Fluorescenční mikroskopie p
-fluorescenční fluorescenční mikroskopie -konfokální mikroskopie -multifotonová konfokální mikroskopie
Fluorescence a fluorofory
Schéma konvenčního fluorescenčního mikroskopu -Na fluorescenčně značený vzorek dopadá pouze světlo o vlnových délkách excitujících daný fluorofor. -Do okuláru prochází pouze světlo emitované fluoroforem. -Lze aplikovat až pět různých fl fluoroforů f ů na jjeden d vzorek. k Potom je možno studovat i vzájemné postavení těchto struktur t kt v rámci á i jedné j d é buňky. b ňk
Konfokální mikroskopie Hlavním přínosem konfokálního typu mikroskopu je omezení světla které je mimo fokus. To umožňuje „rozřezat“ objekt pomocí světelného paprsku, snímat série obrázků a posléze rekonstruovat 3D obraz objektu. Následující schéma popisuje fluorescenční konfokální mikroskop. - Světelný (laserový) paprsek dopadající na objekt je fokusován do malého bodu na objektu. objektu Směs reflektovaného a emitovaného světla je zachycena čočkou a je skrze dichroické zrcadlo (štípač paprsku) fokusována na fotodetektor. Dichroické zrcadlo však nepropustí reflektované světlo (excitující) nýbrž pouze emitované světlo. - Před fotodetektorem se nachází konfokální apertura (štěrbina) skrze kterou prochází pouze emitované světlo a pouze z místa fokusu. Ostatní paprsky emitovaného světla se odrážejí pryč. pryč
Princip konfokálního mikroskopu
Princip spinning-disk konfokálního mikroskopu
Multifotonová konfokální mikroskopie Během snímání pomocí konfokálního mikroskopu dochází k excitaci fluoroforu velmi silným zdrojem světla - laserem. To vede k rychlému vysvícení fluoroforu nejen v místě snímání, ale též v místech kudy paprsek prochází k místu fokusu. Multifotonová mikroskopie je založena na principu snímání pomocí světla jehož energie je příliš nízká pro excitaci fluoroforu. V místě fokusu však dochází k setkání dvou nebo tří nízkoenergetických paprsků (fotonů) a sčítající se energie se stává dostatečnou pro excitaci daného fluoroforu. fluoroforu K excitaci dochází tedy pouze v místě fokusu fokusu.
GFP – green fluorescent protein
Aequoria victoria
Vlastnosti GFP Protein o délce 230 aminokyselin Molekulová hmotnost 27 27-30 30 kDa Excitace 390-470 nm, emise cca 509 nm Fluorofor: Beta-barelová struktura: 11 antiparalelních beta řetězců, uprostřed se nachází alfa-helix s chromoforem. Fluorofor je tvořen Ak zbytky 65, 65 66 a 67 67. K formaci chromoforu je třeba molekulárního kyslíku.
GFP v rostlinném organizmu Rostliny v DNA sekvenci GFP mylně rozeznávaly intron a ten vyštěpovaly. Výsledné GFP bylo nefunkční. Nutná optimalizace užití kodónů. kodónů
Mutace GFP GFP: Cílem mutačních úprav bylo a je: optimalizace užití kodónů, optimalizace teplot pro maturaci (Phe64Leu), urychlení maturace, posun excitačních a emisních spekter p do červené části spektra p (S65T – tzv. (S EGFP), navýšení intenzity fluorescence atd. YFP vzniká z GFP mutací Thr203Tyr a dalšími nutnými mutacemi Je charakteristický ještě delším posunem do mutacemi. červené oblasti. BFP vzniká z GFP mutací Tyr66His(Trp). Spíše slabě fluorescenční nutné další úpravy molekuly. fluorescenční, molekuly Velmi krátká excitační vlnová délka cytotoxická. Používané hlavně pro dvojité značení nebo pro studie FRET. CFP je C j „cyan““ (modrozelený) ( d l ý) chromofor, h f je j oprotii BFP posunut ve směru červené části spektra a je excitován vlnovými délkami které jsou pro buňku méně toxické. Používán ve FRET studiích s YFP chromoforem. chromoforem
Nová generace fluorescenčních proteinů - mFruits dsRedFP izolován z mořské sasanky Discosoma striata. Menší jasnost, často oligomery, agreguje. Izolovány další RFP z jiných mořských živočichů živočichů.
