Verslag van het bezoek aan het 17e symposium “Health related water microbiology” in Florianopolis (Brazilië). Maja Taucer, Eric Penders en Wim Hoogenboezem Dit middelgrote symposium is bij uitstek geschikt om een overzicht te krijgen van de activiteiten die op het gebied van drinkwatermicrobiologie een rol spelen. De topics van het symposium waren: Water and sanitation in developing countries; global changes and water quality; Microbial source tracking; Viruses in water; Catchment protection; Water reuse and health concerns; Water pollution and diseases; New Methods; Microbial risk assessment; Microbial quality of shellfish growing areas; Recreational water and health. Bovendien warden er enkele speciale workshops georganiseerd: Impact of climate change on health; WHO-workshop Quantitative microbial risk assessment. Bovendien gaf Paul Hunter voor “jonge onderzoekers” een mini-course: “How to get your research published”. W. Vogl ( Wenen) presenteerde een studie met een prototype van de op fluorescentie gebaseerde ColiMinder V, een apparaat dat qua meetprincipe sterk lijkt op dat van de coliGuard. Men meet de activiteit van een enzym dat karakteristiek is voor E. coli (ß-D- Glucoronidase). Aan het watermonsters wordt een kunstmatig substraat 4-MUG (4-Methylumbelliferyl ß-D glucoronide) voor dit enzym toegevoegd. Bij aanwezigheid van (fysiologisch actieve) E. coli zal dit substraat worden gesplitst in glucoronide en een sterk fluorescerende component 4-MU. Onderzoek met dit instrument laat zien dat een snelle detectie van E. coli mogelijk is. De presentatie van Vogl liet ook zien dat deze meettechniek hogere gehaltes oplevert dan die met de kweektechniek (Figuur 1). Als E. coli bacteriën enige tijd in het milieu verblijven, verliezen ze het vermogen kolonies te vormen en worden dus “onzichtbaar” voor de klassieke methodieken. De niet kweekbare bacteriën hebben dan nog wel fysiologische activiteit en hun aanwezigheid wordt nog wel met de ColiMinder aangetoond.
Figuur 1. Het verloop van de E. coli aantallen in een rivierwatermonsters: de blauwe lijn zijn de kweekresultaten en de rode lijn de aantallen op basis van enzymatische metingen met de ColiMinder V (slide uit de presentatie van W. Vogl).
1
Het is duidelijk dat de enzymatische metingen een hogere opbrengst hebben en betrouwbaardere getallen kunnen opleveren. Hoewel het meetprincipe gelijk is aan dat van de coliGuard is het aantrekkelijke van dit (prototype) wel, dat het een toestel is, bedoeld voor toepassing in het laboratorium (voor het veldwerk is een draagbare versie in ontwikkeling) en niet als instrument voor de continue-metingen op een vast locatie zoals dat voor de coliGuard wel het geval is. Hoewel het te meten monstervolume (10 ml) te klein is voor toepassing in het drinkwaterlaboratorium is het van belang deze ontwikkeling te volgen. In onze laboratorium praktijk komt het heel vaak voor dat na een geconstateerde besmetting met E. coli, een eerste herhalingsmonster geen E. coli’s bevat maar het tweede herhalingsmonster weer wel, een soort “verkeerslicht-effect”. Wanneer men zou overgaan herhalingsmonsters met een dergelijke enzymatische test te onderzoeken dan zou men in ieder geval sneller duidelijkheid hebben. Een volledige meetserie van een watermonsters duurt maximaal een half uur. Ook de kosten van een dergelijke meting zijn volgens de verwachting van Vogl op termijn laag. Hij besloot zijn voordracht met de opmerking dat een bepaling uiteindelijke net zo duur zal zijn als een kop koffie, maar als de bewerkingstijd per monster een half uur blijft, dan drinkt die Vogl wel dure koffie. De levensvatbaarheid van bacteriën wordt al enige tijd bepaald m.b.v. ethidium monoazide (EMA) of met propidium monoazide (PMA). De Japanners Sangsanont en Katayana lieten zien dat deze stoffen ook voor bepaling van de ineffectiviteit van virussen kan worden gebruikt. Eigenlijk volgens hetzelfde beginsel, als de celwand beschadigd is kunnen de stoffen (PMA of EMA) binnendringen en aan het DNA binden en replicatie van het DNA verhinderen, waardoor het organisme onzichtbaar blijft bij de PCR bepaling. Virussen hebben geen echte celwand maar een beschermend eiwitlaagje, wanneer dit laagje beschadigd is kunnen