kontaktu s pokožkou či očima ihned umýt vodou.
17
Příprava PCR kuliček pro PCR Vyjmout požadované množství zkumavek z fóliového sáčku. Odebrat jednotlivé zkumavky z pásu po osmi zkumavkách přestřihnutím plastových spojení mezi zkumavkami nůžkami. Zkontrolovat tyto zkumavky kvůli ověření, jestli je kulička viditelná na dně každé zkumavky. Vyřadit každou kuličku, která se zdá být podstatně menší nebo deformovaná (indikace kontaminace vlhkostí). Pokud je to nutné, zlehka poklepat zkumavkou o tvrdý povrch, aby se každá kulička usadila se na dně zkumavky.
Důležité! Při vykonávání PCR amplifikace nutno dodržovat extrémní pozornost předcházení kontaminace cizí DNA (viz příloha 8.1) Postup 1) Nasadí se čisté rukavice a stůl se očistí denaturovaným lihem. 2) Na čistém stojánku se nechají rozmrazit alikvoty primerů a sterilní ddH 2 0 při pokojové teplotě. 3) Po rozmrazení se chemikálie udržují na ledu při teplotě 1-4 °C. 4) Připraví se 0,2 ml zkumavky s PCR kuličkami podle počtu vzorků (viz. výše “příprava PCR kuliček pro PCR”). 5) Zkumavky s PCR kuličkami se popíší permanentním fixem. 6) Před použitím je nutné alikvoty
primerů a vzorky DNA jemně promíchat
pipetou. 7) Nemíchat obsah PCR zkumavek do té doby, než jsou přidána všechna níže uvedená činidla. 8) Do každé zkumavky s PCR kuličkou se napipetuje 20 µl sterilní ddH 2 0 2 µl specifického primeru (dle zkoumaného druhu) 2 µl univerzálního primeru A-ITS1 9) Přidá se 1 µl DNA.
18
10) Zavřít víčka zkumavek, zatlačit pevně dolů k zabezpečení utěsnění. Zamíchat obsah zkumavek klepnutím prsty do stěny zkumavky (finger-flick) nebo pozvolna vortexovat a poté zkumavky centrifugovat po několik sekund, aby se přesunuly všechny součásti na dno zkumavek. 11) Před PCR amplifikací minimalizovat čas chlazení na ledu, aby se zabránilo formování nežádoucích produktů.
Pro větší počet vzorků se doporučuje připravit master mix ddH 2 0 a dvou primerů.
Příklad master mixu pro 25 vzorků X. diversicaudatum: 20µl ddH 2 0
x 25 vzorků = 500 µl
2 µl primeru D24
x 25vzorků
= 50 µl
2 µl primeru A-ITS1
x 25vzorků
= 50 µl
Celkový objem
600 µl
Počet vzorků
25
= 24 µl master mixu do jedné zkumavky
Do každé zkumavky se napipetuje 24 µl master mixu a poté se přidá 1µl DNA. Poznámky
Vždy připravit navíc master mix pro jeden dodatečný vzorek.
Ujistit se, že kuličky jsou dostatečně rozpuštěny.
19
3.3 PCR Potřebné věci (viz obrázek 7) 1) PCR zkumavky připravené z “pre-PCR” 2) Stojan na zkumavky 3) Termocykler
Obrázek 7. Potřebné věci pro PCR. 1: Stojan na zkumavky; 2: Zkumavky z “pre-PCR”; 3: Termocykler Postup Zkumavky se vloží do termocykleru a jsou vystaveny následujícím podmínkám: Počáteční denaturace 94°C = 3:00 min Denaturace 94°C = 0:30 min Annealing 55°C = 0:30 min Extenze
72°C = 0:30 min
Finální extenze 72°C = 10:00 min
20
40X
Za 2 hodiny 4 minuty se termocykler vypne a zkumavky se dají do 4°C nebo pro další použití do -20°C či do -70°C. Poznámka Tento program je optimalizován pro PTC–1148 termocykler (Bio-Rad).
3.4 Post-PCR Potřebné věci (viz obrázek 8) 1) Agaróza 2) Analytická váha 3) Barvivo (Loading dye) 4) Délkový standard DNA (DNA ladder) 5) Erlenmayerovy baňky 6) Fotoaparát a tmavá komora 7) Horizontální elektroforetický aparát 8) Hřebeny do elektroforetické vany 9) Nádoba s ledem 10) Odměrný válec 11) Pipeta a špičky 12) Tepelná plotýnka 13) Sybr safe nebo ethidium bromid 14) TAE pufr 15) Transiluminátor 16) Vanička na agarózu 17) Váženka 18) Vzorky 19) Zdroj k elektroforéze
21
Obrázek 8. Potřebné věci pro post PCR. 1: Analytická váha; 2: Erlenmayerova baňka; 3: Tepelná plotýnka; 4: Fotoaparát; 5: Tmavá komora; 6: Transiluminátor; 7: Zdroj na elektroforézu; 8: Horizontální elektroforetický aparát; 9: Pipeta; 10: Sybr safe; 11: Box se špičkami; 12: Váženka; 13: Loading dye a DNA ladder; 14: Vanička na agarózu; 15: TAE pufr; 16: Hřebeny; 17: Agaróza; 18: Amplifikované vzorky; 19: Stojan na zkumavky; 20: Nádoba s ledem.
