FLUORESCENČNÍ MIKROSKOPIE A. ZADÁNÍ 1. Seznamte se důkladně s konstrukcí a ovládáním jednotlivých prvků fluorescenčního mikroskopu Hund / Wetzlar H600 AFL 50/100 a s obsluhou digitálního fotoaparátu OLYMPUS CAMEDIA C-3000 ZOOM 2. Připravte pufry o pH 4, 7 a 9. 3. Inkubujte zvolené vzorky (kvasinky, mech) po dobu (20 min) v pufrech o různém pH. 4. Pozorujte změny ve fluorescenci buněk inkubovaných při různém pH.
B. SEZNAM POMŮCEK Přístrojové vybavení: Fluorescenční mikroskop Hund H600 AFL, digitální fotoaparát OLYMPUS CAMEDIA C-3000 ZOOM pH metr Materiál: kvasnice, mech Chemikálie: pufry (TRIS, MES), fluorescenční barvivo (FDA) Ostatní potřeby: podloţní a krycí sklíčka, Petriho misky, mikropipety, kádinky
C. TEORIE I. Fluorescenční mikroskop Hund H600 AFL můţe pracovat jako: a) Transmisní (v reţimech světlého pole, temného pole a fázového kontrastu) b) Fluorescenční Fluorescenční režim Fluorescenční mikroskopie pracuje se dvěmi metodami, pomocí epifluorescence (pozorování v odraţeném světla) nebo diafluorescence (pozorování v procházejícím světle). Fluorescenční metoda pozorování v procházejícím světle se v současnosti téměř nepouţívá. Fluorescenční mikroskopy jsou vybaveny intenzivním světelným zdrojem, obvykle se pouţívají buď vysokotlaké rtuťové (50-200W) nebo xenonové výbojky (75-150W). Obloukové lampy se zahřívají vysokonapěťovými pulsy a jsou umístěny ve skříňce (tzv. housing), která je spojena s nástavcem pro osvětlení dopadajícím světlem (obr. 1). Jsou zde také umístěny ND filtry, které umoţňují sníţit intenzitu excitačního zařízení. Důleţitou součástí fluorescenční výbavy je systém filtrů, který je u episkopické metody tvořen excitačním filtrem, dichroickým zrcadlem a bariérovým filtrem (obr. 2). Filtry lze umístit do specializované optické kostky (filtrblok). Moderní fluorescenční mikroskopy jsou schopny pojmout 4 aţ 6 fluorescenčních kostek na otočném revolveru nebo pousvných šoupátkách, coţ umoţňuje jejich jednoduchou výměnu pro potřebnou aplikaci (obr. 1).
Obrázek 1: Schéma epifluorescenčního iluminátoru.
Obrázek 2: Schéma optické kostky. Epifluorescence spočívá ve vertikálním osvětlení excitačním světlem o poţadové vlnové délce a objekt je pozorován přes objektiv. Světlo emitované rtuťovou výbojkou prochází excitačním filtrem, čímţ se ze spektra světelného zdroje oddělí poţadované excitační světlo a ostatní světlo je pohlceno. Pak je světlo odraţeno na dichroickém zrcadle pod úhlem 90 do objektivu. Dichroické zrcadlo je umístěno do optické dráhy světla pod úhlem 45 (obr. 3).
Obrázek 3: Fluorescenční mikroskopie v odraţeném světle (epifluorescence)
Dichroické zrcadlo tedy odráţí excitační světlo o určité vlnové délce směrem ke propouští ostatní vlnové délky a také odráţí osamocené paprsky excitačního světla směru zdroje. Bariérový filtr zachytí zbytky excitačního světla, které nebylo k excitaci a propouští pouze fluorescenční světlo, čímţ poskytuje černé k fluorescenčnímu obrazu.
vzorku, zpět ve pouţito pozadí
Pokyny 1) 2)
Nastartujte rtuťovou lampu a podle potřeby proveďte její seřízení. Jako kondenzorová clonka nyní pracuje clonka v tělese excitační optické osy (8.3). Ovládá se páčkou na pravé straně vodorovného krytu optické osy. Tato clonka se dá vycentrovat ručními šrouby na svrchní straně tohoto krytu (8.1).
