Fluorescenční a konfokální mikroskopie

 

Fluorescenční a konfokální mikroskopie   Hana Sehadová, Biologické centrum AVČR, České Budějovice, 2011   

Co je to fluorescence?  

některé látky (fluorofory) po ozáření (excitaci) světlem jsou schopny absorbovat světlo určité  vlnové délky a následně vyzařovat (emitovat) světlo o delší vlnové délce        λ emit > λ excit    (= Stokeovo pravidlo)   

                    

 

•   •   •   •  

        

molekula absorbuje světlo o vysoké energii  (v tomto případě modré)  energie molekuly se zvýší   (= excitovaná molekula)  část energie je pohlcena molekulou   (vlnovka)  molekula vyzařuje světlo o nižší energii   (v tomto případě zelené) 

 

  Fotovybělování (Photobleaching) – fluorofory jsou intensivním světlem rozkládány  a trvale ztrácejí schopnost fluorescence            omezit jejich expozici   (nevratné strukturní změny vedou až k úplnému vyblednutí) 

   

Co se děje s molekulami fluoroforu?  

světlo (= fotony) nese určitou energii, kterou předávavá elektronům v molekulách 

 

       světlo kratší vlnové délky = více energie ‐ délka vlny je kratší a fotony kmitají rychleji     



  

            

 

 

dochází k “excitaci elektronů” ‐ přesouvají se do  vyšší energetické hladiny tj. pohybují se kolem  jádra molekuly ve větší vzdálenosti (orbitalu)  elektron obsahuje energii “navíc”, která má  tendenci se uvolnit, když je elektron “přitažen”  jádrem molekuly opět na nižší energetickou  hladinu (orbital)   energie se uvolní v podobě fotonu, který je  vyzářen  (= fluorescence)  

 

   

 při přeměně energie dochází ke ztrátám ‐ část energie se uvolní do prostředí v podobě          tepla (tepelných pohybů molekul), vyzářený foton tudiž nese menší množství energie    

 

Luminiscence  = jev, kdy látka vysílá do prostoru světlo   

Fotoluminiscence  k luminiscenci dochází po ozáření    • Fluorescence je přechod mezi tzv. povolenými stavy atomu a tudíž jí nic nebrání ve  vypouštění fotonů již za pár nanosekund. Vyzařování emisního světla trvá krátkou dobu  a po zhasnutí excitačního záření téměř okamžitě emise zhasíná (asi za 100 pikosekund).      • Fosforescence proti tomu je  přechod tzv. zakázaný. Žádný  zákaz však nezadrží fotony  věčně, a tak i při fosforescenci se  fotony vyzáří, ale trvá to občas  až několik minut: tj. k emisi  může docházet i dlouhou dobu  po zhasnutí excitačního záření.       

  Bioluminiscence  liší se způsobem jakým se molekula dostane do excitovaného stavu             chemická reakce (přirodní forma chemiluminiscence)   

 

 

     

 

         enzym luciferáza katalyzuje oxidaci luciferinu a tato chemická reakce vede k emisi světla   

 

Využití fluorescence  Nejširší užití v buněčné biologii a molekulární genetice:  

specifické označení molekul ve tkáni (bílkovin, lipidů, sacharidů) 



zviditelnění některých buněčných struktur (jádra, cytoskelet) 

 nalezení určitých sekvencí nukleotidů v DNA či RNA aj.                                    

Fluorofory  Autofluorescence (= primární fluorescence) ‐ přírodní 

•

např.  ‐     chlorofyl (při ozáření UV světlem emituje světlo červené)  - celulóza  - keratin aj.             Příklady autofluorescence 

