KOLEKTIV AUTORŮ METODIKA PRO PRAXI UPLATNĚNÁ CERTIFIKOVANÁ METODIKA

Metodika inokulace jírovce maďalu (Aesculus hippocastanum) původcem choroby bleeding canker, bakterií Pseudomonas syringae pv. aesculi, v polních podmínkách. KOLEKTIV AUTORŮ

METODIKA PRO PRAXI UPLATNĚNÁ CERTIFIKOVANÁ METODIKA

Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i. 2013

Kolektiv autorů: Ing. Iveta Pánková, Ph.D., Ing. Václav Krejzar, Ph.D. - Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i. Ing. Josef Mertelík, CSc., Ing. Kateřina Kloudová - Výzkumný ústav Silva Taroucy pro krajinu a okrasné zahradnictví, v.v.i. Dedikace Metodika je plánovaným výstupem projektu NAZV QI 92A246 „Riziko odumírání jírovce maďalu Aesculus hippocastanum, následkem „bleeding canker“ spojeného s infekcí Pseudomonas syringae pv. aesculi v ČR“. Metodika je určena pro šlechtitele a pěstitele okrasných dřevin, to je pro zahradnické a lesnické podniky zabývající se šlechtěním, množením a účelovou výsadbou jírovce maďalu v životním prostředí člověka. Metodika byla schválena Státní rostlinolékařskou správou, OSVĚDČENÍ č. j. SRS 060412/2013 o uznání uplatněné certifikované metodiky bylo vydáno v souladu s podmínkami „Metodiky hodnocení výsledků výzkumu a vývoje“. Oponenti Ing. Jana Víchová Ph.D. Ing. Michal Hnízdil Jména oponentů a názvy jejich organizací Ing. Jana Víchová, Ph.D. Mendelova universita v Brně Agronomická fakulta Ústav pěstování, šlechtění rostlin a rostlinolékařství Zemědělská 1/1665 613 00 Brno tel.: 545133050, e-mail: [email protected] Ing. Michal Hnízdil Ministerstvo zemědělství České republiky Odbor rostlinných komodit Oddělení polních plodin Těšnov 65/17 110 00 Praha 1 tel.: 221812231, e-mail: [email protected]

Vydal: Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i., Drnovská 507, 161 06 Praha 6 - Ruzyně © Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i., Praha, 2013 ISBN 978-80-7427-142-7 Tato publikace nesmí být přetiskována vcelku nebo po částech, uchovávána v médiích, přenášena nebo uváděna do oběhu pomocí elektronických, mechanických, fotografických či jiných prostředků bez výslovného svolení VÚRV, v.v.i.

2

Obsah: 1. Uvedení do problematiky 2. Cíl metodiky 3. Vlastní popis metodiky 3.1. Rostlinný materiál 3.2. Mikrobiologický materiál 3.3. Založení pokusu 3.4. Podmínky inokulace v přirozených podmínkách 3.5. Způsoby inokulace rostlin jírovce maďalu bakterií Psa 3.5.1. Injikace bakteriální suspenze Psa do vzrostného vrcholu jírovce maďalu 3.5.2. Injikace bakteriální suspenze Psa do letorostů jírovce maďalu 3.5.3. Inokulace do jamkového řezu na kmínku jírovců maďalu jírovce maďalu 3.5.4. Postřikem rostlin jírovce maďalu bakteriální suspenzí Psa 3.6. Hodnocení hladiny rezistence genotypů jírovce maďalu vůči bakterii Pseudomonas syringae pv. aesculi 3.6.1. Hodnocení rezistence vůči bakterii Psa odhadem 3.6.2. Hodnocení rezistence vůči bakterii Psa výpočtem 3.7. Naplnění Kochových postulátů 4. Srovnání novosti postupů 5. Popis uplatnění certifikované metodiky 6. Ekonomické aspekty 7. Seznam použité literatury 8. Seznam souvisejících publikovaných článků 9. Obrazová část