22
Postup 1) Připraví se vanička (např. 60x80mm) na agarózu a přiloží se hřeben na potřebné množství vzorků. 2) Na analytické váze se na vážence naváží požadované množství agarózy. 3) Navážená agaróza se přesype do Erlenmayerovy baňky. 4) Na odměrném válci se naměří 40 ml 1x TAE pufru. Naměřený TAE pufr se nalije do Erlenmayerovy baňky s naváženou agarózou. 5) Směs se ohřeje v Erlenmayerově baňce na plotýnce za průběžného promíchávání a nechá se zchladit v pokojové teplotě. 6) Připipetuje se 0.4 l sybr safe nebo ethidium bromidu, vše se opatrně zamíchá a nalije se do předem připravené vaničky s hřebenem. Je třeba dbát na to, aby po přelití nezůstaly v gelu bublinky vzduchu. 7) Po ztuhnutí gelu (cca 30-45min) se hřeben opatrně vyjme a vanička se vloží do horizontálního elektroforetického aparátu. 8) Loading dye (5 l) se promíchá s 25 l PCR produktu. 9) Do první a poslední jamky se napipetuje 5 l markeru (DNA ladder). Vzorky (5l) se nanáší do jamek (z prava do leva). Nakonec se nanáší pozitivní kontrola a kontrola bez DNA. 10) Elektroforetická vana se uzavře víkem. 11) Připojí se elektroforéza na zdroj a zapne se na 10 min na 40 voltů a poté na 1,5 hodiny na 55 voltů. 12) Po ukončení se elektroforéza odpojí. Gel se vyjme, vloží na transiluminátor a vyfotí. Elektroforetická separace PCR produktů na agarózovém gelu poskytuje možnost porovnat velikost
očekávaných
amplikonů
s délkovým standardem DNA.
DNA
se
separuje
elektroforeticky na základě svého náboje a molekulární hmotnosti. Délka doby elektroforetické separace je závislá na požadované délce dráhy migrace, protékajícím elektrickém proudu, použitém elektroforetickém pufru a na koncentraci agarózy v gelu. Přidáním sybr safe nebo ethidium bromidu do agarózového gelu je umožněno vizualizovat po proběhlé elektroforéze proužky rozdělené DNA.
Vizualizace PCR produktů po elektroforetické separaci probíhá
pomocí UV záření. Sybr safe nebo ethidium bromid se naváže na DNA a při excitaci UV zářením vyzařuje. Hledaný produkt se pod UV světle zviditelní do podoby svítícího proužku, podle srovnání pozice tohoto proužku s pozicí DNA fragmentů délkového standardu je pak určena délka produktu.
23
4 Výsledky elektroforézy Druhově specifický primer D24 a A-ITS1 amplifikuje 813 bp dlouhý fragment pro X. diversicaudatum (obrázek 9). Druhově specifický primer V18 se společným opačným primerem A-ITS1 amplifikuje 591 bp dlouhý fragment pro X. vuittenezi (obrázek 10) . Porovnání PCR produktů dvou druhů je znázorněno na obrázku 11.
Obrázek 9. Elektroforéza amplifikovaných produktů DNA izolovaných ze šesti jedinců X. diversicaudatum (jamky 1-6). M: 100bp délkový standard DNA (Fermentas).
Obrázek 10. Elektroforéza amplifikovaných produktů DNA izolovaných ze šesti jedinců X. vuittenezi (jamky1-6). M: 100bp délkový standard DNA (Fermentas).
Obrázek 11. Porovnání PCR produktů dvou druhů. XD1, XD 2: X. diversicaudatum; XV1, XV2: X. vuittenezi.
24
5 Srovnání ″novosti postupů″ V předložené metodice jsou optimalizovány postupy molekulární diagnostiky fytoparazitických háďátek druhů Xiphinema diversicaudatum a X. vuittenezi pomocí spolehlivé, specifické a selektivní metody polymerázové řetězové reakce za účelem rychlé identifikace ve srovnání s obtížnou a časově náročnou taxonomickou identifikací. Výhody této metodiky jsou popsány v úvodu i závěru.