Zdroj rtuťové lampy: (LEJ – mbq 51 ac) Na čelním panelu je hlavní vypínač a ukazatel provozních hodin výbojky. V poloze zapnuto indikuje tento stav zelená kontrolka. Na zadním panelu je zásuvka pro síťovou šňůru a čtyřkolíkový konektor pro připojení kabelu k lampě. Důleţité jsou dva červené přepínače. Na horním se nastavuje typ rtuťové lampy (L1, L2), na dolním se nastaví frekvence sítě (u nás 50 Hz). Typ lampy je uveden výrobcem na štítku krabice i na patici lampy. Vpravo nahoře je knoflík resetování startu lampy. Centrování rtuťové výbojky 1)
2) 3) 4) 5) 6)
7)
Zapněte zdroj (na čelním panelu). Lampa je zaţehnuta. Rtuťové lampy ovšem nenabíhají do stálého pracovního bodu okamţitě ale po určité době. Tato doba činí obvykle 15 minut. Lampa charakteristicky „nastartuje“ a pak se postupně rozsvěcí, její jas prochází maximem a pak se ustálí. Pracovní napětí lampy ve střídavém reţimu je menší, neţ síťové napětí. Proto ve zdroji je tlumivka, která je zapojena do série a na ní nastává potřebný úbytek napětí. Je proto třeba s vlastním pozorováním určitou dobu počkat. Centrování ovšem provádějte hned po zapnutí lampy. Přepněte otáčivý přepínač na optické ose buzení (1.14) do polohy otevřeno. Centrální černý knoflík na tubusu-iluminátoru (4.1. na obr. 6) nastavte do střední zapadávací pozice (šipka na knoflíku ukazuje svisle nahoru). Na okénku pod knoflíkem (4.2.) vlevo se objeví jasná stopa oblouku lampy. Fokusujte obraz oblouku pomocí černého knoflíku na pravé straně housingu lampy. Otáčením knoflíku se lampa pohybuje vodorovně podél optické osy buzení. Fokusujte obraz odrazu oblouku lampy (je méně jasný neţ obraz oblouku) na okénko (4.2) pomocí knoflíku 4.6 zcela vzadu ve středu housingu. Posouvá se jím odrazné duté zrcátko. Pomocí šestihranného šroubováku (2 mm) a dvou stavěcích šroubů (jsou zprava a zleva šikmo shora v zadním bílém osazení housingu) posuňte obraz odrazu oblouku do polohy vlevo vedle obrazu oblouku. Celkově má být dvojice obrazů na okénku vystředována (viz obr. 6). Pozor! Odraz oblouku se nesmí promítat na elektrody delší dobu. Elektrody by se mohly přehřát a lampa by explodovala. Elektrody je vidět jako tmavé stíny nad a pod obrazem oblouku. Tím je rtuťová lampa vycentrována. Občas překontrolujte toto vycentrování.