3

1. Uvedení do problematiky Aesculus hippocastanum L. - jírovec maďal (koňský kaštan), původem z Balkánského poloostrova je jednoznačně nejvýznamnějším, nejvíce zastoupeným a také nejčastěji vysazovaným druhem jírovce v ČR. Tento druh je účelově používán do zámeckých zahrad, parků, intravilánů měst a obcí, do liniových výsadeb podél cest a komunikací, a ačkoliv je nepůvodním druhem, za více jak 300 let jeho výsadeb se stal neodmyslitelnou a v podstatě nenahraditelnou součástí zeleně. Semena jírovce maďalu jsou důležitou součástí krmiva spárkaté zvěře v oborách s intenzivním chovem jelenů, daňků a muflonů, kde představují důležitou složku tradičního jádrového krmiva a mají i ekonomický přínos (Mertelík et al., 2010). Na trvalém vzestupu je využití jírovce maďalu ve farmaceutickém a kosmetickém průmyslu. Z ostatních druhů jírovců se ve výsadbách využívají pouze některé kultivary A. x carnea, další druhy jsou spíše sbírkové a vyskytují se převážně jako jednotlivé stromy v arboretech a parcích. Z rostlinolékařského hlediska byl jírovec maďal po dlouhá léta bezproblémovou dřevinou dobře využitelnou i v zátěžovém prostředí. První vážné ohrožení jeho zdravotního stavu v celé Evropě nastalo s výskytem klíněnky jírovcové (Cameraria ohridella- CO) v Makedonii (Deschka & Dimic, 1986) a zjištěné v ČR v roce 1993 (Liška, 1997). Poškození listů klíněnkou jírovcovou v interakci s houbovou infekcí Guignardia aesculi (Peck) V. B. Stewart a abiotickými vlivy způsobuje intenzivní nekrózu, svinování listů a předčasnou defoliaci (Mertelík et al., 2004) což výrazně degraduje užitnou hodnotu jírovce v zeleni. Ke koncepčnímu řešení tohoto problému výrazně přispělo objevení genotypu jírovce maďalu rezistentního k CO (Mertelík, Kloudová, 2010b). Nová hrozba devastace jírovců v západní Evropě se objevila po roce 2000 v podobě syndromu bleeding canker (BC), česky slizotoková nekróza, který způsobuje bakterie Pseudomonas syringae pv. aesculi (Psa). Do současnosti došlo vlivem BC- Psa k masivnímu odumírání jírovců ve Velké Británii, Francii, Belgii, Holandsku a Německu. Choroba se projevuje praskáním korových pletiv kmenu a větví a výtokem rezavého, až tmavě hnědého kleje z nich, který postupně zasychá a vytváří sklovitou krustu, drobné krápníkovité útvary a puchýřky vyplněné klejem. Při silné infekci dochází k celkovému chřadnutí až úhynu stromu. Příznaky BC jsou velmi podobné infekcím houbami rodu Phytophthora, jak dříve popsal v USA Caroselli (1953) a v Evropě Brasier a Strouts (1976), které ale nemají masivní výskyt. Bakterie Pseudomonas syringae jako původce BC byla popsána Dijkshoorn-Dekker (2005) a dále specifikována (Weber et al., 2008) jako patovar aesculi (Psa). Z epidemiologického hlediska je zajímavé, že Psa byla poprvé popsána v Indii v souvislosti s listovou skvrnitostí Aesculus indica (Durgapal and Singh, 1980). Z hlediska druhového zastoupení byl BC- Psa prokázán i u A. x carnea, A. pavia a A. flava. Psa může být v současnosti identifikována biochemickými systémy, například Biolog GEN III system protokol A (Biolog, Inc., Hayward CA), chemickými systémy, například databáze Sherlock MIDI gas chromatography system (MIDI, Microbial ID, Inc., Newark, DE) nebo molekulárně- biologickými systémy, například metodou qPCR. Stávající databáze biochemických a chemických systémů umožňují spolehlivě identifikovat původce bleeding canker na úroveň druhu P.syringae. Pro nespolehlivější rozlišení jednotlivých patovarů P. syringae se v současnosti používá molekulárně- biologická metoda qPCR (Green et al., 2009). V souvislosti s masivním šířením BC- Psa v západní Evropě započal po roce 2000 orientační průzkum i v ČR, přičemž výskyt podezřelých symptomů byl zjištěn pouze na několika lokalitách. Při mikrobiologických analýzách byla v jednom případě prokázána infekce houbou Phytophtora cactorum (Černý et al., 2008), v dalších případech nebyl patogen prokázán (Mertelík, Krejzar, Kůdela, 2007 –

4

nepublikováno). Systematický průzkum výskytu původce BC- Psa započal v roce 2009 v rámci projektu NAZV – QI92A246 (Mertelík et al., 2012). V letech 2009-2012 byl proveden průzkum výskytu BC- Psa na více než 200 lokalitách České republiky a bylo zkontrolováno více než 3000 stromů jírovců různého stáří. Příznaky typické pro BC- Psa byly zjištěny na osmnácti lokalitách. V žádném z analyzovaných pletiv příznakových stromů nebyla zjištěna přítomnost houby Phytophthora. V roce 2010 byla poprvé v ČR jednoznačně identifikována Psa ve vzorku korových pletiv jírovce maďalu z lokality Měděnec v Krušných horách (Mertelík et al., 2013). Výsledky identifikace Psa byly potvrzeny také testem patogenity na semenáčcích jírovce maďalu. Izoláty po inokulaci semenáčků jírovce vyvolávaly tvorbu rozsáhlých lézí na letorostech a odumírání vzrostných vrcholů, na listech se tvořily charakteristické rezavě hnědě drobné skvrny kolem vodivých pletiv dobře rozlišitelné od příznaků vytvořených po napadení některými výše zmíněnými houbami. Převažující projev choroby v ČR byl do roku 2011 pouze nižší úrovně v podobě výtoků z kmene a větví, přičemž následné chřadnutí koruny a úhyn stromů známý ze západní Evropy byly pouze ojedinělé a jednalo se o komplexní poškození v důsledku dalších bionóz a abionóz vázaných na jírovce (Mertelík et al., 2012). V roce 2012 však na lokalitě Měděnec, kde BC vykazovalo již více jak 70% z více než sta stromů jírovců rozdílného stáří, se vývoj kritickému stavu chřadnutí a odumírání velmi přiblížil. Intenzivní nárůst projevů BC byl zaznamenán také na dalších sledovaných lokalitách v ČR, stejně jako na srovnávacích kontrolních lokalitách v Nizozemí a Německu. Současně výrazně vzrostl i počet stromů s BC na lokalitách, byly zjištěny nové lokality s BC, bylo prokázáno šíření Psa na nové lokality v okolí již prokázaných a také zavlečení Psa s introdukovaným materiálem jírovců ze zahraničí. Experimentálně bylo prokázáno také spontánní šíření Psa na mladé podsazené návnadové stromky jírovce. Do současnosti je v ČR registrováno již osm lokalit. Vzhledem k přetrvávajícímu masivnímu šíření Psa v Evropě a zhoršování stavu napadených stromů je nutné tuto v ČR novou chorobu jírovců považovat za velmi rizikovou. Negativní dopad na stav zeleně v ČR může být ještě více umocněn tím, že, procentické zastoupení jírovců ve výsadbách je velmi vysoké. Účinná ochrana proti bakterii Psa nebyla doposud nalezena a opatření spočívají pouze v oblasti prevence. Obecně je doporučováno udržovat porosty jírovců v dobré kondici, protože výraznější projev BC byl pozorován u stromů se slabší vitalitou. Výrazný vliv na posílení vitality může mít eliminace klíněnky jírovcové, protože minování může způsobovat až 40% energetické ztráty stromu (Percival a Noviss, 2010). Přímá ochrana proti bakteriálním infekcím u okrasných dřevin je obecně velmi problematická a zpravidla málo účinná. Použití relativně účinných antibiotik oxytetracyklin a streptomycin proti fytopatogenním bakteriím je v ČR, stejně jako ve většině zemí světa zakázáno (s výjimkou např. USA). Nebezpečí jejich používání spočívá v možnosti vzniku rezistentních kmenů. Účinnost přípravků na bázi mědi je poměrně nízká a v zemích EU je v současnosti jejich používání omezeno z důvodu negativního vlivu na životní prostředí. Z hlediska dlouhodobé koncepce řešení se jako perspektivní jeví možnost vyhledávání genotypů jírovce maďalu s přirozenými obrannými mechanismy vůči Psa v populacích jírovců různých proveniencí v ČR i v oblastech původu jírovce maďalu na Balkánu. S ohledem na výsledky nalezení genotypu jírovce maďalu rezistentního ke klíněnce jírovcové, který je dnes již odrůdově chráněný (Mertelík, Kloudová, 2010b) a různých rodů dřevin s odolností k fytopatogenním bakteriím, jako k Erwinia amylovora - hlohy (Mertelík et al, 2012) a hrušně (Korba et al., 2011) k Pseudomonas – peckoviny (Korba, Šillerová, 2011) se jeví existence odolných genotypů jírovce maďalu k Psa jako pravděpodobná. Vyvinutí a praktické uplatnění postupů spolehlivého vyhledávání odolných genotypů, je základním předpokladem budoucí cíleného využití těchto genotypů pro preventivní ochranu. Nezbytnou součástí urychlení procesu následného praktického využití vybraných genotypů v nových výsadbách je použití metod klonového množení jírovce v podmínkách in vitro, které byly již ve Výzkumném ústavu Silva Taroucy pro krajinu a okrasné zahradnictví, v.v.i. vytvořeny (Šedivá et al., 2012).