    • Fluorescenční barvení (= sekundární) ‐ užívá se ke zviditelnění molekul a buněk,                                                                                        které nemají autofluorescenci      ‐     fluorofory se samy vážou na buněčné struktury (= přímá) ‐ např. DAPI na DNA  ‐     kovalentní spojení fluoroforu s látkou, která se specificky váže na určitou buněčnou  strukturu či se akumulují v charakteristické lokalizaci ‐ např.toxiny jako je faloidin (jed  muchomůrky zelené), který se specificky váže na polymerovaný aktin, lysotrackery (v  pozdních endozómech a lysozómech), mitotrackery (v mitochondrií), ER‐tracker (v  endoplazmatickém retikulu)  ‐     značení protilátek fluorofory ‐ monoklonální či polyklonální  ‐     připojení fluoroforu ke genetické informaci kódující konkrétní bílkovinu,  jejíž osud v  buňce nás zajímá (upravený gen vneseme zpět do buňky, protein je syntetizován spolu se  „svítící“ značkou, tudíž můžeme sledovat jeho lokalizaci a dynamiku v buňce) ‐ např. GFP 

   •

barva (tj. vlnová délka) pohlceného (excitovaného) i vyzářeného (emitovaného)       světla závisí na vlastnostech fluoroforu 

 

  •

existuje široká paleta fluoroforů             ‐  pokrývá celé spektrum viditelného  světla (s přesahy do ultrafialové a  infračervené oblasti)    

   

Příklady některých fluorescenčních barviv  DAPI ‐ interkaluje do struktury DNA     a RNA (modře)   

GFP  ‐  zelený fluorescenční protein   

FITC ‐ fluorescein isothiokyanát  (oblíbený fluorofor, snadno  kovalentně modifikující např.  protilátky) 

    Absorpční a emisní spektra        se překrývají   

 

Fluorescein ‐ vyzařuje zelené světlo,  když je osvícen modrým   

Cy3, Cy5 a Alexa 568 ‐ fluorofory  vyvinuté specielně pro fluorescenční  mikroskopii, vysoce fotostabilní a s  vysokou účinností fluorescence 

 

  Chemická specifikace fluorescenčních barviv  •

velké molekuly, obsahující velké množství elektronů, které lze snadno a koordinovaně  excitovat a které se také rychle vracejí zpět do nižší energetické hladiny 

•

nejčastěji se jedná o aromatické sloučeniny a heterocykly s elektrony konjugovanými v  plochých "mracích" nad a pod rovinou ploché molekuly 

 

 

Zelený fluorescenční protein (GFP)  objev GFP přinesl obrovský posun ve fluorescenční mikroskopii živých buněk  • • •

• •

• •

protein mořské medúzy Aequorea victoria  při vystavení modrému světlu fluoreskuje zeleně  využívá se jako reportérový gen pro vizualizaci exprese  proteinů (genovými manipulacemi je vnesen za  promotor příslušného genu a vnesen do organismu, což  umožňuje “značkování” proteinu pro on‐line sledování   in vivo traffickingu či testování lokalizace)  velikost ‐ 238 aminokyselin (29.6 kDa)  terciální struktura GFP   ‐ charakteristické „soudečkovité“ uspořádání vytvořené       antiparalelními β‐listy 

Terciální struktura GFP 

‐ 11 beta‐vláken se sbaluje do velmi kompaktního beta‐ barelu. Uvnitř tohoto soudku se nachází vlastní  chromofor, který je tak chráněn před vnějším  prostředím.  ‐ chromofor vzniká cyklizací a následnou oxidací           postranních zbytků aminokyselin Ser65, Tyr66 a Gly67  cílenou mutagenezí vzniklo několik odstínů odvozených  od GFP (např. YFP, CFP, BFP + nepřibuzný RFP)  do jedné buňky lze vnést několik genových konstruktů  kódujících několik různě barevně označených proteinů     a simultánně sledovat jejich osud v buňce  využity i geny jiných druhů ‐ např. Korálů 

 

•   V souvislosti s objevením a využitím GFP udělena Nobelova cena za chemii 2008   

 

O. Shimomura ‐ objev  proteinu u medúzy    M. Chalfie ‐ detekce genu,  genové manipulace, využití  proteinu jako markeru  („značkovače“) v genetických  výzkumech    R.Y. Tsien ‐ vylepšení proteinu  a rozšíření škály (drobnými  úpravami vytvořil celou  barevnou škálu značkovacích  fluorescenčních proteinů)   

