Využití a princip fluorescenční mikroskopie
Fluorescence • fyzikálně chemický děj • typem luminiscence (elektroluminiscence, fotoluminiscence, radioluminiscence a chemiluminiscence) • patří mezi fotoluminiscenční záření, které je vyvoláno buď účinkem jiného dopadajícího záření, nebo účinkem dopadajících částic.
Principy fluorescence • je sekundární záření, které je charakterizováno vyzářením energie ve velmi krátké době, řádově 10-9 s až 10-6 s. • Emitované záření je vyzářeno atomem, který energii pohltil. • Jedná se o přechod z prvního singletového stavu (S₁) do singletové hladiny (S₀).
Principy fluorescence • Název odvozen podle minerálu fluoritu neboli kazivce (CaF₂), u kterého byl tento jev poprvé pozorován. • U anorganických sloučenin je fluorescence pozorována zřídka (například u soli vzácných zemin, sloučenin uranylu apod.). • Častěji u organických látek, z nichž nejčastěji využívanými jsou sloučeniny obsahující aromatické cykly.
Druhy fluorescence • Fluorescence biologických objektů se obvykle rozděluje na primární a sekundární. • Primární je fluorescence látek přirozeně se vyskytujících nebo vznikajících v biologickém objektu (pletivo, buňky). Říká se jí také autofluorescence. • Sekundární fluorescence pochází od látek uměle vložených do objektu. Jsou to většinou fluorescenční sondy nebo značky.
Vnitřní fluorescence (autofluorescence) • Výhodou autofluorescence je malá náročnost na přípravu vzorku. • Není nutné vzorek speciálně chemicky upravovat.
• Např. červená autofluorescence chlorofilu • Za původce autofluorescence buněčných stěn bývá považován lignin a různé fenolické látky vázané v buněčných stěnách.
Vnitřní fluorescence (autofluorescence) • je dána přítomností vnitřních fluoroforů, • proteiny, redukované formy NADH a NADPH, vitamin A, cytochromy, peroxidáza, hemoglobin, myoglobin či chlorofyl. • Proteiny - záření v UV oblasti spektra. Hlavními fluorofory v proteinech jsou aromatické aminokyseliny (fenylalanin, tryptofan, tyrosin), jejichž absorpční i emisní pás leží mezí 240 a 300nm. • Ostatní uvedené látky vyzařují ve viditelné oblasti spektra (modrá, žlutá či červená).
Příklad vnitřní fluorescence I • Řez stéblem zástupce čeledi Poaceae
Příklad vnitřní fluorescence II •
Příčný řez cévním svazkem v řapíku kapradiny zvané jelení jazyk (Asplenium scolopendrium).
Autofluorescence u rostlinných surovin o ochrana listů a stonků před škodlivým UV zářením (především UV-B oblast 280-320 nm) • pozornost byla věnována tzv. modrozelené fluorescenci (BGF) listů. • Tato fluorescence má dvě složky s maximy přibližně u 440 nm a 520 nm. • Fluoreskující látkou mezi těmito látkami je kyselina ferulová, vázaná kovalentně na buněčné stěny.
Autofluorescence u rostlinných surovin o Pokus se zmrazování buněk kůry jabloní • Mrtvé buňky mají výraznou žlutozelenou fluorescenci buněčných stěn. • Podobný efekt byl pozorován i při vysušování buněk. Tento jev nelze zobecnit a neobjevuje se ve všech případech odumírání buněk. • Podstata této fluorescence také není jasná. • Při pozorování jednoduchých preparátů připravených řezáním nebo jiným mechanickým oddělováním se může tato fluorescence objevit na okrajích preparátů, kde je nejvíce poškozených buněk.