5

2. Cíl metodiky Metodika zohledňuje reálnou potřebu uplatnění preventivní ochrany nových výsadeb jírovců před doposud kurativně neregulovatelným a plošně se šířícím patogenem Pseudomonas syringae pv. aesculi (Psa), přičemž využívá předpoklad existence odolných genotypů k bakterii Psa v multihybridních populacích jírovců. Metodika předkládá jednoduchý, rychlý a efektivní postup vyhodnocení hladiny rezistence genotypů jírovce maďalu k bakterii Psa. Praktické využití standardizovaného metodického postupu umožní selektivní výběr perspektivních genotypů jírovců a preventivní vyloučení silně náchylných genotypů z dalšího procesu účelového šlechtění a množení. Včasné uplatnění tohoto přístupu cílené selekce může významně přispět ke snížení budoucích ekonomických i krajinotvorných ztrát spojených s poškozením a odumřením nových výsadeb. Zvýšená odolnost budoucích výsadeb jírovců s využitím tolerantních až rezistentních genotypů k Psa umožní také stabilizovat výnosy semen v účelových výsadbách a tím zlepšit ekonomickou efektivitu využití semen jako krmiva v chovu spárkaté zvěře v oborách i jako suroviny pro farmaceutický a kosmetický průmysl. 3. Vlastní popis metodiky Vypracované postupy inokulace jsou určeny pro stanovení hladiny rezistence jednotlivých genotypů jírovce maďalu k Psa u rostlinného materiálu kontejnerovaných jírovců v přirozených podmínkách. Metodika inokulace je současně využitelná i pro stanovení virulence různých izolátů Psa izolovaných z korových pletiv jírovců s chorobou BC. 3.1. Rostlinný materiál Pro testování je vhodné používat dvou až tříleté semenáče jírovců. Semena je vhodné sbírat z předem vytypovaných semenných stromů jírovců v dobrém růstovém a zdravotním stavu. Sběr semen je nutné přizpůsobit ranosti stromu a stavu na lokalitě. Pro bezpečný sběr v případě semenných stromů na lokalitách se spárkatou zvěří (obory) je vhodné použít prakticky ověřený zachycovač plodů navržený pro tyto účely (Mertelík, Kloudová, 2011). Výsev semen je nejvhodnější provádět v krátké době po jejich sběru, semena neskladovat, aby nedošlo k vyschnutí slupky, což výrazně snižuje schopnost vyklíčení semen. Vlastní výsev semen provádět do PE přepravek na ovoce na vrstvu cca 15 – 20 cm rašelinového substrátu smíchaného s perlitem v poměru cca 3:1, mezi semeny ponechat mezeru cca 3cm. Semena položit jizvou dolů (vzniká méně semenáčků s esovitě deformovanou bází vzniklou v průběhu prorůstání klíčku tvrdou slupkou) a zasypat cca 1-2 cm vrstvou uvedeného substrátu. Přepravky označit pro rozlišení jednotlivých populací, obalit králičím pletivem proti žíru hlodavců a umístit do otevřených pařenišť. Stimulaci klíčení ani chemické ošetření semen není nutné provádět. Přesadbu vyklíčených semen v jarním období je nutno provést co nejdříve (stačí fáze počátku prorůstání kořenu) do jehlanovitých sadbovačů tzv. quick-potů o velikosti 8x8x18 cm (jeden sadbovač pojme 12 semenáčků) s použitím běžného zahradnického substrátu. Výsev do PE přepravek v podstatě slouží pouze pro rozlišení klíčivých a neklíčivých semen. Systém sadbovačů quick-pot snižuje možnost vzniku přemokření a zajišťuje správné formování kořenového systému. Současně zcela eliminuje vznik tzv. kruhového paměťového efektu kořenů, který vzniká při předpěstování semenáčků přímo v klasických zahradnických kontejnerech. Quick-poty umístit nejlépe do pařenišť pod stínovitě na rošty čímž je vytvořen tzv. „vzduchový polštář“, který zabrání prorůstání kořenů do podloží. Takto zůstávají semenáčky až do dalšího předjaří, kdy se z quick-potů přesadí do hlubokých květináčů tzv. „růžáků“ (rozměry 15x25 cm) s použitím běžného zahradnického substrátu. V další