 

     

“San Diego beach scene”  nakreslena živými bacteriemi     exprimujícími 8 různých barev        fluorescenčního proteinu 

Jan Černý: Zelený fluorescenční protein, Vesmír 4/2009

 

 

Fluorescenční mikroskop ‐ Princip 

podobný klasickému světelnému mikroskopu ‐ doplněný o silný zdroj světla a dva typy filtrů                                      

•

 

Excitační filtr  • mezi zdrojem světla a vzorkem  • umožňuje excitovat jednotlivé   fluorofory světlem o vybraných   vlnových délkách    

Bariérový (emisní) filtr  • mezi vzorkem a okulárem  • do okuláru proniká pouze pozitivní  emitovaný signál na černém pozadí  (excitující záření je odfiltrováno)              vyšší citlivost             možno použít více než jeden typ barviček v jednom vrozku (nejčastěji 2‐3)             změna excitačního světla umožní vždy zviditelnit jinou část tkáně   

Typy fluorescenčních mikroskopů     

trans‐fluorescenční (Transmition light fluorescent microscope)  

    

     ‐ osvětlení vzorku z druhé strany          než je objektiv          ‐ světlo prochází excitačním filtrem a na  preparát dopadá ze spodu, tzv. zástinový  kondenzor odraží světlo tak, ze dopadá na  preparát zboku a excitační světlo tak  prochází mimo objektiv           do objektivu  se dostane pouze emitovaná fluorescence    

 epi‐fluorescenční (Reflected light fluorescent microscope)             ‐ osvětlení vzorku přes objektiv          ‐ emisní světlo se vrací zpět do objektivu                    nutno použít tzv. dichroické zrcadlo,            které odráží excitační světlo do objektivu            a propouští emisní světlo do okuláru           ‐ častěji užívané 

   

 

Schema epifluorescenčního mikroskopu   osvětlení = rtuťová výbojka (UV + viditelné světlo) 

 

                               excitaton filter   dichroické zrcadlo (= dichromatické)     ‐ odráží světlo kratší než určitá vlnová délka       a propouští světlo delší než je tato délka     ‐ pomahá excitačnímu a emisnímu filtru        odstranit nežádoucí světlo         tmavé pozadí   objektive + vzorek   emisní filter   detektor + software pro obrazovou analýzu      ‐ umožňuje zpracovávat obrazový výstup         kvantitativním i kvalitativním způsobem  

 

 

Vhodná kombinace dichroického zrcadla, excitačního a emisního  filtru pro určitý druh fluoroforu se do epifluorescenčního  mikroskopu vkladá pohromadě jako tzn. kostka, jejíž dvě stěny  jsou tvořeny filtry a uhlopříčka dichroickým zrcadlem. Kostky  jsou umístěny na výměníku a je možné je vyměňovat dle  potřeby. Dva a více fluoroforů v jednom vzorku může být  detekováno odděleně použitím různých sad optických filtrů.    

 

 

Historie fluorescenční mikroskopie    • počátek 20. století ‐ první fluorescenční mikroskop                 ‐ vychází z konstrukce mikroskopu pro UV záření                 ‐ August Kőler, Carl Reichert, Heinrich Lehmann, a další                 ‐ využití mikroskopu nebylo doceněno několik desetiletí    • 1930 ‐ rakouský vědec Max Haitinger a další vyvinuli techniku sekundarní fluorescence    • 1950 ‐ zdokonalení techniky, Albert Coons a Nathan Kaplan předvedli lokalizaci antigenu ve  tkáni pomocí reakce s fluorescenčně značenou protilátkou    • 1980 ‐ metoda excitace vzorku pomocí evanescentních vln při totálním odrazu, Daniel  Axelrod ‐ rozlišení malých detailů     • současná konstrukce fluorescenčních mikroskopů pochází z roku 1932 od E. Singera 

      

 

