FLUORESCENČNÍ MIKROSKOPIE OBSAH A. ZADÁNÍ ............................................................................................................................... 1 B. SEZNAM POMŮCEK ........................................................................................................ 1 C. TEORIE ............................................................................................................................... 2 I. Fluorescenční mikroskop Hund H600 AFL........................................................................ 2 Fluorescenční režim ........................................................................................................... 2 Popis mikroskopu ............................................................................................................... 3 II. Autofluorescence rostlinného pletiva ................................................................................ 6 II.1 Studium působení herbicidů a abiotických stresů na chloroplasty v buňce ................ 7 III. Stanovení pH pomocí fluorescenčních barviv ................................................................. 8 IV. Testování vitality buněk pomocí fluorescenčních sond ................................................... 9 D. POSTUP ............................................................................................................................... 9 I. Fluorescenční mikroskop Hund H600 AFL........................................................................ 9 Centrování rtuťové výbojky ................................................................................................ 9 Nastavení binokulárního tubusu....................................................................................... 10 Návod k obsluze digitálního fotoaparátu OLYMPUS CAMEDIA C-3000 ZOOM .......... 10 II. Autofluorescence rostlinného pletiva .............................................................................. 14 II.1 Studium působení herbicidů a abiotických stresů na chloroplasty v buňce .................. 14 III. Stanovení pH pomocí fluorescenčních barviv ............................................................... 14 IV. kontrastování buněk (buněčných komponent) pomocí akridinové oranže .................... 15 E. LITERATURA................................................................................................................... 15
Před zahájením vlastní práce projdeme znalosti teoretické části. V případě absence základních znalostí nemohou být praktika zahájena!
A. ZADÁNÍ 1. Seznamte se důkladně s konstrukcí a ovládáním jednotlivých prvků fluorescenčního mikroskopu Hund / Wetzlar H600 AFL 50/100 a s obsluhou digitálního fotoaparátu OLYMPUS CAMEDIA C-3000 ZOOM 2. Zcentrujte rtuťovou výbojku (viz D.I). 3. Proveďte 2 z uvedených úloh (D.II – D.IV) 4. Vzhled preparátu ve fluorescenčním mikroskopu popište, vyhodnoťte výsledky.
B. SEZNAM POMŮCEK Přístrojové vybavení: Fluorescenční mikroskop Hund H600 AFL, pH metr, digitální fotoaparát OLYMPUS CAMEDIA C-3000 ZOOM Materiál: kvasnice, předpěstované rostliny obilovin, mech (měřík – Rhizomnium punktatum nebo R. undulata), řasy Chemikálie: pufry (TRIS, MES), etanol, fluorescenční barviva (FDA, AO), destilovaná voda Ostatní potřeby: podložní a krycí sklíčka, Petriho misky, mikropipety, kádinky, skalpel
1
C. TEORIE I. Fluorescenční mikroskop Hund H600 AFL může pracovat jako: a) Transmisní (v režimech světlého pole, temného pole a fázového kontrastu) b) Fluorescenční Fluorescenční režim Fluorescenční mikroskopie pracuje se dvěmi metodami, pomocí epifluorescence (pozorování v odraženém světla) nebo diafluorescence (pozorování v procházejícím světle). Fluorescenční metoda pozorování v procházejícím světle se v současnosti téměř nepoužívá. Fluorescenční mikroskopy jsou vybaveny intenzivním světelným zdrojem, obvykle se používají buď vysokotlaké rtuťové (50-200W) nebo xenonové výbojky (75-150W). Obloukové lampy se zahřívají vysokonapěťovými pulsy a jsou umístěny ve skříňce (tzv. housing), která je spojena s nástavcem pro osvětlení dopadajícím světlem (obr. 1). Jsou zde také umístěny ND filtry, které umožňují snížit intenzitu excitačního zařízení. Důležitou součástí fluorescenční výbavy je systém filtrů, který je u episkopické metody tvořen excitačním filtrem, dichroickým zrcadlem a bariérovým filtrem (obr. 2). Filtry lze umístit do specializované optické kostky (filtrblok). Moderní fluorescenční mikroskopy jsou schopny pojmout 4 až 6 fluorescenčních kostek na otočném revolveru nebo posuvných šoupátkách, což umožňuje jejich jednoduchou výměnu pro potřebnou aplikaci (obr. 1).
Obrázek 1: Schéma epifluorescenčního iluminátoru.
2
Obrázek 2: Schéma optické kostky. Epifluorescence spočívá ve vertikálním osvětlení excitačním světlem o požadované vlnové délce a objekt je pozorován přes objektiv. Světlo emitované rtuťovou výbojkou prochází excitačním filtrem, čímž se ze spektra světelného zdroje oddělí požadované excitační světlo a ostatní světlo je pohlceno. Pak je světlo odraženo na dichroickém zrcadle pod úhlem 90° do objektivu. Dichroické zrcadlo je umístěno do optické dráhy světla pod úhlem 45° (obr. 3).