6

vegetaci jsou dvouleté semenáčky připraveny pro testování. U pomaleji rostoucích semenáčků je vhodné tyto ponechat růst ještě jednu vegetaci. 3.2. Mikrobiologický materiál Referenční kmeny Psa pro stanovení rezistence jednotlivých populací jírovce maďalu jsou dostupné na oddělení bakteriologie ve VÚRV, v.v.i. Bakteriální kultura Psa se připravuje pro uživatele těsně před inokulací. Forma předávané bakterie závisí na způsobu inokulace. Pokud se inokuluje postřikem nebo injikací, předá se uživateli bakteriální suspenze o koncentraci 105-106 buněk/ml určená k okamžité inokulaci. Životnost této suspenze je cca 48h při 4°C. Při inokulaci do jamkového řezu na kmínku jírovce se pracuje přímo se segmenty (cca 1x1cm) živného agaru zcela porostlými 2-4 denní kulturou bakterie. Životnost této kultury je cca týden při 4°C. 3.3. Založení pokusu Jednotlivé populace jírovce maďalu určené pro testování hladiny rezistence vůči Psa jsou sázeny do kontejnerů o objemu cca 30l se spodní pískovou drenáží a směsí dvou substrátů: substrát pro okrasné dřeviny (Rašelina Soběslav) a zahradnický substrát s aktivním humusem (Rašelina Soběslav) v poměru 1:1. Rostliny jírovců v kontejnerech jsou v ideálním případě umístěny do polostínu. Jírovce se inokulují nejdříve dva měsíce po přesazení. Přibližně jedna pětina rostlin z každé testovaného genotypu se ponechá jako kontrolní. Během pokusu se rostliny nepřemisťují. 3.4. Podmínky inokulace v přirozených podmínkách Úspěšnost inokulace v přirozených podmínkách a výsledky hodnocení hladiny rezistence genotypů jírovce maďalu vůči bakterii Psa jsou ovlivněny: 1) Celkovým fyziologickým stavem rostlin jírovce maďalu. Je nutné inokulovat rostliny v dobrém fyziologickém stavu, bez příznaků jiných chorob. Všechny rostliny se udržují během celého hodnoceného období pod dostatečnou zálivkou, podle možností se zastiňují proti úpalu a zahrnují mulčovací kůrou proti mrazu. Vystavení úpalu, mrazu a suchu může zkreslit výsledky hodnocení. 2) Vegetačním stádiem rostlin jírovce maďalu v době inokulace. Optimálním vegetačním stádiem pro inokulaci injikací a jamkovým řezem je po vyrašení prvních listů, nárůstu minimálně 4 cm dlouhých letorostů a pučení vzrostného vrcholu. Pro inokulaci postřikem je nezbytná plně rozvinutá listová plocha. 3) Klimatickými podmínkami při inokulaci. Z hlediska patogena je optimálním obdobím pro všechny typy inokulace od poloviny dubna do konce května. Pro invazi patogena do rostlinných pletiv jednoletých i víceletých pravokořenných i roubovaných rostlin jírovců je nejvhodnější vlhké počasí s teplotami mezi 15°C a 20°C. Pro snadnější invazi bakterie Psa se rostliny před inokulací 24 h nezalévají. Důkladná zálivka je nutná ihned po inokulaci. 4) Způsobem inokulace v přirozených podmínkách pokusu. Optimálním obdobím pro všechny způsoby inokulace fytopatogenní bakterií Psa je v jarních měsících. Při inokulaci do jamkového řezu je možné vzhledem k teplotám a vlhkosti inokulovat na podzim v průběhu září (15-20°C). Pro navození co nejvhodnějších vlhkostních podmínek se jírovce po inokulaci postřikem a injikací překrývají na 24h igelitovým pytlem. Po inokulaci vložením segmentu živného agaru s bakterií do jamky se řez na 2-4 týdny překryje parafilmem. 3.5. Způsoby inokulace rostlin jírovce maďalu bakterií Psa Rostliny jírovce maďalu můžeme inokulovat čtyřmi způsoby: 1) Injikací bakteriální suspenze Psa do vzrostného vrcholu jírovce maďalu 7