deze stoffen zich aan het erfelijk materiaal hechten en verhinderen dat het in de PCR-reactie wordt vermenigvuldigd en wordt het virus niet gedetecteerd. Hierbij is wel de kanttekening dat er ook nog andere mechanismen kunnen zijn die de ineffectiviteit van een virus kunnen beïnvloeden, zoals bijvoorbeeld het vermogen om de gastheercel binnen te dringen en zich daar te vermenigvuldigen. Uit een eerdere studie (Paymon, pers. Comm. [1996]) is gebleken dat in culturen van virussen op zoogdiercellijnen wel virus-DNA wordt aangetroffen in bepaalde cellen zonder dat er plaques werden gevormd. Zo’n virus is dus wel instaat gebleken de gastheercel binnen te dringen maar blijkt dan niet in staat tot sterke vermeerdering. Het is aannemelijk dat dit soort mechanismen niet worden waargenomen met studies die EMA en PMA toepassen. Het is dus mogelijk dat dit soort virussen met deze methodieken als “viable” worden gekarakteriseerd, waarbij het nog maar de vraag is of een dergelijk virus echt infectieus is. De “Keynote speaker” Gantzer (Nancy) besprak de oppervlakte-eigenschappen van virussen (voornamelijk die van bacteriofagen) in relatie tot hun gedrag in water. Dit is een belangrijk onderwerp want uit zijn verhaal blijkt dat er enorme verschillen in verwijdering kunnen optreden. Hij begon zijn verhaal met een voorbeeld dat de verwijdering van poliovirussen (2,5 log) onder te verdelen is in drie componenten. De adhesie-component met 1,5 log verwijdering is eigenlijk geen inactivatie maar het gevolg van plakken aan de wanden van de gebruikte laboratoriummaterialen. Verder kon 0,5 log worden toegeschreven aan aggregatie waarbij de virussen samenklonteren. In de plaque-assay wordt elke plaque geïnterpreteerd als veroorzaakt door een enkel virus, maar een plaque kan gevormd zijn uit een “klont” van vele fagen of virussen. En verder was er ook nog een deel inactivatie (0,5 log) aan te wijzen. Uit zijn verhaal blijkt wel dat er belangrijke verschillen bestaan tussen verschillende soorten fagen die gebruikt worden als model-organismen bij de bestudering van verwijdering tijdens zuiveringsprocessen. De ene soort is geschikt voor bestudering
2
van temperatuureffecten, een andere juist weer voor andere eigenschappen. Daarnaast zijn er nog allerlei omgevingsfactoren die bepalend zijn voor het gedrag van fagen in water. Bij een bepaalde zuivering kan de verwijdering van MS2 (het klassieke model-organisme voor virussen) 15 log bedragen terwijl dezelfde zuiveringsinstallatie voor een andere (zeer hydrofobe) bacteriofagen soort maar een verwijdering van 6,5 logeenheden realiseert. In dit zeer fundamentele verhaal kwamen allerlei aspecten als zuurgraad van het water, iso-elektrisch punt, elektroforese eigenschappen, hydrofoob of hydrofiel. Er werd ook aangetoond dat er op basis van de variatie van dit soort kenmerken en de omgevingsfactoren binnen een soort bacteriofaag, belangrijke verschillen in verwijdering kunnen optreden. Op het gebied van Microbiële Source Tracking (MST) zijn er aantal interessante bevindingen gepresenteerd. A. Harris uit Stanford University presenteerde de effectiviteit van verschillende microbiële source tracking (MST) testen voor het detecteren en onderscheiden tussen de verontreiniging met menselijke feces, feces van herkauwers en feces van vogels (Figuur 2). Op DNA-extracten werden verschillende MST Taqman qPCR testen uitgevoerd (GenBac3, HF183, BacHum , BacCow, Rum2Bac en BacR). De concentratie van fecale indicatoren per gram uitwerpselen (natte massa) varieerde tussen de verschillende typen fecaliën maar ook binnen hetzelfde type bron. De aantallen fecale colibacteriën per gram (natte massa) ontlasting verschilt sterk tussen de geiten en koeien, maar in veel mindere mate tussen een van de andere typen bronnen. De concentraties van enterococcen per gram feces kunnen sterk variëren tussen koeien en alle andere en tussen geiten en kippen. Op basis van de voorlopige resultaten was het BacHum het meest gevoelige en het meest specifieke test. Deze studie werd uitgevoerd in Bangladesh toonde aan dat moleculaire MST testen kunnen worden gebruikt om de fecale verontreiniging met menselijke feces, feces van herkauwers en vogels te detecteren en te onderscheiden.