Obrázek 3: Fluorescenční mikroskopie v odraženém světle (epifluorescence) Dichroické zrcadlo tedy odráží excitační světlo o určité vlnové délce směrem ke vzorku, propouští ostatní vlnové délky a také odráží osamocené paprsky excitačního světla zpět ve směru zdroje. Bariérový filtr zachytí zbytky excitačního světla, které nebylo použito k excitaci a propouští pouze fluorescenční světlo, čímž poskytuje černé pozadí k fluorescenčnímu obrazu.
Popis mikroskopu POPIS OKULÁRŮ Idetifikační symboly H P WF 10x/18 10xB/18 POPIS OBJEKTIVŮ Identifikační symboly 160 0.17 A SPL PL 3
Popis Huygensův okulár Okulár s plan korekcí Okulár pro široké pole Okulár se zvětšením 10:1 a clonou zorného pole o průměru 18 mm Dioptrický okulár
Popis Objektiv pro délku tubusu 160 mm Objektiv lze použít s i bez krycího sklíčka Objektiv lze použít pouze pro krycí sklíčka o tloušťce 0.17 mm Achromatický objektiv (chromatická vada korigována pro žlutou a zelenou barvu) Objektiv s semiplanachromatickou korekcí Objektiv s planachromatickou korekcí
10/0.25 Oil Ph Fl
Objektiv se zvětšením 10:1 a numerickou aperturou 0.25 Imersní objektiv Objektiv pro fázový kontrast Fluoridový objektiv pro fluorescenční mikroskopii a hematologická stanovení
BAREVNÉ OZNAČENÍ OBJEKTIVŮ (DIN/ISO standard) 4:1 10:1 20:1 40:1 Zvětšení 50:1 červená žlutá světle světle Barevné zelená modrá označení
Obrázek 4
4
63:1
100:1
tmavě modrá
bílá
Obrázek 5
Obrázek 6
Obrázek 7
5
Obrázek 8
Obrázek 9
II. Autofluorescence rostlinného pletiva Fluorescence biologických objektů se obvykle rozděluje na primární a sekundární. Primární je fluorescence látek přirozeně se vyskytujících nebo vznikajících v biologickém objektu (pletivo, buňky). Říká se jí také autofluorescence. Sekundární fluorescence pochází od látek uměle vložených do objektu. Jsou to většinou fluorescenční sondy nebo značky. Výhodou autofluorescence je malá náročnost na přípravu vzorku. Není nutné vzorek speciálně chemicky upravovat. Pro účely této úlohy vyčleníme z autofluorescence červenou fluorescenci chlorofylu v chloroplastech, protože se jí zabýváme v jiné úloze. Kromě červené autofluorescence chlorofylu je asi nejvýraznějším jevem zelená a žlutozelená autofluorescence. Domníváme se, že její původ je stále nejasný, přesto ale uvedeme některé představy prezentované v literatuře (viz např. Chyra 1990).
6
Za původce autofluorescence buněčných stěn bývá považován lignin a různé fenolické látky vázané v buněčných stěnách. Ve fluorescenčním mikroskopu tak vzniká fluorescenční kontrast zvýrazňující buněčné stěny. V souvislosti s ochranou listů a stonků před škodlivých UV zářením (především UV-B oblast 280-320 nm) byla věnována pozornost tzv. modrozelené fluorescenci (BGF) listů (např. Lichtenthaler). Tato fluorescence má dvě složky s maximy přibližně u 440 nm a 520 nm. Podle Lichtenthalera a Schweigera (1998) je jedinou fluoreskující látkou mezi těmito látkami kyselina ferulová, vázaná kovalentně na buněčné stěny. Z experimentů se zmrazováním buněk kůry jabloní vyplynulo, že mrtvé buňky mají výraznou žlutozelenou fluorescenci buněčných stěn. Podobný efekt byl pozorován i při vysušování buněk. Tento jev nelze zobecnit a neobjevuje se ve všech případech odumírání buněk. Podstata této fluorescence také není jasná. Při pozorování jednoduchých preparátů připravených řezáním nebo jiným mechanickým oddělováním se může tato fluorescence objevit na okrajích preparátů, kde je nejvíce poškozených buněk. Jako příklad složitého autofluorescenčního obrazu uveďme popis obrazu příčného řezu adventivního kořene ozimé pšenice nebo ječmene jarního (Chira 1990): rhizodermis fluoreskuje světle zeleně, ostatní parenchymatická pletiva tmavočervenou barvou, střední válec tmavozeleně, xylém ve střední části světlezeleně, floém tmavozeleně. Světlezelená fluorescence přechází až do žlutozelené a předpokládá se o ní, že odráží míru lignifikace buněčných stěn. Příčný řez stébla pšenice nebo ječmene má tyto autofluorescenční charakteristiky. Epidermis fluoreskuje zlatožlutě (pšenice) nebo žlutozeleně (ječmen), sklerenchym matně zeleně, xylém jasně světlezeleně, floém tmavozeleně, parenchym matně zeleně, pochva cévních svazků zeleně. Chloroplasty fluoreskují jasně červeně. Na pokožkách obvykle průduchy (některé jejich části) fluoreskují světle zeleně, svěrací buňky obsahují chloroplasty a proto fluoreskují červeně. Některé další literaturní údaje o autofluorescenci rostlinných materiálů, které je možné ověřovat v praktiku: pylová zrna fluoreskují světle zeleně a žlutě (kukuřice), škrobová zrna nefluoreskují, trichomy fluoreskují světle zeleně. Poznámka. Na umělém preparátu (voda, glycerin, olej) obsahujícím vzduchové bublinky si ověřte, že vzduchová bublina se jeví barevně (tmavo červeně nebo hnědě). II.1 Studium působení herbicidů a abiotických stresů na chloroplasty v buňce Podstata a význam fluorescence chlorofylu iv vivo jsou podrobně probírány v přednáškách „Fotosyntéza“ a „Luminiscence chlorofylu“. S příslušnými fluorescenčními technikami se můžete seznámit v „praktiku experimentálních metod biofyziky“. Zde se proto jen velmi stručně zmíníme o možnostech sledování indukčního jevu ve fluorescenčním mikroskopu. Intenzita budícího záření ve fluorescenčním mikroskopu je dostatečně velká (je to tzv. aktinické záření), aby vyvolala indukční jev. Po náhlém osvitu rostlinného pletiva adaptovaného na tmu (v našem případě list měříku připravený jako preparát a ponechaný definovanou dobu ve tmě) intezita fluorescence chlorofylu v nepoškozených chloroplastech zpočátku rychle roste (křivka O-J-I-P) do svého maxima P, kterého dosahuje obvykle mezi 0,5 a 2 sekundami. Nárůst intenzity z počáteční hodnoty F0 do hodnoty FP je u plně funkčního systému s vyrelaxovaným nefotochemickým zhášením zhruba pětinásobný (poměr FP/F0 je mírně nad 0,8). Poté intenzita fluorescence pomaleji klesá, prochází minimem S, někdy lokálním maximem M a posléze (3-5 minut) klesá do zhruba stabilní úrovně T. Za určitých podmínek může oscilovat s periodou několik desítek až stovek sekund. Celkový pokles z bodu P do bodu T závisí mj. na intenzitě excitace a rovněž na funkčním stavu. Pro vyjádření tohoto poklesu bylo navrženo několik veličin, např. Rfd = (P-T)/T (Lichtenthaler 1986) 7
Veličina Rfd bývá také označována jako index vitality a u neporušeného systému může dosahovat hodnot i větších než 2, v závislosti na intenzitě budícího záření. Po následném zatemnění se postupně systém vrací a částečně se regeneruje i tento indukční jev. Během expozice při prvním měření indukčního jevu se generuje několik typů nefotochemického zhášení a může docházet i k poškození aparátu. Proto regenerace jevu není po prvních minutách ve tmě úplná a vyžaduje někdy mnoho hodin. Přesto lze říci, že částečná regenerace jevu odlišuje tento jev od prostého rozkladu fluorescenčních center nebo nevratného zhášení fluorescence. Některé herbicidy (typu derivátů močoviny, deriváty triazinu apod.) blokují přenos elektronu na akceptorové straně PSII, zamezí tak vzniku fotochemického i nefotochemického zhášení a vyvolají tak maximální intenzitu fluorescence FM (tj. maximální kvantový výtěžek). Při silné excitaci mohou mít FM a FP blízkou hodnotu. Na lístcích mechu lze vizuálně pozorovat postupné snižování intenzity fluorescence chloroplastů vystaveným budícímu záření. Krátce lze posunout preparát tak, aby se část vzorku, který byl ve tmě dostala do zorného pole. Rozdíl v jasu je zřejmý. Během indukčního jevu se mění i emisní spektrum chlorofylu v chloroplastech, snižuje se emise u 685 nm a roste relativně emise u 730 nm (druhý pás). Měl by tedy vzhled chloroplastů přecházet od jasně červené barvy k tmavější červené. Při působení stresů může v principu docházet ke dvěma jevům. Při uzavírání PSII na akceptorové straně roste fluorescence do FM (např. zmíněné působení některých herbicidů). Při razantním poškození thylakoidních membrán (silná dehydratace, dlouhodobé působení herbicidu) dochází k celkovému poklesu intenzity fluorescence, chloroplasty pak fluoreskují velmi slabě. Je to způsobeno agregačním zhášením nebo rozkladem chlorofylů.