2) Injikací bakteriální suspenze Psa do letorostů jírovce maďalu 3) Inokulací bakterie Psa do jamkového řezu na kmínku jírovců maďalu jírovce maďalu 4) Postřikem rostlin jírovce maďalu bakteriální suspenzí Psa 3.5.1. Injikace bakteriální suspenze Psa do vzrostného vrcholu jírovce maďalu Jedná se o razantní způsob inokulace s rychlou odezvou, ale současně s nejvyšším rizikem nesprávného vyhodnocení příznaků. Při tomto způsobu se musí dodržovat předepsaná koncentrace a množství inokula. Vyšší hodnoty vedou k tvorbě příznaků zaměnitelných s příznaky, které vyvolávají i další patovary druhu Pseudomonas syringae. Rostliny se 24 h před pokusem nezalévají. Inokulují se jednorázově jedním vpichem cca 15-20 µl bakteriální suspenze bakterie Psa o koncentraci 105-106 buněk/ml inzulínovou jehlou do vzrostného vrcholu v jarním období (přibližně od poloviny dubna do poloviny května). Obdobným způsobem se inokulují kontrolní rostliny sterilní vodou. Pro zvýšení účinku inokulace se vzrostný vrchol překryje na 24h igelitovým obalem. Po ukončení pokusu se rostliny dostatečně zalijí. 3.5.2. Injikace bakteriální suspenze Psa do letorostů jírovce maďalu Jedná se o méně razantní způsob inokulace injikací. Postup inokulace, ošetření jírovců před a po inokulaci i množství a koncentrace bakterie jsou shodné s injikací do vzrostného vrcholu. Provádí se dvěma vpichy do letorostu s minimální délkou 4-5 cm, tak aby při hodnocení bylo možné měřit jednotlivé lokalizované léze. Kontrolní rostliny se injikují stejným způsobem sterilní vodou. 3.5.3. Inokulace do jamkového řezu na kmínku jírovců maďalu jírovce maďalu Jamkový řezem lze jírovce inokulovat jak v jarním období (od poloviny dubna do poloviny května), tak v podzimním období (v září). Rostliny se 24-48h před pokusem nezalévají. Jamkový řez se provádí minimálně 3 cm nad bází nebo nad roubem. Podle výšky kmínku se provádí 1-2 řezy. Druhý řez by měl být minimálně 5 cm od prvního, aby bylo možné měřit velikost jednotlivých lézí. Jednotlivé jamkové řezy jsou cca 1cm dlouhé a jsou vedeny směrem k vodivým pletivům. Mezi vodivá a korová pletiva se vloží segment pevného živného média o velikosti cca 1x1 cm plně porostlého s virulentním kmenem Psa. Mezi jednotlivými jamkovými řezy se skalpel otírá 70% roztokem ethanolu. Stejný jamkový řez se provede i u kontrolních rostlin. Mezi korová a vodivá pletiva se vloží segment čistého živného agaru. Pro zvýšení účinku inokulace se jamkový řez na 7-10 dnů překrývá parafinem. Po inokulaci se rostliny důkladně zalijí. 3.5.4. Postřikem rostlin jírovce maďalu bakteriální suspenzí Psa Tímto způsobem lze inokulovat pouze v jarním období (v květnu) po vytvoření dostatečně velké listové plochy. Inokuluje se ručním tlakovým rozprašovačem. Před každou inokulací se rozprašovač nejprve důkladně propláchne 70-75% etanolem nebo 2% chlornanem sodným (Savem), následně se pak vypláchne vodou. Rozprašuje se bakteriální suspenze o koncentraci 105-106 buněk/ml ve sterilní vodě o pokojové teplotě. U kontrolních rostlin se rozprašuje pouze sterilní voda. Rostliny se před pokusem nejméně 24 h nezalévají. Stříká se pouze za bezvětrného a suchého počasí – listová plocha musí být suchá. Pro zvýšení účinku lze do suspenze přidat několik kapek smáčedla (např. 0,5 ml 20% Tweenu na 1 l bakteriální suspenze nebo sterilní vody). Všechny rostliny se překryjí na 24 h igelitovým obalem a důkladně zalijí. Jednotlivé způsoby inokulace lze kombinovat. Například inokulaci jamkovým řezem v podzimním termínu s injikací Psa do vzrostného vrcholu nebo letorostů na jaře. Důležité je u každé varianty

8

ponechat cca jednu pětinu jírovců jako kontrolu, tj. inokulovat je stejným způsobem sterilní vodou nebo sterilním živným agarem. 3.6. Hodnocení hladiny rezistence genotypů jírovce maďalu vůči bakterii Pseudomonas syringae pv. aesculi Vyhodnocení pokusů na stanovení hladiny rezistence u jednotlivých genotypů jírovce maďalu se provádí u všech způsobů inokulace minimálně 3x v průběhu 3 měsíců. Při inokulacích v jarních měsících se provádí hodnocení po 4-6 týdnech (na konci jarního období), po 8-10 týdnech (v letním období), po 12-14 týdnech (na počátku podzimního období) a konečné vyhodnocení v dubnu následují vegetační sezóny. Po inokulaci do jamkového řezu na podzim se provádí první hodnocení po 4-6 týdnech, další hodnocení na jaře a v létě následujícího roku. Hodnocení hladiny rezistence genotypů se za optimálních podmínek provádí v průběhu několika vegetačních období, bez a s opakovanou inokulací. Každá rostlina se hodnotí individuálně. Při každém hodnocení se zjišťuje: a) přítomnost příznaků a lézí na letorostech (Le), kmínku jírovce (K), poškození vzrostného vrcholu (Vv) a listech (Li) inokulované rostliny (přítomnost příznaků - 1, nepřítomnost příznaků - 0); b) velikost lézí na kmínku (Kcm) a letorostech (Lecm) inokulované rostliny (cm); c) celková vitalita inokulované rostliny (V) v porovnání s kontrolními neinokulovanými rostlinami (není rozdíl mezi inokulovanými a neinokulovanými jírovci – 0, je patrný významný rozdíl ve vzrůstu rostliny velikosti její listové plochy, jírovec stagnuje ve vývoji nebo odumírá – 10). Typické příznaky bleedingu jsou zdokumentovány na obrázcích 2-6 v obrazové příloze. 3.6.1. Hodnocení rezistence vůči bakterii Psa odhadem Významné, na první pohled patrné rozdíly mezi náchylnými a tolerantními genotypy jsou zaznamenávány po 3 měsících až 1 roce. Obecně čím více rostlin daného genotypu infikovaných Psa po inokulaci výrazně stagnuje ve vývoji nebo odumírá, tím více je daný genotyp náchylnější k infekci Psa: genotyp tolerantní až rezistentní k bakterii Psa - odumře nebo stagnuje ve vývoji méně než jedna pětina infikovaných jírovců; genotyp náchylný - odumře nebo stagnuje ve vývoji více jak jedna pětina infikovaných jírovců, tento genotyp není vhodný k další reprodukci. 3.6.2. Hodnocení rezistence vůči bakterii Psa výpočtem U každého genotypu se odděleně sečtou body za vitalitu, přítomné příznaky a velikosti lézí na rostlinách infikovaných Psa a spočítá se průměrná hodnota napadení IFY pro daný genotyp, kde Y je počet infikovaných rostlin. IFY = (IF1Li+IF1Le+IF1K+IF1Vv+IF1Kcm+IF1Lecm+IF1V+ ……… +IFYLi+IFYLe+IFYK+IFYVv+IFYKcm+IFYLecm+IFYV) / Y Odděleně se sečtou body za vitalitu, příznaky a velikost lézí na kontrolních rostlinách inokulovaných sterilní vodou nebo sterilním živným agarem a spočítá se průměrná hodnota Kz, kde Z je počet kontrolních rostlin. Kz = (K1Li+K1Le+K1K+K1Vv+K1Kcm+K1Lecm+K1V+ ……… + KzLi+ KzLe+ KzK+ KzVv+ KzKcm+KZLecm+KZV) / Z Konečná průměrná hodnota rezistence pro daný genotyp RGENOTYP je podílem hodnot KZ a IFY RGENOTYP = Kz/ IFY Pro průměrnou hodnotu RGENOTYP<0,2 je genotyp tolerantní až rezistentní vůči původci bleedingu. Pro průměrnou hodnotu RGENOTYP>0,2 je daný genotyp jírovce maďalu náchylný k napadení původcem bleedingu, bakterií Psa. Tento genotyp není vhodný k další reprodukci. 3.7. Naplnění Kochových postulátů