6 Závěr V první části této metodiky je popsána stručná charakteristika háďátek druhů X. diversicaudatum a X. vuittenezi, jejichž morfometrické hodnoty jsou uvedeny v tabulkách. Tato část není daným předmětem metodiky, proto je uvedena jen stručně pro rychlou orientaci uživatele této metodiky. Tato metodika se zabývá molekulární identifikací háďátek X. diversicaudatum a X. vuittenezi. Druh X. vuittenezi je nejrozšířenějším, a X. diversicaudatum druhým nejrozšířenějším druhem v České republice (Erbenová, 1975; Kumari, 2004; Kumari a kol., 2005; Kumari 2006). Navíc je X. diversicaudatum prokázaným vektorem dvou nepovirů – viru latentní kroužkovitosti jahodníku (SLRSV - Strawberry latent ringspot virus) a viru mozaiky huseníku (ArMV - Arabis mosaic virus) (Talyor a Brown, 1997). Na základě jejich rozšíření a škodlivosti byly vybrány právě tyto druhy. Určování háďátek X. diversicaudatum a X. vuittenezi se provádí pomocí časově náročné morfologické a morfometrické studie. Proto byla optimalizována molekulární metoda PCR (polymerázová řetězová reakce), která je spolehlivá a rychlá pro identifikaci těchto druhů. Druhy Xiphinema se typicky vyskytují smíšeně; je tedy nutné, aby druhově specifické primery byly selektivní a senzitivní. Tyto primery jsou selektivní, protože amplifikují fragment odlišné velikosti pro X. diversicaudtaum a X. vuittenezi.
25
Molekulární diagnostika dvou druhů (X. diversicaudatum a X. vuittenezi) na základě polymerázové řetězové reakce je specifická a spolehlivá. Tento molekulární diagnostický protokol je díky použitím druhově specifických primerů spolehlivý i pro detekce všech vývojových stadií larev X. diversicaudatum a X. vuittenezi a je velkým přínosem fytosanitárních služeb. Použití PCR kuliček (PCR-beads) je zvlášť užitečné ve fytosanitárních laboratořích a ostatních diagnostických laboratořích. Výhody PCR-beads PCR systém puReTaq Ready-To-Go™ je výborný pro méně zkušený personál laboratoře. Ke stanovení PCR reakce přidá uživatel pouze specifický primer, ddH 2 O a DNA. PCR-kuličkový kit je velmi robustní a spolehlivý. Snadné použití pro větší počet vzorků. Ekonomicky výhodné. Minimalizace jednotlivých kroků pipetování a redukce potenciálních chyb při nich. Zajišťění nejnižší možné úrovně kontaminace prokaryotické a eukaryotické nukleové kyseliny u každé kuličky. Dodržování některých jednoduchých opatření předejde reintrodukci kontaminace (viz příloha 8.1). Zajišťění větší reprodukovatelnosti mezi reakcemi. Kuličky jsou lyofilizované, proto mohou být uchovány v pokojové teplotě. Vzorky s PCR kuličkami vyžadují minimální uživatelský vstup, čas a nižší odbornost a podávají výsledky, které jsou pokaždé přesné a reprodukovatelné.
Poděkování Autorka děkuje Markétě Vítámvásové za opravu češtiny a technickou pomoc.
26
7 Literatura 7.1 Použitá literatura 1.
Barsi, L., Lamberti, F. (2000a): Morphometric variation and juvenile stages of Xiphinema diversicaudatum (Micoletzky, 1927) Thorne, 1939 and X. index Thorne et Allen, 1950 (Nematoda: Dorylaimida) from the former territory of Yugoslavia. Nematologia Meditteranea 28: 171–187
2.
Barsi, L., Lamberti, F. (2000b): Morphometric variation and juvenile stages of Xiphinema vuittenezi (Nematoda: Dorylaimida) in Serbia. Nematologia Mediterranea 28: 3–12
3.
Erbenová, M. (1975): Ektoparazitická háďátka rodu Xiphinema cobb v ovocných sadech ČSR. Sborník ÚVTI – Zahradnictví 2: 79–86
4.
Kumari, S. ( 2003): A single specimen of Xiphinema vuittenezi with posterior vulva from the Czech republic. International Journal of Nematology 13: 233–235
5.
Kumari, S. (2005): Atlas for identification of 28 genera of plant-parasitic nematodes. RICP,Prague, 60 s
6.
Kumari, S. (2004): The occurrence of Xiphinema vuittenezi, X. pachtaicum and Longidorus leptocephalus (Nematoda: Dorylaimida) in the Central Czech Republic. Helminthologia 41: 103–108
7.
Kumari, S. (2006): Xiphinema simile (Nematoda: Longidoridae) in the Czech Republic and a note on other Xiphinema species. Helminthologia 43: 43–50
8.
Kumari, S., Decreamer, W. (2006):
A female of Xiphinema vuittenezi
(Nematoda: Longidoridae) with two vulvae and abundant numbers of males in a soil sample. Nematology, 8: 943–947 9.