III. Stanovení pH pomocí fluorescenčních barviv Současné techniky měření pH uvnitř živých buněk se stále vyvíjejí. Nejslibnějšími technikami se zdají být měření absorpčních spekter NMR, EPR a fluorescenční techniky (emisní spektra). Zatímco NMR a EPR techniky vyžadují nákladné zařízení, sofistikovanou obsluhu pro interpretaci získaných dat a zdlouhavou přípravu, fluorescenční techniky jsou relativně jednoduché. Většinou jsou založeny na měření intenzity fluorescence při dvou pevných vlnových délkách. Fluorescenční metody však nejsou vhodné pro pozorování rychlých změn v distribuci pH v buňce. Pro fluorescenční stanovení pH v buňce se používá řada fluorescenčních barviv, např. fluorescein diacetát (FDA), chromotropní kyselina (4,5-dihydroxynaftalen-2,7-disulfonová kyselina), chininsulfát nebo HPTS (8-hydroxypyren-1,3,6-trisulfonová kyselina). S velkou výhodou se často používá FDA, neboť FDA jako taková vlastně fluorescenčním barvivem, sama nefluoreskuje. Jakmile však FDA pronikne do buňky, je pomocí vnitrobuněčných enzymů (esteráza) hydrolyzována na fluorescein, který již při vhodně zvolené excitaci (435-490 nm) fluoreskuje (emise při 520 nm). Proces pronikání do buňky a přeměna FDA na fluorescein trvá několik minut. Další výhodou použití FDA je, že vytvořený fluorescein má velmi malou permeabilitu přes buněčnou membránu. To znamená, že fluorescein zůstává po relativně dlouhou dobu lokalizován uvnitř buňky. Nevýhodou může být, že FDA se v alkalickém prostředí samovolně přeměňuje na fluorescein. Roztok s FDA se obvykle uchovává ve tmě. V podstatě se FDA používá dvěma způsoby. Buď jsou buňky předem inkubovány v roztoku s barvivem a těsně před měřením jsou proprány v čistém pufru, nebo se měření provádí přímo po přidání barviva do vzorku bez propírání.
8
IV. Testování vitality buněk pomocí fluorescenčních sond Testování vitality (životaschopnosti) je založeno na měření podílu živých a mrtvých buněk v populaci. Jednou z prvních sond pro toto použití bylo rovněž FDA. Pro rozlišení živých a mrtvých buněk se často využívá také fluorescenční barvivo akridinová oranž (AO). Živé buňky poskytují zelenou fluorescenci, poškozené buňky žlutou a mrtvé buňky červenou fluorescenci. AO se váže na DNA (zelená fluorescence), RNA, denaturovanou DNA a kyselé polysacharidy (červená fluorescence). AO vytváří dimer nebo polymer, pokud jsou sousední molekuly barviva velmi blízko sebe. Excitační a emisní spektra dimeru a polymeru jsou odlišná od spekter monomeru. Barva fluorescence AO vázaného na RNA je obvykle červená nebo oranžová, v kontrastu k zelené fluorescenci monomeru vázaného na DNA. Vysvětlením je, že kationy AO jsou umístěné přibližně na každé třetí párové bázi dvoušroubovicového helixu DNA. Za těchto okolností je vzdálenost mezi molekulami barviva dostatečně velká, aby nedošlo k interakci mezi dvěma molekulami a tím ke vzniku dimerů či polymerů. V takovém případě je fluorescenční charakteristika určována monomerem AO, tj. zelenou emisí. Zatímco pokud je AO vázána na jednořetězcové náhodné klubko (tj. denaturovaná DNA, RNA), je vázána na téměř každou nukleotidovou jednotku fosfátové skupiny. Řetězec náhodného klubka pak dovoluje sousedícím molekulám barviva se přiblížit dostatečně blízko pro interakci mezi molekulami barviva za vzniku polymeru, což vede k červené fluorescenci. Fluorescence je tedy závislá na sekundární struktuře molekuly nukleové kyseliny, neboť ta má silný vliv na vázání AO. Při pH 5, 7-8 živé buňky fluoreskují zeleně a mrtvé červeně. Nad pH 4,7 AO produkuje červenou fluorescenci cytoplazmy. Jádro je červené při nižším pH a posunuje se na žlutozelené při pH 6,8. Vedle testování vitality buněk se AO používá při počítání buněk, na kontrastování buněčných struktur nebo při studiu nukleových kyselin. Při vysokých koncentracích AO (nad 1 mM) dochází k poškození a smrti buňky.