Autofluorescence u rostlinných surovin o popis obrazu příčného řezu adventivního kořene ozimé pšenice nebo ječmene jarního: • • • •
rhizodermis fluoreskuje světle zeleně, ostatní parenchymatická pletiva tmavočervenou barvou, střední válec tmavozeleně, xylém ve střední části světlezeleně
Autofluorescence u rostlinných surovin o popis obrazu příčného řezu stébla pšenice nebo ječmene: • Epidermis fluoreskuje zlatožlutě (pšenice) nebo žlutozeleně (ječmen), • sklerenchym matně zeleně, • parenchym matně zeleně, • pochva cévních svazků zeleně. • chloroplasty fluoreskují jasně červeně
Autofluorescence u rostlinných surovin o Autofluorescence dalších rostlinných materiálů: • • • • •
průduchy (některé jejich části) fluoreskují světle zeleně svěrací buňky obsahují chloroplasty a proto fluoreskují červeně pylová zrna fluoreskují světle zeleně a žlutě (kukuřice) škrobová zrna nefluoreskují trichomy fluoreskují světle zeleně
Vnější fluorescence • používány mnohem častěji než vnitřní • přidávány ke studovanému vzorku a podle typu vazby jsou děleny na fluorescenční značky a fluorescenční sondy. • Dále se mohou dělit také podle kvantového výtěžku fluorescence: fluorescenční barviva používaná v klasické fluorescenční cytochemii (například flourescencin, akridinová oranž, atd.) jsou látky jejichž kvantový výtěžek fluorescence se nemění po přidání ke studovanému vzorku. do druhé skupiny patří látky, kde kvantový výtěžek závisí na bezprostředním okolí fluoroforu
Fluorescenční barviva (fluorochromy) • obsahují ve své molekule reaktivní skupinu, která je schopna reagovat s nukleofilními skupinami (NH₂, OH, SH). • obecně se fluorofory dělí na: • vnitřní (vlastní, intrinsic) • vnější (nevlastní, extrinsic)
Fluorescenční značky • Nejčastěji se používají k fluorescenčnímu značení proteinů, ke kterým se váží kovalentní vazbou. • V některých aplikacích je také využívána vazba biotin-avidin, kdy je studovaná molekula (receptor, polynukleotid, polysacharid atd.) označena biotinem a poté je detekována fluorescenčně značeným avidinem. • Nejznámějšími fluorescenčními značkami jsou FITC a TRITC
Fluorescenční značky • FITC je barvivo s absorpčním maximem při 495 nm, maximální fluorescencí při vlnové délce 519 nm (zelený fluorofor) a molekulovou hmotností 389. • citlivost je značně ovlivněna hodnotou pH. • poměrně snadná fotodestrukce.
• Proto byly připraveny difluoroderiváty,které jsou stabilnější vůči světelnému záření a navíc mají nižší disociační konstantu pKₐ, což přispívá ke snížení závislosti citlivosti fluorescence na pH.
Fluorescenční značky • Nová skupina fluorescenčních značek je označována BODIPY. • obsahují atomy bóru. • vysoký kvantový výtěžek fluorescence • poměrně široké emisní spektrum • nejsou závislé na polaritě prostředí a pH
Fluorescenční sondy • jsou vnější fluorofory, které se váží ke struktuře nekovalentní vazbou a často při tom mění své fluorescenční vlastnosti. • používány ke studiu změn konformace bílkovin, tloušťky membrán, membránového potenciálu apod.
• Pro FISH jsou nejdůležitější sondy pro nukleové kyseliny • K identifikaci a vizualizaci chromozomů se používá akridinová oranž, ethidium bromid, DAPI
Fluorescenční sondy • sondou pro vizualizaci veškeré jaderné DNA je DAPI. Jeho absorpční maximum je při 345 nm, maximální fluorescence je při 455 nm (modrý fluorofor) a má molekulovou hmotnost 277. • Dalším často používaným fluoroforem je akridinová oranž. Jedná se o fluorescenční sondu, jejíž absorpční a emisní pásma se liší podle substrátu, ke kterému je vázána DNA/RNA.
• Obě jsou většinou dodávány v podobě chloridových solí.
Přístroje založené na měření fluorescence • spektrofluorimetry – měří střední signál celého vzorku umístěného obvykle v kyvetě nebo v jamce mikrodestičky • fluorescenční skenery (včetně čteček mikrodestiček) – měří fluorescenci dvojrozměrných makroskopických objektů (elektroforetické gely, bloty, chromatogramy) • průtokové cytometry – měří fluorescenci velkého množství jednotlivých buněk a umožňují identifikaci a separaci jejich subpopulací
Přístroje založené na měření fluorescence • fluorescenční mikroskopy – umožňují pozorovat fluorescenci dvojrozměrných nebo trojrozměrných mikroskopických objektů. • nachází široké uplatnění zejména v medicíně a v oblasti přírodních věd.
