Fluorescenční mikroskopie Mgr. Jan Černý PhD. Oddělení vývojové biologie, Katedra fyziologie živočichů, Přírodovědecká fakulta UK v Praze
[email protected]
Klasická světelná mikroskopie sloužila po mnoho desetiletí jako jeden z hlavních nástrojů biologů při zkoumání živých objektů. Co se tímto způsobem dalo objevit a popsat, to bylo objeveno a popsáno - další pokrok vyžadoval technologické inovace, které by umožnily překonat limitace – velikost rozlišitelných objektů pod úrovní nejkratší vlnové délky viditelného světla a simultánní sledování několika buněčných struktur, pokud možno v živých buňkách. Průlomem v překonání velikostní limity byl objev elektronové mikroskopie, kde fotony jsou nahrazeny
elektromagnetickým
vlněním,
velice
citlivé simultánní pozorování několika struktur s mnoha
různými
aplikacemi
umožnil
objev
fluorescenční mikroskopie, revolucí při aplikaci Obr.1. – Příklady některých fluoroforů s příslušnými excitačními a emisními vlnovými délkami (upraveno dle Alberts a kol. Molecular Biology of the Cell.) DAPI – interkaluje do struktury DNA, GFP – zelený fluorescenční protein, FITC – fluorescein isothiokyanát – oblíbený fluorofor snadno kovalentně modifikující např. protilátky), Cy3, Cy5 a Alexa 568 – fluorofory vyvinuté specielně pro fluorescenční mikroskopii – vysoce fotostabilní a s vysokou účinností fluorescence.
fluorescenční mikroskopie na živé buňky bylo využití zeleného fluorescenčního proteinu molekulárně-biologickými technikami připojeného k různým buněčným proteinům. Klíčovým termínem fluorescenční mikroskopie je fluorofor – látka, která je schopná absorbovat světlo určité vlnové délky a následně emitovat světlo o delší vlnové délce. Světlo různých vlnových délek je možné od sebe oddělit pomocí filtrů – do okuláru tak může proniknout pouze pozitivní emitovaný signál na černém pozadí (excitující záření je odfiltrováno), čímž se výrazně zvyšuje citlivost celé techniky. Fluorofory jsou detekovány pomocí fluorescenčního mikroskopu – přístroje, který je velice podobný klasickému světelnému mikroskopu – odlišností je doplnění o velice silný zdroj světla a dva typy filtrů. První sada filtrů je umístěna mezi zdroj světla a vzorek (umožňuje excitovat jednotlivé fluorofory světlem o vybraných vlnových délkách), druhá pak vpouští do objektivu světlo, které bylo emitováno příslušným fluoroforem. Obr.2. Příklad detekce využívající fluorofor schopný přímo vazby na buněčnou strukturu (DAPI se váže na DNA) a faloidin vážící se na polymerovaný aktin (modifikovaný fluoroforem TRITC). Otlakový preparát myšího varlete, fixovaný 4% formaldehydem, permeabilizovaný pomocí 0,1% Tritonu X-100. Čas přípravy tohoto preparátu je cca 1h. Na obrázku je dobře viditelná spermatogeneze doprovázená kondenzací chromatinu a transformací aktinového skeletu v srpkovité útvary.