D. POSTUP I. Fluorescenční mikroskop Hund H600 AFL Centrování rtuťové výbojky Nastartujte rtuťovou lampu a podle potřeby proveďte její seřízení. Jako kondenzorová clonka nyní pracuje clonka v tělese excitační optické osy (8.3 na obr. 9). Ovládá se páčkou na pravé straně vodorovného krytu optické osy. Tato clonka se dá vycentrovat ručními šrouby na svrchní straně tohoto krytu (8.1 na obr. 9). Zdroj rtuťové lampy: (LEJ – mbq 51 ac) Na čelním panelu je hlavní vypínač a ukazatel provozních hodin výbojky. V poloze zapnuto indikuje tento stav zelená kontrolka. Na zadním panelu je zásuvka pro síťovou šňůru a čtyřkolíkový konektor pro připojení kabelu k lampě. Důležité jsou dva červené přepínače. Na horním se nastavuje typ rtuťové lampy (L1, L2), na dolním se nastaví frekvence sítě (u nás 50 Hz). Typ lampy je uveden výrobcem na štítku krabice i na patici lampy. Vpravo nahoře je knoflík resetování startu lampy. 1. Zapněte zdroj (na čelním panelu). Lampa je zažehnuta. Rtuťové lampy ovšem nenabíhají do stálého pracovního bodu okamžitě ale po určité době. Tato doba činí obvykle 15 minut. Lampa charakteristicky „nastartuje“ a pak se postupně rozsvěcí, její jas prochází
9
maximem a pak se ustálí. Pracovní napětí lampy ve střídavém režimu je menší, než síťové napětí. Proto ve zdroji je tlumivka, která je zapojena do série a na ní nastává potřebný úbytek napětí. Je proto třeba s vlastním pozorováním určitou dobu počkat. Centrování ovšem provádějte hned po zapnutí lampy. 2. Přepněte otáčivý přepínač na optické ose buzení (1.14 na obr. 5) do polohy otevřeno. 3. Centrální černý knoflík na tubusu-iluminátoru (4.1 na obr. 6) nastavte do střední zapadávací pozice (šipka na knoflíku ukazuje svisle nahoru). 4. Na okénku pod knoflíkem (4.2 na obr. 6) vlevo se objeví jasná stopa oblouku lampy. 5. Fokusujte obraz oblouku pomocí černého knoflíku (4.4 na obr. 7) na pravé straně housingu lampy. Otáčením knoflíku se lampa pohybuje vodorovně podél optické osy buzení. 6. Fokusujte obraz odrazu oblouku lampy (je méně jasný než obraz oblouku) na okénko (4.2 na obr. 6) pomocí knoflíku 4.6 (na obr. 7) zcela vzadu ve středu housingu. Posouvá se jím odrazné duté zrcátko. 7. Pomocí šestihranného šroubováku (2 mm) a dvou stavěcích šroubů (jsou zprava a zleva šikmo shora v zadním bílém osazení housingu) posuňte obraz odrazu oblouku do polohy vlevo vedle obrazu oblouku. Celkově má být dvojice obrazů na okénku vystředována (viz obr. 6). Pozor! Odraz oblouku se nesmí promítat na elektrody delší dobu. Elektrody by se mohly přehřát a lampa by explodovala. Elektrody je vidět jako tmavé stíny nad a pod obrazem oblouku. Tím je rtuťová lampa vycentrována. Občas překontrolujte toto vycentrování. Nastavení binokulárního tubusu Nastavte vzdálenost mezi okuláry (tzv. interpupilární vzdálenost) tak, aby jste při pozorování oběma očima viděli pouze jeden obraz. Změna interpupilární vzdálenosti mění také polohu meziobrazu v mikroskopu. Proto je třeba provést korekci. Pro tento účel je na každém okuláru stupnice. Otáčením okuláru nastavte na této stupnici hodnotu interpupilární vzdálenosti takovou, jakou ukazuje horizontální stupnice na binokulárním tubusu (tj. mezi 55 a 75). Pokud máte určitou oční vadu, případně tato vada je různá pro jednotlivé oči, proveďte ještě dodatečnou korekci otáčením okulárů. Dívejte se nejdříve jedním okem a zaostřete