•
Příklad: na jednu protilátku navážeme fluorescein (emituje zelené světlo při excitaci modrým světlem) a na jinou rhodamine (emituje červené světlo při excitaci žluto-zeleným světlem), pak můžeme porovnávat vzájemné pozice různých molekul ve stejné buňce apod.
Fluorescenční mikroskopie • umožňuje zobrazit určité látky obsažené v buňkách často v minimálním množství • je založena na skutečnosti, že některé chemické látky (fluorochromy) po dopadu světla o kratší vlnové délce září světlem o delší vlnové délce - tedy světlem jiné barvy - fluorescence. • je projevem intramolekulové energetické změny vzbuzené v látce absorbovaným zářením.
Princip fluorescenční mikroskopie • Princip - vazba fluorochromu na určitou buněčnou složku (polysacharid, protein), která pak např. v modrém budícím světle září světlem žlutým. • Aby modré světlo budící fluorescenci nevadilo při pozorování, musí být odstraněno bariérovým filtrem. • Ten pohltí modré světlo vycházející z preparátu do objektivu a do okuláru propustí jen světlo žluté. • Výsledkem je tedy obraz žlutě zářících struktur v temném poli.
Funkce fluorescenčního mikroskopu • je založena na následujících dvou principech: • Na vzorek se nechá dopadat pouze světlo v intervalu vlnových délek, které způsobují excitaci • K vytvoření obrazu se použije pouze nezbytně nutná část fluorescenčního světla, které obsahuje i neabsorbovanou část excitačního světla. Obraz se buď pozoruje, nebo se zachytí na mikrofotografii. Volba vlnové délky je velmi podstatná. Proto je ve fluorescenční mikroskopii důležitá volba vhodných optických filtrů.
Základní součásti fluorescenčního mikroskopu • •
•
•
•
Pro činnost fluorescenčního mikroskopu jsou nezbytné čtyři základní součásti: Zdroj světla: Ze světelného zdroje vychází světlo s různými vlnovými délkami od ultrafialové po infračervenou Excitační filtr: Tento filtr propouští pouze světlo, které je potřebné k fluorescenci vzorku, především obvykle s kratší vlnovou délkou. Ostatní světlo pohlcuje. Fluorescenční preparát: Vzorky, které reagují na dopadající světlo fluorescencí (většinou po přidání barvivafluorochrom). Bariérový filtr: Tento filtr pohlcuje všechno excitační světlo, které nebylo použito k excitaci a propouští pouze fluorescenční světlo. Navíc je možné z fluorescenčního spektra nechat projít pouze jeho část.
Princip konstrukce fluorescenčního mikroskopu
Fluorescenční mikroskopie v odraženém světle (epifluorescence) • Dichroické zrcadlo odráží excitační světlo o určité vlnové délce směrem ke vzorku, propouští ostatní vlnové délky a také odráží osamocené paprsky excitačního světla zpět ve směru zdroje. • Bariérový filtr zachytí zbytky excitačního světla, které nebylo použito k excitaci a propouští pouze fluorescenční světlo, čímž poskytuje černé pozadí k fluorescenčnímu obrazu.
Fotobleaching • fluorofory jsou intenzivním zářením rozkládány a ztrácejí schopnost absorpce a emise – tzv. fotobleaching • při absorpcích a následných emisích dochází k uvolňování volných radikálů, které mohou poškozovat fluorofory, způsobovat tak fotobleaching a v neposlední řadě negativně ovlivňují životaschopnost buněk
Využití fluorescenční mikroskopie • o • o o
• o
V mikrobiologii: slouží k mikroskopickému průkazu mikroorganismů v klinických vzorcích (sputum, moč, kožní šupiny aj.). V imunodiagnostice: k detekci buněčných antigenů sdružených s určitými chorobami. molekuly protilátky (zpravidla monoklonální) označené navázaným fluorochromem se specificky vážou s molekulami buněčných a tkáňových antigenů, čímž vznikají komplexy (antigen+protilátka+fluorochrom), které ve vhodném budícím záření v mikroskopu fluoreskují a tím indikují přítomnost antigenu v buňce či tkáni. V diagnostické aplikace v klinice: umožňují vizualizovat kterýkoli genový produkt na buněčné úrovni.
• Děkuji za pozornost