Fluorescenční mikroskopie je dnes nejčastější metodou pro detekci specifických molekul (např. proteinů, lipidů, oligo- nebo polysacharidů i konkrétních sekvencí DNA a RNA) v buňkách bez nezbytnosti jejich destrukce a biochemické frakcionace. Trikem, jak získat specifické reagencie pro rozpoznání jednotlivých struktur v buňce, použitelné pro fluorescenční mikroskopii, je využít protilátky a kovalentně na ně navázat vhodně zvolený fluorofor. Dnes máme k disposici několik desítek různých vesměs heterocyklických sloučenin, které se od sebe liší absorpčními i emisními vlnovými délkami. Touto paletou fluoroforů je možné pokrýt celé spektrum viditelného světla (s přesahy do ultrafialové
a infračervené oblasti) – a s využitím příslušných filtrů je možné simultánně nezávisle pozorovat několik struktur. Každá struktura je „obarvena“ specifickou reagencií (např. monoklonální protilátkou) s kovalentně navázaným fluoroforem s příslušnými absorpčními a emisními charakteristikami. Záření z jednotlivých fluoroforů je možné oddělit pomocí příslušných filtrů. Klasickým příkladem je detekce jádra pomocí fluorescenční látky interkalující do struktury DNA (DAPI – modrá emise), detekce aktinového cytoskeletu pomocí látky pevně se vázající na polymerovaný aktin s kovalentně navázaným fluoroforem (např. faloidin./TRITC – červená emise) a konečně detekce tubulinového cytoskeletu pomocí specifické protilátky označené zeleným fluoroforem – např. FITC. Obr.3. Příklad detekce kombinující DAPI, faloidin/TRITC (viz obr.2) s monoklonální protilátkou proti tubulinu. Buňky buněčné linie HeLa (odvozené od adenokarcinomu děložního krčku před více než 50 lety) byly narostlé na krycím sklíčku, fixované 4% formaldehydem, permeabilizované 0,1% Tritonem X-100, blokované 1% roztokem bovinního sérového albuminu – BSA – a barvené kromě výše zmíněných barviv primární protilátkou proti tubulinu (myší monoklonální), která se po vazbě na příslušný antigen/epitop vizualizovala pomocí sekundární protilátky kovalentně modifikované fluoroforem Alexa 488. Mikroskop je zaostřen na dělící se buňky, které mají více-méně tvar koule, interfázické ploché buňky jsou pod rovinou ostrosti.
Buněčný biolog si dnes může vybrat z celé plejády fluoroforů, které se samy vážou na buněčné struktury – např. výše zmíněné DAPI na DNA. Dále může zvolit reagencie, které byly připraveny kovalentním spojením vhodného fluoroforu a látky, o níž je prokázána specifická vazba na určitou buněčnou strukturu (celá řada biologicky aktivních látek – např. toxinů s příkladem faloidinu – jedu muchomůrky zelené, který se specificky a pevně váže na polymerovaný aktin). Běžně je využíváno nepřeberné množství značených protilátek – ať již monoklonálních tak polyklonálních.
Obr.4. Otiskový preparát myší sleziny. Slezina je krvetvorný orgán, kde dochází k diferenciaci B-lymfocytů. B-lymfocyty (buňky produkující protilátky) byly detekovány pomocí kozí sekundární protilátky (protilátky proti protilátce) rozpoznávající myší imunoglobulin modifikované pomocí fluoroforu Alexa 488. Pro zachycení celkové histologické struktury folikulů a stromatu byl opět využit faloidin/TRITC. Sekundární protilátky jsou připravovány imunizací protilátkami odlišného živočišného druhu. Např. koza rozpozná myší protilátku jako cizorodou substanci a vytvoří proti ní protilátky
Průlomem při aplikaci fluorescenční mikroskopie na živé buňky bylo využití zeleného fluorescenčního proteinu (GFP – green fluorescent protein – spektrum viz obr. 1). Informace pro tuto bílkovinu je součástí genomu medůzy Aqueoria, odkud je možné ji vyizolovat, upravit (častost využití jednotlivých synonymických kodonů je různá u savců a medůz, je možné zamezit dimerizaci, zvýšit kvantový výtěžek, obměnit absorpční a emisní charakteristiky – vše se děje cílenou mutagenezí příslušného genu) a připojit ji ke genetické informaci kódující konkrétní bílkovinu, jejíž osud v buňce nás zajímá. Takto upravený gen vneseme zpět do buňky, protein je syntetizován spolu se „svítící“ značkou, díky níž můžeme sledovat jeho lokalizaci a dynamiku v buňce. Dnes nejsme omezeni jen na jeden barevný odstín, cílenou mutagenezí vzniklo několik odstínů odvozených od GFP, navíc byly využity i geny jiných druhů – např. korálů. Vedle sebe můžeme do jedné buňky vnést několik genových konstruktů kódujících několik různě barevně označených proteinů a simultánně sledovat jejich osud v buňce. Obr.5. Terciální struktura zeleného fluorescenčního proteinu. Tato molekula má charakteristické „soudečkovité“ uspořádání vytvořené antiparalelními β-listy (upraveno dle Alberts a kol. Molecular Biology of the Cell.)