GFP (wt)
Excitation Maximum (nm)
Emission Maximum (nm)
Molar Extinction Coefficient
Quantum Yield
in vivo Structure
Relative Brightness (% of EGFP)
395/475
509
21,000
0.77
Monomer*
48
Green Fluorescent Proteins EGFP
484
507
56,000
0.60
Monomer*
100
AcGFP
480
505
50,000
0.55
Monomer*
82
TurboGFP
482
502
70,000
0.53
Monomer*
110
Emerald
487
509
57,500
0.68
Monomer*
116
Azami Green
492
505
55 000 55,000
0 74 0.74
M Monomer
121
ZsGreen
493
505
43,000
0.91
Tetramer
117
Blue Fluorescent Proteins EBFP
383
445
29 000 29,000
0 31 0.31
Monomer* Monomer
27
Sapphire
399
511
29,000
0.64
Monomer*
55
TSapphire
399
511
44,000
0.60
Monomer*
79
Cyan Fluorescent Proteins ECFP
439
476
32,500
0.40
Monomer*
39
mCFP
433
475
32,500
0.40
Monomer
39
Cerulean
433
475
43,000
0.62
Monomer*
79
CyPet
435
477
35,000
0.51
Monomer*
53
AmCyan1
458
489
44,000
0.24
Tetramer
31
MidoriIshi Cyan
472
495
27,300
0.90
Dimer
73
mTFP1 (Teal)
462
492
64,000
0.85
Monomer
162
http p://www.m microscopyuu.com/articcles/livecelllimaging/ffpintro.htm ml
Protein (Acronym)
Yellow Fluorescent Proteins 514
527
83,400
0.61
Monomer*
151
Topaz
514
527
94,500
0.60
Monomer*
169
Venus
515
528
92,200 ,
0.57
Monomer*
156
mCitrine
516
529
77,000
0.76
Monomer
174
YPet
517
530
104,000
0.77
Monomer*
238
PhiYFP
525
537
124,000
0.39
Monomer*
144
ZsYellow1
529
539
20 200 20,200
0 42 0.42
Tetramer
25
mBanana
540
553
6,000
0.7
Monomer
13
Orange and Red Fluorescent Proteins Kusabira Orange
548
559
51,600
0.60
Monomer
92
mOrange
548
562
71,000
0.69
Monomer
146
dTomato
554
581
69,000
0.69
Dimer
142
dTomatoTandem
554
581
138,000
0.69
Monomer
283
DsRed
558
583
75,000
0.79
Tetramer
176
DsRed2
563
582
43,800
0.55
Tetramer
72
DsRed-Express (T1)
555
584
38,000
0.51
Tetramer
58
DsRedMonomer
556
586
35,000
0.10
Monomer
10
mTangerine
568
585
38,000
0.30
Monomer
34
mStrawberry
574
596
90,000
0.29
Monomer
78
AsRed2
576
592
56,200
0.05
Tetramer
8
mRFP1
584
607
50,000
0.25
Monomer
37
JRed
584
610
44,000
0.20
Dimer
26
mCherry
587
610
72,000
0.22
Monomer
47
HcRed1
588
618
20,000
0.015
Dimer
1
mRaspberry
598
625
86,000
0.15
Monomer
38
HcRed-Tandem
590
637
160,000
0.04
Monomer
19
mPlum
590
649
41 000
0 10
Monomer
12
http p://www.m microscopyuu.com/articcles/livecelllimaging/ffpintro.htm ml
EYFP
http://en.wikipedia.org/wiki/Green_fluorescent_protein
Využití fluorescenčních proteinů jako molekulární fluorescenční značky Fúzní proteiny Výh d Výhody Pozorování dynamiky proteinových struktur v živé buňce bez nutnosti fixace Možnost užití inducibilních ppromotorů a tedyy indukovat tvorbu fúzních jjen v určitém čase Nevýhody Fůze se může projevit v nefunkčnosti fúzního proteinu Fototoxicita modrého krátkovlnného světla používaného pro excitaci BFP
FRET: Fluorescence resonance energy transfer (někdy též Förster resonance energy transfer)
Metoda pro měření nanometrových vzdáleností a jejich změn mezi molekulami in vivo i in vitro. Základní podmínky pro FRET: 1. Donorový a akceptorový fluorofor. Absorpční spektrum akceptoru se musí překrývat s emisním spektrem donoru.
