M. : MIKROSKOPIE III MIKROSKOPIE III

Viková, M. : MIKROSKOPIE III

MIKROSKOPIE III Martina Viková LCAM DTM FT TU Liberec, [email protected]

Přednášky z : Textilní fyzika


Příprava preparátů pro mikroskopii I 1. NATIVNÍ PREPARÁTY (bez zvláštní přípravy) •podélné pohledy vláken, vzorky pigmentů, barviv … •živé objekty ve vodě nebo fyziologickém roztoku (prvoci, řasy, buňky, listy mechu, pokožka, atd.)

•V případě materiálů s malým rozdílem n je nutno použít buď fázového kontrastu, nebo obarvení vzorku, popř. změnit imerzní kapalinu. (typickou ukázkou jsou acetátová vlákna, která nejsou v glycerínu prakticky vidět a je nutno použít jako imerzní kapalinu vodu) •Při dlouhodobém pozorování je nutno brát v úvahu zahřívání preparátu a odpařování imerzní kapaliny Přednášky z : Textilní fyzika


Příprava preparátů pro mikroskopii II 2. NÁTĚRY A ROZTLAKY Vzorek (měkká tkáň, suspenze částic) se rozetře nebo natře na podložním nebo krycím skle.

3. MIKRORELIÉFY A ADHEZIVNÍ PREPARÁTY studují se povrchy nebo povrchové vrstvy Princip: •Nanesení tenké vrstvy rychle tuhnoucí průhledné hmoty (4 – 8% roztok celoidinu v acetonu, bezbarvý lak na nehty, lepidlo, kanagom,.) •Otisk se sejme (sloupne) a přenese (přilepí) na podložní sklíčko, doporučuje se eventuálně lepící pásku zhomogenizovat namočením v benzenu a vysušením



Otisky textilních vláken



Příprava preparátů pro mikroskopii III 4. ŘEZY Princip: ze vzorku se připraví pevný kontrastní tenký řez, který se prohlíží ve SM v procházejícím světle. Parafín zahřát na teplotu o 2oC vyšší, než je teplota tání (≤ 58 oC) Parafín: měkký (45 – 50 oC) střední (50 – 53 oC) tvrdý (53 – 58 oC) Celoidin – nitrát celulózy; rozpustný v éteru a alkohol/éter (1 : 1) Želatina – pro řídké tkáně, které se jinak silně smrští; nebo tukové tkáně (10 až 20 % roztok v destilované vodě)



Příprava preparátů pro mikroskopii IV



Příprava řezů u textilních preparátů



Rozptylující preparát

(preparáty z vláken s přírodní pigmentací-živ.vlákna) Rozptylové diagramy: Délka šipek zde znázorňuje intenzitu paprsků v daném směru po průchodu preparátem.

Režim pozorování -v procházejícím světle

1. 2.

Dopadající paprsky se rozptylují na nehomogenitách indexu lomu rozměrově menších než vlnová délka světla. Takovou nehomogenitou je i každé reálné rozhraní dvou indexů lomu nebo drsnost povrchů. Přednášky z : Textilní fyzika


Fázový preparát

(preparáty s optickou aktivitou) Preparát má oblasti s různým indexem lomu, tzn. s různou rychlostí šíření fáze

Dopadající vlnoplocha

Takto se průchodem zdeformovala původně rovinná vlnoplocha, jinak řečeno, vznikl fázový posuv mezi sousedními paprsky

n1 n d

Δ

Režim pozorování -v procházejícím světle za použití kontrastních metod

1) Fázový preparát bez absorpce (v různých místech preparátu je různý index lomu). Biologické preparáty. 2) Rozdíl optických drah je Δ = d(n - n1) . Tuto strukturu lze zviditelnit různými modifikacemi interferenčního kontrastu.



Dvojlomný preparát

(preparáty z textilních vláken s výjimkou anorganických vláken )

E

Režim pozorování - v procházejícím i dopadajícím polarizovaném světle 1) Optická struktura je tvořena neabsorbujícím dvojlomným krystalem s různě orientovanou optickou osou v jednotlivých částech výbrusu. Mineralogické preparáty. Dvojlom vykazují rovněž biologické preparáty, jako např. nervová vlákna. 2) Lineárně polarizované dopadající světlo průchodem přes preparát obecně změní směr kmitů vektoru elektrické intenzity E prošlého světla. Vznikne světlo elipticky polarizované. 3) Optická struktura (kontrast) se vyjeví v polarizačním mikroskopu (projektoru). Přednášky z : Textilní fyzika


Nerovný povrch preparátu

(difuze způsobená povrchem preparátu)

Rozptylový diagram: silně závisí na povrchovém reliéfu, např.