Konfokální mikroskop  Základní rozdíl mezi fluorescenčním a konfokálním mikroskopem je rozlišovací schopnost  • světlo z fokálního bodu čočky  objektivu davá ostrý obraz   

• světlo z jiného bodu než je        fokální, je také zobrazeno   čockami mikroskopu, ale jeho     obraz není ostrý     • fluorescenční mikroskop  ‐ celý vzorek je zcela osvícen,  tudíž celý vzorek fluoreskuje a   nezaostřené body tvoří pozadí 

 

                  X  • konfokální mikroskop   ‐ použití “pinhole” (= bodová         clonka) odfiltruje neostrý signál   

 

         pinhole je konjugován s fokálním bodem čočky = konfokální pinhole 

    Rozlišovací schopnost mikroskopu  •

je dána minimální vzdáleností dvou ještě rozlišitelných bodů  

•

v případě optického mikroskopu ji lze teoreticky odvodit spojením Rayleighova kritéria             s teorií difrakce (ohyb vlnění) na kruhovém otvoru: 

 

                                                 X min  = 0,61 . λ / n sin θ                 kde   • λ je vlnová délka světla ve vakuu  •  n index lomu prostředí před objektivem  • θje polovina vrcholového úhlu kužele paprsků vstupujících do objektivu    Rayleighovo kritérium (1879) vychází ze skutečnosti, že lidský zrak zaznamená pozvolný předěl mezi dvěma difrakčními  kroužky teprve tehdy, poklesne‐li intenzita mezi nimi alespoň o 20 % oproti přilehlým maximům (pro modré světlo ‐  viditelné záření nejkratších vlnových délek ‐ se teoretická rozlišovací schopnost blíží hodnotě kolem 0.17 mm) 

    Velikost konfokální pinhole  ‐ velikost konfokální pinhole se musí shodovat s velikostí Airyho kruhu:                                             pinhole je menší            ztrácíme užitečné světlo                                           pinhole je větší              promiká více světla mimo focus       

 

‐ difrakce způsobuje, že obrazen bodového světla není bod, ale tzv. Airyho kruh 

 

 

Graph zobrazuje intensitu  světla jako funkci průměru  bodového světla (průměr = 4) 

   

       

 

 

Obraz Airyho kruhu je cirkulárně  symetrický. V ideálním světě by byl  obrazem bodu pouze intensivní  bod přímo v centru (průměr = 0). 

 

 

 

      Na přeexponovaném        obrazu Airyho kruhu      vidíme sekundarní kruh. 

Typy konfokálních mikroskopů  • laserový rastrovací konfokální mikroskop = LSCM (Laser Scanning Confocal Microscope)        ‐  skenující zařízení zařizuje posun ohniska excitujícího laserového paprsku         ‐  obraz celé zaostřené roviny lze pak získat rastrováním bod po bodu některým z těchto postupů:  • rozmítání laserového paprsku  • příčný posuv vzorku před objektivem  • posuv objektivu nad vzorkem   

•

mikroskop s rotujícím diskem = TSCM (Tandem Scanning Confocal Microscope)  ‐  místo skenujícího zařízení obsahuje rotující Nipkowův kotouč, na kterém je mnoho navzájem      oddělených clonek 

  Historie konfokální mikroskopie  •

•

•

Marvin Minsky 1957 – patentoval nápad na konfokální mikroskopii, ale nenašel vhodný zdroj     světla 

  M. Petráň a M. Hadravský 1967 –  z Lékařské fakulty UK v Plzni patentovali konfokální mikroskop  na bázi rotujícího Nipkowa kotouče (Tandem Scanning Confocal Microscope). S tímto přístrojem  byly poprvé získány kvalitní optické řezy silným preparátem, konkrétně mozkovou tkání.  Koncem 70. let – první spolehlivý konfokální mikroskop  s rozmítaným laserovým paprskem 

 