Kumari, S., Polák, J., Choutka, R. (2005): Plant-parasitic nematodes of the genus Xiphinema (Nematoda: Longidoridae) in the vineyards of the Czech Republic. Nematology 7: 81–93
10. Liskova, M., Brown, D. J. F., Taylor, C. E. (1995): The occurrence and distribution of Longidoridae and Trichodoridae in the Slovak Republic. Russian Journal of Nematology 3: 49–60 11. Lišková, M., Sabová, M., Valocká, B. (1992): Contribution to the finding of the southern border of Xiphinema diversicaudatum (Micoletzky, 1927) Thorne, 1939 distribution range in the Slovak Republic. Helminthologia 29: 181–184
27
12. Loof, P. A. A., Luc, M. (1990): A revised polytomous key for the identification of species of the genus Xiphinema Cobb, 1913 (Nematoda: Longidoridae) with exclusion of the X. americanum-group. Systematic Parasitology 16: 35– 66 13. Loof, P. A. A., Luc, M. (1993): A revised polytomous key for the identification of species of the genus Xiphinema Cobb, 1913 (Nematoda: Longidoridae) with exclusion of the X. americanum-group: Supplement 1. Systematic Parasitology 24: 185–189 14. Loof, P. A. A., Luc, M., Baujard, P. (1996): A revised polytomous key for the identification of species of the genus Xiphinema Cobb, 1913 (Nematoda: Longidoridae) with exclusion of the X. americanum-group: Supplement 2. Systematic Parasitology 33: 23–29 15. Oliveira, C. M. G., Fenton, B., Malloch, G., Brown, D. J. F., Neilson, R. (2005): Development of species-specific primers for the ectoparasitic nematode species Xiphinema brevicolle, X. diffusum, X. elongatum, X. ifacolum and X. longicaudatum(Nematoda:
Longidoridae)
based
on
ribosoml
DNA
sequences. Annals of Applied Biology 146: 281-288 16. Stanton, J. M., McNicol, C. D., Steele, V. (1998): Non-manual lysis of secondstage Meloidogyne juveniles for identification of pure and mixed samples based on the polymerase chain reaction. Australasian Plant Pathology 27: 112–115 17. Taylor, C. E., Brown, D. J. F. (1997): Nematode vectors of plant viruses. CABI, Wallingford, UK. 18. Wang, X., Bosselut, N., Castagnone, C., Voisin, R., Abad, P., Esmenjaud, D. (2003): Multiplex polymerase chain reaction identification of single individuals
of
the
longidorid
nematodes
Xiphinema
index,
X.
diversicaudatum, X. vuittenezi, and X. italiae using specific primers from ribosomal genes. Phytopathology 93: 160–166
28
7.2 Původní poznatky VÚRV, v.v.i. k PCR 1. Kumari, S. (2006): Xiphinema simile (Nematoda: Longidoridae) in the Czech Republic and a note on other Xiphinema species. Helminthologia 43: 43–50 2. Kumari, S., Kundu, J. K., Polák, J. (2004): Identification of Xiphinema vuittenezi by polymerase chain reaction. Plant Protection Science 40: 1–4 3. Kumari, S., Polák, J., Choutka, R. (2005): Plant-parasitic nematodes of the genus Xiphinema (Nematoda: Longidoridae) in the vineyards of the Czech Republic. Nematology 7: 81–93
7.3 Původní poznatky ze světa k PCR 1. Hübschen, J., Kling, L., Ipach, U., Zinkernagel, V., Bosselut, N., Esmenjaud, D., Brown, D. J. F., Neilson, R. (2004): Validation of the specificity and sensitivity of species-specific primers that provide a reliable molecular diagnostic for Xiphinema diversicaudatum, X. index and X. vuittenezi. European Journal of Plant Pathology 110: 779–788 2. Leopold, S., Fernández, B. E., Schartl, A., Laimer, M. (2007): Identification of Xiphinema index in an Austrian vineyard. Vitis 46: 49–50 3. Wang, X., Bosselut, N., Castagnone, C., Voisin, R., Abad, P., Esmenjaud, D. (2003): Multiplex polymerase chain reaction identification of single individuals of the longidorid nematodes Xiphinema index, X. diversicaudatum, X. vuittenezi, and X. italiae using specific primers from ribosomal genes. Phytopathology 93: 160–166
29
8 Přílohy 8.1 Jak se vyhnout PCR kontaminaci PCR je velmi senzitivní ke kontaminaci cizí DNA. PCR je molekulární biologická technika, což připouští produkci více než 10 milionů kopií cílové DNA sekvence pouze z několika molekul DNA. Senzitivita PCR znamená, že vzorek použitý pro PCR by neměl být kontaminován žádnou další DNA, která se může usadit v laboratorním prostředí. Proto je nutné provádět kroky, které zredukují kontaminaci.
Důležité! - Negativní kontroly (bez DNA) by měly být přidány do každého stanovení PCR. Pokud jsou vidět proužky po provedení PCR na negativní kontrole, je kontaminována. Tipy jak předejít kontaminaci PCR Nasazení čistého páru rukavic při zahájení práce s PCR. Čištění pracovního povrchu 70% etanolem před a po práci. Častá výměna rukavic. Použití špiček s filtrem. Špičky do pipet s aerosolovými filtry poskytují prevenci před mikrokapičkami vstříknutými do směsi PCR, čímž předchází kontaminaci PCR reakcí. Nekašlat nad zkumavkami. Příprava DNA vzorků by se měla provádět ve vzdáleném prostoru nebo alespoň odděleném od prostoru, kde se připravuje směs na PCR reakci. Může být použit laminární flowbox, vybavený UV lampou k předcházení bakteriálního růstu. Tato pracovní plocha může zabránit kontaminaci z předešlé amplifikované DNA. Vyhnout se tvorbě aerosolů. Nedělat při práci prudké pohyby pipetou. Příprava vlastní sady činidel a jejich udržování v malém alikvotu.