9

K naplnění Kochových postulátů se provádí reizolace bakterie Psa použitá pro stanovení hladiny rezistence z příznakových rostlinných pletiv infikovaných jírovců. Rostlinné pletivo se maceruje ve sterilní vodě pokojové teploty. Macerát se roztírá na bakteriologickém živném médiu King B (KING et al., 1954). Po 2-4 denní kultivaci při teplotě 21-25°C se hodnotí přítomnost fluorescentních bakterií. Vybrané kolonie jsou po přeočkování po 2 dnech hodnoceny testem oxidázy, hypersenzitivním testem na tabáku a identifikačními systémy Biolog GEN III (Biolog, Inc., Hayward CA) a MIDI (MIDI, Microbial ID, Inc., Newark, DE), případně metodou RT-PCR (Green et al., 2009). Reizolace se provádí i u infikovaných rostlin bez lézí k potvrzení nebo vyloučení latentního přežívání původce BC u tolerantních jedinců. 4. Srovnání novosti postupů Předkládaná metodika hodnocení hladiny rezistence genotypů jírovce maďalu k původci BC, bakterii Pseudomonas syringae pv. aesculi je vzhledem k tomu, že se jedná o novou bakteriální chorobu této okrasné a užitkové dřeviny v České republice, první metodikou svého druhu. Při tvorbě metodiky jsme vycházeli z více jak desetiletých znalostí a zkušeností odborníků s touto novou bakteriální chorobou v západní Evropě a z vlastních zkušeností získaných během testování hladiny rezistence jírovce maďalu vůči škůdci klíněnce jírovcové (Cameraria ohridella), během testování hladiny rezistence okrasných a ovocných dřevin vůči původci bakteriální spály růžovitých, bakterii Erwinia amylovora nebo testování hladiny rezistence vůči bakteriálním původcům korových nekróz na peckovinách, bakteriím Pseudomonas syringae. Předpokládaný metodický postup stanovení hladiny rezistence genotypů jírovce maďalu vůči původci BC využívá ověřených agresivních izolátů získaných ze zahraničí, z Velké Británie, Holandska a Německa a český ověřený virulentní reizolát původem z lokality Měděnec v Krušných horách. Výsledkem tohoto metodického postupu je stanovení náchylnosti, tolerance nebo rezistence daného genotypu jírovce maďalu vůči původci BC, bakterii Psa, v přirozených podmínkách České republiky během jediného roku na základě výpočtu průměrné hladiny rezistence genotypu RGENOTYP. Podle navrhované metodiky mohou specializovaná pracoviště hodnotit i agresivitu izolátů získaných při mikrobiologické analýze vzorků rostlinných pletiv jírovců z lokalit s podezřením na výskyt BC. Zejména metoda inokulace injikací bakteriální suspenze patogena tenkou inzulínovu jehlou do vzrostného vrcholu testovaných jírovců vyvolává rychlou a snadno hodnotitelnou reakci. Do 4-6 týdnů po inokulaci vzrostný vrchol buď zcela odumře a odpadne, v případě, že se jedná o náchylnější genotypy jírovce maďalu nebo naopak se vzrostný vrchol rozvíjí a raší bez jakýchkoliv projevů poškození, pokud se jedná o genotypy jírovce se zvýšenou hladinou rezistence. Prudkou reakci na malé množství inokula umožňuje intenzivní látková výměna, která probíhá ve vzrostném vrcholu. Vysoká vlhkost v pupenu zároveň umožňuje delší přežívání a působení fytopatogenní bakterie. Při tomto způsobu inokulace nedochází (oproti injikaci suspenze do letorostů a inokulaci do jamkového řezu) kromě vzrostného vrcholu k dalšímu poškození rostliny. Tyto jírovce mohou být v další vegetační sezóně opakovaně inokulovány a využity pro dlouhodobé studium opakovaného působení infekčního agens. Rostliny jírovce jsou v průběhu testů na stanovení hladiny rezistence vůči původci BC vystaveny přirozeným klimatickým podmínkám, a lze proto hodnotit i jejich přežívání zimního období a jejich revitalizaci v jarních měsících. Skleníkové pokusy toto hodnocení neumožňují. 5. Popis uplatnění certifikované metodiky Metodika je určena pro šlechtitele a pěstitele okrasných dřevin, to je pro zahradnické a lesnické podniky a výzkumné organizace zabývající se šlechtěním, množením a účelovou výsadbou jírovců v životním prostředí člověka. Rezistentní taxony umožní přímé využití klonového potomstva namnoženého in vitro (Šedivá et al., 2012) pro realizaci nových budoucích výsadeb jírovce odolných k bakterii Psa. Rezistentní a tolerantní genotypy vytvoří také základ následného šlechtění jírovců na odolnost k bakterii Psa. Včasné praktické uplatnění tohoto přístupu cílené selekce s využitím