Schema tandemového skenovacího konfokálního mikroskopu 

  • Nipkowův kotouč: ‐ obsahuje desítky až stovky tisíc otvorů (až 200 tis) uspořádaných                                           v Archimedových spirálách        ‐ rotuje rychlostí až desítky Hz        ‐ otvory jsou konjugované (v dopadajícím a detekovaném světle)        ‐ světlo může procházet také stejným souborem otvorů   • vzorek se většinou pozoruje v reálném čase okem (okulár) nebo chlazenou CCD kamerou    

Schema rastrovacího konfokálního mikroskopu   osvětlení = bodový zdroj světla = laserový  paprsek fokusovaný na clonku   clonka (Light Source Pinhole) ‐ je objektivem  mikroskopu zobrazena na vzorek, do bodu      o průměru rovnajícím se difrakční mezi  mikroskopu   excitační filter   dichroické zrcátko   objektiv ‐ sbírá světlo vzorkem odražené nebo  rozptýlené   emisní filter   druhá konfokální bodová clonka (Detektor    Pinhole) ‐ v místě  kam objektiv zaměřuje  světlo z ohniskové roviny vzorku (odfiltruje    až 95% emitovaného světla)   detektor = fotonásobič ‐ propojen s  počítačem 

 

        Paprsky jdoucí z mimoohniskových rovin jsou  zachycené clonkou 

 

Rastrování rozmítáním laserového paprsku  •

dvě otočná řádkovací zrcadla ‐ umožňují osvícení celého vzorku 

•

pro rastrování může být použito také pohyblivé dichroické zrcadlo 

  Analýza obrazu   

• vždy pouze jeden bod ze vzorku je vyobrazen         ‐ detektor je připojen na počítač, který          zároveň dostává informaci o souřadnicích  snímaného bodu a skládá obraz (vždy přidá  jeden pixel)   

‐ např. obrázek 512 x 512 pixel může být     oskenován cca 3x za sekundu   

‐ ke zrychlení může dojít např. náhradou     jednoho skenovacího zrcadla “Acoustic      Optical Deflector”, který užívá vysoce         frekvenční zvukové vlny – zrychlení 10x    •  bod po bodu je oskenován celý vzorek        v ruznůch optických rovinách, vzdálenosti        mezi jednotlivými rovinami snímání by        měly být vždy menší než hloubka ostrosti        jednotlivých snímků    •  skenování ovládáno počítačem – sestaví velmi       čistý 3D obraz (i perspektivní), přičemž objekt        lze zobrazit z libovolné strany (zorného úhlu) 

     

 

Dekonvoluce obrazu  = matematická metoda korekce objektů pro dosažení vyšší ostrosti obrazu   

•

je‐li znám stupeň zkreslení (tj. lze ho matematicky popsat jako konvoluci pomocí funkce  bodových pokryvů), pak lze obraz podrobit dekonvoluci 

•

obraz po dekonvoluci se tak více podobá skutečnému tvaru objektu a stává se tak ostřejší, s  menším šumem a větším rozlišením 

•

Prakticky se dekonvoluce provádí tak, že se pomocí konkrétného mikroskopu pořídí snímky  malé latexové kuličky (známe její tvar) a podle získaných snímků se stanoví míra zkreslení dané  optické soustavy. Následně je získaný obraz přepočítán tak, aby kulička byla zobrazena jako  kulička. Tato korekce se poté používá i pro ostatní objekty. 

  Sekvenční versus současné skenování několika lassery  ‐  při použítí několika fluoroforů v jednom vzorku, kdy každý fluorofor poskytuje různou barvu  excitovaného světla   

sekvenční skenování = postupné snímání emitovaného záření různých fluoroforů, kdy se tyto  fluorofory liší použitým laserem pro excitaci  

•

 ‐  nejprve je získán kompletní obraz emitovaný jedním fluoroforem, potom dalšími          (preparát zůstává na stejném místě)          ‐  následně lze pomocí softwaru složit získané obrazy do jednoho   



současné snímání fluorescenčních obrazů pomocí tří fotonásobičů se spektrálními filtry    ‐   spektrální filtry pro modrou, zelenou         a červenou barvu  ‐   rekombinací dílčích obrazů v základních   barvách získáme optický řez v reálných  barvách emitované fluorescence       



nahrazení fotonásobiče spektrofotometrem – i pro fluorofory s blizkými emisnimi maximy 