30
Tipy jak se vyvarovat přenosu PCR ″carry-over″ kontaminace Izolovat DNA extrakce, pre-PCR a post-PCR. Pokud možno používat tři různé místnosti. Nepřenášet vybavení jako jsou pipety, boxy se špičkami, mikrocentrifugou atd. z jedné místnosti do druhé. Každá osoba v laboratoři by měla mít svou vlastní sadu pipet a činidel pro DNA extrakce, pre-PCR a post-PCR. Činidla by měla být vytvořena a skladována v malých alikvotech, které mohou být vyřazeny, jestliže existuje podezření na jejich kontaminaci. Vždy zacházet se zkumavkami a roztoky z post-PCR s předpokladem, že jsou zde přítomny amplifikované produkty. Používat pro tuto práci oddělené postPCR pipety. Vyvarovat se vytvoření aerosolů. Aerosoly se snadno vytvoří při vyhazování špiček, nebo jestliže se s pipetami příliš mává. Používat špičky s filtrem k redukci rizika přenosu DNA mezi zkumavkami. Pokud je to možné, používat UV-lampu pro dekontaminaci laboratoře, pokud v ní nejsou přítomni lidé. Další tipy při práci s PCR Koncentrace činidel – “nižší je obvykle lepší” (více specifické). Krátce vortexovat nebo zamíchat třepáním rukou činidla před použitím. Spustit negativní kontrolu (y) pro ověření kontaminace. Spustit pozitivní kontrolu (vzorek který byl opakovaně pozitivně amplifikován). Vždy spustit délkový standard DNA na gelu (bude indikovat možné selhání PCR nebo detekčního systému). Shromáždit reakce na ledu. Stále ošetřovat pracovní povrch 10% (v/v) roztokem sava. Ideální je nechat savo působit na povrch nejméně 10 minut a poté setřít sterilní vodou .
31
8.2 Přepočty I) Přepočty molarity chemikálií na 100 ml pro extrakce DNA a] 0,25M NaoH = 1 gram na 100 ml (0,1 litr) 1Molární na jeden litr = 40g (molekulární hmotnost NaOH) 1M 0,1 litr = 40 x 0,1 4g 0.25M 0,1 litr = 4 x 0,25 1g b] 0,5M Tris-HCl = 7,88 gramů na 100 ml (0,1 litr) 1Molární na jeden litr = 157,60 g (Molekulární hmotnost Tris-HCl) 1M 0.1 litr = 157,60 x 0,1 15,76g 0.5M 0,1 litr = 15,76 x 0,5 7,88g c] 0,25M HCl = 2,20 ml 35% HCl na 100 ml (0,1 litr) 1Molární na jeden litr = 36,46 g (Molekulární hmotnost HCl) 1M 0.1 litr = (36,46 x 0,1) 3,646g 0.25M 0,1 litr = (3,646 x 0,25) 0,9115g 1180 g = 1000 ml 0,9115g = X ml (1000x0,9115/1180 0,772 ml) 35% = 0,772 ml 100%= X ml (0,772x100/35 2,20 ml) II) Přepočty koncentrace primerů pro 10 pmol/1l 10l “stock primeru” (Generi Biotech) na 90 l dd H 2 O 10 pmol/1l III) Příprava 1x TAE pufru Zásobní roztok 50x TAE (Fermentas) se naředí deionizovanou vodou v poměru 1:49. Např. pro 1000 ml pracovní koncentrace (1x) se naměří 980 ml deionizované vody a přidá se 20 ml zásobního roztoku TAE (50x)
32
IV) Příprava 1,5 % agarózového gelu Vanička 60 x 80 mm 100 x 150 mm
1x TAE pufr 40 ml 80 ml
Agaróza
Ethidium bromid
0,6 g 1,2 g
0,4l 0,8l
Sybr safe 0,4l 0,8l
V) Denaturovaný líh (cca 70%) 70 ml absolutního ethylalkoholu (99,8%) se smíchá s 30ml deionizované sterilní vody.
VI) Koncentrace magnesium chloridu Pokud je každá PCR kulička dehydratizovaná v reakčním objemu 25 µl, směs se skládá z 1,5mM MgCl 2. Jestliže se požaduje vyšší koncentrace Mg2+, následující tabulka může být použita k determinaci objemu sterilního roztoku 10mM MgCl 2, který by měl být přidán, aby se zvýšila koncentrace Mg2+ reakce. Jestliže je MgCl 2 přidán do reakce, sníží se množství přidané vody v reakci na finální reakční objem 25ul. Konečný [MgCl 2 ] 2,0 mM 2,5 mM 3,0 mM 3,5 mM 4,0 mM 4,5 mM 5,0 mM
Objem 10 mM MgCl 2 k přidání 1,25 l 2,50 l 3,75 l 5,00 l 6,25 l 7,50 l 8,75 l
Přepočet 10 mM MgCl 2 = 0,095211g na 100 ml (0,1 litr) 1Molární na jeden litr = 95,211 g (Molekulární hmotnost MgCl 2 ) 1M 0.1 litr = 95,211 x 0,1 9,5211g 1mM 0,1 litr = 9,5211/ 1000 0,0095211g 10mM 0,1 liter = 0,0095211 x 10 0,095211g
33
8.3 Potřebné věci Informace o konkrétním přístrojovém a materiálním vybavení jsou přiloženy jen jako možná pomoc pro uživatele této metodiky, mohou však být použity i materiály od jiných dodavatelů za předpokladu, že bude dosaženo shodných výsledků. V případě neshody je třeba optimalizovat dané přístrojové a materiální vybavení. P.č. 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18.
