Viková, M. : MIKROSKOPIE III
MIKROSKOPIE III Martina Viková LCAM DTM FT TU Liberec,
[email protected]
Přednášky z : Textilní fyzika
Viková, M. : MIKROSKOPIE III
Příprava preparátů pro mikroskopii I 1. NATIVNÍ PREPARÁTY (bez zvláštní přípravy) •podélné pohledy vláken, vzorky pigmentů, barviv … •živé objekty ve vodě nebo fyziologickém roztoku (prvoci, řasy, buňky, listy mechu, pokožka, atd.)
•V případě materiálů s malým rozdílem n je nutno použít buď fázového kontrastu, nebo obarvení vzorku, popř. změnit imerzní kapalinu. (typickou ukázkou jsou acetátová vlákna, která nejsou v glycerínu prakticky vidět a je nutno použít jako imerzní kapalinu vodu) •Při dlouhodobém pozorování je nutno brát v úvahu zahřívání preparátu a odpařování imerzní kapaliny Přednášky z : Textilní fyzika
Viková, M. : MIKROSKOPIE III
Příprava preparátů pro mikroskopii II 2. NÁTĚRY A ROZTLAKY Vzorek (měkká tkáň, suspenze částic) se rozetře nebo natře na podložním nebo krycím skle.
3. MIKRORELIÉFY A ADHEZIVNÍ PREPARÁTY studují se povrchy nebo povrchové vrstvy Princip: •Nanesení tenké vrstvy rychle tuhnoucí průhledné hmoty (4 – 8% roztok celoidinu v acetonu, bezbarvý lak na nehty, lepidlo, kanagom,.) •Otisk se sejme (sloupne) a přenese (přilepí) na podložní sklíčko, doporučuje se eventuálně lepící pásku zhomogenizovat namočením v benzenu a vysušením
Přednášky z : Textilní fyzika
Viková, M. : MIKROSKOPIE III
Otisky textilních vláken
Přednášky z : Textilní fyzika
Viková, M. : MIKROSKOPIE III
Příprava preparátů pro mikroskopii III 4. ŘEZY Princip: ze vzorku se připraví pevný kontrastní tenký řez, který se prohlíží ve SM v procházejícím světle. Parafín zahřát na teplotu o 2oC vyšší, než je teplota tání (≤ 58 oC) Parafín: měkký (45 – 50 oC) střední (50 – 53 oC) tvrdý (53 – 58 oC) Celoidin – nitrát celulózy; rozpustný v éteru a alkohol/éter (1 : 1) Želatina – pro řídké tkáně, které se jinak silně smrští; nebo tukové tkáně (10 až 20 % roztok v destilované vodě)
Přednášky z : Textilní fyzika
Viková, M. : MIKROSKOPIE III
Příprava preparátů pro mikroskopii IV
Přednášky z : Textilní fyzika
Viková, M. : MIKROSKOPIE III
Příprava řezů u textilních preparátů
Přednášky z : Textilní fyzika
Viková, M. : MIKROSKOPIE III
Rozptylující preparát
(preparáty z vláken s přírodní pigmentací-živ.vlákna) Rozptylové diagramy: Délka šipek zde znázorňuje intenzitu paprsků v daném směru po průchodu preparátem.
Režim pozorování -v procházejícím světle
1. 2.
Dopadající paprsky se rozptylují na nehomogenitách indexu lomu rozměrově menších než vlnová délka světla. Takovou nehomogenitou je i každé reálné rozhraní dvou indexů lomu nebo drsnost povrchů. Přednášky z : Textilní fyzika
Viková, M. : MIKROSKOPIE III
Fázový preparát
(preparáty s optickou aktivitou) Preparát má oblasti s různým indexem lomu, tzn. s různou rychlostí šíření fáze
Dopadající vlnoplocha
Takto se průchodem zdeformovala původně rovinná vlnoplocha, jinak řečeno, vznikl fázový posuv mezi sousedními paprsky
n1 n d
Δ
Režim pozorování -v procházejícím světle za použití kontrastních metod
1) Fázový preparát bez absorpce (v různých místech preparátu je různý index lomu). Biologické preparáty. 2) Rozdíl optických drah je Δ = d(n - n1) . Tuto strukturu lze zviditelnit různými modifikacemi interferenčního kontrastu.
Přednášky z : Textilní fyzika
Viková, M. : MIKROSKOPIE III
Dvojlomný preparát
(preparáty z textilních vláken s výjimkou anorganických vláken )
E
Režim pozorování - v procházejícím i dopadajícím polarizovaném světle 1) Optická struktura je tvořena neabsorbujícím dvojlomným krystalem s různě orientovanou optickou osou v jednotlivých částech výbrusu. Mineralogické preparáty. Dvojlom vykazují rovněž biologické preparáty, jako např. nervová vlákna. 2) Lineárně polarizované dopadající světlo průchodem přes preparát obecně změní směr kmitů vektoru elektrické intenzity E prošlého světla. Vznikne světlo elipticky polarizované. 3) Optická struktura (kontrast) se vyjeví v polarizačním mikroskopu (projektoru). Přednášky z : Textilní fyzika
Viková, M. : MIKROSKOPIE III
Nerovný povrch preparátu
(difuze způsobená povrchem preparátu)
Rozptylový diagram: silně závisí na povrchovém reliéfu, např.
Režim pozorování – v procházejícím světle za použití Hoffmanova kontrastu nebo v dopadajícím světle a temném poli) 1) Optická struktura vzniká též lomem prošlých paprsků na nerovném povrchu a rozptylem na hranách nerovností. 2) Nerovné bývají často oba dva povrchy objektu.