 

 

Příklady snímků pořízených konfokálním mikroskopem 

  Vnitřní ucho (hlemýžď) ‐ Corttiho orgán   • zeleně ‐ vláskové buňky (receptory sluchu)                        (fluorescenin phalloidin se váže na aktin)  • modře ‐ jádra vnitřních buněk (DAPI)  • červeně ‐  neurony 

   

Rekonstrukce dendritické buňky diferencované z  kostní dřeně geneticky modifikované myši (gen  pro MHC glykoprotein II třídy značen GFP)  •  zeleně ‐ endozomální systém (vizualizovaný pomocí                     MHC II. třídy GFP)  •  červeně ‐ mikrotubulární cytokelet (monoklonální                        protilátka proti tubulinu)  •  modře ‐ jádro (DAPI)    

 

 

Střevní tkáň myši 

Buňka endotelu plicní tepny skotu 

• červeně ‐ aktin (RFP + Alexa Fluor 568 navázána na                         phalloidin)   • modře ‐ N‐acetylglucosamine a N‐acetylneuraminic                     residua (Alexa Fluor 350 navázána na lektin                     – aglutinin z pšeničných klíčků)  • zeleně ‐ DNA (SYTOX Green) 

•   červeně ‐ buňka (MitoTracker Red CMXRos) 

 

   

         

•   zeleně ‐ aktin (Alexa Fluor 488 navázána na                      phalloidin)   •   modře ‐ DNA (Hoechst 33258) 

 

 

Srovnaní flourescenční a konfokální mikroskopie ‐ shrnutí  Fluorescenční mikroskopie:  

  Konfokální mikroskopie: 

předpokládá nekonečně malou tloušťku  preparátu (vzorku), při zkoumání silných  vzorků je kvalita zobrazení nepříznivě  ovlivňována překrýváním obrazu roviny, do níž  je mikroskop právě zaostřen (ohnisková  rovina), neostrými obrazy rovin ležících nad ní  a pod ní  



lze zkoumat jen vzorky o tloušťce menší, než je  hloubka ostrosti objektivu, která závisí na  jeho numerické apertuře (Z min = 0,25 nλ/NA2) 



obrazem bodu není bod, ale Airyho kroužky           difrakční obrazec vzniká ohybem  zobrazujícího se světla na čočkách objektivu,  při zobrazení blízkých bodů se mohou jejich  Airyho kroužky překrývat, až se stanou téměř  nerozlišitelnými 



zdroj světla ‐ rtuťová výbojka 



nižší cena 

• vyšší rozlišovací schopnost daná detekcí  světla pouze z ohniskové roviny mikroskopu,  přítomnost pinhole eliminuje neostrý signál  jak vertikálně tak horizontálně           minimální hloubka ostrosti   • možnost optické tomografie – 3D  rekonstrukce obrazu, která není limitována  Rayleighovým kriteriem: obraz vzniká  skládáním z jednotlivých bodů, které jsou  navíc pozorovány přes clonku, jejíž rozměry  bývají menší než průměr Airyho kroužků   • vyžaduje mimořádně silné zdroje světla     typu laserů a speciální technologii      detekce fotonů z horizontalní roviny 

 



5‐10x dražší 



nevýhodou je zatíženost statistickým  šumem, jehož velikost je úměrná √N/N, kde  N je počet detekovaných fotonů (nelze  snadno řešit zvýšením intenzity záření) 

 

                         

                       

           

 

          Pigment Dispersní Hormon (PDH)             v mozku Drosophila melanogaster                snímky stejného mozku pořízené 

     fluorescenčním a konfokálním mikroskopem  

                                                    

 

 

           Praktická část ‐ demonstrace práce na konfokálním mikroskopu                                                       FluoViewTM FV1000