Režim pozorování – v procházejícím světle za použití Hoffmanova kontrastu nebo v dopadajícím světle a temném poli) 1) Optická struktura vzniká též lomem prošlých paprsků na nerovném povrchu a rozptylem na hranách nerovností. 2) Nerovné bývají často oba dva povrchy objektu.



Měření spektrálních vlastností malých vzorků

Omezení klasické spektrofotometrie = min. aperturní otvor ~ Ø 2mm Přednášky z : Textilní fyzika


Makrospektrofotometry 1



Makrospektrofotometry 2 X SPECTRA

Universita v Upsalle

LCAM MAKROSPEFO Přednášky z : Textilní fyzika


Vlákna z míst kriminálních činů

Vlákno nalezené za nehty oběti

Vlákno z košile nalezené na ostří nože, kterým byla oběť zabita



Mikro-spektrofotometrie 1 - počátky 8 2

9

5

4

6

7

7 10

3 1

Schéma mikrofotometru Zeiss

1 – polychromatický zdroj světla, 2 – interferenční filtr, 3 – monochromatický zdroj světla, 4 – kondenzor 5 – preparát, 7 – děliče světla, 8 – preparátový okulár, 9 – okulár s polohou měřeného místa, 10 - fotonásobič



Mikro-spektrofotometrie 2 - počátky

Schéma mikroskopu upraveného na mikrospektrofotometr s monochromatickým osvitem obvykle bylo prováděno měření při alespoň dvou vlnových délkách



Mikro-spektrofotometrie 3 – komerční systémy



Mikro-spektrofotometrie 4 – komerční systémy

TFProbe Microspectrophotometer (USA)

QDI 1000 MSP fa Craic Technologies (USA)



Mikro-spektrofotometrie 5 – komerční systémy MicroSpec™ s inverzním uspořádáním



Mikro-spektrofotometrie 6 – LIM

Klasický optický mikroskop Nikon + spektrometr Ocean Optics nebo Avantes + vláknová optika



LCAM Microspefo I



LCAM Microspefo II



Opakovatelnost měření – vliv osvětlení

Xenonová výbojka

Halogenová žárovka



Spektrální charakteristika - vliv osvětlení 100 90 80

%T

70 60

Tungsten

50

Xenon

40

Mercury

30 20 10 0 200

300

400

500

Wavelenght /nm/ Přednášky z : Textilní fyzika

600

700


Proměnlivé preparáty



Vliv vstupní apertury – průměr vláknové optiky

200μm 100μm 50μm



Porovnání spekter a vliv imerzního prostředí 100 90 80

T%

70 60

MS voda

50

MS glycerin

40

S pletenina

30 20 10 0 400

450

500

550

600

650

Vlnová délka


700

750


LCAM Mikrospefo – dopadající světlo 20

% rem ise

15 35 10

75 75

5

0 400

450

500

550 Vlnová délka (nm)


600

650

700


Bezpečnostní znaky 8000 7000 6000 5000 4000 3000 2000 1000 0 300

400

500

BM

BaSO4

Papír + OZP

BaSO4

600 Papír+OZP

Bílý marker Přednášky z : Textilní fyzika

700

RM

Růžový marker

Goniochromní metalýza




Multispektrální obrazová analýza I

Slit aperture in Spectral-DV™

CCD Microscope Light Source

Slit aperture in microscope

Transmission Grating

Dichroic in microscope Spectral Image Stack

Specimen



Multispektrální obrazová analýza II This dimension sees a line on the sample or a “linescan”

CCD

This dimension sees spectral information.

Transmission grating

Spectral data is gathered at each pixel Přednášky z : Textilní fyzika

intensity

Both Bothdimensions dimensions(X,Y) (X,Y) see seeintensity intensityranges ranges

wavelength


Multispektrální obrazová analýza III Move specimen under slit

3 dimensional data set (spectral stack): X Y Wavelength

660 nm 600 nm

“Show me 515nm emission only” 515 nm

580 nm 515 nm 440 nm Přednášky z : Textilní fyzika

M. : MIKROSKOPIE III MIKROSKOPIE III

Recommend Documents