obraz, pak druhým okem a opět zaostřete. Zapněte (na zadní straně podstavce vlevo nahoře) halogenovou lampu pro transmisní režim. Seřiďte její jas knoflíkem vpravo dole. Knoflík rotačního přepínače na tubusu iluminátoru (4.1) je ve střední zaklaplé pozici. Táhlo na binokulárním tubusu je zatlačené. Snižte stolek, vložte preparát a zařaďte objektiv s nejmenším zvětšením. Hrubým posuvem (1.7 na obr. 4) posuňte stolek k objektivu (vpravo pohyb podle hodinových ručiček). Dívejte se při tom ale z boku a kontrolujte, aby preparát nenarazil do objektivu. Poté posouvejte stolkem pomalu dolů, hrubě a pak jemně (1.8 na obr. 4), pozorujte preparát a zaostřete obraz. Návod k obsluze digitálního fotoaparátu OLYMPUS CAMEDIA C-3000 ZOOM Typ: Digitální kompaktní fotoaparát Olympus CAMEDIA C-3000 ZOOM (s prokládaným CCD snímačem s úhlopříčkou 1/2", 3 340 000 bodů) Objektiv: Výsuvný s trojnásobným optickým transfokátorem Olympus 6,5 – 19,5 mm; 8 členů v 6 skupinách. Zaostřování 80 cm – nekonečno (v režimu Makro 20 cm – 80 cm). Záznamové medium: Výměnné paměťové karty SmartMedia 3,3 V velikosti 2 – 64 MB
10
Popis a technická specifikace fotoaparátu
(1) Kontrolní displej (2) Páčka transfokátoru (3) Blesk (4) Samospoušť (indikátor) (5) Okénko dálkového ovládání (6) Kolečko dioptrické korekce (7) Otvor na řemínek (8) Kryt konektorů (9) Objektiv (10) Mikrofon (11) Konektor externího blesku (12) Konektor AC adaptéru (13) Výstup audio/video (14) USB konektor (15) RS-232C konektor (16) Krytka prostoru karty (17) Tlačítko blesku (18) Tlačítko bodového měření / Makro režim (19) Hledáček (20) LCD obrazovka (21) Křížové tlačítko Jog ovládání Menu (22) Přepínač režimů – Mode (23) Tlačítko spouště (24) Potvrzovací tlačítko, manuální ostření, ochranné tlačítko (25) Zapnutí / vypnutí LCD obrazovky (26) Indikátor činnosti paměťové karty (27) Tlačítko Menu (28) Kryt bateriového prostoru (29) Páčka otevření / zavření bateriového prostoru (30) Závit stativu
11
Režimy záznamu a rozlišení: TIFF (bez komprese obrazu), JPEG (s kompresí obrazu), Quick Time Motion JPEG (pro záznam pohyblivého obrazu), Wave (pro zvukový záznam). 2048 × 1536 pixelů (TIFF, SHQ, HQ) 1600 × 1200 pixelů (TIFF, SQ1) 1280 × 960 pixelů (TIFF, SQ1) 1024 × 768 pixelů (TIFF, SQ2) 640 × 480 pixelů (TIFF, SQ2) - v režimu videozáznam používá fotoaparát rozlišení 320 × 240 pixelů (HQ) 160 × 120 pixelů (SQ) Zkratky SQ2, SQ1, HQ, SHQ označují stupeň komprese snímku. Režim SQ2 (standartní kvalita) používá největší stupeň komprese, tj. snímek má "nejhorší" kvalitu, ale zabírá nejméně místa na záznamovém mediu. Naopak režim SHQ (super vysoká kvalita) používá nejmenší stupeň komprese, má "nejlepší" kvalitu, ale zabírá více místa na záznamovém mediu. Kompletní informace o každém bodu digitálního obrazu se zachová pouze při uložení snímku v nekomprimovaném formátu TIFF. Takový snímek však zabere nejvíce na paměťovém mediu. Například při rozlišení 2048×1536 pixelů se na paměťovou kartu s velikostí 32 MB v režimu záznamu TIFF uloží maximálně 3 snímky, v režimu SHQ 17 snímků a nebo v režimu HQ 42 snímků. Při nejmenším rozlišení (640×480 pixelů) a nevětším stupněm komprese (režim SQ2) se na paměťovou kartu s velikostí 32 MB uloží až 330 snímků.
1) Fotografování vzorku 1. Přepínač režimů (22) přepneme do polohy P (význam ostatních možných poloh přepínače viz obrázek).