Biologická technologie dnes není omezena na prosté vnášení genů do buněčných kultur – umožňuje též vytváření geneticky modifikovaných organismů, které ve svém genomu nesou informaci vytvořenou (nebo jen pozměněnou) rukama genového inženýra. V současné době existuje velké množství transgenních organismů, které ve svém genomu nesou informace pro proteiny označené některou variantou fluorescenčního proteinu – některé i v několika barvách. Pro pozorování živých buněk se s výhodou používá modifikace fluorescenční mikroskopie zvaná konfokální mikroskopie. Nevýhodou klasické fluorescenční mikroskopie je to, že okem (popř. kamerou nebo fotoaparátem) při sebelepším zaostření detekujeme též část světelného signálu pod a nad rovinou ostrosti. Výhodou konfokální mikroskopie je to, že získáváme ostrý obraz obsahující informaci (příslušné emitované fotony) pouze z roviny ostrosti. Nevýhodou konfokální mikroskopie je to, ze pro získání využitelně silných signálů vyžaduje mimořádně silné zdroje světla typu laserů a speciální technologii detekce fotonů z roviny ostrosti, což se odráží v ceně příslušného vybavení, které je 5-10x dražší než je tomu u klasické fluorescenční mikroskopie. Obr.6. 3D rekonstrukce dendritické buňky diferencované z kostní dřeně geneticky modifikované myši, v níž byl gen pro MHC glykoprotein II třídy (klíčová molekula účastnící se tzv. antigenní prezentace) nahrazen verzí s připojeným GFP. Genetickou manipulací byla připravena tzv. MHCII.třídy-GFP knock-in myš, v níž se proteinový hybrid MHC II.třídy-GFP produkuje jen ve správných buňkách (profesionální antigen-prezentující buňky – dendritické buňky, makrofágy, dendritické buňky)ve správném množství. Pomocí konfokální videomikroskopie je možné např. zachytit translokaci zeleného signálu z endozomální lokalizace na buněčný povrch po aktivaci příslušných buněk např. po aplikaci složek bakteriálních buněčných stěn. Zeleně je zachycen endozomální systém vizualizovaný pomocí MHC II. třídy GFP, červeně mikrotubulární cytoskelet (monoklonální protilátka proti tubulinu), modré jádro (DAPI).
Možnosti pozorování struktur v živých buňkách není omezena jen na expresi hybridních fluorescenčních proteinů. Existuje celá řada reagencií, které pronikají přes plasmatickou membránu do buněk a zde se dle své chemické povahy
akumulují
v charakteristické lokalizaci. Příkladem těchto molekul jsou např. tzv. lysotrackery (akumulované v kyselých organelách – pozdních endozómech a lysozómech), mitotrackery (lokalizované do mitochondrií) nebo ER-tracker (lokalizace v endoplazmatickém retikulu). Při použití doporučené koncentrace těchto látek není nijak výrazně ovlivněna fyziologie pozorovaných buněk a je možné je sledovat v živých buňkách po poměrně dlouhou dobu – v řádu hodin. Vzhledem k tomu, že existují různé barevné odstíny od výše zmíněných trackerů – je možné je kombinovat a pozorovat simultánně např. zelené mitochondrie a červené lysozómy. Tento systém může být ještě doplněn o modře zbarvené jádro, pro jehož detekci může být využita reagencie z rodiny molekul označovaných Hoechst, které podobně jako DAPI interkalují do struktury DNA, na rozdíl od DAPI však některé z nich pronikají přes intaktní plazmatickou membránu. Obecnou komplikací fluorescenční mikroskopie je to, že fluorofory jsou intenzivním zářením rozkládány a ztrácejí schopnost absorpce a emise – tzv. fotobleaching. Při absorpcích a následných emisích navíc dochází k uvolňování volných radikálů, které mohou poškozovat fluorofory, způsobovat tak fotobleaching a v neposlední řadě negativně ovlivňují životaschopnost buněk. Při práci se živými buňkami je proto zásadní (zvláště pro dlouhodobá pozorování) omezit jejich expozici světelným zářením z vysokoenergetických zdrojů. Toho je možné dosáhnout využitím clon vpouštějících do objektu excitační světlo pouze při expozici a co nejcitlivějších kamer nebo fotonásobičů. Standardní součástí fluorescenční mikroskopie je využití software pro obrazovou analýzu, který umožňuje zpracovávat obrazový výstup kvantitativním i kvalitativním způsobem..