Figuur 2: “Wanted dead or alive”; Microbiële Source Tracking (MST) in de waterkwaliteit. Aan de Universiteit van Auckland was onderzoek gedaan naar mogelijk ‘’genaturaliseerde’’ E. coli in zoet water. Recente bevindingen tonen aan dat E. coli niet alleen in de darmen groeit maar dat E. coli
3
zich onder bepaalde omstandigheden (tropische klimaat) ook kan vermenigvuldigen in water en in grond. Stammen van E. coli die daartoe in staat zijn, worden " genaturaliseerde " genoemd. Hoewel er meer data is die hun bestaan aantonen, is er nog geen inzicht hoe sommige E. coli stammen zich kunnen aanpassen aan de natuurlijke omgeving. Informatie over mogelijke verschillen tussen genexpressies voor E. coli- isolaten verzameld uit de natuurlijke omgeving en isolaten verzameld uit een gastheer zijn echter nog schaars. In deze studie waren de genexpressies van vijf potentieel genaturaliseerde E. coli uit zoet water en vijf gastheer -geassocieerde E. coli -isolaten van een menselijke oorsprong met behulp van de microarray technologie met elkaar vergeleken. Voorlopige resultaten met deze methode lieten een duidelijke clustering zien van de vijf milieustammen. Deze gegevens dragen bij aan het begrijpen van de “naturalisatie” proces en het voortbestaan van E. coli in het milieu door te wijzen op de specifieke genen en zijn activatie. G.H. Reischer uit TU in Wenen heeft een presentatie gehouden over een nieuwe manier van de MST waar moleculaire screening (sequencing) als gereedschap kan dienen voor de MST van de fecale besmetting. Momenteel zijn de prestaties van verschillende MST methoden zeer variabel. Er is gebrek aan betrouwbare moleculaire methoden voor de detectie van alle in de feces aanwezige micro-organismen. Deze studie onderzoekt in grote lijnen de samenstelling van de microbiële gemeenschap feces van gewervelde dieren. De hypothese is, dat de fylogenetische verwantschap van gewervelde gastheren wordt weerspiegeld in de fylogenetische verwantschap van hun intestinale gemeenschappen. Om dit doel te bereiken zal een database worden gemaakt met fylogenetische marker sequenties uit de intestinale gemeenschappen van een breed scala van gewervelde dieren. Gemeenschappen worden onderzocht door ultra-deep 16S rRNA-gen amplicon sequencing. Tot op heden zijn er 140 verschillende gewervelde diersoorten onderzocht voor deze studie. Taxonomische samenstelling van de fecale monsters werd gedomineerd door leden van de phylum Firmicutes gevolgd door Bacteroides, Proteobacteria en Fusobacteria. Uiteindelijk is de bedoeling dat verzamelde gegevens (database) worden gebruikt als een betrouwbare moleculaire fecale indicatie systeem. S. G. Goh uit de Nationale Universiteit van Singapore presenteerde een evaluatie van meerdere markers voor de bronopsporing van de menselijke feces. Daarvoor werden menselijke geassocieerde markers Bacteroides , Methanobrevibacter smithii en specifiek menselijke polyomavirus (HPyVs) gebruikt. Fecale monsters van diverse lokale dierpopulaties (totaal 68 fecale monsters van mens, honden, katten, muizen en konijnen) werden onderzocht om de mogelijkheid van cross-reactiviteit met deze markers te identificeren. De markers werden ook toegepast op de lokale waterstroomgebieden. Uit de resultaten bleek dat HPyVs geen vals-positieve identificatie toonde van de niet-menselijke gastheren. M.smithii toonde ook een hoge specificiteit voor menselijk afval met 8 % van de cross-reactiviteit met de ontlasting van de hond. B. thetaiotaomicron toonde 12 % vals-positieve identificatie onder de mensen-geassocieerde Bacteroides markers. Toepassing van een enkele marker blijkt minder gevoelig en onvoldoende voor een betrouwbaar oordeel over de menselijke fecale besmetting. De toepassing van meerdere menselijke - specifieke microbiële markers is wel bruikbaar voor de source tracking studies.