10

metodiky testování může významně přispět ke snížení budoucích ekonomických i krajinotvorných ztrát spojených s poškozením a odumřením nových výsadeb. Nalezení genotypů se zvýšenou odolností a jejich uplatnění v budoucích výsadbách jírovců k bakterii Psa umožní i stabilizovat výnosy semen v účelových výsadbách a tím zlepšit ekonomickou efektivitu využití semen jako krmiva v chovu spárkaté zvěře v oborách i jako suroviny pro farmaceutický a kosmetický průmysl. Potřebné kultury Psa pro inokulaci jsou k pro praktické využití udržovány ve Sbírce fytopatogenních bakterií ve VÚRV, v.v.i. Praha Ruzyně v rámci Národní programu konzervace a využívání genetických zdrojů mikroorganismů a drobných živočichů hospodářského významu. 6. Ekonomické aspekty Celkové náklady na otestování hladiny rezistence jednoho genotypu jírovce maďalu v polních podmínkách v technickém izolátu se pohybují v rozmezí 4,5 - 5 tis. Kč. Vytvoření jednoho čtyřletého odrostku vhodného pro přeškolkování pomocí mikropropagace je kalkulováno na 1,5 tis. Kč. (Šedivá et al., 2012). Po dopěstování rostlin do podoby sedmi až desetiletých stromků vhodných pro zakládání cílených výsadeb tradičního použití jírovců v ČR je předpokládaná cena jednoho stromku cca 3-5 tis. Kč. V případě napěstování 200 stromků by celková hodnota stromků činila cca 600 tis. až 1 milion Kč. Vzhledem k tradičně vysokému uplatnění jírovců ve výsadbách v ČR a jejich užitných funkcí je předpokládaný ekonomický přínos vysoký. Další přínosy produkce rezistentního jírovce k bakterii Psa spočívají v obecné rovině preventivní ochrany umožňující udržení jeho významné a široké užitné hodnoty v krajině. Vysazováním tolerantních, případně rezistentních genotypů jírovce maďalu se zabrání ekonomickým ztrátám způsobených náhradou chřadnoucích a odumřelých jírovců v parkových a alejových výsadbách. Ze speciálního hlediska přispěje ke stabilizaci produkce semen v účelových systémech, jako jsou obory s intenzivním chovem spárkaté zvěře, čímž sníží nutnost ekonomicky nákladného přikrmování. 7. Seznam použité literatury Bassler, D., Okpanyi, S., Schrodter A, Loew, D., Schurer, M. and Schulz, H. U., 2003: Bioavailability of beta-aescin from horse chestnut seed extract: comparative clinical studies of two Galenic formulations. Adv Ther 2003 Sep-Oct;20(5), p.: 295-304. Brasier, C. M. and Strouts, R. G., 1976: New records of Phytophthora on trees in Britain: I. Phytophthora root rot and bleeding canker of horse chestnut (Aesculus hippocastanum L.). Eur. J. For. Path. 6, p.: 129–136. CAROSELLI, N. E., 1953: Bleeding canker of hardwoods. Sci Tree Top 2, p.: 1-6. Cerny, K., Strnadova, V., Gregorova, B., Holub, V., Tomsovsky, M., Mrazkova, M. and Gabrielova, S., 2009: Phytophthora cactorum causing bleeding canker of common beech, horse chestnut, and white poplar in the Czech Republic. – Plant Pathol. 58 (2), p.: 394-394. Deschka, G. and Dimic, N., 1986: Cameraria ohridella sp. n. Lepidoptera, Lithocolletidae aus Mazedonien. Jugoslawien. In. Acta Ent. Jugosl., 1986, 22/1-2, p.: 11-23. Dijkshoorn-Dekker, M. W. C., 2005: Eindrapport onderzoeksprogramma ‘‘Red de kastanje voor Nederland’’. Praktijkomderzoek Plant & Omgeving, Wageningen: Werkgroep Aesculaap, Boskoop, 48 pp. Durgapal, J. C. and Singh, B., 1980: Taxonomy of pseudomonads pathogenic to horse-chestnut, wild fig and wild cherry in India. Indian Phytopathology 33, p.: 533-535.