19. 20. 21. 22. 23. 24. 25. 26. 27.
28. 29. 30. 31. 32. 33. 34. 35. 36.
Věc Agaróza (TopVision Agarose) Analytická váha Centrifuga MiniSpin DNA ladder 100 bp (50µg) Eppendorf zkumavky (0,5 ml) bezbarvé Erlenmayerovy baňky (250 ml) Ethidium bromid (roztok) Ethylalkohol 99,8% (1 litr) Fotoaparát Canon A620 HCl (Hydrochloric acid -500 g) Horizontální elektroforéza s příslušenstvím (Biomax MP1015) Inkubátor na zkumavky Jehly Loading dye (6x orange) Nádoba na led NaOH (Sodium hydroxide) PCR kuličky (illustra™ PuReTaq Ready-To-Go PCR Beads) PCR stojánky: Stojan na 0,2 ml zkumavky Stojan na 0,2-2 ml zkumavky Stojan na 0,5-2 ml zkumavky Petriho miska (40mm) pH metr Pipety : 0,5-10 µl 10-100 l 100-1000 µl Primery Rukavice vynilové , vel.S vel M vel L Stereomikroskop Olympus SZX 9 Stojan na pipety Sybr safe Špičky s filtrem: 0,1-10 µl 2-100 µl 50-1000 µl Špičky bez filtru: 0,1-10 µl 2-200 µl 50-1000 µl TAE pufr (50x) Tepelná plotýnka Termocykler MJ Mini Tmavá komora (tubus) Transiluminátor 312 nm Tris-HCl (250g) Triton X-100 (100 ml) Vortex (lab-dancer) Permanentní fixy (Cryoware marker)
Katalogové číslo R0491 EPF5452000018 SM0241 T8911-500EA KAV632417119250 E1510 E 03502 MEGA A620 C6025-500G
Výrobce Fermentas Radwag Eppendorf Fermentas Eppendorf Simax Sigma Canon Lachner
Kontakt * Biogen Váhy-Radwag Maneko Biogen Sigma-Aldrich Maneko Sigma P-lab Schoeller Instruments Lab Mark
IB53000
Biomax
Biogen
BIO TDB-100 R0631 R613071.Z DB0617-500G
Biosan Medin Fermentas Roth Lachner
BioTech Medin Biogen P-lab Lab Mark
27-9559-01
GE Healthcare
AP Czech
5230-29S R181841.R Alpha LW5890AS
Bioplastics AlphaLaboratories inoLab
Labmark P-lab East Port Scientific Vitrum Schoeller Instruments
Eppendorf
Maneko
Generi Biotech
Generi Biotech
Mercator Medical
Biogen
Olympus Eppendorf Invitrogen
Olympus Maneko KRD
Eppendorf
Maneko
Fermentas Yellowline BioRad Vilber Lourmat BioBasic Sigma IKA Nalgene
Biogen Neotec BioTech Schoeller Instruments Schoeller Instruments Lab Mark Sigma-Aldrich Neotec Sigma
632 492 002 040 3111 000.122 3111 000.149 3111 000.165 202VP 202VM 202VG 3111 000.003 S33102 PF0030 077 024 EPF0030 077.067 EPF0030 077.105 EPF0030 000 811 EPF0030 000 870 EPF0030 000 919 B49 PTC-1148 VIL ECX-26.MX DB0103-250G T 8787 336500 6163
* adresy těchto firem jsou na následující stránce Poznámka: Katalogové číslo může být staré, proto je potřeba před objednáním zavolat určitou firmu.