4
Maja heeft een poster gepresenteerd over de toepassing van de MALDI-TOF techniek in Het Waterlaboratorium (Figuur 3). Veel bezoekers van de conferentie waren daarin geïnteresseerd. Bij de posterpresentatie is naar voren gekomen dat op dit moment door David Schwake (Universiteit van Arizona) een methode wordt ontwikkeld die met aanvullende software een typering van de Legionella mogelijk zou maken. Dat is ook voor HWL een interessante ontwikkeling. Ook was de informatie over de toepassing van MALDI t.b.v. de source tracking uitgewisseld.
Figuur 3: Posterpresentatie door Maja Taucer tijdens de HRWM 2013 Naast source tracking van de micro-organismen in water, microbiologische nieuwe methoden en virussen in water, zijn er ook lezingen gegeven over Quantative Microbial Risk Assessment (QMRA). De drinkwater QMRA modellen vereisen kennis over concentraties aan pathogenen in water bij de inname van de waterzuivering en hun verwijdering door de waterzuivering , zodat concentraties aan pathogenen in het gezuiverde water kan worden geschat. Hieruit kan, in combinatie met de verbruikte hoeveelheid (ongekookt) water per dag door de consument, een theoretische dagelijkse dosis worden afgeleid. Vervolgens kan, met behulp van een pathogeen dosis-respons-relatie, het risico van een infectie door inname van drinkwater worden geschat. Solokova (University of Technology, Zweden) kwantificeerde de impact van de stroomopwaartse lozingen vanuit afvalwaterzuiveringen t.a.v. de concentratie aan pathogenen in water bij de inname
5
van een drinkwaterzuiveringsinstallatie. Gegevens over de pathogenen in het bronwater zijn nodig om de gezondheidsrisico's voor de consumenten te kunnen schatten via de QMRA. De Norovirus belasting in het bronwater werd gekwantificeerd met behulp van hydrodynamische modellering, die specifiek gericht is op het scenario van de bovenstroomse lozingen. De Norovirus GGI en GGII concentraties in ruw en behandeld afvalwater werd gekwantificeerd door het aanbrengen van een gamma-verdeling aan de gerapporteerde Norovirus concentraties (bepaald met behulp van de qPCR). De resultaten van de hydrodynamische modellering verstrekt informatie over de relatieve grootte en het belang van de lozingen bovenstrooms, evenals informatie over de tijd tussen het optreden van een lozing en de aankomst van de piekconcentratie bij de inname. Met deze modelresultaten is beheer van de waterzuiveringsinstallaties mogelijk in termen van de vereiste behandeling en de reactietijd t.o.v. de stroomopwaartse lozingen. Bastos (Federale Universiteit van Viscosa, Brazilië) presenteerde een QMRA studie waarbij hij de impact van het drinkwaterverbruikgegevens op de berekende risico’s evalueert met behulp van een grote database van Cryptosporidium oöcysten in bronwater. De hoeveelheid (ongekookt) water dat verbruikt wordt, wordt beïnvloed door verschillende factoren zoals cultuur, leeftijd, klimaat en de mate van lichamelijke activiteit. Er werden verschillende waterverbruik-modellen getest, waarbij de gemiddelde waterverbruikwaarden varieerden van 0,250 liter (een glas) tot 1,75 liter per dag. Op basis van gevoeligheidsanalyses is gebleken dat de hoeveelheid water verbruikt per dag een grote impact heeft op de risico-inschattingen. Zijn studie bevestigt dat het waterverbruik een essentieel element is in de QMRA. Afhankelijk van het waterverbruik en het model hiervan, werden verschillen in twee ordes van grootte geconstateerd in de Cryptosporidium infectie risico-inschattingen. Daarnaast werd aangetoond dat de hoeveelheid water verbruikt per dag een significant effect heeft op de totale onzekerheid in ramingen van jaarlijkse infectie. De resultaten uit een onderzoek door Ferguson (GHD, Australië) betreffende de recovery’s van Cryptosporidium en Giardia uit verschillende watermonsters, gemeten via een versie van US EPA methode 1623, geven een richting aan welke parameters voor de waterkwaliteit de meest belangrijke