POPIS OKULÁRŮ Idetifikační symboly
Popis Huygensův okulár Okulár s plan korekcí Okulár pro široké pole Okulár se zvětšením 10:1 a clonou zorného pole o průměru 18 mm Dioptrický okulár
H P WF 10x/18 10xB/18 Popis objektivů
Identifikační symboly 160 0.17 A SPL PL 10/0.25 Oil Ph Fl
Popis Objektiv pro délku tubusu 160 mm Objektiv lze pouţít s i bez krycího sklíčka Objektiv lze pouţít pouze pro krycí sklíčka o tloušťce 0.17 mm Achromatický objektiv (chromatická vada korigována pro ţlutou a zelenou barvu) Objektiv s semiplanachromatickou korekcí Objektiv s planachromatickou korekcí Objektiv se zvětšením 10:1 a numerickou aperturou 0.25 Imersní objektiv Objektiv pro fázový kontrast Fluoridový objektiv pro fluorescenční mikroskopii a hematologická stanovení
Barevné označení objektivů (DIN/ISO standard) 4:1 10:1 20:1 Zvětšení Barevné označení
červená
ţlutá
světle zelená
40:1 50:1 světle modrá
63:1
100:1
tmavě modrá
bílá
Obrázek 4
Obrázek 5
Obrázek 6
Obrázek 7
Obrázek 8
Obrázek 9
Návod k obsluze digitálního fotoaparátu OLYMPUS CAMEDIA C-3000 ZOOM 1) Popis a technická specifikace fotoaparátu 2) Příprava fotoaparátu a připojení k fluorescenčnímu mikroskopu HUND 3) Fotografování vzorku 4) Export snímků do PC 5) Upravení a vyhodnocení snímků pomocí software 1) Popis a technická specifikace fotoaparátu
(1) Kontrolní displej (2) Páčka transfokátoru (3) Blesk (4) Samospoušť (indikátor) (5) Okénko dálkového ovládání (6) Kolečko dioptrické korekce (7) Otvor na řemínek (8) Kryt konektorů (9) Objektiv (10) Mikrofon (11) Konektor externího blesku (12) Konektor AC adaptéru (13) Výstup audio/video (14) USB konektor (15) RS-232C konektor (16) Krytka prostoru karty (17) Tlačítko blesku (18) Tlačítko bodového měření / Makro reţim (19) Hledáček (20) LCD obrazovka (21) Kříţové tlačítko Jog ovládání Menu (22) Přepínač reţimů – Mode (23) Tlačítko spouště (24) Potvrzovací tlačítko, manuální ostření, ochranné tlačítko (25) Zapnutí / vypnutí LCD obrazovky (26) Indikátor činnosti paměťové karty (27) Tlačítko Menu (28) Kryt bateriového prostoru (29) Páčka otevření / zavření bateriového prostoru (30) Závit stativu Typ: Digitální kompaktní fotoaparát Olympus CAMEDIA C-3000ZOOM s barevnouTFT LCD obrazovkou a prokládaným CCD snímačem s úhlopříčkou 1/2" (3 340 000 bodů). Objektiv: Výsuvný s trojnásobným optickým transfokátorem Olympus 6,5 – 19,5 mm; 8 členů v 6 skupinách. Zaostřování 80 cm – nekonečno (v reţimu Makro 20 cm – 80 cm). Záznamové medium: Výměnné paměťové karty SmartMedia 3,3 V velikosti 2 – 64 MB Reţimy záznamu a rozlišení: TIFF (bez komprese obrazu), JPEG (s kompresí obrazu), Quick Time Motion JPEG (pro záznam pohyblivého obrazu), Wave (pro zvukový záznam). 2048 1536 pixelů (TIFF, SHQ, HQ) 1600 1200 pixelů (TIFF, SQ1) 1280 960 pixelů (TIFF, SQ1) 1024 768 pixelů (TIFF, SQ2) 640 480 pixelů (TIFF, SQ2) - v reţimu videozáznam pouţívá fotoaparát rozlišení 320 240 pixelů (HQ) 160 120 pixelů (SQ)