11

Ernst E, Pittler M.H. and Stevinson, C., 2002: Complementary/alternative medicine in dermatology: evidence-assessed efficacy of two diseases and two treatments. Am J Clin Dermatol 3(5), p.: 341-348. Green, S., Laue, B., Fossdal, C. G., A’hara, S. W. and Cottrell, J. E., 2009: Infection of horse chestnut (Aesculus hippocastanum) by Pseudomonas syringae pv. aesculi and its detection by quantitative real-time PCR. Plant Pathology 58, p.: 731–744. King, E. O., Ward, M. K. and Raney, D. E., 1954: Two simple media for the demonstration of phycocyanin and fluorescin. J Lab Clin Med 44, p.: 301–307. KORBA J., ŠILLEROVÁ J., PAPRŠTEIN F., SEDLÁK J., 2011: Lokální odrůdy hrušní a jejich hladina náchylnosti k bakteriální spále růžovitých rostlin. Zahradnictví, 2/11, 12-14, ISSN 1213-7596. KORBA J., ŠILLEROVÁ J., 2011: Metodika výběru podnoží peckovin odolných k bakteriím z rodu Pseudomonas, Oponovaná metodika pro praxi, © Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i., Praha, 2011. Kůdela, V., Novacky, A. and Fucikovsky, L., 2002: Rostlinolékařská bakteriologie. Praha, Academia, 346 pp. Liška, J., 1997: Verbreitung der Rosskastanienminiermotte in der Tschechischen Republik. in Forstschutz Aktuell, Juli 1997 Nr.21, p.: 5. Mertelik J., Kloudova K., Pankova I., Krejzar V. Kudela V., 2013: Occurrence of horse chestnut bleeding canker caused by Pseudomonas syringae pv. aesculi in the Czech Republic. Forest Pathology 43, p.: 165-167. Mertelík, J., Kloudová, K., Pánková, I., Krejzar, V. and Kůdela, V., 2012: Vývoj slizotokové nekrózy jírovců způsobené infekcí Pseudomonas syringae pv. aesculi v období 2010 až 2012 na první lokalitě prokázaného výskytu choroby v ČR. Acta Pruhoniciana 101, s.: 5-8. Mertelík J., Kloudová K., Stejskal J., 2010a: Problematika uplatnění klonu jírovce maďalu M06 s rezistentním chováním ke klíněnce jírovcové jako plodonosného stromu v oborách s intenzivním chovem spárkaté zvěře. Acta Pruhoniciana 94, s.: 9-12. Mertelík J., Kloudová K., 2010b: Šlechtitelské osvědčení o udělení ochranných práv k odrůdě podle zákona č.408/2000 Sb. Vydané: Národní odrůdový úřad, Ústřední kontrolní a zkušební ústav zemědělský, Hroznová 2, 65606 Brno. Dne: 23.11.2010. Ochranná práva k odrůdě jírovce maďalu (Aesculus hippocastanum L.), schválený název ´Mertelík´, Číslo šlechtitelského osvědčení: 55/2010, č.j. NOÚ/PO1852/PHA/R55/2010. Mertelík, J., Kloudová, K. a Vanc, P., 2004: Occurrence of Aesculus hippocastanum with high degree of resistance to Cameraria in the czech republic ohridella.Acta fytotechnica et zootechnica, Special number, Proceedings of XVI. Slovak and Czech Plant Protection Conference, vol. 7, p.: 204. Percival, C.G. and Noviss, K., 2010: Managing Pseudomonas Bleeding Canker of Horse Cheastnut. Bartlet Tree Research Laboratories Technical Report. http://www.bartlett.com/resources/ManagingPseudomonas-Bleeding-Canker-of-Horse-Chestnut.pdf. Stelfox, D. and Herbut, M., 1979: Growth of a Phytophthora sp. on carrot agar. Can. Plant Dis. Surv. 59(3), p.: 61-62. 12

Strouts, R. G. and Winter, T. G., 2000: Diagnosis of Ill-health in Trees. 2nd Edition. Norwich, UK The Stationery Office. 332 pp. Suter, A., Bomme, S. and Rechner, J., 2006: Treatment of patients with venous insufficiency with fresh plant horse chestnut seed extract: a review of 5 clinical studies. Adv Ther 2006 Jan-Feb;23(1), p.: 179-190. Šedivá, J., Mertelík, J., Kloudová, K., 2012: Mikropropagace jírovce maďalu (Aesculus hippocastanum L.). Certifikovaná metodika č. 11/2012–057. Webber, J., Rose, J., Parkinson, N., Stanford, H. and Elphinstone, J., 2006: Characterization of Possible Causal Agent of Horse Chestnut Bleeding Canker in the UK. York, UK: Inform. For. Research, Central Sci. Lab. Webber, J.F., Parkinson, N.M., Rose, R., Stanford, H., Cook, R.T.A. and Elphinstone, J.G., 2008: Isolation and identification of Pseudomonas syringae pv. aesculi causing bleeding canker of horse chestnut in the UK. Plant Pathology 57, p.: 368. Použitá literatura je uložena u autorů metodiky.

8. Seznam souvisejících publikovaných článků Mertelík, J., Kloudová, K., Pánková, I., Krejzar, V. a Kůdela, V., 2011: Slizotoková nekróza jírovce maďálu způsobená Pseudomonas syringae pv. aesculi v České republice. Zahradnictví 12(10), s.: 5860. Mertelik J., Kloudova K., Pankova I., Krejzar V. Kudela V., 2013: Occurrence of horse chestnut bleeding canker caused by Pseudomonas syringae pv. aesculi in the Czech Republic. Forest Pathology 43, p.: 165-167. Mertelík, J., Kloudová, K., Pánková, I., Krejzar, V. and Kůdela, V., 2012: Vývoj slizotokové nekrózy jírovců způsobené infekcí Pseudomonas syringae pv. aesculi v období 2010 až 2012 na první lokalitě prokázaného výskytu choroby v ČR. Acta Pruhoniciana 101, s.: 5-8. Pánková, I., Krejzar, V., Kůdela, V., Mertelík, J. a Kloudová, K., 2009: Pátrání po příčině slizotokové nekrózy jírovce maďalu v ČR. Věd. příloha čas. Úroda, s.: 171-174. Pánková, I., Krejzar, V., Mertelík, J. a Kloudová, K., 2012: Potvrzený výskyt původce „bleeding canker“ v ČR. Věd. příloha čas. Úroda 60 (12), s.: 203-206.

9. Obrazová část Titulní fotografie – Semenáčky jírovce maďalu po inokulaci původcem bleeding canker, bakterií bakterií Pseudomonas syringae pv. aesculi . Fotografie z poslední strany – Charakteristický příznak napadení bakterií Pseudomonas syringae pv. aesculi na listu jírovce maďalu.

13

Obrázek 2: léze na kmínku jírovce maďalu

Obrázek 3: léze na letorostu jírovce maďalu

Obrázek 4: léze na letorostu a řapících

Obrázek 5: léze na listech, odumírání listů

Obrázek 6: revitalizace inokulovaného jírovce

14

15