Přednášky z : Textilní fyzika
Viková, M. : MIKROSKOPIE III
Měření spektrálních vlastností malých vzorků
Omezení klasické spektrofotometrie = min. aperturní otvor ~ Ø 2mm Přednášky z : Textilní fyzika
Viková, M. : MIKROSKOPIE III
Makrospektrofotometry 1
Přednášky z : Textilní fyzika
Viková, M. : MIKROSKOPIE III
Makrospektrofotometry 2 X SPECTRA
Universita v Upsalle
LCAM MAKROSPEFO Přednášky z : Textilní fyzika
Viková, M. : MIKROSKOPIE III
Vlákna z míst kriminálních činů
Vlákno nalezené za nehty oběti
Vlákno z košile nalezené na ostří nože, kterým byla oběť zabita
Přednášky z : Textilní fyzika
Viková, M. : MIKROSKOPIE III
Mikro-spektrofotometrie 1 - počátky 8 2
9
5
4
6
7
7 10
3 1
Schéma mikrofotometru Zeiss
1 – polychromatický zdroj světla, 2 – interferenční filtr, 3 – monochromatický zdroj světla, 4 – kondenzor 5 – preparát, 7 – děliče světla, 8 – preparátový okulár, 9 – okulár s polohou měřeného místa, 10 - fotonásobič
Přednášky z : Textilní fyzika
Viková, M. : MIKROSKOPIE III
Mikro-spektrofotometrie 2 - počátky
Schéma mikroskopu upraveného na mikrospektrofotometr s monochromatickým osvitem obvykle bylo prováděno měření při alespoň dvou vlnových délkách
Přednášky z : Textilní fyzika
Viková, M. : MIKROSKOPIE III
Mikro-spektrofotometrie 3 – komerční systémy
Přednášky z : Textilní fyzika
Viková, M. : MIKROSKOPIE III
Mikro-spektrofotometrie 4 – komerční systémy
TFProbe Microspectrophotometer (USA)
QDI 1000 MSP fa Craic Technologies (USA)
Přednášky z : Textilní fyzika
Viková, M. : MIKROSKOPIE III
Mikro-spektrofotometrie 5 – komerční systémy MicroSpec™ s inverzním uspořádáním
Přednášky z : Textilní fyzika
Viková, M. : MIKROSKOPIE III
Mikro-spektrofotometrie 6 – LIM
Klasický optický mikroskop Nikon + spektrometr Ocean Optics nebo Avantes + vláknová optika
Přednášky z : Textilní fyzika
Viková, M. : MIKROSKOPIE III
LCAM Microspefo I
Přednášky z : Textilní fyzika
Viková, M. : MIKROSKOPIE III
LCAM Microspefo II
Přednášky z : Textilní fyzika
Viková, M. : MIKROSKOPIE III
Opakovatelnost měření – vliv osvětlení
Xenonová výbojka
Halogenová žárovka
Přednášky z : Textilní fyzika
Viková, M. : MIKROSKOPIE III
Spektrální charakteristika - vliv osvětlení 100 90 80
%T
70 60
Tungsten
50
Xenon
40
Mercury
30 20 10 0 200
300
400
500
Wavelenght /nm/ Přednášky z : Textilní fyzika
600
700
Viková, M. : MIKROSKOPIE III
Proměnlivé preparáty
Přednášky z : Textilní fyzika
Viková, M. : MIKROSKOPIE III
Vliv vstupní apertury – průměr vláknové optiky
200μm 100μm 50μm
Přednášky z : Textilní fyzika
Viková, M. : MIKROSKOPIE III
Porovnání spekter a vliv imerzního prostředí 100 90 80
T%
70 60
MS voda
50
MS glycerin
40
S pletenina
30 20 10 0 400
450
500
550
600
650
Vlnová délka
Přednášky z : Textilní fyzika
700
750
Viková, M. : MIKROSKOPIE III
LCAM Mikrospefo – dopadající světlo 20
% rem ise
15 35 10
75 75
5
0 400
450
500
550 Vlnová délka (nm)
Přednášky z : Textilní fyzika
600
650
700
Viková, M. : MIKROSKOPIE III
Bezpečnostní znaky 8000 7000 6000 5000 4000 3000 2000 1000 0 300
400
500
BM
BaSO4
Papír + OZP
BaSO4
600 Papír+OZP
Bílý marker Přednášky z : Textilní fyzika
700
RM
Růžový marker
Goniochromní metalýza
Viková, M. : MIKROSKOPIE III
Přednášky z : Textilní fyzika
Viková, M. : MIKROSKOPIE III
Multispektrální obrazová analýza I
Slit aperture in Spectral-DV™
CCD Microscope Light Source
Slit aperture in microscope
Transmission Grating
Dichroic in microscope Spectral Image Stack
Specimen
Přednášky z : Textilní fyzika
Viková, M. : MIKROSKOPIE III
Multispektrální obrazová analýza II This dimension sees a line on the sample or a “linescan”
CCD
This dimension sees spectral information.
Transmission grating
Spectral data is gathered at each pixel Přednášky z : Textilní fyzika
intensity
Both Bothdimensions dimensions(X,Y) (X,Y) see seeintensity intensityranges ranges
wavelength
Viková, M. : MIKROSKOPIE III
Multispektrální obrazová analýza III Move specimen under slit
3 dimensional data set (spectral stack): X Y Wavelength
660 nm 600 nm
“Show me 515nm emission only” 515 nm
580 nm 515 nm 440 nm Přednášky z : Textilní fyzika