Zkratky SQ2, SQ1, HQ, SHQ označují stupeň komprese snímku. Reţim SQ2 (standartní kvalita) pouţívá největší stupeň komprese, tj. snímek má "nejhorší" kvalitu, ale zabírá nejméně místa na záznamovém mediu. Naopak reţim SHQ (super vysoká kvalita) pouţívá nejmenší stupeň komprese, má "nejlepší" kvalitu, ale zabírá více místa na záznamovém mediu. Kompletní informace o kaţdém bodu digitálního obrazu se zachová pouze při uloţení snímku v nekomprimovaném formátu TIFF. Takový snímek však zabere nejvíce na paměťovém mediu. Například při rozlišení 20481536 pixelů se na paměťovou kartu s velikostí 32 MB v reţimu záznamu TIFF uloţí maximálně 3 snímky, v reţimu SHQ 17 snímků a nebo v reţimu HQ 42 snímků. Při nejmenším rozlišení (640480 pixelů) a nevětším stupněm komprese (reţim SQ2) se na paměťovou kartu s velikostí 32 MB uloţí aţ 330 snímků. 2) Příprava fotoaparátu a připojení k fluorescenčnímu mikroskopu HUND 1. Vloţíme do fotoaparátu odpovídající baterii: - ověříme, zda přepínač reţimů (22) je v poloze OFF (vypnuto) - otevřeme krytku (28) pomocí páčky (29) a mírného tlaku ve směru šipky zobrazené na krytce - vloţíme baterie podle schématu zobrazeného na spodní straně fotoaparátu vedle krytky (28) - po vloţení baterií krytku opět zajistíme (28) páčkou (29) - po ukončení práce s fotoaparátem z něj baterie (hlavně akumulátory!) vyjměte 2. Zkontrolujeme, zda je ve fotoaparátu zasunuta paměťová karta: - otevřeme krytku prostoru karty (16) - v případě, ţe je štěrbina prázdná, zasuneme paměťovou kartu do otvoru tak, jak je nakresleno na krytce (16) a opatrně na ni zatlačíme, aby karta "zaskočila". Nedotýkejte se kontaktů na kartě! 3. Sejmeme krytku objektivu tak, ţe zmáčkneme dva protilehlé výstupky na krytce a krytku odděláme. Obdobně postupujeme při nasazování krytky. Při nezmáčknutí výstupků při nasazování či sejmutí můţe dojít k poškození závitu objektivu. Krytku je nutno sejmout vždy před zapnutím fotoaparátu (do reţimu záznamu i do reţimu prohlíţení), protoţe po zapnutí se vysunuje objektiv do pracovní polohy. Šetří se tak mechanismus vysouvání objektivu. 4. Objektiv fotoaparátu opatrně přišroubujeme k fotografickému nástavci fluorescenčního mikroskopu tak, abychom nepoškodili závity. 3) Fotografování vzorku 1. Přepínač reţimů (22) přepneme do polohy P (význam ostatních moţných poloh přepínače viz obrázek).
2. Otevřeme závěrku na fotografickém nástavci mikroskopu a zapneme LCD displej fotoaparátu tlačítkem (25). (pozn. fotoaparát není zrcadlovka, proto musíme mít zapnutý LCD displej; v hledáčku (19) nic neuvidíme) 3. Nastavíme poţadovanou kvalitu záznamu: - tlačítkem (27) zobrazíme MENU fotoaparátu - kříţovým tlačítkem (21) šipkami ▲ nebo ▼ zvolíme nabídku - šipkou ► (21) vstoupíme do podnabídky a pomocí šipek ▲ a ▼ (21) zvolíme reţim SHQ - potvrdíme 2 tlačítkem OK (24) 4. Vypneme automatický blesk tak, ţe 3 zmáčkneme tlačítko (17); na kontrolním displeji (1) se objeví symbol 5. Namáčkneme spoušť (23). Fotoaparát by měl být schopen automaticky nastavit expozici a zaostřit preparát – zelená dioda v hledáčku svítí. V případě neostrých kontur fotoaparát nemusí vzorek zaostřit korektně – zelená dioda v hledáčku bliká. V tom případě je nutno zaostřit vzorek ručně: - stiskneme tlačítko OK (24) a šipkou ► (21) zvolíme manuální ostření MF - šipkami ▲ a ▼ (21) zaostříme na vzorek - vypnutí manuálního ostření se provádí obdobně (tlačítko OK (24) → ► (21) → tlačítko OK(24)) 6. Vyfotografujeme snímek domáčknutím spouště (23); snímek se na několik sekund objeví na LCD displeji a zároveň se rozbliká kontrolka (26) signalizující ukládání snímku na paměťovou kartu (během ukládání nelze vyfotografovat další snímek). 