2. Donorový a akceptorový fluorofor musí být velmi blízko u sebe, aby došlo k FRET (většinou 10-100 10 100 Å). Å)
Natue Structural Biology 2000: 7(9) 730-734
FRET: Fluorescence resonance energy transfer Účinnost přenosu energie (E) se řídí podle vzorce E=1{1+(R/R0)6}, kde R0 je vzdálenost mezi fluorofory, při které je 50% energie předáno (tedy 50% excitovaných ý donorových ý molekul je j deaktivováno díky y FRET). ) Závisí na spektrálních p charakteristikách fluoroforů a jejich vzájemné orientaci. Známe-li R0 a měříme-li E, je možné stanovit vzdálenost mezi molekulami. Obecně lze takto stanovit spíše p změnu vzdálenosti mezi molekulami,, neboť E závisí také na orientaci molekul a dalších faktorech. Příklady fluoroforů tvořících páry pro FRET: GFP a jeho deriváty (zvláště ECFP a YFP) Coumarin – derivát fluoresceinu Cyaninové barvy (Cy5, Cy5.5, Cy7) – vhodné pro měření vzdáleností >100 Å (R0 je velké) Cheláty lanthanoidů – organické fluorofory
FRET: Fluorescence resonance energy transfer
FRET: Fluorescence resonance energy transfer
Natue Structural Biology 2000: 7(9) 730-734
FRAP: Fluorescence recovery after photobleaching
Metoda vyvinuta původně pro laterální difůzi molekul v membránách. Princip FRAP: ý p proteinem Fluorescenční molekula jje fúzována se zkoumaným nebo membránovými lipidy. Po ozáření vybraného místa excitačním světlem je fluorescence y molekul vysvícena. Pozorujeme znovuobnovení fluorescence ve vysvíceném místě, které svědčí o laterálním pohybu molekul v membránách, kontinuitě membránových ý organel g ((ER nebo GA), ) turnoveru zkoumaných ý molekul nebo transportu molekul (cytoskelet).
http://microscope.olympus.com/contentsDB/01world/01reseach/a_appli/17/contents.html
FRAP: Fluorescence recovery after photobleaching
BiFC Bi-molecular Bi molecular fluorescence complementation
Fluorescenční timer: protein, který mění barvu v čase
Terskikh et al. 2000, Science 290:1585-1588
Úloha 1: vizualizace buněčných struktur pomocí fluorescenční mikroskopie
Jádra (SYTO)
Mitochondrie (MitoTracker red CMXRos)
Mikrotubuly: GFP-tubulin
Endoplazmatické retikulum: volné GFP se signálními sekvencemi pro ER
Vakuoly (FM4-64) Buněčná stěna (calcofluor)
Aktin: GFP-fimbrin
Úloha 2: pozorování některých buněčných struktur pomocí konfokálního mikroskopu
I Interfázová fá áb buňka ňk
Dělící se buňka - fragmoplast
vakuoly vakuoly
jadérko
mitochondrie
Buněčná stěna
Endoplazmatické retikulum
Úloha 3: měření růstu kořenového vlásku, pozorování jader, pozorování mitotických struktur