34
Kontakty firem AP Czech s.r.o. Hošťálková 48 160 00 Praha 6 Tel/Fax: 220 511 392 220 518 399 220 518 743
[email protected] http://www.apczech.cz
Biogen Praha s.r.o. Ke sv. Isidoru 2293/4a 149 00 Praha 4, Chodov Tel: 241 401 693 Fax: 241 401 694 Mob: 602 665 384
[email protected] http://www.biogen.cz
BioTech a.s. Služeb 4 108 52, Praha 10 Tel: 272 701 739 Fax: 272 701 742
[email protected] http://www.biotech.cz
East Port Scientific, s.r.o. Rubličova 1/969 161 00 Praha 6, Ruzyně Tel: 235 318 177 Fax: 233 312 428
[email protected] http://www.genetika.cz
Generi Biotech s.r.o Machkova 587 500 11 Hradec Králové 11 Tel: 495 056 353 Fax: 495 056 316
[email protected] http://www.generi-
KRD, s.r.o. Pekařská 603/12 155 00 Praha 5, Jinonice Tel: 257 013 400 Fax: 257 013 405
[email protected] http://www.krd.cz
Lab Mark a.s., Pod Cihelnou 23 161 00 Praha 6, Ruzyně Tel: 233 335 548 233 335 930 Fax: 224 311 830
[email protected] http://www.labmark.cz
Maneko, s. r. o. na Pískách 71 160 00 Praha 6, Tel: 233 335 638-9 233 336 579 Fax: 233 332 656
[email protected] http://www.maneko.cz
Medin Jana Želivského 6 130 00, Praha 3 Tel: 222 592 334 Fax: 222 592 334 Mob.: 606 686 530
[email protected] http://www.medin.cz
Neotec, spol. s. r.o Jinonická 80, 158 00 Praha 5 Tel: 257 289 511 257 289 515 Fax: 233 312 515 http://www.neotec.cz
Olympus C&S Evropská 176 160 41 Praha 6 Tel: 221 985 211 Fax: 221 985 505
[email protected] http://www.olympus.cz
P-lab a.s. Korunní 127 130 00 Praha 3,Vinohrady Tel: 271 730 800 Fax: 271 131 176
[email protected] http://www.p-lab.cz
Schoeller Instruments, s. r.
Sigma-Aldrich spol. s r.o. Sokolovská 100/94 186 00 Praha 8 Tel: 246 003 251 246 003 252 Fax: 246 003 291 246 003 292
[email protected] http://www.sigmaaldrich.com
Váhy-Radwag Lidická 55 787 01 Šumperk Tel/Fax: 583 210 016 mob: 777 255 695
Vitrum Praha Pražská 442 281 67 Stříbrná Skalice Tel: 321 570 321 Fax: 321 570 320
[email protected] http://www.vitrum.cz
biotech.com
o.
Vídeňská 1398/124 148 00 Praha 4 Tel: 261 009 111 261 711 765-6 Fax: 244 470 745 261 009 112
[email protected] http://www.schoeller.cz
35
[email protected]
http://vahy-radwag.cz
8.4 Referenční materiál I. Celková izolovaná DNA druhu X. vuittenezi Tato DNA byla předána Státní rostlinolékařské správě. DNA ze všech vzorků byla úspěšně amplifikována (obrázek 12). Tyto vzorky se doporučuje používat jako pozitivní vzorky. Číslo vzorku XV 1 XV 2 XV 3 XV 4 XV 5 XV 6 XV 7 XV 8 XV 9 XV 10 XV 11
Počet háďátek v jedné zkumavce 1♀ 1♀ 1♀ 1♀ 1♀ 1♀ 1♀ 1♀ 1♀ 1♀ 1♀
Množství DNA 39 µm 39 µm 39 µm 39 µm 39 µm 39 µm 39 µm 39 µm 39 µm 39 µm 39 µm
Číslo vzorku XV 12 XV 13 XV 14 XV 15 XV 16 XV 17 XV 18 XV 19 XV 20 XV 21 XV 22
Počet háďátek ve jedné zkumavce 1♀ 1♀ 1♀ 1♀ 1♀ 1♀ 1♀ 1♀ 1♀ 15 ♀ 15 ♀
Obrázek 12. Amplifikované referenční vzorky druhu X. vuittenezi. 36
Množství DNA 39 µm 39 µm 39 µm 39 µm 39 µm 39 µm 39 µm 39 µm 39 µm 159 µm 159 µm
II. Celková izolovaná DNA druhu X. diversicaudatum Tato DNA byla předána Státní rostlinolékařské správě. DNA ze všech vzorků byla úspěšně amplifikována (obrázek 13). Tyto vzorky se doporučuje používat jako pozitivní vzorky. Číslo vzorku XD 1 XD 2 XD 3 XD 4 XD 5 XD 6 XD 7 XD 8 XD 9 XD10 XD 11
Počet háďátek v jedné zkumavce 1♀ 1♀ 1♀ 1♀ 1♀ 1♀ 1♀ 1♀ 1♀ 1♀ 1♂
Množství DNA 39 µm 39 µm 39 µm 39 µm 39 µm 39 µm 39 µm 39 µm 39 µm 39 µm 39 µm
Číslo vzorku XD 12 XD 13 XD 14 XD 15 XD 16 XD 17 XD 18 XD 19 XD 20 XD 21 XD 22
Počet háďátek ve jedné zkumavce 1♂ 1♂ 1♂ 1♂ 1♂ 1♂ 1♂ 1♂ 1♂ 15 ♀ 15 ♂
Obrázek 13. Amplifikované referenční vzorky druhu X. diversicaudatum