7. Pro záznam videosekvence (například pronikání herbicidu, indukční jev ap.) zvolíme na přepínači reţimů (22) Video-reţim (viz obrázek výše). - při částečně stisknutém tlačítku spouště (23) se automaticky nastaví expozice a zaostření - po úplném stisknutí spouště (23) se začne videosekvence nahrávat (zároveň se nahrává i zvuková stopa!) - délka nahrávání závisí na zvolené kvalitě záznamu; k dispozici jsou dvě úrovně kvality: SQ (160 120 pixelů, délka záznamu 120 s) HQ (320 240 pixelů, délka záznamu 30 s) - obraz se snímá s frekvencí 12,5 snímků za s (tj. kaţdých 80 ms) - pro ukončení videosekvence se opět stiskne tlačítko spouště (23) 8. Po ukončení fotografování (videosekvence) přepneme přepínač reţimů (22) do polohy OFF (vypnuto), odšroubujeme z fotografického nástavce mikroskopu a nasadíme krytku objektivu. 4) Export snímků do PC 1. Fotoaparát připojíme k PC pomoci USB kabelu (šedý kabel z příslušenství fotoaparátu): - menší konektor zapojíme do zdířky (14) a větší do USB portu počítače (můţe se připojovat k počítači za chodu) - sundáme krytku objektivu a přepneme přepínač reţimů (22) do polohy prohlíţení 2. Na PC spustíme program CAMEDIA Master 2.0 dodávaný s fotoaparátem (v případě absence programu v PC je nutno jej doinstalovat): - v levém sloupci klikneme na ikonku My Camera - po načtení snímků můţeme pomocí myši a klávesy Ctrl označit snímky, které chceme exportovat do PC - v nabídce (horní lišta) klikneme na Camera a pak na Download Selected Images... (v případě ţe chceme exportovat všechny snímky klikneme na Download All Images...) - počítač nás vyzve pro zadání adresáře, do kterého chceme snímky exportovat
- do vybraného adresáře exportuje snímky ve formátu TIFF nebo JPG (to závisí na tom, jaký formát jsme si zvolili při fotografování viz 3) Fotografování vzorku) - stejným způsobem se exportují i videosekvence 3. Vypneme fotoaparát (přepínač (22) v poloze OFF), odpojíme od PC a nasadíme opatrně krytku objektivu. 5) Upravení a vyhodnocení snímků pomocí software Ne vţdy se podaří vyfotografovat snímek přesně tak jak bychom chtěli. Snímek můţe být málo kontrastní, můţe v něm převládat některá barva vlivem nedokonalé automatické korekce na bílou barvu, nebo chceme vybrat jen určité objekty ze snímku atd. Pro tyto operace s digitální fotografií byla vytvořena řada softwarových aplikací. Upravování snímků lze provádět v jakémkoli editoru pracujícím s formáty TIFF a JPG jako jsou například IrfanView, ACDSee, Photoshop, CorelPhotopaint a další. Základní operace s digitální fotografií umoţňuje i software CAMEDIA Master 2.0 dodávaný s fotoaparátem. Korekce úrovní jasu, kontrastu a barev lze jednoduše provést v programu IrfanView (v ostatních programech je postup velice podobný): 1. Spustíme program IrfanView (jedná se o freeware a můţete program zkopírovat zdarma z internetové adresy http://www.irfanview.com/). 2. V nabídce na horní liště klikneme na Image a pak na Enhance colors. 3. Pomocí posuvníků můţeme měnit jas, kontrast, gama korekci a intenzitu barevných kanálů (červená, modrá a zelená) 4. Upravený obrázek uloţíme (File – Save as...) Testování vitality buněk pomocí fluorescenčních sond Testování vitality (ţivotaschopnosti) je zaloţeno na měření podílu ţivých a mrtvých buněk v populaci. Jednou z prvních sond pro toto pouţití byl fluorescein diacetát (FDA). FDA jako taková vlastně není fluorescenčním barvivem, neboť tato látka sama nefluoreskuje. Jakmile však FDA pronikne do buňky, je pomocí vnitrobuněčných enzymů (esteráza) hydrolyzována na fluorescein, který jiţ při vhodně zvolené excitaci (435-490 nm) fluoreskuje (emise při 520 nm). Proces pronikání