factoren kunnen zijn bij het bepalen van de recovery’s van Cryptosporidium en Giardia. De parameters pH, alkaliteit en troebelheid werden in de categoriale analyse als mogelijk de belangrijkste factoren benoemd bij drie van de vier verschillende watermatrix groepen. Gebruikers kunnen hun systeemkenmerken en monitoringsgegevens invoeren in een QMRA model, zoals QMRA-spot (Schijven), die dan automatisch berekeningen uitvoert en een inschatting geeft van het risico. Toepassing van deze modellen met site specifieke gegevens kan leiden tot artefacten in de QMRA en resulteert in onjuiste uitkomsten. Patrick Smeets (KWR) gaf tijdens zijn presentatie een methode waarmee de uitkomsten van QMRA modellen beter te interpreteren zijn, inzicht in de prestaties van watervoorziening werd verbeterd en de artefacten in de QMRA identificeerbaar zijn. Saskia Rutjes (RIVM) gaf een samenvatting van de uitkomsten van de risico-evaluaties die werden uitgevoerd vanaf 2009-2012 voor de Nederlandse drinkwaterproductielocaties met oppervlaktewater als bron en toonde het voordeel aan van het gebruik van een infectierisico als een gezondheidskundige maatlat. Van de 46 infectierisico's die werden beoordeeld voor de 12 productielocaties, voldeden 35 aan de wettelijke eisen van het 10-4 risico. Campylobacter is de index pathogeen die leidt tot verhoogde infectie-risico’s en kan worden verklaard door de aanwezigheid van dieren in opslagbassins van gedeeltelijk behandeld oppervlaktewater. Het niet voldoen aan de
6
risico-eisen kan ook deels verklaard worden door ontbrekende gegevens met betrekking tot de efficiëntie van bepaalde zuiveringsstappen. Bij drie productielocaties werd aanbevolen om de waterkwaliteit van de bron of de efficiëntie van bepaalde zuiveringsstappen te verbeteren. Vanwege het gebruik van QMRAspot, werd een juiste inzameling en het gebruik van ruwe data gewaarborgd, waarmee een uniforme en continue kwaliteit van de risicobeoordeling werd gegarandeerd. De systematische beoordeling van de microbiële veiligheid van drinkwater door QMRA biedt hulp bij risicomanagement in prioritering en doelstelling van effectieve preventieve maatregelen als integraal deel van waterveiligheidsplannen. Naast het gebruik van QMRA analyses voor de drinkwaterproductie, werden ook gegevens gepresenteerd van QMRA’s t.b.v. de recreatie, hergebruik van afvalwater voor drinkwaterproductie of gebruik van afvalwater als hulpmiddel bij de productie van gewassen. De poster van Wim Hoogenboezem en Roland Tschumie, over ATP-metingen als alternatief bij controle van reparaties en werkzaamheden in het drinkwaterleidingnet, werd goed bezocht.
Figuur 4. Posterpresentatie door Wim Hoogenboezem tijdens de HRWM 2013. Van Abel et al, (University of Washington, USA) presenteerde een poster waarin gemeld wordt dat het aantal consumpties aan drinkwater, verspreid genomen over een dag, invloed heeft op de kans op een infectie bij kortdurende besmetting. Wanneer 1 consumptie per dag was gemodelleerd, heeft een lagere percentage van de bevolking een infectierisico > 10-4 (6.7% (mediaan)), dan wanneer er 3 consumpties per dag wordt gemodelleerd (18.6 %), waarmee dus een onderschatting bestaat van het risico. Evenals bij de eerdere gemelde studie van Boras, is het belangrijk om de consumptieparameter in drinkwater QMRA beter te karakteriseren. Verder was er een poster van Cantusio-Neto
7
(Laboratory of Microbiology - Water Supply and Sanitation Society, Brazilië) over effectiviteit van het gebruik van ozon op de inactivatie van Cryptosporidium spp. oöcysten en Giardia spp. cysten, gemeten als celwandschade met direct immuno-fluorescentie. De resultaten laten zien dat ozon een efficiënte oxidant is voor de Giardia spp. en dat de oocysten van Cryptosporidium meer resistent zijn voor dit oxidatie proces. Een hogere dosis liet geen verbetering zien in de inactiviteit van deze oocysten. Gebruik van ozon met peroxide was meer effectief.
8