37
Množství DNA 39 µm 39 µm 39 µm 39 µm 39 µm 39 µm 39 µm 39 µm 39 µm 159 µm 159 µm
III. Trvalé preparáty Tyto trvalé preparáty byly předány Státní rostlinolékařské správě Číslo
Druh
XV 1 XV 2 XV 3 XV 4 XV 5 XV 6
X. vuittenezi X. vuittenezi X. vuittenezi X. vuittenezi X. vuittenezi X. vuittenezi
Datum výroby 08.08.2004 08.08.2004 08.08.2004 08.08.2004 08.08.2004 08.08.2004
XV 7 XV 8 XV 9 XV 10 XV 11 XV 12 XV 13
X. vuittenezi X. vuittenezi X. vuittenezi X. vuittenezi X. vuittenezi X. vuittenezi X. vuittenezi
17.08.2004 17.08.2004 17.08.2004 17.08.2004 17.08.2004 17.08.2004 17.08.2004
1♀ 2♀ 2♀ 2♀ 2♀ 2♀ 2♀
Kostelec Kostelec Kostelec Kostelec Kostelec Kostelec Kostelec
vinná réva vinná réva vinná réva vinná réva vinná réva vinná réva vinná réva
08.10.2008 08.10.2008 08.10.2008 08.10.2008 08.10.2008 08.10.2008 08.10.2008
XV 14
X. vuittenezi
04.10.2004
1♀ bez mukra
Hrušky 1
vinná réva
08.10.2008
XV 15 XV 16 XV 17 XV 18
X. vuittenezi X. vuittenezi X. vuittenezi X. vuittenezi
04.10.2004 04.10.2004 04.10.2004 04.10.2004
1♀ 1♀ 1♀ 1♀
Mohyla Míru Mohyla Míru Mohyla Míru Mohyla Míru
jabloň jabloň jabloň jabloň
08.10.2008 08.10.2008 08.10.2008 08.10.2008
XV 19 XV 20
X. vuittenezi X. vuittenezi
04.10.2004 04.10.2004
2♀ 2♀
Hrušky 1 Hrušky 1
vinná réva vinná réva
08.10.2008 08.10.2008
XV 21 XV 22 XV 23
X. vuittenezi X. vuittenezi X. vuittenezi
27.06.2007 27.06.2007 27.06.2007
1♂ 1♂ 1♂
Slaný Slaný Slaný
jabloň jabloň jabloň
08.10.2008 08.10.2008 08.10.2008
XD 24 XD 25 XD 26 XD 27 XD 28 XD 29 XD 30 XD 31
X. diversicaudatum X. diversicaudatum X. diversicaudatum X. diversicaudatum X. diversicaudatum X. diversicaudatum X. diversicaudatum X. diversicaudatum
28.08.2003 28.08.2003 28.08.2003 28.08.2003 28.08.2003 28.08.2003 28.08.2003 28.08.2003
4 larvy 5 larev 1 larva 1 larva 1 larva 1 larva 1 larva 5 larev
Bílé Podolí Bílé Podolí Bílé Podolí Bílé Podolí Bílé Podolí Bílé Podolí Bílé Podolí Bílé Podolí
broskvoň broskvoň broskvoň broskvoň broskvoň broskvoň broskvoň broskvoň
08.10.2008 08.10.2008 08.10.2008 08.10.2008 08.10.2008 08.10.2008 08.10.2008 08.10.2008
XD 32 XD 33 XD 34 XD 35 XD 36 XD 37 XD 38 XD 39 XD 40
X. diversicaudatum X. diversicaudatum X. diversicaudatum X. diversicaudatum X. diversicaudatum X. diversicaudatum X. diversicaudatum X. diversicaudatum X. diversicaudatum
17.01.2005 17.01.2005 17.01.2005 17.01.2005 17.01.2005 17.01.2005 17.01.2005 17.01.2005 17.01.2005
1♀ 1♀ 1♀ 1♀ 3♀ (1 bez mukra) 3♀ 3♀ 1♂ 1♂
Třebanice Třebanice Třebanice Třebanice Třebanice Třebanice Třebanice Třebanice Třebanice
třešeň třešeň třešeň třešeň třešeň třešeň třešeň třešeň třešeň
08.10.2008 08.10.2008 08.10.2008 08.10.2008 08.10.2008 08.10.2008 08.10.2008 08.10.2008 08.10.2008
XD 41 XD 42
X. diversicaudatum X. diversicaudatum
24.12.2004 24.12.2004
2♂ 3♂
Lhenice Lhenice
třešeň třešeň
08.10.2008 08.10.2008
preparátu
Počet jedinců 1 larva 1 larva 1 larva 1 larva 1 larva 1 larva
38
Lokalita Polešovice Polešovice Polešovice Polešovice Polešovice Polešovice
Hostitelská rostlina vinná réva vinná réva vinná réva vinná réva vinná réva vinná réva
Datum předělání
Poznámky
39
Poznámky
40
Odměrné válce
Centrifuga Centrifuga (otevřená)
pH metr
Vortex
Název:
Určování háďátek Xiphinema diversicaudatum a X. vuittenezi pomocí polymerázové řetězové reakce (Metodika pro praxi)
Autor:
Kumari S.
Vydal:
Výzkumný Ústav Rostlinné Výroby, v.v.i. Drnovská 507, 16106 Praha 6–Ruzyně
Tisk:
VÚRV, v.v.i., Praha
Počet stran:
40
Vydání:
první
Rok vydání:
2008
ISBN:
978-80-87011-98-0
Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i., 2008