do buňky a přeměna FDA na fluorescein trvá několik minut. Další výhodou pouţití FDA je, ţe vytvořený fluorescein má velmi malou permeabilitu přes buněčnou membránu. To znamená, ţe fluorescein zůstává po relativně dlouhou dobu lokalizován uvnitř buňky. V podstatě se FDA pouţívá dvěma způsoby. Buď jsou buňky předem inkubovány v roztoku s barvivem a těsně před měřením jsou proprány v čistém pufru, nebo se měření provádí přímo po přidání barviva do vzorku bez propírání. Nevýhodou můţe být, ţe FDA se v alkalickém prostředí samovolně přeměňuje na fluorescein. Roztok s FDA se obvykle uchovává ve tmě. Pro rozlišení ţivých a mrtvých buněk se často vyuţívá také fluorescenční barvivo akridinová oranţ (AO). Ţivé buňky poskytují zelenou fluorescenci, poškozené buňky ţlutou a mrtvé buňky červenou fluorescenci. AO se váţe na DNA (zelená fluorescence), RNA, denaturovanou DNA a kyselé polysacharidy (červená fluorescence). AO vytváří dimer nebo polymer, pokud jsou sousední molekuly barviva velmi blízko sebe. Excitační a emisní spektra dimeru a polymeru jsou nepatrně různá vzhledem k monomeru a z toho důvodu barva fluorescence AO vázaného na RNA je obvykle červená nebo oranţová, v kontrastu k zelené fluorescenci monomeru vázaného na DNA. Vysvětlením je, ţe kationty AO jsou umístěné přibliţně na kaţdé třetí párové bázi dvoušroubovicového helixu DNA. Za těchto okolností je
vzdálenost mezi molekulami barviva dostatečně velká, aby nedošlo k interakci mezi dvěma molekulami a tím ke vzniku dimerů či polymerů. V takovém případě je fluorescenční charakteristika určována monomerem AO, tj. zelenou emisí. Zatímco pokud je AO vázána na jednořetězcové náhodné klubko (tj. denaturovaná DNA, RNA), je vázána na téměř kaţdou nukleotidovou jednotku fosfátové skupiny. Řetězec náhodného klubka pak dovoluje sousedícím molekulám baviva se přiblíţit dostatečně blízko pro interakci mezi molekulami barviva za vzniku polymeru, coţ vede k červené fluorescenci. Fluorescence je tedy závislá na sekundární struktuře molekuly nukleové kyseliny, neboť ta má silný vliv na vázání AO. Při pH 5, 7-8 ţivé buňky fluoreskují zeleně a mrtvé červeně. Nad pH 4,7 AO produkuje červenou fluorescenci cytoplazmy. Jádro je červené při niţším pH a posunuje se na ţlutozelené při pH 6,8. D. POSTUP 1. namícháme zásobní roztoky FDA a AO: 5 mg FDA a15 mg AO rozpustíme v 1 ml DMSO (uchováváme ve tmě při 4°C) 1. ze zásobního roztoku připravíme pracovní roztok: do 1 ml H2O přidáme 10 l zásobního roztoku FDA (AO) 2. do pufru o daném pH (4, 7, 9) dáme kvasinky a necháme inkubovat cca 20 min při pokojové teplotě 3. na podloţní sklíčko napipetujeme 2 l buněčné suspenze a přidáme 5 l pracovního roztoku FDA (AO); necháme inkubovat 5 min 4. ve fluorescenčním mikroskopu pozorujeme změny v intenzitě a barvě fluorescence při různém pH
E. LITERATURA J. Slavík (1982) Intracellular pH of Yeast cells measured with fluorescent probes. FEBS Letters 140: 22-26 J. Slavík (1983) Intracellular pH topography: determination by a fluorescent probe. FEBS Letters 156: 227-230 W.T. Mason (1999) Fluorescent a luminescent probes for biological activity. Academic Press, San Diego, London, Boston, New York, Sydney, Tokyo, Toronto E. Chira (1990) Fluorescenčné metódy ve šlachtení. Príroda, Bratislava P. Jeřábková (2006) Studium vlastnostní biologického materiálu pomocí metod obrazové analýzy. Dizertační práce. VUT v Brně, Fakulta chemická