2. Otevřeme závěrku na fotografickém nástavci mikroskopu a zapneme LCD displej fotoaparátu tlačítkem (25). (pozn. fotoaparát není zrcadlovka, proto musíme mít zapnutý LCD displej; v hledáčku (19) nic neuvidíme) 3. Nastavíme požadovanou kvalitu záznamu: - tlačítkem (27) zobrazíme MENU fotoaparátu - křížovým tlačítkem (21) šipkami ▲ nebo ▼ zvolíme nabídku - šipkou ► (21) vstoupíme do podnabídky a pomocí šipek ▲ a ▼ (21) zvolíme režim SHQ - potvrdíme 2× tlačítkem OK (24) 4. Vypneme automatický blesk tak, že 3× zmáčkneme tlačítko (17); na kontrolním displeji (1) se objeví symbol 5. Namáčkneme spoušť (23). Fotoaparát by měl být schopen automaticky nastavit expozici a zaostřit preparát – zelená dioda v hledáčku svítí. V případě neostrých kontur fotoaparát nemusí vzorek zaostřit korektně – zelená dioda v hledáčku bliká. V tom případě je nutno zaostřit vzorek ručně: 12
- stiskneme tlačítko OK (24) a šipkou ► (21) zvolíme manuální ostření MF - šipkami ▲ a ▼ (21) zaostříme na vzorek - vypnutí manuálního ostření se provádí obdobně (tlačítko OK (24) → ► (21) → tlačítko OK(24)) 6. Vyfotografujeme snímek domáčknutím spouště (23); snímek se na několik sekund objeví na LCD displeji a zároveň se rozbliká kontrolka (26) signalizující ukládání snímku na paměťovou kartu (během ukládání nelze vyfotografovat další snímek). 7. Pro záznam videosekvence (například pronikání herbicidu, indukční jev ap.) zvolíme na přepínači režimů (22) Video-režim (viz obrázek výše). - při částečně stisknutém tlačítku spouště (23) se automaticky nastaví expozice a zaostření - po úplném stisknutí spouště (23) se začne videosekvence nahrávat (zároveň se nahrává i zvuková stopa!) - délka nahrávání závisí na zvolené kvalitě záznamu; k dispozici jsou dvě úrovně kvality: SQ (160 ×120 pixelů, délka záznamu 120 s) HQ (320 × 240 pixelů, délka záznamu 30 s) - obraz se snímá s frekvencí 12,5 snímků za s (tj. každých 80 ms) - pro ukončení videosekvence se opět stiskne tlačítko spouště (23) 8. Po ukončení fotografování (videosekvence) přepneme přepínač režimů (22) do polohy OFF (vypnuto), odšroubujeme z fotografického nástavce mikroskopu a nasadíme krytku objektivu. 2) Export snímků do PC 1. Fotoaparát připojíme k PC pomoci USB kabelu (šedý kabel z příslušenství fotoaparátu): - menší konektor zapojíme do zdířky (14) a větší do USB portu počítače (může se připojovat k počítači za chodu) - sundáme krytku objektivu a přepneme přepínač režimů (22) do polohy prohlížení 2. Na PC spustíme program CAMEDIA Master 2.0 dodávaný s fotoaparátem (v případě absence programu v PC je nutno jej doinstalovat): - v levém sloupci klikneme na ikonku My Camera - po načtení snímků můžeme pomocí myši a klávesy Ctrl označit snímky, které chceme exportovat do PC - v nabídce (horní lišta) klikneme na Camera a pak na Download Selected Images... (v případě že chceme exportovat všechny snímky klikneme na Download All Images...) - počítač nás vyzve pro zadání adresáře, do kterého chceme snímky exportovat - do vybraného adresáře exportuje snímky ve formátu TIFF nebo JPG (to závisí na tom, jaký formát jsme si zvolili při fotografování viz 3) Fotografování vzorku) - stejným způsobem se exportují i videosekvence 3. Vypneme fotoaparát (přepínač (22) v poloze OFF), odpojíme od PC a nasadíme opatrně krytku objektivu. 3) Upravení a vyhodnocení snímků pomocí software Ne vždy se podaří vyfotografovat snímek přesně tak jak bychom chtěli. Snímek může být málo kontrastní, může v něm převládat některá barva vlivem nedokonalé automatické korekce na bílou barvu, nebo chceme vybrat jen určité objekty ze snímku atd. Pro tyto operace s digitální fotografií byla vytvořena řada softwarových aplikací. Upravování snímků lze provádět v jakémkoli editoru pracujícím s formáty TIFF a JPG jako jsou například IrfanView, ACDSee, Photoshop, CorelPhotopaint a další. Základní operace s digitální fotografií umožňuje i software CAMEDIA Master 2.0 dodávaný s fotoaparátem.
13
Korekce úrovní jasu, kontrastu a barev lze jednoduše provést v programu IrfanView (v ostatních programech je postup velice podobný): 1. Spustíme program IrfanView (jedná se o freeware a můžete program zkopírovat zdarma z internetové adresy http://www.irfanview.com/). 2. V nabídce na horní liště klikneme na Image a pak na Enhance colors. 3. Pomocí posuvníků můžeme měnit jas, kontrast, gama korekci a intenzitu barevných kanálů (červená, modrá a zelená) 4. Upravený obrázek uložíme (File – Save as...)
II. Autofluorescence rostlinného pletiva 1. 2.
Studujte vzhled autofluorescence jednotlivých typů rostlinného pletiva (pokožka, vodivá pletiva, mezofyl, sklerenchym) na vybraných rostlinných materiálech. Na umělém preparátu (voda, glycerin, olej) obsahujícím vzduchové bublinky si ověřte, že vzduchová bublina se jeví barevně (tmavočerveně nebo hnědě).
II.1 Studium působení herbicidů a abiotických stresů na chloroplasty v buňce 1. Seznamte se důkladně s digitálním fotoaparátem Olympus a se způsobem jeho připojení k mikroskopu, se záznamem obrázků a převodem obrázků do počítače. 2. Prostudujte vizuálně ve fluorescenčním mikroskopu fluorescenci lístků mechu měříku. Identifikujte jednotlivé složky autofluorescence. 3. Zaznamenejte pomocí digitálního fotoaparátu průběh fluorescenčního indukčního jevu v automatickém a ručním režimu. 4. Studujte jev pronikání herbicidu do pletiva a buněk, posuďte kinetiku difúze herbicidu pletivem. 5. Ověřte možnosti detekce poškození pletiva abiotickými stresy pomocí autofluorescence (vyšší teploty, zmrazení, vysušení, fotoinhibice). 6. Po převodu obrázků do počítače vyhodnoťte některé veličiny této křivky (významné body, hodnotu Rfd) pro celé zorné pole, případně pro některé chloroplasty. Použijte některou z metod analýzy obrazu. Proveďte statistické vyhodnocení veličin.
III. Stanovení pH pomocí fluorescenčních barviv 1. namícháme zásobní roztoky FDA a AO: 5 mg FDA a15 mg AO rozpustíme v 1 ml DMSO (uchováváme ve tmě při 4°C) 2. ze zásobního roztoku připravíme pracovní roztok: do 1 ml H2O přidáme 10 µl zásobního roztoku FDA (AO) 3. do pufru o daném pH (4, 7, 9) dáme kvasinky a necháme inkubovat cca 20 min při pokojové teplotě 4. na podložní sklíčko napipetujeme 2 µl buněčné suspenze a přidáme 5 µl pracovního roztoku FDA (AO); necháme inkubovat 5 min 5. ve fluorescenčním mikroskopu pozorujeme změny v intenzitě a barvě fluorescence při různém pH 6. Pokuste se odhadnout pH vnitřku buněk pomocí studia preparátů ve fluorescenčním mikroskopu.
14
IV. kontrastování buněk (buněčných komponent) pomocí akridinové oranže Tenké řezy: 1. Pro zvýraznění struktur pomocí akridinové oranže připravte rostlinné preparáty jako tenké ruční řezy. 2. Máčejte je 1 hodinu ve vodě s 0,0001 % AO. 3. Umístěte řezy v destilované vodě nebo v glycerinu na podložní sklíčko a kryjte krycím sklíčkem. Pozorovaná fluorescence je světle zelená. Řasy: 1. Namícháme zásobní roztok AO: 15 mg AO v 1 ml 95% etanolu. 2. Namícháme pracovní roztok AO: používá se 100x zředěný zásobní roztok, tj. 10µl zásobního roztoku AO do 1 ml H2O. 3. Na podložní sklíčko napipetujeme 2 µl buněčné suspenze a 5 µl pracovního roztoku. 4. Po 5 minutách pozorujeme buňky ve fluorescenčním mikroskopu.
E. LITERATURA Chira E. (1990) Fluorescenčné metódy v šľachtení. Príroda, Bratislava Jeřábková P. (2006) Studium vlastností biologického materiálu pomocí metod obrazové analýzy. Disertační práce. VUT v Brně, Fakulta chemická Lazár D. (1999) Chlorophyll a fluorescence induction. Biochim. Biophys. Acta 1412, 1-28. Lichtenthaler H.K., Buschmann, C., Rinderle, U., Schmuck, G. (1988) Application of chlorophyll fluorescence in ecophysiology. Radiation and Environmental Biophysics 25, 297-308. Lichtenthaler H.K., Schweiger J. (1998) Cell bound ferulic acid, the major substance of the blue/green fluorescence emission of plants. J. Plant Physiol. 152:272-282. Mason W.T. (1999) Fluorescent a luminescent probes for biological activity. Academic Press, San Diego, London, Boston, New York, Sydney, Tokyo, Toronto Slavík J. (1982) Intracellular pH of Yeast cells measured with fluorescent probes. FEBS Letters 140: 22-26 Slavík J. (1983) Intracellular pH topography: determination by a fluorescent probe. FEBS Letters 156: 227-230
15
